JP5222720B2 - ＨＧＦβ鎖変異体 - Google Patents

ＨＧＦβ鎖変異体 Download PDF

Info

Publication number
JP5222720B2
JP5222720B2 JP2008506827A JP2008506827A JP5222720B2 JP 5222720 B2 JP5222720 B2 JP 5222720B2 JP 2008506827 A JP2008506827 A JP 2008506827A JP 2008506827 A JP2008506827 A JP 2008506827A JP 5222720 B2 JP5222720 B2 JP 5222720B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
hgf
met
cell
chain
mutation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2008506827A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2008536500A (ja
Inventor
ダニエル ケイ． キルヒホファー，
ロバート エー． ラザルス，
クリスチャン ウィースマン，
Original Assignee
ジェネンテック， インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ジェネンテック， インコーポレイテッド filed Critical ジェネンテック， インコーポレイテッド
Publication of JP2008536500A publication Critical patent/JP2008536500A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5222720B2 publication Critical patent/JP5222720B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/4753—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

(関連出願)
本出願は、その全体の内容が本明細書中に出典明記によって援用される２００５年４月１５日出願の仮出願第６０／６７１６１０号に基づく米国特許法第１１９条第(ｅ)項の優先権を主張して、米国特許法施行規則第１．５３条第(ｂ)項第(１)号に基づき出願された非仮出願である。
(技術分野)
本発明は一般に分子生物学及び増殖因子調節の分野に関する。より詳細には、本発明はＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路の修飾因子(モジュレーター)及び該修飾因子の用途に関する。
(背景技術)
散乱因子(ＳＦ)としても知られている肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)はｃ-ｍｅｔプロトオンコジーンによってコードされているレセプターチロシンキナーゼ(Cooper等, 1984a & b)であるＭｅｔに対するリガンドである(Bottaro等, 1991)。Ｍｅｔに結合しているＨＧＦは細胞内キナーゼドメインのリン酸化を誘導し、様々な細胞型において細胞増殖、分化及び遊走を生じる細胞内経路の複合集団の活性化を生じる；幾つかの最近発刊された概説が包括的な概要を提供する(Birchmeier等, 2003；Trusolino及びComoglio, 2002；Maulik等, 2002)。胚発生及び組織再生におけるその基本的な重要性に加えて、ＨＧＦ／Ｍｅｔシグナル伝達経路はまた浸潤性腫瘍増殖及び転移に関係しており、それ自体、興味ある治療標的(Birchmeier等, 2003；Trusolino及びComoglio, 2002；Danilkovitch-Miagkova及びZbar, 2002；Ma等, 2003)である。
ＨＧＦはプラスミノーゲン関連増殖因子ファミリーに属し、Ｎ末端フィンガードメイン(Ｎ)と４つのクリングル(Ｋ１−Ｋ４)ドメインを含む６９ｋＤａのα鎖と、Ｃｌａｎ ＰＡ(Ｓ)／ファミリーＳ１由来のキモトリプシン様セリンプロテアーゼのプロテアーゼドメインに強い類似性を有している３４ｋＤａのβ鎖を含む(Nakamura等, 1989；Donate等, 1994；Rawlings等, 2002)。プラスミノーゲン及び他のセリンプロテアーゼチモーゲンと同様に、ＨＧＦは単鎖前駆体型(ｓｃＨＧＦ)として分泌される。ｓｃＨＧＦはヘパリン硫酸プロテオグリカン、例えば細胞表面上又は細胞外マトリックス内のシンデカン-１(Derksen等, 2002)に結合する。ヘパリン硫酸プロテオグリカンがＮドメインに結合し(Hartmann等, 1998)、それがまたＫ１に位置しているアミノ酸と共に高親和性のＭｅｔ結合に寄与している(Lokker等, 1994)。ｓｃＨＧＦは高親和性でＭｅｔに結合することができるが、レセプターを活性化させることができない(Lokker等, 1992；Hartmann等, 1992)。ＨＧＦシグナル伝達活性の獲得は、ｓｃＨＧＦのＡｒｇ４９４-Ｖａｌ４９５でのタンパク分解的切断(活性化)時に付随的であり、成熟ＨＧＦつまりジスルフィド結合α／βヘテロ二量体の生成を生じる(Lokker等, 1992；Hartmann等, 1992；Naldini等, 1992)。ＨＧＦのプロテアーゼ様ドメイン(ＨＧＦβ鎖)は、Ｇｌｎ５３４[ｃ５７]及びＴｙｒ６７３[ｃ１９５]を有する全てのセリンプロテーゼ(Perona及びCraik, 1995；Hedstrom, 2002)に見出される必要とされるＡｓｐ[ｃ１０２]-Ｈｉｓ[ｃ５７]-Ｓｅｒ[ｃ１９５](括弧での標準的なキモトリプシノーゲン番号付け)触媒三連構造を欠いているので、触媒的活性がない。
ＨＧＦ活性の調節におけるその重要性のため、このプロセスはＨＧＦ変換酵素とその対応する生理学的阻害剤によって密に制御されなければならない。ｓｃＨＧＦ活性化は、肝細胞増殖因子活性因子(ＨＧＦＡ)(Miyazawa等, 1993)、マトリプターゼ／ＭＴ-ＳＰ１(Takeuchi等 1999；Lin等, 1999)、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(Naldini等, 1992)、第ＸＩＩａ因子(Shimomura等, 1995)、第ＸＩａ因子(Peek等, 2002)及び血漿カリクレイン(Peek等, 2002)を含むキモトプシン様セリンプロテアーゼによってインビトロで媒介される。ｓｃＨＧＦと同様に、これらのプロテアーゼは不活性な前駆体として産生される；その酵素活性はまた他の活性化プロテアーゼ及びＫｕｎｉｔｚ及びセルピン型両方の阻害剤によって堅固に調節される。
セリンプロテアーゼとその活性化プロセスは開示されている(Donate等, 1994)。セリンプロテアーゼでは、チモーゲンの活性化切断は適切に形成された活性部位を生じるいわゆる「活性化ドメイン」と基質／阻害剤相互作用領域のコンホメーション再構成をなす。活性化ドメインは[ｃ１４０]-、[ｃ１８０]-及び[ｃ２２０]-ループと命名された表面曝露ループと新たに形成されたＮ末端の疎水性ポケットへの挿入を構成する(Huber及びBode, 1978)。相同リガンド／レセプター対マクロファージ刺激タンパク質(ＭＳＰ)／Ｒｏｎにおいて、セリンプロテアーゼ様ＭＳＰβ鎖はレセプター結合のために主要なエネルギーを提供する(Wang等, 1997；Miller及びLeonard, 1998)。これは、Ｍｅｔのための高親和性レセプター結合部位がＨＧＦα鎖中に存在しているＨＧＦ／Ｍｅｔ系とは逆である(Lokker等, 1994；Okigaki等, 1992)。
正常な細胞の機能及び臨床疾患の病因におけるＨＧＦ／Ｍｅｔシグナル伝達軸の重要性から、この軸の調節に基づいた非常に有効な治療的手段を開発するために必要であることを示唆する。しかしながら、特にＨＧＦ-ＨＧＦ及びＨＧＦ／Ｍｅｔ相互作用のあまり明らかとなっていないメカニズムを考慮すると、この経路の複雑さはこの分野の発展を減速させ、ＨＧＦ-ＨＧＦ及びＨＧＦ／Ｍｅｔ相互作用の作用機構の理解に基づく手法を開発するために必要であることを浮き彫りにした。以下に開示される本発明はこの必要性を満たし、他の利点を提供するものである。
特許出願及び刊行物を含むここで引用した全ての文献はその全体を出典明示により援用する。
(発明の開示)
プラスミノーゲン関連の増殖因子である肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)はそのレセプターチロシンキナーゼＭｅｔ(本明細書において、Ｃ-Ｍｅｔ、ｃ-Ｍｅｔ又はｃ-ｍｅｔとも称される)と結合し、発生、組織再生及び浸潤性腫瘍増殖に関係する。セリンプロテアーゼ様ＨＧＦβ鎖自体はＭｅｔと結合する。Ｍｅｔへの結合以外に、ＨＧＦ／Ｍｅｔ経路による適当なシグナル伝達に作用するためにＨＧＦβ鎖のどの領域及び特定の残基が必要であるかは明らかでない。本発明者等は、β鎖内の特定の領域／位置が適当なＨＧＦ機能活性に重大に関与しており、この関与はその同種レセプターへのＨＧＦβ鎖の結合を伴うか否かにかかわらないことを推測した。本明細書に記載の結果から、Ｃ-ＭｅｔへのＨＧＦ(特にＨＧＦβ鎖のもの)結合を実質的に害するか否かにかかわらず、ＨＧＦβ鎖の二量体化領域及び／又はＮ末端領域の突然変異がＨＧＦ／Ｍｅｔ生物学的機能を破壊しうることが証明される。必ずではないが一般に、これらの突然変異は、野生型ＨＧＦの「活性化ドメイン」又は「活性部位領域」を含むと思われる位置と関係していない。
本明細書において記述される突然変異分析法により、作用強度の範囲全体の野生型ＨＧＦ／ＨＧＦ及びＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ相互作用を阻害できる多数のＨＧＦ変異体の設定の基準が提供される。このような変異体の例を本明細書中に記載する。これらの変異体は、ｃ-ｍｅｔへの結合に関して野生型ＨＧＦと競合することができるが、ｃ-ｍｅｔ関連の生物学的機能への作用能が減弱している。このＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ軸の完全な又は実質的な阻害が望ましくない場合には特に有用であり、ＨＧＦ及びｃ-ｍｅｔが正常な細胞及び組織において偏在して発現されるので、特に関心がある。また、これらの変異体は、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ生物活性の完全な欠損ではなく減弱が望まれる病態を治療するための有益な治療剤として用いることができる。本発明の方法及び組成物は、少なくともある程度はこれらの所見に基づくものであり、以下により詳細に記載する。
一態様では、本発明は、ＨＧＦβ鎖Ｎ末端領域及び／又はＨＧＦβ鎖二量体化領域に突然変異を含むＨＧＦ変異体を含んでなるＨＧＦ／Ｃ-Ｍｅｔアンタゴニスト分子を提供する。
ＨＧＦβ鎖Ｎ末端領域の突然変異は、ＨＧＦ結合ポケットへのＨＧＦβ鎖Ｎ末端の挿入を害する任意のものでありうる。一実施態様では、結果として生じるＨＧＦβ鎖変異体は、野生型ＨＧＦβ鎖と比較して減弱した結合親和性でＣ-Ｍｅｔと結合する。一実施態様では、結果として生じるＨＧＦβ鎖変異体は、野生型ＨＧＦβ鎖と実質的に同等の結合親和性でＣ-Ｍｅｔと結合する。一実施態様では、結果として生じる、変異したＨＧＦβ鎖を含む完全長ＨＧＦは、完全長野生型ＨＧＦと比較して減弱した結合親和性でＣ-Ｍｅｔと結合する。一実施態様では、結果として生じる、変異したＨＧＦβ鎖を含む完全長ＨＧＦは、完全長野生型ＨＧＦと実質的に同等の結合親和性でＣ-Ｍｅｔと結合する。一実施態様では、突然変異は、Ｐ１'位置(すなわち４９５[ｃ１６])にあるか又はＰ１'位置に隣接しており、該突然変異により切断可能なＨＧＦ変異体となり、ＨＧＦβ鎖のＮ末端が活性部位／結合ポケットに挿入されないものである。活性部位／結合ポケットに挿入されない例には、限定するものではないが、変異体が(i)疎水的相互作用、及び(ii)Ａｓｐ６７２[ｃ]１９４にＮ末端を伴う塩橋の形成の何れか又はその両方内で欠損している立体構造、例えば、正荷電の置換アミノ酸残基又は挿入アミノ酸残基などの突然変異をＮ末端に有する立体構造が含まれる。一実施態様では、この変異体を介するシグナル伝達が害される。一実施態様では、突然変異は、一又は複数の位置Ｐ１'、Ｐ２'、Ｐ３'及びＰ４'内又はこれらに隣接してある。
ＨＧＦβ鎖二量体化ドメイン内の突然変異は、２つのＨＧＦβ鎖間の接触を害して、その２つの鎖(従って２つのＨＧＦ分子)の二量体化を害すると思われる任意のものでありうる。例えば、Kirchhofer等, J Biol Chem. (2004), 279(38): 39915-24に記載のあるように、このような突然変異はＨＧＦ複合体のアミノ酸構造から明白である。関連するアミノ酸位は、本明細書に記載のものを含むがこれに限定されるものではない。一実施態様では、結果として生じるＨＧＦ変異体は、他のＨＧＦβ鎖との二量体化能が減弱している。一実施態様では、ＨＧＦβ鎖二量体化領域内の突然変異は、結果として生じるＨＧＦ変異体のＣ-Ｍｅｔへの結合を実質的に害さない。
二量体化ドメインは、(例えば、ＨＧＦ／Ｍｅｔ活性化複合体内で)二量体を形成するために他のＨＧＦβ鎖と相互作用するＨＧＦβ鎖の領域を指す。プロＨＧＦの切断の際に、ＨＧＦβ鎖に立体配置的な変化が起こる。ＨＧＦβ鎖Ｎ末端残基４９５は残基Ａｓｐ６７２との塩橋を形成する。いくつかの実施態様では、ＨＧＦβの二量体化領域は、およそ４９５から５０２までのＨＧＦβの残基、Ｙ６１９、Ｔ６２０、Ｇ６２１を含む[ｃ１４０ループ]アミノ酸、６６２から６６５を含む[ｃ１８０]ループアミノ酸、又はこれらの混合物に対応する少なくとも１つのアミノ酸残基(最大すべてのアミノ酸残基)を含んでなるか、基本的にこれらから成るか、あるいはこれらから成る。一実施態様では、二量体化ドメインには、上記の位置の一又は複数の近くに／隣接して配置される位置であって、該一又は複数の位置に影響すると予測される位置が含まれる。例えば、本実施態様では、二量体化ドメインは位置６２２及び６２６を更に含んでもよい。
一態様では、本発明のＨＧＦ／Ｍｅｔアンタゴニスト分子はＨＧＦβ鎖Ｎ末端領域に突然変異を含んでおり、該突然変異が位置Ｖ４９５、Ｇ４９８、Ｒ５０２＋Ｔ５０３、及び／又はＤ６７２にあるものである。突然変異は、ＨＧＦβ鎖のＮ末端領域の一次、二次及び／又は三次構造を変化させる何れかの形態であってもよい。例えば、一実施態様では、ＨＧＦβ鎖Ｎ末端領域内の突然変異は、置換、挿入及び／又は欠失、例えばＶ４９５Ｇ、Ｖ４９５Ａ、Ｇ４９８Ｉ、Ｇ４９８Ｐ、Ｇ４９８Ｖ、Ｒ５０２欠失＋Ｔ５０３欠失、又はＤ６７２Ｎである。他の実施態様では、ＨＧＦβ鎖Ｎ末端領域の突然変異はＶ４９５の欠失である。また、ＨＧＦβ鎖のＮ末端領域の一次、二次及び／又は三次構造を変える突然変異は、ＨＧＦβ鎖Ｎ末端領域自体にないアミノ酸位にあってもよい。例えば、ＨＧＦβ鎖Ｎ末端との塩橋形成を取り除くＤ６７２の突然変異(例えばＤ６７２Ｎ)もまた、ＨＧＦβ鎖Ｎ末端領域の一次、二次及び／又は三次構造を変えると思われる。ゆえに、ＨＧＦβ鎖Ｎ末端領域及びＨＧＦβ鎖二量体化領域の突然変異が、必ずしも排他的であるという必要はない。例えば、本明細書において、記述され、図１に例証されるように、特定の位置の突然変異はＨＧＦβ鎖のＮ末端及び二量体化ドメインの両方に作用すると思われる。
一態様では、本発明のＨＧＦ／Ｍｅｔアンタゴニスト分子はＨＧＦβ鎖二量体化ドメイン内に突然変異を含んでおり、該突然変異は位置Ｎ４９７、Ｇ４９８、Ｐ５００内にあるか、Ｔ５０１及びＲ５０２、又はＲ５０２にあるか、これらに隣接してある。突然変異は、ＨＧＦβ鎖の二量体化領域の一次、二次及び／又は三次構造を変化させる何れかの形態であってもよい。ＨＧＦβ鎖の二量体化領域の構造を変える突然変異の例には、荷電性の残基か又は野生型配列に大きな側鎖(例えば嵩)を有する残基を導入する突然変異が含まれ、荷電性残基により反発性の相互作用が起こり、大きな側鎖により有害な立体相互作用が生じる。さらに、マレイミド及びハロアセチル基を含有するものなどの特定のチオールアルキル化試薬による修飾に有用なシステイン突然変異(例えばＬ６２２Ｃ、Ｉ６６４Ｃ、Ｐ５００Ｃ及びＮ４９７Ｃ)がまた導入されうる。一実施態様では、ＨＧＦβ鎖二量体化領域内の突然変異は、置換、挿入及び／又は欠失、例えばＮ４９７Ｒ又はＫ、Ｇ４９８Ａ又はＳ、Ｐ５００Ｗ、Ｈ又はＥ、Ｔ５０１とＲ５０２間の挿入(例えばＲ及び／又はＳの挿入)、又はＲ５０２欠失である。一実施態様では、位置Ｎ４９７の突然変異はＮ４９７Ｆ、Ａ又はＥでない。一実施態様では、突然変異は一又は複数の位置４９５から５０３にあり、このような突然変異はレセプターへの結合及び／又はＨＧＦβ鎖二量体化を変更しうる。他の実施態様では、二量体化ドメインに作用する突然変異は、二量体化ドメイン外の一又は複数の位置にある突然変異、例えば４９４−４９５の切断部位にある又はこれに隣接した突然変異と組み合わされうる。例えば、非切断部位であると思われる突然変異(例えばＲ４９４Ｅ：Ｖ４９５Ｇ二重突然変異)であり、二量体化ドメイン内にも突然変異を含む変異体では、このような変異体は、たとえインビボで切断される場合であっても障害された生物学的機能を表す。
本発明のＨＧＦ／Ｍｅｔアンタゴニスト分子のいくつかの実施態様では、分子は、位置５３４、５７８、６１９、６７３、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９９及び／又は７０２に野生型アミノ酸を含んでなる。本発明のＨＧＦ／Ｍｅｔアンタゴニストのいくつかの実施態様では、アンタゴニストは、位置Ｌ６２２(例えばＬ６２２Ｃ又はＫ)、Ｉ６２３(例えばＩ６２３Ｃ)、Ｄ６２６(例えばＤ６２６Ｋ)、Ｌ６２２＋Ｄ６２６(例えばＬ６２２Ｋ＋Ｄ６２６Ｋ)、Ｋ６６３(例えばＫ６６３Ｃ)、Ｉ６６４(例えばＩ６６４Ｃ)、Ｒ５０２(例えば５０２Ｃ)、Ｐ５００(例えばＰ５００Ｃ)、Ｎ４９７(例えばＮ４９７Ｃ)、Ｒ４９４＋Ｉ６２３(例えばＲ４９４Ｅ＋Ｉ６２３Ｃ)、Ｎ４９７＋Ｇ４９８(例えばＮ４９７Ｒ＋Ｇ４９８Ａ、又はＮ４９７Ｋ＋Ｇ４９８Ａ)、Ｎ４９７＋Ｐ５００(例えばＮ４９７Ｒ＋Ｐ５００Ｈ、又はＮ４９７Ｋ＋Ｐ５００Ｈ)、Ｇ４９８＋Ｐ５００(例えばＧ４９８Ａ＋Ｐ５００Ｈ)、Ｎ４９７＋Ｇ４９８＋Ｐ５００(例えばＮ４９７Ｒ＋Ｇ４９８Ａ＋Ｐ５００Ｈ、又はＮ４９７Ｋ＋Ｇ４９８Ａ＋Ｐ５００Ｈ)、Ｎ４９７＋Ｌ６２２(例えばＮ４９７Ｒ＋Ｌ６２２Ｋ、又はＮ４９７Ｋ＋Ｌ６２２Ｋ)、Ｎ４９７＋Ｄ６２６(例えばＮ４９７Ｒ＋Ｄ６２６Ｋ、又はＮ４９７Ｋ＋Ｄ６２６Ｋ)、Ｎ４９７＋Ｌ６２２＋Ｄ６２６(例えばＮ４９７Ｒ＋Ｌ６２２Ｋ＋Ｄ６２６Ｋ、又はＮ４９７Ｋ＋Ｌ６２２Ｋ＋Ｄ６２６Ｋ)に突然変異を含む。
一実施態様では、本発明のＨＧＦ／Ｍｅｔアンタゴニスト分子は、ＨＧＦ活性部位単独に、又は、本明細書に記載の突然変異の一又は複数と組み合わせて突然変異を含む。活性部位の突然変異は位置６６７及び／又は７０４に突然変異を含む。好適な突然変異には、これらの位置の一又は両方のＣ又はＷへの置換が含まれる。
通常は、本発明のＨＧＦ／Ｍｅｔアンタゴニスト分子は、通常野生型ＨＧＦと関係している生物学的特徴の一又は複数を減弱するＨＧＦβ鎖に突然変異を有するＨＧＦ分子を含んでなる。例えば、一実施態様では、前記分子は、野生型ＨＧＦと比較してＣ-Ｍｅｔシグナル伝達能(例えばＭｅｔリン酸化)を減弱している。他の実施態様では、前記分子は、野生型ＨＧＦと比較して細胞遊走を促進する能力を減弱している。他の実施態様では、前記分子は、野生型ＨＧＦと比較して細胞増殖を促進する能力を減弱している。他の実施態様では、前記分子は、野生型ＨＧＦと比較して血管新生を促進する能力を減弱している。一般的に、本発明のＨＧＦ／Ｍｅｔアンタゴニスト分子は、Ｍｅｔへの結合に伴い、本明細書に記載の変異したＨＧＦβ鎖に結合するＨＧＦａ鎖の少なくとも一部を含んでなる。
本明細書に記載の変異解析で示されるように、ＨＧＦβ鎖の特定の領域及びその中の特定のアミノ酸位は、ＨＧＦ生物学的機能の調節に重要な役割を果たす。したがって、一態様では、本発明は、これらの領域を特異的に標的とするＨＧＦ／Ｍｅｔモジュレーターも提供する。このようなモジュレーターには、アプタマーなどの核酸、結合ペプチド及び抗体などのポリペプチドが含まれる。
ここでの使用では、数の前の文字は野生型ヒトＨＧＦポリペプチド内のその数により示されるアミノ酸位にみられる対応の野生型アミノ酸を示し、数の後の文字(一又は複数)は(ある場合には)突然変異型／アミノ酸(例えば、置換アミノ酸、欠失(ｄｅｌ)又は挿入(ｉｎｓ)を示す。
一態様では、本発明は、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ調節活性を有するＨＧＦ変異体、例えばＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ活性のアンタゴニスト又はＨＧＦ生物活性の欠損ではなく減少を表すＨＧＦ変異体(例えば細胞増殖刺激活性)を提供する。一実施態様では、本発明のアンタゴニストは、インビボ又はインビトロで野生型ＨＧＦの生物活性(このような生物活性には、レセプターリン酸化、細胞増殖の刺激、細胞生存の促進、血管新生の促進、細胞遊走の誘導／促進が含まれるがこれに限定されるものではない)を阻害することが可能である。一実施態様では、ＨＧＦ変異体は、減弱した細胞増殖促進活性(例えば細胞増殖、細胞生存、血管形成、細胞遊走)を提供する。
一実施態様では、本発明のアンタゴニスト分子は、Ｍｅｔへの結合について野生型ＨＧＦと競合する。いくつかの実施態様では、前記分子は、ｃ-ｍｅｔレセプター多量体化(例えば二量体化)を阻害する。いくつかの実施形態では、前記分子は、他のβ鎖分子と相互に作用する(例えば、多量体化／二量体化)能力を減弱している変異体(突然変異体)β鎖を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記分子は、ＨＧＦβ鎖多量体化(例えば二量体化)を阻害する。いくつかの実施態様では、前記分子はｃ-ｍｅｔと結合するが、減弱したｃ-ｍｅｔ活性化能を示す(これは例えば、ｃ-ｍｅｔリン酸化、分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ(ＭＡＰＫ)リン酸化の減少、及び／又はＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ依存性細胞遊走、細胞増殖、細胞生存、細胞形態形成、血管新生などの減少により示される)。
野生型対応配列に対して一又は複数の位置が変異されている本発明の任意の分子では、突然変異は対応する野生型残基の機能的効果を変更する任意の形態でありうる。突然変異は、当該分野で知られている任意の好適な形態、例えば置換、挿入、付加及び／又は欠失によって得ることができる(及び／又は実験的に決定することができる)。ある実施態様では、変異は非保存的置換を含む。好適な置換には、限定されるものではないが、ここに(特に実施例に)記載されたもの、例えばアラニン及びセリンのようなアミノ酸のものが含まれる。
一態様では、分子／物質(例えばここに記載されたＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ調節物質)は細胞傷害剤のような毒素に結合している。これらの分子／物質は、例えば放射線及び／又は化学療法剤のような添加剤／促進剤と組み合わせて処方又は投与することができる。
本発明はまたＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達軸の調節不全に関連する疾患状態を調節するのに有用な方法と組成物を提供する。よって、一態様では、本発明は、被検体におけるｃ-ｍｅｔ活性化を調節する方法において、本発明のＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔアンタゴニスト分子を被検体に投与することを含み、ｃ-ｍｅｔ活性化が調節される方法を提供する。一実施態様では、上記分子はＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ活性を阻害するＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔアンタゴニストである。一実施態様では、上記アンタゴニストはｃ-ｍｅｔへの野生型ＨＧＦβ鎖の特異的結合を阻害する。一態様では、本発明は、被検体におけるｃ-ｍｅｔの活性化に関連した病理的症状を治療する方法であって、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストを被検体に投与することを含み、ｃ-ｍｅｔ活性化が阻害される方法を提供する。
ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路は、例えば細胞成長刺激(例えば細胞増殖、細胞生存、細胞遊走、細胞形態形成)及び血管新生を含む複数の生物学的及び生理学的機能に関与している。よって、他の態様では、本発明はｃ-ｍｅｔ活性化細胞成長(例えば増殖及び／又は生存)を阻害する方法であって、本発明のアンタゴニストに細胞又は組織を接触させることを含み、それによってｃ-ｍｅｔ活性化に関連する細胞増殖が阻害される方法を提供する。更に他の態様では、本発明は、血管新生を阻害する方法であって、異常な血管新生に関連する細胞、組織、及び／又は被検体に本発明のＨＧＦ／Ｍｅｔアンタゴニストを投与することを含み、それによって血管新生が阻害される方法を提供する。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫(例えば自己免疫)疾患及び／又は血管新生関連疾患のような疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明のアンタゴニストの使用を提供する。アンタゴニストは、抗体、抗体断片、ポリペプチド(例えばオリゴペプチド、ＨＧＦポリペプチド突然変異体／変異体)、核酸(アプタマー)、又はそれらの組み合わせを含むここに記載の任意の形態であり得る。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫(例えば自己免疫)疾患及び／又は血管新生関連疾患のような疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の核酸の使用を提供する。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫(例えば自己免疫)疾患及び／又は血管新生関連疾患のような疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の発現ベクターの使用を提供する。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫(例えば自己免疫)疾患及び／又は血管新生関連疾患のような疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の宿主細胞の使用を提供する。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫(例えば自己免疫)疾患及び／又は血管新生関連疾患のような疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の製造品の使用を提供する。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫(例えば自己免疫)疾患及び／又は血管新生関連疾患のような疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明のキットの使用を提供する。
一態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ活性化細胞増殖を阻害する方法であって、本発明の有効量のアンタゴニストに細胞又は組織を接触させることを含み、それによってｃ-ｍｅｔ活性化に関連する細胞増殖が阻害される方法を提供する。
一態様では、本発明は、被検体におけるｃ-ｍｅｔ活性化の調節不全に関連する病理症状を治療する方法であって、本発明の有効量のアンタゴニストを被検体に投与することを含み、それによって上記症状が治療される方法を提供する。
一態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又は両方を発現する細胞の成長を阻害する方法であって、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストに上記細胞を接触させることを含み、それによって上記細胞の成長の阻害を生じさせる方法を提供する。一実施態様では、細胞には異なった細胞によって(例えばパラ分泌効果によって)発現されるＨＧＦが接触させられる。
一態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又は両方を発現する細胞を含む癌性腫瘍を持つ哺乳動物を治療的に処置する方法であって、本発明のアンタゴニストの有効量を上記哺乳動物に投与することを含み、それによって上記哺乳動物を効果的に治療する方法を提供する。一実施態様では、細胞には異なった細胞によって(例えばパラ分泌効果によって)発現されるＨＧＦが接触させられる。
一態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又は両方の発現又は活性の増加に関連した細胞増殖性疾患を治療又は予防する方法であって、本発明のアンタゴニストの有効量を、そのような治療を必要とする被検体に投与することを含み、それによって上記細胞性増殖疾患を効果的に治療又は防止する方法を提供する。一実施態様では、上記増殖性疾患は癌である。
一態様では、本発明は、細胞の増殖がｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又は両方の増殖促進効果に少なくとも部分的に依存する細胞の増殖を阻害する方法であって、本発明のアンタゴニストの有効量に上記細胞を接触させることを含み、それによって上記細胞の増殖を阻害する方法を提供する。一実施態様では、細胞には異なった細胞によって(例えばパラ分泌効果によって)発現されるＨＧＦが接触させられる。
一態様では、本発明は、腫瘍の増殖がｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又は両方の増殖促進効果に少なくとも部分的に依存する被検体における腫瘍を治療的に処置する方法であって、本発明のアンタゴニストの有効量に上記細胞を接触させることを含み、それによって上記腫瘍を効果的に治療する方法を提供する。一実施態様では、細胞には異なった細胞によって(例えばパラ分泌効果によって)発現されるＨＧＦが接触させられる。
本発明の方法は任意の好適な病理的状態、例えばＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路の調節不全に関連する細胞及び／又は組織に影響を及ぼしめるために使用することができる。一実施態様では、本発明の方法において標的とされる細胞は癌細胞である。例えば、癌細胞は、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、乳頭癌細胞(例えば甲状腺)、大腸癌細胞、膵臓癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、中枢神経系癌細胞、骨原性肉腫細胞、腎臓癌細胞、肝細胞癌細胞、膀胱癌細胞、胃癌細胞、頭頸部扁平上皮癌、メラノーマ細胞、多発性骨髄腫細胞及び白血病細胞からなる群から選択されるものでありうる。一実施態様では、本発明の方法において標的とされる細胞は過剰増殖及び／又は過形成性細胞である。一実施態様では、本発明の方法において標的とされる細胞は形成異常細胞である。更に他の実施態様では、本発明の方法において標的とされる細胞は転移性細胞である。
本発明の方法は更なる治療工程を更に含みうる。例えば、一実施態様では、方法は標的細胞及び／又は組織(例えば癌細胞)が放射線治療又は化学療法剤に曝露される工程を更に含む。一実施態様では、本発明のＨＧＦ／Ｍｅｔアンタゴニスト分子は、一又は複数の他の治療的薬剤、例えばエルロチニブ(TARCEVA(登録商標))、ペメトレキセド(ALIMTA(登録商標))、ベバシズマブ(AVASTIN(登録商標))、ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))、トラスツズマブ(HERCEPTIN(登録商標))及びリツキシマブ(RITUXAN(登録商標))と組み合わせて被検体に投与される。併用療法における治療薬の投与を同時に又は連続して行うことができる。
ここに記載されるように、ｃ-ｍｅｔ活性化は、その調節不全が多くの病理的症状に至る重要な生物学的プロセスである。従って、本発明の方法の一実施態様では、標的とされる細胞(例えば癌細胞)は、同じ組織由来の正常細胞と比較してｃ-ｍｅｔの活性化が高められるものである。一実施態様では、本発明の方法は標的細胞の死を引き起こす。例えば、本発明のアンタゴニストとの接触はｃ-ｍｅｔ経路を通してシグナル伝達する細胞の無能を生じ得、それが細胞死を生じる。
ｃ-ｍｅｔ活性化（よってシグナル伝達）の調節不全は、例えばＨＧＦ(ｃ-ｍｅｔの同種リガンド)及び又はｃ-ｍｅｔ自体の過剰発現を含む多くの細胞変化から生じうる。従って、ある実施態様では、本発明の方法は、同じ組織由来の正常細胞と比較してｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又は両方が上記細胞(例えば癌細胞)によってより豊富に発現される細胞を標的とすることを含む。ｃ-ｍｅｔ発現細胞は、様々な供給源からのＨＧＦによって、つまり自己分泌又はパラ分泌形式で調節されうる。例えば、本発明の方法の一実施態様では、標的細胞に、(例えばパラ分泌効果を介して)異なった細胞に発現される肝細胞増殖因子が接触／結合する。上記異なった細胞は同じ又は異なった組織由来でありうる。一実施態様では、標的細胞に、(例えば自己分泌効果／ループを介して)標的細胞自身によって発現されるＨＧＦが接触／結合する。
ある実施態様では、本発明のＨＧＦ／Ｍｅｔアンタゴニストは、その阻害及び／又は治療効果(例えば向上した親和性、改善された薬物動態学的性質(例えば半減期、安定性、クリアランス速度)、被検体に対する低減した毒性)を向上させる修飾を含むＨＧＦ突然変異体を含む。そのような修飾には、例えば、グリコシル化、ペグ化、非天然発生であるが機能的に等価なアミノ酸、結合基等での置換が含まれる。好適な修飾は当該分野でよく知られており、更に必要に応じて実験的に決定することができる。
一態様では、本発明は、本発明の一又は複数のＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔアンタゴニスト及び担体を含有する組成物を提供する。一実施態様では、担体は薬学的に許容可能である。
一態様では、本発明は本発明のＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔアンタゴニストをコードする核酸を提供する。一実施態様では、本発明の核酸は、ポリペプチド(例えばＨＧＦ突然変異体／変異体)であるか又はそれを含むＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔアンタゴニストをコードする。一実施態様では、本発明の核酸は、抗体又はその断片であるか又はそれを含むＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔアンタゴニストをコードする。
一態様では、本発明は本発明の核酸を含むベクターを提供する。
一態様では、本発明は本発明の核酸又はベクターを含む宿主細胞を提供する。ベクターは任意のタイプであり得、例えば発現ベクターのような組換えベクターである。様々な宿主細胞の任意のものを用いることができる。一実施態様では、宿主細胞が原核細胞、例えば大腸菌である。一実施態様では、宿主細胞は真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞のような哺乳動物細胞である。
一態様では、本発明は、本発明のＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔアンタゴニストの作製方法を提供する。例えば、本発明は、抗体(又はその断片)である又は抗体を含んでなるアンタゴニストの作製方法であって、適切な宿主細胞において該抗体(又はその断片)をコードする本発明の組み換えベクターを発現させ、該抗体を回収することを含む方法を提供する。他の例では、本発明は、ポリペプチド(例えばＨＧＦ突然変異体／変異体)である又はポリペプチドを含んでなるＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔアンタゴニストの作製方法であって、適切な宿主細胞において該ポリペプチドをコードする本発明の組換えベクターを発現させ、該ポリペプチドを回収することを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、容器、及び、容器に内包される組成物を具備する製造品であって、該組成物が本発明の一又は複数のＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔアンタゴニストを含有してなるものである製造品を提供する。一実施態様では、組成物は本発明の核酸を含有してなる。一実施態様では、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔアンタゴニストを含有してなる組成物は担体を更に含有し、いくつかの実施態様ではその担体は薬学的に受容可能である。一実施態様では、本発明の製造品は、被検体に組成物を投与するための指示書を更に具備する。
一態様では、本発明は、本発明の一又は複数のＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔアンタゴニストを含有してなる組成物を含む第一容器と、バッファーを含んでいる第二容器を具備するキットを提供する。一実施態様では、バッファーは薬学的に受容可能である。一実施態様では、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔアンタゴニストを含有してなる組成物は担体を更に含有し、いくつかの実施態様ではその担体は薬学的に受容可能である。一実施態様では、キットは、被検体に組成物を投与するための指示書を更に具備する。
(発明を実施するための形態)
本発明はＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路を調節するための方法、組成物、キット及び製造品を提供する。
これらの方法、組成物、キット及び製造品の詳細をここに提供する。
一般的方法
本発明の実施には、別段の記載がない限り、当業者の技量の範囲内にある分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の一般的な技術を使用する。かかる技術は、例えば“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, ２版 (Sambrook等, 1989)；“Oligonucleotide Synthesis” (M. J. Gait編, 1984)；“Animal Cell Culture” (R. I. Freshney編, 1987)；“Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.)；“Current Protocols in Molecular Biology” (F. M. Ausubel等編, 1987、及び定期的に最新のもの)；“PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis等編, 1994)；“A Practical Guide to Molecular Cloning” (Perbal Bernard V., 1988)のような文献に十分に記載されている。
定義
本明細書において使用するように、アミノ酸名称の言及は、一又は複数の以下の様式で当分野で認められている表示であり、これらは本明細書中で相互に交換可能に用いられる：(i) 省略しない名称(例えばトリプトファン、セリン、グリシンなど)、(ii) ３文字略記号(例えばＴｒｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙなど)、及び(iii) １文字表記(例えばＷ、Ｓ、Ｇなど)。
ペプチド又はポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる同類置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、特定のペプチド又はポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ(ＤＮＡＳＴＡＲ)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、米国特許第６８２８１４６号に記載のように、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。
本明細書中で用いる「ペプチド」及び「ポリペプチド」なる用語は交換可能に用いられるが、一般的に「ペプチド」なる用語は２００未満の連続したアミノ酸を含んでなるポリペプチドを指す場合は除く。一般的に、「ペプチド」なる用語は、ペプチジル結合によって結合した、連続した、相対的に短い配列のアミノ酸を指す。典型的に、必ずではないが、ペプチドはおよそ２から５０のアミノ酸、４から４０のアミノ酸又は１０から３０のアミノ酸の長さを有する。
ここで使用される「ベクター」という用語は、それが連結しているその他の核酸を輸送することのできる核酸分子を指す。一つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、付加的なＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる環状二重鎖ＤＮＡループを指す。他のタイプのベクターはファージベクターである。その他の型のベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムへライゲーションすることができる。所定のベクターは、それらが導入される宿主内において自己複製することができる(例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクター、及びエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入によって宿主細胞のゲノムに組み込まれ、宿主ゲノムと共に複製される。更に、所定のベクターは、それらが作用可能に連結している遺伝子の発現を方向づけ得る。このようなベクターは、ここでは、「組換え発現ベクター」(あるいは単に「組換えベクター」)と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術で利用する発現ベクターは、しばしばプラスミドの形をとる。本明細書では、プラスミドが最も広く使用されているベクターの形態であるので、「プラスミド」及び「ベクター」は相互交換可能に使用することができる。
ここで交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体(アナログ)、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、もしくは合成反応によりポリマー中に取り込み可能な任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前又は後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは合成後に、例えば標識との結合により、さらに修飾されてもよい。他のタイプの修飾には、例えば「キャップ(caps)」、類似体との自然に生じたヌクレオチドの一又は複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結(例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等)及び荷電連結(ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等)を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ply-L-リジン等)を含むもの、インターカレータ(intercalators)を有するもの(例えばアクリジン、ソラレン等)、キレート剤(例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等)を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結を含むもの(例えばアルファアノマー核酸等)、並びにポリヌクレオチド(類)の未修飾形態が含まれる。更に、糖類中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホナート基、ホスファート基で置き換えられてもよく、標準的な保護基で保護されてもよく、又は付加的なヌクレオチドへのさらなる連結を調製するように活性化されてもよく、もしくは固体又は半固体担体に結合していてもよい。５'及び３'末端のＯＨはホスホリル化可能であり、又は１〜２０の炭素原子を有する有機キャップ基部分又はアミンで置換することもできる。また他のヒドロキシルは標準的な保護基に誘導体化されてもよい。またポリヌクレオチドは当該分野で一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖類の類似形態のものをさらに含み得、これらには例えば２'-Ｏ-メチル-、２'-Ｏ-アリル、２'-フルオロ又は２'-アジド-リボース、炭素環式糖の類似体、アルファ-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース類又はリキソース類、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及び非塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。一又は複数のホスホジエステル連結は代替の連結基で置き換えてもよい。これらの代替の連結基には、限定されるものではないが、ホスファートがＰ(Ｏ)Ｓ(「チオアート」)、Ｐ(Ｓ)Ｓ(「ジチオアート」)、「(Ｏ)ＮＲ２(「アミダート」)、Ｐ(Ｏ)Ｒ、Ｐ(Ｏ)ＯＲ'、ＣＯ又はＣＨ２(「ホルムアセタール」)と置き換えられた実施態様のものが含まれ、ここでそれぞれのＲ及びＲ'は独立して、Ｈ又は、エーテル(-Ｏ-)結合を含んでいてもよい置換もしくは未置換のアルキル(１-２０Ｃ)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はアラルジル(araldyl)である。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。先の記述は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含むここで引用される全てのポリヌクレオチドに適用される。
ここで使用される「オリゴヌクレオチド」とは、短く、一般的に単鎖であり、また必ずしもそうではないが、一般的に約２００未満のヌクレオチド長さの、一般的に合成のポリヌクレオチドを意味する。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」なる用語は、相互に排他的なものではない。ポリヌクレオチドについての上述した記載はオリゴヌクレオチドと等しく、十分に適用可能である。
ここで用いられる「肝細胞増殖因子」又は「ＨＧＦ」という用語は、別段の記載をしない限り、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路を、そのようなプロセスが生じることを可能にする条件下で活性化させることができる任意の天然又は変異体(天然であろうと合成であろうと)ＨＧＦポリペプチドを意味する。「野生型ＨＧＦ」という用語は一般に天然に生じるＨＧＦタンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。「野生型ＨＧＦ配列」という用語は一般に天然に生じるＨＧＦに見出されるアミノ酸配列を意味する。
本明細書で用いる「実質的に害しない」、「実質的に減弱しない」、「実質的に同様な」又は「実質的に同等である」なる句及びその変形語は、２つの数値間の類似性が十分に高く、当分野の技術者が２つの値間の相違をこれらの値により測定される生物学的特性の範囲内でほとんど又は全く生物学的な有意差がないとみなす程度のものであることを示す。前記の２つの値の相違は、好ましくはおよそ５０％未満、好ましくはおよそ４０％未満、好ましくはおよそ３０％未満、好ましくはおよそ２０％未満、好ましくはおよそ１０％未満である。「２つの数値」の例には、野生型タンパク質と関係している値と、前記タンパク質の変異型と関係している値とが含まれる。
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、最も広い意味で互換性をもって使用され、モノクローナル抗体(全長又は無傷のモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体(例えば、所望の生物学的活性を示す限りにおいての二重特異性抗体)を含み、またある種の抗体断片(ここに更に詳細に記載)を含みうる。抗体はヒト、ヒト化及び／又は親和性成熟でありうる。
「抗体断片」は、無傷の抗体に存在するときその部分に通常は不随する機能の少なくとも一つ、好ましくは殆ど又は全てを好ましくは保持している無傷の抗体の一部のみを含む。一実施態様では、抗体断片は無傷の抗体の抗原結合部位を含み、よって抗原に結合する能力を保持している。他の実施態様では、抗体断片、例えばＦｃ領域を含むものは、無傷の抗体に存在するときＦｃ領域に通常は不随する生物学的機能の少なくとも一つ、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合を保持する。一実施態様では、抗体断片は、無傷の抗体に実質的に同様なインビボ半減期を有している一価抗体である。例えば、そのような抗体断片は断片にインビボ安定性を付与することができるＦｃ配列に結合した抗原結合アームを含みうる。
ここで用いられる「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体、即ち、集団を構成する個々の抗体が少量で存在しうる自然に起こりうる突然変異以外は同一であるものを意味する。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原に向けられている。更に、典型的に異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種から誘導された又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖の残りの部分は他の種から誘導された又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体、並びにそれらが所望の生物学的活性を示す限りにおいてそれらの抗体の断片を特に含む(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984))。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)であって、そのレシピエントの高頻度可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性及び容量を持つマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域に由来する残基で置換されている。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク(ＦＲ)領域残基が対応する非ヒト残基で置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、ドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、抗体の性能を更に精密にするために施される。一般に、ヒト化抗体は、高頻度可変ループの全て又は実質上全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全て又は実質上全てがヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含むであろう。更なる詳細については、Jones等, Nature 321: 522-525 (1986)；Riechmann等, Nature 332: 323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)を参照のこと。また次の概説論文とそこに引用されている文献を参照のこと：Vaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle及びGross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)。
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のものに相当する、及び／又はここに開示されたヒト抗体を製造する何れかの技術を使用して製造されたアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除く。
「親和性成熟」抗体とは、変化を有しない親抗体と比較し、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめるその一又は複数のＣＤＲｓに一又は複数の変化を有する抗体である。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルでさえの親和性を有する。親和性成熟抗体は、当該分野において知られている方法によって生産される。Marks等 Bio/Technology 10:779-783(1992)は、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟について記載している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Barbas等, Proc Nat Acad. Sci, USA 91: 3809-3813(1994)；Schier等, Gene 169:147-155(1995)；Yelton等, J. Immunol. 155:1994-2004(1995)；Jackson等, J. Immunol. 154(7):3310-9(1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol. 226:889-896(1992)に記載されている。
「阻止(ブロック)」抗体又は「アンタゴニスト」抗体はそれが結合する抗原の生物学的活性を阻害又は低減させるものである。好適な阻止(ブロック)抗体又はアンタゴニスト抗体は抗原の生物学的活性を実質的に又は完全に阻害する。
ここで使用される「アゴニスト抗体」は、対象のポリペプチドの機能的活性の少なくとも一を模倣する抗体である。
「疾患」又は「病態」は本発明の物質／分子又は方法で治療することで恩恵を得るあらゆる症状のことである。これには、問題の疾患に哺乳動物を罹患させる素因になる病理状態を含む、慢性及び急性の疾患又は病気が含まれる。ここで治療される疾患の非限定的な例は、悪性及び良性の腫瘍ないしは癌；非白血病及びリンパ悪性腫瘍；ニューロン、神経膠、星状細胞、視床下部及び他の腺、マクロファージ、上皮、ストロマ及び胞胚腔の疾患；及び炎症性疾患、免疫性疾患、神経変性疾患、血管新生関連疾患及びミトコンドリアないしは代謝不全に関する疾患が含まれる。
「細胞増殖性疾患」及び「増殖性疾患」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖を伴う疾患を意味する。一実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。
ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。「癌」、「癌性」、「癌増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」という用語はここで意味するように互いに排除するものではない。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長／増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより具体的な例には、多発性骨髄腫、扁平細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平癌腫、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌(例えば腎細胞癌)、肝臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌及び頭頸部癌の様々なタイプが含まれる。
ここで使用される「治療」とは、治療されている個体又は細胞の自然の過程を変えることを試みる臨床的介入を意味し、予防か又は臨床的病理の過程の何れかで実施され得る。治療の所望の効果には、疾患の発生又は再発の防止、症状の軽減、疾患のあらゆる直接的又は間接的病理的結果の消失、転移の予防、疾患進行速度の減少、疾患状態の寛解(amelioration)又は緩和、及び寛解(remission)又は改善された予後が含まれる。ある実施態様では、本発明の抗体は疾患又は障害の発生を遅延させるために使用される。
「有効量」は、所望の治療的又は予防的結果を達成するために必要な用量及び時間での有効な量を意味する。
本発明の物質／分子の「治療的有効量」という用語は、疾患状態、年齢、性別、及び個体の体重、及び個体において所望の応答を生じさせるための物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの能力のような因子に応じて変化しうる。治療的有効量はまた物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストのあらゆる毒性又は有害な作用に治療的に恩恵のある効果が優るものである。「予防的に有効な量」は所望の予防結果を達成するのに必要な用量及び時間での有効量を意味する。典型的には、必ずしも必要ではないが、予防的用量は疾患の前又は疾患の初期段階で被検体に使用されるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ないであろう。
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を意味する。この用語は、放射性同位元素(例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位元素)、化学治療薬、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド類(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤、酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞毒性剤を以下に記載する。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(商標登録))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethiylenethiophosphoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン)；カンプトテシン(合成アナログトポテカンを含む)；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む)；クリプトフィシン(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン(合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む)；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１(例えばAgnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186(1994)参照)；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；ビスホスホネート、例えばクロドロネート；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidainine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidanmol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド類、例えばTAXOL(登録商標)パクリタキセル(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)、ABRAXANETMパクリタキセルのクレモフォー無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)、及びTAXOTERE(登録商標)ドキセタキセル(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；クロランブシル；GEMZAR(登録商標)ゲムシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；プラチナアナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン；NAVELBINE(登録商標)ビノレルビン；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＰＴ-１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸のようなレチノイド；カペシタビン(capecitabine)；及び上述したものの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
また上記の「化学療法剤」の定義に含まれるものには、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節物質(ＳＥＲＭ)、例えば、タモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びＦＡＲＥＳＴＯＮトレミフェン；副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、MEGASE(登録商標)酢酸メゲストロール、AROMASIN(登録商標)エキセメスタン、フォルメスタニー(formestanie)、ファドロゾール、RIVISOR(登録商標)ボロゾール、FEMARA(登録商標)レトロゾール、及びARIMIDEX(登録商標)アナストロゾール；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に付着細胞の増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｌｆ、及びＨ-Ｒａｓ；リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現阻害剤(例えば、ANGIOZYME(登録商標)リボザイム)及びＨＥＲ２発現阻害剤；遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン、及びVAXID(登録商標)ワクチン；PROLEUKIN(登録商標)ｒＩＬ-２；LURTOTECAN(登録商標)トポイソメラーゼ１阻害剤；ABARELIX(登録商標)ｒｍＲＨ；及び上記のものの製薬的に許容される塩類、酸類又は誘導体を含む。
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、増殖がインビトロ又はインビボの何れかでＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ活性化に依存する細胞の増殖を阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、増殖阻害剤は、Ｓ期にＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ依存性細胞の割合を有意に減少させるものでありうる。増殖阻害剤の例には、細胞周期の進行を(Ｓ期以外の位置で)阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤が含まれる。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキサン、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。Ｇ１を停止させる薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael編, Chapter 1, 表題"Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類(パクリタキセル及びドセタキセル)は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル(TAXOTERE(登録商標), Rhone-Poulenc Rorer)は、パクリタキセル(TAXOL(登録商標), Bristol-Myers Squibb)の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化する。
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学名は(８Ｓ-シス)-１０-[(３-アミノ-２,３,６-トリデオキシ-α-Ｌ-リキソ-ヘキサピラノシル)オキシ]-７,８,９,１０-テトラヒドロ-６,８,１１-トリヒドロキシ-８-(ヒドロキシアセチル)-１-メトキシ-５,１２-ナフタセンジオンである。
ＨＧＦ／Ｍｅｔアンタゴニスト−ペプチド／ポリペプチド(抗体を含む)
本発明の一態様は、ＨＧＦβ鎖-β鎖相互作用及びＨＧＦ-Ｍｅｔ相互作用の単離されたペプチド／ポリペプチド及び抗体モジュレーターに関係する。一実施態様では、モジュレーター(例えばペプチド／ポリペプチド及び抗体)は、標準的なタンパク質精製技術を用いた適切な精製スキームによって細胞又は組織源から単離できる。他の実施態様では、モジュレーターは組換えＤＮＡ技術により産生される。組換え発現に代えて、モジュレーターは、標準的なペプチド合成技術を用いて化学的に合成されてもよい。
本発明のＨＧＦ／Ｍｅｔアンタゴニスト分子は図１に記載のものを含む。また、本発明は、調節活性を有するペプチド／ポリペプチドをコードしたままで、これらのペプチド／ポリペプチドの対応する残基から何れかの残基が変化している突然変異体又は変異体タンパク質を提供する。一実施態様では、ペプチド／ポリペプチドアンタゴニストの変異体は、参照ペプチド／ポリペプチドアンタゴニストの配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有する。通常、変異体は、所望の程度のアンタゴニスト活性を有しながら、当分野で認められる結合アッセイ定量化単位／測定基準に基づいて、参照の結合体ペプチド／ポリペプチドアンタゴニストと実質的に同じかそれよりも大きな結合親和性、例えば参照の結合体ペプチド／ポリペプチド／リガンドの少なくとも０．７５×、０．８×、０．９×、１．０×、１．２５×又は１．５×の結合親和性を示す。
通常、本発明の変異体には、配列の特定位置の残基が他のアミノ酸により置換されている変異体が含まれ、そして更に、親のタンパク質／ペプチドの２つの残基の間に付加的な一又は複数の残基を挿入する可能性、並びに親配列から一又は複数の残基を欠失する可能性、又は一又は複数の残基を親配列に付加する可能性を有する。本発明には任意のアミノ酸置換、挿入又は欠失が包含される。好ましくは、置換は本明細書に記載の保存的な置換である。
「単離された」又は「精製された」ペプチド、ポリペプチド、タンパク質又は生物学上活性な断片は、その自然環境の成分から単離及び／又は回収される。混入成分には、一般的にポリペプチドの診断的使用又は治療的使用を妨げる物質が含まれ、酵素、ホルモン類及び他のタンパク質性又は非タンパク質性の物質が含まれうる。乾燥重量にして好ましくは３０％未満、好ましくは２０％未満、１０％及び好ましくは５％未満の望ましくない混入物質(汚染物質)を有する調製物は、実質的に単離されているとみなす。単離され、組換え産生されたペプチド／ポリペプチド又はその生物学的に活性な部分は、実質的に培養液を含まないのが好ましい。すなわち、培養液がペプチド／ポリペプチド調製物の好ましくは２０％未満、好ましくはおよそ１０％未満及び好ましくはおよそ５％未満の容量を表すものである。混入物の例には、細胞片、培養液、及びペプチド／ポリペプチドのインビトロ合成の間に用いられ産生される物質などがある。
ペプチド／ポリペプチドの保存的置換を「好ましい置換」と題して表Ａに示す。これらの置換が生物学的活性に変化をもたらす場合、表Ａに「例示的置換」と名前を付けた又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な変化が導入され、生成物がスクリーニングされうる。
表Ａ
Figure 0005222720
ペプチド／ポリペプチドの生物学的特性における実質的な修飾は、(ａ)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又はへリックス構造、(ｂ)標的部位における分子の電荷又は疎水性、もしくは(ｃ)側鎖の嵩を、維持する効果について有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループ分けできる：
(１)疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
(２)中性親水性：cys, ser, thr;
(３)酸性：asp, glu;
(４)塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
(５)鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
(６)芳香族：trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類のものに交換することが必要であろう。
また、抗体修飾因子の変異体は、抗体の活性に実質的に影響することなく当分野で公知の情報に基づいて作製することができる。例えば、抗体変異体は、抗体分子中に異なる残基によって置換された少なくとも一のアミノ酸残基を有しうる。抗体について、置換の突然変異誘発のために最も関心のある部位は一般的に高頻度可変領域を含むが、フレームワーク領域(ＦＲ)変異も考慮される。
抗体について、ある種の置換変異体は、親抗体(例えばヒト化又はヒト抗体)の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般に、更なる開発のために選択されて得られた変異体は、それらが生成された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を生成する簡便な方法はファージディスプレイを用いた親和性成熟化である。簡単に述べれば、いくつかの高頻度可変領域部位(例えば６−７部位)を突然変異させて各部位において全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このようにして生成された抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージ化されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合体として表出される。ついで、ファージディスプレイ変異体を、ここに開示されるそれらの生物学的活性(例えば結合親和性)についてスクリーニングする。修飾の候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。あるいは、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体と抗原との接触点を同定するのが有利である。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体がひとたび生成されたら、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、これらに限られないが、天然源からの単離(自然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又はオリゴヌクレオチド媒介(又は部位特異的)突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及び抗体の初期調製された変異体又は非変異体型のカセット突然変異誘発による調製を含む。
本発明の免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸修飾を導入し、よってＦｃ領域変異体を産生するのが望ましい場合がある。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジのシステインを含む、一又は複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾(例えば置換)を有するヒトＦｃ領域配列(例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４Ｆｃ領域)を含みうる。
一実施態様では、Ｆｃ領域変異体は、改変された新生児Ｆｃレセプター(ＦｃＲｎ)結合親和性を示しうる。そのような変異体Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２３８、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２６５、２７２、２８６、２８８、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、３８６、３８８、４００、４１３、４１５、４２４、４３３、４３４、４３５、４３６、４３９又は４４７の任意の一又は複数においてのアミノ酸修飾を含み得、ここでＦｃ領域の残基の番号付けはKabatにおけるＥＵインデックスのものである。ＦｃＲｎへの結合性が低減させられたＦｃ領域変異体は、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２５２、２５３、２５４、２５５、２８８、３０９、３８６、３８８、４００、４１５、４３３、４３５、４３６、４３９又は４４７の任意の一又は複数においてのアミノ酸修飾を含み得、ここでＦｃ領域の残基の番号付けはKabatにおけるＥＵインデックスのものである。上述のＦｃ領域変異体は、あるいは、ＦｃＲｎに対して増加した結合性を示し、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の任意の一又は複数においてのアミノ酸修飾を含み得、ここでＦｃ領域の残基の番号付けはKabatにおけるＥＵインデックスのものである。
ＦｃγＲへの結合性が低減させられたＦｃ領域変異体は、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７２、２７８、２８９、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３２２、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１４、４１６、４１９、４３４、４３５、４３７、４３８又は４３９の任意の一又は複数においてのアミノ酸修飾を含み得、ここでＦｃ領域の残基の番号付けはKabatにおけるＥＵインデックスのものである。
例えば、Ｆｃ領域変異体はＦｃγＲIへの減少した結合性を示し得、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２３８、２６５、２６９、２７０、３２７又は３２９の任意の一又は複数においてアミノ酸修飾を含み、ここでＦｃ領域の残基の番号付けはKabatにおけるＥＵインデックスのものである。
Ｆｃ領域変異体はＦｃγＲIIへの減少した結合性を示し得、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２３８、２６５、２６９、２７０、２９２、２９４、２９５、２９８、３０３、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３７３、３７６、４１４、４１６、４１９、４３５、４３８又は４３９の一又は複数においてアミノ酸修飾を含み得、ここでＦｃ領域の残基の番号付けはKabatにおけるＥＵインデックスのものである。
対象とするＦｃ領域変異体はＦｃγＲIIIへの減少した結合性を示し得、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７２、２７８、２８９、２９３、２９４、２９５、２９６、３０１、３０３、３２２、３２７、３２９、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１６、４３４、４３５又は４３７の一又は複数においてのアミノ酸修飾を含み得、ここでＦｃ領域の残基の番号付けはKabatにおけるＥＵインデックスのものである。
改変された(すなわち改善されたか減少させられた)Ｃ１ｑ結合性及び／又は補体依存性細胞障害性(ＣＤＣ)を持つＦｃ領域変異体は国際公開第９９／５１６４２号に記載されている。そのような変異体はＦｃ領域のアミノ酸位置２７０、３２２、３２６、３２７、３２９、３３１、３３３又は３３４の一又は複数においてアミノ酸置換を含みうる。また、Ｆｃ領域変異体については、Duncan及びWinter Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号を参照のこと。
ベクター構築
ここに記載されたペプチド／ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は標準的な組換え技術を用いて得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列は適切な供給源細胞から単離し配列決定することができる。抗体に対する供給源細胞はハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞を含む。あるいは、ポリヌクレオチドはヌクレオチド合成機又はＰＣＲ技術を用いて合成することができる。一度入手したら、免疫グロブリンをコードする配列を、宿主細胞中で異種ポリヌクレオチドを複製して発現することができる組換えベクター中に挿入する。当該分野で公知の入手可能な多数のベクターが本発明の目的のために使用できる。適当なベクターの選択は主としてベクターに挿入される核酸の大きさ及びベクターにより形質転換する特定の宿主細胞に依存する。各ベクターは、その機能(異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、又は双方)とそれが存在する特定の宿主細胞とのその適合性に応じて様々な成分を含む。一般に、ベクター成分には、限定されるものではないが、複製開始点(特にベクターが原核細胞に挿入される場合)、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位(ＲＢＳ)、シグナル配列、異種核酸挿入片及び転写終結配列が含まれる。
一般に、レプリコン及び宿主細胞に適する種由来のコントロール配列を含むプラスミドベクターをこれらの宿主と共に用いる。通常、ベクターは複製部位、並びに形質転換細胞における表現型選択を提供し得るマーカー配列を有する。例えば、大腸菌は典型的には大腸菌種由来のプラスミドのｐＢＲ３２２を用いて形質転換する。ｐＢＲ３２２はアンピシリン(Ａｍｐ)及びテトラサイクリン(Ｔｅｔ)耐性をコードする遺伝子を含むため、形質転換細胞を同定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体、又は他の微生物のプラスミドないしはバクテリオファージはまた内因性タンパク質の発現のために微生物によって使用され得るプロモーターを含んでもよいしまたは含むよう改変してもよい。
また、レプリコンと宿主微生物に適するコントロール配列とを含むファージベクターを形質転換ベクターとしてこれらの宿主と共に用いてもよい。例えば、λＧＥＭ.ＴＭ.-１１などのバクテリオファージを組換えベクターの作製に利用してもよく、これを用いて大腸菌ＬＥ３９２などの感受性宿主細胞を形質転換することができる。
当業者が確認できる特定の状況の必要性に従って、恒常的プロモーター又は誘導プロモーターの何れかを本発明で使用することができる。種々の可能性ある宿主細胞によって認識される多数のプロモーターがよく知られている。制限酵素消化によって供給源ＤＮＡ由来のプロモーターを除去し、単離したプロモーター配列を選択したベクターに挿入することで、選択したプロモーターをここに記載のポリペプチドをコードするシストロンＤＮＡに機能しうる形で連結させることができる。天然のプロモーター配列と多数の異種プロモーターの双方を用いて標的遺伝子の増幅及び／又は発現を導くことができる。しかしながら、異種プロモーターが好ましく、これはそれらが一般に天然の標的ポリペプチドプロモーターと比べ、より多くの転写と高い収量の発現標的遺伝子を可能にするからである。
原核生物宿主との使用に適したプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーター、βガラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン(trp)プロモーター系及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃ又はｔｒｃプロモーターが含まれる。しかしながら、細菌において機能的な他のプロモーター(例えば、他の既知のバクテリア又はファージプロモーター)も同様に適している。そのヌクレオチド配列は公開されているので、当業者は、リンカー又はアダプターを用いてそれらを標的の軽鎖及び重鎖をコードするシストロンと連結させて任意の必要な制限酵素部位を供給することができる(例えば、Siebenlist等, (1980) Cell 20:269)。
ある実施態様では、組換えベクター内の各シストロンは、発現されたポリペプチドの膜を越えての移行を指示する分泌シグナル配列要素を含む。一般に、シグナル配列はベクターの成分であってよく、又はベクターに挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であってもよい。本発明の目的のために選択されるシグナル配列は宿主細胞によって認識され、プロセシングされる(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものであるべきである。異種ポリペプチドの本来のシグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物の宿主細胞に対しては、シグナル配列を例えば、アルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、又は熱安定性エンテロトキシンＩＩ(ＳＴＩＩ)リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ及びＭＢＰからなる群から選択される原核生物のシグナル配列で置換する。
ポリペプチドを発現させるのに好適な原核生物の宿主細胞としては、グラム陰性又はグラム陽性生物などの古細菌及び真正細菌が挙げられる。有用な細菌の例としてはエシェリキア属(例えば、大腸菌)、桿菌(例えば、枯草菌)、腸内細菌、シュードモナス種(例えば、緑膿菌)、ネズミチフス菌、セラチア・マルセスカンス、クレブシエラ属、プロテウス属、赤痢菌属、根粒菌、ビトレオスシラ(Vitreoscilla)、又はパラコッカス(Paracoccus)が挙げられる。好ましくは、グラム陰性細胞が使用される。好ましくは、宿主細胞は最少量のタンパク分解性酵素を分泌すべきであり、更なるプロテアーゼ阻害剤は細胞培養物中に望ましくは導入してもよい。
ペプチド／ポリペプチド産生
宿主細胞に上述した発現ベクターを形質転換又は形質移入して、誘導プロモーターに適するように改変した一般的な栄養培地で培養し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅する。
形質移入は、コード配列が実際に発現されようとされまいと、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。数多くの形質移入法が当業者に知られており、例えばＣａＰＯ４沈殿法及びエレクトロポレーションである。成功裏の形質移入は、一般に、このベクターの作用の任意の指標が宿主細胞内で生じる場合に認識される。
形質転換とはＤＮＡが染色体外要素としてか又は染色体成分によってのいずれかで複製されうるようにＤＮＡを原核生物の宿主に導入することを意味する。形質転換は、用いる宿主細胞に応じて、かかる細胞に適当な標準的な技術を用いて行う。一般に、かなりの細胞壁障壁を含む細菌細胞には塩化カルシウムを用いるカルシウム処理を用いる。他の形質転換法はポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。用いられる更に別の技術はエレクトロポレーションである。
本発明のペプチド／ポリペプチドを生産するために用いられる原核細胞は、当該分野で既知であり選択した宿主細胞の培養に好適な培地中で増殖させる。好適な培地の例としては必要な栄養素を添加したルリア・ブロス(ＬＢ)が挙げられる。好ましい実施態様では、発現ベクターを含有する原核細胞の増殖を選択的に可能にするために、培地はまた発現ベクターの構成を基に選択した選択剤も含んでもよい。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖のためには、アンピシリンを培地に加える。
炭素、窒素、及び無機リン酸供給源の他に、任意の必要なサプリメントも適当な濃度で単独で又は他のサプリメントもしくは窒素錯体供給源などの培地との混合物として取り入れて含めてもよい。場合によっては、培養培地はグルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリスリトール及びジチオスレイトールからなる群から選択される一又は複数の還元剤を含んでもよい。
原核宿主細胞を好適な温度で培養する。大腸菌増殖には、例えば、好ましい温度は約２０℃から約３９℃、より好ましくは約２５℃から約３７℃にわたり、更により好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、主として宿主生物に依存して、約５から約９の範囲の任意のｐＨであってもよい。大腸菌には、ｐＨは好ましくは約６．８から約７．４であり、より好ましくは約７．０である。
発現ベクターに誘導プロモーターを用いる場合には、タンパク質発現はプロモーターの活性化に好適な条件下で誘導される。例えば、転写の制御にＰｈｏＡプロモーターを用いる場合、形質転換された宿主細胞は誘導のためにリン酸制限培地で培養されうる。用いられるベクターコンストラクトによっては、当該分野で周知のように、種々の他の誘導物質を用いてもよい。
ここに記載したペプチド／ポリペプチドは宿主細胞の周辺質に分泌されそこから回収される。タンパク質回収は典型的には、一般に浸透圧ショック、超音波処理又は溶解といった手段による微生物の破壊を伴う。細胞を破壊したら、細胞細片又は全細胞を遠心分離又は濾過によって取り除くことができる。タンパク質は、例えば、親和性樹脂クロマトグラフィーによって更に精製してもよい。あるいは、タンパク質が培養培地に移行され、そこから単離される場合もある。細胞を培養物から取り除き、培養物上清を濾過し、産生されたタンパク質の更なる精製のために濃縮することができる。発現されたポリペプチドは更に単離され、一般的に既知の方法、例えば免疫親和性又はイオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥでのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；セファデックスＧ-７５を使用するゲル濾過；マトリックスに固定した適切な抗原を使用するリガンドアフィニティ、疎水性アフィニティー樹脂及びウェスタンブロットアッセイを使用して更に単離、同定することができる。
原核宿主細胞の他に、真核宿主細胞系もまた当該分野で十分に確立されている。好適な宿主には哺乳動物細胞株、例えばＣＨＯ、及び昆虫細胞、例えば以下に記載のものが含まれる。
ペプチド／ポリペプチド精製
産生されたペプチド／ポリペプチドを精製して、更なるアッセイ及び使用のために実質的に均質な調製物を得ることができる。当該分野で周知の標準的なタンパク質精製法を用いることができる。以下の手順は好適な精製手順の例である：免疫親和性又はイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ又はＤＥＡＥなどのカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、及び例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過。
発明の方法
本発明は、ＨＧＦβ鎖の特定の領域内の突然変異により分子の生物学的活性の修飾が生じ、このような突然変異体分子がＨＧＦ／Ｍｅｔ経路の調節にアンタゴニスト的な作用を示すという発見に基づいた種々の方法を提供する。
(ペプチド／ポリペプチド等を含む)様々な物質又は分子を、本発明の方法に従って治療剤として用いることができる。これらの物質又は分子を薬学的に有用な組成物を調製するために既知の方法に従って製剤することができ、その生成物は薬学的に許容可能な担体ビヒクルと混合されて組み合わされる。所望の純度を有する活性成分を、任意成分の生理学的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、保存用の治療製剤が調製される(Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版、Osol, A.編(1980))。許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤は、使用される投与量及び濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及びその他有機酸などのバッファー；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量(約１０残基未満)のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含むその他炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトール又はソルビトール；塩類形成対イオン、例えばナトリウム；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ、又はＰＥＧを含む。
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなければならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に滅菌濾過膜を通した濾過によって即座に達成される。
本明細書中の治療用組成物は一般に滅菌アクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針による貫通可能なストッパーを持つ静脈内溶液バッグ又はバイアル中に配される。
投与経路は既知の方法、例えば静脈内注射又は注入、腹腔内、大脳内、筋肉内、眼球内、動脈内又は病巣内経路、局所投与、又は徐放系による。
本発明の薬学的組成物の用量及び所望の薬剤濃度は、想定する特定の使用によって変化しうる。適当な用量の測定又は投与の経路は、一般的な医師の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効な用量の決定のための信頼性のある手引きとなる。有効な用量の異種間スケーリングは、Mordenti, J. 及び Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics", Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi等編, Pergamon Press, New York 1989, pp.42-46に記載の原理に従って実施することができる。
本発明の物質又は分子のインビボ投与が用いられるとき、正常な用量は投与経路によって、１日当たり約１０ｎｇ／ｋｇ哺乳動物体重から約１００ｍｇ／ｋｇ哺乳動物体重又はそれより多く、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日と変わりうる。特定の用量及び運搬の方法に関する手引きは、文献に示される；例えば、米国特許第４６５７７６０号；第５２０６３４４号；又は第５２２５２１２号を参照。異なる製剤が異なる処置及び異なる疾患のために効果的であり、特定の器官又は組織を治療することを目的とする投与は他の器官又は組織への投与と異なる方法で送達する必要があることは予想される。
物質又は分子の投与を必要とする疾患又は障害の治療に好適な放出特性を有する製剤で物質又は分子の徐放投与が望ましい場合、物質又は分子のマイクロカプセル化が考えられる。除放のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン(ｒｈＧＨ)、インターフェロン-(ｒｈＩＦＮ-)、インターロイキン-２、及びＭＮｒｇｐ１２０を用いて成功裏に行われている。Johnson等, Nat. Med., 2: 795-799 (1996)；Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993)；Hora等, Bio/Technology, 8: 755-758 (1990)；Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems", Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell及びNewman編 (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462；国際公開第９７／０３６９２号；国際公開第９６／４００７２号；国際公開第９６／０７３９９号；及び米国特許第５６５４０１０号。
これらのタンパク質の徐放製剤は、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づきポリ-乳酸-コグリコール酸(ＰＬＧＡ)ポリマーを用いて開発された。ＰＬＧＡの分解生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座に排除されうる。更に、このポリマーの分解性は、その分子量及び組成に依存して数ヶ月から数年まで調節できる。Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer": M. Chasin及び R. Langer (編), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp1-41。
ＨＧＦ／Ｍｅｔシグナル伝達経路においてＨＧＦ機能に重要であるＨＧＦβ鎖内の領域の同定により、アンタゴニストが標的としうるＨＧＦβ鎖内の部位が示される。潜在的なアンタゴニストの例には、ＨＧＦβ鎖のＮ末端及び／又は二量体化領域に結合するオリゴヌクレオチド(それはアプタマーであってもよい)及び、特に、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、及びこのような抗体ないし断片のキメラ型ないしはヒト化型、並びにヒト抗体及び抗体断片を含むがこれに限定されない抗体が含まれる。アプタマーは、標的分子に結合できる核酸分子である。アプタマーの生成及び治療的使用は当分野で十分に確立されている。例として、米国特許第５４７５０９６号、及び加齢性黄斑変性症の治療のためのMacugen(登録商標)(Eyetech, New York)の治療的有効性を参照のこと。
本明細書に記載のように、本発明のＨＧＦ／Ｍｅｔアンタゴニスト物質／分子はペプチド又はポリペプチド(抗体を含む)であってもよい。このようなペプチド及びポリペプチドを得る方法は当分野に周知であり、適切な標的抗原に対する結合体についてのペプチド及びポリペプチドライブラリーのスクリーニングを含む。一実施態様では、適切な標的抗原はＨＧＦβ鎖(又は、Ｎ末端及び／又は二量体化領域を含んでなるその部分)を含んでなり、これは本明細書において、詳述される。一実施態様では、適切な標的抗原は、Ｍｅｔ、例えばＭｅｔの細胞外ドメインを含んでなる。ペプチド及びポリペプチドのライブラリーは当分野で公知であり、当分野の方法に従って調製することもできる。例として、Clark等、米国特許第６１２１４１６号、及び、Garrard等、同第５７５０３７３号、同第５７３３７４３号、同第５８３７２４２号、同第５９６９１０８号、同第６１７２１９７号、同第５５８０７１７号及び同第５６５８７２７号を参照のこと。例えば上掲のClark等、及びGarrard等に記述されているように、ファージコートタンパク質などの異種性タンパク質成分に融合したポリペプチド及びペプチドのライブラリーは当分野で周知である。第一の選択されたペプチド又はポリペプチド結合体の変異体は、対象とする特性(例えば、亢進した標的結合親和性、改善された薬物動態、低減された毒性、改善された治療指標など)を得るためにペプチド又はポリペプチドの変異体をスクリーニングすることによって、生成できる。例えば、対象とする特性は、Ｍｅｔに結合できるが、ＨＧＦ関連の生物活性、例えば細胞増殖、Ｍｅｔリン酸化、細胞遊走及び血管新生を活性化する能力が減弱している。突然変異誘発技術は当分野で公知であり、突然変異のための領域はＨＧＦβ鎖内、特に本明細書に記載のＨＧＦβ鎖Ｎ末端挿入及び／又はβ鎖-β鎖二量体化と関係している特定の位置内である。さらに、スキャニング突然変異誘発技術(例えばアラニンスキャニングに基づくもの)は、特にペプチド又はポリペプチド内の個々のアミノ酸残基の構造的及び／又は機能的な重要性を評価するために役立ちうる。
ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達及び／又は前記シグナル伝達と関係している生物活性を調節する本発明の候補物質／分子の能力の決定は、インビトロ又はインビボのアッセイにおいて、物質／分子の調節能を試験することにより行うことができる。これらのアッセイは、例えば、上掲のOkigaki等、上掲のMatsumoto等、Date等, FEBS Let. (1997), 420:1-6、上掲のLokker等、上掲のHartmann等、Kirchhofer等, J Biol. Chem. (2004), 279:39915-24、Stamos等 (2004) EMBO J. 23: 2325-35、Kirchhofer等, FEBS Lett. (2005) 579: 1945-50、及びNakatsu等 (Microvasc.Res. 66: 102, 2003)に記載のように、当分野で十分に確立されている。
ＨＧＦβ鎖抗体
本発明は、さらに、抗体の使用を含んでなる方法を提供する。例示的な抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。
１．ポリクローナル抗体
抗体はポリクローナル抗体を含みうる。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫剤と、所望されればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫剤は、ＨＧＦβ鎖(又はその一部)又はその融合タンパク質を含みうる。免疫剤を免疫化される哺乳動物において免疫原性であることが知られているタンパク質にコンジュゲートさせるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコレート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
２．モノクローナル抗体
あるいは、抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫剤により免疫化することで、免疫剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫剤は、典型的にはＨＧＦβ鎖(又はその一部)又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。ついで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は増殖を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプテリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性であるものである。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
ついでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＨＧＦβ鎖に対するモノクローナル抗体の存在について検定することができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード解析法によって測定することができる。
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる［上掲のGoding］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として増殖させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の一般的な免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製されうる。
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質をさもなければ生成しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［上掲の米国特許第４８１６５６７号；Morrison等］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られている。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製には、またインビトロ法が適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成することができる。
抗体はＨＧＦβ鎖(又は均等物)に適切な／所望の親和性をもって結合する抗体又は抗体断片についてファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによってまた産生させることができる。そのような技術は、例えば米国特許第５７５０３７３号；第５７８０２７９号；第５８２１０４７号；第６０４０１３６号；第５４２７９０８号；第５５８０７１７号及びその中の文献に開示されているように、当該分野でよく知られている。
３．ヒト及びヒト化抗体
本発明のＨＧＦβ鎖抗体は、更にヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖或いはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは殆ど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは殆ど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一つ又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター(Winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに用いることにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリー［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381(1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及びBoerner等の方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985)及びBoerner等, J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第５５４５８０７号；同第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；同第５６６１０１６号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10, 779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996)；Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
また、抗体は、上に記載のような既知の選択及び／又は突然変異誘発法を利用して親和的に成熟している。好ましい親和性成熟抗体は、５倍、より好ましくは１０倍、更により好ましくは２０又は３０倍も成熟抗体の調製の元である出発抗体(一般的には、マウス、ヒト化又はヒト)より高い親和性を有する。
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合、結合特異性の一方はＨＧＦβ鎖に対するものであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してであり得る。
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内の一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が１９９３年５月１３日公開の国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
国際公開第９６／２７０１１号に記載された他の方法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体の割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第一抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第二の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロ二量体の収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片(例えば、Ｆ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
大腸菌からＦａｂ'断片を直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞及び正常なヒトＴ細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
また、組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法が既知である。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させた。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成した。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の二つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、二つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等, J.Immunol. 147:60 (1991)。
例示的な二重特異性抗体は、ＨＧＦβ鎖上の二つの異なるエピトープ又はＨＧＦβ鎖上のエピトープ及び他のポリペプチド上のエピトープ(例えばｃ-ｍｅｔ又はＨＧＦα鎖)に結合しうる。
５．ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲内である。ヘテロコンジュゲート抗体は、二つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第４６７６９８０号］及びＨＩＶ感染の治療のために［国際公開第９１／００３６０号；国際公開第９２／２００３７３号；欧州特許第０３０８９号］提案されている。これら抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第４６７６９８０号に開示されたものが含まれる。
６．エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌の治療における抗体の効能を向上させることが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成されたホモ二量体抗体は、向上した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体-依存性細胞性細胞毒性(ＡＤＣＣ)を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つホモ二量体抗体は、Wolff等 Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993)に記載されているヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、二つのＦｃ領域を有するように加工し、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)参照。
７．免疫コンジュゲート
また、本発明は、化学治療薬、毒素(例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片)などの細胞毒性薬とコンジュゲートしている抗体、あるいは放射性同位体(つまり、放射性コンジュゲート)を含む免疫複合体（免疫コンジュゲート）に関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬は上に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性核種が利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞毒性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートＨＣＬ等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン２,６-ジイソシアネート等)、及びビス-活性フッ素化合物(１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドの抗体への結合のためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと。
他の実施形態では、腫瘍の予備標的化に使用するために、抗体は「レセプター」(ストレプトアビジン等)にコンジュゲートされてもよく、抗体-レセプターコンジュゲートが患者に投与され、ついで清澄化剤を用いて未結合コンジュゲートを循環から除去し、次に細胞毒性薬(例えば、放射性ヌクレオチド等)にコンジュゲートされた「リガンド」(アビジン等)を投与する。
８．免疫リポソーム
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985)；Hwang等, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980)；及び米国特許第４４８５０４５号及び第４５４４５４５号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第５０１３５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成されうる。リポソームは、所定の孔径のフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ'断片は、Martin等, J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームにコンジュゲートされ得る。化学治療薬(ドキソルビシン等)は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989)参照。
９．抗体の薬学的組成物
抗体は、様々な疾患の治療のために薬学的組成物の形態で投与することができる。
全抗体が阻害剤として使用される場合、内部移行抗体が好ましい。しかし、また、リポフェクション又はリポソームを使用して、それが所望される細胞中に本発明の抗体を送達することができる。抗体断片が使用される場合、最小の阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、ＨＧＦβ鎖に結合する能力及び／又はＨＧＦβ鎖とｃ-ｍｅｔ間の相互作用を妨害する能力、ＨＧＦβ鎖Ｎ末端の挿入を妨害する能力、及び／又はＨＧＦβ鎖-β鎖の相互作用を妨害する能力を保持するペプチド及びポリペプチドを設計することができる。そのようなペプチド及びポリペプチドは化学的に合成し、及び／又は組換えＤＮＡ技術により生産することができる。Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893 (1993)を参照のこと。ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な一つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものを含んでもよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、その機能を向上させる薬剤、例えば細胞毒性薬、サイトカイン、化学療法剤又は増殖阻害剤を含んでもよい。そのような分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセルに、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマイクロエマルション中に封入されていてもよい。このような技術は、上掲のRemington's Pharmaceutical Sciencesに開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOTTM(乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア)等の分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に亘って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。安定化のための合理的な方法を、関与する機構に応じて、案出することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ-Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
次は本発明の方法及び組成物の実施例である。上に与えた一般的な記載に照らして、様々な他の実施態様を実施することができることが理解される。
材料と方法
基本的にKirchhofer等, J Biol. Chem. (2004), 279:39915-24、Stamos等 (2004) EMBO J. 23: 2325-35に記載されているように、ＨＧＦ変異体を生成した。上掲のKirchhofer等及び上掲のStamos等に記載されているような試薬及び方法を使用して、Ｍｅｔ結合及びＭＤＡ-ＭＢ４３５細胞遊走アッセイを行った。基本的に上掲のKirchhofer等に記載されているように、Ａ５４９細胞を用いてＭｅｔリン酸化アッセイを行った。５０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦを用いてリン酸化を阻害するために用量依存的にＨＧＦ変異体を加えたことを除いては、同様にしてＭｅｔリン酸化の阻害を行った。基本的にKirchhofer等, FEBS Lett. (2005) 579: 1945-50に記載のように、ＢｘＰＣ３アッセイにおいて、細胞増殖の阻害を行った。基本的にNakatsu等 (Microvasc.Res. 66: 102, 2003)に記載されるように、インビトロ血管新生アッセイを行った。６日間の実験の間１日置きに１０μｇ／ｍｌの濃度のＨＧＦ変異体を培養液に加えた。実験終了後、１ビーズ当たりの出芽の数を定量化して、４つの独立した実験の平均的±ＳＤとして表した。
結果
競合ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、野生型ＨＧＦβ鎖(β鎖単独及び完全長ＨＧＦ)と比較したときの、示した突然変異を有するＨＧＦβ鎖変異体(β鎖単独として及び、完全長ＨＧＦとして)のＭｅｔＩｇＧ結合能についての特性を示した。任意の潜在的なジスルフィド結合二量体の形成を最小限にするために、野生型ＨＧＦβ及びＨＧＦβ鎖変異体をＣ６０４Ｓバックグラウンドにおいて作製したので、野生型ＨＧＦβは、実際にはＨＧＦβ Ｃ６０４Ｓとした。更に、選択した完全長２鎖ＨＧＦ変異体を細胞遊走アッセイにおいて、評価して、β鎖の突然変異の結果として生物学的機能に対する作用がある場合にはそれを決定した。結果を図１Ａ、Ｂ、Ｃに示す。ＨＧＦ変異体Ｇ４９８Ｉは、図２に示すように、用量に依存した形でＭｅｔのＨＧＦ依存性リン酸化を阻害した。また、ＨＧＦ変異体Ｒ４２４Ａ：Ｒ４９４Ｅ(単鎖ＨＧＦ)についての結果も示す。ＨＧＦ変異体Ｇ４９８Ｉ及びＧ４９８Ｐは、図３に示すように、Ｍｅｔリン酸化アッセイにおいて、野生型ＨＧＦと比較して有意にＭｅｔを活性化しなかった。また、ＨＧＦ変異体Ｒ４２４Ａ：Ｒ４９４Ｅについての結果も示す。ＭｅｔのＨＧＦ依存性リン酸化は、用量に依存した形で調節された。また、変異体ＨＧＦであるＧ４９８Ｉ及びＧ４９８ＰはＢｘＰＣ３細胞増殖を阻害したが、野生型ＨＧＦの活性の２．５％及び５６％であった。さらに、１０μｇ／ｍｌの濃度の選択した完全長ＨＧＦ変異体(Ｄ６７２Ｎ、Ｖ４９５Ｇ、Ｇ４９８Ｉ、Ｒ４２４Ａ：Ｒ４９４Ｅ)はインビトロアッセイにおいて、血管新生を阻害した(図４)ので、ＨＧＦの全体の生物学的機能へのＨＧＦβ鎖(及び選択したその突然変異)の重要性がさらに確認された。
一部の参考文献リスト
Angeloni, D., Danilkovitch-Miagkova, A., Miagkov, A., Leonard, E. J., and Lerman, M. I. (2004). The soluble sema domain of the RON receptor inhibits MSP-induced receptor activation. J. Biol. Chem., 279, 3726-3732.
Birchmeier, C., Birchmeier, W., Gherardi, E., and Vande Woude, G. F. (2003). Met, metastasis, motility and more. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 4, 915-925.
Boose, J. A., Kuismanen, E., Gerard, R., Sambrook, J., and Gething, M. J. (1989). The single-chain form of tissue-type plasminogen activator has catalytic activity: Studies with a mutant enzyme that lacks the cleavage site. Biochemistry 28, 638-643.
Bottaro, D. P., Rubin, J. S., Faletto, D. L., Chan, A. M., Kmiecik, T. E., Vande Woude, G. F., and Aaronson, S. A. (1991). Identification of the hepatocyte growth factor receptor as the c-met proto-oncogene product. Science 251, 802-804.
Broze Jr., G. J. (2001). Protein Z-dependent regulation of coagulation. Thromb. Haemost. 86, 8-13.
CCP4 (1994). The CCP4 suite: Programs for protein crystallography. Acta Crystallogr D50, 760-763.
Chirgadze et al., FEBS Letters (1998), 430:126-129.
Cohen, G. H. (1997). Align - a program to superimpose protein coordinates, accounting for insertions and deletions. J Appl. Crystallog. 30, 1160-1161.
Cooper, C. S., Blair, D. G., Oskarsson, M. K., Tainsky, M. A., Eader, L. A., and Vande Woude, G. F. (1984a). Characterization of human transforming genes from chemically transformed, teratocarcinoma, and pancreatic carcinoma cell lines. Cancer Res. 44, 1-10.
Cooper, C. S., Park, M., Blair, D. G., Tainsky, M. A., Huebner, K., Croce, C. M., and Vande Woude, G. F. (1984b). Molecular cloning of a new transforming gene from a chemically transformed human cell line. Nature 311, 29-33.
Danilkovitch, A., Miller, M., and Leonard, E. J. (1999). Interaction of macrophage-stimulating protein with its receptor. J. Biol. Chem. 274, 29937-29943.
Danilkovitch-Miagkova, A., and Zbar, B. (2002). Dysregulation of Met receptor tyrosine kinase activity in invasive tumors. J. Clin. Invest. 109, 863-867.
Date et al., FEBS Lett. (1997), 420:1-6.
Dennis, M. S., Eigenbrot, C., Skelton, N. J., Ultsch, M. H., Santell, L., Dwyer, M. A., O'Connell, M. P., and Lazarus, R. A. (2000). Peptide exosite inhibitors of factor VIIa as anticoagulants. Nature 404, 465-470.
Derksen, P. W., Keehnen, R. M. J., Evers, L. M., van Oers, M. H. J., Spaargaren, M., and Pals, S. T. (2002). Cell surface proteoglycan syndecan-1 mediates hepatocyte growth factor binding and promotes Met signalling in multiple myeloma. Blood 99, 1405-1410.
Di Cera, E., Guinto, E. R., Vindigni, A., Dang, Q. D., Ayala, Y. M., Wuyi, M., and Tulinsky, A. (1995). The Na+ binding site of thrombin. J. Biol. Chem. 270, 22089-22092.
Dickinson, C. D., Kelly, C. R., and Ruf, W. (1996). Identification of surface residues mediating tissue factor binding and catalytic function of the serine protease factor VIIa. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14379-14384.
Donate, L. E., Gherardi, E., Srinivasan, N., Sowdhamini, R., Aparicio, S., and Blundell, T. L. (1994). Molecular evolution and domain structure of plasminogen-related growth factors (HGF/SF and HGF1/MSP). Protein Sci. 3, 2378-2394.
Drain, J., Bishop, J. R., and Hajduk, S. L. (2001). Haptoglobin-related protein mediates trypanosome lytic factor binding to Trypanosomes. J. Biol. Chem. 276, 30254-30260.
Gherardi, E., Youles, M. E., Miguel, R. N., Blundell, T. L., Iamele, L., Gough, J., Bandyopadhyay, A., Hartmann, G., and Butler, P. J. (2003). Functional map and domain structure of MET, the product of the c-met protooncogene and receptor for hepatocyte growth factor/scatter factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 12039-12044.
Hartmann, G., Naldini, L., Weidner, K. M., Sachs, M., Vigna, E., Comoglio, P. M., and Birchmeier, W. (1992). A functional domain in the heavy chain of scatter factor/hepatocyte growth factor binds the c-Met receptor and induces cell dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11574-11578.
Hartmann, G., Prospero, T., Brinkmann, V., Ozcelik, C., Winter, G., Hepple, J., Batley, S., Bladt, F., Sachs, M., Birchmeier, C., et al. (1998). Engineered mutants of HGF/SF with reduced binding to heparan sulphate proteoglycans, decreased clearance and enhanced activity in vivo. Curr. Biol. 8, 125-134.
Hedstrom, L. (2002). Serine protease mechanism and specificity. Chem. Rev. 102, 4501-4523.
Huber, R., and Bode, W. (1978). Structural basis of the activation and action of trypsin. Acc Chem. Res. 11, 114-122.
Kunkel, T. A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci USA 82, 488-492.
Kurosky, A., Barnett, D. R., Lee, T. H., Touchstone, B., Hay, R. E., Arnott, M. S., Bowman, B. H., and Fitch, W. M. (1980). Covalent structure of human haptoglobin: a serine protease homolog. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 3388-3392.
Lijnen, H. R., Van Hoef, B., Nelles, L., and Collen, D. (1990). Plasminogen activation with single-chain urokinase-type plasminogen activator (scu-PA). Studies with active site mutagenized plasminogen (Ser740 → Ala) and plasmin-resistant scu-PA (Lys158 → Glu). J. Biol. Chem. 265, 5232-5236.
Lin, C.-Y., Anders, J., Johnson, M., Sang, Q. A., and Dickson, R. B. (1999). Molecular cloning of cDNA for matriptase, a matrix-degrading serine protease with trypsin-like activity. J. Biol. Chem. 274, 18231-18236.
Lokker, N. A., Mark, M. R., Luis, E. A., Bennett, G. L., Robbins, K. A., Baker, J. B., and Godowski, P. J. (1992). Structure-function analysis of hepatocyte growth factor: identification of variants that lack mitogenic activity yet retain high affinity receptor binding. EMBO J. 11, 2503-2510.
Lokker, N. A., Presta, L. G., and Godowski, P. J. (1994). Mutational analysis and molecular modeling of the N-terminal kringle-containing domain of hepatocyte growth factor identifies amino acid side chains important for interaction with the c-Met receptor. Protein Eng. 7, 895-903.
Ma, P. C., Maulik, G., Christensen, J., and Salgia, R. (2003). c-Met: structure, functions and potential for therapeutic inhibition. Cancer Metastasis Rev. 22, 309-325.
Malkowski, M. G., Martin, P. D., Guzik, J. C., and Edwards, B. F. P. (1997). The co-crystal structure of unliganded bovine α-thrombin and prethrombin-2: movement of the Tyr-Pro-Pro-Trp segment and active site residues upon ligand binding. Protein Sci. 6, 1438-1448.
Mark, M. R., Lokker, N. A., Zioncheck, T. F., Luis, E. A., and Godowski, P. J. (1992). Expression and characterization of hepatocyte growth factor receptor-IgG fusion proteins. Effects of mutations in the potential proteolytic cleavage site on processing and ligand binding. J. Biol. Chem. 267, 26166-26171.
Matsumoto, K., Takehara, T., Inoue, H., Hagiya, M., Shimizu, S., and Nakamura, T. (1991). Biochem. Biophys. Res. Commun. 181, 691-699.
Matsumoto, K., Kataoka, H., Date, K., and Nakamura, T. (1998). Cooperative interaction between α- and β-chains of hepatocyte growth factor on c-Met receptor confers ligand-induced receptor tyrosine phosphorylation and multiple biological responses. J. Biol. Chem. 273, 22913-22920.
Maulik, G., Shrikhande, A., Kijima, T., Ma, P. C., Morrison, P. T., and Salgia, R. (2002). Role of the hepatocyte growth factor receptor, c-Met, in oncogenesis and potential for therapeutic inhibition. Cytokine Growth Factor Rev. 13, 41-59.
Miller, M., and Leonard, E. J. (1998). Mode of receptor binding and activation by plasminogen-related growth factors. FEBS Lett. 429, 1-3.
Miyazawa, K., Shimomura, T., Kitamura, A., Kondo, J., Morimoto, Y., and Kitamura, N. (1993). Molecular cloning and sequence analysis of the cDNA for a human serine protease responsible for activation of hepatocyte growth factor. J. Biol. Chem. 268, 10024-10028.
Naka, D., Ishii, T., Yoshiyama, Y., Miyazawa, K., Hara, H., Hishida, T., and Kitamura, N. (1992). Activation of hepatocyte growth factor by proteolytic conversion of single chain form to a heterodimer. J. Biol. Chem. 267, 20114-20119.
Nakamura, T., Nishizawa, T., Hagiya, M., Seki, T., Shimonishi, M., Sugimura, A., Tashiro, K., and Shimizu, S. (1989). Molecular cloning and expression of human hepatocyte growth factor. Nature 342, 440-443.
Naldini, L., Tamagnone, L., Vigna, E., Sachs, M., Hartmann, G., Birchmeier, W., Daikuhara, Y., Tsubouchi, H., Blasi, F., and Comoglio, P. M. (1992). Extracellular proteolytic cleavage by urokinase is required for activation of hepatocyte growth factor/scatter factor. EMBO J. 11, 4825-4833.
Okigaki, M., Komada, M., Uehara, Y., Miyazawa, K., and Kitamura, N. (1992). Functional characterization of human hepatocyte growth factor mutants obtained by deletion of structural domains. Biochemistry 31, 9555-9561.
Parry, M. A., Fernandez-Catalan, C., Bergner, A., Huber, R., Hopfner, K. P., Schlott, B., Guhrs, K. H., and Bode, W. (1998). The ternary microplasmin-staphylokinase-microplasmin complex is a proteinase-cofactor-substrate complex in action. Nat. Struct. Biol. 5, 917-923.
Peek, M., Moran, P., Mendoza, N., Wickramasinghe, D., and Kirchhofer, D. (2002). Unusual proteolytic activation of pro-hepatocyte growth factor by plasma kallikrein and coagulation factor XIa. J. Biol. Chem. 277, 47804-47809.
Peisach, E., Wang, J., de los Santos, T., Reich, E., and Ringe, D. (1999). Crystal structure of the proenzyme domain of plasminogen. Biochemistry 38, 11180-11188.
Perona, J. J., and Craik, C. S. (1995). Structural basis of substrate specificity in the serine proteases. Protein Sci. 4, 337-360.
Rawlings, N. D., O'Brien, E., and Barrett, A. J. (2002). MEROPS: the protease database. Nucl. Acid Res. 30, 343-346.
Renatus, M., Engh, R. A., Stubbs, M. T., Huber, R., Fischer, S., Kohnert, U., and W., B. (1997). Lysine 156 promotes the anomalous proenzyme activity of tPA: X-ray crystal structure of single-chain human tPA. EMBO J. 16, 4797-4805.
Richardson, J. L., Kroger, B., Hoeffken, W., Sadler, J. E., Pereira, P., Huber, R., Bode, W., and Fuentes-Prior, P. (2000). Crystal structure of the human α-thrombin-haemadin complex: an exosite II-binding inhibitor. EMBO J. 19, 5650-5660.
Shimomura, T., Miyazawa, K., Komiyama, Y., Hiraoka, H., Naka, D., Morimoto, Y., and Kitamura, N. (1995). Activation of hepatocyte growth factor by two homologous proteases, blood-coagulation factor XIIa and hepatocyte growth factor activator. Eur J Biochem 229, 257-261.
Stubbs, M., and Bode, W. (1993). A player of many parts: The spotlight falls on thrombin's structure. Thromb. Res. 69, 1-58.
Takeuchi, T., Shuman, M. A., and Craik, C. S. (1999). Reverse biochemistry: use of macromolecular protease inhibitors to dissect complex biological processes and identify a membrane-type serine protease in epithelial cancer and normal tissue. Proc Natl Acad Sci USA 96, 11054-11061.
Trusolino et al., FASEB J. (1998), 12:1267-1280.
Trusolino, L., and Comoglio, P. M. (2002). Scatter-factor and semaphorin receptors: cell signalling for invasive growth. Nature Rev. Cancer 2, 289-300.
Tsiang, M., Jain, A. K., Dunn, K. E., Rojas, M. E., Leung, L. L. K., and Gibbs, C. S. (1995). Functional mapping of the surface residues of human thombin. J. Biol. Chem. 270, 16854-16863.
Vijayalakshmi, J., Padmanabhan, K. P., Mann, K. G., and Tulinsky, A. (1994). The isomorphous structures of prethrombin2, hirugen-, and PPACK-thrombin: changes accompanying activation and exosite binding to thrombin. Protein Sci. 3, 2254-2271.
Wang, D., Bode, W., and Huber. R (1985). Bovine chymotrypsinogen A: x-ray crystal structure analysis and refinement of a new crystal form at 1.8Å resolution. J. Mol. Biol. 185, 595-624.
Wang, D., Julian, F. M., Breathnach, R., Godowski, P. J., Takehara, T., Yoshikawa, W., Hagiya, M., and Leonard, E. J. (1997). Macrophage stimulating protein (MSP) binds to its receptor via the MSP β chain. J. Biol. Chem. 272, 16999-17004.
様々なＨＧＦ変異体の特徴付けを表す。ＨＧＦβ鎖Ｎ末端挿入変異体及びＨＧＦβ鎖二量体化変異体を例示する。「細胞遊走」データは、示された突然変異(一又は複数)を含んでいる完全長ＨＧＦの存在下におけるＭＤＡ-ＭＢ４３５細胞の遊走に関するものであり、野生型ＨＧＦの存在下における遊走の割合として表される。「ＨＧＦβ／ＭｅｔＩｇＧ結合」データは、ＭｅｔＩｇＧに対するＨＧＦβ鎖(示された突然変異(一又は複数)を含むもの)の結合に関するものであり、競合結合アッセイにおいて、ＩＣ５０(野生型)に対するＩＣ５０(変異体)の比率として表される。これらのデータにおいて、ＷＴはＣ６０４Ｓ変異体を指す。ＨＧＦβ変異体もこの突然変異を含んでいた。注：一般的な参照として、突然変異は、それが潜在的なβ鎖-β鎖の相互作用を破壊すると思われる場合には太字で示し、それがＮ末端の挿入を破壊すると思われる場合には斜体及び下線(太字又は非太字)で示す。これらの予想は、それぞれの突然変異に対して観察され又は予測される主な効果−すなわち、β鎖-β鎖相互作用又は活性部位／結合ポケットに挿入するβ鎖Ｎ末端の能力の何れかに対する効果に基づく。それにも関わらず、熟練した技術者は、特定の突然変異が一つ又は両方の効果を有するかどうか、図１Ａにそのように示されているか否かを容易に決定できるであろう。例えば、場合によって、突然変異はβ鎖-β鎖相互作用及びＮ末端の挿入の両方に作用し得、又は場合によって、β鎖-β鎖相互作用に作用すると予想される図１Ａに示す突然変異がＮ末端の挿入に作用することが経験的に示されうる。同様に、外見上は「障害性の」Ｍｅｔ結合値は斜体で示し、外見上は「正常な」結合値は太字の文字で示すが、「障害」及び「正常性」の程度は相対的なものである。 競合結合アッセイにおいて測定した、示した突然変異(一又は複数)を含む完全長ＨＧＦのＭｅｔへの結合。データは、ＩＣ５０(野生型)に対するＩＣ５０(変異体)の比率として表している。 示した突然変異を含む完全長ＨＧＦによる細胞遊走及び細胞増殖の阻害。変異体ＨＧＦ及び野生型ＨＧＦの存在下における細胞遊走及び細胞増殖それぞれの量(遊走については野生型ＨＧＦ １ｎＭ、増殖については野生型ＨＧＦ ０．２５ｎＭ)は、野生型ＨＧＦ単独の存在下において観察される活性の割合として表す。 示したＨＧＦ変異体によるＡ５４９細胞におけるＨＧＦ依存性Ｍｅｔリン酸化の阻害。Ｒ４２４Ａ：Ｒ４９４Ｅは一本鎖ＨＧＦを指す。Ｍｅｔリン酸化の量はＲＬＵ(相対光量)として示す。 示したＨＧＦ変異体によるＡ５４９肺カルシノーマ細胞におけるＨＧＦ依存性Ｍｅｔリン酸化の阻害。Ｍｅｔリン酸化の量はコントロールの割合として示す(このコントロールは、０．５ｎＭの野生型ＨＧＦの存在下において観察される量である)。 野生型及び変異体ＨＧＦの存在下におけるＡ５４９細胞のＭｅｔのリン酸化。Ｍｅｔリン酸化の量は、それぞれの野生型の各ＨＧＦ濃度の野生型ＨＧＦの存在下において観察される最大のリン酸化の割合として示す。 野生型及び変異体のＨＧＦ存在下におけるＡ５４９細胞のＭｅｔのリン酸化。Ｍｅｔリン酸化の量は、それぞれの野生型の各ＨＧＦ濃度の野生型ＨＧＦの存在下において観察される最大のリン酸化の割合として示す。 変異体ＨＧＦの存在下における血管新生活性。血管新生の量は、示されるＨＧＦ変異体の存在下における出芽／ビーズの数として示す。

Claims (19)

  1. ヒトＨＧＦβ鎖Ｎ末端領域のＶ４９５Ｇ、Ｖ４９５Ａ、Ｇ４９８Ｉ、Ｇ４９８Ｐ、Ｇ４９８Ｖ、Ｒ５０２欠失＋Ｔ５０３欠失及びＤ６７２Ｎからなる群から選択される一又は複数の位置に突然変異及び／又はヒトＨＧＦβ鎖二量体化領域のＮ４９７Ｒ、Ｎ４９７Ｋ、Ｇ４９８Ａ、Ｇ４９８Ｓ、Ｐ５００Ｗ、Ｐ５００Ｈ、Ｐ５００Ｅ、Ｔ５０１とＲ５０２との間の挿入又はＲ５０２欠失からなる群から選択される一又は複数の位置に突然変異を含むヒトＨＧＦ変異体を含んでなるＨＧＦ／Ｃ-Ｍｅｔアンタゴニスト分子。
  2. ヒトＨＧＦ変異体が野生型ヒトＨＧＦと比較して減弱した細胞増殖、細胞遊走、Ｍｅｔリン酸化又は血管新生からなる群から選択される一又は複数の生物学的機能を有するものである、請求項１に記載のアンタゴニスト分子。
  3. 結果として生じるヒトＨＧＦ変異体がＶ４９５Ｇ、Ｖ４９５Ａ、Ｇ４９８Ｉ、Ｇ４９８Ｐ、Ｇ４９８Ｖ、Ｒ５０２欠失＋Ｔ５０３欠失及びＤ６７２Ｎからなる群から選択される一又は複数の位置に突然変異を含み、野生型ヒトＨＧＦと比較して減弱した結合親和性でＣ-Ｍｅｔに結合するものである、請求項１又は２に記載のアンタゴニスト分子。
  4. 結果として生じるヒトＨＧＦ変異体がＮ４９７Ｒ、Ｎ４９７Ｋ、Ｇ４９８Ａ、Ｇ４９８Ｓ、Ｐ５００Ｗ、Ｐ５００Ｈ、Ｐ５００Ｅ、Ｔ５０１とＲ５０２との間の挿入又はＲ５０２欠失からなる群から選択される一又は複数の位置に突然変異を含み、野生型ヒトＨＧＦと同等な結合親和性でＣ-Ｍｅｔに結合するものである、請求項１ないし３の何れか一に記載のアンタゴニスト分子。
  5. 前記分子が位置５３４、５７８、６１９、６７３、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９９及び／又は７０２にヒトＨＧＦの野生型のアミノ酸を含有する、請求項１ないし４の何れか一に記載のアンタゴニスト分子。
  6. 前記分子がＶ４９５Ａ、Ｖ４９５Ｇ、Ｇ４９８Ｉ、Ｇ４９８Ｐ、Ｇ４９８Ｖ及びＤ６７２Ｎからなる群から選択される一又は複数の位置に突然変異を含み、野生型ヒトＨＧＦと比較して減弱したＣ-Ｍｅｔリン酸化能を有している、請求項１ないし５の何れか一に記載のアンタゴニスト分子。
  7. 前記分子がＶ４９５Ａ、Ｖ４９５Ｇ、Ｎ４９７Ｒ、Ｎ４９７Ｋ、Ｇ４９８Ｉ、Ｇ４９８Ｐ、Ｇ４９８Ｖ及びＤ６７２Ｎからなる群から選択される一又は複数の位置に突然変異を含み、野生型ヒトＨＧＦと比較して減弱した細胞遊走促進能を有している、請求項１ないし６の何れか一に記載のアンタゴニスト分子。
  8. 前記分子がＶ４９５Ｇ、Ｇ４９８Ｉ及びＤ６７２Ｎからなる群から選択される一又は複数の位置に突然変異を含み、野生型ヒトＨＧＦと比較して減弱した細胞増殖促進能を有している、請求項１ないし７の何れか一に記載のアンタゴニスト分子。
  9. 前記分子がＶ４９５Ｇ、Ｇ４９８Ｉ及びＤ６７２Ｎからなる群から選択される一又は複数の位置に突然変異を含み、野生型ヒトＨＧＦと比較して減弱した血管新生能を有している、請求項１ないし８の何れか一に記載のアンタゴニスト分子。
  10. 被検体のｃ-ｍｅｔ活性化を調節するための薬剤であって、請求項１ないし９の何れか一に記載のＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔアンタゴニスト分子を含有してなり、前記分子がヒトＨＧＦのＶ４９５Ａ、Ｖ４９５Ｇ、Ｇ４９８Ｉ、Ｇ４９８Ｐ、Ｇ４９８Ｖ及びＤ６７２Ｎからなる群から選択される一又は複数の位置に突然変異を含み、これによってｃ-ｍｅｔ活性化が調節される薬剤。
  11. 被検体における細胞の増殖を調節するための薬剤であって、請求項１ないし９の何れか一に記載のＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔアンタゴニスト分子を含有してなり、前記分子がヒトＨＧＦのＶ４９５Ｇ、Ｇ４９８Ｉ及びＤ６７２Ｎからなる群から選択される一又は複数の位置に突然変異を含み、これによって被検体における細胞の増殖が調節される薬剤。
  12. 被検体における細胞の遊走を調節するための薬剤であって、請求項１ないし９の何れか一に記載のＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔアンタゴニスト分子を含有してなり、前記分子がヒトＨＧＦのＶ４９５Ａ、Ｖ４９５Ｇ、Ｇ４９７Ｒ、Ｇ４９７Ｋ、Ｇ４９８Ｉ、Ｇ４９８Ｐ、Ｇ４９８Ｖ及びＤ６７２Ｎからなる群から選択される一又は複数の位置に突然変異を含み、これによって被検体における細胞の遊走が調節される薬剤。
  13. 被検体における細胞の血管新生活性を調節するための薬剤であって、請求項１ないし９の何れか一に記載のＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔアンタゴニスト分子を含有してなり、前記分子がヒトＨＧＦのＶ４９５Ｇ、Ｇ４９８Ｉ及びＤ６７２Ｎからなる群から選択される一又は複数の位置に突然変異を含み、これによって被検体における細胞の血管新生活性が調節される薬剤。
  14. 被検体のｃ-ｍｅｔ活性化に関連する病態を治療するための医薬であって、請求項１ないし９の何れか一に記載のＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔアンタゴニスト分子を含有してなり、これによって病態が治療される医薬。
  15. 前記病態が癌である、請求項１４に記載の医薬。
  16. 請求項１ないし９の何れか一に記載のＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔアンタゴニスト分子をコードする核酸。
  17. 請求項１６に記載の核酸を含んでなる宿主細胞。
  18. 請求項１ないし９の何れか一に記載の一又は複数のＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔアンタゴニスト分子を含む容器を具備する製造品。
  19. 請求項１ないし９の何れか一に記載のＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔアンタゴニスト分子の作製方法であって、該アンタゴニスト分子をコードする核酸を宿主細胞内で発現させ、細胞からアンタゴニスト分子を回収することを含む方法。
JP2008506827A 2005-04-15 2006-04-17 ＨＧＦβ鎖変異体 Expired - Fee Related JP5222720B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67161005P 2005-04-15 2005-04-15
US60/671,610 2005-04-15
PCT/US2006/014662 WO2006113767A2 (en) 2005-04-15 2006-04-17 Hgf beta chain variants

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2008536500A JP2008536500A (ja) 2008-09-11
JP5222720B2 true JP5222720B2 (ja) 2013-06-26

Family

ID=37011985

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008506827A Expired - Fee Related JP5222720B2 (ja) 2005-04-15 2006-04-17 ＨＧＦβ鎖変異体

Country Status (17)

Country Link
US (2) US7737115B2 (ja)
EP (1) EP1869070B1 (ja)
JP (1) JP5222720B2 (ja)
KR (1) KR101259655B1 (ja)
CN (1) CN101193910A (ja)
AU (1) AU2006236360B2 (ja)
BR (1) BRPI0611464A2 (ja)
CA (1) CA2605037C (ja)
ES (1) ES2446923T3 (ja)
HK (1) HK1111706A1 (ja)
IL (1) IL186157A0 (ja)
MX (1) MX2007012687A (ja)
NZ (1) NZ561704A (ja)
RU (1) RU2403261C2 (ja)
SG (1) SG161281A1 (ja)
WO (1) WO2006113767A2 (ja)
ZA (1) ZA200710599B (ja)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1870459B1 (en) 2005-03-31 2016-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
DK2009101T3 (en) 2006-03-31 2018-01-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody modification method for purification of a bispecific antibody
DK2006381T3 (en) 2006-03-31 2016-02-22 Chugai Pharmaceutical Co Ltd PROCEDURE FOR REGULATING ANTIBODIES BLOOD PHARMACOKINETICS
SG193868A1 (en) 2007-09-26 2013-10-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modified antibody constant region
HUE029635T2 (en) 2007-09-26 2017-03-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd A method for modifying an isoelectric point of an antibody by amino acid substitution in CDR
JP5717624B2 (ja) 2009-03-19 2015-05-13 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
TWI682995B (zh) 2009-03-19 2020-01-21 日商中外製藥股份有限公司 抗體恆定區域改變體
WO2011037158A1 (ja) 2009-09-24 2011-03-31 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
MX2012002013A (es) * 2009-10-19 2012-03-16 Genentech Inc Moduladores de activador del factor de crecimiento de hepatocitos.
US20110206704A1 (en) * 2009-10-19 2011-08-25 Genentech, Inc. Methods and compositions for modulating hepatocyte growth factor activator
BR112012017124C1 (pt) * 2009-12-25 2021-08-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Método para produzir e para purificar um multímero polipeptídico
WO2011108714A1 (ja) 2010-03-04 2011-09-09 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
RU2620071C2 (ru) 2010-11-17 2017-05-22 Чугаи Сеияку Кабушики Каиша Мультиспецифическая связывающая антиген молекула, которая обладает альтернативной функцией к функции фактора свертывания крови viii
TW202323302A (zh) 2010-11-30 2023-06-16 日商中外製藥股份有限公司 細胞傷害誘導治療劑
CA2925256C (en) 2013-09-27 2023-08-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide heteromultimer
MA39776A (fr) 2014-03-24 2017-02-01 Hoffmann La Roche Traitement du cancer avec des antagonistes de c-met et corrélation de ces derniers avec l'expression de hgf
EP3279216A4 (en) 2015-04-01 2019-06-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha PROCESS FOR PREPARING POLYPEPTIDE HETERO OLIGOMER
EP3398965A4 (en) 2015-12-28 2019-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha METHOD FOR PROMOTING THE EFFICACY OF PURIFYING A POLYPEPTIDE CONTAINING AN FC REGION

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4342566A (en) 1980-02-22 1982-08-03 Scripps Clinic & Research Foundation Solid phase anti-C3 assay for detection of immune complexes
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5362716A (en) 1989-12-27 1994-11-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods for stimulating hematopoietic progenitors using hepatocyte growth factor and lymphokines
US5648273A (en) 1989-12-27 1997-07-15 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Hepatic growth factor receptor is the MET proto-oncogene
US5871959A (en) 1989-12-27 1999-02-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of producing hepatocycte growth factor/scatter factor and related cell lines
JPH03255096A (ja) 1990-03-01 1991-11-13 Toyobo Co Ltd 組換ラット肝実質細胞増殖因子
EP0571387B1 (en) 1990-09-14 2003-12-17 THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary United States Department of Commerce A non-mitogenic competitive hgf antagonist
ES2104914T3 (es) 1991-05-10 1997-10-16 Pharmacia & Upjohn Spa Formas truncadas del factor de crecimiento de hepatocitos (hgf).
US5227158A (en) 1991-06-10 1993-07-13 Genentech, Inc. Method of stimulating hepatocyte proliferation by administration of hepatocyte growth factor and gamma-interferon
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5328837A (en) * 1992-05-18 1994-07-12 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor protease domain variants
CA2117893A1 (en) 1992-05-18 1993-11-25 Paul J. Godowski Variant dimers for receptor activation
ES2181689T3 (es) 1992-05-18 2003-03-01 Genentech Inc Variantes del factor de crecimiento de hepatocitos.
US5316921A (en) 1992-05-18 1994-05-31 Genentech, Inc. Single-chain hepatocyte growth factor variants
AU675968B2 (en) 1992-09-18 1997-02-27 United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services A method of preventing tumor metastasis
US6193969B1 (en) 1993-06-03 2001-02-27 Protherics Inc. Antibody fragments in therapy
HU219813B (hu) 1993-06-30 2001-08-28 Pharmacia S.P.A. Mitogenezis és motogenezis peptid inhibitorok
US6214344B1 (en) 1995-06-02 2001-04-10 Genetech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor antagonists and uses thereof
US5686292A (en) 1995-06-02 1997-11-11 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor antagonist antibodies and uses thereof
EP0941111A4 (en) 1996-11-05 2000-09-27 Smithkline Beecham Corp HEPATOCYTE GROWTH FACTOR ANTAGONISTS
WO2004087896A2 (en) 2003-03-31 2004-10-14 Pfizer Products Inc. Hepatocyte differentiation of stem cells
KR20110117728A (ko) 2003-06-06 2011-10-27 제넨테크, 인크. Ｈｇｆ 베타 쇄와 ｃ-ｍｅｔ 사이의 상호작용의 변조
TWI476206B (zh) 2003-07-18 2015-03-11 Amgen Inc 對肝細胞生長因子具專一性之結合劑

Also Published As

Publication number Publication date
EP1869070B1 (en) 2013-11-27
EP1869070A2 (en) 2007-12-26
HK1111706A1 (en) 2008-08-15
RU2007142191A (ru) 2009-05-20
CN101193910A (zh) 2008-06-04
AU2006236360A1 (en) 2006-10-26
AU2006236360B2 (en) 2012-02-02
NZ561704A (en) 2009-10-30
KR101259655B1 (ko) 2013-04-30
MX2007012687A (es) 2008-03-14
US20100210826A1 (en) 2010-08-19
IL186157A0 (en) 2008-01-20
BRPI0611464A2 (pt) 2010-09-08
CA2605037A1 (en) 2006-10-26
WO2006113767A3 (en) 2007-01-11
SG161281A1 (en) 2010-05-27
ES2446923T3 (es) 2014-03-10
KR20080011191A (ko) 2008-01-31
WO2006113767A2 (en) 2006-10-26
US7737115B2 (en) 2010-06-15
US20060293235A1 (en) 2006-12-28
CA2605037C (en) 2015-02-24
RU2403261C2 (ru) 2010-11-10
ZA200710599B (en) 2009-08-26
US8110377B2 (en) 2012-02-07
JP2008536500A (ja) 2008-09-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5222720B2 (ja) ＨＧＦβ鎖変異体
US20190054138A1 (en) Methods and compositions for modulating hgf/met
US7407660B2 (en) Methods and compositions for selective modulation of vascularization
CN100538364C (zh) 调节HGFβ链和C-MET的相互作用
AU2011236037A1 (en) Modulating the interaction between HGF beta chain and C-MET

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20090408

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20110830

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20111130

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20120807

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20121106

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20130212

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20130311

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160315

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees