JP5653068B2

JP5653068B2 - 低分子量キトサンの製造方法

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Publication number: JP5653068B2
Application number: JP2010106330A
Authority: JP
Inventors: 昭博山村; 光朗川口; 又平　芳春; 芳春又平; 佐藤　智典; 智典佐藤
Original assignee: Yaizu Suisan Kagaku Kogyo Co Ltd
Current assignee: Yaizu Suisan Kagaku Kogyo Co Ltd
Priority date: 2010-05-06
Filing date: 2010-05-06
Publication date: 2015-01-14
Anticipated expiration: 2030-05-06
Also published as: JP2011236264A

Description

本発明は、遺伝子導入用キャリアーとして用いられる低分子量キトサンの製造方法に関する。

近年の目覚ましい遺伝子工学の進歩によって、多くの遺伝病やガンなどの原因遺伝子が同定、単離されてきている。そしてそれら病気の原因となる遺伝子の異常がＤＮＡレベルで明らかにされたことで、その異常な遺伝子を正常に戻すことによりその病気を治療するという遺伝子治療が考えられるようになってきた。

現在、実用化されている遺伝子治療法は大きくわけて２つある。１つは、先天性免疫不全症や先天性代謝異常症などの先天的な遺伝病において、その欠損した遺伝子を外部から導入して補うという治療法であり、もう１つはガン細胞やＡＩＤＳなどのような細胞やウイルスをターゲットにして、それらの増殖を抑制したり、死滅させるための遺伝子を導入する治療法である。上記どちらの治療法においても、目的とする遺伝子を細胞内に導入し、発現させることが重要であることが知られている。

しかしながら、遺伝子と細胞膜は共にアニオン性を示し、電気的に反発してしまうため、遺伝子を単独で直接細胞内に導入することは非常に困難である。また、遺伝子導入用キャリアーとして、ウイルスベクターやカチオン性リポソーム、脂質、ポリマーなど、様々な物質が検討されてきたが、安全性や導入効率などの面で問題があり、実用化の妨げとなっている。

そこで、安全性と導入効率に優れた遺伝子導入用キャリアーとしてキトサンを用いることが検討されている。例えば、特許文献１には、０．１〜１．０ｄｌ／ｇ程度の固有粘度（３０℃、０．２Ｎ酢酸＋０．１Ｎ酢酸ナトリウム溶液）の低分子量キトサンが、遺伝子導入用キャリアーとして適当であることが記載されている。また、特許文献２には、１．０ｄｌ／ｇ以上の固有粘度（３０℃、０．２Ｎ酢酸＋０．１Ｎ酢酸ナトリウム溶液）のキトサンを遺伝子導入用キャリアーとして用いることが記載されている。また、非特許文献１には１５ｋＤａ、５２ｋＤａ、７５ｋＤａのキトサンが細胞内への高い遺伝子導入活性を有し、１００ｋＤａ以上のキトサンでは遺伝子導入活性がなかったことが記載されている。

特開平３−１９８７８２号公報特開２０００−１５７２７０号公報

佐藤智典ら「アミノ化多糖を用いた遺伝子の細胞内導入と発現活性」バイオ・高分子シンポジウム講演要旨集、Ｖｏｌ．８、ｐ７９−８０（１９９８）

キトサンを用いた遺伝子導入用キャリアーについては、従来、キトサンの分子量と細胞内への遺伝子導入活性との相関についての検討が数多くなされてきたが、同程度に低分子量化されたキトサンであっても遺伝子導入活性にバラつきがあり、十分な再現性が得られないという問題があった。

したがって、本発明の目的は、遺伝子導入用キャリアーとして、安全性と導入効率に優れ、その遺伝子導入活性にバラつきが少ない低分子量キトサンを、再現性良く製造する方法を提供することにある。

上記目的を達成するために本発明者らが鋭意研究した結果、低分子量キトサンの調製にあたり特定の工程を採用することにより、遺伝子導入活性にバラつきが少ない低分子量キトサンが、再現性良く得られることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明の低分子量キトサンの製造方法は、遺伝子導入用キャリアーとして用いられる低分子量キトサンの製造方法であって、キチンを原料とし、
（１）強アルカリを用いた脱アセチル化工程と、
（２）エンドトキシンフリー水による洗浄工程と、
（３）過酸化水素を用いた低分子量化工程と、
を含むことを特徴とする。

本発明においては、前記低分子量キトサンの重量平均分子量（Ｍｗ）が４５〜６０ｋＤａであり、かつ数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）が２〜４であることが好ましい。

本発明によれば、遺伝子導入用キャリアーとして、安全性と導入効率に優れ、その遺伝子導入活性にバラつきが少ない低分子量キトサンを、再現性良く製造することができる。

キトサンは、主にエビやカニなどの甲殻類の甲羅に含まれるキチン（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンがβ−１，４結合した多糖）のアセトアミド基を脱アセチル化して得られる多糖類である。脱アセチル化して生じるアミノ基がイオン化しているため、発熱物質であるエンドトキシンと強く結合する性質を有している。また、キトサンにエンドトキシンが一度結合すると、それを除去することは困難である。このような性質を利用して、キトサンをエンドトキシン吸着体として利用することなども報告されている（特開２００７−１４５７４３号公報）。ここで、エンドトキシンとは、グラム陰性菌の細胞外膜に存在する内毒素であり、その構成成分はリポ多糖であり、人体内に混入した場合は、発熱、炎症、アナフィラキシーなどの毒作用が惹起される可能性があることから、医薬品類や医療用具などにおいては適正な汚染管理が求められている。

本発明の低分子量キトサンの製造方法は、キトサンを低分子量化して低分子量キトサンを得るものであるが、市販のキトサンや、キトサンとして調製され保存されているものなどを原料にすると、既にエンドトキシンが混入しているおそれがあり、また、あやまってエンドトキシンが混入してしまうおそれもあるので、遺伝子導入用キャリアーとしての安全性の観点や、遺伝子導入効率の観点からも、そのようなキトサン素材を用いずに、キチンを原料とする。

本発明の低分子量キトサンの製造方法においては、下記の工程により、キチンから低分子量キトサンを得る。

（１）強アルカリを用いた脱アセチル化工程
脱アセチル化のための強アルカリとしては、苛性ソーダが好ましく例示される。例えば、１６〜２０Ｎ程度の苛性ソーダ水溶液を湯浴等で６０〜１００℃程度に加熱して、この苛性ソーダ水溶液１ｋｇに対して、キチン１〜２００ｇ程度を投入し、撹拌しながら１〜８時間程度保温する。これにより、キチンが脱アセチル化度７０〜９５％程度のキトサンとなる。

なお、強アルカリを用いた脱アセチル化工程は、上記の態様に限られるものではなく、原料のキチンを強アルカリで処理することにより、脱アセチル化度７０〜９５％程度のキトサンとなる工程であれば、本発明に適用できる。

（２）エンドトキシンフリー水による洗浄工程
エンドトキシンフリー水とは、エンドトキシンを実質的に含まない水であり、具体的には、エンドトキシン濃度が０．２５（ＥＵ/ｇ）以下、好ましくは、０．０１（ＥＵ/ｇ）以下の水である。このようなエンドトキシンフリー水は、限外ろ過膜（ＵＦ膜）などで調製することができる。また、市販のエンドトキシンフリー水を用いてもよい。

エンドトキシンを測定する方法としては、日本薬局方に収載されているカブトガニ血球抽出物由来成分を利用したリムルステストをはじめ、鶏胚致死試験、ウサギ発熱性試験、ガスマススペクトル、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ等が挙げられる。市販のエンドトキシン測定用キットを用いてもよい。

本発明の低分子量キトサンの製造方法においては、エンドトキシンフリー水による洗浄工程を、上記に説明した強アルカリを用いた脱アセチル化工程の結果得られたキトサンに対して行うか、又は、下記に説明する過酸化水素を用いた低分子量化工程の結果得られた低分子量キトサンに対して行うか、又は、それらのいずれに対しても行う。本発明においては、強アルカリを用いた脱アセチル化工程の結果得られたキトサンと、過酸化水素を用いた低分子量化工程の結果得られた低分子量キトサンとのいずれに対しても行うことが好ましい。

洗浄は、強アルカリを用いた脱アセチル化工程の結果得られたキトサン、又は、過酸化水素を用いた低分子量化工程の結果得られた低分子量キトサンに、エンドトキシンフリー水を添加して、固液分離するという操作を、洗浄水のｐＨが９程度以下になるまで繰り返すことにより行う。固液分離は、４２メッシュ（開口３５５μｍ）〜３３０メッシュ（開口４５μｍ）程度の篩で行うことが、作業性がよいので好ましい。

なお、エンドトキシンフリー水による洗浄工程は、上記の態様に限られるものではなく、洗浄することにより、強アルカリを用いた脱アセチル化工程や、過酸化水素を用いた低分子量化工程で用いられたアルカリを除去する工程であれば、本発明に適用できる。

また、洗浄後のキトサン又は低分子量キトサンは、エタノールに分散・固液分離して脱水後、真空乾燥を行うことが好ましい。これによれば、乾燥工程でのキトサンの結着を防ぎ、乾燥後の粉砕工程を省略できる。

（３）過酸化水素を用いた低分子量化工程
過酸化水素を用いた低分子量化のための溶媒としては、苛性ソーダ水溶液とエンドトキシンフリー水を混合して調製した、０．１〜３Ｎ程度の苛性ソーダ水溶液を用いることができる。この苛性ソーダ水溶液を湯浴等で６０〜９０℃程度に加熱して、その１ｋｇに対して、上記（１）の強アルカリを用いた脱アセチル化工程の結果得られたキトサンを４０〜１００ｇ程度を投入し、更に３０〜１００ｍｌ程度の１０〜３０％過酸化水素水を加え、撹拌しながら０．１〜２時間程度保温する。これにより、重量平均分子量（Ｍｗ）が1５〜７５ｋＤａ程度である低分子量キトサンとなる。

なお、過酸化水素を用いた低分子量化工程は、上記の態様に限られるものではなく、キトサンを過酸化水素で処理することにより、重量平均分子量（Ｍｗ）が1５〜７５ｋＤａ程度である低分子量キトサンとなる工程であれば、本発明に適用できる。

本発明においては、上記工程を経ることにより得られる低分子量キトサンの重量平均分子量（Ｍｗ）が４５〜６０ｋＤａであり、かつ数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）が２〜４であることがより好ましく、上記低分子量キトサンの重量平均分子量（Ｍｗ）が４５〜６０ｋＤａであり、かつ数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）が２．５〜３．８であることが更に好ましい。重量平均分子量（Ｍｗ）及び数平均分子量（Ｍｎ）は、プルランを標準物質とし、サイズ排除クロマトグラフィーで測定することができる。

本発明の製造方法によって得られた低分子量キトサンは、これをエンドトキシンフリー水に分散した後、塩酸でｐＨ５．０程度に調整して溶解した後、０．１Ｎ苛性ソーダでｐＨ６．５程度に調整後、凍結乾燥を行い、低分子量キトサン粉末とすることが好ましい。
これによれば、水、中性の緩衝液に容易に溶解するキトサン塩とすることができる。また、塩酸以外の各種無機酸、有機酸も塩酸の代わりに用いることができる。

本発明の製造方法によって得られた低分子量キトサンの品質は、常法に従い、ルシフェラーゼ等のタンパク質を発現させるためのプラスミドを、適当な培養細胞に遺伝子導入し、その発現効率を求めることによって確認することができる。

その導入の際、プラスミド−低分子量キトサン複合体の形成は、両者の溶液を０〜５０℃で１０分〜２４時間、好ましくは２０〜３０℃で１〜４時間混合することにより得ることができる。この時の両者の混合の比率は、プラスミド１塩基：低分子量キトサン中のグルコサミン単位＝１：２〜１：２０とすることが好ましく、１：５〜１：１０とすることがより好ましい。なお、両者の溶媒としては、滅菌された超純水、緩衝液等が好ましく用いられる。

本発明の製造方法によって得られた低分子量キトサンの品質は、そのエンドトキシン濃度によっても確認することができる。エンドトキシン濃度としては、０〜１０００（ＥＵ/ｇ）であることが好ましく、０〜１００（ＥＵ/ｇ）であることがより好ましい。

以下に例を挙げて本発明について更に具体的に説明する。なお、これらの例は本発明の範囲を限定するものではない。

＜実施例１＞
カニ殻由来のキチンを原料として、下記工程により、低分子量キトサンの調製を行った。

（１）脱アセチル化工程
４８％苛性ソーダ１kgを湯浴で加熱して８０±２℃とし、キチンＴＣＬ（甲陽ケミカル株式会社製）１００ｇを投入し、撹拌しながら８０±２℃で４時間保温した。

（２）洗浄工程その１
脱アセチル化したキチン（キトサン）をエンドトキシンフリー水（大塚製薬社製）で洗浄した後、３３０メッシュ（開口４５μｍ）で固液分離を行い、洗浄水のｐＨが９以下になるまで同じ操作を繰り返した。水洗浄後のキトサンは、１Lのエタノールに分散・固液分離して脱水後、真空乾燥を行い、８４．３ｇのキトサンを得た。

（３）低分子化工程
洗浄したキトサン８０ｇ、エンドトキシンフリー水１，１２０ｍｌ、４８％苛性ソーダ１１．２ｇを混合し、湯浴で加熱して８０±３℃とする。次いで６４ｍｌの３０％過酸化水素水を加え、８０±３℃で１時間保温した。

（４）洗浄工程その２
低分子化したキトサンをエンドトキシンフリー水で洗浄した後、３３０メッシュで固液分離を行い、洗浄水のｐＨが９以下になるまで同じ操作を繰り返した。水洗浄後のキトサンは、１Lのエタノールに分散・固液分離して脱水後、真空乾燥を行い、６４．０ｇの低分子量キトサンを得た。

（５）粉末化工程
洗浄した低分子量キトサン１０ｇを９０ｍｌのエンドトキシンフリー水に分散した後、塩酸でｐＨ５．０に調整して溶解した。更に０．１Ｎ苛性ソーダでｐＨ６．５に調整後、凍結乾燥を行い、１０．２ｇの低分子量キトサン粉末を得た。

＜比較例１＞
カニ殻由来のキトサンを原料として、ゲル濾過分画法による下記の方法で、低分子量キトサンの調製を行った。

キトサンＬＬ（焼津水産化学工業社製）１ｇを、４５０ｍｌの水に分散し、１Ｎ塩酸５０ｍｌを加えて溶解した。この液に、０．２５ｇの塩化ナトリウムを添加、溶解後１．０μｍのメンブレンフィルターでろ過し、キトサン溶液とした。

上記キトサン溶液２５ｍｌを、移動相で平衡化したゲルろ過カラム(ＴｏｙｏｐｅａｒｌＨＷ-５５Ｆ(東ソー株式会社製)φ４０×１０００ｍｍ、移動相：０．５％塩化ナトリウムを含む０．１Ｎ塩酸)に供し、分画を行った。

得られた各画分に対しＨＰＬＣによる分子量分析を行い、ピークトップ分子量が、４０〜６０ｋＤａとなっている画分を回収し、透析チューブ（シームレスセルロースチューブ、ＭＷＣＯ１２，０００〜１６，０００、和光純薬工業株式会社製）に入れ、水に対して透析し脱塩した。得られた脱塩液を凍結乾燥し粉末とした。

＜比較例２＞
比較例１と同じ方法で、製造バッチの異なる低分子量キトサン粉末を調製した。

＜試験例１＞低分子量キトサン粉末の分子量測定
０．４５μｍの分析カラムは、ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＰＷ_ＸＬ（東ソー社製）とＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＰＷ_ＸＬ（東ソー社製）を連結し使用した。移動相は、５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸を用い、流量０．８ｍｌ／ｍｉｎで分析した。また、カラム温度は４０℃とし、示差屈折計で検出し、試料の分子量を測定した。
重量平均分子量、数平均分子量は常法に従い、保持時間１５分から２５分までのキトサンのピークについて計算を行った。

その結果を、まとめて下記表１に示す。

＜試験例２＞低分子量キトサン粉末の遺伝子導入活性測定
実施例１、比較例１、及び比較例２の低分子量キトサン粉末について、下記方法で遺伝子導入活性の測定を行った。

（１）２４穴ｐｌａｔｅへの細胞の接着
７０％コンフルエントの細胞（ＣＯＳ７細胞）をトリプシン処理によってはがし、ＤＭＥＭＦＢＳ（＋）培地に懸濁した。細胞懸濁液５０μｌを取り、これにトリパンブルー５０μｌを加えて染色した。染色した細胞の数をヘモサイトメーターによって測定し、懸濁液の濃度を求めた。２４穴プレートの各ウェルにＤＭＥＭＦＢＳ（＋）培地０．５ｍｌを加えて 8×10⁴個の細胞を播き、24時間培養して細胞を接着させた。

（２）キトサン溶液、及びプラスミド溶液の調製
３．０３ｍｇ／ｍｌになるようにキトサンを精秤し、予め１ＮのＨＣｌでｐＨ６．５に調整したＰＢＳ（−）を所定量加え、３７℃、１２０ｒｐｍで一晩振盪した。これを０．２２μｍのメンブレンフィルターで濾過滅菌してキトサン溶液を調製した。プラスミド溶液は、ルシフェラーゼ遺伝子のプラスミドを純水で、１ｍｇ／ｍｌの濃度となるように調製した。

（３）トランスフェクション
所定量のプラスミド溶液及びキトサン溶液をそれぞれｐＨ６．５に調整した１０ｍＭＭＯＰＳＰＢＳ（−）溶液で希釈して１５分間以上インキュベートし、プラスミド溶液とキトサン溶液をＮ／Ｐ比（キトサンのアミノ基とプラスミドのリン酸基との比）が５となるように混合してさらに１５分間インキュベートすることによりプラスミド／キトサン複合体溶液を調製した。

細胞が接着した２４穴プレートから培地を除去し、ＤＭＥＭｐＨ６．５ＦＢＳ（＋）培地４５０μｌ、複合体溶液５０μｌを加えてトランスフェクションさせた。トランスフェクションは１サンプルあたり３ｗｅｌｌずつ行った。４時間後培地を吸い取り、ＤＭＥＭＦＢＳ（＋）培地を０．５ｍｌ加えて２４時間培養した。

（４）測定
２４穴プレートの培地を吸い取り、ＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、細胞溶解用溶液「Ｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｌｙｓｉｓｒｅａｇｅｎｔ」（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）１００μｌを加えて細胞を溶解させた。溶液をよくピペッティングし、ウェル毎にエッペンドルフチューブに回収した。これを４℃、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ルシフェリン溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）１００μｌと上清２０μｌを測定用チューブに入れて軽く混合し、ルミノメーター（ＴＤ−２０／２０Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ、ＴＵＲＮＥＲＤＥＳＩＧＮＳ）で測定を行った。

（５）補正
なお、ルシフェラーゼ発現活性の結果を細胞固有のタンパク質量で補正するため、ルシフェラーゼアッセイに用いた細胞溶解液のタンパク量をプロテインアッセイ（Ｌｏｗｒｙ法）によって測定して、前記ルミノメーターでの測定値をその値で除した値を用いて遺伝子導入活性を求めた。

遺伝子導入活性の結果を、まとめて下記表１に示す。なお、遺伝子導入活性は、比較例２を１００％としてその相対活性として示した。

＜試験例３＞低分子量キトサン粉末のエンドトキシン測定
標準品はエンドトキシン標準品ＣＳＥ−Ｌセット（生化学バイオビジネス株式会社製）を用いた。試料は、注射用水（大塚製薬社製）に溶解し適宜希釈したものを使用した。試薬はエンドスペシーＥＳ−２４Ｓ（生化学バイオビジネス株式会社製）セットとトキシカラーＤＩＡ−ＭＰセット（生化学バイオビジネス株式会社製）を使用し、エンドトキシンを定量した。

その結果を、まとめて下記表１に示す。

以上から、比較例１、２では、エンドトキシンが顕著に混入していた。これは、キトサンを原料にしたことが原因であると考えられた。それに対し、実施例１では、エンドトキシンがほとんど検出されずに、エンドトキシンフリーの状態を保っていた。また、比較例１ではＭｗ／Ｍｎの値が４を超え、また、比較例２ではＭｗの値が６０ｋＤａを超えており、実施例１が示すほどの遺伝子導入活性は得られなかった。これは、キトサンの分子量が所定の重量平均分子量の範囲でそろっているためにプラスミドと安定な複合体を形成し、細胞に取り込まれやすくなったことが一因として考えられた。

Claims

遺伝子導入用キャリアーとして用いられる低分子量キトサンの製造方法であって、キチンを原料とし、
（１）強アルカリを用いた脱アセチル化工程と、
（２）エンドトキシンフリー水による洗浄工程と、
（３）過酸化水素を用いた低分子量化工程とを含み、
重量平均分子量（Ｍｗ）が４５〜６０ｋＤａであり、かつ数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）が２〜４であり、エンドトキシン濃度が０〜１０００（ＥＵ/ｇ）である低分子量キトサンを得ることを特徴とする低分子量キトサンの製造方法。