WO2021049587A1 - 抗体医薬の効果増強用組成物 - Google Patents

抗体医薬の効果増強用組成物 Download PDF

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康 梨井
真之 藤野
▲祐▼生子 守屋
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株式会社アウレオ
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for enhancing the effect of an antibody drug.
  • Immune checkpoints are a braking mechanism to prevent such runaway so that activated immune cells do not attack even normal tissues and cells, and cancer cells are the opposite. This mechanism is used to avoid the attack of immune cells. This is one of the functions of cancer cells to survive themselves, and it is also a part that has not been clarified so far. With the progress of this research, in recent years, it has been clarified that clinically effective anti-cancer effects can be obtained with antibody drugs that inhibit the functions of immune checkpoint molecules PD-1 and CTLA4, and immune checks Research and development of point inhibitors are being carried out even more actively (see Non-Patent Documents 1 to 3).
  • Patent Document 1 a culture of Aureobasidium pullulans, which is also known as black yeast, which produces abundant ⁇ -glucan, as a moisturizer for skin (Patent Document 1) and an agent for improving constipation.
  • Patent Document 2 a culture of Aureobasidium pullulans, which is also known as black yeast, which produces abundant ⁇ -glucan, as a moisturizer for skin (Patent Document 1) and an agent for improving constipation.
  • Patent Document 2 immunostimulator
  • Patent Document 4 immunoadjuvant
  • Patent Document 5 biological healing promoter used to reduce side effects of anticancer agents
  • Biohealing promoter used for promotion (Patent Document 6), composition for preventing / treating bovine mammitis (Patent Document 7), composition for promoting cytokine production in macrophages (Patent Document 8), influenza virus infection (Patent Document 9), a TRAIL expression enhancer (Patent Document 10), an anemia prevention / amelioration composition (Patent Document 11), a fat accumulation inhibitor (Patent Document 12), and the like are disclosed.
  • An object of the present invention is to provide a composition capable of enhancing the effect of an antibody drug such as an immune checkpoint inhibitor by utilizing Aureobasidium pullulans.
  • ⁇ -glucan contained in the culture of Aureobasidium pullulans can be used in combination with an antibody drug such as an immune checkpoint inhibitor.
  • an antibody drug such as an immune checkpoint inhibitor.
  • a composition for enhancing the effect of an antibody drug which contains ⁇ -glucan as an active ingredient and is administered together with the antibody drug.
  • ⁇ -glucan is used as an active ingredient, the effect of the antibody drug can be enhanced by administering it together with the antibody drug. Therefore, it is suitably used as a strengthening agent such as an immune checkpoint inhibitor.
  • Test Example 2 It is a chart which shows the outline of the administration schedule of each test substance in Test Example 1. It is a chart which shows the result of having examined the tumor volume after the lapse of a predetermined number of days from the tumor cell transplantation in Test Example 1.
  • Test Example 2 the spleen lymphocytes were subjected to multiple staining with an anti-mouse CD4 antibody or an anti-mouse CD8 antibody, and an anti-mouse Ki-67 (lymphocyte activation marker) antibody, and FACS analysis was performed. is there.
  • TIL tumor-infiltrating lymphocytes
  • anti-mouse CD4 antibody or anti-mouse CD8 antibody and anti-mouse Ki-67 (lymphocyte activation marker) antibody
  • FACS analysis was performed. It is a chart which shows.
  • FIG. 5 is a chart showing the results of FACS analysis by multiple staining of spleen lymphocytes with anti-mouse CD4 antibody or anti-mouse CD8 antibody and anti-mouse INF- ⁇ antibody in Test Example 2.
  • TIL tumor infiltrating lymphocyte
  • an anti-mouse CD4 antibody an anti-mouse CD8 antibody
  • an anti-mouse INF- ⁇ antibody an anti-mouse INF- ⁇ antibody
  • FACS analysis was performed. It is a chart which shows the outline of the administration schedule of each test substance in Test Example 3. It is a chart which shows the result of having examined the tumor volume after the lapse of a predetermined number of days from the tumor cell transplantation in Test Example 3.
  • ⁇ -glucan is used as an active ingredient of a composition for enhancing the effect of an antibody drug.
  • ⁇ -glucan is a polysaccharide in which ⁇ -glucose is polymerized by glycosidic bond.
  • grains such as barley and oats, yeasts such as beer yeast and baker's yeast, incomplete fungi such as black yeast, basidiomycetes such as Shiitake, Maitake, Kawaratake, Suehirotake, Sparassis crispa, and Mannentake, and seaweeds such as kelp and wakame. Since it is contained in fungi and the like, it can be obtained by extracting from those natural products using an appropriate solvent or the like. As the extraction method, the conventional method may be followed, and there is no particular limitation.
  • an extraction solvent such as water or hydroalcohol
  • the heating conditions are typically 105 to 135 ° C.
  • the pressurization conditions are typically 1.8 to 2.1 atm.
  • extraction may be performed while performing acid treatment, alkali treatment, or enzyme treatment with an enzyme that lowers the molecular weight of the polysaccharide.
  • the solvent may be distilled off and concentrated, or the powder may be dried and powdered by a drying means such as spray drying.
  • various ⁇ -glucan materials have been distributed, and such commercially available products may be used.
  • the ⁇ -glucan used in the present invention is preferably polymerized by a ⁇ -1,3 glycosidic bond, a ⁇ -1,4 glycosidic bond, a ⁇ -1,6 glycosidic bond, or the like, and has a ⁇ -1,3 glycosidic bond. It is more preferable that the homopolymerization is contained as the main chain, or that the heteropolymerization of the ⁇ -1,3 glycosidic bond and the ⁇ -1,6 glycosidic bond is contained as the main chain, and the homopolymerization of the ⁇ -1,3 glycosidic bond is carried out. It is even more preferable that it is contained as a main chain and contains a ⁇ -1,6 glycosidic bond as a side chain.
  • the ⁇ -glucan may have a functional group such as a sulfate group or a phosphoric acid group.
  • the molecular weight is preferably in the range of an average molecular weight of 50 to 1,000,000, and more preferably in the range of an average molecular weight of 200,000 to 500,000.
  • the molecular weight of ⁇ -glucan can be measured by a gel filtration method or the like.
  • the ⁇ -glucan used in the present invention is a ⁇ -glucan-containing culture composition derived from a culture of Aureobasidium pullulans or a ⁇ -glucan-containing culture composition derived from shiitake mushrooms, as shown in Examples described later. And so on.
  • the ⁇ -glucan-containing culture composition includes a culture itself obtained by culturing a microorganism belonging to Aureobasidium pullulans (hereinafter, may be referred to as “Aureobasidium pullulans”), or bacterial cells by centrifugation or the like. Not only the culture in which water was separated and removed, the concentrate of the culture, the diluted solution of the culture, or the solid matter from which water was removed from the culture, but also these were desalted to identify ⁇ -glucan and the like. It also includes those with an increased content of the components of.
  • the aureobasidium pullulans used in the present invention may be any microorganism that belongs to Aureobasidium pullulans and has a ⁇ -glucan-producing ability.
  • Aureobasidium pullulans M-1 Aureobasidium pullulans. M-1, Trust number: FERM BP-08615, Trust date: Transferred from FERM P-19213 deposited on February 10, 2004 and February 14, 2003) (Patent of Independent Administrative Institution Product Evaluation Technology Infrastructure Organization) Biological Deposit Center Postal Code 292-0818, 2-5-8 Kazusa Kamashita, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan Room 120), Aureobasidium pullulans M-2, Deposit No.
  • FERM BP-10014 Deposit Date : April 22, 2004
  • Patent Organism Depositary Center Postal Code 292-0818, 2-5-8 Kazusa Kamashita, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan, Room 120 is preferably used.
  • the ⁇ -glucan produced by these strains was analyzed by NMR measurement (13CNMR: Varian UNITY INOVA500 type, 1HNMR: Varian UNITY INOVA600 type), and ⁇ -glucan was ⁇ -from the main chain to which glucose was ⁇ -1,3 bound. It has been clarified that it is ⁇ -1,3-1,6-glucan having a structure in which glucose is branched by -1,6 bond.
  • the above-mentioned aureobasidium microorganism can be cultured according to a known method (see JP-A-57-149301, etc.). That is, a medium containing 0.5 to 5.0% by mass of a carbon source (sucrose), 0.1 to 5.0% by mass of a nitrogen source (for example, rice bran), and other trace substances (for example, vitamins and inorganic substances).
  • the bacteria may be inoculated at pH 5.2 to 6.0) and aerated culture at a temperature of 20 to 30 ° C. for 2 to 14 days, preferably aeration stirring culture.
  • ⁇ -glucan is produced, the viscosity of the culture increases, resulting in a highly viscous gel.
  • the culture thus obtained usually contains 0.6 to 10% by mass of solid content, and the solid content contains 5 to 80% by mass of ⁇ -glucan.
  • the culture containing ⁇ -glucan obtained by the above culture is preferably used after being sterilized by heating or pressurizing. Further, the cells may be separated and removed by centrifugation or the like and then sterilized before use. Further, if necessary, a concentrated one or a dried one can be used. Further, an extracted component rich in ⁇ -glucan, or a desalted and purified product thereof can also be used.
  • the culture of microorganisms belonging to Aureobasidium pullulans is highly safe because it is used as a food additive such as a thickening stabilizer.
  • composition according to the present invention is used to be administered together with the antibody drug in order to enhance the effect of the antibody drug. That is, when the effect of an antibody drug is expressed for the purpose of anticancer effect or the like, it can be used to enhance the effect.
  • administered with an antibody drug is a range in which both the ⁇ -glucan or ⁇ -glucan-containing culture composition and the antibody drug component show their effectiveness in the biological composition of the tissue or cell to be applied. It suffices if they can be contacted in a timely manner, and it is not always necessary to administer both components in a single preparation. That is, the effects of the present invention can be enjoyed even if both components are continuously administered as separate preparations or administered at intervals of a predetermined time within the range showing the effectiveness.
  • the antibody drug to which the composition according to the present invention is applied is not particularly limited.
  • it may contain an antibody having an effect of suppressing the growth of cancer through immune checkpoint inhibition.
  • the types of diseases and cancers to which the antibody drug can be applied are not particularly limited, and if it is a cancer, for example, lung cancer, lymphoma, melanoma, leukemia, renal cell cancer, renal pelvis / urinary tract cancer, etc.
  • the antibody examples include, but are not limited to, anti-PD-L1 antibody, anti-PD-1 antibody, anti-LAG3 antibody, anti-CTLA4 antibody, anti-TIM3 antibody, anti-TIGIT antibody, anti-VISTA antibody and the like.
  • the antibody may be a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or an antiserum form containing the antibody. Further, it may be an antibody against a human protein, or may be an antibody against an animal protein such as a mouse, a rat, a rabbit, a goat, a cow, or a monkey. Further, it may be a human type antibody or an animal type antibody such as a mouse. Alternatively, it may be prepared by causing an animal such as a mouse, a rat, a rabbit, a goat, a cow, or a monkey to produce antiserum.
  • the administration route of the composition according to the present invention is not particularly limited, and a known formulation form is appropriately selected, and oral administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, nasal administration, pulmonary administration, vaginal administration, and intravenous administration. , It is possible to adapt to transrectal administration.
  • the dose of the composition according to the present invention can be appropriately determined depending on the type of antibody drug, the health condition, symptoms, age of the recipient or the recipient animal, the administration method, the number of administrations, the administration time, and the like.
  • the solid content of the ⁇ -glucan or ⁇ -glucan-containing culture composition is 0.025 to 4000 mg / kg (body weight).
  • Administer in volume in the case of intraperitoneal administration, the ⁇ -glucan or ⁇ -glucan-containing culture composition is administered in an amount of 0.05 to 5 mg / kg (body weight) in terms of solid content.
  • compositions according to the invention typically include, for example, pharmaceuticals, non-pharmaceutical products, functional foods, dietary supplements, supplements, health foods, veterinary medicines, veterinary pharmaceutical products, veterinary functional foods, animals. It can be used in various product forms such as dietary supplements for animals, supplements for animals, and health foods for animals. Alternatively, it can be used in combination with those products. It may also be used in combination with various foods and drinks.
  • Aureobasidium pullulans M-2 (Aureobasidium pullulans M-2, Incorporated Administrative Agency Product Evaluation Technology Infrastructure Organization Patent Biological Deposit Center Accession No .: FERM BP-10014) was inoculated into a liquid medium and shaken at 24.5 ° C for 4 days. By finally culturing, ⁇ -glucan was produced in the culture medium. The ⁇ -glucan concentration was estimated to be approximately 6 mg / mL by the phenol sulphate method and the enzymatic method.
  • mice C57BL / 6 mice (Nippon SLC Co., Ltd.) were inoculated with 3 ⁇ 10 5 mouse melanoma cell lines B16F10 (RIKEN Biobank) into the flanks of the mice. , By growing the tumor for 16 days.
  • test animals were divided into four groups: an untreated group, an anti-PD-L1 antibody alone administration group, a ⁇ -glucan single administration group, and an anti-PD-L1 antibody and ⁇ -glucan combination administration group, and the N number was 26 animals in the untreated group, 18 animals in the PD-L1 antibody alone administration group, 6 animals in the ⁇ -glucan single administration group, and 9 animals in the anti-PD-L1 antibody and ⁇ -glucan combination group.
  • the untreated group will be referred to as the "control group”
  • the anti-PD-L1 antibody single administration group will be referred to as "test group 1”
  • test group 2 The combined administration group of anti-PD-L1 antibody and ⁇ -glucan may be referred to as "test group 3".
  • test group 1 the anti-mouse PD-L1 antibody (Clone:) was administered at the 8th and 12th days after the tumor cell transplantation. MIH5) was intraperitoneally administered at a dose of 200 ⁇ g / animal.
  • test group 2 the ⁇ -glucan-containing culture composition prepared in Production Example 1 was used at the 8th, 11th, and 14th days after the tumor cell transplantation. It was intraperitoneally administered at a dose of 30 mg / kg in terms of the amount of ⁇ -glucan.
  • test group 3 For the combined administration group of the anti-PD-L1 antibody and ⁇ -glucan (“test group 3”), the anti-mouse PD-L1 antibody and the ⁇ -glucan-containing culture composition prepared in Production Example 1 above were individually administered. At the same time point as the group, the mice were intraperitoneally administered at the same dose as each single administration group.
  • FIG. 1 shows an outline of the administration schedule of each test substance.
  • the major axis and the minor axis of the tumor were measured, and the tumor volume (mm 3 ) was recorded by the following formula. ..
  • Table 1 and FIG. 2 show the results of the tumor volume after a predetermined number of days have passed since the tumor cell transplantation.
  • Table 2 shows the results of statistical analysis of the Brown-Forsythe Test to determine the significance between the groups when the tumor volumes were compared on the 16th day after tumor cell transplantation.
  • test group 3 the tumor volume was significantly reduced in the combined administration group of the anti-PD-L1 antibody and ⁇ -glucan as compared with the untreated group (“control group”).
  • the reducing effect was statistically significantly observed as compared with the anti-PD-L1 antibody alone administration group (“test group 1”) and the ⁇ -glucan alone administration group (“test group 2”) (16). See day comparison).
  • anti-mouse CD4 antibody BioLegend Japan Co., Ltd.
  • anti-mouse CD8 antibody BioLegend Japan Co., Ltd.
  • anti-mouse Ki-67 lymphocyte activation marker
  • anti-mouse INF- ⁇ antibody Naippon Becton Dickinson Co., Ltd.
  • FACS analysis After staining the cell surface antigen, the intracellular antigen was stained. Fixation Buffer and Permeabilization Wash Buffer (BioLegend Japan Co., Ltd.) were used for staining the intracellular antigen.
  • FIG. 3 shows the results of FACS analysis by multiple staining of spleen lymphocytes with an anti-mouse CD4 antibody, an anti-mouse CD8 antibody, and an anti-mouse Ki-67 (lymphocyte activation marker) antibody.
  • FIG. 4 shows the results of FACS analysis of tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) by multiple staining with anti-mouse CD4 antibody or anti-mouse CD8 antibody and anti-mouse Ki-67 (lymphocyte activation marker) antibody. Is shown.
  • FIG. 5 shows the results of FACS analysis by multiple staining of spleen lymphocytes with anti-mouse CD4 antibody or anti-mouse CD8 antibody and anti-mouse INF- ⁇ antibody.
  • FIG. 6 shows the results of FACS analysis by multiple staining of tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) with anti-mouse CD4 antibody, anti-mouse CD8 antibody, and anti-mouse INF- ⁇ antibody.
  • TIL tumor-infiltrating lymphocytes
  • ⁇ Test Example 3> In the same manner as in Test Example 1, a cancer-bearing mouse was prepared by transplanting a tumor cell line, and it was investigated whether the administration of the test substance had an effect on the growth of the tumor. At that time, as a test substance, ⁇ -glucan derived from shiitake mushroom (“Micelle glucan”, manufactured by RL-JP Co., Ltd.) (hereinafter referred to as “Micelle ⁇ -glucan”) is used instead of ⁇ -glucan derived from aureobasidium pullulans. ) was used.
  • mice C57BL / 6 mice (Nippon SLC Co., Ltd.) were inoculated with 3 ⁇ 10 5 mouse melanoma cell lines B16F10 (RIKEN Biobank) into the flanks of the mice. , By growing the tumor for 13 days.
  • test animals were divided into four groups: an untreated group, a micelle ⁇ -glucan alone administration group, an anti-PD-L1 antibody alone administration group, and an anti-PD-L1 antibody and micelle ⁇ -glucan combination administration group.
  • There were 4 animals in the untreated group 2 animals in the micelle ⁇ -glucan alone administration group, 3 animals in the PD-L1 antibody alone administration group, and 3 animals in the anti-PD-L1 antibody and micelle ⁇ -glucan combination group.
  • the untreated group is referred to as "control group A”
  • the micelle ⁇ -glucan single administration group is referred to as "test group 1A”
  • test group 2A the anti-PD-L1 antibody single administration group
  • the combined administration group of anti-PD-L1 antibody and micelle ⁇ -glucan may be referred to as “test group 3A”.
  • test group A physiological saline was intraperitoneally administered at the 8th, 12th, and 14th days after the tumor cell transplantation.
  • test group 1A 100 mg / kg of micelle ⁇ -glucan was administered in terms of the amount of ⁇ -glucan at the 8th and 11th days after tumor cell transplantation. The dose was intraperitoneally administered.
  • test group 2A 200 ⁇ g / animal of anti-mouse PD-L1 antibody (Clone: MIH5) was administered at the 8th and 12th days after tumor cell transplantation. The dose was intraperitoneally administered.
  • test group 3A the anti-mouse PD-L1 antibody was applied to the tumor cells on the 8th and 12th days after the tumor cell transplantation in the same manner as described above. It was administered in the form of administration, and micelle ⁇ -glucan was intraperitoneally administered at a dose of 100 mg / kg in terms of the amount of ⁇ -glucan at the 8th and 11th days after tumor cell transplantation.
  • FIG. 7 shows an outline of the administration schedule of each test substance.
  • Table 3 and FIG. 8 show the results of the tumor volume after a predetermined number of days have passed since the tumor cell transplantation.
  • Table 4 shows the results of statistical analysis of the Brown-Forsythe Test to determine the significance between the groups when the tumor volumes were compared on the 12th day after the tumor cell transplantation.
  • test group 3A the tumor volume was significantly reduced as compared with the untreated group (“control group A”).
  • control group A the untreated group
  • test group 2A the anti-PD-L1 antibody alone administration group

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Abstract

免疫チェックポイント阻害剤等の抗体医薬の効果を増強することができる組成物を提供する。 β－グルカンを、抗体医薬の効果を増強するための組成物の有効成分として用いる。この組成物は、免疫チェックポイント阻害を介してがんの増殖を抑制する作用効果を有する抗体医薬、例えば、ＰＤ－Ｌ１に対するモノクローナル抗体を含む抗体医薬に好適に用いられる。

Description

抗体医薬の効果増強用組成物
　本発明は、抗体医薬の効果増強用組成物に関するものである。
　新たながん治療法として、免疫チェックポイントをターゲットにした分子標的薬が注目さている。免疫チェックポイントとは、活性化した免疫細胞が正常な組織や細胞までをも攻撃してしまうことがないように、そのような暴走を防ぐためのブレーキ機構であって、がん細胞は、逆にこの機構を利用して、免疫細胞の攻撃から免れている。これはがん細胞が持つ自身を生き延びさせるための機能の一つであり、これまで解明できなかった部分でもある。この研究の進展により、近年、免疫チェックポイント分子であるＰＤ－１やＣＴＬＡ４の機能を阻害する抗体医薬等で、臨床的にも有効な抗がん効果が得られることが明らかとされ、免疫チェックポイント阻害剤の研究、開発がより一層盛んに行われている（非特許文献１～３参照）。
　一方、本出願人は、β－グルカンを豊富に産生する、通称黒酵母とも呼ばれるアウレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）の培養物を利用して、皮膚用保湿剤（特許文献１）、便秘改善剤（特許文献２）、免疫賦活剤（特許文献３）、免疫アジュバント（特許文献４）、抗がん剤の副作用を低減するために用いられる生体治癒促進剤（特許文献５）、熱火傷の治癒促進のために用いられる生体治癒促進剤（特許文献６）、ウシの乳房炎の予防・治療用組成物（特許文献７）、マクロファージにおけるサイトカイン産生促進組成物（特許文献８）、インフルエンザウイルス感染症の治療剤（特許文献９）、TRAIL発現亢進剤（特許文献１０）、貧血予防・改善用組成物（特許文献１１）、脂肪蓄積抑制剤（特許文献１２）などを開示している。
Ishida, Y., Agata, Y., Shibahara, K. and Honjo, T.「Induced expression of PD-1, a novel member of the immunoglobulin gene superfamily, upon programmed cell death.」EMBO J. 11 3887-3895 (1992) Freeman, G. J., Long, A. J., Iwai, Y., Bourque, K., Chernova, T., Nishimura, H., Fitsz, L. J., Malenkovich, N., Okazaki, T., Byrne, M. C., Horton, H. F., Fouser, L., Carter, L., Ling, V., Bowman, M. R., Carreno, B. M., Collins, M., Wood, C. R. and Honjo, T.「Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation.」J. Exp. Med. 192 1027-1034 (2000) Spencer C. Wei, Colm R. Duffy, and James P. Allison「Fundamental Mechanisms of Immune Checkpoint Blockade Therapy」CANCER RESEARCH, doi: 10.1158/2159-8290.CD-18-0367, August 16, 2018
特許第４００００７８号公報 特許第４０５４６９７号公報 特許第４３６９２５８号公報 特許第５２４２８５５号公報 特許第５３３１４８２号公報 特許第５７１５６５９号公報 特許第５５５４２２１号公報 特許第５５５９１７３号公報 特許第５５６０４７２号公報 特許第５９３７０２９号公報 特許第６２９３１８７号公報 特許第６３８０９６８号公報
　本発明の目的は、アウレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）を利用して、免疫チェックポイント阻害剤等の抗体医薬の効果を増強することができる組成物を提供することにある。
　上記目的を達成するため本発明者らが鋭意研究したところ、アウレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）の培養物に含まれるβ－グルカンには、免疫チェックポイント阻害剤等の抗体医薬と併用することで、その効果を増強する作用効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下のとおりである。
　［１］β－グルカンを有効成分として含有し、抗体医薬とともに投与されるものであることを特徴とする抗体医薬の効果増強用組成物。
　［２］前記抗体医薬は、免疫チェックポイント阻害を介してがんの増殖を抑制する作用効果を有するものである、上記［１］記載の抗体医薬の効果増強用組成物。
　［３］前記抗体医薬は、ＰＤ－Ｌ１に対するモノクローナル抗体を含むものである、上記［１］記載の抗体医薬の効果増強用組成物。
　［４］前記抗体医薬は、メラノーマの増殖を抑制する作用効果を有するものである、上記［１］記載の抗体医薬の効果増強用組成物。
　本発明によれば、β－グルカンを有効成分とするので、抗体医薬とともに投与することで、その抗体医薬の効果を増強することができる。よって、免疫チェックポイント阻害剤等の強化剤等として好適に用いられる。
試験例１における各被検物質の投与スケジュールの概要を示す図表である。 試験例１において腫瘍細胞移植から所定日数経過後の腫瘍体積を調べた結果を示す図表である。 試験例２において、脾臓リンパ球について、抗マウスＣＤ４抗体又は抗マウスＣＤ８抗体、及び抗マウスＫｉ－６７（リンパ球活性化マーカー）抗体で多重染色を行い、ＦＡＣＳ解析を行った結果を示す図表である。 試験例２において、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）について、抗マウスＣＤ４抗体又は抗マウスＣＤ８抗体、及び抗マウスＫｉ－６７（リンパ球活性化マーカー）抗体で多重染色を行い、ＦＡＣＳ解析を行った結果を示す図表である。 試験例２において、脾臓リンパ球について、抗マウスＣＤ４抗体又は抗マウスＣＤ８抗体、及び抗マウスＩＮＦ－γ抗体で多重染色を行い、ＦＡＣＳ解析を行った結果を示す図表である。 試験例２において、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）について、抗マウスＣＤ４抗体又は抗マウスＣＤ８抗体、及び抗マウスＩＮＦ－γ抗体で多重染色を行い、ＦＡＣＳ解析を行った結果を示す図表である。 試験例３における各被検物質の投与スケジュールの概要を示す図表である。 試験例３において腫瘍細胞移植から所定日数経過後の腫瘍体積を調べた結果を示す図表である。
　本発明においては、β－グルカンを、抗体医薬の効果増強用組成物の有効成分として用いる。
　β－グルカンは、β－グルコースがグリコシド結合により重合した多糖である。例えば、大麦やオーツ麦などの穀類、ビール酵母、パン酵母等の酵母類、黒酵母等の不完全菌類、シイタケ、マイタケ、カワラタケ、スエヒロタケ、ハナビラタケ、マンネンタケ等の担子菌類、昆布、ワカメ等の海藻類などに含まれるので、それら天然物から適当な溶媒を用いて抽出すること等により得ることができる。抽出方法としては常法に従はばよく、特に制限はない。例えば、必要に応じて乾燥・粉砕した原料に水、含水アルコール等の抽出溶媒を加えて、加熱及び／又は加圧下に抽出する方法などが挙げられる。加熱条件としては、典型的に１０５～１３５℃、加圧条件としては、典型的に１．８～２．１気圧などが挙げられる。また、抽出効率の向上のためには、酸処理やアルカリ処理、あるいは、多糖類を低分子化させる酵素による酵素処理を施しながら抽出しても構わない。抽出後には、溶媒を溜去して濃縮したり、噴霧乾燥等の乾燥手段で、乾燥粉末化したりしてもよい。なお近年では、各種β－グルカン素材が流通しているので、そのような市販品を利用してもよい。
　本発明に用いるβ－グルカンは、β-１，３グリコシド結合、β-１，４グリコシド結合、β-１，６グリコシド結合などにより重合されていることが好ましく、β-１，３グリコシド結合のホモ重合を主鎖として含むか、もしくはβ-１，３グリコシド結合及びβ-１，６グリコシド結合のヘテロ重合を主鎖として含むものであることがより好ましく、β-１，３グリコシド結合のホモ重合を主鎖として含み、且つβ-１，６グリコシド結合を側鎖として含むものであることが更により好ましい。β－グルカンは、硫酸基、リン酸基等の官能基を有していてもよい。分子量としては、平均分子量５０００～１００万の範囲であることが好ましく、平均分子量２０万～５０万の範囲であることがより好ましい。β－グルカンの分子量は、ゲル濾過法などで測定することができる。
　本発明に用いるβ－グルカンは、後述する実施例で示されるように、アウレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）の培養物由来のβ－グルカン含有培養組成物やシイタケ由来のβ－グルカン含有培養組成物などであることができる。
　以下には、アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物に由来するβ－グルカンについて、更に詳述する。そのβ－グルカン含有培養組成物としては、アウレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）に属する微生物（以下、「アウレオバシジウム微生物」という場合がある。）を培養した培養物そのもの、遠心分離等により菌体を分離除去した培養物、その培養物の濃縮液、その培養物の希釈液、あるいはその培養物から水分を除いた固形物等だけでなく、これらを脱塩等してβ－グルカン等の特定の成分の含有量を高めたものも含まれる。
　本発明において用いられる上記アウレオバシジウム微生物としては、アウレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）に属し、β－グルカン生産能を有する微生物であればよいが、例えば、アウレオバシジウム プルランスＭ―１（Aureobasidium pullulans M-1、受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ－０８６１５、受託日：２００４年２月１０日、２００３年２月１４日に寄託されたＦＥＲＭ　Ｐ－１９２１３号より移管）（独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター　郵便番号２９２－０８１８　日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２０号室）や、アウレオバシジウム プルランスＭ―２（Aureobasidium pullulans M-2、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－１００１４、受託日：２００４年４月２２日）（独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター　郵便番号２９２－０８１８　日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２０号室）が好適に用いられる。なお、これらの菌株が産生するβ－グルカンは、NMR測定（１３ＣＮＭＲ　：Ｖａｒｉａｎ社ＵＮＩＴＹ　ＩＮＯＶＡ５００型、１ＨＮＭＲ　：　Ｖａｒｉａｎ社ＵＮＩＴＹ　ＩＮＯＶＡ６００型）による構造解析で、グルコースがβ－１，３結合した主鎖からβ－１，６結合でグルコースが分岐した構造を有するβ－１，３－１，６－グルカンであることが明らかとなっている。
　上記アウレオバシジウム微生物の培養は、公知の方法（特開昭５７－１４９３０１号公報等参照）に準じて行うことができる。すなわち、炭素源（ショ糖）０．５～５．０質量％、窒素源（例えば米糠）０．１～５．０質量％、その他微量物質（例えば、ビタミン類、無機質）を加えた培地（ｐＨ５．２～６．０）に菌を接種し、温度２０～３０℃で２～１４日間通気培養、好ましくは通気撹拌培養すればよい。β－グルカンが生成されるにしたがって培養物の粘度が上昇し、粘性の高いジェル状になる。このようにして得られる培養物には、通常、０．６～１０質量％の固形分が含まれており、該固形分中にはβ－グルカンが５～８０質量％含まれている。
　上記の培養によって得られるβ－グルカンを含む培養物は、加熱又は加圧加熱殺菌して用いることが好ましい。また、遠心分離等により菌体を分離除去した後殺菌して用いてもよい。また、必要に応じて濃縮したもの、あるいは乾燥したものを用いることもできる。更に、β?グルカンに富む成分を抽出したものや、それを脱塩、精製したものを用いることもできる。なお、アウレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）に属する微生物の培養物は、増粘安定剤等の食品添加物として使用されているものであり安全性が高い。
　本発明による組成物は、抗体医薬の効果を増強するため、その抗体医薬とともに投与するように用いられる。すなわち、抗がん効果等を目的として抗体医薬の効果を発現させるときに、その効果を高めるために用いることができる。
　ここで、「抗体医薬とともに投与」とは、上記β－グルカンあるいはβ－グルカン含有培養組成物と抗体医薬の両成分が、適用対象の組織や細胞等の生体構成に、その有効性を示す範囲で時期を経ずに接触させることができればよく、必ずしも両成分が単一の製剤に含まれている状態で投与される必要はない。すなわち、その有効性を示す範囲で、両成分をそれぞれ別製剤として連続投与したり、所定時間あけて投与したりしても、本発明の効果を享受することができる。
　本発明による組成物が適用される抗体医薬としては、特に制限されるものではない。例えば、免疫チェックポイント阻害を介してがんの増殖を抑制する作用効果を有する抗体を含むものであり得る。抗体医薬が適用され得る疾病やがんの種類についても、特に制限されるものではなく、がんであれば、例えば、肺がん、リンパ腫、メラノーマ、白血病、腎細胞がん、腎盂・尿管がん、咽頭がん、骨肉種、胃がん、悪性中皮腫、卵巣がん、子宮頸がん　、膵がん、MSI-High結腸・直腸がん、食道がん、肝細胞がん、胆道がん等が例示される。抗体としては、例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体等が知られているが、これらに限らない。抗体は、ポリクローナル抗体でもよく、モノクローナル抗体でもよく、抗体を含む抗血清の形態であってもよい。また、ヒトの蛋白質に対する抗体であってもよく、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシ、サル等の動物の蛋白質に対する抗体であってもよい。更に、ヒト型の抗体であってもよく、マウス等の動物型の抗体であってもよい。あるいは、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシ、サルなどの動物に抗血清を産生させる等して調製されたものであってもよい。
　本発明による組成物の投与経路に特に制限はなく、公知の製剤形態を適宜選択して、経口投与、腹腔内投与、筋肉内投与、経鼻投与、経肺投与、経膣投与、経静脈投与、経直腸投与などに適応することが可能である。
　本発明による組成物の投与量は、抗体医薬の種類、被投与者又は被投与動物の健康状態、症状、年齢や、投与方法・投与回数・投与時期などによって、適宜決定することができる。一般的な投与量を例示すれば、例えば、経口的に摂取する場合には、上記β－グルカンあるいはβ－グルカン含有培養組成物の固形分換算にして０．０２５～４０００ｍｇ/ｋｇ（体重）の量で投与する。また、腹腔内投与の場合には、上記β－グルカンあるいはβ－グルカン含有培養組成物の固形分換算にして０．０５～５ｍｇ/ｋｇ（体重）の量で投与する。
　本発明による組成物は、典型的に、例えば医薬品、医薬部外品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント、健康食品、動物用医薬品、動物用医薬部外品、動物用機能性食品、動物用栄養補助食品、動物用サプリメント、動物用健康食品など各種の製品形態で使用されることが可能である。あるいはそれら製品と組み合わせて使用されることが可能である。また各種の飲食品と組み合わせて使用してもよい。
　以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
　［製造例１］　
アウレオバシジウム プルランス Ｍ－２（Aureobasidium pullulans M-2、独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ－１００１４）を液体培地に植菌し、２４．５℃で４日間振とう培養することで、培養液中にβ－グルカンを産生させた。β－グルカン濃度はフェノール硫酸法および酵素法によっておよそ６ｍｇ／ｍＬと見積られた。
　＜試験例１＞　
　常法に従い、腫瘍細胞株の移植による担がんマウスを作成し、被験物質の投与によってその腫瘍の成長に影響があるかどうかを調べた。
　具体的には、担がんマウスを作成は、Ｃ５７ＢＬ/６マウス（日本エスエルシー株式会社）に対し、マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６Ｆ１０（理研バイオバンク）の３×１０５個を、マウス脇腹に接種し、１６日間腫瘍を成長させることにより行った。
　試験動物を、無処置群、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の単独投与群、β－グルカンの単独投与群、及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体とβ－グルカンの併用投与群、の４群に分け、Ｎ数は、無処置群で２６匹、ＰＤ－Ｌ１抗体の単独投与群で１８匹、β－グルカンの単独投与群で６匹、抗ＰＤ－Ｌ１抗体とβ－グルカンの併用群で９匹とした。以下では、便宜上、無処置群を「対照群」といい、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の単独投与群を「試験群１」といい、β－グルカンの単独投与群を「試験群２」といい、抗ＰＤ－Ｌ１抗体とβ－グルカンの併用投与群を「試験群３」という場合がある。
　被験物質の投与形態としては、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の単独投与群（「試験群１」）では、腫瘍細胞移植から８日目及び１２日目の時点で、抗マウスＰＤ－Ｌ１抗体（Clone: MIH5）を２００μｇ／匹の投与量で腹腔内に投与した。β－グルカン単独投与群（「試験群２」）では、腫瘍細胞移植から８日目、１１日目、及び１４日目の時点で、上記製造例１で調製したβ－グルカン含有培養組成物をそのβ－グルカン量に換算して３０ｍｇ／ｋｇの投与量で腹腔内に投与した。抗ＰＤ－Ｌ１抗体とβ－グルカンの併用投与群（「試験群３」）については、抗マウスＰＤ－Ｌ１抗体と上記製造例１で調製したβ－グルカン含有培養組成物を、それぞれの単独投与群と同様の時点で、それぞれの単独投与群と同様の投与量でマウス腹腔内に投与した。図１には、各被検物質の投与スケジュールの概要を示す。
　メラノーマ細胞株の接種後から６日目、８日目、１２日目、１４日目、１６日目に、腫瘍の長径及び短径を測定し、下記式による腫瘍体積（ｍｍ３）を記録した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　腫瘍細胞移植から所定日数経過後の腫瘍体積の結果を、表１及び図２に示す。また、腫瘍細胞移植から１６日目の腫瘍体積を比較したときの各群間での有意性の有無をBrown-Forsythe Testにて統計解析にて調べた結果を、表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　その結果、抗ＰＤ－Ｌ１抗体とβ－グルカンの併用投与群（「試験群３」）では、無処置群（「対照群」）に比べて、顕著に腫瘍体積が減少していた。その減少効果は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の単独投与群（「試験群１」）やβ－グルカン単独投与群（「試験群２」）に比べても、統計的に有意に認められた（１６日目の比較参照）。
　＜試験例２＞　
　腫瘍細胞移植後１６日目の担がんマウスを解剖し、それぞれの試験群の担がんマウスから脾臓リンパ球及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を分離・精製した。リンパ球は、採取した組織を滅菌蒸留水にて溶血した後、リンパ球分離キット（商品名「lympholyte-M」、（Cedarlane Laboratories社）にて調製した。
　各リンパ球について、抗マウスＣＤ４抗体（BioLegend Japan株式会社）、抗マウスＣＤ８抗体（BioLegend Japan株式会社）、抗マウスＫｉ－６７（リンパ球活性化マーカー）抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）、及び抗マウスＩＮＦ－γ抗体（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）を用いて、染色を行い、ＦＡＣＳ解析を行った。細胞表面抗原の染色の後、細胞内抗原の染色を行った。細胞内抗原の染色はFixation BufferおよびPermeabilization Wash Buffer（BioLegend Japan株式会社）を用いた。
　図３には、脾臓リンパ球について、抗マウスＣＤ４抗体又は抗マウスＣＤ８抗体、及び抗マウスＫｉ－６７（リンパ球活性化マーカー）抗体で多重染色を行い、ＦＡＣＳ解析を行った結果を示す。
　図４には、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）について、抗マウスＣＤ４抗体又は抗マウスＣＤ８抗体、及び抗マウスＫｉ－６７（リンパ球活性化マーカー）抗体で多重染色を行い、ＦＡＣＳ解析を行った結果を示す。
　図５には、脾臓リンパ球について、抗マウスＣＤ４抗体又は抗マウスＣＤ８抗体、及び抗マウスＩＮＦ－γ抗体で多重染色を行い、ＦＡＣＳ解析を行った結果を示す。
　図６には、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）について、抗マウスＣＤ４抗体又は抗マウスＣＤ８抗体、及び抗マウスＩＮＦ－γ抗体で多重染色を行い、ＦＡＣＳ解析を行った結果を示す。
　図３の結果にみられるように、脾臓リンパ球のＫｉ－６７発現に関して、ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞共に、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の単独投与群（「試験群１」）又はβ－グルカンの単独投与群（「試験群２」）又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体とβ－グルカンの併用投与群（「試験群３」）で、無処置群（「対照群」）に対する目立った差異は認められなかった。
　図４の結果にみられるように、腫瘍浸潤リンパ球のＫｉ－６７発現に関して、ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞共に、無処置群（「対照群」）又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の単独投与群（「試験群１」）又はβ－グルカンの単独投与群（「試験群２」）と比較して、抗ＰＤ－Ｌ１抗体とβ－グルカンの併用投与群（「試験群３」）では、その発現が顕著に高くなる傾向が認められた（図４中、「＊＊」はｐ＜０．０１を表わし、「＊＊＊」はｐ＜０．００１を表わす。）。
　図５の結果にみられるように、脾臓リンパ球のＩＮＦ－γ発現に関して、ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞共に、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の単独投与群（「試験群１」）又はβ－グルカンの単独投与群（「試験群２」）又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体とβ－グルカンの併用投与群（「試験群３」）で、無処置群（「対照群」）に対する目立った差異は認められなかった。
　図６の結果にみられるように、腫瘍浸潤リンパ球のＩＮＦ－γ発現に関して、ＣＤ８陽性Ｔ細胞において、無処置群（「対照群」）又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の単独投与群（「試験群１」）又はβ－グルカンの単独投与群（「試験群２」）と比較して、抗ＰＤ－Ｌ１抗体とβ－グルカンの併用投与群（「試験群３」）では、その発現が顕著に高くなる傾向が認められた。一方、ＣＤ４陽性Ｔ細胞においては、無処置群（「対照群」）と抗ＰＤ－Ｌ１抗体とβ－グルカンの併用投与群（「試験群３」）との間で、それほど差はみられなかった（図６中、「＊＊」はｐ＜０．０１を表わし、「＊＊＊」はｐ＜０．００１を表わす。）。
　以上から、抗ＰＤ－Ｌ１抗体やβ－グルカンの投与により、細胞浸潤性Ｔ細胞を活性化しその細胞障害性が高められることが明らかとなった。一方、脾臓リンパ球に、顕著な影響はなかった。また、その活性化効果は、併用することによって、単独投与よりも顕著に高められることが明らかとなった。これらは、担がんマウスの腫瘍体積の低減効果と、よく整合する結果であった。
　＜試験例３＞　
　試験例１と同様にして、腫瘍細胞株の移植による担がんマウスを作成し、被験物質の投与によってその腫瘍の成長に影響があるかどうかを調べた。その際、被験物質として、アウレオバシジウム プルランス由来のβ－グルカンに替えて、シイタケ由来のβ－グルカン（「ミセルグルカン」、株式会社 ＲＬ－ＪＰ製）（以下、「ミセルβ－グルカン」という。）を用いた。
　具体的には、担がんマウスを作成は、Ｃ５７ＢＬ/６マウス（日本エスエルシー株式会社）に対し、マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６Ｆ１０（理研バイオバンク）の３×１０５個を、マウス脇腹に接種し、１３日間腫瘍を成長させることにより行った。
　試験動物を、無処置群、ミセルβ－グルカン単独投与群、抗ＰＤ－Ｌ１抗体単独投与群、及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体とミセルβ－グルカンの併用投与群の４群に分け、Ｎ数は、無処置群で４匹、ミセルβ－グルカン単独投与群で２匹、ＰＤ－Ｌ１抗体単独投与群で３匹、抗ＰＤ－Ｌ１抗体とミセルβ－グルカンの併用群で３匹とした。以下では、便宜上、無処置群を「対照群Ａ」といい、ミセルβ－グルカン単独投与群を「試験群１Ａ」といい、抗ＰＤ－Ｌ１抗体単独投与群を「試験群２Ａ」といい、抗ＰＤ－Ｌ１抗体とミセルβ－グルカンの併用投与群を「試験群３Ａ」という場合がある。
　被験物質の投与形態としては、無処置群（「対照群Ａ」）では、腫瘍細胞移植から８日目、１２日目、及び１４日目の時点で、生理食塩水を腹腔内に投与した。ミセルβ－グルカン単独投与群（「試験群１Ａ」）では、腫瘍細胞移植から８日目、１１日目の時点で、ミセルβ－グルカンをそのβ－グルカン量に換算して１００ｍｇ／ｋｇの投与量で腹腔内に投与した。抗ＰＤ－Ｌ１抗体の単独投与群（「試験群２Ａ」）では、腫瘍細胞移植から８日目及び１２日目の時点で、抗マウスＰＤ－Ｌ１抗体（Clone: MIH5）を２００μｇ／匹の投与量で腹腔内に投与した。抗ＰＤ－Ｌ１抗体とミセルβ－グルカンの併用投与群（「試験群３Ａ」）については、抗マウスＰＤ－Ｌ１抗体を、腫瘍細胞移植から８日目及び１２日目の時点で、上記同様の投与形態で投与し、ミセルβ－グルカンを、腫瘍細胞移植から８日目及び１１日目の時点で、そのβ－グルカン量に換算して１００ｍｇ／ｋｇの投与量で腹腔内に投与した。図７には、各被検物質の投与スケジュールの概要を示す。
　メラノーマ細胞株の接種後から６日目、８日目、１１日目、１２日目に、腫瘍の長径及び短径を測定し、試験例１同様にして腫瘍体積（ｍｍ３）を記録した。
　腫瘍細胞移植から所定日数経過後の腫瘍体積の結果を、表３及び図８に示す。また、腫瘍細胞移植から１２日目の腫瘍体積を比較したときの各群間での有意性の有無をBrown-Forsythe Testにて統計解析にて調べた結果を、表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
　その結果、抗ＰＤ－Ｌ１抗体とミセルβ－グルカンの併用投与群（「試験群３Ａ」）では、無処置群（「対照群Ａ」）に比べて、顕著に腫瘍体積が減少していた。その減少効果は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の単独投与群（「試験群２Ａ」）に比べても、より高い傾向であった（１２日目の比較参照）。
 

Claims (4)

  1. 　β－グルカンを有効成分として含有し、抗体医薬とともに投与されるものであることを特徴とする抗体医薬の効果増強用組成物。
  2. 　前記抗体医薬は、免疫チェックポイント阻害を介してがんの増殖を抑制する作用効果を有するものである、請求項１記載の抗体医薬の効果増強用組成物。
  3. 　前記抗体医薬は、ＰＤ－Ｌ１に対するモノクローナル抗体を含むものである、請求項１記載の抗体医薬の効果増強用組成物。
  4. 　前記抗体医薬は、メラノーマの増殖を抑制する作用効果を有するものである、請求項１記載の抗体医薬の効果増強用組成物。
     
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