JP5560472B2

JP5560472B2 - インフルエンザウイルス感染症の治療剤

Info

Publication number: JP5560472B2
Application number: JP2011535462A
Authority: JP
Inventors: 直幸守屋; ▲祐▼生子守屋; 安弘二川; 太見子西野; 妃里草野; 忠昭宮崎
Original assignee: Aureo Co Ltd
Current assignee: Aureo Co Ltd
Priority date: 2009-10-08
Filing date: 2010-10-07
Publication date: 2014-07-30
Anticipated expiration: 2030-10-07
Also published as: EP2486931A1; US20120202771A1; TWI496578B; US20140199346A1; EP2486931B1; JPWO2011043435A1; WO2011043435A1; EP2486931A4; TW201119661A

Description

本発明は、インフルエンザウイルス感染症の治療剤に関するものである。

インフルエンザウイルス感染症は、のどの痛み、鼻汁、高熱、頭痛、関節痛等の症状を呈し、気管支炎、肺炎等を併発して重症化することもあり、特に高齢者などでは死亡率も高くなる。また、学校や高齢者施設等における集団感染により多くのヒトを巻き込んで社会的流行を引き起こす。

インフルエンザウイルス感染症への対策は、従来、ワクチン接種による予防が基本であった。しかしながら、インフルエンザウイルスの抗原性が変異しやすく、ワクチンのみによってその流行を完全に制圧することは困難であった。また、ワクチンを短期間に大量生産することが困難であり、新型インフルエンザウイルスの出現や、流行株の予測が外れた場合等には対応できないという問題があった。

このような問題に対して、近年、オセルタミビル（商品名「タミフル」、中外製薬株式会社）、アマンタジン（商品名「シンメトレル」、ノバルティスファーマ株式会社）、ザナミビル（商品名「リレンザ」、グラクソ・スミスクライン社）等の抗インフルエンザウイルス薬が用いられるようになっている。しかしながら、発症後４８時間以内に服用しなければより有効な効果が期待できずに使い勝手が悪かったり、因果関係が明確でないものも含め副作用があったり、耐性をもったウイルスが出現したりするなどの問題が指摘されている。

一方、下記特許文献１には、アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する菌を培養して得られるβ−１，３−１，６−グルカンを含む培養物を、免疫賦活剤の有効成分として用いることが記載されている。

特開２００５−２２００６５号公報

従来、天然物由来の有効成分を利用する抗ウイルス用組成物はその有効性が十分とはいえなかった。

本発明の目的は、天然物由来の有効成分を利用するインフルエンザウイルス感染症の治療剤であって、優れた効果を有するものを提供することにある。

本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物の培養物から得られるβ−グルカン含有組成物を有効成分として含有し、インフルエンザウイルス感染症の重症化を抑制し、治癒を促進するために用いられるものであることを特徴とするインフルエンザウイルス感染症の治療剤。
［２］前記アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物は、アウレオバシジウムプルランスＭ−１（Aureobasidium pullulans M-1）（FERM BP-08615）又はアウレオバシジウムプルランスＭ−２（Aureobasidium pullulans M-2）（FERM BP-10014）である上記［１］記載のインフルエンザウイルス感染症の治療剤。
［３］更に、乳酸菌の菌体を有効成分として含有する上記［１］又は［２］記載のインフルエンザウイルス感染症の治療剤。
［４］前記乳酸菌の菌体がエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の死菌体である上記［３］記載のインフルエンザウイルス感染症の治療剤。
［５］インフルエンザノイラミニダーゼ阻害剤、抗ウイルス剤、抗生物質、及びステロイド剤からなる群から選ばれた少なくとも１種と組み合わせて投与されることを特徴とする上記［１］〜［４］のいずれか１つに記載のインフルエンザウイルス感染症の治療剤。

本発明のインフルエンザウイルス感染症の治療剤によれば、インフルエンザウイルス感染症の重症化を抑制し、治癒を促進することができる。その有効成分は、アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物の培養物から得られるβ−グルカン含有組成物であるので、長期間摂取しても副作用のおそれがなく、簡便な摂取形態でも安心して、その優れた効果を享受できる。また、乳酸菌の菌体を併用することにより、より効果が高められる。更に、インフルエンザノイラミニダーゼ阻害剤、抗ウイルス剤、抗生物質、及びステロイド剤からなる群から選ばれた少なくとも１種と組み合わせて投与することにより、より効果が高められる。

インフルエンザウイルスを感染させたマウスに対してアウレオバシジウムプルランスＭ−１の培養液を投与したときのマウス体重変動の結果（試験群１）を示す図表である（試験例１）。インフルエンザウイルスを感染させたマウスに対して抗インフルエンザ薬のオセルタミビル（商品名「タミフル」、中外製薬株式会社）を投与したときのマウス体重変動の結果（試験群２）を示す図表である（試験例１）。インフルエンザウイルスを感染させたマウスに対してリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を投与したときのマウス体重変動の結果（対照群１）を示す図表である（試験例１）。インフルエンザウイルスを感染させたマウスに対してアウレオバシジウムプルランスＭ−１の培養液を投与したときのマウス体重変動の結果（試験群３）を示す図表である（試験例２）。インフルエンザウイルスを感染させたマウスに対してアウレオバシジウムプルランスＭ−２の培養液を投与したときのマウス体重変動の結果（試験群４）を示す図表である（試験例２）。インフルエンザウイルスを感染させたマウスに対してアウレオバシジウムプルランスＭ−１の培養液とエンテロコッカス・フェカリスの加熱殺菌菌体とを併用投与したときのマウス体重変動の結果（試験群５）を示す図表である（試験例２）。インフルエンザウイルスを感染させたマウスに対してアウレオバシジウムプルランスＭ−１の培養液と抗インフルエンザ薬のオセルタミビル（商品名「タミフル」、中外製薬株式会社）とを併用投与したときのマウス体重変動の結果（試験群６）を示す図表である（試験例２）。インフルエンザウイルスを感染させたマウスに対して抗インフルエンザ薬のオセルタミビル（商品名「タミフル」、中外製薬株式会社）を投与したときのマウス体重変動の結果（試験群７）を示す図表である（試験例２）。インフルエンザウイルスを感染させたマウスに対してリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を投与したときのマウス体重変動の結果（対照群２）を示す図表である（試験例２）。試験例２の試験期間中の各試験群のマウス生存率の推移を示す図表である。インフルエンザウイルスを感染させたマウスに対してアウレオバシジウムプルランスＭ−２の培養液とエンテロコッカス・フェカリスの加熱殺菌菌体とを併用投与したときのマウス体重変動の結果（試験群８）を示す図表である（試験例３）。インフルエンザウイルスを感染させたマウスに対してアウレオバシジウムプルランスＭ−２の培養液とエンテロコッカス・フェカリスの加熱殺菌菌体とを併用投与したときのマウス体重変動の結果（試験群９）を示す図表である（試験例３）。インフルエンザウイルスを感染させたマウスに対してアウレオバシジウムプルランスＭ−２の培養液とエンテロコッカス・フェカリスの加熱殺菌菌体とを併用投与したときのマウス体重変動の結果（試験群１０）を示す図表である（試験例３）。インフルエンザウイルスを感染させたマウスに対してアウレオバシジウムプルランスＭ−２の培養液とエンテロコッカス・フェカリスの加熱殺菌菌体とを併用投与したときのマウス体重変動の結果（試験群１１）を示す図表である（試験例３）。インフルエンザウイルスを感染させたマウスに対してエンテロコッカス・フェカリスの加熱殺菌菌体を投与したときのマウス体重変動の結果（試験群１２）を示す図表である（試験例３）。インフルエンザウイルスを感染させたマウスに対してリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を投与したときのマウス体重変動の結果（対照群３）を示す図表である（試験例３）。試験例３の試験期間中の各試験群のマウス生存率の推移を示す図表である。試験例４の各試験群のマウス肺中のウイルス力価を示す図表である。試験例５の各試験群のマウス肺中の生細胞に対するＮＫ細胞の割合を示す図表である。試験例５の各試験群のマウス肺中のＮＫ細胞に対する活性化したＮＫ細胞の割合を示す図表である。試験例５の各試験群のマウス肺中の生細胞に対するＴ細胞の割合を示す図表である。試験例５の各試験群のマウス肺中のＴ細胞に対する活性化したＴ細胞の割合を示す図表である。

本発明は、アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物の培養物から得られるβ−グルカン含有組成物（以下、「アウレオバシジウム由来β−グルカン含有組成物」という。）を有効成分として含有する。このアウレオバシジウム由来β−グルカン含有組成物としては、アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属し、β−グルカン生産能を有する微生物（以下、「アウレオバシジウム微生物」という。）を培養した培養物そのもの、遠心分離等により菌体を分離除去した培養液、その培養液の濃縮液、その培養液の希釈液、あるいはその培養液から水分を除いた固形物等だけでなく、これらを脱塩等してβ−グルカンの含有量を高めたもの、あるいは、これらからβ−グルカンを精製したものも含まれる。

本発明において用いられる上記アウレオバシジウム由来β−グルカン含有組成物は、上記アウレオバシジウム微生物を培養することにより生産されるβ−グルカンを、該培養物の質量１００ｇに対する含有量に換算して、５０〜３，０００ｍｇ含有するものであることが好ましく、１００〜２，０００ｍｇ含有するものであることがより好ましい。

なお、β−グルカンの含有量の決定は、例えば次のような方法で行うことができる。すなわち、培養液にアミラーゼ、アミログルコシダーゼ、プロテアーゼ等を用いて酵素処理を施し、蛋白質や、プルラン等のα−グルカンを除き、エタノール沈殿を行う。更に、ガラスフィルターでろ過し、高分子試料を得る。このとき、単糖を含む低分子物質を除くため、８０％エタノールで充分に洗浄する。洗浄した高分子試料はアセトンで更に洗浄し、硫酸を加え、加水分解を行う。加水分解後、中和し、そのろ液を採取して、グルコースオキシダーゼ法によりブドウ糖を定量し、下記数式１に基づいて計算した値をβ−グルカン量とする。
数式１：β−グルカン（ｇ／１００ｇ）＝ブドウ糖（ｇ／１００ｇ）×０．９

また、β−グルカンの含有量の決定は、いわゆる糖鎖含有高分子物質（多糖）量として決定することもできる。この場合は、培養液にアミラーゼ、アミログルコシダーゼ、プロテアーゼ等を用いて酵素処理を施し、蛋白質や、プルラン等のα−グルカンを除き、エタノール沈殿を行う。更に、ガラスフィルターでろ過し、高分子試料を得る。このとき、単糖を含む低分子物質を除くため、８０％エタノールで充分に洗浄する。洗浄した高分子試料はアセトンで更に洗浄したものの重量を測定することで糖鎖含有高分子物質（多糖）量とする。

なお、このようにして定量されるβ−グルカンは、硫酸基、リン酸基等の官能基を有するものとして定量される。したがって、このように広義の糖鎖含有高分子物質（多糖）としてβ−グルカンを定量した場合には、上記アウレオバシジウム微生物を培養することにより生産されるβ−グルカンの含有量は、該培養物の質量１００ｇに対する含有量に換算して、７０〜５，０００ｍｇ含有するものであることが好ましく、１４０〜３，０００ｍｇ含有するものであることがより好ましい。

本発明において用いられる上記アウレオバシジウム微生物としては、アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属し、β−グルカン生産能を有する微生物であればよいが、例えば、アウレオバシジウムプルランスＭ−１（Aureobasidium pullulans M-1、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、受託番号FERM BP-08615、2004年2月10日国際寄託）や、アウレオバシジウムプルランスＭ−２（Aureobasidium pullulans M-2、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、受託番号FERM BP-10014、2004年4月22日国際寄託）が好適に用いられる。なお、これらの菌株が産生するβ−グルカンは、ＮＭＲ測定（13CNMR :Varian社UNITY INOVA500型、1HNMR : Varian社UNITY INOVA600型）による構造解析で、グルコースがβ−１，３結合した主鎖からβ−１，６結合でグルコースが分岐した構造を有するβ−１，３−１，６−グルカンであることが明らかとなっている。

上記アウレオバシジウム微生物の培養は、公知の方法（特開昭５７−１４９３０１号公報等参照）に準じて行うことができる。すなわち、炭素源（ショ糖）０．５〜５．０質量％、Ｎ源０．１〜５．０質量％、その他微量物質（例えば、ビタミン類、無機質）を加えた培地（ｐＨ５．２〜６．０）に菌を接種し、温度２０〜３０℃で２〜１４日間通気培養、好ましくは通気撹拌培養すればよい。β−グルカンが生成されるにしたがって培養液の粘度が上昇し、粘性の高いジェル状になる。このようにして得られる培養液には、通常、０．６〜１０質量％の固形分が含まれており、該固形分中にはβ−グルカンが５〜８０質量％含まれている。また、β−グルカン以外にも、例えば、該グルカンの作用を助ける成分であるリン、カリウム、マグネシウム、ビタミンＣ等の他の有用成分も含まれているので、β−グルカンの有する生理活性効果を効率よく発揮できる。

本発明においては、上記の培養によって得られる培養物をそのまま加熱又は加圧加熱殺菌して用いてもよく、遠心分離等により菌体を分離除去した後、この培養液を殺菌して用いてもよい。また、必要に応じて濃縮したもの、更には乾燥したものを用いることもできる。更に、β?グルカンのみを抽出して用いることもできる。なお、アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物の培養物は、増粘安定剤等の食品添加物として使用されているものであり安全性が高い。

その適用の方法としては、経口用に製されたものは、例えば、これを経口的に摂取して体内からその生理活性効果を発揮させることができる。

投与すべき量は、治療目的又は予防目的のちがい、症状の強弱、患者の年齢・投与方法・投与回数・投与時期などによって適宜決定することができる。一般的な有効投与量を例示すれば、例えば、経口的に摂取する場合には、β−グルカン量換算で１日およそ０．０６〜６０ｍｇ／ｋｇ（体重）の量で摂取する。本発明のインフルエンザウイルス感染症の治療剤は、インフルエンザウイルスに感染した後に引き起こされる合併症の予防および治療のためにも有効である。例えば、中耳炎・副鼻腔炎・気管支炎・慢性気管支炎増悪・肺炎・脳症・腎不全などがあげられるが、所謂サイトカインストームに起因する疾患や、組織破壊性疾患（ＴＨ１亢進に起因する疾患）の予防に特に有効である。

本発明のインフルエンザウイルス感染症の治療剤は、上記アウレオバシジウム培養物以外の有効成分として、更に、乳酸菌の菌体を含有するものであってもよい。これによれば、乳酸菌の生理活性効果との相乗作用を期待できる。

乳酸菌としては、食品に使用可能な乳酸菌などであって安全性に問題がないものを用いる。具体的には、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ブレービス（Lactobacillus brevis）、ストレプトコッカス・クレモリス（Streptococcus cremoris）、ストレプトコッカス・ラクティス（Streptococcus lactis）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium Longum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）等が例示できる。上記乳酸菌は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。

なお、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）は乳酸菌製剤等に用いられている乳酸菌であり、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）は、チーズ、発酵乳、ヨーグルト、乳酸菌飲料等に用いられている乳酸菌であり、ストレプトコッカス・クレモリス（Streptococcus cremoris）、ストレプトコッカス・ラクティス（Streptococcus lactis）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）は、チーズ、ヨーグルト等に用いられている乳酸菌であり、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium Longum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）は発酵乳等に用いられている乳酸菌である。したがって、これらの乳酸菌は、いずれも当業者が容易に入手できるものである。

また、乳酸菌は生菌に限らず加熱殺菌した死菌体であってもよい。死菌体を用いた場合には、保存安定性が高くなり、医薬品や機能性食品の原料として用いる場合の安全性も高くなる。このような乳酸菌の死菌体としては、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、ラクトバチルス・ブレービス・サブスピーシズ・コアグランス（Lactobacillus brevis subspecies coagulans）の死菌体が市販されており、好ましく使用できる。

上記乳酸菌の培養は常法にしたがって行えばよい。また、死菌体は、上記乳酸菌の培養物から、濾過、遠心分離等の方法により菌体を回収し、水洗後、水等に懸濁して８０〜１１５℃、３０分〜３秒間加熱殺菌すればよい。加熱殺菌した乳酸菌は、必要に応じて濃縮、乾燥してから用いてもよい。

上記乳酸菌の投与すべき量は、治療目的又は予防目的のちがい、症状の強弱、患者の年齢・投与方法・投与回数・投与時期などによって適宜決定することができる。一般的な有効投与量を例示すれば、例えば、経口的に摂取する場合には、乾燥死菌体量換算で１日およそ１×１０^９〜４×１０^１１個／ｋｇ（体重）、より好ましくは２×１０^９〜１×１０^１１個／ｋｇ（体重）の量で摂取する。

本発明においては、上記の乳酸菌の中でも、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の死菌体が特に好ましく用いられる。エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の死菌体は、強い免疫賦活活性を有していることが知られており、上記アウレオバシジウム培養物と併用することにより、抗インフルエンザウイルス効果においてもそれらの相乗効果を期待できる。

本発明においては、その投与の一形態として、インフルエンザノイラミニダーゼ阻害剤、抗ウイルス剤、抗生物質、及びステロイド剤からなる群から選ばれた少なくとも１種と組み合わせて投与することもできる。これによれば、これらの薬の抗インフルエンザウイルス効果との相乗効果を期待できる。インフルエンザノイラミニダーゼ阻害剤としては、オセルタミビル、ザナミビルが好ましく例示できる。抗ウイルス剤としては、アマンタジンが好ましく例示できる。抗生物質としては、クラリスロマイシン、セファクロル、セフジニル、セフポドキシムプロキセチル、塩酸セフォチアム、セフカペンピボキシル塩酸塩、セフジトレンピボキシル、セフメタゾールナトリウム、塩酸セフォチアム、塩酸セフォゾプラン、塩酸ピブメシリナム、スルタミシリントシル酸塩、ホスホマイシンカルシウム、硫酸イセパマイシン、ゲンタマイシン硫酸塩、カナマイシン一硫酸塩が好ましく例示できる。ステロイド剤としては、メチルプレドニゾロンが好ましく例示できる。

本発明において、その投与の一形態として、インフルエンザノイラミニダーゼ阻害剤、抗ウイルス剤、抗生物質、及びステロイド剤からなる群から選ばれた少なくとも１種と組み合わせて投与する場合には、それらの抗ウイルス剤を、それぞれの抗ウイルス剤にとって好適な態様で投与しつつ、アウレオバシジウム培養物を投与すればよい。この場合、アウレオバシジウム培養物は、特に目立った副作用を示すことがないので、これを比較的長い期間継続的に投与しつつ、上記抗ウイルス剤を比較的短期間併用して投与することもできる。

以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

［製造例１］
下記のようにしてアウレオバシジウムプルランスＭ−１（Aureobasidium pullulans M-1）（FERM BP-08615）の培養液を調製した。

前培養液を、ショ糖１％、アスコルビン酸０．１％、米糠０．１％を含む液体培地（ｐＨ５．３）に適量接種して、２５℃、７２〜９６時間（製造バッチによって異なる）、通気撹拌培養を行った。培養終了後、この培養液を１２１℃、１５分間殺菌した。得られた殺菌後の培養液は、固形分およそ１．２質量％を含み、該固形分１００ｇ中のβ-グルカン含量は１６．７ｇであった。また、培養液そのものの質量１００ｇ中に含まれる含有量に換算して、０．２ｇ／１００ｇ含有するものであった。この培養液を以下の試験に用いた。

［試験例１］
下記表１に記載の各試験群及び対照群についてそれぞれ試験液を準備し、これらの経口投与がインフルエンザウイルスを感染させたマウスに対してどのような効果を示すかを調べた。なお、抗インフルエンザ薬であるオセルタミビルとしては、「タミフルドライシロップ３％」（商品名、中外製薬株式会社）を利用した。

実験動物としてはマウス（C57BL/6NJcl系統、雄、６週齢）を用い、インフルエンザウイルスとしてはＨ１Ｎ１亜型インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８を使用した。マウスへのインフルエンザウイルスの感染は次のようにして行った。すなわち、イソフルランを充満させた容器にマウスを入れ、呼吸がゆっくりになるのを確認してから取り出し、ウイルス力価が２×１０^４ｐｆｕ／ｍＬになるようにＰＢＳにて段階希釈して調製した希釈ウイルス液をマウスの両鼻から交互にマイクロピペットで５０μＬ（１，０００ｐｆｕ／匹）を注入した。麻酔から醒めたのを確認して飼育ゲージに戻した。

下記表２に示す形態・方法で試験液の投与を行った。なお、アウレオバシジウム培養液（試験群１）については試験期間中毎日、ゾンデ法により１日１回２００μＬを経口投与し、抗インフルエンザ薬であるオセルタミビル（試験群２）については、その投与方法としてもっとも効果的であるとされている方法（「DIRK B. MENDEL et al., ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, Mar. 1998, p.640-646」参照）に準じて、ウイルス感染後の５日間、ゾンデ法により１日２回の経口投与を行なった（朝晩１回２００μＬずつ）。ウイルス感染後のマウスの体重を毎日測定し、体重の推移と生存率を求めた。

その結果を試験群１について図１に、試験群２について図２に、対照群１について図３にそれぞれ示す。

図１のとおり、試験群１の生存率は１００％であった。感染後、１匹は感染時の体重を下回ることなく１４日後の試験終了時には感染初日と比して５％増加していた。他の１匹については、感染後およそ７日以降体重の減少がはじまり、その３日後の感染１０日目に最大約１５％の体重減少がみられたが以後体重は回復し、感染初日と同じ体重で試験を終えた。他のもう１匹については、感染後５日もしくは６日から体重の減少がはじまったが、その２日後の感染８日目に最大約６％の体重減少がみられ、以後体重は回復し、感染初日と同じ体重で試験を終えた。

図２のとおり、試験群２の生存率は１００％であった。感染後、１匹は感染時の体重を下回ることなく１４日後の試験終了時には感染初日と比して５％増加していた。他の１匹については、感染後およそ６日以降体重の減少がはじまり、その３日後の感染９日目に最大約２０％の体重減少がみられたが以後体重は回復し、感染初日と同じ体重で試験を終えた。他のもう１匹については、感染後５日から体重の減少がはじまったが、その４日後の感染９日目に最大約２５％の体重減少がみられ、以後体重は回復し、感染初日と比して３％体重が減少して試験を終えた。

図３のとおり、対象群１の生存率は６６．６％（３匹中１匹死亡）であった。感染後、１匹は７日目から顕著な体重減少がはじまり、体重は回復することなく、感染後１２日目に死亡した。他の１匹については、感染後４日以降体重の減少がはじまり、その５日後の感染後９日目に最大約２８％の体重減少がみられたが以後体重は回復し、感染初日と比して６％体重が減少して試験を終えた。他のもう１匹については、感染後５日から体重の減少がはじまったが、感染後１１日目から感染後１４日目にあたりで、最大約２８％の体重減少がみられ、感染後１４日目に若干の体重回復があり試験を終えた。

以上の結果をまとめると、アウレオバシジウム培養液の投与により、インフルエンザウイルス感染による症状としてのマウスの体重減少が抑制され、また、その体重減少から回復が促進された。そしてその効果は抗インフルエンザウイルス薬であるオセルタミビル（商品名「タミフル」、中外製薬株式会社）と同等あるいはそれ以上であった。したがって、アウレオバシジウム属に属する微生物の培養物から得られるβ−グルカン含有組成物が、インフルエンザウイルス感染症の治療、特にウイルス感染後の重症化を抑制し、治癒を促進する治療のために有効であることが明らかとなった。

アウレオバシジウム由来β−グルカン含有組成物がどのようなメカニズムで効果を発揮しているかは明らかではないが、マクロファージ貪食能活性化など免疫賦活による作用のみならず、体に備わる免疫バランス機能を高めて、例えばＴｈ１細胞系免疫とＴｈ２細胞系免疫とのバランスを保ち、過剰な免疫反応が不必要に自己組織を攻撃してしまうことを抑えていることによることが考えられた。

［製造例２］
製造例１と同様にして、アウレオバシジウムプルランスＭ−２（Aureobasidium pullulans M-2）（FERM BP-10014）の培養液を調製した。その培養液は、固形分およそ１．２質量％を含み、該固形分１００ｇ中のβ?グルカン含量は５４．２ｇであった。また、培養液そのものの質量１００ｇ中に含まれる含有量に換算して、０．６５ｇ／１００ｇ含有するものであった。この培養液を以下の試験に用いた。

［試験例２］
下記表３に記載のように、各試験群及び対照群についてそれぞれ試験液を準備し、これらの経口投与がインフルエンザウイルスを感染させたマウスに対してどのような効果を示すかを調べた。なお、表中のＥＦ乳酸菌死菌体は、市販のエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱殺菌菌体粉末である。

実験動物のマウスへのインフルエンザウイルスの感染は、ウイルス力価が試験例1の２倍になるように行った。すなわち、希釈ウイルス液４×１０^４ｐｆｕ／ｍＬをマウスの両鼻から交互にマイクロピペットで５０μＬ（２，０００ｐｆｕ／匹）を注入した以外は、試験例１と同様にして行った。

各試験液の投与は下記表４に示す形態・方法で行った。すなわち、試験群３〜５、対照群２については試験期間中毎日、ゾンデ法により１日１回試験液２００μＬを経口投与した。アウレオバシジウム培養液とオセルタミビルとを併用する試験群６においては、試験例1の試験群２と同様に、オセルタミビルの効果的な投与を行うため、ウイルス感染後の５日間、アウレオバシジウム培養液にオセルタミビルを懸濁させたものを１日２回（朝晩１回２００μＬずつ）経口投与し、それ以外の期間はアウレオバシジウム培養液のみを１日１回２００μＬ経口投与した。また、オセルタミビルを単独で投与する試験群７においては、オセルタミビル単独での最大の効果と比較するため、ウイルス感染後の１７日間継続して毎日（朝晩１回２００μＬずつ）経口投与した。

ウイルス感染後のマウスの体重を毎日測定し、体重の推移と生存率を求めた。

その結果を試験群３について図４に、試験群４について図５に、試験群５について図６に、試験群６について図７に、試験群７について図８に、対照群２について図９にそれぞれ示す。また、図１０には各群のマウスの生存率の推移を示す。

この試験例２では、ウイルス力価が試験例1の２倍になるようにマウスへの感染を行った結果、ＰＢＳを投与した対照群２（図９）では、感染後１０日目までに４匹とも死亡した（図１０）。

また、アウレオバシジウム培養液を投与した試験群３（図４）及び試験群４（図５）でも、試験群３及び４にわたるマウス総数１０匹のうち４匹（４０％）が試験期間中に死亡した（図１０）。また、試験群３（図４）では５匹中４匹に、試験群４（図５）では５匹中３匹に最大約４１％の体重減少がみられ、体重減少のあったマウスは、死亡するか、又はほとんど体重を回復しないまま試験を終えた。

更に、オセルタミビルを投与した試験群７（図８）でも、４匹中４匹に最大約３４％の体重減少がみられ、４匹中２匹（５０％）が試験期間中に死亡した（図１０）。

これに対して、図７に示されるように、アウレオバシジウム培養液とオセルタミビルとを併用した試験群６では、ウイルス感染後６〜９日の間４匹中全てに体重減少が見られたものの、４匹中死亡した１匹（２５％）を除いて、最大約２５％の体重減少にとどまり、その後正常レベルにまで回復した。また、アウレオバシジウム培養液と乳酸菌の加熱殺菌菌体粉末とを併用した試験群５でも同様の傾向がみられた。すなわち、試験期間中に４匹中死亡したのは１匹（２５％）のみであり、ウイルス感染後３〜１０日の間４匹中３匹に体重減少が見られたものの、死亡した１匹を除いて、その後正常レベル近くにまで顕著に回復した。

以上から、アウレオバシジウム由来β−グルカン含有組成物が、インフルエンザウイルス感染症の治療、特にウイルス感染後の重症化を抑制し、治癒を促進する治療のために有効であり、その効果は、乳酸菌の菌体やオセルタミビルを併用することにより、より高められることが明らかとなった。

［試験例３］
乳酸菌の菌体との併用による効果を更に検討した。具体的には、下記表５に示す各試験群及び対照群について、それぞれ試験液を準備し、試験例２と同様にして、これらを経口投与するとともにインフルエンザウイルスを感染させたマウスの体重の推移と生存率を調べた。なお、表中のＥＦ乳酸菌死菌体は、市販のエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱殺菌菌体粉末である。

各試験液の投与は下記表６に示す形態・方法で行った。すなわち、試験群８では、β―グルカン濃度０．２ｇ／１００ｇに調製したアウレオバシジウムプルランスＭ−２（Aureobasidium pullulans M-2）（FERM BP-10014）の培養液の２００μＬに、上記乳酸菌死菌体の６．７×１０^９個を懸濁し、これを試験期間中、毎日、ゾンデ法により１日１回経口投与した。試験群９では、上記乳酸菌死菌体の１０．１×１０^９個を懸濁した以外は、試験群８と同様にして試験を行った。試験群１０では、上記乳酸菌死菌体の３．４×１０^９個を懸濁した以外は、試験群８と同様にして試験を行った。試験群１１では、上記アウレオバシジウム培養液としてβ―グルカン濃度０．１ｇ／１００ｇに調製したものを用いた以外は、試験群８と同様にして試験を行った。試験群１２では、上記乳酸菌死菌体の６．７×１０^９個をＰＢＳに懸濁し、これを試験期間中、毎日、ゾンデ法により１日１回経口投与した。

その結果を試験群８について図１１に、試験群９について図１２に、試験群１０について図１３に、試験群１１について図１４に、試験群１２について図１５に、対照群３について図１６にそれぞれ示す。また、図１７には各群のマウスの生存率の推移を示す。

この試験例３では、試験例２と同様に、ウイルス力価が試験例1の２倍になるようにマウスへの感染を行った結果、ＰＢＳを投与した対照群３（図１６）では、感染後９日目までに５匹中４匹が死亡した（図１７）。

また、乳酸菌の加熱殺菌菌体粉末を投与した試験群１２（図１５）でも、４匹中４匹に最大約３３．３％の体重減少がみられ、４匹中２匹（５０％）が試験期間中に死亡した（図１７）。

これに対して、図１１〜図１４に示されるように、アウレオバシジウム培養液と乳酸菌の加熱殺菌菌体粉末とを併用した試験群８〜試験群１１では、各試験群にわたるマウス総数１９匹のうち、試験期間中に死亡したのは各群で１匹ずつにとどまり、一方で体重減少を見せないマウスが各群に少なくとも２匹おり合計９匹であった。その他も試験期間内で正常レベル近くにまで回復した。特に、試験群９及び試験群１０では、それぞれの試験群で死亡した１匹を除いて、最大約１９．１６％の体重減少にとどまり、その後正常レベルにまで顕著に回復した。

以上から、アウレオバシジウム由来β−グルカン含有組成物が、インフルエンザウイルス感染症の治療、特にウイルス感染後の重症化を抑制し、治癒を促進する治療のために有効であり、その効果は、乳酸菌の菌体を併用することにより、より高められることが明らかとなった。

［試験例４］（マウス肺中ウイルス力価）
試験例１〜試験例３で示された効果の作用機序を検討するために、インフルエンザウイルスに感染させたマウスの肺中のウイルス力価に与える影響を調べた。具体的には、下記表７に示す各試験群及び対照群について、それぞれ試験液を準備し、これらを経口投与するとともにインフルエンザウイルスを感染させたマウスの肺中のウイルス力価を調べた。なお、表中のＥＦ乳酸菌死菌体は、市販のエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus
faecalis）の加熱殺菌菌体粉末である。

各試験液の投与は下記表８に示す形態・方法で行った。すなわち、試験液の投与開始からの期間を１週間にした以外は試験例２と同様にしてマウスにインフルエンザウイルスを感染させた。試験群１３では、試験液として、アウレオバシジウムプルランスＭ−２（Aureobasidium pullulans M-2）（FERM BP-10014）の培養液のβ―グルカン濃度を０．２ｇ／１００ｇに調製し、その２００μＬを、試験期間中、毎日、ゾンデ法により１日１回経口投与した。試験群１４では、上記アウレオバシジウム培養液の２００μＬに、上記乳酸菌死菌体の６．７×１０^９個を懸濁して併用した以外は、試験群１３と同様にして試験を行った。また、オセルタミビルを単独で投与する試験群１５においては、オセルタミビル単独での最大の効果と比較するため、ウイルス感染後に継続して毎日（朝晩１回２００μＬずつ）経口投与した。

マウス肺中ウイルス力価の測定は以下のようにして行った。

ウイルス感染後の１日、３日、５日後に、それぞれ各群につき３匹を解剖し、ＰＢＳで洗浄し血液を除いた肺を採取した。採取した肺は、破砕し、組織を細胞懸濁液として取り出した後に、５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上澄みを採取して試料とした。採取した試料は、１×ＭＥＭで１０^−１〜１０^−６まで希釈系列を作り、１０倍で段階希釈した。一方ＭＤＣＫ細胞を前日から培養しておき、ＭＤＣＫ細胞（１サンプル：１２ｗｅｌｌプレート１枚）が隙間なく増えていることを確認したうえで、ＭＤＣＫ細胞の培地を除き、１ｍｌのＰＢＳで洗浄した。洗浄に用いたＰＢＳを除き、段階希釈した試料を１００μＬずつ添加した後、５％ＣＯ_２インキュベーター（３７℃）で１時間静置した。途中細胞が乾かないように、１５分おきにプレート揺らす操作を行った。次に２×ＭＥＭと１．６％Ａｇａｒ液を同量ずつ混ぜ合わせ、最終濃度が０．０００５％となるようにトリプシンを加えてＭＥＭ−Ａｇａｒ溶液を調製し、４２℃のウォーターバスで温めておいた。１時間後にウイルス溶液を除去し、１ｍｌのＰＢＳで洗浄し、調製したＭＥＭ−Ａｇａｒ溶液を各ウェルに１ｍｌずつ添加し、固まるまでしばらく静置した。その後５％ＣＯ_２インキュベーター（３５℃）で培養し、４８時間後に、プラーク数をカウントした。

その結果を図１８に示す。

その結果、マウス肺中ウイルス力価は、感染１日目では、ＰＢＳを投与した対照群４は、６．３１（ｌｏｇ_１０ＰＦＵ）、アウレオバシジウム培養液を投与した試験群１３では６．３６（ｌｏｇ_１０ＰＦＵ）、アウレオバシジウム培養液と乳酸菌の併用群である試験群１４では５．５９（ｌｏｇ_１０ＰＦＵ）、陽性対照であるオセルタミビル（抗インフルエンザ薬タミフルの有効成分）の投与群である試験群１５では、５．８８（ｌｏｇ_１０ＰＦＵ）であった。感染３日目、５日目になると、ＰＢＳを投与した対照群４の値は、それぞれ８．８０（ｌｏｇ_１０ＰＦＵ）、９．４３（ｌｏｇ_１０ＰＦＵ）と感染１日目に比べて、ウイルス量が１５４倍、２，０５７倍と増加していたが、アウレオバシジウム培養液を投与した試験群１３では、感染３日目が７．７５（ｌｏｇ_１０ＰＦＵ）、感染５日目が７．１８（ｌｏｇ_１０ＰＦＵ）と感染１日目に比べて、それぞれ２２．８倍、８．３倍の増加であった。またアウレオバシジウム培養液と乳酸菌の併用群である試験群１４では、それぞれ７．６１（ｌｏｇ_１０ＰＦＵ）、７．２４（ｌｏｇ_１０ＰＦＵ）と、感染１日目に比べて、８１．４倍、４０．１倍の増加であり、対照群４に比べ、ウイルス力価の上昇が抑制されていた。一方、抗インフルエンザ薬タミフルの有効成分であるオセルタミビル単独で投与したところ（試験群１５）、感染３日目で６．８３（ｌｏｇ_１０ＰＦＵ）、感染５日目で７．７６（ｌｏｇ_１０ＰＦＵ）であり、感染１日目と比較して１５．４倍、１２２倍の増加であった。

結果を表９にまとめた。すなわち、ＰＢＳを投与した対照群４の感染後各日でのウイルス量を１とした時の、対応する感染後各日での試験群のウイルス量を一覧にした。

表９に示すように、ＰＢＳを投与した対照群４を１とした場合、アウレオバシジウム培養液を投与した試験群１３は、３日目で１／１２、５日目で１／４２５のウイルス量であり、アウレオバシジウム培養液と乳酸菌の併用群である試験群１４では、３日目で、１／１６、５日目で１／４４２のウイルス量であった。したがって、アウレオバシジウム培養液の投与（試験群１３）、又はアウレオバシジウム培養液と乳酸菌の併用（試験群１４）により、肺でのウイルス増殖を有効に抑えたものと考えられた。なお、試験群１４の結果にみられるように、この試験例で、感染１日目においてアウレオバシジウム培養液とともに乳酸菌の菌体を併用すると、アウレオバシジウム培養液単独使用よりウイルス力価の上昇を更に抑制していた。

［試験例５］（マウス肺中Ｔ細胞活性およびＮＫ細胞活性）
試験例１〜試験例３で示された効果の作用機序を検討するために、インフルエンザウイルスに感染させたマウスの肺中の活性化Ｔ細胞及び活性化ＮＫ細胞を調べた。具体的には、下記表１０に示す各試験群及び対照群について、それぞれ試験液を準備し、これらを経口投与するとともにインフルエンザウイルスを感染させたマウスの５日目の肺中のＴ細胞数とそのうちの活性化Ｔ細胞、またＮＫ細胞数とそのうちの活性化ＮＫ細胞を調べた。なお、表中のＥＦ乳酸菌死菌体は、市販のエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱殺菌菌体粉末である。

各試験液の投与は、上記試験例４と同様にして下記表１１に示す形態・方法で行った。すなわち、試験液の投与開始からの期間を１週間にした以外は試験例２と同様にしてマウスにインフルエンザウイルスを感染させた。試験群１６では、試験液として、アウレオバシジウムプルランスＭ−２（Aureobasidium pullulans M-2）（FERM BP-10014）の培養液のβ―グルカン濃度を０．２ｇ／１００ｇに調製し、その２００μＬを、試験期間中、毎日、ゾンデ法により１日１回経口投与した。試験群１７では、上記アウレオバシジウム培養液の２００μＬに、上記乳酸菌死菌体の６．７×１０^９個を懸濁して併用した以外は、試験群１６と同様にして試験を行った。また、オセルタミビルを単独で投与する試験群１７においては、オセルタミビル単独での最大の効果と比較するため、ウイルス感染後に継続して毎日（朝晩１回２００μＬずつ）経口投与した。

マウス肺中の活性化Ｔ細胞数及び活性化ＮＫ細胞数はつぎのようにして行った。すなわち、ウイルス感染後の５日目に各群につき３匹を解剖し、ＰＢＳで洗浄し血液を除いた肺を採取した。マウス１匹分の肺に対して、ＨＥＰＥＳｂｕｆｆｅｒを４．９ｍｌ、コラゲナーゼＤ（１００ｍｇ/ＭｌｉｎＨＥＰＥＳ）を１００μｌ、ＤＮａｓｅ１を１０μｌ加え、ホモジナイズし、組織を軽く破砕した。３７℃で３０分間振とうし、酵素処理を行った。再度ホモジナイズし、完全に組織を破砕した。群ごとに、破砕した３匹分の肺組織を一つにまとめ、メッシュに通し細胞以外の余分な部分を除去し、ＰＢＳで細胞の洗浄を繰り返し、細胞数をカウントした。

１サンプルあたり２×１０^６ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように９６ｗｅｌｌに分注し、余分な細胞に抗体がつかないようにブロッキングするため「ＬＥＡＦＰｕｒｉｆｉｅｄａｎｔｉ−ＭｏｕｓｅＣＤ１６／３２」を１μｌ／ｗｅｌｌ（ｉｎ１００μｌＦＡＣＳｂｕｆｆｅｒ）添加し氷上で３０分静置した。Ｔ細胞に対するＣＤ３ＡＰＣ抗体、ＮＫ細胞に対するＮＫ１．１ＦＩＴＣ抗体、活性化Ｔ細胞に対するＰＥＣｙ７-ＣＤ６９抗体、活性化ＮＫ細胞に対するＰＥＣｙ７-ＣＤ６９抗体の各抗体を、１μｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、４℃で３０分遮光しながら静置した。細胞に結合しなかった抗体を除去するためにＦＡＣＳｂｕｆｆｅｒで数回洗浄し、死滅細胞を標識して区別するための７−ＡＡＤを１サンプルあたり１０μｌ添加し、フローサイトメーター・セルソーター装置でＦＡＣＳ解析を行ない、生細胞中のＮＫ細胞又はT細胞の割合を求めた。また、各細胞中、活性化された細胞の割合を求めた。

その結果を図１９〜図２２に示す。

感染５日目において、自然免疫において重要な役割を担うＮＫ細胞について、肺の生細胞中でのＮＫ細胞の割合が、ＰＢＳを投与した対照群５で７．５％、アウレオバシジウム培養液を投与した試験群１６で６．４％、アウレオバシジウム培養液と乳酸菌を併用した試験群１７で３．７％であった。オセルタミビル（抗インフルエンザ薬タミフルの有効成分）の投与群である試験群１８では１．８％程度と対照群の約１／４の量でしかなかった（以上図１９）。また、各ＮＫ細胞のうち活性化されたＮＫ細胞の割合は、ＰＢＳを投与した対照群５が６４．７％、アウレオバシジウム培養液を投与した試験群１６が６６．４％、アウレオバシジウム培養液と乳酸菌を併用した試験群１７は５７．２であった。一方で、オセルタミビル（抗インフルエンザ薬タミフルの有効成分）の投与群である試験群１８では、４６．２％にとどまっていた（以上図２０）。試験群１６と試験群１７のインフルエンザウイルス増殖抑制の理由の一つとしてＮＫ細胞の活性化が上げられるが、上記試験例４（図１８）に示されるように、試験群１６（上記試験例４での試験群１３と対応）と試験群１７（上記試験例４での試験群１４と対応）は、ＰＢＳ投与群である対照群５と比較して、試験群１３で１／４２５、試験群１４で１／４４２にインフルエンザウイルスの増殖を抑えており、ＮＫ細胞活性亢進以外の経路でもインフルエンザウイルスを抑制する機構が存在することが示唆された。一方で、試験群１８において、活性化されたＮＫ細胞数が他の群よりも少ない理由として、オセルタミビルがインフルエンザウイルスのＮＡ阻害剤としてインフルエンザウイルスに直接作用することで増殖抑制を行うものであり、ＮＫ細胞の活性化には関与していないためであると推察された。

次に獲得免疫で重要な役割を担うＴ細胞について、ウイルス感染後５日目での肺での生細胞中でＴ細胞数は、各群ともに３％前後と非常に少なく、細胞数での差はほとんどなかった（以上図２１）。しかし、このＴ細胞の中で活性化しているＴ細胞数は、ＰＢＳを投与した対照群５は２２．９％、アウレオバシジウム培養液を投与した試験群１６が３８．５％であり、対照群５と比較すると、１．６８倍多く活性化していた。また、アウレオバシジウム培養液と乳酸菌の併用群である試験群１７が１７．３％であった。また、オセルタミビル（抗インフルエンザ薬タミフルの有効成分）の投与群である試験群１８は、７．３％であり、ＰＢＳを投与した対照群５と比較すると活性化したＴ細胞は約１／３の量でしかなかった（以上図２２）。

以上のように、アウレオバシジウム培養物単独使用で、あるいは乳酸菌との併用で、オセルタミビル（抗インフルエンザ薬タミフルの有効成分）よりも活性化されたＴ細胞やＮＫ細胞が増えており、インフルエンザウイルスの侵入・増殖を抑えるだけでなく、インフルエンザウイルス感染による症状の重篤化を抑えることが示唆された。また、アウレオバシジウム培養物または、アウレオバシジウム培養物と乳酸菌の併用物を投与することで、自然免疫から獲得免疫への移行がスムーズに行われていることが考えられ、その結果、体重減少率や死亡率の低下に寄与していることが示唆された。

なお、アウレオバシジウム培養物とオセルタミビル（抗インフルエンザ薬タミフルの有効成分）とは、それぞれが異なるインフルエンザウイルス感染防御のメカニズムによる作用機序を持つことが推察されるため、上記試験例２の試験群６に見られるように（図１０）、それらの併用によりインフルエンザウイルスの侵入・増殖や、またはインフルエンザウイルス感染による症状の重篤化を、より効果的に抑えることが示唆された。

Claims

アウレオバシジウムプルランスに属する微生物の培養物から得られるβ−グルカン含有組成物を有効成分として含有し、インフルエンザウイルス感染症の重症化を抑制し、治癒を促進するために用いられるものであることを特徴とするインフルエンザウイルス感染症の治療剤。
前記アウレオバシジウムプルランスに属する微生物は、アウレオバシジウムプルランスＭ−１（Aureobasidium pullulans M-1）（FERM BP-08615）又はアウレオバシジウムプルランスＭ−２（Aureobasidium pullulans M-2）（FERM BP-10014）である請求項１記載のインフルエンザウイルス感染症の治療剤。
更に、乳酸菌の菌体を有効成分として含有する請求項１又は２記載のインフルエンザウイルス感染症の治療剤。
前記乳酸菌の菌体がエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の死菌体である請求項３記載のインフルエンザウイルス感染症の治療剤。
インフルエンザノイラミニダーゼ阻害剤、抗ウイルス剤、抗生物質、及びステロイド剤からなる群から選ばれた少なくとも１種と組み合わせて投与されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載のインフルエンザウイルス感染症の治療剤。