JP6260902B2

JP6260902B2 - ビタミンａ測定装置及びビタミンａ測定システム

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Publication number: JP6260902B2
Application number: JP2014046811A
Authority: JP
Inventors: 幸雄河野; 雅行和田; 忠文宮野; 勝久廣川; 基次藤原; 井上　浩一; 浩一井上; 伊東　哲; 哲伊東; 靖羽毛田
Original assignee: Hiroshima Prefecture; DKK TOA Corp
Current assignee: Hiroshima Prefecture; DKK TOA Corp
Priority date: 2014-03-10
Filing date: 2014-03-10
Publication date: 2018-01-17
Anticipated expiration: 2034-03-10
Also published as: JP2015169627A

Description

本発明は、ビタミンＡ測定装置及びビタミンＡ測定システムに関する。さらに詳しくは、血液等、夾雑物を多く含む試料のビタミンＡ測定に適したビタミンＡ測定装置及びビタミンＡ測定システムに関する。

ビタミンＡは、ヒトにとっても、家畜にとっても、欠乏すると、失明、浮腫、尿石等の健康被害をもたらす重要な栄養素である。その一方、ビタミンＡは過剰摂取した場合に毒性を持つことがある。
また、家畜の飼育にあたっては、ビタミンＡの摂取量を適切に制限すべき場合もある。例えば、高品質肉用牛の生産現場では、脂肪交雑（所謂，霜降り）向上、肉色の向上の観点で、ビタミンＡの摂取量を、健康被害や生産性の低下をもたらさない範囲で削減することが行われている。
そのため、従来、個々の家畜の栄養状態を把握するため、家畜の血液中のビタミンＡ濃度を測定することが行われている。また、家畜に適量のビタミンＡを摂取させるため、飼料や、飼料に添加するビタミン製剤中のビタミンＡ含有量を測定することが行われている。
また、ヒトが食する食品、食品の原材料についても、食品成分調査の一環として、ビタミンＡ含有量の調査が行われている。

ビタミンＡ含有量（液体中の含有量の場合、濃度）の測定を、検査機関や研究所において精密分析する際は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が用いられている。また、簡便法として、吸光度測定法が知られている。
しかし、血液等の試料のビタミンＡを吸光度測定法により求める場合、ビタミンＡ以外の夾雑物による吸収が無視できないため、正確な測定が難しい。そこで、非特許文献１では、紫外線照射によりビタミンＡを破壊する前後において吸光度を測定し、前後の吸光度差からビタミンＡ濃度を求めることが開示されている。
非特許文献１において、紫外線照射は水銀ランプにより行っている。試料を入れた複数の試験管は、垂直に立てた水銀ランプを囲むように配置された一対の半円形の試験管ラックに設けた孔に挿入されて、水銀ランプからの紫外線照射を受けるようになっている。

ＯｔｔｏＡ．Ｂｅｓｓｅｙ，ＯｌｉｖｅｒＨ．Ｌｏｗｒｙ，ＭａｒｙＪａｎｅＢｒｏｃｋａｎｄＪｅａｎｎｅＡ．Ｌｏｐｅｚ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９４６，１６６：１７７−１８８．

しかし、非特許文献１の方法を用いても、夾雑物を多く含む試料のビタミンＡ測定は、正確に行えない場合が多かった。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、夾雑物を多く含む試料であっても、簡便に正確なビタミンＡ測定が可能なビタミンＡ測定装置及びビタミンＡ測定システムを提供することを課題とする。

上記の課題を達成するために、本発明は以下の構成を採用した。
［１］試料中の脂溶成分が抽出された抽出液を収容したセルを保持するセルホルダーと、
前記セルホルダーに保持されたセル中の抽出液に、ビタミンＡに吸収されるビタミンＡ検出光を照射するビタミンＡ検出用ＬＥＤ光源と、
前記セル中の抽出液を透過した光を検出する検出器と、
前記セル中の抽出液に、ビタミンＡを分解するビタミンＡ分解光を照射するビタミンＡ分解用ＬＥＤ光源と
を備えることを特徴とするビタミンＡ測定装置。
［２］前記セルホルダーに保持されるセルが、上端が開口し下端が閉塞された有底筒状のセルであり、
前記ビタミンＡ検出用ＬＥＤ光源と前記検出器とが、前記セルホルダーに保持されたセルを該セルの側面側から挟むように配置され、
前記ビタミンＡ分解用ＬＥＤ光源が、前記セルホルダーに保持されたセルの下端側から、前記セル中の抽出液に対してビタミンＡ分解光を照射するように配置された［１］に記載のビタミンＡ測定装置。
［３］前記セルホルダーに保持されるセルが、上端が開口し下端が閉塞された有底筒状のセルであり、
前記ビタミンＡ検出用ＬＥＤ光源と前記検出器とが、前記セルホルダーに保持されたセルを該セルの側面側から挟むように配置され、
前記ビタミンＡ分解用ＬＥＤ光源が、前記セルホルダーに保持されたセルの側面側から、前記セル中の抽出液にビタミンＡ分解光を照射するように配置された［１］に記載のビタミンＡ測定装置。
［４］前記ビタミンＡ検出光のピーク波長が、３１０〜３４０ｎｍである［１］〜［３］のいずれか一項に記載のビタミンＡ測定装置。
［５］前記ビタミンＡ分解光のピーク波長が、２８０〜４００ｎｍである［１］〜［４］のいずれか一項に記載のビタミンＡ測定装置。
［６］さらに、前記セルホルダーに保持されたセル中の抽出液に、ベータカロテンに吸収されるベータカロテン検出光を照射するベータカロテン検出用ＬＥＤ光源を備える［１］〜［５］のいずれか一項に記載のビタミンＡ測定装置。

［７］［１］〜［６］のいずれか一項に記載のビタミンＡ測定装置と、演算装置とを備え、
該演算装置は、前記セル中の抽出液にビタミンＡ分解光を照射する前後における、前記検出器で検出されるビタミンＡ検出光の吸光度の差に基づき、前記試料中のビタミンＡ含有量または該ビタミンＡ含有量に対応する指標を求めることを特徴とするビタミンＡ測定システム。
［８］［６］に記載のビタミンＡ測定装置と、演算装置とを備え、
該演算装置は、前記セル中の抽出液にビタミンＡ分解光を照射する前後における、前記検出器で検出されるビタミンＡ検出光の吸光度の差に基づき、前記試料中のビタミンＡ含有量または該ビタミンＡ含有量に対応する指標を求めると共に、前記セル中の抽出液にビタミンＡ分解光を照射する前または後における前記検出器で検出されるベータカロテン検出光の吸光度に基づき、前記試料中のベータカロテン含有量または該ベータカロテン含有量に対応する指標を求めることを特徴とするビタミンＡ測定システム。

本発明のビタミンＡ測定装置及びビタミンＡ測定システムによれば、夾雑物を多く含む試料であっても、簡便に正確なビタミンＡ測定が可能である。

本発明の第１実施形態に係るビタミンＡ測定装置の、（ａ）は縦断面図、（ｂ）は（ａ）のＩ−Ｉ断面図である。本発明の第２実施形態に係るビタミンＡ測定装置の、（ａ）は縦断面図、（ｂ）は（ａ）のII−II断面図である。実施例の結果を示すグラフである。

［第１実施形態］
本発明の第１実施形態に係るビタミンＡ測定装置（測定装置１）について、図１を参照して説明する。本実施形態の測定装置１は、基台１０と、複数のビタミンＡ分解用のＬＥＤ光源１２と、セル２０を保持するためのセルホルダー３０と、ビタミンＡ検出用のＬＥＤ光源４１及び検出器４２と、ベータカロテン検出用のＬＥＤ光源５１及び検出器５２と、から概略構成されている。

基台１０は、ＬＥＤ光源１２の光以外の外光がセル２０の下方からセル２０内に侵入しないよう、遮光性の材質で形成されている。
ビタミンＡ分解用のＬＥＤ光源１２は、ベアチップの状態で、基台１０の上面に形成された凹部１１内に複数配列されている。本実施形態では、３２個（４個×８）を配列した例を示している。
ＬＥＤ光源１２は、ビタミンＡを分解可能な波長の光（ビタミンＡ分解光）を発せられるものであればよい。ＬＥＤ光源１２のピーク波長は２８０〜４００ｎｍであることが好ましく、３００〜３８０ｎｍであることがより好ましく、入手容易性の点から、３７５ｎｍ、または３６５ｎｍであることが特に好ましい。中でも、ピーク波長３７５ｎｍのものが、発光効率が高く熱がこもりにくい点、安価である点から好ましい。

セルホルダー３０に保持されるセル２０は上端が開口し下端が閉塞された有底角筒状であり、ほぼ正方形の底部２１と、肉厚で互いに対向する側面部２２、２３と、側面部２２、２３の両端側をつなぐ肉薄で互いに対向する側面部２４、２５とを備えている。また、これらの底部２１、側面部２２、２３、２４、２５で囲まれる空間が、断面長方形の液体収容部２６となっている。
なお、液体収容部２６の断面を長方形としてあるのは、少ない液料で光路長を確保するためである。したがって、収容する液体を充分な量確保できる場合は、液体収容部２６の断面は正方形とすることができる。
セル２０には、ＬＥＤ光源１２、４１、５１の各々から発せられる光を透過可能で、かつ、これらの光に対して耐光性を有する材質を用いることが好ましい。例えば、硝子やアクリル樹脂を用いることが好ましく、特に、石英硝子を用いることが好ましい。

セルホルダー３０は、基台１０のＬＥＤ光源１２が配列された部分の上に固定されている。セルホルダー３０は有底角筒状であり、ほぼ正方形の底部３１と、下端が底部３１の周縁を囲むように設けられた側面部３２とを有している。また、これらの底部３１、側面部３２で囲まれる空間が、断面正方形のセル収容部３７となっている。

側面部３２には、ＬＥＤ光源４１から発せられる光を透過させるための一対の光透過孔３３、３４と、ＬＥＤ光源５１から発せられる光を透過させるための一対の光透過孔３５、３６とが形成されている。光透過孔３６は光透過孔３３の下方近傍に、光透過孔３５は光透過孔３４の下方近傍に形成されている。
セル収容部３７は、セル２０を、上側に手でつまめる程度の部分を残して収容できる深さとなっている。また、セル収容部３７の横断面外形（すなわち、側面部３２の内側）は、セル２０の外形より僅かに大きい寸法とされ、収容したセル２０を、ほぼ定位置に固定できるようになっている。

セルホルダー３０の底部３１には、ＬＥＤ光源１２から発せられる光を透過可能で、かつ、その光に対して耐光性を有する材質を用いることが好ましい。特に、石英硝子を用いることが好ましい。ＬＥＤ光源１２の光は、セルホルダー３０の底部３１を透過して、セル２０の下方からセル２０内に照射されるようになっている。
セルホルダー３０の側面部３２は、各ＬＥＤ光源から発せられる光以外の外光を遮断できるよう、遮光性を有していることが好ましい。例えば樹脂や金属等を用いて作製することができる。
底部３１と側面部３２とは、接着等により一体化させることができる。

また、このセルホルダー３０を側面側から挟むように（すなわち、セルホルダー３０内に配置されるセル２０を側面側から挟むように）、ビタミンＡ検出用のＬＥＤ光源４１と検出器４２が対向配置されている。
ＬＥＤ光源４１は、側面部３２に形成された光透過孔３３に対向して、検出器４２は、側面部３２に形成された光透過孔３４に対向して、各々配置されている。その結果、ＬＥＤ光源４１からセルホルダー３０内に配置されるセル２０を透過して検出器４２に至る光路が形成されるようになっている。
ＬＥＤ光源４１は、ビタミンＡに吸収される波長の光（ビタミンＡ検出光）を発せられるものであればよい。ＬＥＤ光源４１のピーク波長はビタミンＡの吸収極大波長付近である３１０〜３４０ｎｍであることが好ましく、３２５ｎｍであることがより好ましい。

また、このセルホルダー３０を側面から挟むように（すなわち、セルホルダー３０内に配置されるセル２０を側面側から挟むように）ベータカロテン検出用のＬＥＤ光源５１と検出器５２が対向配置されている。
ＬＥＤ光源５１は、側面部３２に形成された光透過孔３５に対向して、検出器５２は、側面部３２に形成された光透過孔３６に対向して、各々配置されている。その結果、ＬＥＤ光源５１からセルホルダー３０内に配置されるセル２０を透過して検出器５２に至る光路が形成されるようになっている。
ＬＥＤ光源５１は、ベータカロテンに吸収される波長の光（ベータカロテン検出光）を発せられるものであればよい。ＬＥＤ光源５１のピーク波長はベータカロテンの吸収極大波長付近である４３０〜４７０ｎｍであることが好ましく、４５３ｎｍであることがより好ましい。また、入手容易性の点から、４５０ｎｍ、または４５５ｎｍを好適に採用することができる。

ＬＥＤ光源５１の配置場所は検出器４２の下方近傍であり、検出器５２の配置場所はＬＥＤ光源４１の下方近傍である。そのため、ＬＥＤ光源４１のみを点灯した際、検出器５２は、ＬＥＤ光源４１の光を直接受光して、セル２０中の液体の影響を受けない参照光を測定できるようになっている。また、ＬＥＤ光源５１のみを点灯した際、検出器４２は、ＬＥＤ光源５１の光を直接受光し、セル２０中の液体の影響を受けない参照光を測定できるようになっている。
なお、ＬＥＤ光源４１、５１と検出器４２、５２は、全体が図示を省略する遮光材によって覆われ、外光から遮断されるようになっている。

［第２実施形態］
本発明の第２実施形態に係るビタミンＡ測定装置（測定装置２）について、図２を参照して説明する。なお、図２において、図１と同等の構成部材には、図１と同じ符号を付して、その詳細な説明を省略する。
本実施形態の測定装置２は、基台６０と、複数のビタミンＡ分解用のＬＥＤ光源１２と、ＬＥＤ光源１２が取り付けられた照射板８０及び照射板９０と、セル２０を保持するためのセルホルダー７０と、ビタミンＡ検出用のＬＥＤ光源４１及び検出器４２と、ベータカロテン検出用のＬＥＤ光源５１及び検出器５２と、から概略構成されている。

ビタミンＡ分解用のＬＥＤ光源１２は、基台６０ではなく、照射板８０及び照射板９０に各々形成された凹部８１、凹部９１に、ベアチップの状態で複数配列されている。本実施形態では、各々７２個（８個×９）を配列した例を示している。
セルホルダー７０は、基台６０の上に固定されている。セルホルダー７０は有底角筒状であり、ほぼ正方形の底部７１と、互いに対向する遮光性の側面部７２ａ、７２ｂと、側面部７２ａ、７２ｂの両端側をつなぐように対向すると透光性の側面部７８ａ、７８ｂとを備えている。また、これらの底部７１、側面部７２ａ、７２ｂ、７８ａ、７８ｂで囲まれる空間が、断面正方形のセル収容部７７となっている。

側面部７２ａ、７２ｂには、ＬＥＤ光源４１から発せられる光を透過させるための一対の光透過孔７３、７４が各々形成されている。また、ＬＥＤ光源５１から発せられる光を透過させるための一対の光透過孔７５、７６が各々形成されている。光透過孔７６は光透過孔７３の下方近傍に、光透過孔７５は光透過孔７４の下方近傍に形成されている。
セル収容部７７の寸法は、第１実施形態のセル収容部３７と同様とされている。

底部７１と側面部７２ａ、７２ｂには、第１実施形態におけるセルホルダー３０の側面部３２と同様の材質を用いることができる。
側面部７８ａ、７８ｂは、ＬＥＤ光源１２から発せられる光を透過させるため、透光性とされている。側面部７８ａ、７８ｂの材質としては、第１実施形態におけるセルホルダー３０の底部３１と同様の材質を用いることができる。
ＬＥＤ光源１２の光は、セルホルダー７０の７８ａ、７８ｂを透過して、セル２０の両側面からセル２０内に照射されるようになっている。

また、このセルホルダー７０を側面部７２ａ、７２ｂ側から挟むように（すなわち、セルホルダー７０内に配置されるセル２０を側面側から挟むように）、ビタミンＡ検出用のＬＥＤ光源４１と検出器４２が対向配置されている。
ＬＥＤ光源４１は、側面部７２ａに形成された光透過孔７３に対向して、検出器４２は、側面部７２ｂに形成された光透過孔７４に対向して、各々配置されている。その結果、ＬＥＤ光源４１からセルホルダー７０内に配置されるセル２０を透過して検出器４２に至る光路が形成されるようになっている。

また、このセルホルダー７０を側面部７２ａ、７２ｂから挟むように（すなわち、セルホルダー３０内に配置されるセル２０を側面側から挟むように）ベータカロテン検出用のＬＥＤ光源５１と検出器５２が対向配置されている。
ＬＥＤ光源５１は、側面部７２ｂに形成された光透過孔７５に対向して、検出器５２は、側面部７２ａに形成された光透過孔７６に対向して、各々配置されている。その結果、ＬＥＤ光源５１からセルホルダー７０内に配置されるセル２０を透過して検出器５２に至る光路が形成されるようになっている。
ＬＥＤ光源４１、５１と検出器４２、５２の相互の位置関係は、第１実施形態と同様であり、検出器５２をＬＥＤ光源４１の参照光測定用に、検出器４２をＬＥＤ光源５１の参照光測定用に利用できる点も同様である。
ＬＥＤ光源４１、５１から発せられる光の光路は、ＬＥＤ光源１２の光の光路と直角に交差するようになっている。
また、ＬＥＤ光源４１、５１と検出器４２、５２は、全体が図示を省略する遮光材によって覆われ、外光から遮断されるようになっている。

照射板８０は、ＬＥＤ光源１２が配列された側を側面部７８ａに向けてセルホルダー７０に密着するように、基台６０の上に垂設されている。照射板９０は、ＬＥＤ光源１２が配列された側を側面部７８ｂに向けてセルホルダー７０に密着するように、基台６０の上に垂設されている。
照射板８０と照射板９０は、各ＬＥＤ光源の光以外の外光がセルホルダー７０の側面からセル２０内に侵入しないよう、遮光性を有するように形成されている。

［その他の実施形態］
上記各実施形態では、何れもセルホルダー３０に保持されるセル２０として、外形が正方形のものを用いたが液体収容部２６が断面長方形であることに合わせて、外形も長方形としてもよい。また、外形が円形や楕円形のセルであってもよい。
セル２０の外形が異なる場合、それに応じて、セルホルダー３０のセル収容部３７の形状も適宜変更すればよい。
また、ビタミンＡ分解用のＬＥＤ光源１２の配置場所にも特に限定はなく、例えば、セル２０の上部に配置して、セル２０中の液体に、上方からビタミンＡ分解光を照射するように構成してもよい。
また、上記各実施形態では、何れもベータカロテン検出用のＬＥＤ光源５１及び検出器５２を有するものとしたが、これらは必須ではない。ＬＥＤ光源４１の発光量の揺らぎを補正するための参照光を検出する検出器は、検出器５２と別個に用意してもよいし、省略してもよい。
また、ＬＥＤ光源４１とＬＥＤ光源５１に対応する２つのベアチップが１つのＬＥＤに内蔵されている場合、検出器４２及び検出器５２の一方を省略することができる。

［測定方法］
第１実施形態の測定装置１及び第２実施形態の測定装置２は、何れも、試料中の脂溶成分が抽出された抽出液について、ＬＥＤ光源１２を照射する前のＬＥＤ光源４１の光（ビタミンＡ検出光）の吸光度ＯＤ１と照射した後のＬＥＤ光源４１の光（ビタミンＡ検出光）の吸光度ＯＤ２とを測定する。
具体的には、まず、試料中の脂溶成分が抽出された抽出液を準備し、セル２０に入れる。抽出液の準備方法については、後述する。
抽出液を入れたセル２０を図１、図２に示すように、セルホルダー３０（７０）内に配置する。
そして、ビタミンＡ検出用のＬＥＤ光源４１のみを点灯し、検出器４２の受光量に基づき吸光度ＯＤ１を求める。このとき、同時に検出器５２でもＬＥＤ光源４１の光を参照光として受光し、この参照光により、ＬＥＤ光源４１の発光量の揺らぎを補正する。これにより、吸光度ＯＤ１を正確に求めることができる。

次に、ＬＥＤ光源１２のみを点灯し、セル２０中の抽出液に照射し、抽出液中のビタミンＡを分解する。ＬＥＤ光源１２による照射時間は、正確な測定結果を得やすいことから、抽出液中のビタミンＡのほぼ全量を分解できる時間とすることが好ましい。
分解に必要な時間は、照射される抽出液の量、抽出液の成分、ＬＥＤ光源１２の波長、発光効率、数、等に依存する。適切な分解時間は、同種の抽出液にＬＥＤ光源１２により光を照射しつつ検出器４２の受光量の変化を観察し、照射開始から受光量の変化がほぼなくなる迄とすればよい。
なお、精度よりも迅速な測定を優先する場合等は、抽出液中のビタミンＡの一部を分解できる所定の時間としても差し支えない。

次に、再度ビタミンＡ検出用のＬＥＤ光源４１のみを点灯し、検出器４２の受光量に基づき吸光度ＯＤ２を求める。このとき、同時に検出器５２でもＬＥＤ光源４１の光を参照光として受光し、この参照光により、ＬＥＤ光源４１の発光量の揺らぎを補正する。これにより、吸光度ＯＤ２を正確に求めることができる。
なお、後述のように、吸光度ＯＤ１と吸光度ＯＤ２は、両者の差をとる。そのため、これらの吸光度は、試料中の脂溶成分が抽出されていないゼロ液を用いて、ゼロ補正をする必要がない。

測定装置１及び測定装置２は、また、試料中の脂溶成分が抽出された抽出液について、ＬＥＤ光源５１の光（ベータカロテン検出光）の吸光度ＯＤＣを測定する。この吸光度ＯＤＣは、ゼロ液の吸光度を考慮してゼロ補正した吸光度である。
具体的には、前記吸光度ＯＤ１を測定する前、前記吸光度ＯＤ２を測定した後、または前記吸光度ＯＤ１と吸光度ＯＤ２を測定する間（ＬＥＤ光源１２の点灯の前でも後でもよい。）で、ベータカロテン検出用のＬＥＤ光源５１のみを点灯し、検出器５２の受光量に基づき吸光度ＯＤＳを求める。このとき、同時に検出器４２でもＬＥＤ光源５１の光を参照光として受光し、この参照光により、ＬＥＤ光源５１の発光量の揺らぎを補正する。これにより、吸光度ＯＤＳを正確に求めることができる。

また、別途、試料中の脂溶成分が抽出されていないゼロ液をセル２０に入れ、ベータカロテン検出用のＬＥＤ光源５１のみを点灯し、検出器５２の受光量に基づき吸光度ＯＤＲを求める。このとき、同時に検出器４２でもＬＥＤ光源５１の光を参照光として受光し、この参照光により、ＬＥＤ光源５１の発光量の揺らぎを補正する。これにより、吸光度ＯＤＲを正確に求めることができる。
ゼロ液は、試料中の脂溶成分を抽出するための抽出溶媒であることが好ましい。
吸光度ＯＤＣは、抽出液の吸光度ＯＤＳからゼロ液の吸光度ＯＤＲを差し引いた値として求められる。
なお、予めゼロ液を用いて測定装置１または測定装置２の吸光度のゼロ補正をしておけば（ゼロ液を測定したときの検出器５２の受光量を透過光量１００％としておけば）、吸光度ＯＤＳが吸光度ＯＤＣとなる。

［ビタミンＡ測定システム］
本発明のビタミンＡ測定装置によって得られた吸光度ＯＤ１と吸光度ＯＤ２から試料中のビタミンＡ含有量を求めるには、まず、吸光度ＯＤ１と吸光度ＯＤ２との差である吸光度差ΔＯＤ（＝ＯＤ１−ＯＤ２）を求める。
そして、ビタミンＡ標準液を用い予め作成した検量線等に基づき、吸光度差ΔＯＤに対応するビタミンＡ濃度を求め、これを抽出液のビタミンＡ濃度とする。次いで抽出効率等を考慮し、抽出液のビタミンＡ濃度から試料中のビタミンＡ含有量（試料が液体の場合はビタミンＡ濃度）を求める。

また、本発明のビタミンＡ測定装置によって得られた吸光度ＯＤ１と吸光度ＯＤ２から試料中のビタミンＡ含有量に対応する指標を求めてもよい。
試料中のビタミンＡ含有量に対応する指標とは、試料中のビタミンＡ含有量と何らかの対応をもつ数値や分類等を意味する。例えば、吸光度差ΔＯＤや抽出液のビタミンＡ濃度を、指標としてもよい。また、試料中のビタミンＡ含有量、吸光度差ΔＯＤ、抽出液のビタミンＡ濃度のいずれかに所定の係数をかけた数値を指標としてもよい。また、試料中のビタミンＡ含有量、吸光度差ΔＯＤ、抽出液のビタミンＡ濃度のいずれかを所定の閾値と比較し、「ビタミンＡ過剰」、「ビタミンＡ適量」、「ビタミンＡ不足」等に分類したものを指標としてもよい。

本発明のビタミンＡ測定装置によって得られた吸光度ＯＤＣから試料中のベータカロテン含有量を求めるには、ベータカロテン標準液を用い予め作成した検量線等に基づき、吸光度ＯＤＣに対応するベータカロテン濃度を求め、これを抽出液のベータカロテン濃度とする。次いで抽出効率等を考慮し、抽出液のベータカロテン濃度から試料中のベータカロテン含有量（試料が液体の場合はベータカロテン濃度）を求める。

また、本発明のビタミンＡ測定装置によって得られた吸光度ＯＤＣから試料中のベータカロテン含有量に対応する指標を求めてもよい。
試料中のベータカロテン含有量に対応する指標とは、試料中のベータカロテン含有量と何らかの対応をもつ数値や分類等を意味する。例えば、吸光度ＯＤＣや抽出液のベータカロテン濃度を、指標としてもよい。また、試料中のベータカロテン含有量、吸光度ＯＤＣ、抽出液のベータカロテン濃度のいずれかに所定の係数をかけた数値を指標としてもよい。また、試料中のベータカロテン含有量、吸光度ＯＤＣ、抽出液のベータカロテン濃度のいずれかを所定の閾値と比較し、「ベータカロテン過剰」、「ベータカロテン適量」、「ベータカロテン不足」等に分類したものを指標としてもよい。

吸光度ＯＤ１と吸光度ＯＤ２から、試料中のビタミンＡ含有量または該ビタミンＡ含有量に対応する指標を求める作業、並びに吸光度ＯＤＣから、試料中のベータカロテン含有量または該ベータカロテン含有量に対応する指標を求める作業は、本発明のビタミンＡ測定装置に内蔵された演算装置によって行ってもよいし、当該作業の一部または全部を、外部の演算装置または人手により行ってもよい。

［抽出液の調製］
抽出液は、多数の成分を含む試料の、脂溶成分を抽出した液である。試料としては、家畜やヒトの血液、飼料や、飼料に添加するビタミン製剤、ヒトが食する食品、食品の原材料等が挙げられる。
抽出は、試料と抽出溶媒を攪拌混合後分離し、抽出溶媒層を得ることにより行う。試料が固体の場合は、予め水溶液または水分散液としてから抽出溶媒と攪拌混合する。
また、蛋白質を含む試料の場合、抽出に先立ち、または抽出と同時に、除蛋白を行うことが好ましい。除蛋白は、蛋白質変性剤の添加により行うことができる。
また、酸化防止のために、抽出溶媒には抗酸化剤を添加することが好ましい。
また、ビタミンＡが脂肪酸エステルの形で存在している試料の場合は、予め鹸化し、ビタミンＡを分離しておく。

抽出溶媒としては、ヘキサン、ジエチルエーテル、石油エーテル、クロロホルム、アセトンが挙げられる。中でも沸点が高く測定中に揮発しにくいことから、ヘキサンが好ましい。
蛋白質変性剤としては、エタノール、過塩素酸、トリクロロ酢酸が挙げられる。中でも比較的安全で取扱い易いことから、エタノールが好ましい。
抗酸化剤としては、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ビタミンＣ、ビタミンＥが挙げられる。中でも保管中に劣化しにくいことから、ＢＨＴが好ましい。

［作用機序］
本発明者らは、非特許文献１の測定方法を用いても、夾雑物を多く含む試料のビタミンＡ測定は、正確に行えない場合が多い原因を検討した。その結果、吸光度の測定と紫外線照射を別の場所で行っているため、セルを移動させなければならない点に問題があることを見出した。すなわち、紫外線照射前後で２回吸光度を測定するが、移動のため２回の測定におけるセルの位置が微妙にずれる。また、人手により移動するため、移動の間にセルに与えられる振動も、その都度異なってしまう。そのため、セル中の液体が攪拌される状態にもばらつきが生じる。このような状況が相俟って、無視し得ない測定誤差をもたらしているものと考えられた。

本発明のビタミンＡ測定装置及びビタミンＡ測定システムによれば、ビタミンＡ検出と分解に、何れもコンパクトなＬＥＤ光源を用いたため、これらの光源を、セルの周囲に固定的に配置することができる。そのため、一連の測定を、セルを移動させることなく完結させることができる。
そのため、本発明のビタミンＡ測定装置及びビタミンＡ測定システムによれば、夾雑物を多く含む試料であっても、簡便に正確なビタミンＡ測定が可能になったものと考えられる。

［実験例１］
本発明の装置を用いて、牛の血液中のビタミンＡを測定した。
（試料と抽出液）
試料として、黒毛和種去勢肥育牛１２頭（約２５ヶ月齢）の血液を用いた。
牧場においてロープで牛を保定し、頸静脈から真空採血管を用いて約６ｍＬを採取した。採血後、畜産技術センター（広島県庄原市）に持帰り（約１時間）、遠心分離機（３５００ｒｐｍ×５０分）で血清を分離した。

２ｍＬ容の樹脂製マイクロチューブに血清０．５ｍＬとエタノール（９９．９％）０．５ｍＬを入れて攪拌し（フタを閉めて手で１０回程度ふり混ぜる）、除蛋白を行った。次いで、マイクロチューブにヘキサン０．８ｍＬを加え、シェーカーで５分間攪拌した。その後、卓上小型遠心分離機（６２００ｒｐｍ）で約１分間遠心分離し、上層（ヘキサン層）を抽出液として得た。

（測定装置等）
図１の装置を用いた。ただし、ＬＥＤ光源１２としては、ＬＥＤチップが多数配列された高出力紫外ＬＥＤモジュール（３６５ｎｍ：１５Ｖ５００ｍＡ）を用いた。ＬＥＤ光源４１としては、ピーク波長３２５ｎｍのものを用いた。
セル２０としては、液体収容部２６における光路長が１ｃｍ、幅３ｍｍであり、底部が透明加工された石英硝子製のセルを用いた。

（測定）
マイクロピペットを用いて抽出液をセル２０に入れ（約０．８ｍＬ）、ＬＥＤ光源４１のみを点灯し、セル２０を透過したＬＥＤ光源４１の吸光度を検出器４２で測定し吸光度ＯＤ１を得た。なお、吸光度ＯＤ１は、検出器５２で検出した参照光を用いて補正した。
吸光度ＯＤ１の測定後、ＬＥＤ光源１２のみを点灯し、６０秒間セル２０の下方からビタミンＡ分解光を照射した。
その後再びＬＥＤ光源４１のみを点灯し、セル２０を透過したＬＥＤ光源４１の吸光度を検出器４２で測定し吸光度ＯＤ２を得た。なお、吸光度ＯＤ２は、検出器５２で検出した参照光を用いて補正した。
各抽出液について２回ずつ測定した結果を表１に示す。表１には、吸光度差ΔＯＤ（＝ＯＤ１−ＯＤ２）も示した。また、吸光度ＯＤ１、吸光度ＯＤ２、吸光度差ΔＯＤの各平均値も示した。

［参照実験例１］
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、牛の血液中のビタミンＡを測定した。
（試料と抽出液）
試料として、実験例１と同じ黒毛和種去勢肥育牛１２頭（約２５ヶ月齢）の血液を用い、実験例１と同様にして抽出液を得た。抽出液０．６ｍＬをマイクロピペットで新しい１．５ｍＬ容マイクロチューブに分取し、窒素ガス気流下４０℃でヘキサンを全て揮発させた。その後、０．０５ｍＬのヘキサンを加え、チューブミキサーを用いて溶解させて濃縮抽出液を得、これをＨＰＬＣ打込試料とした。

（測定装置等）
ポンプ（Ｗａｔｅｒｓ６００、登録商標）、オートサンプラー（Ｗａｔｅｒｓ７１７、登録商標）、ＰＤＡ検出機（Ｗａｔｅｒｓ９９６、登録商標）を備えるＨＰＬＣシステムを用いた。カラムとしてはＷａｔｅｒｓ（登録商標）ＰｕｒｅｓｉｌＣ１８（カラム温度４０℃）を用い、移動層としては、クロロホルムとメタノールの混合溶液（１５％クロロホルム、８５％メタノール）を用いた。移動層の流量は１ｍＬ／ｍｉｎ、試料打込量は１０μＬ、検出波長は３２５ｎｍとした。

（測定）
標準試料としては、市販のレチノールをヘキサンに溶解して約１ｍｇ／ｍＬのビタミンＡ溶液とした１次稀釈液を、さらに２００倍に稀釈した２次希釈液を用いた。
標準試料（２次希釈液）の濃度は、３２５ｎｍの吸光度を分光光度計で測定して確認した。標準試料は吸光度が１．０９７であったことから、これに、レチノールの重量濃度（１ｇ／１００ｍＬ）あたりの３２５ｎｍにおける吸光度測定値（１８３２）と、レチノール当量（μｇ）とビタミンＡ効力（ＩＵ）との関係（レチノール当量０．３μｇ＝ビタミンＡ効力１ＩＵ）とを考慮して１８０１（吸光度１＝ビタミンＡ濃度１８０１ＩＵ／ｄＬ）を乗ずると、濃度は１９７６（ＩＵ／ｄＬ）であることが確認できた。

濃縮抽出液を打込試料とした際のＨＰＬＣ面積と、標準試料を打込試料とした際のＨＰＬＣ面積との対比から、濃縮抽出液のビタミンＡ濃度を算出した。また、希釈率と抽出効率を乗じて、濃縮抽出液のビタミンＡ濃度を、血清中ビタミンＡ濃度に換算した。
なお、希釈率と抽出効率は、以下の式により求められる値である。
希釈率＝濃縮抽出液の量（ｍＬ）／抽出液の量（ｍＬ）
＝０．０５／０．６＝０．０８３
抽出効率＝抽出に用いたヘキサンの量（ｍＬ）／抽出に用いた血清の量（ｍＬ）
＝０．８／０．５＝１．６
すなわち、濃縮抽出液が標準試料と同じＨＰＬＣ面積を得られたとすれば、その血清中ビタミンＡ濃度は、下記式より、２６２（ＩＵ／ｄＬ）となる。
１９７６（ＩＵ／ｄＬ）×０．０８３×１．６＝２６２（ＩＵ／ｄＬ）

各濃縮抽出液について２回ずつ測定し、得られた血清中ビタミンＡ濃度を、表１に「ＨＰＬＣ（ＩＵ／ｄＬ）」として示した。
また、実験例１で得た吸光度と参照実験例１で得た血清中ビタミンＡ濃度「ＨＰＬＣ（ＩＵ／ｄＬ）」の関係を図３に纏めた。

表１、図３に示すように、吸光度ＯＤ１は、ＨＰＬＣで求めた血清中ビタミンＡ濃度と充分な相関関係を示さなかったが、吸光度差ΔＯＤは、ＨＰＬＣで求めた血清中ビタミンＡ濃度と良好な相関関係を示した。また、表１に示すように、吸光度ＯＤ１は、２回の測定の差が最大で０．０１（分析Ｎｏ．９）であったが、吸光度差ΔＯＤは、２回の測定の差が最大で０．００５（分析Ｎｏ．８）であり、良好な再現性が得られることも確認できた。

［実験例２］
本発明の装置を用いて、鶏レバーとビタミン製剤のビタミンＡを測定した。なお、鶏レバーとビタミン製剤のビタミンＡは脂肪酸エステルの形で存在するため、除蛋白後抽出前に鹸化を行った。

（試料と抽出液）
試料（鶏レバーまたはビタミン製剤）の０．５ｇを５０ｍＬ容のフタ付遠沈管にとった。この遠沈管に１０％ピロガロール（酸化防止剤）含有エタノールを１０ｍＬ加え混ぜ、除蛋白を行った。次いで、この遠沈管に６０％ＫＯＨを２ｍＬ加え、時々手でふり混ぜながら７０℃で１時間湯浴することにより、鹸化を行った。
鹸化後、流水で５分間冷却してから、遠沈管に水５ｍＬ、ヘキサン１０ｍＬを加えてシェーカーで５分間混合した。その後、卓上小型遠心分離機（３０００ｒｐｍ）で約５分間遠心分離し、上層（ヘキサン層）を抽出液として得た。
得られた抽出液を、鶏レバーについては２０倍に、ビタミン製剤については１０倍に、各々ヘキサンで希釈して希釈抽出液を得た。

（測定）
実験例１と同じ装置を用い、実験例１と同様にして、吸光度ＯＤ１を得た。また、ＬＥＤ光源１２の点灯時間を表２に示すように変更した他は、実験例１と同様にして、吸光度ＯＤ２を得た。
表２には、ＬＥＤ光源１２の点灯時間が５分の時のＯＤ２を用いて求めた吸光度差ΔＯＤ（＝ＯＤ１−ＯＤ２）も示した。
また、吸光度差ΔＯＤに１８０１を乗じた値である「希釈抽出液ＶＡ濃度（ＩＵ／ｄＬ）」、「希釈抽出液ＶＡ濃度（ＩＵ／ｄＬ）」に希釈率を乗じた値である「抽出液ＶＡ濃度（ＩＵ／ｄＬ）」、「抽出液ＶＡ濃度（ＩＵ／ｄＬ）」に抽出効率を乗じた値である「試料中ＶＡ含有量（ＩＵ／１００ｇ）」を各々表２に示した。
なお、希釈率と抽出効率は、以下の式により求められる値である。
希釈率＝希釈抽出液の量（ｍＬ）／抽出液の量（ｍＬ）
抽出効率＝抽出に用いたヘキサンの量（ｍＬ）／抽出に用いた試料の量（ｇ）

［参照実験例２］
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、鶏レバーとビタミン製剤のビタミンＡを測定した。
（試料と抽出液）
試料として、実験例２と同じ鶏レバーとビタミン製剤を用い、実験例２と同様にして抽出液を得た。この抽出液を、濃縮や希釈をすることなく、そのままＨＰＬＣ打込試料とした。

（測定装置等）
参照実験例１と同じＨＰＬＣシステムを用い、参照実験例１と同じ条件でＨＰＬＣ測定を行った。標準試料も、参照実験例１と同じ市販のレチノールのヘキサン溶液（１９７６（ＩＵ／ｄＬ））を用いた。

濃縮抽出液を打込試料とした際のＨＰＬＣ面積と、標準試料を打込試料とした際のＨＰＬＣ面積との対比から、抽出液のビタミンＡ濃度を算出した。また、抽出効率を乗じて、抽出液のビタミンＡ濃度を、試料中ビタミンＡ含有量に換算した。
なお、抽出効率は、以下の式により求められる値である。
抽出効率＝抽出に用いたヘキサンの量（ｍＬ）／抽出に用いた試料の量（ｇ）
＝１０（ｍＬ）／０．５（ｇ）＝２０（ｍＬ／ｇ）
すなわち、抽出液が標準試料と同じＨＰＬＣ面積を得られたとすれば、その試料中ビタミンＡ含有量は、下記式より、３９５２０（ＩＵ／１００ｇ）となる。
１９７６（ＩＵ／ｄＬ）×２０＝３９５２０（ＩＵ／１００ｇ）
各抽出液について測定し、得られた試料中ビタミンＡ含有量を、表２に「ＨＰＬＣ（ＩＵ／１００ｇ）」として示した。
表２に示すように、本発明の装置で求めた鶏レバーとビタミン製剤中のビタミンＡ含有量は、ＨＰＬＣ法で求めた値と良く一致していた。

１０…基台、２０…セル、３０…セルホルダー、４１…ＬＥＤ光源、４２…検出器、
５１…ＬＥＤ光源、５２…検出器、１２…ＬＥＤ光源

Claims

試料中の脂溶成分が抽出された抽出液を収容したセルを保持するセルホルダーと、
前記セルホルダーに保持されたセル中の抽出液に、ビタミンＡに吸収されるビタミンＡ検出光を照射するビタミンＡ検出用ＬＥＤ光源と、
前記セル中の抽出液を透過した光を検出する検出器と、
前記セル中の抽出液に、ビタミンＡを分解するビタミンＡ分解光を照射するビタミンＡ分解用ＬＥＤ光源と
を備えることを特徴とするビタミンＡ測定装置。
前記セルホルダーに保持されるセルが、上端が開口し下端が閉塞された有底筒状のセルであり、
前記ビタミンＡ検出用ＬＥＤ光源と前記検出器とが、前記セルホルダーに保持されたセルを該セルの側面側から挟むように配置され、
前記ビタミンＡ分解用ＬＥＤ光源が、前記セルホルダーに保持されたセルの下端側から、前記セル中の抽出液に対してビタミンＡ分解光を照射するように配置された請求項１に記載のビタミンＡ測定装置。
前記セルホルダーに保持されるセルが、上端が開口し下端が閉塞された有底筒状のセルであり、
前記ビタミンＡ検出用ＬＥＤ光源と前記検出器とが、前記セルホルダーに保持されたセルを該セルの側面側から挟むように配置され、
前記ビタミンＡ分解用ＬＥＤ光源が、前記セルホルダーに保持されたセルの側面側から、前記セル中の抽出液にビタミンＡ分解光を照射するように配置された請求項１に記載のビタミンＡ測定装置。
前記ビタミンＡ検出光のピーク波長が、３１０〜３４０ｎｍである請求項１〜３のいずれか一項に記載のビタミンＡ測定装置。
前記ビタミンＡ分解光のピーク波長が、２８０〜４００ｎｍである請求項１〜４のいずれか一項に記載のビタミンＡ測定装置。
さらに、前記セルホルダーに保持されたセル中の抽出液に、ベータカロテンに吸収されるベータカロテン検出光を照射するベータカロテン検出用ＬＥＤ光源を備える請求項１〜５のいずれか一項に記載のビタミンＡ測定装置。
請求項１〜６のいずれか一項に記載のビタミンＡ測定装置と、演算装置とを備え、
該演算装置は、前記セル中の抽出液にビタミンＡ分解光を照射する前後における、前記検出器で検出されるビタミンＡ検出光の吸光度の差に基づき、前記試料中のビタミンＡ含有量または該ビタミンＡ含有量に対応する指標を求めることを特徴とするビタミンＡ測定システム。
請求項６に記載のビタミンＡ測定装置と、演算装置とを備え、
該演算装置は、前記セル中の抽出液にビタミンＡ分解光を照射する前後における、前記検出器で検出されるビタミンＡ検出光の吸光度の差に基づき、前記試料中のビタミンＡ含有量または該ビタミンＡ含有量に対応する指標を求めると共に、前記セル中の抽出液にビタミンＡ分解光を照射する前または後における前記検出器で検出されるベータカロテン検出光の吸光度に基づき、前記試料中のベータカロテン含有量または該ベータカロテン含有量に対応する指標を求めることを特徴とするビタミンＡ測定システム。