JPH1067664A - 活性酸素障害抑制剤 - Google Patents
活性酸素障害抑制剤Info
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- JPH1067664A JPH1067664A JP24255996A JP24255996A JPH1067664A JP H1067664 A JPH1067664 A JP H1067664A JP 24255996 A JP24255996 A JP 24255996A JP 24255996 A JP24255996 A JP 24255996A JP H1067664 A JPH1067664 A JP H1067664A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 強い抗酸化作用を有し、しかも従来知られて
いる抗酸化物質よりも効率的に細胞内に取り込まれるこ
とができて細胞などが受ける活性酸素障害を抑制する優
れた効果を発現する活性酸素障害抑制剤を提供する。 【解決手段】次の一般式 【化１】 （式中のＲ1、Ｒ2は水素原子又は炭素数２〜２４の飽和
若しくは不飽和脂肪酸残基であり、それぞれ同一であっ
てもよいし、異なっていてもよく、またｎは１〜５の整
数、Ｘは１価の陽イオンである）で表わされるホスファ
チジルクロマノール誘導体を有効成分とする活性酸素障
害抑制剤。
いる抗酸化物質よりも効率的に細胞内に取り込まれるこ
とができて細胞などが受ける活性酸素障害を抑制する優
れた効果を発現する活性酸素障害抑制剤を提供する。 【解決手段】次の一般式 【化１】 （式中のＲ1、Ｒ2は水素原子又は炭素数２〜２４の飽和
若しくは不飽和脂肪酸残基であり、それぞれ同一であっ
てもよいし、異なっていてもよく、またｎは１〜５の整
数、Ｘは１価の陽イオンである）で表わされるホスファ
チジルクロマノール誘導体を有効成分とする活性酸素障
害抑制剤。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ホスファチジルクロマ
ノール誘導体を有効成分とする活性酸素障害抑制剤に関
するものである。
ノール誘導体を有効成分とする活性酸素障害抑制剤に関
するものである。
【０００２】
【従来の技術】活性酸素による生体内での酸化反応は、
動脈硬化、白内障、リューマチ性関節炎、心筋並びに消
化器の虚血−再灌流後の組織障害などの種々の疾病や障
害をひき起こすこと、さらには発癌や老化にも関わるこ
とが知られている［”ＦｒｅｅＲａｄｉｃａｌｓ ｉｎ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｓｅｃ
ｏｎｄ ｅｄ．”（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ， Ｂ． ａｎ
ｄ Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ， Ｊ．Ｍ．Ｃ．，ｅ
ｄ．）， Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏ
ｒｄ（１９８９）， ”Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅ
ｓｓ：Ｏｘｉｄａｎｔｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｏｘｉｄａ
ｎｔｓ”（Ｓｉｅｓ，Ｈ．，ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９９１）参照］。ま
た、細胞レベルでの活性酸素が関与する障害としては、
脂質の酸化変性による細胞膜構造の破壊やタンパク質の
酸化変性による機能障害、ＤＮＡの切断などが挙げられ
る［”Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｇｉｎｇ， ａｎｄ
Ｄｉｓｅａｓｅ”（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ， Ｄ． ｅｔ
ａｌ．， ｅｄｓ．）， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，
ＮｅｗＹｏｒｋ，２９３−３０５（１９８４）参照］。
動脈硬化、白内障、リューマチ性関節炎、心筋並びに消
化器の虚血−再灌流後の組織障害などの種々の疾病や障
害をひき起こすこと、さらには発癌や老化にも関わるこ
とが知られている［”ＦｒｅｅＲａｄｉｃａｌｓ ｉｎ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｓｅｃ
ｏｎｄ ｅｄ．”（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ， Ｂ． ａｎ
ｄ Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ， Ｊ．Ｍ．Ｃ．，ｅ
ｄ．）， Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏ
ｒｄ（１９８９）， ”Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅ
ｓｓ：Ｏｘｉｄａｎｔｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｏｘｉｄａ
ｎｔｓ”（Ｓｉｅｓ，Ｈ．，ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９９１）参照］。ま
た、細胞レベルでの活性酸素が関与する障害としては、
脂質の酸化変性による細胞膜構造の破壊やタンパク質の
酸化変性による機能障害、ＤＮＡの切断などが挙げられ
る［”Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｇｉｎｇ， ａｎｄ
Ｄｉｓｅａｓｅ”（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ， Ｄ． ｅｔ
ａｌ．， ｅｄｓ．）， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，
ＮｅｗＹｏｒｋ，２９３−３０５（１９８４）参照］。
【０００３】したがって、培養細胞や生体より分離した
細胞などは、この様な活性酸素障害により保存中に死滅
したり、あるいは重大な機能障害を受けたりするため、
細胞を保存する上での大きな問題点となっている［Ｃｙ
ｔｏｂｉｏｌｏｇｙ，２５，３７７−３９３，（１９８
８）参照］。細胞内にはビタミンＥ（α−トコフェロー
ル）などの抗酸化物質やカタラーゼ、スーパーオキシド
ジスムターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼなどの抗
酸化酵素が存在する。しかし、酸化的細胞障害がおこる
こと自体、これらの生体内物質だけでは不十分なことを
示している（日本食品工業学会誌，Ｖｏｌ．４０，２１
８−２２３，１９９３年 参照）。そこで、抗酸化物質
の添加による細胞の活性酸素による障害の抑制に関して
様々な検討［例えばＢｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉ
ｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１１２３，３０９−３１
５（１９９２），Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１６，４０５−４
０９（１９９４）など］が行われている。
細胞などは、この様な活性酸素障害により保存中に死滅
したり、あるいは重大な機能障害を受けたりするため、
細胞を保存する上での大きな問題点となっている［Ｃｙ
ｔｏｂｉｏｌｏｇｙ，２５，３７７−３９３，（１９８
８）参照］。細胞内にはビタミンＥ（α−トコフェロー
ル）などの抗酸化物質やカタラーゼ、スーパーオキシド
ジスムターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼなどの抗
酸化酵素が存在する。しかし、酸化的細胞障害がおこる
こと自体、これらの生体内物質だけでは不十分なことを
示している（日本食品工業学会誌，Ｖｏｌ．４０，２１
８−２２３，１９９３年 参照）。そこで、抗酸化物質
の添加による細胞の活性酸素による障害の抑制に関して
様々な検討［例えばＢｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉ
ｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１１２３，３０９−３１
５（１９９２），Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１６，４０５−４
０９（１９９４）など］が行われている。
【０００４】しかしながら、従来用いられてきた抗酸化
物質では細胞の活性酸素障害を完全に防ぐにはことはで
きなかった。特に、細胞内に抗酸化剤を効率良く取り込
ませることが困難であり、このことを解決するために様
々な試み［例えばビタミンＣ誘導体による赤血球の酸化
的溶血抑制効果を調べたＣｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄＰ
ｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ，７１，９５−９７
（１９９４）など］がなされてきた。
物質では細胞の活性酸素障害を完全に防ぐにはことはで
きなかった。特に、細胞内に抗酸化剤を効率良く取り込
ませることが困難であり、このことを解決するために様
々な試み［例えばビタミンＣ誘導体による赤血球の酸化
的溶血抑制効果を調べたＣｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄＰ
ｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ，７１，９５−９７
（１９９４）など］がなされてきた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、強い抗酸化
作用を有し、しかも従来知られている抗酸化物質よりも
効率的に細胞内に取り込まれることができ、細胞などが
受ける活性酸素障害を抑制する優れた効果を発現する活
性酸素障害抑制剤を提供することを目的としてなされた
ものである。
作用を有し、しかも従来知られている抗酸化物質よりも
効率的に細胞内に取り込まれることができ、細胞などが
受ける活性酸素障害を抑制する優れた効果を発現する活
性酸素障害抑制剤を提供することを目的としてなされた
ものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは前記目的を
達成するために鋭意研究を重ねた結果、本発明者らの一
人が抗酸化剤、乳化剤として先に特開平６−２２８１７
０号公報で提案した、特定のホスファチジルクロマノー
ル誘導体が、細胞内に効率的に取り込まれ、細胞の活性
酸素障害に対して極めてすぐれた抑制効果を有すること
を見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至っ
た。
達成するために鋭意研究を重ねた結果、本発明者らの一
人が抗酸化剤、乳化剤として先に特開平６−２２８１７
０号公報で提案した、特定のホスファチジルクロマノー
ル誘導体が、細胞内に効率的に取り込まれ、細胞の活性
酸素障害に対して極めてすぐれた抑制効果を有すること
を見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至っ
た。
【０００７】すなわち、本発明は、次の一般式
【０００８】
【化２】
【０００９】（式中のＲ1、Ｒ2は水素原子又は炭素数２
〜２４の飽和若しくは不飽和脂肪酸残基であり、それぞ
れ同一であってもよく、また互いに異なっていてもよ
く、またｎは１〜５の整数、Ｘは１価の陽イオンであ
る）で表わされるホスファチジルクロマノール誘導体を
有効成分とすることを特徴とする活性酸素障害抑制剤で
ある。なお、本発明における活性酸素障害抑制剤とは、
強い抗酸化作用を有し、しかもそれが細胞内に効率的に
取り込まれることによって、細胞が受ける酸化的障害を
抑制する優れた効果を示す成分を含有したものをいう。
〜２４の飽和若しくは不飽和脂肪酸残基であり、それぞ
れ同一であってもよく、また互いに異なっていてもよ
く、またｎは１〜５の整数、Ｘは１価の陽イオンであ
る）で表わされるホスファチジルクロマノール誘導体を
有効成分とすることを特徴とする活性酸素障害抑制剤で
ある。なお、本発明における活性酸素障害抑制剤とは、
強い抗酸化作用を有し、しかもそれが細胞内に効率的に
取り込まれることによって、細胞が受ける酸化的障害を
抑制する優れた効果を示す成分を含有したものをいう。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。先ず、本発明に用いるホスファチジルクロマノー
ル誘導体は、前記一般式において、Ｒ1、Ｒ2は水素原
子、又は前記誘導体の製造原料として入手が容易な炭素
数２〜２４の飽和若しくは不飽和脂肪酸残基であり、そ
れらはそれぞれ同一であってもよいし、また互いに異な
っていてもよく、例えばミリスチン酸、パルミチン酸、
パルミトオレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノ
ール酸、リノレン酸、アラキドン酸、イコサペンタエン
酸、ドコサヘキサエン酸などの炭素数１０〜２２の脂肪
酸残基が好ましい。また、前記Ｒ1及びＲ2の脂肪酸残基
は、保存安定性の観点から、飽和のものが好ましく、こ
のことから不飽和のものはあらかじめ水素添加などの処
理をして用いるのが望ましい。さらにまた、前記一般式
において、Ｘは１価の陽イオンであって、例えば水素原
子、カリウム、ナトリウムなどのアルカリ金属イオン、
アンモニア、トリエタノールアミンなどの有機アミン、
リジン、アルギニンなどの塩基性アミノ酸などが挙げら
れる。また、ｎは１〜５、好ましくは１〜２の整数であ
る。
する。先ず、本発明に用いるホスファチジルクロマノー
ル誘導体は、前記一般式において、Ｒ1、Ｒ2は水素原
子、又は前記誘導体の製造原料として入手が容易な炭素
数２〜２４の飽和若しくは不飽和脂肪酸残基であり、そ
れらはそれぞれ同一であってもよいし、また互いに異な
っていてもよく、例えばミリスチン酸、パルミチン酸、
パルミトオレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノ
ール酸、リノレン酸、アラキドン酸、イコサペンタエン
酸、ドコサヘキサエン酸などの炭素数１０〜２２の脂肪
酸残基が好ましい。また、前記Ｒ1及びＲ2の脂肪酸残基
は、保存安定性の観点から、飽和のものが好ましく、こ
のことから不飽和のものはあらかじめ水素添加などの処
理をして用いるのが望ましい。さらにまた、前記一般式
において、Ｘは１価の陽イオンであって、例えば水素原
子、カリウム、ナトリウムなどのアルカリ金属イオン、
アンモニア、トリエタノールアミンなどの有機アミン、
リジン、アルギニンなどの塩基性アミノ酸などが挙げら
れる。また、ｎは１〜５、好ましくは１〜２の整数であ
る。
【００１１】そして、本発明に用いるホスファチジルク
ロマノール誘導体の具体例としては、ｎが１のものとし
て、例えば次の様なものが例示される。なお、以下の例
示化合物名において、「−ＧＰＭＣ」は「−ｓｎ−グリ
セロ−３−ホスホ−２’−ヒドロキシメチル−２’，
５’，７’，８’−テトラメチル−６’−ヒドロキシ−
クロマン」を意味する。すなわち、１，２−ジラウロリ
ル−ＧＰＭＣ、１，２−ジミリストイル−ＧＰＭＣ、
１，２−ジパルミトイル−ＧＰＭＣ、１，２−ジステア
ロイル−ＧＰＭＣ、１，２−ジアラキドニル−ＧＰＭ
Ｃ、１−ミリストイル−２−パルミトイル−ＧＰＭＣ、
１−ミリストイル−２−ステアロイル−ＧＰＭＣ、１−
パルミトイル−２−ミリストイル−ＧＰＭＣ、１−パル
ミトイル−２−ステアロイル−ＧＰＭＣ、１−ステアロ
イル−２−ミリストイル−ＧＰＭＣ、１−ステアロイル
−２−パルミトイル−ＧＰＭＣ、及びこれらの塩などで
ある。また、ｎが２の場合は、前記の各例示化合物名の
「ＧＰＭＣ」を「−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−２’
−ヒドロキシエチル−２’，５’，７’，８’−テトラ
メチル−６’−ヒドロキシ−クロマン」（以下、「−Ｇ
ＰＥＣ」と略す）と置き換えた化合物が例として挙げら
れる。
ロマノール誘導体の具体例としては、ｎが１のものとし
て、例えば次の様なものが例示される。なお、以下の例
示化合物名において、「−ＧＰＭＣ」は「−ｓｎ−グリ
セロ−３−ホスホ−２’−ヒドロキシメチル−２’，
５’，７’，８’−テトラメチル−６’−ヒドロキシ−
クロマン」を意味する。すなわち、１，２−ジラウロリ
ル−ＧＰＭＣ、１，２−ジミリストイル−ＧＰＭＣ、
１，２−ジパルミトイル−ＧＰＭＣ、１，２−ジステア
ロイル−ＧＰＭＣ、１，２−ジアラキドニル−ＧＰＭ
Ｃ、１−ミリストイル−２−パルミトイル−ＧＰＭＣ、
１−ミリストイル−２−ステアロイル−ＧＰＭＣ、１−
パルミトイル−２−ミリストイル−ＧＰＭＣ、１−パル
ミトイル−２−ステアロイル−ＧＰＭＣ、１−ステアロ
イル−２−ミリストイル−ＧＰＭＣ、１−ステアロイル
−２−パルミトイル−ＧＰＭＣ、及びこれらの塩などで
ある。また、ｎが２の場合は、前記の各例示化合物名の
「ＧＰＭＣ」を「−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−２’
−ヒドロキシエチル−２’，５’，７’，８’−テトラ
メチル−６’−ヒドロキシ−クロマン」（以下、「−Ｇ
ＰＥＣ」と略す）と置き換えた化合物が例として挙げら
れる。
【００１２】本発明に用いるホスファチジルクロマノー
ル誘導体は、化学的方法、酵素的方法などいずれの方法
で製造したものでも良いが、例えば以下に例示するよう
なホスホリパーゼＤによる酵素的方法（特開平６−２２
８１７０公報参照）を用いることにより、温和な条件
で、しかも高い収率で簡便に合成することができる。先
ず、基質としてリン脂質及び２，５，７，８−テトラメ
チル−６−ヒドロキシ−２−ヒドロキシメチル−クロマ
ン若しくは２，５，７，８−テトラメチル−６−ヒドロ
キシ−２−ヒドロキシエチル−クロマンを、モル比とし
て１：１〜１：１０の割合で溶剤に溶解若しくは懸濁さ
せ、これにホスホリパーゼＤを０．１〜１００単位／ｍ
ｌ（反応液）となるように添加し、攪拌しながら、適当
な条件下でホスファチジル基の転移反応（リン酸エステ
ル結合反応）を行わせて、目的物質を含む反応物を得
る。
ル誘導体は、化学的方法、酵素的方法などいずれの方法
で製造したものでも良いが、例えば以下に例示するよう
なホスホリパーゼＤによる酵素的方法（特開平６−２２
８１７０公報参照）を用いることにより、温和な条件
で、しかも高い収率で簡便に合成することができる。先
ず、基質としてリン脂質及び２，５，７，８−テトラメ
チル−６−ヒドロキシ−２−ヒドロキシメチル−クロマ
ン若しくは２，５，７，８−テトラメチル−６−ヒドロ
キシ−２−ヒドロキシエチル−クロマンを、モル比とし
て１：１〜１：１０の割合で溶剤に溶解若しくは懸濁さ
せ、これにホスホリパーゼＤを０．１〜１００単位／ｍ
ｌ（反応液）となるように添加し、攪拌しながら、適当
な条件下でホスファチジル基の転移反応（リン酸エステ
ル結合反応）を行わせて、目的物質を含む反応物を得
る。
【００１３】酵素反応を実施する際の反応系は水系、有
機溶媒系あるいはこれらの混合系などのいずれでもよ
い。またこの反応に用いられる溶剤としては、リン脂質
を溶解若しくは懸濁させるもので、酵素活性を著しく低
下させないものであればいずれでもよく、例えばｎ−ヘ
キサン、シクロヘキサン、ジエチルエーテル、クロロホ
ルム、酢酸エチル、アセトニトリル、ｔｅｒｔ−ブタノ
ール、またはこれらの任意の混合溶剤などが好適なもの
として挙げられるが、特にジエチルエーテル、酢酸エチ
ルが好ましい。また、酵素反応条件としてはホスホリパ
ーゼＤが作用する条件であれば特に制限されず、勿論、
用いるホスホリパーゼＤの好適作用条件が採用される
が、通常、例えばｐＨ２〜１０、好ましくはｐＨ４〜
７、温度５〜８０℃、好ましくは１０〜５０℃で１０分
〜１００時間、好ましくは３０分〜６０時間である。そ
して、例えばホスホリパーゼＤとしてシグマ社製の商品
名：ホスホリパーゼＤ Ｔｙｐｅ ＶＩＩを用いた場合
には、この酵素反応条件はｐＨ３〜８、好ましくはｐＨ
５〜６、温度１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で
１５分〜４８時間、好ましくは１〜１０時間である。
機溶媒系あるいはこれらの混合系などのいずれでもよ
い。またこの反応に用いられる溶剤としては、リン脂質
を溶解若しくは懸濁させるもので、酵素活性を著しく低
下させないものであればいずれでもよく、例えばｎ−ヘ
キサン、シクロヘキサン、ジエチルエーテル、クロロホ
ルム、酢酸エチル、アセトニトリル、ｔｅｒｔ−ブタノ
ール、またはこれらの任意の混合溶剤などが好適なもの
として挙げられるが、特にジエチルエーテル、酢酸エチ
ルが好ましい。また、酵素反応条件としてはホスホリパ
ーゼＤが作用する条件であれば特に制限されず、勿論、
用いるホスホリパーゼＤの好適作用条件が採用される
が、通常、例えばｐＨ２〜１０、好ましくはｐＨ４〜
７、温度５〜８０℃、好ましくは１０〜５０℃で１０分
〜１００時間、好ましくは３０分〜６０時間である。そ
して、例えばホスホリパーゼＤとしてシグマ社製の商品
名：ホスホリパーゼＤ Ｔｙｐｅ ＶＩＩを用いた場合
には、この酵素反応条件はｐＨ３〜８、好ましくはｐＨ
５〜６、温度１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で
１５分〜４８時間、好ましくは１〜１０時間である。
【００１４】この酵素反応終了後、反応物から本発明に
用いるホスファチジルクロマノール誘導体を精製するに
は、その精製法は特に限定されず、適宜の方法が採用さ
れる。その例としては、先ず溶媒、例えばクロロホル
ム：メタノール混液、ヘキサンなどを用いて目的物質を
抽出し、さらにこの抽出物にクロマトグラフィ、溶媒分
画法などの単独又は組合せによる精製法を施して、高純
度の目的物質を得ることができる。このときのクロマト
グラフィとしては、例えばカラムクロマトグラフィ、薄
層クロマトグラフィなどが挙げられる。またカラムクロ
マトグラフィを採用する場合には、その担体としては疎
水性のものであればよく、例えばシリカゲルなどが好適
である。本発明に用いられるホスファチジルクロマノー
ル誘導体の製造方法の参考例を以下に示す。
用いるホスファチジルクロマノール誘導体を精製するに
は、その精製法は特に限定されず、適宜の方法が採用さ
れる。その例としては、先ず溶媒、例えばクロロホル
ム：メタノール混液、ヘキサンなどを用いて目的物質を
抽出し、さらにこの抽出物にクロマトグラフィ、溶媒分
画法などの単独又は組合せによる精製法を施して、高純
度の目的物質を得ることができる。このときのクロマト
グラフィとしては、例えばカラムクロマトグラフィ、薄
層クロマトグラフィなどが挙げられる。またカラムクロ
マトグラフィを採用する場合には、その担体としては疎
水性のものであればよく、例えばシリカゲルなどが好適
である。本発明に用いられるホスファチジルクロマノー
ル誘導体の製造方法の参考例を以下に示す。
【００１５】参考例１ （１，２−ジミリストイル−ｓ
ｎ−グリセロ−３−ホスホ−２’−ヒドロキシメチル−
２’，５’，７’，８’−テトラメチル−６’−ヒドロ
キシ−クロマンの製造） 市販のジミリストイル−Ｌ−α−ホスファチジルコリン
（シグマ社製）１０ｇと２，５，７，８−テトラメチル
−６−ヒドロキシ−２−ヒドロキシメチル−クロマン
（株式会社クラレ製）４ｇにジエチルエーテル２００ｍ
ｌを加えて懸濁させ、これにＣａＣｌ2０．０１Ｍを含
む０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）４８００ｍ
ｌを加えて３７℃に保温したのち、市販のホスホリパー
ゼＤ（シグマ社製商品名：ホスホリパーゼＤ Ｔｙｐｅ
ＶＩＩ）６０００単位を含む酵素液２００ｍｌを加え
て撹拌しながら３７℃で２時間反応させた。この反応物
につき、高速液体クロマトグラフィにより分析した結
果、目的物質への変換率（用いたリン脂質に対する生成
目的物質の割合）は９５％と高率であった。得られた反
応物をクロロホルム：メタノール（２：１）で抽出処理
したのち、ケイ酸カラムに吸着させ、さらにクロロホル
ム：メタノール（９５：５）で溶出後、減圧乾固して目
的物質７ｇを得た。この物質を薄層クロマトグラフィに
より、シリカゲルのプレート（ＳＩＬＩＣＡ ＧＥＬ
６０、メルク社製、以下同じ）、展開溶媒としてクロロ
ホルム：メタノール＝８０：２０を用いて展開した結
果、塩化第二鉄−バソフェナントロリン試薬による発色
法で赤色を呈し（クロマン環の存在を示す）、かつディ
ットマー試薬による発色法で青色を呈する（リンの存在
を示す）単一のスポット（Ｒｆ＝０．４３）が検出され
た。このことから、同一分子中にリン脂質とクロマン環
を有する物質の生成が確認された。機器分析の結果、ホ
スホリパーゼＤによる酵素反応で得られたこの物質はリ
ン脂質のリン酸と前記クロマン誘導体のアルコール性水
酸基とのリン酸エステル結合物（ホスファチジル基の転
移反応物）であることが確認され、そしてこの物質は前
記一般式において、Ｒ1、Ｒ2が共にミリスチン酸残基
で、ｎが１、ＸがＫ+である１，２−ジミリストイル−
ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−２’−ヒドロキシメチル
−２’，５’，７’，８’−テトラメチル−６’−ヒド
ロキシ−クロマンであることが確認された。
ｎ−グリセロ−３−ホスホ−２’−ヒドロキシメチル−
２’，５’，７’，８’−テトラメチル−６’−ヒドロ
キシ−クロマンの製造） 市販のジミリストイル−Ｌ−α−ホスファチジルコリン
（シグマ社製）１０ｇと２，５，７，８−テトラメチル
−６−ヒドロキシ−２−ヒドロキシメチル−クロマン
（株式会社クラレ製）４ｇにジエチルエーテル２００ｍ
ｌを加えて懸濁させ、これにＣａＣｌ2０．０１Ｍを含
む０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）４８００ｍ
ｌを加えて３７℃に保温したのち、市販のホスホリパー
ゼＤ（シグマ社製商品名：ホスホリパーゼＤ Ｔｙｐｅ
ＶＩＩ）６０００単位を含む酵素液２００ｍｌを加え
て撹拌しながら３７℃で２時間反応させた。この反応物
につき、高速液体クロマトグラフィにより分析した結
果、目的物質への変換率（用いたリン脂質に対する生成
目的物質の割合）は９５％と高率であった。得られた反
応物をクロロホルム：メタノール（２：１）で抽出処理
したのち、ケイ酸カラムに吸着させ、さらにクロロホル
ム：メタノール（９５：５）で溶出後、減圧乾固して目
的物質７ｇを得た。この物質を薄層クロマトグラフィに
より、シリカゲルのプレート（ＳＩＬＩＣＡ ＧＥＬ
６０、メルク社製、以下同じ）、展開溶媒としてクロロ
ホルム：メタノール＝８０：２０を用いて展開した結
果、塩化第二鉄−バソフェナントロリン試薬による発色
法で赤色を呈し（クロマン環の存在を示す）、かつディ
ットマー試薬による発色法で青色を呈する（リンの存在
を示す）単一のスポット（Ｒｆ＝０．４３）が検出され
た。このことから、同一分子中にリン脂質とクロマン環
を有する物質の生成が確認された。機器分析の結果、ホ
スホリパーゼＤによる酵素反応で得られたこの物質はリ
ン脂質のリン酸と前記クロマン誘導体のアルコール性水
酸基とのリン酸エステル結合物（ホスファチジル基の転
移反応物）であることが確認され、そしてこの物質は前
記一般式において、Ｒ1、Ｒ2が共にミリスチン酸残基
で、ｎが１、ＸがＫ+である１，２−ジミリストイル−
ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−２’−ヒドロキシメチル
−２’，５’，７’，８’−テトラメチル−６’−ヒド
ロキシ−クロマンであることが確認された。
【００１６】参考例２ （１，２−ジミリストイル−ｓ
ｎ−グリセロ−３−ホスホ−２’−ヒドロキシエチル−
２’，５’，７’，８’−テトラメチル−６’−ヒドロ
キシ−クロマンの製造） ２，５，７，８−テトラメチル−６−ヒドロキシ−２−
ヒドロキシメチル−クロマンの代わりに、２，５，７，
８−テトラメチル−６−ヒドロキシ−２−ヒドロキシエ
チル−クロマン（株式会社クラレ製）４ｇを用いた以外
は参考例１と同様にして目的物質７ｇを得た。なお、精
製前の反応物につき、高速液体クロマトグラフィにより
分析した結果、目的物質への変換率は９５％と高率であ
った。この物質を薄層クロマトグラフィにより、シリカ
ゲルのプレート、展開溶媒としてクロロホルム：メタノ
ール＝８０：２０を用いて展開した結果、塩化第二鉄−
バソフェナントロリン試薬による発色法で赤色を呈し、
かつディットマー試薬による発色法で青色を呈する単一
のスポット（Ｒｆ＝０．４８）が検出された。このこと
から、同一分子中にリン脂質とクロマン環を有する物質
の生成が確認された。機器分析の結果、ホスホリパーゼ
Ｄによる酵素反応で得られたこの物質はリン脂質のリン
酸と前記クロマン誘導体のアルコール性水酸基とのリン
酸エステル結合物（ホスファチジル基の転移反応物）で
あることが確認され、そしてこの物質は前記一般式にお
いて、Ｒ1、Ｒ2が共にミリスチン酸残基で、ｎが２、Ｘ
がＨ+である１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ
−３−ホスホ−２’−ヒドロキシエチル−２’，５’，
７’，８’−テトラメチル−６’−ヒドロキシ−クロマ
ンであることが確認された。
ｎ−グリセロ−３−ホスホ−２’−ヒドロキシエチル−
２’，５’，７’，８’−テトラメチル−６’−ヒドロ
キシ−クロマンの製造） ２，５，７，８−テトラメチル−６−ヒドロキシ−２−
ヒドロキシメチル−クロマンの代わりに、２，５，７，
８−テトラメチル−６−ヒドロキシ−２−ヒドロキシエ
チル−クロマン（株式会社クラレ製）４ｇを用いた以外
は参考例１と同様にして目的物質７ｇを得た。なお、精
製前の反応物につき、高速液体クロマトグラフィにより
分析した結果、目的物質への変換率は９５％と高率であ
った。この物質を薄層クロマトグラフィにより、シリカ
ゲルのプレート、展開溶媒としてクロロホルム：メタノ
ール＝８０：２０を用いて展開した結果、塩化第二鉄−
バソフェナントロリン試薬による発色法で赤色を呈し、
かつディットマー試薬による発色法で青色を呈する単一
のスポット（Ｒｆ＝０．４８）が検出された。このこと
から、同一分子中にリン脂質とクロマン環を有する物質
の生成が確認された。機器分析の結果、ホスホリパーゼ
Ｄによる酵素反応で得られたこの物質はリン脂質のリン
酸と前記クロマン誘導体のアルコール性水酸基とのリン
酸エステル結合物（ホスファチジル基の転移反応物）で
あることが確認され、そしてこの物質は前記一般式にお
いて、Ｒ1、Ｒ2が共にミリスチン酸残基で、ｎが２、Ｘ
がＨ+である１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ
−３−ホスホ−２’−ヒドロキシエチル−２’，５’，
７’，８’−テトラメチル−６’−ヒドロキシ−クロマ
ンであることが確認された。
【００１７】参考例３ （１，２−ジパルミトイル−ｓ
ｎ−グリセロ−３−ホスホ−２’−ヒドロキシメチル−
２’，５’，７’，８’−テトラメチル−６’−ヒドロ
キシ−クロマンの製造） ジミリストイル−Ｌ−α−ホスファチジルコリン（シグ
マ社製）の代わりに、市販のジパルミトイル−Ｌ−α−
ホスファチジルコリン（シグマ社製）１０ｇを用いた以
外は参考例１と同様にして目的物質６ｇを得た。なお、
精製前の反応物につき、高速液体クロマトグラフィによ
り分析した結果、目的物質への変換率は９５％と高率で
あった。この物質を薄層クロマトグラフィにより、シリ
カゲルのプレート、展開溶媒としてクロロホルム：メタ
ノール＝８０：２０を用いて展開した結果、塩化第二鉄
−バソフェナントロリン試薬による発色法で赤色を呈
し、かつディットマー試薬による発色法で青色を呈する
単一のスポット（Ｒｆ＝０．４８）が検出された。この
ことから、同一分子中にリン脂質とクロマン環を有する
物質の生成が確認された。機器分析の結果、ホスホリパ
ーゼＤによる酵素反応で得られたこの物質はリン脂質の
リン酸と前記クロマン誘導体のアルコール性水酸基との
リン酸エステル結合物（ホスファチジル基の転移反応
物）であることが確認され、そしてこの物質は前記一般
式において、Ｒ1、Ｒ2が共にパルミチン酸残基で、ｎが
１、ＸがＨ+である１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グ
リセロ−３−ホスホ−２’−ヒドロキシメチル−２’，
５’，７’，８’−テトラメチル−６’−ヒドロキシ−
クロマンであることが確認された。
ｎ−グリセロ−３−ホスホ−２’−ヒドロキシメチル−
２’，５’，７’，８’−テトラメチル−６’−ヒドロ
キシ−クロマンの製造） ジミリストイル−Ｌ−α−ホスファチジルコリン（シグ
マ社製）の代わりに、市販のジパルミトイル−Ｌ−α−
ホスファチジルコリン（シグマ社製）１０ｇを用いた以
外は参考例１と同様にして目的物質６ｇを得た。なお、
精製前の反応物につき、高速液体クロマトグラフィによ
り分析した結果、目的物質への変換率は９５％と高率で
あった。この物質を薄層クロマトグラフィにより、シリ
カゲルのプレート、展開溶媒としてクロロホルム：メタ
ノール＝８０：２０を用いて展開した結果、塩化第二鉄
−バソフェナントロリン試薬による発色法で赤色を呈
し、かつディットマー試薬による発色法で青色を呈する
単一のスポット（Ｒｆ＝０．４８）が検出された。この
ことから、同一分子中にリン脂質とクロマン環を有する
物質の生成が確認された。機器分析の結果、ホスホリパ
ーゼＤによる酵素反応で得られたこの物質はリン脂質の
リン酸と前記クロマン誘導体のアルコール性水酸基との
リン酸エステル結合物（ホスファチジル基の転移反応
物）であることが確認され、そしてこの物質は前記一般
式において、Ｒ1、Ｒ2が共にパルミチン酸残基で、ｎが
１、ＸがＨ+である１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グ
リセロ−３−ホスホ−２’−ヒドロキシメチル−２’，
５’，７’，８’−テトラメチル−６’−ヒドロキシ−
クロマンであることが確認された。
【００１８】このようにして得られた本発明の有効成分
であるホスファチジルクロマノール誘導体は、後述する
ごとく、ビタミンＥやビタミンＣなどの抗酸化ビタミン
やプロブコールやブチルヒドロキシトルエンなどの合成
抗酸化剤に比べて細胞内に非常に取り込まれやすく、ま
た細胞中での抗酸化活性が極めて高いという特性を有す
るので、これら誘導体の少なくとも１種を有効成分とし
て、例えば０．００１〜１０００００μｍｏｌ含有させ
ることにより、すぐれた活性酸素障害抑制剤として極め
て有用であり、本剤は、これを例えば培養細胞や生体よ
り分離した赤血球、リンパ球などの細胞に添加すれば、
それら細胞が受ける活性酸素障害を防ぐことができる。
であるホスファチジルクロマノール誘導体は、後述する
ごとく、ビタミンＥやビタミンＣなどの抗酸化ビタミン
やプロブコールやブチルヒドロキシトルエンなどの合成
抗酸化剤に比べて細胞内に非常に取り込まれやすく、ま
た細胞中での抗酸化活性が極めて高いという特性を有す
るので、これら誘導体の少なくとも１種を有効成分とし
て、例えば０．００１〜１０００００μｍｏｌ含有させ
ることにより、すぐれた活性酸素障害抑制剤として極め
て有用であり、本剤は、これを例えば培養細胞や生体よ
り分離した赤血球、リンパ球などの細胞に添加すれば、
それら細胞が受ける活性酸素障害を防ぐことができる。
【００１９】本発明に用いる前記ホスファチジルクロマ
ノール誘導体は、その粗製物あるいは精製物のいずれで
もよく、また単独であるいは他の抗酸化物質と混合して
用いてもよく、またそのままの状態で、あるいはこれを
適当な溶剤、例えば水、ジメチルスルホオキシド、メタ
ノール、エタノールなどに溶解又は懸濁させた溶液、さ
らには常法により賦形剤、例えば糖類などを添加するか
しないで乾燥、粉末化などして得た固形物など、いずれ
の状態でも用いられる。
ノール誘導体は、その粗製物あるいは精製物のいずれで
もよく、また単独であるいは他の抗酸化物質と混合して
用いてもよく、またそのままの状態で、あるいはこれを
適当な溶剤、例えば水、ジメチルスルホオキシド、メタ
ノール、エタノールなどに溶解又は懸濁させた溶液、さ
らには常法により賦形剤、例えば糖類などを添加するか
しないで乾燥、粉末化などして得た固形物など、いずれ
の状態でも用いられる。
【００２０】本発明の活性酸素障害抑制剤は、使用対
象、使用方法などに制限はないが、殊に細胞に対する活
性酸素障害抑制剤として、例えば培養細胞、赤血球やリ
ンパ球などの生体細胞などに極めて好適に用いられ、こ
のときの添加量は０．００１〜１０００００μｍｏｌ／
ｌ、好ましくは０．０１〜１００μｍｏｌ／ｌである。
象、使用方法などに制限はないが、殊に細胞に対する活
性酸素障害抑制剤として、例えば培養細胞、赤血球やリ
ンパ球などの生体細胞などに極めて好適に用いられ、こ
のときの添加量は０．００１〜１０００００μｍｏｌ／
ｌ、好ましくは０．０１〜１００μｍｏｌ／ｌである。
【００２１】
【実施例】次に実施例により、本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらの例によってなんら制限され
るものではない。
明するが、本発明はこれらの例によってなんら制限され
るものではない。
【００２２】実施例１ （赤血球に対する酸化的溶血抑
制効果試験） 健常人よりヘパリン採血した血液５０ｍｌを４℃で１５
００Ｇ、１０分間冷却遠心した。プラズマとバフィーコ
ートを除去後、赤血球部分を５倍容の予め冷却したリン
酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で３回洗浄して赤血球画分を調
製した。試験に用いた表１に示した抗酸化剤液は次の様
に調製した。ホスファチジルクロマノール誘導体は前記
参考例１に示した方法により合成した１，２−ジミリス
トイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−２’−ヒドロキ
シメチル−２’，５’，７’，８’−テトラメチル−
６’−ヒドロキシ−クロマン（ＤＭ−ＧＰＭＣ）を用い
た。ＤＭ−ＧＰＭＣはＰＢＳを添加後、超音波で分散さ
せ、最終濃度５０μＭの本発明区分の試験液を作成し
た。また比較区分としたビタミンＥ（ｄｌ−α−トコフ
ェロール、エーザイ社製）、２，２，５，７，８−ペン
タメチル−６−クロマノール（ＰＭＣ、エーザイ社
製）、プロブコール（シグマ社製）、ブチルヒドロキシ
トルエン（ＢＨＴ、和光純薬工業社製）は、それぞれエ
タノールに溶解し、適量のＰＢＳで希釈して最終濃度５
０μＭの試験液を作成した。ビタミンＣ（シグマ社製）
はＰＢＳに溶解して最終濃度５０μＭの試験液を作成し
た。前記した赤血球画分を試験管に１ｍｌずつ分注し、
これに前記濃度に調製した試験液を１ｍｌずつ加え、３
７℃で３０分振盪しながら保温後、ＰＢＳで３回洗浄を
行い、抗酸化剤処理した赤血球を得た。
制効果試験） 健常人よりヘパリン採血した血液５０ｍｌを４℃で１５
００Ｇ、１０分間冷却遠心した。プラズマとバフィーコ
ートを除去後、赤血球部分を５倍容の予め冷却したリン
酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で３回洗浄して赤血球画分を調
製した。試験に用いた表１に示した抗酸化剤液は次の様
に調製した。ホスファチジルクロマノール誘導体は前記
参考例１に示した方法により合成した１，２−ジミリス
トイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−２’−ヒドロキ
シメチル−２’，５’，７’，８’−テトラメチル−
６’−ヒドロキシ−クロマン（ＤＭ−ＧＰＭＣ）を用い
た。ＤＭ−ＧＰＭＣはＰＢＳを添加後、超音波で分散さ
せ、最終濃度５０μＭの本発明区分の試験液を作成し
た。また比較区分としたビタミンＥ（ｄｌ−α−トコフ
ェロール、エーザイ社製）、２，２，５，７，８−ペン
タメチル−６−クロマノール（ＰＭＣ、エーザイ社
製）、プロブコール（シグマ社製）、ブチルヒドロキシ
トルエン（ＢＨＴ、和光純薬工業社製）は、それぞれエ
タノールに溶解し、適量のＰＢＳで希釈して最終濃度５
０μＭの試験液を作成した。ビタミンＣ（シグマ社製）
はＰＢＳに溶解して最終濃度５０μＭの試験液を作成し
た。前記した赤血球画分を試験管に１ｍｌずつ分注し、
これに前記濃度に調製した試験液を１ｍｌずつ加え、３
７℃で３０分振盪しながら保温後、ＰＢＳで３回洗浄を
行い、抗酸化剤処理した赤血球を得た。
【００２３】赤血球の溶血試験は次の様に行った。前記
の各抗酸化剤処理した赤血球を１００μｌずつ、３本
（それぞれＡ，Ｂ，Ｃ）の試験管に分注した。そしてＡ
には１ｍｌのＰＢＳを、Ｂ，Ｃにはフリーラジカル発生
剤である２，２’−アゾビス（２−アミジノプロピル）
ジハイドロクロライド（和光純薬工業社製）を７５ｍＭ
含むＰＢＳ１ｍｌ加え、３７℃、暗所で振盪しながら４
時間保温した。その後、Ａ，ＢにはＰＢＳ４ｍｌをＣに
は０．１％トリトンＸ−１００（和光純薬工業社製）溶
液を４ｍｌ加え、混合後、１５００Ｇで５分間遠心分離
し、上清の５４０ｎｍの吸光度を測定した。溶血率は次
式から算出した。 溶血率（％）＝（Ｂの吸光度−Ａの吸光度）÷（Ｃの吸
光度−Ａの吸光度）×１００ ホスファチジルクロマノール添加区と、ビタミンＥ、Ｐ
ＭＣ、ビタミンＣ、プロブコール又はＢＨＴを添加した
比較区分の赤血球の各溶血率を求めた結果を表１に示
す。
の各抗酸化剤処理した赤血球を１００μｌずつ、３本
（それぞれＡ，Ｂ，Ｃ）の試験管に分注した。そしてＡ
には１ｍｌのＰＢＳを、Ｂ，Ｃにはフリーラジカル発生
剤である２，２’−アゾビス（２−アミジノプロピル）
ジハイドロクロライド（和光純薬工業社製）を７５ｍＭ
含むＰＢＳ１ｍｌ加え、３７℃、暗所で振盪しながら４
時間保温した。その後、Ａ，ＢにはＰＢＳ４ｍｌをＣに
は０．１％トリトンＸ−１００（和光純薬工業社製）溶
液を４ｍｌ加え、混合後、１５００Ｇで５分間遠心分離
し、上清の５４０ｎｍの吸光度を測定した。溶血率は次
式から算出した。 溶血率（％）＝（Ｂの吸光度−Ａの吸光度）÷（Ｃの吸
光度−Ａの吸光度）×１００ ホスファチジルクロマノール添加区と、ビタミンＥ、Ｐ
ＭＣ、ビタミンＣ、プロブコール又はＢＨＴを添加した
比較区分の赤血球の各溶血率を求めた結果を表１に示
す。
【００２４】
【表１】
【００２５】表１から、本発明区分であるホスファチジ
ルクロマノールを添加したものは、他の抗酸化剤を添加
したものに比べて、活性酸素による赤血球の酸化的溶血
を極めて効果的に抑制することがわかる。
ルクロマノールを添加したものは、他の抗酸化剤を添加
したものに比べて、活性酸素による赤血球の酸化的溶血
を極めて効果的に抑制することがわかる。
【００２６】実施例２ （赤血球に取り込まれる抗酸化
剤の量の測定） 実施例１と同様の方法で抗酸化剤処理した赤血球中に取
り込まれた抗酸化剤の量を以下の方法で測定した。抗酸
化剤処理した赤血球０．５ｍｌを試験管に取り、ｎ−ヘ
キサン／エタノール液（４／１、ｖｏｌ／ｖｏｌ）を４
ｍｌ添加し、１分間超音波処理した。そこに２ｍｌの脱
イオン水を加え、３０秒間ボルテックスミキサーで攪拌
した後、１５００Ｇで５分間遠心分離して上層のｎ−ヘ
キサン層を別の褐色スピッツロールに取り移した。下層
をさらにｎ−ヘキサンで３ｍｌづつ２回の抽出操作を行
い、回収したｎ−ヘキサン層をエバポレータで濃縮して
溶媒を完全に留去し、残留物を直ちにｎ−ヘキサン１０
０μｌに溶かし試料液とした。試料液中の各抗酸化剤の
量を高速液体クロマトグラフィで測定した。なお、ビタ
ミンＣのみは以下の操作で抽出したものを高速液体クロ
マトグラフィに供した。抗酸化剤処理した赤血球０．１
ｍｌを遠沈管に取り、０．３ｍｌの０．１％トリフルオ
ロ酢酸溶液を加え１分間超音波処理した後、１００００
Ｇで１５分間遠心分離した後、その上清を試料液とし
た。ホスファチジルクロマノール添加区と、ビタミン
Ｅ、ＰＭＣ、ビタミンＣ、プロブコール又はＢＨＴを添
加した比較区分の、赤血球に取り込まれた各抗酸化剤の
量を求めた結果を表２に示す。
剤の量の測定） 実施例１と同様の方法で抗酸化剤処理した赤血球中に取
り込まれた抗酸化剤の量を以下の方法で測定した。抗酸
化剤処理した赤血球０．５ｍｌを試験管に取り、ｎ−ヘ
キサン／エタノール液（４／１、ｖｏｌ／ｖｏｌ）を４
ｍｌ添加し、１分間超音波処理した。そこに２ｍｌの脱
イオン水を加え、３０秒間ボルテックスミキサーで攪拌
した後、１５００Ｇで５分間遠心分離して上層のｎ−ヘ
キサン層を別の褐色スピッツロールに取り移した。下層
をさらにｎ−ヘキサンで３ｍｌづつ２回の抽出操作を行
い、回収したｎ−ヘキサン層をエバポレータで濃縮して
溶媒を完全に留去し、残留物を直ちにｎ−ヘキサン１０
０μｌに溶かし試料液とした。試料液中の各抗酸化剤の
量を高速液体クロマトグラフィで測定した。なお、ビタ
ミンＣのみは以下の操作で抽出したものを高速液体クロ
マトグラフィに供した。抗酸化剤処理した赤血球０．１
ｍｌを遠沈管に取り、０．３ｍｌの０．１％トリフルオ
ロ酢酸溶液を加え１分間超音波処理した後、１００００
Ｇで１５分間遠心分離した後、その上清を試料液とし
た。ホスファチジルクロマノール添加区と、ビタミン
Ｅ、ＰＭＣ、ビタミンＣ、プロブコール又はＢＨＴを添
加した比較区分の、赤血球に取り込まれた各抗酸化剤の
量を求めた結果を表２に示す。
【００２７】
【表２】
【００２８】表２から、本発明区分であるホスファチジ
ルクロマノールを添加したものは、他の抗酸化剤を添加
したものに比べて、赤血球内へ顕著に取り込まれやすい
ことがわかる。
ルクロマノールを添加したものは、他の抗酸化剤を添加
したものに比べて、赤血球内へ顕著に取り込まれやすい
ことがわかる。
【００２９】実施例３ （牛大動脈血管内皮細胞に対す
る酸化的細胞障害抑制効果試験） 牛大動脈血管内皮細胞（ＢＡＥＣ）を子牛血清を１０
％、ペニシリンを１００ユニット／ｍｌ、ストレプトマ
イシン０．１ｍｇ／ｍｌを添加したＤ−ＭＥＭ（ギブコ
社製）で培養した。コンフルエントに達したＢＡＥＣか
ら培地を除去後、滅菌したリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）
で細胞を３回洗浄した。そして、ｔｅｒｔ−ブチルヒド
ロペルオキシド（シグマ社製）と表３に示す各抗酸化剤
を含むＤ−ＭＥＭを添加し、３７℃、ＣＯ2インキュベ
ーター中で６時間培養した。ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペ
ルオキシドの細胞毒性により細胞内から培地に洩れ出す
乳酸脱水素酵素活性を測定キット（ベーリンガーマンハ
イム社製）で測定した。また、抗酸化剤とｔｅｒｔ−ブ
チルヒドロペルオキシドを含まないＤ−ＭＥＭを添加し
て６時間培養した細胞に０．１％ドデシル硫酸ナトリウ
ム溶液を加え、全細胞中の乳酸脱水素酵素活性を測定し
コントロールとした。ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキ
シドと試験する抗酸化剤を含む培地は次の様に調製し
た。ホスファチジルクロマノール誘導体は、前記参考例
２に示した方法により合成した１，２−ジミリストイル
−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−２’−ヒドロキシエチ
ル−２’，５’，７’，８’−テトラメチル−６’−ヒ
ドロキシ−クロマン（ＤＭ−ＧＰＥＣ）を用いた。ＤＭ
−ＧＰＥＣは、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド２
ｍＭを含むＤ−ＭＥＭを添加後、超音波で分散させ、最
終濃度５０μＭの濃度の本発明区分の試験液を作成し
た。また比較区分のビタミンＥ（ｄｌ−α−トコフェロ
ール、エーザイ社製）、２，２，５，７，８−ペンタメ
チル−６−クロマノール（ＰＭＣ、エーザイ社製）、プ
ロブコール（シグマ社製）、ブチルヒドロキシトルエン
（ＢＨＴ、和光純薬工業社製）は、それぞれエタノール
に溶解し、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド２ｍＭ
を含むＤ−ＭＥＭで希釈して、最終濃度５０μＭの各試
験液を作成した。ビタミンＣ（シグマ社製）は、ｔｅｒ
ｔ−ブチルヒドロペルオキシド２ｍＭを含むＤ−ＭＥＭ
に溶解して、最終濃度５０μＭの試験液を作成した。
る酸化的細胞障害抑制効果試験） 牛大動脈血管内皮細胞（ＢＡＥＣ）を子牛血清を１０
％、ペニシリンを１００ユニット／ｍｌ、ストレプトマ
イシン０．１ｍｇ／ｍｌを添加したＤ−ＭＥＭ（ギブコ
社製）で培養した。コンフルエントに達したＢＡＥＣか
ら培地を除去後、滅菌したリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）
で細胞を３回洗浄した。そして、ｔｅｒｔ−ブチルヒド
ロペルオキシド（シグマ社製）と表３に示す各抗酸化剤
を含むＤ−ＭＥＭを添加し、３７℃、ＣＯ2インキュベ
ーター中で６時間培養した。ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペ
ルオキシドの細胞毒性により細胞内から培地に洩れ出す
乳酸脱水素酵素活性を測定キット（ベーリンガーマンハ
イム社製）で測定した。また、抗酸化剤とｔｅｒｔ−ブ
チルヒドロペルオキシドを含まないＤ−ＭＥＭを添加し
て６時間培養した細胞に０．１％ドデシル硫酸ナトリウ
ム溶液を加え、全細胞中の乳酸脱水素酵素活性を測定し
コントロールとした。ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキ
シドと試験する抗酸化剤を含む培地は次の様に調製し
た。ホスファチジルクロマノール誘導体は、前記参考例
２に示した方法により合成した１，２−ジミリストイル
−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−２’−ヒドロキシエチ
ル−２’，５’，７’，８’−テトラメチル−６’−ヒ
ドロキシ−クロマン（ＤＭ−ＧＰＥＣ）を用いた。ＤＭ
−ＧＰＥＣは、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド２
ｍＭを含むＤ−ＭＥＭを添加後、超音波で分散させ、最
終濃度５０μＭの濃度の本発明区分の試験液を作成し
た。また比較区分のビタミンＥ（ｄｌ−α−トコフェロ
ール、エーザイ社製）、２，２，５，７，８−ペンタメ
チル−６−クロマノール（ＰＭＣ、エーザイ社製）、プ
ロブコール（シグマ社製）、ブチルヒドロキシトルエン
（ＢＨＴ、和光純薬工業社製）は、それぞれエタノール
に溶解し、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド２ｍＭ
を含むＤ−ＭＥＭで希釈して、最終濃度５０μＭの各試
験液を作成した。ビタミンＣ（シグマ社製）は、ｔｅｒ
ｔ−ブチルヒドロペルオキシド２ｍＭを含むＤ−ＭＥＭ
に溶解して、最終濃度５０μＭの試験液を作成した。
【００３０】細胞障害率は次式で計算した。 細胞障害率（％）＝培養液中の乳酸脱水素酵素活性÷コ
ントロールの乳酸脱水素酵素活性×１００ ホスファチジルクロマノール添加区と、ビタミンＥ、Ｐ
ＭＣ、ビタミンＣ、プロブコール又はＢＨＴを添加した
比較区分の細胞の受けた各障害率を求めた結果を表３に
示す。
ントロールの乳酸脱水素酵素活性×１００ ホスファチジルクロマノール添加区と、ビタミンＥ、Ｐ
ＭＣ、ビタミンＣ、プロブコール又はＢＨＴを添加した
比較区分の細胞の受けた各障害率を求めた結果を表３に
示す。
【００３１】
【表３】
【００３２】表３から、本発明区分であるホスファチジ
ルクロマノールを添加したはものは、他の抗酸化剤を添
加したものに比べて、牛大動脈血管内皮細胞の活性酸素
障害を極めて効果的に抑制することがわかる。
ルクロマノールを添加したはものは、他の抗酸化剤を添
加したものに比べて、牛大動脈血管内皮細胞の活性酸素
障害を極めて効果的に抑制することがわかる。
【００３３】実施例４ （マウス脾臓細胞に対する酸化
的細胞障害抑制効果試験） Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス（６週令、メス）から脾臓細胞を
採取し、ＰＢＳで３回洗浄した後、ｔｅｒｔ−ブチルヒ
ドロペルオキシドと表４に示す各抗酸化剤を含むＲＰＭ
Ｉ−１６４０（ギブコ社製）に１０7個／ｍｌとなるよ
うに浮遊させ、３７℃、ＣＯ2インキュベーターで３時
間培養した。ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドの細
胞毒性により細胞内から培地に洩れ出す乳酸脱水素酵素
活性を測定キット（ベーリンガーマンハイム社製）で測
定した。また、抗酸化剤とｔｅｒｔ−ブチルヒドロペル
オキシドを含まないＲＰＭＩ−１６４０を添加して３時
間培養した細胞に０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（和
光純薬工業社製）溶液を加えた後、全細胞中の乳酸脱水
素酵素活性を測定しコントロールとした。ｔｅｒｔ−ブ
チルヒドロペルオキシドと試験する抗酸化剤を含む培地
は次の様に調製した。ホスファチジルクロマノール誘導
体は参考例３で示した方法により合成した１，２−ジパ
ルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−２’−ヒド
ロキシメチル−２’，５’，７’，８’−テトラメチル
−６’−ヒドロキシ−クロマン（ＤＰ−ＧＰＭＣ）を用
いた。ＤＰ−ＧＰＭＣはｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオ
キシド１ｍＭを含むＲＰＭＩ−１６４０を添加後、超音
波で分散させ、最終濃度５０μＭの濃度の本発明区分の
試験液を作成した。また比較区分のビタミンＥ（ｄｌ−
α−トコフェロール、エーザイ社製）、２，２，５，
７，８−ペンタメチル−６−クロマノール（ＰＭＣ、エ
ーザイ社製）、プロブコール（シグマ社製）、ブチルヒ
ドロキシトルエン（ＢＨＴ、和光純薬工業社製）は、そ
れぞれエタノールに溶解し、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペ
ルオキシド２ｍＭを含むＲＰＭＩ−１６４０で希釈し
て、最終濃度５０μＭの各試験液を作成した。ビタミン
Ｃ（シグマ社製）は、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキ
シド２ｍＭを含むＲＰＭＩ−１６４０に溶解して、最終
濃度５０μＭの試験液を作成した。
的細胞障害抑制効果試験） Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス（６週令、メス）から脾臓細胞を
採取し、ＰＢＳで３回洗浄した後、ｔｅｒｔ−ブチルヒ
ドロペルオキシドと表４に示す各抗酸化剤を含むＲＰＭ
Ｉ−１６４０（ギブコ社製）に１０7個／ｍｌとなるよ
うに浮遊させ、３７℃、ＣＯ2インキュベーターで３時
間培養した。ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドの細
胞毒性により細胞内から培地に洩れ出す乳酸脱水素酵素
活性を測定キット（ベーリンガーマンハイム社製）で測
定した。また、抗酸化剤とｔｅｒｔ−ブチルヒドロペル
オキシドを含まないＲＰＭＩ−１６４０を添加して３時
間培養した細胞に０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（和
光純薬工業社製）溶液を加えた後、全細胞中の乳酸脱水
素酵素活性を測定しコントロールとした。ｔｅｒｔ−ブ
チルヒドロペルオキシドと試験する抗酸化剤を含む培地
は次の様に調製した。ホスファチジルクロマノール誘導
体は参考例３で示した方法により合成した１，２−ジパ
ルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−２’−ヒド
ロキシメチル−２’，５’，７’，８’−テトラメチル
−６’−ヒドロキシ−クロマン（ＤＰ−ＧＰＭＣ）を用
いた。ＤＰ−ＧＰＭＣはｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオ
キシド１ｍＭを含むＲＰＭＩ−１６４０を添加後、超音
波で分散させ、最終濃度５０μＭの濃度の本発明区分の
試験液を作成した。また比較区分のビタミンＥ（ｄｌ−
α−トコフェロール、エーザイ社製）、２，２，５，
７，８−ペンタメチル−６−クロマノール（ＰＭＣ、エ
ーザイ社製）、プロブコール（シグマ社製）、ブチルヒ
ドロキシトルエン（ＢＨＴ、和光純薬工業社製）は、そ
れぞれエタノールに溶解し、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペ
ルオキシド２ｍＭを含むＲＰＭＩ−１６４０で希釈し
て、最終濃度５０μＭの各試験液を作成した。ビタミン
Ｃ（シグマ社製）は、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキ
シド２ｍＭを含むＲＰＭＩ−１６４０に溶解して、最終
濃度５０μＭの試験液を作成した。
【００３４】細胞障害率は次式で計算した。 細胞障害率（％）＝培養液中の乳酸脱水素酵素活性÷コ
ントロールの乳酸脱水素酵素活性×１００ ホスファチジルクロマノール添加区と、ビタミンＥ、Ｐ
ＭＣ、ビタミンＣ、プロブコール、ＢＨＴを添加した比
較区分の細胞の受けた各障害率を表４に示す。
ントロールの乳酸脱水素酵素活性×１００ ホスファチジルクロマノール添加区と、ビタミンＥ、Ｐ
ＭＣ、ビタミンＣ、プロブコール、ＢＨＴを添加した比
較区分の細胞の受けた各障害率を表４に示す。
【００３５】
【表４】
【００３６】表４から、本発明区分であるホスファチジ
ルクロマノールを添加したはものは、他の抗酸化剤を添
加したものに比べて、マウス脾臓細胞の活性酸素障害を
極めて効果的に抑制することがわかる。
ルクロマノールを添加したはものは、他の抗酸化剤を添
加したものに比べて、マウス脾臓細胞の活性酸素障害を
極めて効果的に抑制することがわかる。
【００３７】実施例５ （活性酸素障害抑制剤の調製
例） 前記参考例１に示した方法により合成し、滅菌した１，
２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−
２’−ヒドロキシメチル−２’，５’，７’，８’−テ
トラメチル−６’−ヒドロキシ−クロマン（ＤＭ−ＧＰ
ＭＣ）１０ｇをジメチルスフホキシドに懸濁させ、１分
間超音波処理した後、全量を１ｌとし、１アンプルに
１．０ｍｌの割合で無菌的に封入して、活性酸素障害抑
制剤を調製した。
例） 前記参考例１に示した方法により合成し、滅菌した１，
２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−
２’−ヒドロキシメチル−２’，５’，７’，８’−テ
トラメチル−６’−ヒドロキシ−クロマン（ＤＭ−ＧＰ
ＭＣ）１０ｇをジメチルスフホキシドに懸濁させ、１分
間超音波処理した後、全量を１ｌとし、１アンプルに
１．０ｍｌの割合で無菌的に封入して、活性酸素障害抑
制剤を調製した。
【００３８】実施例６ （活性酸素障害抑制剤の調製
例） 前記参考例２に示した方法により合成し、滅菌した１，
２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−
２’−ヒドロキシエチル−２’，５’，７’，８’−テ
トラメチル−６’−ヒドロキシ−クロマン（ＤＭ−ＧＰ
ＥＣ）１０ｇを生理食塩水に懸濁させ、１分間超音波処
理したものにビタミンＣ１０ｇを溶解して全量を１ｌと
し、１アンプルに１．０ｍｌの割合で無菌的に封入し
て、活性酸素障害抑制剤を調製した。
例） 前記参考例２に示した方法により合成し、滅菌した１，
２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−
２’−ヒドロキシエチル−２’，５’，７’，８’−テ
トラメチル−６’−ヒドロキシ−クロマン（ＤＭ−ＧＰ
ＥＣ）１０ｇを生理食塩水に懸濁させ、１分間超音波処
理したものにビタミンＣ１０ｇを溶解して全量を１ｌと
し、１アンプルに１．０ｍｌの割合で無菌的に封入し
て、活性酸素障害抑制剤を調製した。
【００３９】
【発明の効果】ホスファチジルクロマノール誘導体を有
効成分とする本発明の活性酸素障害抑制剤は、強い抗酸
化作用を有し、しかも従来の抗酸化剤に比べて細胞内に
効率的に取り込まれるので、例えば本剤を培養細胞や生
体より分離した赤血球、リンパ球などの細胞の保存の際
などに添加することにより、これら細胞などが受ける活
性酸素による障害を顕著に抑制することができる。
効成分とする本発明の活性酸素障害抑制剤は、強い抗酸
化作用を有し、しかも従来の抗酸化剤に比べて細胞内に
効率的に取り込まれるので、例えば本剤を培養細胞や生
体より分離した赤血球、リンパ球などの細胞の保存の際
などに添加することにより、これら細胞などが受ける活
性酸素による障害を顕著に抑制することができる。
Claims (1)
- 【請求項１】 次の一般式 【化１】 （式中のＲ1、Ｒ2は水素原子又は炭素数２〜２４の飽和
若しくは不飽和脂肪酸残基であり、それぞれ同一であっ
てもよく、また互いに異なっていてもよく、またｎは１
〜５の整数、Ｘは１価の陽イオンである）で表わされる
ホスファチジルクロマノール誘導体を有効成分とするこ
とを特徴とする活性酸素障害抑制剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24255996A JPH1067664A (ja) | 1996-08-27 | 1996-08-27 | 活性酸素障害抑制剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24255996A JPH1067664A (ja) | 1996-08-27 | 1996-08-27 | 活性酸素障害抑制剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1067664A true JPH1067664A (ja) | 1998-03-10 |
Family
ID=17090900
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24255996A Pending JPH1067664A (ja) | 1996-08-27 | 1996-08-27 | 活性酸素障害抑制剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1067664A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010230447A (ja) * | 2009-03-26 | 2010-10-14 | Hiroshima Prefecture | 家畜の血中ビタミンａ及びベータカロテン濃度測定方法並びに家畜の血中ビタミンａ及びベータカロテン濃度測定装置 |
-
1996
- 1996-08-27 JP JP24255996A patent/JPH1067664A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010230447A (ja) * | 2009-03-26 | 2010-10-14 | Hiroshima Prefecture | 家畜の血中ビタミンａ及びベータカロテン濃度測定方法並びに家畜の血中ビタミンａ及びベータカロテン濃度測定装置 |
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