JP6226950B2

JP6226950B2 - 低エンドトキシンのキトサン製造方法

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Publication number: JP6226950B2
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Authority: JP
Inventors: グラッドマン，ジューン; ハーディー，クレイグ; ホガース，アンドリュー
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Description

本発明は、低エンドトキシンのアルカリ性キトサンの製造方法、低エンドトキシンの中性キトサン、キトサン塩およびキトサン誘導体の製造方法、およびこれらの方法によって得られる製造物に関する。

キトサンは、出血を制御する目的で使用される止血用材料の調製において特に有用である。

キトサンは、甲殻類の加工の固体廃棄物から派生的に生じ、菌類を培養して抽出することもできる。キトサンは水不溶性のカチオン性高分子材料である。キトサンは、止血用材料として使用する以前にまず水溶性の塩へと頻繁に転換される。そうすることでキトサン塩が血液中に溶解し、ゲル状となって血液の流出がくい止められる。

キトサン塩は体内で容易に分解されることから、本明細書に記載される応用例に適用して好適なものである。キトサンはリゾチーム酵素によりグルコサミンに転換されるため、体内から自然に排出される。キトサンを体内から取り除く必要がない。しかも、キトサン塩はマイルドな抗菌性を有しているため、使用することで感染のリスクが低減される。

キトサンを利用して、出血の制御目的で使用するのに好適な止血用材料の調製を行うためには、キトサンに含まれるエンドトキシンの濃度が十分に低いことを確認する必要がある。

エンドトキシンは、グラム陰性菌の外膜表面に存在するリポ多糖である。エンドトキシンは、ほ乳類、特にヒトにとって猛毒であり、混入する材料から取り除くことが極めて困難である。通常はエンドトキシンの存在が確認されない血流や他の組織にエンドトキシンが放出されると、発熱を引き起こすことがある。従って、薬学的に許容される製造物では、そこからエンドトキシンを取り除く必要がある。

発熱因子、特にエンドトキシンを取り除くまたは破壊する処置は、“パイロジェン除去”方法と称せられる。エンドトキシンを含む材料のパイロジェン除去技術として、イオン交換クロマトグラフィー、限外瀘過、蒸留、およびエンドトキシンの破壊を狙った様々な化学的方法が挙げられる。

特許文献１は、キトサンからエンドトキシンを除く方法に関し、以下の工程を含む：
ａ）無菌環境中で、滅菌済み、発熱因子フリーの設備および材料を利用し；
ｂ）エンドトキシンを含むキトサンを２４時間までかけて膨潤させ；
ｃ）１ｋｇ／２５Ｌから１．５ｋｇ／２５Ｌのキトサンを、０．０１Ｍから４．０Ｍの塩基性水酸化物中に溶解させ；
ｄ）得られた塩基性のキトサン溶液を継続的に撹拌し；
ｅ）前記溶液を撹拌しながら、６０℃から１００℃の範囲で４５分間から４時間加熱し；
ｆ）前記溶液を、その容積の１０倍までのエンドトキシンフリーの超純水ですすぎ；
ｇ）前記溶液のｐＨを６．８から７．５の範囲で中和させ；
ｈ）超高純度の低エンドトキシンのキトサンスラリーを形成させ、それをエンドトキシンフリーの閉鎖系に移し；
ｉ）前記スラリーから余分な水分を取り除く。

これは、複雑でコストのかかる方法であり、特に、無菌設備が必要とされ、溶液をその容積の１０倍のエンドトキシンフリーの水ですすぐ必要がある。

特許文献２は、低エンドトキシンを含む水溶性のキトサンを以下の工程で製造する方法に関する：
（ａ）水不溶性のキトサンを、塩基性溶液と最初に１時間超接触させ；
（ｂ）前記水不溶性のキトサンをすすいで残存する塩基性溶液を取り除き、この時にエンドトキシンフリーの水を使うことが望ましく；
（ｃ）相間移動剤を含む反応溶液中で、水不溶性のキトサンの部分的なアセチル化を行い；
（ｄ）界面活性剤を含み、ｐＨが約７．０から約７．４である水溶液中で、前記の部分的にアセチル化された水溶性のキトサンを溶解させ；
（ｅ）この水溶液に水混和性溶剤を加え、さらに、水溶液のｐＨを少なくとも８．０に調整することで、水溶液／水混和性溶剤の混合液から、低濃度のエンドトキシンを含む水溶性キトサンを沈殿させ；さらに、
（ｆ）必要であれば、イソプロパノールなどの非溶媒で洗浄する。

しかし、この方法は複雑で費用がかかる上に、大量のエンドトキシンフリーの水や他の溶液を使うことが望まれる。さらに、この方法は相間移動剤を使うことが必要とされ、工程が２、３時間越かかる。

特許文献３は、以下の工程でキトサン中のエンドトキシンを減少させる方法に関する：
（ａ）エンドトキシンを含むキトサンを水溶液中に溶解させ；
（ｂ）この水溶液を界面活性剤と接触させ、エンドトキシンの含有量が減少した水不溶性の固形物と水溶液を形成させ；
（ｃ）固／液分離手段を用い、固形物を水溶液から分離する。

しかし、この方法は、不溶性の固形物を得るために、溶解したキトサンと反応する界面活性剤が必要である。こうして得られる固形物は、キトサンと界面活性剤の混合物、あるいは、キトサンと界面活性剤の反応生成物であろう。

国際公開第２００８／０６３５０３号米国特許出願公開第２００６／２９３５０９号台湾特許第５９３３４２号

本発明は、前述の障害を軽減することを目的とする。

本発明の第一の態様においては、以下の工程を含む、低エンドトキシンのアルカリ性キトサンの製造方法が提供される：
（ａ）キトサンをアルカリ溶液と接触させ、混合物を形成し；さらに、
（ｂ）前記混合物を少なくとも約１２時間放置する。

本発明のさらなる態様においては、以下の工程を含む、低エンドトキシンのアルカリ性キトサンの製造方法が提供される：
（ａ）キトサンをアルカリ溶液と接触させ、混合物を形成し；
（ｂ）前記混合物を少なくとも約１２時間放置し；さらに、
（ｃ）前記混合物を乾燥させる。

本発明により、低濃度のエンドトキシンを含むアルカリ性キトサンを効率よく製造する方法が提供される。この方法は、洗浄工程、すすぎ工程、界面活性剤や相間移動剤の使用、無菌設備、かつ/またはエンドトキシンフリー水の使用を必要としないことで有利である。さらに、特別仕様のエアフィルターや無菌状態も必要としない。本発明の方法は、キトサンのアセチル化の工程を含まないことが好ましい。

本明細書の「アルカリ溶液」という用語は、ｐＨ値が７．５越の溶液を意味する。

エンドトキシンの分子量には大きなばらつきがあるため、エンドトキシンの濃度は、材料１グラム当たりのエンドトキシン活性単位（ＥＵ）で計測する。エンドトキシン濃度は、特定量の基準エンドトキシンとの相対的な量として計測される。

例えば、本発明のエンドトキシンの濃度は、キトサン１グラム当たりのエンドトキシン活性単位（ＥＵ）により計測される。本明細書の「低エンドトキシン」という用語は、キトサンの１グラム当たりのエンドトキシン活性単位（ＥＵ）が１００未満の濃度のエンドトキシンを意味する。

従って、本発明の方法は、エンドトキシン濃度が１００ＥＵ/ｇ未満のアルカリ性キトサンを製造するに好適である。

最終的に得られるアルカリ性キトサンのエンドトキシン濃度は、好ましくは５０ＥＵ/ｇ未満で、より好ましくは２０ＥＵ/ｇ未満で、さらにより好ましくは１５ＥＵ/ｇ未満で、最も好ましくは１０ＥＵ/ｇ未満である。

本方法では、低濃度のアルカリ溶液が好ましいことが見いだされた。本方法で使用されるアルカリ溶液の濃度は、約０．０１Ｍから約１Ｍでよい。アルカリ溶液の濃度は、１Ｍ未満であることが好ましい。好ましいアルカリ溶液の濃度は、約０．０２Ｍから０．２Ｍで、さらに好ましいアルカリ溶液の濃度は、約０．０４Ｍから０．０６Ｍで、典型的には、０．０５Ｍである。アルカリ溶液の濃度は、約０．０１Ｍ、０．０５Ｍ、０．１０Ｍ、０．１５Ｍ、０．２０Ｍ、０．２５Ｍ、０．３０Ｍ、０．３５Ｍ、０．４０Ｍ、０．４５Ｍ、０．５０Ｍ、０．５５Ｍ、０．６０Ｍ、０．６５Ｍ、０．７０Ｍ、０．７５Ｍ、０．８０Ｍ、０．８５Ｍ、０．９０Ｍ、あるいは０．９５Ｍでもよい。良好な結果は、アルカリ溶液の濃度が０．１Ｍで得られる。

いくつかの実施形態において、アルカリ溶液のキトサンに対する量は、アルカリ溶液約１０部に対してキトサン約１部から、アルカリ溶液約１部に対してキトサン約１０部までの範囲内でよい。好ましくは、アルカリ溶液のキトサンに対する量は、キトサン約２部に対してアルカリ溶液約１部であり、より好ましくは、キトサン約１部に対してアルカリ溶液約１部である。

アルカリ溶液は、以下から選択されるアルカリまたはアルカリ土類成分を、単独または２種類以上組み合わせて含んでよい：金属水酸化物、金属炭酸塩、金属重亜硫酸塩、金属過ケイ酸塩、共役塩基、および水酸化アンモニウム。

好適な金属として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、あるいはマグネシウムが挙げられる。

好ましいアルカリ成分は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたは炭酸ナトリウムである。典型的には水酸化ナトリウムが使用される。

アルカリ溶液をキトサンと接触させる場合、当該技術分野において周知の任意の好適な方法で行ってよい。例えば、アルカリ溶液をキトサン上に噴霧してよいし、あるいは、キトサンをアルカリ溶液と混合してもよい。アルカリ溶液と接触したキトサンは均一に分散されるのが好ましい。

好ましくは、キトサンはアルカリ溶液と混合される。低分子量であれば、キトサンはアルカリ溶液中に完全にまたは部分的に溶解できる。キトサンはアルカリ溶液と約３０分までかけて混合させてよいが、より好ましくは約１０分である。いくつかの実施形態において、キトサンはアルカリ溶液と３０分を超えて混合させてよい。いくつかの実施形態において、キトサンとアルカリ溶液の混合物は、工程（b）の処理中に断続的に撹拌させてよい。

キトサンとアルカリ溶液の混合物が放置される最中に、エンドトキシンがアルカリにより破壊される。キトサンとアルカリ溶液の混合物は、少なくとも約１２時間放置される。キトサンとアルカリ溶液の混合物の放置時間が長いほど、最終的に得られるアルカリ性キトサン中のエンドトキシンの濃度が低くなることが発見された。混合物の放置時間が約１２時間の場合に、好適に低濃度のエンドトキシンが得られる。有利なことに、本発明の方法では、キトサンをアルカリ溶液と混合させ続ける必要がなく、その混合物を放置しておいてよい。

いくつかの実施形態において、混合物は少なくとも約１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、または７２時間の間、放置しておいてよい。

混合物は少なくとも４８時間放置するのが好ましい。

いくつかの実施形態において、混合物は少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０日、またはそれ以上放置しておいてよい。

いくつかの実施形態において、混合物は約２から４週間（あるいは、１４から３０日間）、またはそれ以上放置される。混合物は、好ましくは２４時間から７０日の間、さらに好ましくは７日から３５日の間、最も好ましくは１４日から２１日の間、放置される。

良好な結果は、キトサンを０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液に接触させ、その混合物を約１２日から１６日の間放置することで得られ、約１４日が好ましい。

混合物は、室温と室圧の下で放置されてよい。室温と室圧とは、温度が約２０℃から２５℃で、気圧が約１気圧（ａｔｍ）のことである。有利なことに、混合物は無菌環境で放置される必要がない。

混合物は、好ましくは、清潔な容器に保存される。混合物は不活性雰囲気下に保存されてよい。

混合物は、防腐剤をさらに含んでもよい。防腐剤は、例えば、混合物を長時間放置した場合に発生する微生物増殖の危険性を解消できて有利である。防腐剤は、生体適合性があり、アルカリ性環境での使用に適していれば任意の防腐剤でよい。好適な防腐剤として、銀イオン、亜鉛イオン、クロルヘキシジン、あるいはこれらを２種以上組み合わせたものが挙げられる。

本発明の方法は、乾燥工程を含んでも含まなくてもよい。乾燥工程は、当該技術分野において周知の従来の任意の乾燥手段で行ってよい。乾燥工程は、好ましくは、オーブンまたは空気乾燥器を通してろ過することにより行う。この乾燥工程でも特別な無菌設備を必要としない。

一旦混合物が乾燥工程で乾燥されると、混合物内のエンドトキシンレベルが著しく増加しないことが発見された。このことは、混合物の継続処理に有利である。

以上より、エンドトキシン濃度が１００ＥＵ/ｇ未満の低エンドトキシンのアルカリ性キトサンが提供される。低エンドトキシンのアルカリ性キトサンは水不溶性でもよい。分子量が低い場合には、低エンドトキシンのアルカリ性キトサンがいくらかの水溶性を示す可能性がある。

本発明のさらなる態様においては、本発明に記載される方法で得られる低エンドトキシンのアルカリ性キトサンが提供される。

本発明のさらなる態様においては、エンドトキシン濃度が１００ＥＵ／ｇ未満のアルカリ性キトサンが提供される。

アルカリ性キトサンのエンドトキシン濃度は、好ましくは５０ＥＵ／ｇ未満で、より好ましくは２０ＥＵ／ｇ未満で、さらにより好ましくは１５ＥＵ／ｇ未満で、最も好ましくは１０ＥＵ／ｇ未満である。

低エンドトキシンのアルカリ性キトサンは、例えば、誘導体または共重合体のような他のキトサン産物を製造するため、或は、低分子量キトサンまたはキトサンオリゴ糖を製造するために使用することができる。低エンドトキシンのアルカリ性キトサンは、キトサン系の繊維、布帛類、塗料、フィルム、ゲル、溶液、シート、発泡体等の他形態のキトサン、あるいは、キトサン誘導体または共重合体を製造するための原材料としても有用であろう。

特に、低エンドトキシンのアルカリ性キトサンは、中性キトサンやキトサン塩、およびキトサン誘導体など、エンドトキシンが低濃度である他の有用なキトサン産物を調製するために使用でき、そのような産物の例として、カルボキシメチルキトサン、ヒドロキシエチルキトサン、アシルキトサン、アルキルキトサン、スルホニルキトサン、リン酸化キトサン、アルキリデンキトサン、金属キレート、塩化キトサン、乳酸キトサン、酢酸キトサン、リンゴ酸キトサン、およびグルコン酸キトサンが挙げられる。

以上のように、本発明のさらなる態様においては、低エンドトキシンの中性キトサン、キトサン塩またはキトサン誘導体を製造する方法が提供され、この方法は、本発明に記載される方法で調製されるアルカリ性キトサンを酸と接触させる工程を含む。

この方法により、医療的に有用な低濃度エンドトキシンの中性キトサン、キトサン塩またはキトサン誘導体が提供できる。

アルカリ性キトサンを酸に接触させる工程は、本発明の第一の態様に記載される方法の乾燥工程の前に行うことができる。

酸のアルカリ性キトサンへの接触は、当該技術分野において周知の任意の好適な方法で行ってよい。例えば、酸をアルカリ性キトサン上に噴霧してよいし、アルカリ性キトサンを酸と混合してもよい。

好ましくは、アルカリ性キトサンを酸と混合する。

本明細書の中性キトサンは、そのｐＨ値が約６．５から約７．５の範囲にあるキトサンを意味し、好ましくは、約７である。

従って、中性キトサンの調製では、アルカリ性キトサンを、適切な容量及び濃度の酸と混合し、ｐＨ値が６．５から７．５の範囲にある中性溶液を形成すればよい。アルカリ性キトサンを中和するために必要な酸の容量、かつ/または濃度は、アルカリ性キトサンのｐＨに依存するであろう。

また、キトサン塩またはキトサン誘導体の調製では、アルカリ性キトサンを、中性キトサンの製造に必要な量を超えた容量と濃度の酸と混合してよい。

本発明で好適に使用される酸は以下から選択し、単独あるいは２種以上を組み合わせて使用してよい：有機酸、カルボン酸、脂肪酸、アミノ酸、ルイス酸、一塩基酸、二塩基酸、多塩基酸、核酸、および鉱酸。

好適な有機酸は以下から選択し、単独あるいは２種以上組み合わせて使用してよい：酢酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、アセチルサリチル酸、グルコン酸、および乳酸。

好適な脂肪酸は以下から選択し、単独あるいは２種以上組み合わせて使用してよい：ミリストレイン酸、パルミトオレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノール酸、リノエライジン酸、α−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルシン酸、ドコサヘキサエン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、およびセロチン酸。

好適なアミノ酸は以下から選択し、単独あるいは２種以上組み合わせて使用してよい：ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、およびタウリン。

好適な鉱酸は以下から選択し、単独あるいは２種以上組み合わせて使用してよい：塩酸、硫酸、および硝酸。中和目的で選択される酸は、塩酸が好ましい。

酸の濃度は、約０．００１Ｍからその酸がとり得る最大濃度までの範囲でよい。例えば、硫酸の典型的な最大濃度は、約９８％硫酸である。酸の濃度は、約０．０１Ｍから５Ｍ、０．０１Ｍから３Ｍ、あるいは０．１Ｍから２Ｍでよい。好ましい酸の濃度は約１Ｍである。酸の濃度は、約０．０１Ｍ、０．０５Ｍ、０．１０Ｍ、０．１５Ｍ、０．２０Ｍ、０．２５Ｍ、０．３０Ｍ、０．３５Ｍ、０．４０Ｍ、０．４５Ｍ、０．５０Ｍ、０．５５Ｍ、０．６０Ｍ、０．６５Ｍ、０．７０Ｍ、０．７５Ｍ、０．８０Ｍ、０．８５Ｍ、０．９０Ｍ、０．９５Ｍ、または１．０Ｍでよい。

酸は、酸と非溶媒とを含む酸液として存在してよい。非溶媒は、キトサンが不溶であれば任意の溶媒でよい。典型的な非溶媒として、乳酸エチル、酢酸エチル、酢酸メチル、エタノール、アセトン、あるいはこれらの混合物が挙げられる。好ましい非溶媒として、酢酸エチルあるいはエタノールが挙げられる。より好ましい非溶媒は、エタノールと水が８０：２０の割合で含まれる非溶媒である。エタノールと水が８０：２０の割合で含まれる非溶媒を使用した場合、反応がより速く進行することが観察されており、有益である。

酸液に対するキトサンの割合は、約５対１から約１対５でよい。好ましい酸液に対するキトサンの割合は、約２対１である。

いくつかの実施形態において、低エンドトキシンのアルカリ性キトサンは、酸と約５分間混合してよい。後に混合物を乾燥させながら反応を継続させてよい。

アルカリ性キトサンを酸と混合させて得られる溶液は、酸性塩を含んでいてよい。生成される酸性塩が生物的適合性であるように、アルカリ溶液と酸を選択することが好ましい。例えば、アルカリ溶液は水酸化ナトリウムを含み、酸は塩酸を含んでよい。このような例では、酸性塩は生物的適合性がある塩化ナトリウムとなるであろう。

酸性塩は、塩基性のアルカリ性キトサンと酸の反応により生成される副産物である。

酸性塩が最終的なキトサン産物に混在することで、その有用性に影響を及ぼす可能性がある。例えば、キトサンのゲル化効率は、生理食塩水中で水中に比べ低下し、濃度が２倍である生理食塩水中ではさらに低効率となる。この明細書で、濃度が２倍である生理食塩水とは、１．８％の塩化ナトリウムを含む生理食塩水を想定する。従って、最終的なキトサン産物に混在する酸性塩の量はできるだけ少ないほうが望ましく、理想的には、最終的なキトサン産物の有用性にほとんど影響を及ぼさないか、あるいは実質的に影響を及ぼさないレベルの酸性塩である。

驚くべきことに、濃度が約０．０１Ｍから約０．１Ｍのアルカリ溶液を使用すると、含まれるエンドトキシンが望ましい程度に低濃度であると同時に、中性キトサン、キトサン塩またはキトサン誘導体の製造のための後工程で生成される酸性塩副産物の量が減少することが発見された。このことは、酸性塩副産物量を低減させて得られたキトサン産物を使用した場合、そのゲル化能が、酸性塩をより多く含む産物に比べて向上することを意味し、有益である。本発明の方法により、キトサン産物の洗浄あるいはすすぎを必要とすることなく、酸性塩が好適に少量のキトサン産物が提供される。また、洗浄あるいはすすぎ工程で、エンドトキシンフリー水を使用する必要がないため、さらに有利である。

さらに、本明細書に記載される低濃度のアルカリ溶液を使用することで、中性キトサン、キトサン塩またはキトサン誘導体の製造時でのキトサン粘度の低下が低減されることが見いだされた。低濃度のアルカリとは、約０．０１Ｍから約１Ｍのことであり、好ましくは、１Ｍ未満で、より好ましくは、約０．０２Ｍから約０．２Ｍである。いくつかの実施形態において、アルカリ濃度は、０．０５Ｍでよい。いくつかの実施形態において、アルカリ濃度は、この明細書に上述された通りでよい。従って、低濃度のアルカリ溶液を本方法で使用することは、キトサンの損傷を低減して有益である。こうして、粘度の変化を最小限に抑制しながら、キトサンからエンドトキシンを取り除くことができる。本方法では、キトサン粘度の低下を約２５％未満にすることが望ましく、好ましくは約１５％未満であり、より好ましくは約１０％未満である。

本方法で低エンドトキシンの中性キトサンを製造した場合、この産物は、他のキトサン系産物を製造するための原材料に使用されて好適である。その使用法の一つとして、とりわけ、キトサン塩の製造が挙げられるが、このキトサン塩は、その高い吸収性により出血を制御するための止血調製に使用されて理想的である。キトサン塩は水溶性であることが望ましい。

このように、本発明の他の態様においては、本明細書に記載される方法で製造される低エンドトキシンの中性キトサンを、酸と接触させて、低エンドトキシンのキトサン塩を製造してもよい。

所望のキトサン塩を製造するのに適していれば、酸は任意の酸でよい。例えば、酢酸キトサンが所望であれば、酢酸を使用してよいし、コハク酸キトサンが所望であれば、コハク酸を使用してよい、等である。本方法で低エンドトキシンのキトサン塩を製造する場合、本明細書に記載される任意の酸を使用してよい。

低エンドトキシンのキトサン塩またはキトサン誘導体を製造する方法は、低エンドトキシンの中性キトサンと酸の混合物を乾燥する工程をさらに含んでよい。乾燥工程は、当該技術分野において周知の任意の好適な乾燥方法で行ってよい。乾燥工程は、オーブンまたは空気乾燥器を通してろ過することにより行うことが好ましい。

このようにして、エンドトキシンの濃度が１００ＥＵ/ｇ未満の、低エンドトキシンの中性キトサン、キトサン塩またはキトサン誘導体が提供される。

低エンドトキシンの中性キトサンは、水不溶性でもよい。

低エンドトキシンのキトサン塩は、水溶性でもよい。

本発明のさらなる態様においては、本明細書に記載される任意の方法で得られる低エンドトキシンの中性キトサン、キトサン塩またはキトサン誘導体が提供される。

本発明のさらなる態様においては、エンドトキシンの濃度が１００ＥＵ/ｇ未満の、中性キトサン、キトサン塩またはキトサン誘導体が提供される。

中性キトサン、キトサン塩またはキトサン誘導体のエンドトキシン濃度は、好ましくは５０ＥＵ/ｇ未満、より好ましくは２０ＥＵ/ｇ未満、さらにより好ましくは１５ＥＵ/ｇ未満、最も好ましくは１０ＥＵ/ｇ未満である。

本発明の低エンドトキシンのキトサン塩は、血液の流出をくい止める止血剤として使用して好適である。

従って、本発明のさらなる態様においては、血液の流出をくい止める止血剤として使用される、本明細書に記載の低エンドトキシンのキトサン塩が提供される。

本発明の低エンドトキシンのキトサン塩は、表在性の生命に別状のない出血、あるいは生死に関わる出血に対処する創傷被覆材に含有されてよい。

従って、本発明のさらなる態様においては、表在性の生命に別状のない出血、あるいは生死に関わる出血に対処する創傷被覆材として使用される、本明細書に記載の低エンドトキシンのキトサン塩が提供される。

本発明の低エンドトキシンのキトサン塩は、血液の流出をくい止める止血用創傷被覆材製造のために使用されて好適である。本発明のさらなる態様においては、本明細書に記載の低エンドトキシンのキトサン塩を含む、止血用創傷被覆材が提供される。

本発明のまたさらなる態様においては、本明細書に記載の低エンドトキシンのキトサン塩を含む、止血用材料が提供される。

止血用材料、かつ/またはキトサン塩は、粒子状、粉末状、顆粒状、フレーク状、繊維状、ゲル状、発泡体様、シート状、フィルム状、あるいは液状などの好適な任意の形態でよい。

本発明のまたさらなる態様においては、血液の流出をくい止める方法が提供され、以下の工程を含む：任意に創傷領域を可能な範囲で洗浄し；本明細書に記載の低エンドトキシンのキトサン塩を含む止血用創傷被覆材を前記創傷領域に適用し；ゲル凝血塊が形成されるまで、創傷領域に一定の圧力を加える。

一定の圧力は、創傷領域に約3分間かそれ以上加えるのが好ましい。

ここで、添付図面を参照して、本技術の実施例を以下の非限定的な例の中で詳しく説明する。

異なる濃度の酸性塩副産物が異質の溶媒中でキトサン産物の粘度に与える影響を示すグラフである。酸処理がキトサン重合体の粘度に与える影響を示すグラフである。生理食塩水の本発明の二つの異なる止血用材料への浸透を示すグラフである。本発明の二つの異なる止血用材料の血液凝固に要する時間を示すグラフである。本発明の二つの異なる止血用材料の上腹部断絶試験での止血の割合を示すグラフである。

エンドトキシン試験
１．キトサンのエンドトキシン試験用に、ＵＳＰ（米国薬局方）抽出溶液をＵＳＰの詳述に従い調製し（４．６ｍｌの１ＭＨＣｌと４５．４ｍｌのエンドトキシンフリー水）；
２．抽出のため、０．１ｇの試験用キトサン産物を９．９ｍｌのＵＳＰ抽出溶液に加え、３７℃で４８時間放置し；
３．４８時間後、１００μｌの抽出物を０．９ｍｌのエンドトキシンフリー水で希釈し、それから；
４．上記の希釈液１００μｌを、１００μｌのチャールスリバー社のエンドトキシン特異的（ＥｎｄｏｔｏｘｉｎＳｐｅｃｉｆｉｃ：ＥＳ）緩衝液と混合する。

ＦＤＡ承認の使い捨てカートリッジを利用するＥｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）−ＰＴＳ（商標）携帯式の分光光度計を用いて、最終的な抽出物を試験する。抽出物を２０００倍希釈して使用し、試験での検出下限量は１０ＥＵ/ｇである。

実施例
実施例１：
５０ｇのキトサン（プリメックス社、アイスランド）を５０ｇの１ＭＮａＯＨと３０分間混合した。こうして得られる湿ったアルカリ性キトサン団粒を室温で４８時間放置した。それから、トレイに載せオーブンを使い４０℃で乾燥した。
未加工キトサンのエンドトキシン初期量：３８３ＥＵ/ｇ
乾燥処理済みアルカリ性キトサン：１０．６ＥＵ/ｇ
コントロール実験（抽出過程で、キトサンの代わりに０．１ｇのエンドトキシンフリー水を用いた）：＜１０ＥＵ/ｇ

実施例２：
５０ｇのキトサン（プリメックス社、アイスランド）を５０ｇの０．５ＭＮａＯＨと１０分間混合した。こうして得られる湿ったアルカリ性キトサン団粒を室温で７２時間放置した。それから、トレイに載せオーブンを使い４０℃で乾燥した。
未加工キトサンのエンドトキシン初期量：３８３ＥＵ/ｇ
乾燥処理済みアルカリ性キトサン：３８．３ＥＵ/ｇ

実施例３：
５０ｇのキトサン（プリメックス社、アイスランド）を５０ｇの０．２ＭＮａＯＨと１０分間混合した。こうして得られる湿ったアルカリ性キトサン団粒を室温で７日間放置した。それから、トレイに載せオーブンを使い４０℃で乾燥した。
未加工キトサンのエンドトキシン初期量：３８３ＥＵ/ｇ
乾燥処理済みアルカリ性キトサン：２７．９ＥＵ/ｇ

実施例４：
５０ｇのキトサン（プリメックス社、アイスランド）を５０ｇの０．１ＭＮａＯＨと１０分間混合した。こうして得られる湿ったアルカリ性キトサン団粒を室温で１４日間放置した。それから、トレイに載せオーブンを使い４０℃で乾燥した。
未加工キトサンのエンドトキシン初期量：３８３ＥＵ/ｇ
乾燥処理済みアルカリ性キトサン：１２．７ＥＵ/ｇ

実施例５：
５０ｇのキトサン（プリメックス社、アイスランド）を１００ｇの０．２ＭＮａＯＨと１０分間混合した。こうして得られる湿ったアルカリ性キトサン団粒を室温で２日間放置した。それから、トレイに載せオーブンを使い４０℃で乾燥した。
未加工キトサンのエンドトキシン初期量：３８３ＥＵ/ｇ
乾燥処理済みアルカリ性キトサン：３５．７ＥＵ/ｇ

実施例６：
５０ｇのキトサン（プリメックス社、アイスランド）を１００ｇの０．１ＭＮａＯＨと１０分間混合した。こうして得られる湿ったアルカリ性キトサン団粒を室温で２日間放置した。それから、トレイに載せオーブンを使い４０℃で乾燥した。
未加工キトサンのエンドトキシン初期量：３８３ＥＵ/ｇ
乾燥処理済みアルカリ性キトサン：４９．３ＥＵ/ｇ

実施例７：
５０ｇのキトサン粉末（コグニス社、ドイツ）を５０ｇの０．１ＭＮａＯＨと１０分間混合した。こうして得られる湿ったアルカリ性キトサン団粒を室温で７日間放置した。それから、トレイに載せオーブンを使い４０℃で乾燥した。
未加工キトサンのエンドトキシン初期量：４５．３ＥＵ/ｇ
乾燥処理済みアルカリ性キトサン：＜１０ＥＵ/ｇ
コントロール実験（抽出過程で、キトサンの代わりに０．１ｇのエンドトキシンフリー水を用いた）：＜１０ＥＵ/ｇ

実施例８：
５０ｇのキトサン粉末（コグニス社、ドイツ）を５０ｇの０．０５ＭＮａＯＨと１０分間混合した。こうして得られる湿ったアルカリ性キトサン団粒を室温で７日間放置した。それから、トレイに載せオーブンを使い４０℃で乾燥した。
未加工キトサンのエンドトキシン初期量：４５．３ＥＵ/ｇ
乾燥処理済みアルカリ性キトサン：＜１０ＥＵ/ｇ
コントロール実験（抽出過程で、キトサンの代わりに０．１ｇのエンドトキシンフリー水を用いた）：＜１０ＥＵ/ｇ

実施例９：
５０ｇのキトサン粉末（コグニス社、ドイツ）を５０ｇの０．０２５ＭＮａＯＨと１０分間混合した。こうして得られる湿ったアルカリ性キトサン団粒を室温で７日間放置した。それから、トレイに載せオーブンを使い４０℃で乾燥した。
未加工キトサンのエンドトキシン初期量：４５．３ＥＵ/ｇ
乾燥処理済みアルカリ性キトサン：＜１３．５ＥＵ/ｇ
コントロール実験（抽出過程で、キトサンの代わりに０．１ｇのエンドトキシンフリー水を用いた）：＜１０ＥＵ/ｇ

さらに、本方法はスケールアップでき、より大きなバッチサイズでの製造も可能である。実施例１０と１１は、医療装置の製造で慣用されるＣｌａｓｓ１００，０００のクリーンルーム（ＵＳＦＥＤＳＴＤ２０９Ｅクリーンルーム規格）で実施された。

実施例１０：
３．５ｋｇのキトサン粉末（プリメックス社、アイスランド）を３．５ｋｇの０．１ＭＮａＯＨと３０分間混合した。こうして得られる湿ったアルカリ性キトサン団粒を室温で１４日間放置した。それから、空気乾燥器を通してろ過することにより４０℃で乾燥した。
未加工キトサンのエンドトキシン初期量：２８８ＥＵ/ｇ
乾燥処理済みアルカリ性キトサン：１０．２ＥＵ/ｇ
コントロール実験（抽出過程で、キトサンの代わりに０．１ｇのエンドトキシンフリー水を用いた）：＜１０ＥＵ/ｇ

実施例１１：
３．５ｋｇのキトサン粉末（プリメックス社、アイスランド）を３．５ｋｇの１ＭＮａＯＨと３０分間混合した。こうして得られる湿ったアルカリ性キトサン団粒を室温で２４時間放置した。それから、空気乾燥器を通してろ過することにより４０℃で乾燥した。
未加工キトサンのエンドトキシン初期量：２８８ＥＵ/ｇ
乾燥処理済みアルカリ性キトサン：１５．３ＥＵ/ｇ
コントロール実験（抽出過程で、キトサンの代わりに０．１ｇのエンドトキシンフリー水を用いた）：＜１０ＥＵ/ｇ

本方法は、キトサン繊維あるいはキトサン布帛等の、物理的に別形態をとるキトサンでも使用可能である。

実施例１２：
１０ｇのキトサン繊維（１．８ｄｔｅｘ × ２８ｍｍ）を１０ｇの０．１ＭＮａＯＨと１０分間混合した。こうして得られる湿ったアルカリ性キトサン繊維を室温で２日間放置した。それから、トレイに載せ研究室用オーブンを使い４０℃で乾燥した。
未加工キトサン繊維のエンドトキシン初期量：８８ＥＵ/ｇ
乾燥処理済みアルカリ性キトサン繊維：＜１０ＥＵ/ｇ
コントロール実験（抽出過程で、キトサンの代わりに０．１ｇのエンドトキシンフリー水を用いた）：＜１０ＥＵ/ｇ

実施例１３：
５ｇのキトサン不織布（６０ｇｓｍ）を５ｇの０．１ＭＮａＯＨと１０分間混合した。こうして得られる湿ったアルカリ性キトサン布帛を室温で２日間放置した。それから、トレイに載せ研究室用オーブンを使い４０℃で乾燥した。
未加工キトサン布帛のエンドトキシン初期量：４０１ＥＵ/ｇ
乾燥処理済みアルカリ性キトサン布帛：＜７８ＥＵ/ｇ
コントロール実験（抽出過程で、キトサンの代わりに０．１ｇのエンドトキシンフリー水を用いた）：＜１０ＥＵ/ｇ

次の実施例１４と１５では、水酸化ナトリウムと異なる塩基を用いる。

実施例１４：
５０ｇのキトサン（プリメックス社、アイスランド）を５０ｇの０．２ＭＫＯＨ（水酸化カリウム）と３０分間混合した。こうして得られる湿ったアルカリ性キトサン団粒を室温で７日間放置した。それから、トレイに載せ研究室用オーブンを使い４０℃で乾燥した。
未加工キトサンのエンドトキシン初期量：３８３ＥＵ/ｇ
乾燥処理済みアルカリ性キトサン：１４．４ＥＵ/ｇ
コントロール実験（抽出過程で、キトサンの代わりに０．１ｇのエンドトキシンフリー水を用いた）：＜１０ＥＵ/ｇ

実施例１５：
５０ｇのキトサン（プリメックス社、アイスランド）を５０ｇの０．５Ｍ炭酸ナトリウムと３０分間混合した。こうして得られる湿ったアルカリ性キトサン団粒を室温で７日間放置した。それから、トレイに載せ研究室用オーブンを使い４０℃で乾燥した。
未加工キトサンのエンドトキシン初期量：３８３ＥＵ/ｇ
乾燥処理済みアルカリ性キトサン：２５．８ＥＵ/ｇ
コントロール実験（抽出過程で、キトサンの代わりに０．１ｇのエンドトキシンフリー水を用いた）：＜１０ＥＵ/ｇ

実施例１から１５の全ては、低エンドトキシンのアルカリ性キトサンの製造に関する。この低エンドトキシンのアルカリ性キトサンは、後工程で他のキトサン系産物の原材料として使用できる。例えば、アルカリ性キトサンは、塩基と反応して生体適合性の塩を生成する適切な酸を低量加えることで、ｐＨ７に中和され中性キトサンを形成する。例えば、塩基性溶液に水酸化ナトリウムを使用した場合、塩酸を加えることで中和できる。この場合、製造物は少量の残存塩化ナトリウムを含むであろう。

実施例１６：
実施例４の湿ったアルカリ性キトサン団粒をビーカーに２０ｇ量り取った。そこには、１０ｇのキトサンと１０ｇの０．１ＭＮａＯＨが含まれていた。ＮａＯＨを中和するには、１ｇの１ＭＨＣｌが必要であった。これを、別のビーカーで９ｇのエタノールと混合した。それから、この酸液を湿ったアルカリ性キトサン団粒と混合し、５分間撹拌した。こうして得られた混合物を、研究室用オーブンを使い４０℃で乾燥した。そこには、０．２９％の塩化ナトリウムが含まれていた。

実施例１７：
実施例４の湿ったアルカリ性キトサン団粒をビーカーに２０ｇ量り取った。そこには、１０ｇのキトサンと１０ｇの０．１ＭＮａＯＨが含まれていた．ＮａＯＨを中和するには、１ｇの１Ｍ酢酸が必要であった。これを、別のビーカーで９ｇのエタノールと混合した。それから、この酸液を湿ったアルカリ性のキトサン団粒と混合し、５分間撹拌した。こうして得られた混合物を、研究室用オーブンを使い４０℃で乾燥した。そこには、０．５％の酢酸ナトリウムが含まれていた。

実施例１から１５で製造された低エンドトキシンのアルカリ性キトサンは、低エンドトキシンの水溶性キトサン塩または他のキトサン誘導体を製造するのに使用できる。これを遂行するにあたり、無菌環境を必要とせず、高価なエンドトキシンフリー水を大量に使用することを必要とせず、すすぎや洗浄を必要としないことで、有益である。例えば、低エンドトキシンのアルカリ性キトサンは、過剰量の適切な酸と反応させることもできる。この場合、酸のごく一部が塩基と反応し、生体適合性の塩を生成するであろう。

実施例１８：
Ｃｌａｓｓ１００，０００のクリーンルームにて、実施例１０の乾燥済み低エンドトキシンのアルカリ性キトサンを３．１ｋｇ量り取り、ステンレススチールミキサーに入れた。まず、３．６ｋｇの乳酸を０．９ｋｇのエンドトキシンフリー水と予備混合させた。これを、ミキサー稼働中にキトサン上に噴霧した。こうして得られた材料を、空気乾燥器を通してろ過することにより４０℃で乾燥した。
この材料は、完全な水溶性であった。
未加工キトサンのエンドトキシン初期量：２８８ＥＵ/ｇ
乾燥処理済みアルカリ性キトサン：１０．２ＥＵ/ｇ（実施例１０）
乾燥済み水溶性キトサン：１３．８ＥＵ/ｇ
コントロール実験（抽出過程で、キトサンの代わりに０．１ｇのエンドトキシンフリー水を用いた）：＜１０ＥＵ/ｇ

実施例１９：
Ｃｌａｓｓ１００，０００のクリーンルームにて、実施例１１の乾燥済み低エンドトキシンのアルカリ性キトサンを３．１ｋｇ量り取り、ステンレススチールミキサーに入れた。まず、３．９ｋｇの乳酸を０．９ｋｇのエンドトキシンフリー水と予備混合させた。これを、ミキサー稼働中にキトサン上に噴霧した。こうして得られた材料を、空気乾燥器を通してろ過することにより４０℃で乾燥した。
この材料は、完全な水溶性であった。
未加工キトサンのエンドトキシン初期量：２８８ＥＵ/ｇ
乾燥処理済みアルカリ性キトサン：１５．３ＥＵ/ｇ（実施例４）
乾燥済み水溶性キトサン：１４．６ＥＵ/ｇ
コントロール実験（抽出過程で、キトサンの代わりに０．１ｇのエンドトキシンフリー水を用いた）：＜１０ＥＵ/ｇ

他の実施例では、カルボキシメチルキトサン等の低エンドトキシンのキトサン誘導体の製造においても、低エンドトキシンのアルカリ性キトサンを原材料として使用できる。

実施例２０：
実施例１の湿ったアルカリ性キトサン団粒をビーカーに２０ｇ量り取った。そこには、１０ｇのキトサンと１０ｇの１ＭＮａＯＨが含まれていた。別のビーカーで、５ｇのクロロ酢酸ナトリウム、５ｇの水、および１０ｇのエタノールからなる混合物を調製した。それから、この混合液を湿ったアルカリ性キトサン団粒中に撹拌しながら混ぜた。それから、４時間の間、温度を６０℃まで上昇させた。こうして得られた混合物を１０ｇのエタノールで３回洗浄し残存する全てのクロロ酢酸ナトリウムを取り除き、その後、研究室用オーブンを使い４０℃で乾燥させた。

酸の粘度に対する効果
ｐＨが中性のキトサンまたはキトサン塩を製造するために、低エンドトキシンのアルカリ性キトサンを酸と反応させると、副産物である酸性塩が生成される。この副産物が混在すると、キトサン産物の出来栄えに影響を与える可能性がある。例えば、副産物の量が生理食塩水中のキトサンの粘度に影響を与える可能性がある。

図１を参照すると、乳酸ナトリウムを生理食塩水中に異なる濃度で加えた結果を示し、この操作により、現在市販で購入できるキトサン産物のＣＥＬＯＸ（登録商標）をサンプルとして２ｇ用いた場合、その粘度が異質の溶媒液２０ｇ中で３分後にどのような影響を受けるかを示す結果である。

基質溶媒は、体液からの生理食塩水であり、そこに異なる濃度の乳酸ナトリウムを加えた。乳酸ナトリウムは、水酸化ナトリウムと乳酸との反応により生じる副産物を代表する。

結果を表１と図１に示す。

図１から、加える塩の濃度が上昇すると、溶媒中のＣＥＬＯＸ（登録商標）の粘度が低下することが明らかである。従って、本発明のキトサン産物に残存する塩副産物が非常に微量であることが有益となる。

低濃度アルカリ溶液の粘度に対する効果
実施例１０で製造された低エンドトキシンのアルカリ性キトサンを用いた試験により、酸処理によるキトサン重合体の粘度に対する影響を検証した。ここで粘度は、分子量の測定単位と見なすことができる。試験は次の方法工程を含む：
ａ）実施例１０で製造された低エンドトキシンのアルカリ性キトサン顆粒を、５ｇ量り取り；
ｂ）６００ｍｌのビーカーに４．９５ｇの酢酸を量り取り；
ｃ）４９０．０５ｇの脱イオン化した水を前記ビーカーに加え、１％の酢酸溶液を４９５ｇ調製し；
ｄ）このビーカーをスターラープレートに載せ、スターラーをオンにし（溶液の粘度が増加するにしたがい、スターラーの速度をあげる）；
ｅ）キトサン顆粒を酢酸溶液に加え；
ｆ）全ての顆粒が溶解するまで定期的に溶液をチェックし、必要ならば、溶液の粘度が増加するにしたがい、撹拌の速度を上げ；
ｇ）キトサン顆粒を酢酸溶液に投入した時点から合わせて２４時間の間、溶液を放置し;
ｈ）ブルックフィールド型粘度計にスピンドル６４を装着し；
ｉ）スピンドルを、１０ｒｐｍにセットし；
ｊ）スピンドル上の目印までスピンドルを溶液に浸し、粘度計をオンにして安定するまで待ち；
ｋ）決められた時間間隔で、粘度（ｃＰｓ）を記録する。

上述の粘度試験の結果を下記の表２と図２に示す。各バッチのそれぞれの経過時間点で、３度の計測の平均をとった。

図２で示された粘度の計測結果から、０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液を用いて調製された低エンドトキシンのアルカリ性キトサン重合体の分子量は、何週間もの間安定していると推察できる。

アルカリ溶液の濃度の低下による効果
本発明の方法のアルカリ溶液の濃度を低下させることでの効果を、（１）生理食塩水の試験サンプルへの浸透率、（２）血液凝固までの時間、および（３）生体モデルとしての上腹部断絶に対する止血の割合、にそれぞれ焦点を合わせた３つの実験により試験した。

図３を参照すると、浸透性試験の結果が示される。

一般的な試験方法は、以下の通り：５ｍｌの蒸留水を試験管に入れた。一滴の食用赤色染料を水に加えた。３ｇの止血用粉末サンプルを丁寧に水の上に載せて粉末の層を形成させた。１分後に、水が止血用粉末内を移動した距離を測定し、浸透率として記録した。

図３から見てとれるように、１．０Ｍの水酸化ナトリウムを用いて調製された止血用粉末は、０．１Ｍの水酸化ナトリウムを用いて調製された止血用粉末に比べて、経時的に不安定であり、さらに、顆粒内に浸透する生理食塩水が増加していることは、血液が顆粒を通過し、ゲル状の栓を形成しない可能性が大きいことを示す。

図４を参照すると、止血試験の結果が示される。

一般的な試験方法は、以下の通り：０．７５ｇ止血用粉末サンプルを試験管に入れ、そこに、５ｍｌのウサギのヘパリン化血液を加えた。それから試験管を逆さまにし、血液が完全に凝固しゲル状の塊になるまでの時間を記録した。

図４から見てとれるように、１．０Ｍの水酸化ナトリウムを用いて調製された止血用粉末は、０．１Ｍの水酸化ナトリウムを用いて調製された止血用粉末に比べて、血液を凝固させる時間が長い。約３倍長くかかっており、このことは止血性が低いことと関連する（低圧力で、中程度の量の出血を生体モデルとした時、１８０秒を超えても１００％の止血が得られないことがデータで示されている）。

図５を参照すると、止血試験の結果が示される。

一般的な試験方法は、以下の通り：豚モデル（非ヘパリン化）として、豚の腹壁動脈に、３から５ｃｍの傷をつけた。顆粒状の止血材料を塗り、１分間圧迫した。再出血した場合、さらに１分間圧迫した。

図５から見てとれるように、０．１Ｍの水酸化ナトリウムを用いて調製された止血用顆粒が、試験の１００％の場合において止血が得られたのに対して、１．０Ｍの水酸化ナトリウムを用いて調製された止血用顆粒では、６０％であった。

本発明の止血材料を調製する場合、使用するアルカリ溶液の濃度が低いほど、材料の有する浸透性、血液凝固、および止血能が高いことが、試験結果より示される。

本発明が、例示のためにのみ記述された以上の実施例に制限されることを意図するものでないことは、当然ながら理解されよう。

Claims

低エンドトキシンのアルカリ性キトサンを製造する方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）キトサンを濃度が０．０１Ｍから０．２Ｍのアルカリ溶液と接触させて混合物を形成し；さらに
（ｂ）前記混合物を少なくとも１２時間放置する。
前記混合物を乾燥させる工程（ｃ）をさらに含み、任意に前記乾燥させる工程（ｃ）がオーブンで行われる、請求項１に記載の方法。
前記アルカリ溶液が、以下から選択されるアルカリまたはアルカリ土類成分を、単独または２種以上の組み合わせで含む、請求項１又は２に記載の方法：金属水酸化物、金属炭酸塩、金属重亜硫酸塩、金属過ケイ酸塩、共役塩基、および水酸化アンモニウム、ここで前記金属が、任意にナトリウム、カリウム、カルシウム、あるいはマグネシウムから選択され、前記アルカリ成分が、任意に水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、あるいは炭酸ナトリウムから選択され；および／または任意に前記アルカリ溶液が前記キトサン上に噴霧されるか、あるいは前記キトサンが前記アルカリ溶液に混合される。
前記混合物が工程（ｂ）で少なくとも４８時間放置され、任意に２から４週間放置され；および／または前記混合物が清潔な容器に放置され、かつ／または不活性雰囲気下に放置される、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
前記混合物が、任意に銀イオン、亜鉛イオン、クロルヘキシジン、あるいはこれらの２種以上の組み合わせから選択される防腐剤をさらに含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
請求項１から５のいずれかに記載の方法によって調製されるアルカリ性キトサンを、酸と接触させる工程を含む、低エンドトキシンの中性キトサン、キトサン塩またはキトサン誘導体を製造する方法。
前記アルカリ性キトサンを酸と接触させる工程を、請求項２から５のいずれかに記載の乾燥させる工程（ｃ）の前に行う；ここで任意に前記酸を前記アルカリ性キトサン上に噴霧するか、あるいは前記アルカリ性キトサンを前記酸に混合する、請求項６に記載の方法。
前記酸が下記から、単独あるいは２種以上の組み合わせで選択される、請求項６または７のいずれかに記載の方法：任意に下記から、単独あるいは２種以上の組み合わせで選択される有機酸：酢酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、アセチルサリチル酸、グルコン酸、および乳酸；カルボン酸；任意に下記から、単独あるいは２種以上の組み合わせで選択される脂肪酸：ミリストレイン酸、パルミトオレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノール酸、リノエライジン酸、α−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルシン酸、ドコサヘキサエン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、およびセロチン酸；任意に下記から、単独あるいは２種以上の組み合わせで選択されるアミノ酸：ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、およびタウリン；ルイス酸；一塩基酸；二塩基酸；多塩基酸；核酸；および任意に下記から、単独あるいは２種以上の組み合わせで選択される鉱酸：塩酸、硫酸、および硝酸、および／または前記酸の濃度が１Ｍである。
前記酸が、前記酸と任意に乳酸エチル、酢酸エチル、酢酸メチル、エタノール、アセトン、８０：２０の割合で混合されるエタノール：水、あるいは、これらの２種以上の混合物から選択される非溶媒とを含む酸液として存在する；ここで任意にキトサンの酸液に対する前記割合が、５：１から１：５である；および／または前記アルカリ性キトサンが前記酸と５分間混合される、請求項６から８のいずれかに記載の方法。
反応物の乾燥工程をさらに含み、任意に前記乾燥工程が、オーブンまたは空気乾燥器を通してろ過することにより行われる、請求項６から９のいずれかに記載の方法。