JP5254375B2 - ポリリン酸と水溶性コラーゲンの複合体材料とその製造方法 - Google Patents
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Description
[1] 少なくとも1つのポリリン酸とコラーゲンとが結合してなる、ポリリン酸−コラーゲン複合体。
但しこの複合体のポリリン酸は、一般式 (PnO3n+1)(n+2)-(式中、nは2〜5000の整数を表す)で示される少なくとも1種のものであり得る。このポリリン酸は直鎖縮合ポリリン酸でもあり得る。該ポリリン酸は、上記式中のnが20〜2000の整数であることがより好ましい。また、上記コラーゲンは好ましくはアテロコラーゲンである。さらに、上記複合体中のポリリン酸:コラーゲンの重量比は、0.1%:99.9%〜20%:80%であることが好ましい。
[2] 上記[1]記載の複合体を含有する組織再生促進用医療材料。
[3] 上記[1]記載の複合体を含有する歯周病治療用医療材料。
この方法における混合は、pH5.0〜8.0の条件下で行うことが好ましい。
また、ここで用いるポリリン酸溶液は、ポリリン酸溶液が、一般式 (PnO3n+1)(n+2) H(式中、nは2〜5000の整数を表す)で示される少なくとも1種のポリリン酸又はその塩の溶液であり得る。該ポリリン酸は、上記式中のnが好ましくは20〜2000の整数であるものであり得る。ポリリン酸溶液は、平均鎖長60〜70のポリリン酸又はその塩の溶液であってもよい。また、コラーゲン溶液に含まれるコラーゲンは水溶性コラーゲン、特にアテロコラーゲンであることが好ましい。さらに、製造されるポリリン酸−コラーゲン複合体のポリリン酸:コラーゲンの重量比が0.1%:99.9%〜20%:80%であることが好ましい。
ここで、「平均鎖長」とは、上記nの値の平均値を意味する。
1.ポリリン酸
コラーゲンと結合して本発明の複合体を形成させるポリリン酸としては、限定するものではないが、オルトリン酸が脱水縮合して得られる直鎖縮合ポリリン酸(ヘキサメタリン酸を含む)、側鎖に有機基が導入された側鎖ポリリン酸及び環状ポリリン酸等が挙げられる。好ましくは該複合体中のポリリン酸は、一般式「(PnO3n+1)(n+2)-」で表されるポリリン酸イオンであり、特に、2個以上のリン酸(PO4)四面体が頂点の酸素原子を共有して直鎖状に連なった構造をした直鎖縮合ポリリン酸イオンである。本発明においては、上記一般式中のnは少なくとも2以上の整数であって、好ましくは2〜5,000、より好ましくは5〜5,000、更に好ましくは15〜2,000、最も好ましくは20〜2,000である。本発明において、中長鎖のポリリン酸を使用する場合には、上記一般式中のnは、好ましくは20〜1,000、より好ましくは30〜500、さらに好ましくは50〜200、なお好ましくは60〜100であり得る。本明細書中においては、ポリリン酸の鎖長とは、重合したリン酸の個数(上記一般式ではnの値)を意味するものとする。従って、「平均鎖長」とは、重合したリン酸の個数(上記一般式ではn)の平均値を表す。
本発明の複合体を形成するための基材としては、生体適合性をもつ材料としてコラーゲンを用いる。コラーゲンとしては、黄紋構造を有する繊維状のタンパク質であり、限定するものではないが、主として軟骨以外の組織から得られるI型コラーゲン、IIIコラーゲン及びV型コラーゲン、主として軟骨組織から得られるII型コラーゲン、並びに網目状の会合体を形成しているIV型コラーゲン及びVI型コラーゲン等の各種コラーゲンが挙げられる。本発明においては、好ましくはこれらのコラーゲンは水溶性コラーゲンとして用いる。したがって本発明では、これらのコラーゲンは、そのタンパク質繊維の両端のテロペプチドを除去したアテロコラーゲンであることが望ましい。本発明のコラーゲンとして、例えば牛、豚、鶏、及び鮭等の魚類を含む動物の組織由来の水溶性コラーゲンであればすべて使用可能である。しかしながら、本発明で用いるコラーゲンは天然由来のものに限定されるものではなく、動物の生体組織から得られるものであってもよいし、遺伝子工学的手法を用いて微生物又は培養細胞におけるタンパク質製造により人工的に得られるものであってもよい。ヒトの体内に適用する場合には、抗原性及び微生物感染の危険性などを考慮し、ヒト由来又はヒト由来の遺伝子組換え体を用いることが好ましい。さらに、本発明で用いるコラーゲンは、後述するポリリン酸−コラーゲン複合体の形成を妨害しない限り、誘導体であってもよい。コラーゲン誘導体としては、エステル、エーテル、アミド、ウレタン、ウレア等の化学結合により、例えば水酸基、カルボキシル基、アミノ基、シアノ基、チオール基、飽和若しくは不飽和アルキル基、ベンゼン環、又は複素環構造を有する基等の各種官能基がコラーゲンに導入されているものが挙げられる。
上記のポリリン酸とコラーゲンとを用いて、本発明の複合体を製造する方法について以下に述べる。
複合体のポリリン酸イオンの供給源として使用する上記記載のポリリン酸又はその塩は、ポリリン酸溶液の状態で用いる。このポリリン酸溶液は、滅菌蒸留水に溶解したものでもよいし、Tris塩酸緩衝液又はリン酸緩衝液等の緩衝液に溶解したものでもよい。このときポリリン酸の濃度は0.5〜10重量%であり、好ましくは1〜5重量%である。このような濃度のポリリン酸溶液と、0.1〜10重量%、好ましくは0.1〜2重量%のコラーゲン溶液とを混合する。ここで、ポリリン酸溶液及びコラーゲン溶液の濃度は、溶解させたポリリン酸若しくはその塩、又はコラーゲンのそれぞれの乾燥重量の、各溶液の全重量に対するパーセンテージで示す。この混合を行う際には、pHが5.0〜8.0であることが好ましく、特にpH7.0〜8.0であることがより好ましい。このような条件下でポリリン酸とコラーゲンとを混合すると、不透明なゲル状物質が析出してくる。この析出物がポリリン酸−コラーゲン複合体である。
上記の方法で製造されたポリリン酸−コラーゲン複合体は、生体適合性材料として様々な用途に使用することができる。特に、本発明のポリリン酸−コラーゲン複合体は、ポリリン酸の組織再生促進作用を利用して種々の組織再生促進用医療材料として使用することが可能である。
食品添加物規格のヘキサメタリン酸ナトリウム20gを精製水200mlに溶解し、これに96%のエタノール32mlを徐々に加えた。これをよく攪拌し室温で30分ほど放置した後,遠心分離(10,000×g、20分、25℃)を行い、水溶液成分と沈殿物とを分離した。水溶液成分を廃棄し、回収した沈殿物に70%エタノールを加えて洗浄し、真空乾燥した。このようにして、9.2gの中長鎖ポリリン酸塩を沈殿物として得た(収量46.0%)。さらに、このポリリン酸塩をポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、その分子量を分析した。電気泳動には15%ポリアクリルアミドゲルを用い、電気泳動後のゲルをトルイジンブルーによって染色して観察した。試料に含まれるポリリン酸の平均鎖長(平均分子量)は、既知鎖長のポリリン酸を鎖長マーカーとして同時に電気泳動し、その電気泳動結果と対比することによって、およその値を見積もった。この分析の結果である分子量分布は図1に示した。レーン1〜5は鎖長マーカーであり、レーン1は平均鎖長5、レーン2は平均鎖長15、レーン3は平均鎖長35、レーン4は平均鎖長45、レーン5は平均鎖長65のポリリン酸を示す。試料としては、レーン6には溶媒分割による中長鎖ポリリン酸分離前のヘキサメタリン酸ナトリウムを、レーン7には溶媒分割により分離した中長鎖ポリリン酸をロードした。
ヘキサメタリン酸ナトリウムより実施例1に述べた方法で分離した中長鎖ポリリン酸塩10.0 gを滅菌蒸留水1,000 mlに溶解した。その後、室温で鶏由来のアテロコラーゲン(アテロヘルゲン)286 g(固形分1.72 g)を加え、ゲル状の析出物を得た。これをメッシュで濾過し70%エチルアルコールで洗浄した結果、湿重量129.3 gの複合体を得た。さらにこれを真空乾燥機で乾燥することによって、乾燥重量2.74 gの乾燥ポリリン酸−コラーゲン複合体を得ることができた。
次に、製造したポリリン酸−コラーゲン複合体の歯周組織再生効果を確認するために、ラットを用いて、歯周組織の再生実験をおこなった。Wister系雄ラット(8週齢、計18匹)を麻酔し、1/2ラウンドバーを使用して下顎第一、第二臼歯の頬側歯槽骨頂より約2mmを削除し、人工的な歯周ポケット(歯肉溝)を形成した。処理群(9匹)においては、シリンジを用いて、そのように形成した歯肉溝に実施例2で製造したポリリン酸−コラーゲン複合体を約0.1 ml注入した。また、比較群(9匹)には、コラーゲンのみを注入した。この注入操作は歯肉溝作製のための手術翌日から毎日行い、最長で3週間続行した。
平均鎖長15、35、75のポリリン酸ナトリウム(phosphate glass、シグマ社製)を用いて、3種のポリリン酸−コラーゲン複合体を作製した。まず、各平均鎖長のポリリン酸ナトリウム1gを、pH 7.5 の条件下で滅菌蒸留水100 mlに溶解して、3種のポリリン酸溶液を調製した。その後、室温で鶏由来のアテロコラーゲン(アテロヘルゲン)28.6 g(固形分0.172 g)をそれぞれの溶液に加え、ゲル状の析出物を得た。それらをメッシュで濾過し70%エチルアルコールで洗浄することにより、平均鎖長15、35、75のポリリン酸をそれぞれ含有する3種のポリリン酸−コラーゲン複合体を得た。
Claims (1)
- 濃度が0.1〜10重量%のヘキサメタリン酸溶液と、87〜100%エタノールとを2:1〜9:1の体積比で混合し、析出したポリリン酸を反応液から分離することを特徴とする、平均鎖長60〜70のポリリン酸の濃縮分離方法。
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