JP5360476B2 - 家畜の血中ビタミンａ及びベータカロテン濃度測定方法並びに家畜の血中ビタミンａ及びベータカロテン濃度測定装置 - Google Patents

Description

この発明は、家畜の血中ビタミンＡ、とビタミンＡの前駆物質であるベータカロテンの濃度測定方法およびその装置に関し、この方法及び装置を用いて家畜，特に、高品質牛肉の生産現場で慣行されている肥育牛の血中ビタミンＡと、体内でビタミンＡになり得るベータカロテン濃度を測定することにより、血中ビタミンＡ濃度を意図的に制御するための測定方法およびその装置に関するものである。

従来、高品質牛肉の生産現場で慣行されている肥育牛のビタミンＡの制御の目的のメリットは、脂肪交雑（所謂，霜降り）向上、肉色の向上を図り、収益向上であるが、制御の失敗によるデメリットもある。
即ち，家畜のビタミンＡ欠乏は、肉用牛の飼養現場で多発し、健康被害（死亡事故、失明、浮腫、尿石）や、生産性の低下〔体重の増加不良、飼料要求率の増大、牛肉生産量の低下、異常肉（水腫）発生〕の原因となっている。
一方、ビタミンＡの過剰給与は、上質肉の最重要形質である脂肪交雑（所謂，霜降り）の形成を妨げることが明らかにされている。

このことから、肉用牛の生産現場における的確なビタミンＡ、ベータカロテン制御を可能にする方法および装置が必要とされる。
それに対して、従来、肉用牛のビタミンＡの栄養状態は、飼育者が家畜の外貌や行動の観察により推測される場合が多いが、観察不測や個体ごとの症状の違いに対応できない等の理由から、誤った推測による事故が後を絶たない。

このように、ビタミンＡの栄養状態を的確に把握するためには、家畜の血中ビタミンＡ、ベータカロテン濃度を測定することが最も有効であるが、この測定には高額な費用を要するため、技術者や獣医師などによる利用に留まっているのが実状であった。

また、従来のビタミンＡ、ベータカロテン測定は、指導者や獣医師が現場で血液を採取し、事務所に持ち帰った後、外部（または内部）の検査機関に出検し、後日検査結果を受け取ってから対処するため、即時的な対応は出来ないという欠点がある。

そのため、血中ビタミンＡ、ベータカロテン濃度測定の、結果を即時に得ることにより迅速な診断が可能となる測定方法や廉価な装置及びランニングコスト、分析作業が簡易化でき、農家による利用も充分できる家畜の血中ビタミンＡ、ベータカロテン濃度測定方法およびその装置の開発が待たれている。

また、ビタミンＡ分析においては、機器分析が行われており、その分析機器は、検査機関や研究所においては、精密分析をする場合、高速液体クロマトグラフィーを用いて物質を分離して測定するというＨＰＬＣ法や、簡便法としては、分光光度計を用いて吸光度を測定する紫外吸光度法が用いられていた。

また、水質汚染成分の濃度測定を、発色試薬と反応させたときの吸光度を測定するハンディータイブの濃度測定装置があった。例えば、特許文献１のように。

特開２００４−２３９８１３号公報

そこで、この発明の課題は、簡易な測定方法と従来の測定装置を改良した装置を用いて農家現場において、１つの抽出液（サンプル）で、血中ビタミンＡとベータカロテンの濃度を同時に、かつ、簡易、迅速に測定できる家畜の血中ビタミンＡとベータカロテンの濃度測定方法およびその装置を開発・提供することにある。

上記の課題を解決するため、本発明は、以下の構成を採用した。
[１]蛋白変性液と脂溶成分抽出液と抗酸化剤とを混合して混合液を得る工程と、前記混合液と家畜の全血とを攪拌混合して攪拌混合液を得る工程と、前記攪拌混合液を遠心分離することにより脂溶成分抽出液層に、前記家畜の全血中に含まれるビタミンＡ及びベータカロテンを抽出する工程と、前記脂溶成分抽出液層に２種類の特定波長の光を照射して、各々の照射波長における吸光度を測定する工程と、前記吸光度から、前記家畜の全血中に含まれるビタミンＡ及びベータカロテンの濃度を演算する工程とからなることを特徴とする家畜の血中ビタミンＡ及びベータカロテンの濃度測定方法。
[２]前記２種類の特定波長は、３２５ｎｍ及び４５０ｎｍであり、３２５ｎｍの照射波長における吸光度からビタミンＡの濃度を演算し、４５０ｎｍの照射波長における吸光度からベータカロテンの濃度を演算することを特徴とする[１]に記載の家畜の血中ビタミンＡ及びベータカロテンの濃度測定方法。
[３]２種類の特定波長の光を測定対象液に照射する光源部と、前記光源部から照射され、前記測定対象液を透過した光を受光する受光部と、を備え、蛋白変性液、脂溶成分抽出液及び抗酸化剤を混合した混合液並びに家畜の全血を攪拌混合した後、該攪拌混合液を遠心分離することにより、前記家畜の全血中に含まれるビタミンＡ及びベータカロテンを脂溶成分抽出液層に抽出し、該脂溶成分抽出液層に前記２種類の特定波長の光を照射して、各々の照射波長における吸光度を測定し、該測定値の演算により前記家畜の全血中に含まれるビタミンＡ及びベータカロテンの濃度を測定することを特徴とする家畜の血中ビタミンＡ及びベータカロテンの濃度測定装置。
[４]前記２種類の特定波長は、３２５ｎｍ及び４５０ｎｍであり、３２５ｎｍの照射波長における吸光度からビタミンＡの濃度を測定し、４５０ｎｍの照射波長における吸光度からベータカロテンの濃度を測定することを特徴とする[３]に記載の家畜の血中ビタミンＡ及びベータカロテンの濃度測定装置。

この発明による測定方法によると、
１） 従来分析法で必要な血清分離工程、蛋白変性工程（除蛋白）、抽出工程のうち、血清分離工程を省略しており、全血からビタミンＡの抽出を可能とした。
２） さらに、従来、蛋白変性工程における溶血により測定値が２０〜３０％低下（一部ビタミンＡの破壊）する問題を、蛋白変性工程と脂溶成分抽出工程を同時並行して行うことにより解決し、測定時間を大幅に短縮できる。
３） また、全血中のビタミンＡ濃度は血清中濃度よりも３０〜３５％程度低いため、ビタミンＡ濃度が低い肥育牛血の測定精度維持が懸念されることに対し、脂溶成分抽出液に対する検体の比率を高め、該抽出液のビタミンＡ濃度を高くすることにより対応する等極めて有益なる効果を奏する。
また、この発明の測定装置によると、
４） 既存の装置に比べ、ハンディであり、農家現場で手軽に血液分析でき、即時に測定結果が判明し、また、分析作業の簡素化が図れ、迅速にビタミンＡ濃度測定が可能である。
５） さらに、この装置によると、吸光度は、特定波長が３２５ｎｍおよび４５０ｎｍの二波長測定とすることにより、抽出液の測定に対して、波長の切替えが不要であり、３２５ｎｍをピーク発光波長としてビタミンＡ測定ができ、かつ、４５０ｎｍをピーク発光波長としてビタミンＡ前駆物質であるベータカロテンとを同時に測定できる等の極めて有益なる効果を奏する。

本発明の実施工程の一実施例を示す説明図である。 本発明の一実施例を示す測定装置の説明図である。 本発明の方法を用いて抽出した牛血液中のビタミンＡ濃度およびベータカロテン濃度とを市販の分光光度計とで比較測定したグラフ図であり、（ａ）はビタミンＡの吸光度の測定結果であり、（ｂ）は、ベータカロテンの吸光度の測定結果である。 従来例の実施工程の一実施例を示す説明図である。

以下、本発明について詳細に説明する。なお、本発明においては、以下の記述に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲においては適宜変更可能である。

次に、この発明の一実施例を図面に従って詳述する。
本実施例に係る家畜の血中ビタミンＡ及びベータカロテンの濃度測定方法は、蛋白変性液と脂溶成分抽出液と抗酸化剤とを混合して混合液を得る工程（Ｖ）と、混合液と家畜の全血とを攪拌混合して攪拌混合液を得る工程（Ｗ）と、攪拌混合液を遠心分離することにより脂溶成分抽出液層に、家畜の全血中に含まれるビタミンＡ及びベータカロテンを抽出する工程（Ｘ）と、脂溶成分抽出液層に２種類の特定波長の光を照射して、各々の照射波長における吸光度を測定する工程（Ｙ）と、吸光度から、家畜の全血中に含まれるビタミンＡ及びベータカロテンの濃度を演算する工程（Ｚ）とからなる。

尚、抗酸化剤の具体的な一例としては、ＢＨＴ（ブチルヒドロキシトルエン）であり、蛋白変性液の具体的な一例としては、エタノールであり、脂溶成分抽出液の具体的な一例としては、ヘキサンである。しかし、これらと同一な作用をなす薬剤であれば、これらの薬剤に限定されることはない。
蛋白変性液と脂溶成分抽出液と抗酸化剤とを混合して混合液を得る工程（Ｖ）は、具体的には、エタノールとヘキサンを１:２の混合比としたものにＢＨＴ０．０２％を添加し、混合して、混合液を得るものである。
次に、混合液と家畜の全血とを攪拌混合して攪拌混合液を得る工程（Ｗ）は、具体的には、工程（Ｖ）で得た混合液１．２ｍｌに家畜(例えば、牛)の全血０．６ｍｌを添加し（検体・エタノール比 ３：２、検体・ヘキサン比３：４）、３０秒間攪拌して攪拌混合液を得るものである。
さらに、攪拌混合液を遠心分離することにより脂溶成分抽出液層に、家畜の全血中に含まれるビタミンＡ及びベータカロテンを抽出する工程（Ｘ）は、具体的には、工程（Ｗ）で得た攪拌混合液を、２０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、ヘキサン層を分離するものである。
そして、脂溶成分抽出液層に２種類の特定波長の光を照射して、各々の照射波長における吸光度を測定する工程（Ｙ）は、具体的には、３２５ｎｍ及び４５０ｎｍの光を、工程（Ｘ）で分離したヘキサン層に照射し、各々の照射波長における吸光度を測定するものである。
吸光度から、家畜の全血中に含まれるビタミンＡ及びベータカロテンの濃度を演算する工程（Ｚ）は、具体的には、３２５ｎｍの照射波長における吸光度からビタミンＡの濃度を演算し、４５０ｎｍの照射波長における吸光度からベータカロテンの濃度を演算するもものである。

次に、この方法の発明に基づいて抽出したビタミンＡ及びベータカロテンを簡易に測定する測定装置の一実施例を図２に基づいて詳述する。
尚、この装置は、出願人の測定装置（特開２００３−６５９５１）の改良に基づくもので、該測定器の内部に、挿入管（１）を設けており、該挿入管（１）に、サンプルである抽出液（３）を入れた測定容器（２）を挿入するものであり、前記挿入管（１）を横方向に貫通して光路（１ａ）と光路（１ｂ）が、挿入管（１）の長さ方向に近接して設けてある。

そして、挿入管（１）を挟んで、光路（１ａ）の両側には、３２５ｎｍのピーク発光波長を有するＬＥＤ（６ａ）とフォトダイオード（７ａ）が、及び光路（１ｂ）の両側には、４５０ｎｍの発光波長を有するＬＥＤ（６ｂ）とフォトダイオード（７ｂ）が、それぞれ光の照射方向が逆向きになるように設置されている。即ち，ＬＥＤ（６ａ）とフォトダイオード（７ｂ）、及びＬＥＤ（６ｂ）とフォトダイオード（７ａ）とは、それぞれ挿入管（１）の同じ側に、その長さ方向に沿い近接して配置されている。

ＬＥＤ（６ａ，６ｂ）はＣＰＵ（１２）に接続された制御部（１３）により、ＯＮ／ＯＦＦ及び発光量が制御される。フォトダイオード（７ａ，７ｂ）の出力電流はアンプ部（１４）で電圧に変更され、更にＡ／Ｄ変換器（１５）でデジタル変換されてＣＰＵ（１２）に送られる。ＣＰＵ（１２）には、測定結果を表示するための表示部（１６）、設定などのための操作キー（１７）、及びデータなどの記憶のためのメモリ（１８）が接続されている。

次に、この発明の測定装置による測定操作を説明すると、最初に、サンプルである抽出液（３）として測定容器（３）にヘキサンを入れ、この測定容器（２）を挿入管（１）にセットする。続いて、ＬＥＤ（６ｂ）はＯＦＦにした状態で、制御部（１３）によりＬＥＤ（６ａ）に電流を流し、３２５ｎｍの光を発光させる。ＬＥＤ（６ａ）の光は光路（１ａ）を通って測定容器（２）のサンプル（３）を通過し、更に光路（１ａ）を経てフォトダイオード（７ａ）に到達する。この透過光を受光したフォトダイオード（７ａ）で発生した電流は、アンプ部（１４）により電圧変換され及びＡ／Ｄ変換器（１５）でデジタル変換され、ＣＰＵ（１２）により電圧値ＲＳａとして測定される。同時に、ＬＥＤ（６ａ）の光は直接又は挿入管（１）の壁面で反射し、ＬＥＤ（６ａ）に近接して設置されたフォトダイオード（７ｂ）に参照光として到達する。このとき、フォトダイオード（７ｂ）で発生した電流が同様にアンプ部（１４）、Ａ／Ｄ変換器（１５）を通って変換され、ＣＰＵ（１２）により電圧値ＲＲａとして測定する。

続いて、ＬＥＤ（６ａ）をＯＦＦにした状態で、ＬＥＤ（６ｂ）をＯＮにして４５０ｎｍの光を発光させる。ＬＥＤ（６ｂ）の光は光路（１ｂ）を通って測定容器（２）のサンプル（３）を通過し、フォトダイオード（７ｂ）に到達する。この透過光を受光したフォトダイオード（７ｂ）で発生した電流は、アンプ部（１４）、Ａ／Ｄ変換器（１５）で変換し、ＣＰＵ（１２）により電圧値ＲＳｂとして測定する。同時に、ＬＥＤ（６ｂ）の光は直接又は挿入管（１）の壁面で反射し、ＬＥＤ（６ｂ）に近接して設置されたフォトダイオード（７ａ）に到達し、この参照光を受光したフォトダイオード（７ａ）で発生した電流を同様処理して、ＣＰＵ（１２）により電圧値ＲＲｂとして測定する。

次に、この方法の発明に基づいてビタミンＡおよびベータカロテンを抽出した脂溶成分抽出液２ｍｌをサンプル（３）として測定容器（２）に移し、挿入管（１）にセットする。続いて、上記参照用サンプルの場合と同様に、ＬＥＤ（６ｂ）をＯＦＦにしてＬＥＤ（６ａ）から３２５ｎｍの光を発光させる。ＬＥＤ（６ａ）のサンプル（３）を通過した透過光をフォトダイオード（７ａ）で受光し、同様の処理により電圧値ＳＳａを測定する。同時に、ＬＥＤ（６ａ）からフォトダイオード（７ｂ）に直接到達した光を参照光として受光し、同様に処理して電圧値ＳＲａを測定する。

上記操作においてヘキサンから測定した電圧値ＲＳａを透過率１として、ビタミンＡサンプルの透過率を下記数式１により算出する。更に、求めたビタミンＡサンプルの透過率から、ランベルトーベールの法則に従って、下記数式２によりビタミンＡサンプルの吸光度を計算することができる。

〔数式１〕
ビタミンＡサンプルの透過率
＝電圧値ＳＳａ／電圧値ＲＳａ×電圧値ＳＲａ／電圧値ＲＲａ

〔数式２〕
ビタミンＡサンプルの吸光度
＝−ｌｏｇ（ビタミンＡサンプルの透過率）

上記数式１において、電圧値ＳＲａ／電圧値ＲＲａはＬＥＤ（６ａ）の光量変化を補正するためのものであり、この補正を行わない場合には吸光度測定値に誤差を生じる。

続いて、上記と同様にＬＥＤ（６ａ）をＯＦＦにした状態で、ＬＥＤ（６ｂ）をＯＮにして４５０ｎｍの光を発光させる。ＬＥＤ（６ｂ）の光は光路（１ｂ）を通って測定容器（２）のサンプル（３）を通過し、フォトダイオード（７ｂ）で受光され、フォトダイオード（７ｂ）で発生した電流をアンプ部（１４）、Ａ／Ｄ変換器（１５）で変換し、ＣＰＵ（１２）により電圧値ＳＳｂとして測定する。同時に、ＬＥＤ（６ｂ）からの直接光をフォトダイオード（７ａ）で受光し、同様に処理してＣＰＵ（１２）により電圧値ＳＲｂとして測定する。

ベータカロテンサンプルの透過率及び吸光度の計算はビタミンＡサンプルと同様である。

〔数式３〕
ベータカロテンサンプルの透過率
＝電圧値ＳＳｂ／電圧値ＲＳｂ×電圧値ＳＲｂ／電圧値ＲＲｂ

〔数式４〕
ベータカロテンサンプルの吸光度
＝−ｌｏｇ（ベータカロテンサンプルの透過率）

また、この装置は、ＬＥＤを光源として使用しているため、小型で電池作動によるポータブルタイプの装置として構築することも容易である。

図３（ａ），図３（ｂ）は、この発明の方法を用いて抽出した牛血液中のビタミンＡおよびベータカロテンを市販の分光光度計で測定した吸光度と本発明の測定装置で測定した吸光度の相関図である。ビタミンＡ、ベータカロテンとも市販の分光光度計との相関は良好で、本装置によりビタミンＡ、ベータカロテンの吸光度を精度良く測定できることがわかる。

また、ビタミンＡの吸光度およびベータカロテンの吸光度から、ビタミンＡ濃度およびベータカロテン濃度を求めることは、予め各成分濃度と吸光度の関係を求めておけば容易であり、本装置に内蔵したＣＰＵによりそれを計算し、表示器に各成分濃度を表示することができる。したがって、本装置を用いることにより簡便にビタミンＡおよびベータカロテン濃度を測定することができる。

さらに、本発明の実施例ではビタミンＡの測定用として３２５ｎｍのピーク発光波長のＬＥＤを、ベータカロテンの測定用として４５０ｎｍのピーク発光波長のＬＥＤをそれぞれ使用したが、ビタミンＡで３１０〜３４０ｎｍ、ベータカロテンで４３０〜４７０ｎｍの範囲でピーク発光波長を含む光源を適切に選択できる。

この発明の家畜の血中ビタミンＡおよびベータカロテン濃度測定方法、およびその装置の製造技術を確立し、それに基づいて測定方法を実施し、また、測定装置の製造・販売をすることにより、産業上の利用可能性があるものである。

１ 挿入管
２ 測定容器
３ サンプル（抽出液）
１ａ，１ｂ 光路
６ａ，６ｂ ＬＥＤ
７ａ，７ｂ フォトダイオード
１２ ＣＰＵ
１３ 制御部
１４ アンプ部
１５ Ａ／Ｄ変換器
１６ 測定結果を表示するための表示部
１７ 設定などのための操作キー
１８ データなどの記憶のためのメモリ

Claims (4)

1. 蛋白変性液と脂溶成分抽出液と抗酸化剤とを混合して混合液を得る工程と、
   前記混合液と家畜の全血とを攪拌混合して攪拌混合液を得る工程と、
   前記攪拌混合液を遠心分離することにより脂溶成分抽出液層に、前記家畜の全血中に含まれるビタミンＡ及びベータカロテンを抽出する工程と、
   前記脂溶成分抽出液層に２種類の特定波長の光を照射して、各々の照射波長における吸光度を測定する工程と、
   前記吸光度から、前記家畜の全血中に含まれるビタミンＡ及びベータカロテンの濃度を演算する工程と
   からなることを特徴とする家畜の血中ビタミンＡ及びベータカロテンの濃度測定方法。
2. 前記２種類の特定波長は、３２５ｎｍ及び４５０ｎｍであり、３２５ｎｍの照射波長における吸光度からビタミンＡの濃度を演算し、４５０ｎｍの照射波長における吸光度からベータカロテンの濃度を演算することを特徴とする請求項１に記載の家畜の血中ビタミンＡ及びベータカロテンの濃度測定方法。
3. 第１の特定波長の光と第２の特定波長の光を測定対象液に照射する光源部と、
   前記光源部から照射され、前記測定対象液を透過した光を受光する受光部と、
   前記受光部が受光した光に基づく測定値を記憶させるメモリと、
   前記光源部を制御するとともに、前記メモリに記憶された測定値に基づき演算処理を行なう制御部と、を備え、
   前記制御部は、
   （１）脂溶成分抽出液を第１の測定対象液として、前記第１の特定波長及び前記第２の特定波長を照射したときの測定値、並びに家畜の全血中に含まれるビタミンＡ及びベータカロテンを抽出させた脂溶成分抽出液を第２の測定対象液として、前記第１の特定波長及び前記第２の特定波長を照射したときの測定値を前記メモリに各々記憶させ、
   （２）前記第１の測定対象液を第１の特定波長で測定したときの測定値と、前記第２の測定対象液を第１の特定波長で測定したときの測定値とに基づき、ビタミンＡの吸光度を、並びに、前記第１の測定対象液を第２の特定波長で測定したときの測定値と、前記第２の測定対象液を第２の特定波長で測定したときの測定値とに基づき、ベータカロテンの吸光度をそれぞれ演算し、
   （３）前記ビタミンＡの吸光度から前記家畜の全血中に含まれるビタミンＡの濃度を、並びに、前記ベータカロテンの吸光度から前記家畜の全血中に含まれるベータカロテンの濃度をそれぞれ演算する
   ことを特徴とする家畜の血中ビタミンＡ及びベータカロテンの濃度測定装置。
4. 前記第１の特定波長は３２５ｎｍであり、前記第２の特定波長は４５０ｎｍであることを特徴とする請求項３に記載の家畜の血中ビタミンＡ及びベータカロテンの濃度測定装置。

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