ES2446923T3

ES2446923T3 - Variantes de cadena beta de HGF

Info

Publication number: ES2446923T3
Application number: ES06758404.5T
Authority: ES
Inventors: Daniel K. Kirchhofer; Robert A. Lazarus; Christian Wiesmann
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 2005-04-15
Filing date: 2006-04-17
Publication date: 2014-03-10
Anticipated expiration: 2026-04-17
Also published as: JP2008536500A; JP5222720B2; CN101193910A; CA2605037A1; IL186157A0; WO2006113767A3; US8110377B2; HK1111706A1; ZA200710599B; US20100210826A1; CA2605037C; EP1869070B1; KR101259655B1; AU2006236360A1; SG161281A1; NZ561704A; EP1869070A2; BRPI0611464A2; AU2006236360B2; US20060293235A1

Abstract

Molécula antagonista de HGF/C-Met que comprende un mutante de HGF que comprende una mutación en lacadena b de HGF en la posición V495, G498, R502 más T503, o D672, en la que la mutación en la cadena b deHGF impide la inserción del extremo N terminal de la cadena b de HGF en un bolsillo de unión a HGF, y en la que elmutante de HGF resultante presenta una función biológica reducida en comparación con el HGF de tipo natural.

Description

Variantes de cadena beta de HGF

5 CAMPO TECNlCO [0001] La presente invencion se refiere generalmente a los campos de la biologia molecular y la regulacion del factor de crecimiento. Mas especificamente, la presente invencion se refiere a moduladores de la ruta de senalizacion de HFG/c-met y a usos de dichos moduladores. ANTECEDENTES [0002] El factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), tambien conocido como factor dispersor (SF), es el ligando para Met (Bottaro et al., 1991), una tirosina quinasa receptora codificada por el protooncogen c-met (Cooper et al.,

15 1984a &b). La union de HGF a Met induce la fosforilacion del dominio quinasa intracelular que da como resultado la activacion de una compleja serie de rutas intracelulares que conducen al crecimiento, diferenciacion y migracion celular en diversos tipos de celulas; varios estudios publicados recientemente proporcionan una exhaustiva vision global (Birchmeier et al., 2003; Trusolino y Comoglio, 2002; Maulik et al., 2002). Ademas de su importancia fundamental en el desarrollo embrionario y regeneracion tisular, la ruta de senalizacion de HGF/Met tambien estaba implicada en el crecimiento tumoral invasivo y metastasis y, por tanto, representa una diana terapeutica interesante (Birchmeier et al., 2003; Trusolino y Comoglio, 2002; Danilkovitch-Miagkova y Zbar, 2002; Ma et al., 2003). [0003] HGF pertenece a la familia de factores de crecimiento relacionados con plasminogeno y comprende una cadena α de 69 kDa que contiene el dominio del dedo N-terminal (N) y cuatro dominios de Kringle (K1-K4), y una

25 cadena β de 34 kDa que tiene una gran similitud con dominios de proteasas de serina proteasas similares a quimotripsina del Clan PA(S)/FamiliaS1 (Nakamura et al., 1989; Donate et al., 1994; Rawlings et al., 2002). Al igual que el plasminogeno y otros zimogenos de serina proteasa, el HGF se secreta en forma precursora de cadena sencilla (scHGF). scHGF se une a proteoglicanos de heparan sulfato, tales como sindecan-1 (Derksen et al., 2002) en superficies celulares o en la matriz extracelular. Los proteoglicanos de heparan sulfato se unen al dominio N (Hartmann et al., 1998), que tambien contribuye a la union de Met de alta afinidad junto con aminoacidos situados en K1 (Lokker et al., 1994). Aunque scHGF es capaz de unirse a Met con alta afinidad, no puede activar al receptor (Lokker et al., 1992; Hartmann et al., 1992). La adquisicion de la actividad de senalizacion de HGF depende de la escision proteolitica (activacion) de scHGF en Arg494-Val495 que da como resultado la formacion de HGF maduro, un heterodimero α/β unido mediante puentes disulfuro (Lokker et al., 1992; Hartmann et al., 1992; Naldini et al.,

35 1992). El dominio de tipo proteasa de HGF (cadena � de HGF) esta desprovisto de actividad catalitica ya que carece de la triada catalitica requerida Asp [c102]-His [c57]-Ser [c195] (numeracion estandar de quimiotripsinogeno en parentesis) hallada en todas las serina proteasas (Perona y Craik, 1995; Hedstrom, 2002), que tiene una Gln534 [c57] y Tyr673 [c195]. [0004] Debido a su importancia en la regulacion de la actividad de HGF, este proceso debe estar controlado estrechamente por enzimas convertidoras de HGF y sus inhibidores fisiologicos correspondientes. La activacion de scHGF se mide in vitro por serina proteasas similares a quimotripsina, incluyendo el activador del factor de crecimiento de hepatocitos (HGFA) (Miyazawa et al., 1993), matriptasa/MT-SP1 (Takeuchi et al. 1999; Lin et al., 1999), el activador de plasminogeno de tipo uroquinasa (Naldini et al., 1992), factor Xlla (Shimomura et al., 1995),

45 factor Xla (Peek et al., 2002) y kalikreina plasmatica (Peek et al., 2002). Similares a scHGF, estas proteasas se producen en forma de precursores inactivos; sus actividades enzimaticas tambien estan fuertemente reguladas por otras proteasas de activacion e inhibidores tanto de tipo Kunitz como de tipo serpina. [0005] Se han descrito las serina proteasas y su proceso de activacion (Donate et al., 1994). En las serina proteasas, la escision de activacion del zimogeno produce una reordenacion conformacional del denominado "dominio de activacion" dando origen a un punto activo formado adecuadamente y la region de interaccion sustrato/inhibidor. El dominio de activacion constituye tres bucles expuestos a la superficie llamados bucles [c140], [c180] y [c220] y la insercion del extremo N terminal recien formado en un bolsillo hidrofobico (Huber y Bode, 1978). En la proteina homologa estimuladora de macrofagos del par ligando/receptor (MSP)/Ron, la cadena β de MSP

55 similar a serina proteasa proporciona la energia principal para la union al receptor (Wang et al., 1997; Miller y Leonard, 1998). Esto se invierte a partir del sistema HGF/Met, donde el punto de union al receptor de alta afinidad para Met esta en la cadena α de HGF (Lokker, et al., 1994; Okigaki et al., 1992). [0006] La importancia del eje de senalizacion de HGF/Met en la funcion celular normal y en la etiologia de trastornos clinicos sugiere la necesidad de desarrollar medios terapeuticos altamente efectivos basados en la modulacion de este eje. La complejidad de esta ruta, sin embargo, particularmente a la luz del mecanismo poco entendido de las interacciones de HGF-HGF y HGF/Met, ha progresado lentamente en este frente y ha destacado la necesidad de desarrollar estrategias que se basen en un mejor entendimiento del mecanismo de accion de las interacciones de HGF-HGF y HGF/Met. La invencion descrita aqui a continuacion satisface esta necesidad y proporciona otras

65 ventajas.

DESCRlPClON DE LA lNVENClON

[0007] El factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un factor de crecimiento relacionado con plasminogeno, se une a su Met de tirosina quinasa receptora (tambien referida en este documento como C-Met, c-Met o c-met), que esta implicada en el desarrollo, regeneracion tisular y crecimiento tumoral invasivo. La propia cadena de HGF de tipo serina proteasa se une a Met. A parte de unirse a Met, no esta claro que regiones y residuos especificos en la cadena de HGF son necesarios para realizar la senalizacion adecuada a traves de la ruta de HGF/Met. Los presentes inventores predijeron que ciertas regiones/posiciones en la cadena contribuyen de manera importante a una actividad funcional correcta de HGF, donde estas contribuciones pueden implicar o no la union de la cadena de HGF a su receptor afin. Los resultados descritos en el presente documento aportan evidencias de que mutaciones en la region N terminal y/o la region de dimerizacion de la cadena de HGF pueden alterar la funcion biologica de HGF/Met, con o sin impedir sustancialmente la union de HGF (en particular la cadena de HGF) a c-Met- En general, pero no necesariamente, estas mutaciones no implican posiciones pensadas para comprender el "dominio de activacion" o "la region del sitio activo" del HGF de tipo natural.

[0008] Los analisis de mutacion descritos en este documento proporcionan una base para el diseno de una multitud de mutantes de HGF capaces de inhibir las interacciones de HGF/HGF de tipo natural y HGF/c-met en un espectro de potencias. Los ejemplos de dichos mutantes se describen en este documento. Estos mutantes son capaces de competir con HGF de tipo natural por la union a c-met, aunque muestran una capacidad reducida para realizar las funciones biologicas asociadas a c-met. Esto es particularmente ventajoso cuando la inhibicion completa o sustancial del eje HGF/c-met es indeseable; esto es particularmente importante puesto que HGF y c-met se expresan de forma ubicua en celulas y tejidos normales. Estos mutantes tambien pueden usarse como agentes terapeuticos ventajosos para tratar afecciones patologicas en las que la actividad biologica reducida, pero no su completa ausencia, de HGF/c-met es deseable. Los metodos y composiciones de la invencion se basan, como minimo en parte, en estos hallazgos que se describen con mas detalles a continuacion.

[0009] En un aspecto, la presente invencion proporciona una molecula antagonista de HGF/C-Met que comprende un mutante de HGF que comprende una mutacion en la region N terminal de la cadena de HGF tal como se define en las reivindicaciones.

[0010] Una mutacion en la region N terminal de la cadena de HGF puede ser cualquiera que impida la insercion del extremo N terminal de la cadena de HGF en un bolsillo de union de HGF. En una realizacion, el mutante de la cadena de HGF resultante se une a C-Met con una afinidad de union reducida en comparacion con la cadena de HGF de tipo natural. En una realizacion, el mutante de la cadena de HGF resultante se une a C-Met con una afinidad sustancialmente equivalente a la cadena de HGF de tipo natural. En una realizacion, el HGF de longitud completa resultante que contiene una cadena � de HGF mutada, se une a C-Met con una afinidad de union reducida en comparacion con el HGF de longitud completa de tipo natural. En una realizacion, el HGF de longitud completa resultante que contiene una cadena de HGF mutada se une a C-Met con una afinidad sustancialmente equivalente al HGF de longitud completa de tipo natural. En una realizacion, una mutacion se encuentra en o adyacente a la posicion P1' (es decir, 495 [c16]), en la que la mutacion da lugar a un mutante de HGF escindible, y en la que el extremo N terminal de la cadena de HGF no se inserta en el sitio activo/bolsillo de union. Ejemplos para la incapacidad de insertarse en el sitio activo/bolsillo de union incluyen, pero sin limitacion, configuraciones en las que el mutante es defectuoso en alguno o ambos de (i) interacciones hidrofobicas, y (ii) formacion de puentes de sales que implican el extremo N-terminal a Asp672 [c] 194, por ejemplo, donde un extremo N terminal contiene una mutacion, por ejemplo, un residuo de aminoacido sustituido o insertado cargado positivamente. En una realizacion, la senalizacion a traves de este mutante esta impedida. En una realizacion, una mutacion se encuentra en o adyacente a una o mas de las posiciones P1', P2', P3' y P4'.

[0011] Tambien se describe en el presente documento una mutacion en el dominio de dimerizacion de la cadena de HGF que puede ser cualquiera que se espera que impida el contacto entre dos cadenas de HGF, de manera que se impida la dimerizacion de las dos cadenas (y de este modo, dos moleculas de HGF). Dichas mutaciones serian evidentes a partir de la estructura de aminoacidos de complejos de HGF, por ejemplo, tal como se describe en Kirchhofer et al., J Biol Chem. (2004), 279(38):39915-24. Las posiciones de aminoacidos relevantes incluyen, pero sin limitacion, las descritas en el presente documento. En un ejemplo, el mutante de HGF resultante ha reducido la capacidad de dimerizarse con otra cadena de HGF. En un ejemplo, una mutacion en la region de dimerizacion de la cadena �de HGF no impide sustancialmente la union del mutante de HGF resultante a C-Met.

[0012] El dominio de dimerizacion se refiere a una region de una cadena de HGF que interacciona con otra cadena de HGF para formar un dimero (por ejemplo, en un complejo de activacion de HGF/Met). Tras la escision de proHGF, la cadena de HGF experimenta un cambio conformaciones. El residuo 495 N-terminal de la cadena de HGF forma un puente de sal con el residuo Asp 672. En algunos ejemplos, la region de dimerizacion de una cadena de HGF comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, por lo menos un residuo de aminoacido (hasta todos los residuos de aminoacidos) correspondientes a los residuos de la cadena de HGF de aproximadamente 495 a 502, incluyendo los aminoacidos [bucle c140] Y619, T620, G621, incluyendo los aminoacidos del bucle [c180] 662 a 665, o mezclas de los mismos. En un ejemplo, el dominio de dimerizacion

incluye posiciones localizadas proximas/adyacentes a una o mas de las posiciones indicadas anteriormente y, de este modo, se predice que influyen a dicha una o mas posiciones. Por ejemplo, en este ejemplo, el dominio de dimerizacion puede incluir ademas las posiciones 622 y 626.

[0013] En un aspecto, una molecula antagonista de HGF/Met de la invencion comprende una mutacion en la region N terminal de la cadena � de HGF, en la que la mutacion esta en la posicion V495, G498, R502 mas T503, y/o D672, tal como se define en las reivindicaciones. Una mutacion puede estar en cualquier forma que altere la estructura primaria, secundaria y/o terciaria de la region N terminal de la cadena de HGF. Por ejemplo, en una realizacion, una mutacion en la region N terminal de la cadena de HGF es una sustitucion, insercion y/o delecion, tal como V495G, V495A, G498l, G498P, G498V, R502del mas T503del, o D672N. En otra realizacion, una mutacion en la region N terminal de la cadena de HGF es una delecion de V495. Una mutacion que altera la estructura primaria, secundaria y/o terciaria de la region N terminal de la cadena de HGF tambien puede ser una posicion de aminoacido que no este en la propia region N terminal de la cadena de HGF. Por ejemplo, una mutacion de D672 que elimina la formacion de puentes de sales (por ejemplo, D672N) con la region N terminal de la cadena de HGF, tambien se esperaria que altere la estructura primaria, secundaria y/o terciaria de la region N terminal de la cadena �de HGF. De este modo, las mutaciones de la region N terminal de la cadena de HGF y la region de dimerizacion de la cadena de HGF necesariamente no se excluyen mutuamente. Por ejemplo, tal como se describe en el presente documento, y se ejemplifica en la figura 1, se puede esperar que una mutacion en ciertas posiciones afecte a los dominios N terminales y de dimerizacion de la cadena de HGF.

[0014] Una molecula antagonista de HGF/Met puede comprender una mutacion en el dominio de dimerizacion de la cadena β de HGF, en la que la mutacion es en la posicion N497, G498, P500, en o adyacente a T501 y R502, o R502. Una mutacion puede estar en cualquier forma que altere la estructura primaria, secundaria y/o terciaria de la region de dimerizacion de la cadena de HGF. Los ejemplos de mutaciones que alterarian la estructura de la region de dimerizacion de la cadena de HGF incluyen mutaciones que introducen un residuo que esta cargado o tiene una cadena lateral grande (por ejemplo, voluminosa) en la secuencia de tipo natural, mediante lo cual un residuo cargado puede dar lugar a interacciones de repulsion y una cadena lateral grande puede dar lugar a interacciones estericas adversas. Ademas, tambien se pueden introducir mutaciones de cisteina (por ejemplo, L622C, l664C, P500C, y N497C) que estan disponibles para la modificacion mediante reactivos alquilantes de tiol, tales como los grupos que contienen maleimida y haloacetilo. En un ejemplo, una mutacion en la region de dimerizacion de la cadena β de HGF es una sustitucion, insercion y/o delecion, tal como N497R o K; G498A o S; P500W, H o E; insercion entre T501 y R502 (por ejemplo, una insercion de R y/o S); o R502del. En un ejemplo, una mutacion en la posicion N497 no es N497F, A o E. En un ejemplo, una mutacion esta en una o mas de las posiciones 495 a 503, en la que dicha mutacion podria alterar la dimerizacion de la cadena de HGF y/o la union al receptor. En otro ejemplo, las mutaciones que afectan al dominio de dimerizacion se pueden combinar con una mutacion en una o mas posiciones fuera del dominio de dimerizacion, por ejemplo, una mutacion en o adyacente al sitio de separacion 494

495. Por ejemplo, en un mutante que se esperaria no separable (por ejemplo, el doble mutante R494E:V495G) y que tambien contiene una mutacion en el dominio de dimerizacion, dicho mutante mostraria sin embargo una funcion biologica impedida incluso si se separa in vivo.

[0015] En algunas realizaciones de una molecula antagonista de HGF/Met de la invencion, la molecula comprende aminoacidos de tipo natural en la posicion 534, 578, 619, 673, 692, 693, 694, 695, 696, 699, y/o 702. En algunos ejemplos de antagonistas de HGF/Met, los antagonistas comprenden mutaciones en la posicion L622 (por ejemplo, L622C o K); 1623 (por ejemplo, l623C); D626 (por ejemplo, D626K); L622 mas D626 (por ejemplo, L622K mas D626K); K663 (por ejemplo, K663C); l664 (por ejemplo, l664C); R502 (por ejemplo, 502C); P500 (por ejemplo, P500C); N497 (por ejemplo, N497C); R494 mas l623 (por ejemplo, R494E mas l623C); N497 mas G498 (por ejemplo, N497R mas G498A, o N497K mas G498A); N497 mas P500 (por ejemplo, N497R mas P500H, o N497K mas P500H); G498 mas P500 (por ejemplo, G498A mas P500H); N497 mas G498 mas P500 (por ejemplo, N497R mas G498A mas P500H, o N497K mas G498A mas P500H); N497 mas L622 (por ejemplo, N497R mas L622K, o N497K mas L622K); N497 mas D626 (por ejemplo, N497R mas D626K, o N497K mas D626K); N497 mas L622 mas D626 (por ejemplo, N497R mas L622K mas D626K, o N497K mas L622K mas D626K).

[0016] En un ejemplo, una molecula antagonista de HGF/Met comprende una mutacion en el sitio activo de HGF solo o en combinacion con una o mas de las mutaciones descritas en el presente documento. Las mutaciones del sitio activo incluyen mutaciones en la posicion 667 y/o 704. Las mutaciones adecuadas incluyen la sustitucion de una o ambas de estas posiciones con una C o unW.

[0017] En general, una molecula antagonista de HGF/Met de la invencion comprende una molecula de HFG que tiene una mutacion en la cadena de HGF que reduce una o mas de las caracteristicas biologicas asociadas normalmente con HGF de tipo natural. Por ejemplo, en una realizacion, la molecula ha reducido la capacidad de senalizacion de C-Met (por ejemplo, fosforilacion de Met) en comparacion con HGF de tipo natural. En otra realizacion, la molecula ha reducido la capacidad de estimular la migracion celular en comparacion con la HGF de tipo natural. En otra realizacion, la molecula ha reducido la capacidad de estimular la proliferacion celular en comparacion con HGF de tipo natural. En otra realizacion, la molecula ha reducido la capacidad de estimular la angiogenesis en comparacion con HGF de tipo natural. Una molecula antagonista de HGF/Met de la invencion

comprende en general por lo menos una parte del HGF una cadena que esta implicada en la union a Met, unida a una cadena �de HGF mutada tal como se describe aqui.

[0018] Tal como se muestra mediante el analisis mutacional aqui descrito, ciertas regiones y posiciones de aminoacido especificas en las mismas, en la cadena de HGF juegan papeles importantes en la modulacion de funciones biologicas de HGF. Por consiguiente, en el presente documento se describen moduladores de HGF/Met que reconocen especificamente estas regiones. Dichos moduladores incluyen acidos nucleicos, tales como aptameros y polipeptidos, tales como peptidos de union y anticuerpos.

[0019] Tal como se utiliza aqui, la letra antes de un numero indica el correspondiente aminoacido de tipo natural hallado en la posicion de aminoacido indicado por ese numero en un polipeptido de HGF humano de tipo natural, y la letra o letras (si estan presentes) despues del numero indica el tipo de mutacion/aminoacido (por ejemplo, aminoacido de sustitucion, delecion (del) o insercion (ins)).

[0020] En un aspecto, la presente invencion proporciona un mutante de HGF que tiene actividad moduladora de HGF/c-met, por ejemplo un antagonista de actividad de HGF/c-met o una variante de HGF que muestra una reduccion, pero no una ausencia, de actividad biologica de HGF (por ejemplo, actividad estimuladora de crecimiento celular). En una realizacion, un antagonista de la invencion es capaz de inhibir la actividad biologica de HGF de tipo natural in vivo o in vitro (dicha actividad biologica incluye, pero sin limitacion, la fosforilacion del receptor, la estimulacion de la proliferacion celular, el aumento de la supervivencia celular, la promocion de la angiogenesis, la induccion/promocion de la migracion celular). En una realizacion, un mutante de HGF proporciona una actividad de promocion del crecimiento celular reducida (por ejemplo, proliferacion celular, supervivencia celular, migracion celular, angiogenesis).

[0021] Una molecula antagonista puede competir con HGF de tipo natural para la union a Met. En algunos ejemplos, dicha molecula inhibe la multimerizacion (por ejemplo, dimerizacion) del receptor c-met. En algunos ejemplos, dicha molecula comprende una variante (mutante) de cadena que tiene una capacidad reducida de interaccionar (por ejemplo, multimerizar/dimerizar) con otra molecula de cadena . En algunos ejemplos, dicha molecula inhibe la multimerizacion (por ejemplo, dimerizacion) de la cadena de HGF. En algunas realizaciones, dicha molecula se une a c-Met, pero exhibe una capacidad reducida para efectuar la activacion de c-met (por ejemplo, tal como se indica por la reduccion de la fosforilacion de c-met, fosforilacion de proteina quinasa (MAPK) activada por mitogeno, y/o una reduccion en la migracion celular, proliferacion celular, supervivencia celular, morfogenesis celular, angiogenesis, etc, dependiente de HGF/c-met).

[0022] En cualquier molecula de la invencion en la que se mutan una o mas posiciones en relacion con la secuencia homologa de tipo natural, la mutacion puede ser de cualquier forma que altere el efecto funcional del correspondiente residuo de tipo natural tal como se define en las reivindicaciones. Se puede obtener una mutacion en cualquier forma adecuada conocida en la tecnica (y/o determinada empiricamente), por ejemplo mediante sustitucion, insercion, adicion y/o delecion. En algunas realizaciones, una mutacion comprende una sustitucion no conservativa. Las sustituciones adecuadas incluyen, pero sin limitacion, las descritas en este documento (en particular en los ejemplos), por ejemplo, con aminoacidos, tales como alanina y serina.

[0023] En un aspecto, una molecula/sustancia (por ejemplo, moduladores de HGF/c-met tal como se describen en el presente documento) se une a una toxina, tal como un agente citotoxico. Estas moleculas/sustancias se pueden formular o administrar en combinacion con un aditivo/agente potenciador, tal como radiacion y/o un agente quimioterapeutico.

[0024] La presente invencion tambien proporciona metodos y composiciones utiles para modular estados patologicos asociados con la desregulacion del eje de senalizacion de HGF/c-met. De este modo, en un aspecto, la presente invencion proporciona una molecula antagonista de HGF/c-met de la presente invencion para utilizar en un metodo de reduccion de la activacion de c-met en un sujeto, comprendiendo dicho metodo administrar al sujeto una molecula antagonista de HGF/c-met de la presente invencion, mediante lo cual se reduce la activacion de c-met. En una realizacion, dicha molecula es un antagonista de HGF/c-met que inhibe la actividad de HGF/c-met. En una realizacion, dicho antagonista inhibe la union de la cadena e HGF de tipo natural a c-met. En un aspecto, la invencion proporciona una molecula antagonista de HGF/c-met de la invencion para utilizar en un metodo de tratamiento de una afeccion patologica asociada con la activacion de c-met en un sujeto, comprendiendo dicho metodo administrar al sujeto un antagonista de c-met de la invencion, mediante lo cual se inhibe la activacion de cmet.

[0025] La ruta de senalizacion de HGF/c-met esta implicada en multiples funciones biologicas y fisiologicas, que incluyen, por ejemplo, la estimulacion del crecimiento celular (por ejemplo, la proliferacion celular, la supervivencia celular, la migracion celular, la morfogenesis celular) y la angiogenesis. De este modo, en un aspecto, la presente invencion proporciona un metodo de inhibicion del crecimiento celular (por ejemplo, proliferacion y/o supervivencia) activado por c-met, comprendiendo dicho metodo poner en contacto una celula o tejido con un antagonista de la invencion, mediante lo cual se inhibe la proliferacion celular asociada con la activacion de c-met. En otro aspecto, la invencion proporciona un metodo de inhibicion de la angiogenesis, comprendiendo dicho metodo administrar a una

celula, a un tejido y/o a un sujeto con una afeccion asociada con una angiogenesis anormal un antagonista de HGF/Met de la invencion, mediante lo cual se inhibe la angiogenesis.

[0026] Se puede utilizar un antagonista de la invencion en la preparacion de un medicamento para el tratamiento terapeutico y/o profilactico de una enfermedad, tal como un cancer, un tumor, un trastorno proliferativo celular, un trastorno inmune (tal como autoinmune) y/o un trastorno relacionado con la angiogenesis. El antagonista puede estar en cualquier forma descrita en el presente documento, incluyendo anticuerpo, fragmento de anticuerpo, polipeptido (por ejemplo, un oligopeptido, mutante/variante del polipeptido HGF), acido nucleico (aptamero) o combinacion de los mismos.

[0027] Se puede utilizar un acido nucleico de la invencion en la preparacion de un medicamento para el tratamiento terapeutico y/o profilactico de una enfermedad, tal como un cancer, un tumor, un trastorno proliferativo celular, un trastorno inmune (tal como autoinmune) y/o un trastorno relacionado con la angiogenesis.

[0028] Se puede utilizar un vector de expresion de la invencion en la preparacion de un medicamento para el tratamiento terapeutico y/o profilactico de una enfermedad, tal como un cancer, un tumor, un trastorno proliferativo celular, un trastorno inmune (tal como autoinmune) y/o un trastorno relacionado con la angiogenesis.

[0029] Se puede utilizar una celula huesped de la invencion en la preparacion de un medicamento para el tratamiento terapeutico y/o profilactico de una enfermedad, tal como un cancer, un tumor, un trastorno proliferativo celular, un trastorno inmune (tal como autoinmune) y/o un trastorno relacionado con la angiogenesis.

[0030] Se puede utilizar un articulo de fabricacion de la invencion en la preparacion de un medicamento para el tratamiento terapeutico y/o profilactico de una enfermedad, tal como un cancer, un tumor, un trastorno proliferativo celular, un trastorno inmune (tal como autoinmune) y/o un trastorno relacionado con la angiogenesis.

[0031] En el presente documento se describe un kit utilizado en la preparacion de un medicamento para el tratamiento terapeutico y/o profilactico de una enfermedad, tal como un cancer, un tumor, un trastorno proliferativo celular, un trastorno inmune (tal como autoinmune) y/o un trastorno relacionado con la angiogenesis.

[0032] Tambien se describen en el presente documento: un metodo de inhibicion de la proliferacion celular activada por c-met, comprendiendo dicho metodo poner en contacto una celula o tejido con una cantidad eficaz de un antagonista de la invencion, mediante el cual se inhibe la proliferacion celular asociada con la activacion de c-met; un metodo de tratamiento de una afeccion patologica asociada con la desregulacion de la activacion de c-met en un sujeto, comprendiendo dicho metodo administrar al sujeto una cantidad eficaz de un antagonista de la invencion, mediante el cual se trata dicha afeccion; un metodo de inhibicion del crecimiento de una celula que expresa c-met o factor de crecimiento de hepatocitos, o ambos, comprendiendo dicho metodo poner en contacto dicha celula con un antagonista de c-met de la invencion, provocando asi la inhibicion del crecimiento de dicha celula, en el que la celula puede entrar en contacto con el HGF expresado por una celula diferente (por ejemplo, a traves de un efecto paracrino); un metodo de tratamiento terapeutico de un mamifero que tiene un tumor canceroso que comprende una celula que expresa c-met o factor de crecimiento de hepatocitos, o ambos, comprendiendo dicho metodo administrar a dicho mamifero una cantidad eficaz de un antagonista de la invencion, tratando asi de manera eficaz dicho mamifero, en el que la celula puede entrar en contacto con el HGF expresado por una celula diferente (por ejemplo, a traves de un efecto paracrino); un metodo para el tratamiento o prevencion de una trastorno proliferativo celular asociado con una expresion o actividad incrementada de c-met o factor de crecimiento de hepatocitos, o ambos, comprendiendo dicho metodo administrar a un sujeto con necesidad de dicho tratamiento una cantidad eficaz de un antagonista de la invencion, tratando o previniendo asi de manera eficaz dicho trastorno proliferativo celular, en el que dicho trastorno proliferativo puede ser cancer; un metodo de inhibicion del crecimiento de una celula, en el que el crecimiento de dicha celula es, por lo menos en parte, dependiente del efecto potenciador del crecimiento de c-met o factor de crecimiento de hepatocitos, o ambos, comprendiendo dicho metodo poner en contacto dicha celula con una cantidad eficaz de un antagonista de la invencion, inhibiendo asi el crecimiento de dicha celula, en el que la celula puede entrar en contacto con el HGF expresado por una celula diferente (por ejemplo, a traves de un efecto paracrino); y un metodo de tratamiento terapeutico de un tumor en un mamifero, en el que el crecimiento de dicho tumor es, por lo menos en parte, dependiente del efecto potenciador del crecimiento de c-met o factor de crecimiento de hepatocitos,

o ambos, comprendiendo dicho metodo poner en contacto dicha celula con una cantidad eficaz de un antagonista de la invencion, tratando asi de manera eficaz dicho tumor, en el que la celula puede entrar en contacto con el HGF expresado por una celula diferente (por ejemplo, a traves de un efecto paracrino).

[0033] Los metodos descritos en este documento se pueden utilizar para afectar a cualquier estado patologico adecuado, por ejemplo, celulas y/o tejidos asociados con la desregulacion de la ruta de senalizacion de HGF/c-met. En un ejemplo, una celula que es una diana en un metodo de la presente invencion es una celula cancerosa. Por ejemplo, una celula cancerosa puede ser una seleccionada del grupo que consiste en una celula de cancer de

mama, una celula de cancer colorrectal, una celula de cancer de pulmon, una celula de carcinoma papilar (por ejemplo, de la glandula tiroides), una celula de cancer de colon, una celula de cancer pancreatico, una celula de cancer de ovario, una celula de cancer de cuello de utero, una celula de cancer del sistema nervioso central, una celula de sarcoma osteogenico, una celula de carcinoma renal, una celula de carcinoma hepatocelular, una celula de cancer de vejiga, una celula de carcinoma gastrico, una celula de carcinoma escamoso de cabeza y cuello, una celula de melanoma, una celula de mieloma multiple, y una celula de leucemia. En un ejemplo, una celula que es una diana en un metodo de la invencion es una celula hiperproliferativa y/o hiperplasica. En un ejemplo, una celula que es una diana en un metodo de la invencion es una celula displasica. En aun otro ejemplo, una celula que es una diana en un metodo de la invencion es una celula metastasica.

[0034] Los metodos descritos en el presente documento pueden comprender ademas etapas de tratamiento adicionales. Por ejemplo, en un ejemplo, un metodo comprende ademas una etapa en la que una celula y/o tejido diana (por ejemplo, una celula cancerosa) esta expuesta a tratamiento por radiacion o un agente quimioterapeutico. En un ejemplo, una molecula antagonista de HGF/Met de la invencion se administra a un sujeto en combinacion con uno o mas de otros agentes terapeuticos, por ejemplo erlotinib (TARCEVA®), pemetrexed (ALlMTA ®), bevacizumab (AVASTlN®), gefitinib (lRESSA®), trastuzumab (HERCEPTlN®), y rituximab (RlTUXAN®). La administracion de agentes terapeuticos en terapia de combinacion puede tener lugar de manera simultanea o secuencial.

[0035] Tal como se describe en el presente documento, la activacion de c-met es un proceso biologico importante, la desregulacion del cual conduce a numerosas afecciones patologicas. Por consiguiente, en un ejemplo de metodos descritos en el presente documento, una celula que es una diana (por ejemplo, una celula cancerosa) es aquella en que aumenta la activacion de c-met en comparacion con una celula normal del mismo origen tisular. En un ejemplo, un metodo de la invencion provoca la muerte de una celula diana. Por ejemplo, el contacto con un antagonista de la invencion puede dar lugar a la incapacidad de las celulas para senalar a traves de la ruta de c-met, lo cual da lugar a la muerte celular.

[0036] La desregulacion de la activacion de c-met (y de este modo la senalizacion) puede resultar de una serie de cambios celulares, incluyendo, por ejemplo, la sobrexpresion de HGF (un ligando afin de c-met) y/o el propio c-met. Por consiguiente, en algunos ejemplos, un metodo descrito en el presente documento comprende reconocer una celula en la que c-met o el factor de crecimiento de hepatocitos, o ambos, se expresan de manera abundante por dicha celula (por ejemplo, una celula cancerosa) en comparacion con una celula normal del mismo origen de tejido. Una celula que expresa c-met se puede regular por HGF de una variedad de fuentes, es decir, de una manera autocrina o paracrina. Por ejemplo, en un ejemplo de metodos descritos en este documento, una celula diana entra en contacto/se une a un factor de crecimiento de hepatocitos expresado en una celula diferente (por ejemplo, a traves de un efecto paracrino). Dicha celula diferente puede ser del mismo o diferente origen de tejido. En un ejemplo, una celula diana entra en contacto/se une a un HGF expresado por la propia celula diana (por ejemplo, a traves de un efecto/bucle autocrino).

[0037] En algunos ejemplos, los antagonistas de HGF/Met de la invencion comprenden mutantes de HGF que comprenden modificaciones que aumentan su efecto inhibidor y/o terapeutico (incluyendo, por ejemplo, una afinidad aumentada, propiedades farmacocineticas mejoradas (tales como la semivida, estabilidad, velocidad de eliminacion), toxicidad reducida para el sujeto). Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, modificaciones que implican glicosilacion, pegilacion, sustitucion con aminoacidos no naturales, pero funcionalmente equivalentes, grupos de enlace, etc. Las modificaciones adecuadas son conocidas en el sector y se pueden determinar adicionalmente de forma empirica segun sea necesario.

[0038] En un aspecto, la presente invencion proporciona composiciones que comprenden uno o mas antagonistas de HGF/c-met de la presente invencion y un portador. En una realizacion, el portador es farmaceuticamente aceptable.

[0039] En un aspecto, la presente invencion proporciona acidos nucleicos que codifican un antagonista de HGF/cmet de la presente invencion, tal como se define en las reivindicaciones. En una realizacion, un acido nucleico de la invencion codifica un antagonista de HGF/c-met que es o comprende un polipeptido (por ejemplo, un mutante/variante de HGF). Un acido nucleico puede codificar un antagonista de HGF/c-met que es o comprende un anticuerpo o fragmento del mismo.

[0040] En un aspecto, la presente invencion proporciona vectores que comprenden un acido nucleico de la invencion tal como se define en las reivindicaciones.

[0041] En un aspecto, la presente invencion proporciona celulas huesped que comprenden un acido nucleico o un vector de la invencion tal como se define en las reivindicaciones. Un vector puede ser de cualquier tipo, por ejemplo, un vector recombinante, tal como un vector de expresion. Se puede utilizar cualquiera de un conjunto de celulas huesped. En una realizacion, una celula huesped es una celula procariota, por ejemplo, E. coli. En una realizacion, una celula huesped es una celula eucariota, por ejemplo, una celula de mamifero, tal como una celula de ovario de hamster chino (CHO).

[0042] En un aspecto, la presente invencion proporciona metodos para producir un antagonista de HGF/c-met de la invencion tal como se define en las reivindicaciones. Por ejemplo, la presente invencion proporciona un metodo de produccion de un antagonista de HGF/c-met que es o comprende un polipeptido (tal como un mutante/variante de HGF), comprendiendo dicho metodo expresar en una celula huesped adecuada un vector recombinante de la invencion que codifica dicho polipeptido, y recuperar dicho polipeptido.

[0043] En un aspecto, la presente invencion proporciona un articulo de fabricacion que comprende un recipiente; y una composicion contenida en el recipiente, en el que la composicion comprende uno o mas antagonistas de HGF/cmet de la invencion tal como se define en las reivindicaciones. La composicion puede comprender un acido nucleico de la invencion. En una realizacion, una composicion que comprende un antagonista de HGF/c-met comprender ademas un portador, que, en algunas realizaciones, es farmaceuticamente aceptable. En una realizacion, un articulo de fabricacion de la invencion comprende ademas instrucciones para administrar la composicion al sujeto.

[0044] Tambien se describe en este documento un kit que comprende un primer recipiente que comprende una composicion que comprende uno o mas antagonistas de HGF/c-met de la invencion; y un segundo recipiente que comprende un tampon. En un ejemplo, el tampon es farmaceuticamente aceptable. En un ejemplo, una composicion que comprende un antagonista de HGF/c-met comprender ademas un portador, que, en algunas realizaciones, es farmaceuticamente aceptable. En un ejemplo, un kit comprende ademas instrucciones para administrar la composicion al sujeto.

BREVE DESCRlPClON DE LOS DlBUJOS

[0045]

Figura 1 (A) representa la caracterizacion de varios mutantes de HGF. Se ejemplifican mutantes de la insercion Nterminal de la cadena de HGF y la dimerizacion de la cadena de HGF. Los datos de "migracion celular" se refieren a la migracion de celulas MDA-MB435 en presencia de HGF de longitud completa que contenian la mutacion o mutaciones indicadas, expresada como el porcentaje de migracion en presencia de HGF de tipo natural. Los datos de "union HGF /MetlgG" se refieren a la union de la cadena de HGF (que contiene la mutacion o mutaciones indicadas) a MetlgG, expresada como la proporcion de lC50(mutante) con respecto a lC50 (tipo natural) en un ensayo de union de competicion. En estos datos, WT se refiere al mutante C604S; los mutantes de cadena de HGF tambien contenian esta mutacion. Nota: Como referencia general, las mutaciones se indican en negrita si se espera que alteren las potenciales interacciones de cadena -cadena , y las mutaciones se indican en cursiva y subrayadas (negrita o no negrita) si se espera que alteren la insercion del N-terminal. Estas suposiciones se basan en el efecto predominante observado o esperado para las respectivas mutaciones, es decir, el efecto en las interacciones de cadena -cadena o la capacidad del extremo N-terminal de la de cadena de insertarse en un sitio activo/bolsillo de union. A pesar de esto, el experto en la materia seria capaz de determinar facilmente si una mutacion particular tendria uno o ambos efectos, ya se indique o no en la figura 1A. Por ejemplo, en algunos casos, una mutacion puede afectar a las interacciones de cadena �-cadena y a la insercion del extremo N-terminal, o en algunos casos, una mutacion indicada en la figura 1A que se espera que afecte a las interacciones de cadena cadena se puede mostrar empiricamente que afecta a la insercion del extremo N-terminal. De manera similar, los valores de union a Met aparentemente "impedidos" se indican en cursiva y los valores de union aparentemente "normales" se indican en negrita, aunque el grado de "impedimento" y "normalidad" es relativo.

(B): Union de HGF de longitud completa que contiene la mutacion o mutaciones indicadas a Met medida en un ensayo de union de competicion. Los datos se expresan como la proporcion de lC50 (mutante) con respecto a lC50 (tipo natural).

(C): lnhibicion de la migracion y la proliferacion celular por el HGF de longitud completa que contiene la mutacion o mutaciones indicadas. La cantidad de actividad de migracion y proliferacion celular, respectivamente, en presencia de HGF mutante y HGF de tipo natural (HGF de tipo natural 1 nM para la migracion; HGF de tipo natural 0,25 nM para la proliferacion) se expresa como el porcentaje de actividad observada en presencia de HGF de tipo natural solo. Figura 2 (A) lnhibicion de la fosforilacion de Met dependiente de HGF en celulas A549 por mutantes de HGF tal como se indica; R424A: R494E se refiere a HGF de cadena unica. La cantidad de fosforilacion de Met se indica como RLU (unidad relativa de luz). (B) lnhibicion de la fosforilacion de Met dependiente de HGF en celulas de carcinoma de pulmon A549 por mutantes de HGF tal como se indica. La cantidad de fosforilacion de Met se indica como el porcentaje de control (que es la cantidad observada en presencia de HGF de tipo natural 0,5 nM). Figuras 3(A) y (B) Fosforilacion de Met en celulas A549 en presencia de HGF de tipo natural y mutante. La cantidad de fosforilacion de Met se indica como el porcentaje de fosforilacion maxima observada en presencia de HGF de tipo natural a cada una de las respectivas concentraciones de HGF de tipo natural. Figura 4. Actividad angiogenica en presencia de HGF mutante. La cantidad de angiogenesis se indica como el numero de brotes/particula en presencia de los mutantes de HGF indicados.

MODOS PARA LLEVAR A CABO LA lNVENClON

[0046] La presente invencion proporciona metodos, composiciones, kits y articulos de fabricacion para modular la ruta de senalizacion de HGF/c-met.

[0047] En el presente documento se proporcionan detalles de estos metodos, composiciones, kits y articulos de fabricacion.

Técnicas generales

[0048] La practica de la presente invencion empleara, a menos que se indique lo contrario, tecnicas convencionales de biologia molecular (incluyendo tecnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquimica, e inmunologia, que estan dentro del alcance de la tecnica. Dichas tecnicas se explican completamente en la bibliografia, tales como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edicion (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. l. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, lnc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, y actualizaciones periodicas); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988).

Definiciones

[0049] Tal como se emplean en este documento, las referencias a los nombres de aminoacidos pueden ser las designaciones aceptadas en el sector en una o mas de las siguientes formas, todas ellas utilizadas de forma intercambiable en este documento: (i) nombre completo (por ejemplo, triptofano, serina, glicina, etc.), (ii) abreviaturas de tres letras (por ejemplo, Trp, Ser, Gly, etc.), y (iii) designaciones de una letra (por ejemplo, W, S, G, etc.).

[0050] "Porcentaje (%) de identidad en la secuencia de aminoacidos" con respecto a una secuencia de peptido o polipeptido se define como el porcentaje de los residuos de aminoacidos en una secuencia candidata que son identicos a los residuos de aminoacidos en la secuencia de peptido o polipeptido especifica, despues de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para conseguir el maximo porcentaje de identidad en la secuencia, y sin considerar cualquiera sustitucion conservativa como parte de la identidad en la secuencia. El alineamiento para fines de determinar el porcentaje de identidad en la secuencia de aminoacidos puede conseguirse de diversas maneras que estan dentro del alcance de la tecnica, por ejemplo, usando software informatico disponible publicamente tal como software BLAST, BLAST-2, ALlGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar parametros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo necesario para alcanzar el maximo alineamiento sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Para los fines del presente documento, sin embargo, los valores del % de identidad en la secuencia de aminoacidos se generan usando el programa informatico de comparacion de secuencias ALlGN-2, tal como se describe en la patente de Estados Unidos No. 6.828.146.

[0051] Tal como se utiliza en este documento, los terminos "peptido" y "polipeptido" se utilizan de forma intercambiable, a excepcion de que el termino "peptido" se refiere, en general, a un polipeptido que comprende menos de 200 aminoacidos contiguos. El termino "peptido", en general, se refiere a una secuencia contigua y relativamente corta de aminoacidos unidos por enlaces peptidilos. Habitualmente, pero no necesariamente, un peptido tiene una longitud de aproximadamente 2 a 50 aminoacidos, 4-40 aminoacidos o 10-30 aminoacidos.

[0052] El termino "vector", tal como se usa en este documento, pretende referirse a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plasmido", que se refiere a un bucle de ADN de doble cadena circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector en fago. Otro tipo de vector es un vector viral, donde segmentos adicionales de ADN pueden ligarse en el genoma viral. Algunos vectores son capaces de replicacion autonoma en una celula huesped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicacion bacteriano y vectores episomales de mamifero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamifero) pueden integrarse en el genoma de una celula huesped despues de la introduccion en la celula huesped, y de este modo, se replican junto con el genoma del huesped. Ademas, algunos vectores son capaces de dirigir la expresion de genes a los que estan unidos de forma operativa. Dichos vectores se denominan en este documento como "vectores de expresion recombinantes" (o simplemente, "vectores recombinantes"). En general, los vectores de expresion de utilidad en tecnicas de ADN recombinantes a menudo estan en forma de plasmidos. En la presente memoria descriptiva, "plasmido" y "vector" pueden usarse de forma intercambiable puesto que el plasmido es la forma mas habitualmente usada de vector.

[0053] "Polinucleotido" o "acido nucleico", tal como se usan de forma intercambiable en este documento, se refieren a polimeros de nucleotidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y ARN. Los nucleotidos pueden ser desoxirribonucleotidos, ribonucleotidos, nucleotidos o bases modificadas, y/o sus analogos, o cualquier sustrato que puede incorporarse en un polimero mediante ADN o ARN polimerasa, o mediante una reaccion de sintesis. Un polinucleotido puede comprender nucleotidos modificados, tales como nucleotidos metilados y sus analogos. Si esta presente, la modificacion de la estructura nucleotidica puede realizarse antes o despues del ensamblaje del polimero. La secuencia de nucleotidos puede estar interrumpida por componentes no nucleotidicos. Un polinucleotido puede modificarse adicionalmente despues de la sintesis, tal como mediante conjugacion con una marca. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, caperuzas ("caps"), sustitucion de uno o mas de los

nucleotidos de origen natural con un analogo, modificaciones internucleotidicas tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriesteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), los que contienen restos colgantes, tales como, por ejemplo, proteinas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, peptidos senal, poli-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), los que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidantes, etc.), los que contienen alquilantes, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, acidos nucleicos alfa anomericos, etc.), asi como formas no modificadas del polinucleotido (o de los polinucleotidos). Ademas, cualquiera de los grupos hidroxilo normalmente presentes en los azucares puede sustituirse, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos mediante grupos protectores convencionales, o activados para preparar enlaces adicionales con nucleotidos adicionales, o pueden conjugarse a soportes solidos o semi-solidos. El OH 5' y 3' terminal puede fosforilarse o sustituirse por aminas o restos organicos de grupos formadores de caperuzas de desde 1 a 20 atomos de carbono. Otros hidroxilos tambien pueden derivatizarse a grupos protectores convencionales. Los polinucleotidos tambien pueden contener formas analogas de azucares de ribosa o desoxirribosa que se conocen generalmente en el sector, incluyendo, por ejemplo, 2'-Ometil-, 2'-O-alil-, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, analogos de azucares carbociclicos, azucares alfa-anomericos, azucares epimericos, tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azucares de piranosa, azucares de furanosa, psedoheptulosas, analogos aciclicos y analogos de nucleosido abasicos tales como metil ribosido. Uno o mas enlaces fosfodiester pueden sustituirse mediante grupos enlazantes alternativos. Estos grupos enlazantes alternativos incluyen, aunque sin limitacion, realizaciones en las que el fosfato se sustituye por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), "(O)NR.sub.2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO o CH.sub.2 ("formacetal"), donde cada uno de R o R' es independientemente H o alquilo sustituido o no sustituido (1-20 C.) que opcionalmente contiene un enlace eter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No es necesario que todos los enlaces en un polinucleotido sean identicos. La anterior descripcion se aplica a todos los polinucleotidos mencionados en este documento, incluyendo ARN y ADN.

[0054] "Oligonucleotido" tal como se usa en este documento, se refiere en general a polinucleotidos cortos, generalmente de cadena sencilla, generalmente sinteticos, que en general, pero no necesariamente, tienen menos de aproximadamente 200 nucleotidos de longitud. Los terminos "oligonucleotido" y "polinucleotido" no son mutuamente excluyentes. La descripcion anterior para polinucleotidos es igual y completamente aplicable a oligonucleotidos.

[0055] El termino "factor de crecimiento de hepatocitos" o "HGF", tal como se usa en este documento, se refiere, a menos que se indique especificamente lo contrario, a cualquier polipeptido de HGF nativo o variante (ya sea nativo o sintetico) que es capaz de activar la ruta de senalizacion de HGF/c-met en condiciones que permiten que tenga lugar dicho proceso. El termino "HGF de tipo natural" se refiere en general a un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de una proteina de HGF de origen natural. El termino "secuencia de HGF de tipo natural" se refiere en general a una secuencia de aminoacidos que se encuentra en un HGF de origen natural.

[0056] Las frases "que no impide sustancialmente", "no reduce sustancialmente", "son sustancialmente similares" o "son sustancialmente equivalentes", y variaciones de las mismas, tal como se utilizan en este documento, indican un grado suficientemente elevado de similitud entre dos valores numericos, de manera que un experto en la materia consideraria la diferencia entre los dos valores como de significancia biologica pequena o nula en el contexto de la caracteristica biologica medida por dichos valores. La diferencia ente dichos dos valores es preferiblemente inferior a aproximadamente el 50%, preferiblemente inferior a aproximadamente el 40%, preferiblemente inferior a aproximadamente el 30%, preferiblemente inferior a aproximadamente el 20%, preferiblemente inferior a aproximadamente el 10%. Los ejemplos de "dos valores numericos" incluyen un valor asociado con una proteina de tipo natural y un valor asociado con una forma mutada de dicha proteina.

[0057] Los terminos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se usan de forma intercambiable en el sentido mas amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de longitud completa o intactos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecificos (por ejemplo, anticuerpos biespecificos siempre que muestren la actividad biologica deseada) y tambien pueden incluir ciertos fragmentos de anticuerpo (tal como se describe con mas detalle en este documento). Un anticuerpo puede ser humano, humanizado y/o madurado para afinidad.

[0058] "Fragmentos de anticuerpo" comprenden solamente una parte de un anticuerpo intacto, donde la parte preferentemente conserva al menos una, preferentemente la mayoria o todas, las funciones normalmente asociadas con esa parte cuando esta presente en un anticuerpo intacto. En una realizacion, un fragmento de anticuerpo comprende un punto de union al antigeno del anticuerpo intacto y por lo tanto conserva la capacidad de unirse al antigeno. En otra realizacion, un fragmento de anticuerpo, por ejemplo uno que comprende la region Fc, conserva al menos una de las funciones biologicas normalmente asociadas con la region Fc cuando esta presente en un anticuerpo intacto, tal como union a FcRn, modulacion de la semivida del anticuerpo, funcion ADCC y union al complemento. En una realizacion, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que tiene una semivida in vivo sustancialmente similar a un anticuerpo intacto. Por ejemplo, dicho fragmento de anticuerpo puede comprender un brazo de union al antigeno unido a una secuencia Fc capaz de conferir estabilidad in vivo al fragmento.

[0059] El termino "anticuerpo monoclonal", tal como se usa en este documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la poblacion son identicos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente especificos, al estar dirigidos contra un unico antigeno. Ademas, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que habitualmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal esta dirigido contra un unico determinante en el antigeno.

[0060] Los anticuerpos monoclonales en este documento incluyen especificamente anticuerpos "quimericos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es identica a u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos obtenidos de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la cadena o cadenas es identica a u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos obtenidos de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, asi como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que muestren la actividad biologica deseada (Patente de Estados Unidos N° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)).

[0061] Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quimericos que contienen una secuencia minima obtenida de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que residuos de una region hipervariable del receptor se sustituyen por residuos de una region hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador), tal como raton, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la region armazon (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todos de al menos uno, y habitualmente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas de las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente tambien comprendera al menos una parte de una region constante de inmunoglobulina (Fc), habitualmente la de una inmunoglobulina humana. Para mas detalles, vease Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992). Veanse tambien los siguientes articulos de estudio y referencias citadas en esos documentos: Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & lmmunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1.038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5: 428-433 (1994).

[0062] Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoacidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o se ha preparado usando cualquiera de las tecnicas para preparar anticuerpos humanos como se ha descrito en este documento. Esta definicion de un anticuerpo humano excluye especificamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de union al antigeno no humanos.

[0063] Un anticuerpo "madurado para afinidad" es uno con una o mas alteraciones en una o mas CDR del mismo que dan como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antigeno, en comparacion con un anticuerpo parental que no posee esta alteracion o alteraciones. Los anticuerpos madurados para afinidad preferidos tendran afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antigeno diana. Los anticuerpos madurados para afinidad se producen mediante procedimientos conocidos en el sector. Marks et al. Bio/technology 10: 779-783 (1992) describe maduracion para afinidad mediante cambios de los dominios VH y VL. La mutagenesis aleatoria de residuos de CDR y/o armazon se describe por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155(1995); Yelton et al. J. lmmunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. lmmunol, 154(7):3310-9 (1995); y Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

[0064] Un anticuerpo "de bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biologica del antigeno al que se une. Los anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonistas preferidos inhiben sustancial o completamente la actividad biologica del antigeno.

[0065] Un "anticuerpo agonista", tal como se usa en este documento, es un anticuerpo que mimetiza por lo menos una de las actividades funcionales de un polipeptido de interes.

[0066] Un "trastorno" o "afeccion patologica" es cualquier afeccion que podria beneficiarse del tratamiento con una sustancia/molecula o metodo de la invencion. Esto incluye trastornos o enfermedades cronicas y agudas incluyendo aquellas afecciones patologicas que predisponen al mamifero para el trastorno en cuestion. Los ejemplos no limitantes de trastornos a tratar en este documento incluyen tumores o canceres malignos y benignos; tumores no de leucemia y linfoides; trastornos neuronal, glial, astrocitico, hipotalamico y otros trastornos glandulares, macrofagicos, epiteliales, estromaticos y blastocelicos; y trastornos inflamatorios, inmunologicos, neurodegenerativos, relacionados con la angiogenesis y trastornos relacionados con efectos mitocondriales o metabolicos.

[0067] Los terminos "trastorno proliferativo celular" y "trastorno proliferativo" se refieren a trastornos que estan asociados con cierto grado de proliferacion celular anormal. En una realizacion, el trastorno proliferativo celular es cancer.

[0068] "Tumor", tal como se usa en este documento, se refiere a todo crecimiento y proliferacion celular neoplasico, ya sea maligno o benigno, y a todas las celulas y tejidos precancerosos y cancerosos. Los terminos "cancer", "canceroso", "trastorno proliferativo celular", "trastorno proliferativo" y "tumor" no se excluyen mutuamente cuando se mencionan en este documento.

[0069] Los terminos "cancer" y "canceroso" se refieren o describen la afeccion fisiologica en mamiferos que se caracteriza habitualmente por un crecimiento/proliferacion celular no regulada. Los ejemplos de cancer incluyen, pero sin limitacion, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos mas particulares de dichos canceres incluyen mieloma multiple, cancer de celulas escamosas, cancer de pulmon microcitico, cancer de pulmon macrocitico, adenocarcinoma de pulmon, carcinoma escamoso de pulmon, cancer de peritoneo, cancer hepatocelular, cancer gastrointestinal, cancer pancreatico, glioblastoma, cancer de cuello del utero, cancer de ovario, cancer de higado, cancer de vejiga, hepatoma, cancer de mama, cancer de colon, cancer colorrectal, cancer de endometrio o carcinoma uterino, carcinoma de glandulas salivales, cancer de rinon (por ejemplo, carcinoma de celulas renales), cancer de higado, cancer de prostata, cancer de vulva, cancer de tiroides, carcinoma hepatico y diversos tipos de cancer de cabeza y cuello.

[0070] Tal como se usa en este documento, "tratamiento" se refiere a una intervencion clinica en un intento de alterar la evolucion natural del individuo o celula que se esta tratando, y puede realizarse por profilaxis o durante la evolucion de una patologia clinica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen prevenir la aparicion o recurrencia de la enfermedad, alivio de los sintomas, disminucion de cualquier consecuencia patologica directa o indirecta de la enfermedad, prevenir la metastasis, reducir la velocidad de avance de la enfermedad, mejoria o alivio del estado de la enfermedad, y remision o pronostico mejorado. En algunas realizaciones, se usan anticuerpos de la invencion para retrasar el desarrollo de una enfermedad o trastorno.

[0071] Una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para alcanzar el resultado terapeutico o profilactico deseado.

[0072] Una "cantidad terapeuticamente eficaz" de una sustancia/molecula de la invencion, agonista o antagonista puede variar segun factores, tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y la capacidad de la sustancia/molecula, agonista o antagonista para desencadenar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapeuticamente eficaz es tambien una en la que cualquier efecto toxico o perjudicial de la sustancia/molecula, agonista o antagonista es mucho menor que los efectos terapeuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilacticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profilactico deseado. Habitualmente, pero no necesariamente, puesto que se usa una dosis profilactica en sujetos antes de o en una fase temprana de la enfermedad, la cantidad profilacticamente eficaz sera menor que la cantidad terapeuticamente eficaz.

[0073] El termino "agente citotoxico", tal como se usa en este documento, se refiere a una sustancia que inhibe o impide la funcion de celulas y/o causa la destruccion de celulas. El termino pretende incluir isotopos radiactivos (por ejemplo, At211, l131, l125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isotopos radiactivos de Lu), agentes quimioterapeuticos por ejemplo metotrexato, adriamicina, alcaloides de vinca (vincristina, vinblastina, etoposido), doxorrubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de las mismas, tales como enzimas nucleoliticas, antibioticos, y toxinas, tales como toxinas de molecula pequena o toxinas enzimaticamente activas de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas, y los diversos agentes antitumorales o anticancer que se describen posteriormente. Otros agentes citotoxicos se describen posteriormente. Un agente tumoricida causa la destruccion de las celulas tumorales.

[0074] Un "agente quimioterapeutico" es un compuesto quimico util en el tratamiento del cancer. Los ejemplos de agentes quimioterapeuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y CYTOXAN® ciclosfosfamida; alquil sulfonatos tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); una camptotecina (incluyendo el analogo sintetico topotecan); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus analogos de adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina l y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los analogos sinteticos, KW-2189 y CB1-TM 1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrogeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloruro oxido de mecloretamina, melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibioticos tales como los antibioticos de enediina (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gammall y caliqueamicina omega ll (vease, por ejemplo, Agnew, Chem lntl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, tales como clodronato; una esperamicina; asi como neocarzinostatina cromoforo y cromoforos de antibiotico de la

cromoproteina enediina relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina ADRlAMYClN® (incluyendo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolinodoxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, acido micofenolico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); analogos del acido folico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; analogos de purina tales como fludarabina, 6mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; analogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgenos tales como calusterona, dromostanolona propionato, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; rellenadores de acido folico tales como acido frolinico; aceglatona; aldofosfamida glicosido; acido aminolevulinico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; acido podofilico; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo polisacaridico PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermanio; acido tenuazonico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANET sin Cremofor, formulacion de nanoparticulas de paclitaxel con insercion de albumina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, lllinois), y doxetaxel TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina GEMZAR®; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; analogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina NAVELBlNE®; novantrona; teniposido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como acido retinoico; capecitabina; y sales, acidos o derivados farmaceuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

[0075] Tambien se incluyen en la definicion de "agente quimioterapeutico" anterior agentes anti-hormonales que actuan para regular o inhibir la accion hormonal sobre tumores, tales como anti-estrogenos y moduladores selectivos de receptores de estrogenos (SERM), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno FARESTON; inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la produccion de estrogenos en las glandulas adrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASlN®, formestano, fadrozol, vorozol RlVlSOR®, letrozol FEMARA®, y anastrozol ARlMlDEX®; y anti-androgenos, tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, y goserelina; asi como troxacitabina (un analogo de 1,3-dioxolano nucleosido citosina); oligonucleotidos antisentido, particularmente los que inhiben la expresion de genes en rutas de senalizacion implicadas en la proliferacion celular aberrante, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Ralf y H-Ras; ribozimas tales como un inhibidor de la expresion de VEGF (por ejemplo, ribozima ANGlOZYME®) y un inhibidor de la expresion de HER2; vacunas tales como vacunas de terapia genica, por ejemplo, vacuna ALLOVECTlN®, vacuna LEUVECTlN®, y vacuna VAXlD®; PROLEUKlN® rlL-2; inhibidor de topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELlX®; y sales, acidos o derivados farmaceuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

[0076] Un "agente inhibidor del crecimiento", cuando se usa en este documento, se refiere a un compuesto o composicion que inhibe el crecimiento de una celula cuyo crecimiento depende de la activacion de HGF/c-met in vitro o in vivo. De este modo, el agente inhibidor del crecimiento puede ser uno que reduce significativamente el porcentaje de celulas dependientes de HGF/c-met en fase S. Los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean el avance del ciclo celular (en un punto diferente de la fase S), tales como agentes que inducen la detencion en G1 y detencion en la fase M. Los bloqueantes de fase M convencionales incluyen los vinca (vincristina y vinblastina), taxanos, e inhibidores de topoisomerasa ll, tales como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etoposido, y bleomicina. Los agentes que detienen G1 tambien extienden su accion a la detencion de la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo, y ara-C. Puede encontrarse mas informacion en "The Molecular Basis of Cancer", Mendelsohn and lsrael, eds., Capitulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" de Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente pag. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son farmacos anticancer que se obtienen ambos del arbol del tejo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), obtenido del tejo europeo, es un analogo semisintetico de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamblaje de microtubulos a partir de dimeros de tubulina y estabilizan los microtubulos impidiendo la despolimerizacion, lo que da como resultado la inhibicion de la mitosis en las celulas.

[0077] "Doxorrubicina" es un antibiotico de antraciclina. El nombre quimico completo de la doxorrubicina es (8S-cis)10-[(3-amino-2,3,6-tridesoxi-a-L-lixo-hexapiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metoxi5,12-naftacenodiona.

Antagonistas de HGF/Met - peptidos/polipeptidos (incluyendo anticuerpos)

[0078] Un aspecto de la descripcion de este documento se refiere a moduladores de peptido/polipeptido y anticuerpo aislados de la interaccion de cadena β-cadena β de HGF y la interaccion de HGF-Met. Los moduladores (tales como peptidos/polipeptidos y anticuerpos) se pueden aislar de celulas o fuentes de tejido mediante un esquema de purificacion apropiado utilizando tecnicas de purificacion de proteina estandar. En otro ejemplo, los moduladores se producen mediante tecnicas de ADN recombinante. como alternativa a la expresion recombinante, los moduladores se pueden sintetizar quimicamente utilizando tecnicas de sintesis de peptidos estandar.

[0079] Las moleculas antagonistas de HGF/Met incluyen las descritas en la figura 1. La descripcion del presente documento tambien proporciona una proteina mutante o variante, en la cual los residuos se pueden cambiar de los residuos correspondientes de estos peptidos/polipeptidos, mientras se codifica un peptido/polipeptido que mantiene la actividad moduladora. Una variante de un antagonista de peptido/polipeptido puede tener por lo menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% de identidad de la secuencia de aminoacidos con la secuencia de un antagonista de peptido/polipeptido de referencia. En general, la variante muestra sustancialmente una afinidad de union igual o superior al antagonista de peptido/polipeptido de union de referencia, por ejemplo, por lo menos 0,75 veces, 0,8 veces, 0,9 veces, 1,0 veces, 1,25 veces o 1,5 veces la afinidad de union del peptido/polipeptido/ligando de union de referencia, basado en la unidad de cuantificacion/metrica del ensayo de union aceptado en la tecnica, a la vez que se mantiene un grado deseable de actividad antagonista.

[0080] En general, las variantes incluyen variantes en las que residuos en una posicion particular en la secuencia se han sustituido por otros aminoacidos, y ademas incluyen la posibilidad de insertar un residuo o residuos adicionales entre dos residuos de la proteina/peptido parental, asi como la posibilidad de eliminar uno o mas residuos de la secuencia parental o anadir uno o mas residuos a la secuencia parental. Cualquier sustitucion, insercion o delecion de aminoacido esta comprendido por la invencion. En circunstancias favorables, la sustitucion es una sustitucion conservativa tal como se describe en este documento.

[0081] Un peptido, polipeptido, proteina o fragmento biologicamente activo "aislado" o "purificado" se separa y/o recupera de un componente de su medio natural. Los componentes contaminantes incluyen materiales que habitualmente interferirian con los usos diagnostico o terapeutico para el polipeptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros materiales proteinicos o no proteinicos. Las preparaciones que tienen preferiblemente menos del 30% en peso en seco de material contaminante no deseado (contaminantes), preferiblemente inferior al 20%, 10% y preferiblemente inferior al 5% de contaminantes, se consideran que estan sustancialmente aislados. Un peptido/polipeptido producido recombinantemente aislado o una parte biologicamente activa de los mismos esta preferiblemente sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa preferiblemente menos del 20%, preferiblemente menos de aproximadamente el 10%, y preferiblemente menos de aproximadamente el 5% del volumen de una preparacion de peptido/polipeptido. Los ejemplos de contaminantes incluyen restos celulares, medio de cultivo, y sustancias utilizadas y producidas durante la sintesis in vitro del peptido/polipeptido.

[0082] En la tabla A se muestran sustituciones conservativas de peptidos/polipeptidos bajo el titulo de "sustituciones preferentes". Si estas sustituciones dan lugar a una modificacion de la actividad biologica, entonces se pueden introducir mas modificaciones sustanciales, denominadas "sustituciones de ejemplo" en la Tabla A o, tal como se describe adicionalmente a continuacion en referencia a las clases de aminoacido, y se criban los productos.

Tabla A 5

Residuo original: Sustituciones de ejemplo Sustituciones preferentes

Ala (A): val; leu; ile val

Arg (R): lys; gln; asn lys

Asn (N): gln; his; asp; lys; arg gln

Asp (D): glu; asn glu

Cys (C): ser; ala ser

Gln (Q): asn; glu asn

Glu (E): asp; gln asp

Gly (G): ala ala

His (H): asn; gln; lys; arg arg

lle (l): leu; val; met; ala; phe; norleucina leu

Leu (L): norleucina; ile; val; met; ala; phe ile

Lys (K): arg; gln; asn arg

Met (M): leu; phe; ile leu

Phe (F): leu; val; ile; ala; tyr tyr

Pro (P): ala ala

Ser (S): thr; cys cys

Thr (T): ser ser

Trp (W): tyr; phe tyr

Tyr (Y): trp; phe; thr; ser phe

Val (V): ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu

[0083] Se realizan modificaciones sustanciales en las propiedades biologicas del peptido/polipeptido mediante la seleccion de sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de: (a) la estructura del esqueleto del polipeptido en el area de la sustitucion, por ejemplo, en conformacion de lamina o de helice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molecula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos naturales se dividen en grupos basandose en las propiedades comunes de las cadenas laterales:

(1): hidrofobicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2): hidrofilicos neutros: cys, ser, thr;

(3): acidos: asp, glu;

(4): basicos: asn, gln, his, lys, arg;

(5): residuos que influyen sobre la orientacion de la cadena: gly, pro, y

(6): aromaticos: trp, tyr, phe.

[0084] Las sustituciones no conservativas implicaran intercambiar un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase.

[0085] Las variantes de moduladores de anticuerpo tambien se pueden producir en base a informacion conocida en el sector, sin afectar sustancialmente a la actividad del anticuerpo. Por ejemplo, las variantes de anticuerpo pueden tener por lo menos un residuo de aminoacido en la molecula de anticuerpo sustituida por un residuo diferente. Para los anticuerpos, los puntos de mayor interes para la mutagenesis de sustitucion incluyen generalmente las regiones hipervariables, pero tambien se contemplan las alteraciones de la region de armazon (FR).

[0086] Para los anticuerpos, un tipo de variante por sustitucion implica la sustitucion de uno o mas residuos de la region hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la variante o variantes resultantes seleccionadas para el desarrollo posterior tendran propiedades biologicas mejoradas en relacion al anticuerpo parental del cual se generan. Una manera conveniente para generar dichas variantes por sustitucion implica la maduracion para afinidad utilizando la expresion en fagos. Brevemente, se mutan varios sitios de la region hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones de aminoacidos en cada sitio. Los anticuerpos generados de esta manera se expresan a partir de particulas de fagos filamentosos como fusiones al producto del gen lll de M13 empaquetada en cada particula. A continuacion, las variantes expresadas en el fago se criban por su actividad biologica (por ejemplo, afinidad de union) tal como se describe aqui. Con el fin de identificar los sitios candidatos de la region hipervariable para la modificacion, se puede aplicar la mutagenesis por rastreo de alanina para identificar residuos de la region hipervariable que contribuyen significativamente a la union a antigeno. Alternativamente, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura del cristal del complejo antigeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antigeno. Dichos residuos de contacto y residuos proximos son candidatos para la sustitucion segun las tecnicas elaboradas aqui. Una vez se generan dichas variantes, el panel de variantes se somete a cribado tal como se describe aqui y se pueden seleccionar anticuerpos con propiedades superiores en uno o mas ensayos pertinentes para un desarrollo posterior.

[0087] Las moleculas de acido nucleico que codifican las variantes en la secuencia de aminoacidos del anticuerpo se preparan mediante una serie de procedimientos conocidos en la tecnica. Estos procedimientos incluyen, pero sin limitacion, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes en las secuencias de aminoacidos naturales)

o la preparacion por mutagenesis mediada por oligonucleotidos (o dirigida de sitio), la mutagenesis de PCR y la mutagenesis de cassette de una variante preparada anteriormente o una version no variante del anticuerpo.

[0088] Puede ser deseable introducir una o mas modificaciones de aminoacidos en una region Fc de polipeptidos inmunoglobulina de la invencion, generando de este modo una variante de la region Fc. La variante de la region Fc puede comprender una secuencia de la region Fc humana (por ejemplo, una region Fc de lgG1, lgG2, lgG3 o lgG4 humana) que comprende una modificacion de aminoacido (por ejemplo, una sustitucion) en una o mas posiciones de aminoacidos que incluyen la de una cisteina bisagra.

[0089] En una realizacion, la variante de la region Fc puede mostrar una afinidad de union al receptor de Fc neonatal alterada (FcRn). Dichas regiones Fc variantes pueden comprender una modificacion de aminoacido en alguna o mas de las posiciones de aminoacido 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 o 447 de la region Fc, en la que la numeracion de los residuos en la region Fc es la del indice EU como en Kabat. Las variantes de la region Fc con union reducida a un FcRn pueden comprender una modificacion de aminoacido en alguna o mas de las posiciones de aminoacido 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 o 447 de la region Fc, en la que la numeracion de los residuos en la region Fc es la del indice EU como en Kabat. Como alternativa, las variantes de la region Fc mencionadas anteriormente pueden mostrar una union incrementada a FcRn y comprenden una modificacion de aminoacido en alguna o mas de las posiciones de aminoacido 238, 256,

265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434 de la region Fc, en la que la numeracion de los residuos en la region Fc es la del indice EU como en Kabat.

[0090] La variante de la region Fc con una union reducida a un FcyR puede comprender una modificacion de aminoacido en alguna o mas de las posiciones de aminoacido 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 o 439 de la region Fc, en la que la numeracion de los residuos en la region Fc es la del indice EU como en Kabat.

[0091] Por ejemplo, la variante de la region Fc puede mostrar una union reducida a un FcyRl y comprende una modificacion de aminoacido en alguna o mas de las posiciones de aminoacido 238, 265, 269, 270, 327 o 329 de la region Fc, en la que la numeracion de los residuos en la region Fc es la del indice EU como en Kabat.

[0092] La variante de la region Fc puede mostrar una union reducida a un FcyRlll y comprende una modificacion de aminoacido en alguna o mas de las posiciones de aminoacido 238, 265, 269, 270, 292, 294, 295, 298, 303, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 o 439 de la region Fc, en la que la numeracion de los residuos en la region Fc es la del indice EU como en Kabat.

[0093] La variante de la region Fc de interes puede mostrar una union reducida a un FcyRlll y comprende una modificacion de aminoacido en una o mas de las posiciones de aminoacido 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 322, 327, 329, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 o 437 de la region Fc, en la que la numeracion de los residuos en la region Fc es la del indice EU como en Kabat.

[0094] Las variantes de la region de Fc con una union a Clq y/o Citotoxicidad Dependiente de Complemento (CDC) alteradas (es decir, aumentada o disminuida) se describen en el documento WO99/51642. Dichas variantes pueden comprender una sustitucion de aminoacido en una o mas de las posiciones de aminoacidos 270, 322, 326, 327, 329, 331, 333 o 334 de la region Fc. Vease tambien, Duncan & Winter Nature 322: 738-40 (1988); patente de Estados Unidos No. 5.648.260; patente de Estados Unidos No. 5.624.821; y WO94/29351 referente a las variantes de la region Fc.

Construccion de vectores

[0095] Las secuencias de polinucleotidos que codifican los peptidos/polipeptidos descritos en este documento pueden obtenerse usando tecnicas recombinantes convencionales. Las secuencias de polinucleotidos deseadas pueden aislarse y secuenciarse a partir de celulas fuente apropiadas. Las celulas fuente para anticuerpos incluirian celulas productoras de anticuerpos, tales como celulas de hibridoma. Como alternativa, pueden sintetizarse polinucleotidos usando un sintetizador de nucleotidos o tecnicas de PCR. Una vez obtenidas, las secuencias que codifican las inmunoglobulinas se insertan en un vector recombinante capaz de replicar y expresar polinucleotidos heterologos en una celula huesped. Muchos vectores que estan disponibles y se conocen en el sector pueden usarse para los fines de la presente invencion. La seleccion de un vector apropiado dependera principalmente del tamano de los acidos nucleicos a insertar en el vector y la celula huesped particular a transformar con el vector. Cada vector contiene diversos componentes, dependiendo de su funcion (amplificacion o expresion de polinucleotido heterologo, o ambos) y su compatibilidad con la celula huesped particular en la que reside. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero sin limitacion: un origen de replicacion (en particular cuando el vector se inserta en una celula procariota), un gen marcador de seleccion, un promotor, un punto de union al ribosoma (RBS), una secuencia senal, el inserto de acido nucleico heterologo y una secuencia de terminacion de la transcripcion.

[0096] En general, los vectores plasmidicos que contienen secuencias de replicon y de control que se obtienen de una especie compatible con la celula huesped se usan junto con estos huespedes. El vector habitualmente tiene un sitio de replicacion, asi como secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar una seleccion fenotipica en celulas transformadas. Por ejemplo, E. coli se transforma habitualmente usando pBR322, un plasmido obtenido de una especie de E. coli. pBR322 contiene genes que codifican resistencia a ampicilina (Amp) y tetraciclina (Tet) y, por lo tanto, proporciona medios sencillos para identificar celulas transformadas. pBR322, sus derivados, u otros plasmidos microbianos o bacteriofago tambien pueden contener, o modificarse para contener, promotores que pueden ser usados por el organismo microbiano para la expresion de proteinas endogenas.

[0097] Ademas, se pueden utilizar vectores de fagos que contienen secuencias de replicon y de control que son compatibles con el microorganismo huesped, como vectores transformantes junto con estos huespedes. Por ejemplo, pueden utilizarse bacteriofagos tales como λGEM.TM.-11 para preparar un vector recombinante que puede usarse para transformar celulas huesped susceptibles, tales como E. coli LE392.

[0098] En la presente invencion pueden utilizarse promotores constitutivos o inducibles, segun las necesidades de una situacion particular, que puede ser evaluada por un experto en la materia. Se conoce un gran numero de promotores reconocidos por diversas celulas huesped potenciales. El promotor seleccionado puede estar unido de forma operativa al ADN cistron que codifica un polipeptido descrito en este documento extrayendo el promotor del

ADN fuente mediante digestion con enzimas de restriccion e insertando la secuencia promotora aislada en el vector de eleccion. Pueden usarse la secuencia promotora nativa y muchos promotores heterologos para dirigir la amplificacion y/o expresion de los genes diana. Sin embargo, se prefieren promotores heterologos, puesto que generalmente permiten una mayor transcripcion y mayores rendimientos del gen diana expresado en comparacion con el promotor polipeptidico diana nativo.

[0099] Los promotores adecuados para su uso con huespedes procariotas incluyen el promotor PhoA, los sistemas promotores de β-galactamasa y lactosa, un sistema promotor de triptofano (trp) y promotores hibridos, tales como el promotor tac o trc. Sin embargo, otros promotores que son funcionales en bacterias (tales como otros promotores bacterianos o de fagos conocidos) tambien son adecuados. Sus secuencias nucleotidicas se han publicado, con lo que se permite a un experto en la materia unirlas de forma operativa a cistrones que codifican las cadenas ligera y pesada diana (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269) usando enlazadores o adaptadores para suministrar cualquier sitio de restriccion requerido.

[0100] En algunas realizaciones, cada cistron en un vector recombinante comprende una componente de secuencia senal de secrecion que dirige la translocacion de los polipeptidos expresados a traves de una membrana. En general, la secuencia senal puede ser un componente del vector, o puede formar parte del ADN del polipeptido diana que se inserta en el vector. La secuencia senal seleccionada para los fines de la presente invencion debe ser una que sea reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa senal) por la celula huesped. Para celulas huesped procariotas que no reconocen ni procesan las secuencias senal nativas para los polipeptidos heterologos, la secuencia senal es sustituida por una secuencia senal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo que consiste en fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp, o secuencias lideres de enterotoxina ll termoestable (STll), LamB, PhoE, PelB, OmpA y MBP.

[0101] Las celulas huesped procariotas adecuadas para expresar polipeptidos incluyen Arqueobacterias y Eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos. Los ejemplos de bacterias utiles incluyen Escherichia (por ejemplo, E. coli), Bacilos (por ejemplo, B. subtilis), Enterobacteria, especies de Pseudomonas (por ejemplo, P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, o Paracoccus. Preferentemente, se usan celulas gram-negativas. Preferentemente la celula huesped debe secretar cantidades minimas de enzimas proteoliticas, y de manera deseable pueden incorporarse inhibidores de proteasa adicionales en el cultivo celular

Produccion de peptidos/polipeptidos

[0102] Las celulas huesped se transforman o transfectan con los vectores de expresion descritos anteriormente y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados segun sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

[0103] Transfeccion se refiere la captacion de un vector de expresion por una celula huesped, se expresen o no de cualquier secuencia codificante. El experto en la materia conoce muchos metodos de transfeccion, por ejemplo, precipitacion con CaPO4 y electroporacion. La transfeccion con exito se reconoce generalmente cuando cualquier indicacion del funcionamiento de este vector se produce en la celula huesped.

[0104] Transformacion significa introducir ADN en el huesped procariota, de modo que el ADN sea replicable, como un elemento extracromosomico o mediante un integrante del cromosoma. Dependiendo de la celula huesped usada, la transformacion se realiza usando tecnicas convencionales apropiadas para dichas celulas. El tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio se usa generalmente para celulas bacterianas que contienen barreras de la pared celular sustanciales. Otro metodo de transformacion emplea polietilenglicol/DMSO. Otra tecnica usada es la electroporacion.

[0105] Las celulas procariotas usadas para producir los peptidos/polipeptidos de la invencion se cultivan en medios conocidos en el sector y adecuados para el cultivo de las celulas huesped seleccionadas. Los ejemplos de medios adecuados incluyen caldo luria (LB) mas suplementos de nutrientes necesarios. En realizaciones preferidas, el medio tambien contiene un agente de seleccion, seleccionado en base a la construccion del vector de expresion, para permitir de forma selectiva el crecimiento de celulas procariotas que contienen el vector de expresion. Por ejemplo, se anade ampicilina a los medios para el cultivo de celulas que expresan un gen de resistencia a ampicilina.

[0106] Tambien pueden incluirse cualquier suplemento necesario, ademas de fuentes de carbono, nitrogeno, y fosfato inorganico, a concentraciones apropiadas introducidas en solitario o en forma de mezcla con otro suplemento

o medio, tal como una fuente compleja de nitrogeno. Opcionalmente, el medio de cultivo puede contener uno o mas agentes reductores seleccionados del grupo que consiste en glutation, cisteina, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol y ditiotreitol.

[0107] Las celulas huesped procariotas se cultivan a temperaturas adecuadas. Para el cultivo de E. coli, por ejemplo, la temperatura preferida varia entre aproximadamente 20'C y aproximadamente 39'C, mas

preferentemente entre aproximadamente 25'C y aproximadamente 37'C, aun mas preferentemente a aproximadamente 30'C. El pH del medio puede ser cualquier pH que varia entre aproximadamente 5 y aproximadamente 9, dependiendo principalmente del organismo huesped. Para E. coli, el pH esta preferentemente entre aproximadamente 6,8 y aproximadamente 7,4, y mas preferentemente aproximadamente 7,0.

[0108] Si se usa un promotor inducible en el vector de expresion, se induce la expresion de proteinas en condiciones adecuadas para la activacion del promotor. Por ejemplo, si se usa un promotor PhoA para controlar la transcripcion, las celulas huesped transformadas pueden cultivarse en un medio limitante de fosfato para la induccion. Pueden usarse diversos inductores diferentes, segun la construccion de vector empleada, tal como se conoce en el sector.

[0109] Los peptidos/polipeptidos descritos en este documento expresados en un microorganismo pueden secretarse en y recuperarse del periplasma de las celulas huesped. La recuperacion de proteinas habitualmente implica romper los microorganismos, generalmente mediante medios tales como choque osmotico, sonicacion o lisis. Una vez que se han roto las celulas, los restos celulares o las celulas completas pueden extraerse mediante centrifugado o filtracion. Las proteinas pueden purificarse adicionalmente, por ejemplo, mediante cromatografia de afinidad en resina. Como alternativa, las proteinas pueden transportarse al medio de cultivo y aislarse de este. Las celulas pueden extraerse del cultivo y el sobrenadante del cultivo puede filtrarse y concentrarse para una purificacion adicional de las proteinas producidas. Los polipeptidos expresados pueden aislarse e identificarse adicionalmente usando metodos conocidos habitualmente, tales como fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o intercambio ionico; precipitacion con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografia en silice o en una resina de intercambio cationico, tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitacion con sulfato de amonio; filtracion en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; resinas de afinidad hidrofobica, afinidad de ligando usando un antigeno adecuado inmovilizado en una matriz y ensayo de transferencia Western.

[0110] Ademas de las celulas huesped procariotas, los sistemas de celulas huesped eucariotas tambien estan bien establecidos en el sector. Los huespedes adecuados incluyen lineas celulares de mamifero, tales como CHO, y celulas de insecto, tales como las que se describen posteriormente.

Purificacion de peptidos/polipeptidos

[0111] Los peptidos/polipeptidos que se producen pueden purificarse para obtener preparaciones que son sustancialmente homogeneas para ensayos y usos adicionales. Pueden emplearse metodos convencionales de purificacion de proteinas conocidos en el sector. Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificacion adecuados: fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o intercambio ionico, precipitacion con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografia en silice o en una resina de intercambio cationico, tal como DEAE, cromatoenfoque, SDS-PAGE, precipitacion con sulfato de amonio, y filtracion en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75.

Metodos de la invencion

[0112] La invencion proporciona diversos metodos basados en el descubrimiento de que mutaciones en ciertas regiones de la cadena β de HGF dan lugar a la modificacion de las actividades biologicas de la molecula, mediante lo cual dichas moleculas mutantes muestran efectos antagonicos en la modulacion de la ruta de HGF/Met.

[0113] Pueden utilizarse diversas sustancias o moleculas (incluyendo peptidos/polipeptidos, etc.) como agentes terapeuticos segun los metodos descritos en el presente documento. Estas sustancias o moleculas pueden formularse segun metodos conocidos para preparar composiciones farmaceuticamente utiles, mediante los cuales el producto de estas se combina en una mezcla con un vehiculo portador farmaceuticamente aceptable. Se preparan formulaciones terapeuticas para el almacenamiento mezclando el principio activo que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizantes fisiologicamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edicion, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables no son toxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones, tales como fosfato, citrato y otros acidos organicos; antioxidantes, incluyendo acido ascorbico; polipeptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteinas, tales como albumina del suero, gelatina o inmunoglobulinas; polimeros hidrofilos, tales como polivinilpirrolidona, aminoacidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacaridos, disacaridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azucar, tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; y/o tensioactivos no ionicos, tales como TWEENTT, PLURONlCST o PEG.

[0114] Las formulaciones a usar para administracion in vivo deben ser esteriles. Esto se consigue facilmente mediante filtracion a traves de membranas de filtracion esteriles, antes o despues de la liofilizacion y reconstitucion.

[0115] Las composiciones terapeuticas en este documento generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso esteril, por ejemplo, una bolsa o vial de solucion intravenosa que tiene un tapon perforable por una aguja de inyeccion hipodermica.

[0116] La via de administracion es segun metodos conocidos, por ejemplo inyeccion o infusion mediante las vias intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial o intralesional, administracion topica

o mediante sistemas de liberacion sostenida.

[0117] Las dosificaciones y concentraciones de farmacos deseadas de composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden variar dependiendo del uso particular previsto. La determinacion de la dosificacion o via de administracion apropiada esta al alcance de un medico especialista. Los experimentos en animales proporcionan unan guia fiable para la determinacion de dosis eficaces para terapia humana. El escalado entre especies de dosis eficaces puede realizarse siguiendo los principios expuestos por Mordenti, J. y Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" en Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, Nueva York 1989, pags. 42-96.

[0118] Cuando se emplea la administracion in vivo de una sustancia o molecula de la invencion, las cantidades de dosificacion normales pueden variar entre aproximadamente 10 ng/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal de mamifero o mas al dia, preferentemente de aproximadamente 1 Ig/kg/dia a 10 mg/kg/dia, dependiendo de la via de administracion. En la bibliografia se proporciona una guia sobre dosificaciones y metodos de administracion particulares; vease, por ejemplo, patentes de Estados Unidos N°. 4.657.760; 5.206.344; o 5.225.212. Se anticipa que diferentes formulaciones seran eficaces para diferentes compuestos de tratamiento y diferentes trastornos, que la administracion dirigida a un organo o tejido, por ejemplo, puede requerir la administracion de una manera diferente de la dirigida a otro organo o tejido.

[0119] Cuando se desea la administracion de liberacion sostenida de una sustancia o molecula en una formulacion con caracteristicas de liberacion adecuadas para el tratamiento de cualquier enfermedad o trastorno que requiere la administracion de la sustancia o molecula, se contempla la microencapsulacion de la sustancia o molecula. La microencapsulacion de proteinas recombinantes para liberacion sostenida se ha realizado con exito con hormona del crecimiento humana (rhGH), interferon- (rhlFN-), interleuquina-2, y MN rgp120. Johnson et al., Nat. Med., 2:795799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology, 8:755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single lmmunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems," en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pag. 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072,WO 96/07399; y patente de Estados Unidos No. 5,654,010.

[0120] Las formulaciones de liberacion sostenida de estas proteinas se desarrollaron usando polimero de acido polilactico-coglicolico (PLGA) debido a su biocompatibilidad y amplia gama de propiedades biodegradables. Los productos de degradacion de PLGA, acidos lactico y glicolico, pueden eliminarse rapidamente del cuerpo humano. Ademas, la degradabilidad de este polimero puede ajustarse de meses a anos dependiendo de su peso molecular y composicion. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," en: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: Nueva York, 1990), pags. 1-41.

[0121] La identificacion de regiones en la cadena de HGF que son criticas para la funcion de HGF en la ruta de senalizacion de HGF/Met proporciona sitios en la cadena de HGF contra los que se pueden dirigir los antagonistas. Ejemplos de potenciales antagonistas incluyen un oilgonucleotido (que puede ser un aptamero) que se une al extremo N-terminal y/o regiones de dimerizacion de la cadena de HGF y, en particular, anticuerpos que incluyen, sin limitacion, anticuerpos policlonales y monoclonales y fragmentos de anticuerpo, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos antiidiotipicos, y versiones quimericas o humanizadas de dichos anticuerpos o fragmentos, asi como anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos. Los aptameros son moleculas de acido nucleico que son capaces de unirse a una molecula diana. La generacion y uso terapeutico de aptameros estan bien establecidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 5.475.096, y la eficacia terapeutica de Macugen® (Eyetech, Nueva York) para tratar la degeneracion macular relacionada con la edad.

[0122] Tal como se describe en este documento, una sustancia/molecula antagonista de HGF/Met puede ser un peptido o polipeptido (incluyendo un anticuerpo). Los metodos para obtener dichos peptidos y polipeptidos se conocen bien en el sector, e incluyen cribar bibliotecas de peptidos y polipeptidos para enlazantes a un antigeno diana adecuado. En un ejemplo, los antigenos diana adecuados comprenderian la cadena β de HGF (o una parte de la misma que comprende la region N-terminal y/o la region de dimerizacion), que se describe con detalle en este documento. En un ejemplo, los antigenos diana adecuados comprenderian Met, por ejemplo, el dominio extracelular de Met. Las bibliotecas de peptidos y polipeptidos son conocidos en el sector y tambien se pueden preparar segun los metodos del sector. Vease, por ejemplo, Clark et al., patentes de Estados Unidos Nos. 6.121.416; y Garrard et al., 5.750.373, 5.733.743, 5.837.242, 5.969.108, 6.172.197, 5.580.717, y 5.658.727. Las bibliotecas de peptidos y polipeptidos fusionadas a un componente de proteina heterologa, tal como una proteina de la envuelta de un fago, se conocen bien en el sector, por ejemplo, como se describe en Clark et al. y Garrard et al., supra. Las variantes de un primer enlazador peptidico o polipeptidico pueden generarse cribando mutantes del peptido o polipeptido para obtener las caracteristicas de interes (por ejemplo, potenciar la afinidad de union a la diana, farmacocinetica potenciada, toxicidad reducida, indice terapeutico mejorado, etc.). Por ejemplo, una caracteristica de interes puede ser la capacidad de unirse a Met, pero una capacidad reducida de activar actividades biologicas relacionadas con HGF activado, tales como proliferacion celular, fosforilacion de Met, migracion celular y angiogenesis. Las tecnicas

de mutagenesis se conocen bien en el sector y las regiones para la mutacion estarian dentro de la cadena de HGF, en particular posiciones asociadas con la insercion N-terminal de la cadena de HGF y/o la dimerizacion cadena -cadena �, tal como se describe en el presente documento. Ademas, las tecnicas de mutagenesis de barrido (tales como las que se basan en barrido de alanina) pueden ser especialmente utiles para evaluar la importancia estructural y/o funcional de los residuos de aminoacidos individuales en un peptido o polipeptido.

[0123] La determinacion de la capacidad de una sustancia/molecula candidata de la invencion para modular la senalizacion de HGF/c-met y/o actividades biologicas asociadas con dicha senalizacion, puede realizarse analizando la capacidad moduladora de la sustancia/molecula en ensayos in vitro o in vivo, que estan bien establecidos en el sector, por ejemplo, como se describe en Okigaki et al., supra; Matsumoto et al., supra; Date et al., FEBS Let. (1997), 420:1-6; Lokker et al., supra; Hartmann et al., supra; Kirchhofer et al., J Biol. Chem. (2004), 279:39915-24; Stamos et al. (2004) EMBO J. 23: 2325-35; Kirchhofer et al., FEBS Lett. (2005) 579: 1945-50; y Nakatsu et al. (Microvasc.Res. 66: 102,2003).

Anticuerpos contra cadena �de HGF

[0124] El presente documento describe metodos que comprenden el uso de anticuerpos. Los anticuerpos de ejemplo incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecificos y heteroconjugados.

1.: Anticuerpos policlonales

[0125] Los anticuerpos pueden comprender anticuerpos policlonales. Los metodos de preparacion de anticuerpos policlonales son conocidos por los expertos en la materia. Pueden generarse anticuerpos policlonales en un mamifero, por ejemplo, mediante una o mas inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Habitualmente, el agente inmunizante y/o adyuvante se inyectara en el mamifero mediante multiples inyecciones subcutaneas o intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir una cadena β de HGF activada (o una parte de la misma) o una proteina de fusion de la misma. Puede ser util conjugar el agente inmunizante a una proteina que se sabe que es inmunogena en el mamifero que se inmuniza. Los ejemplos de dichas proteinas inmunogenas incluyen, pero sin limitacion, hemocianina de lapa californiana, albumina de suero, tiroglobulina bovina, e inhibidor de tripsina de soja. Los ejemplos de adyuvantes que pueden emplearse incluyen adyuvante completo de Freund y adyuvante MPL-TDM (monofosforil lipido A, trehalosa dicorinomicolato sintetico). El protocolo de inmunizacion puede seleccionarse por un experto en la materia sin gran experimentacion.

2.: Anticuerpos monoclonales

[0126] Los anticuerpos pueden ser, como alternativa, anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando metodos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256: 495 (1975). En un metodo de hibridoma, un raton, hamster, u otro huesped animal apropiado, se inmuniza habitualmente con un agente inmunizante para generar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se uniran especificamente al agente inmunizante. Como alternativa, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro.

[0127] El agente inmunizante incluira habitualmente la cadena β de HGF (o una parte de la misma) o una proteina de fusion de la misma. Generalmente, se usan linfocitos de la sangre periferica ("PBL"), si se desean celulas de origen humano, o se usan celulas del bazo o celulas de ganglios linfaticos si se desean fuentes de mamifero de origen no humano. Los linfocitos se fusionan a continuacion con una linea celular inmortalizada usando un agente de fusion adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una celula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pags. 59-103]. Las lineas celulares inmortalizadas son habitualmente celulas de mamifero transformadas, particularmente celulas de mieloma de origen de roedor, bovino y humano. Habitualmente, se emplean lineas celulares de mieloma de rata o raton. Las celulas de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contiene una o mas sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las celulas no fusionadas inmortalizadas. Por ejemplo, si las celulas parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas habitualmente incluira hipoxantina, aminopterina, y timidina ("medio HAT"), sustancias que impiden el crecimiento de celulas deficientes en HGPRT.

[0128] Las lineas celulares inmortalizadas preferidas son las que se fusionan eficazmente, soportan una expresion estable a nivel elevado de anticuerpo por las celulas productoras de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Las lineas celulares inmortalizadas mas preferidas son lineas de mieloma murinas, que pueden obtenerse, por ejemplo, a partir del Salk lnstitute Cell Distribution Center, San Diego, California y la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Las lineas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de raton-humano tambien se han descrito para la produccion de anticuerpos humanos monoclonales [Kozbor, J. lmmunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, lnc., Nueva York, (1987) pags. 51-63].

[0129] A continuacion puede analizarse la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra la cadena β de HGF en el medio de cultivo en el que las celulas de hibridoma se cultivan. Preferentemente, la especificidad de

union de anticuerpos monoclonales producidos por las celulas de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitacion o mediante un ensayo de union in vitro, tal como radioinmunoensayo (RlA) o ensayo inmunoadsorbente ligado a enzima (ELlSA). Dichas tecnicas y ensayos se conocen en el sector. La afinidad de union del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el analisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980).

[0130] Una vez que las celulas de hibridoma deseadas se han identificado, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilucion limitante y cultivarse mediante metodos convencionales [Goding, supra]. Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio Eagle modificado por Dulbecco y medio RPMl-1640. Como alternativa, las celulas de hibridoma pueden cultivarse in vivo como ascitis en un mamifero.

[0131] Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse o purificarse a partir del medio de cultivo o liquido ascitico mediante procedimientos de purificacion de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, proteina A-Sefarosa, cromatografia en hidroxilapatita, electroforesis en gel, dialisis o cromatografia de afinidad.

[0132] Los anticuerpos monoclonales tambien pueden prepararse mediante metodos de ADN recombinantes, tales como los descritos en la patente de Estados Unidos N° 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invencion puede aislarse y secuenciarse facilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleotidos que son capaces de unirse especificamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las celulas de hibridoma de la invencion sirven como fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresion, que a continuacion se transfectan en celulas huesped, tales como celulas COS de simio, celulas de Ovario de Hamster Chino (CHO), o celulas de mieloma que de otro modo no producirian proteina inmunoglobulina, para obtener la sintesis de anticuerpos monoclonales en las celulas huesped recombinantes. El ADN tambien puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de dominios constantes de cadena pesada y ligera humana por las secuencias homologas murinas [patente de Estados Unidos N° 4.816.567; Morrison et al., supra] o mediante la union covalente a la secuencia codificante de inmunoglobulina de toda o parte de la secuencia que codifica un polipeptido no de inmunoglobulina. Dicho polipeptido no de inmunoglobulina puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo de la invencion, o puede sustituirse por los dominios variables de un punto de combinacion con un antigeno de un anticuerpo de la invencion para crear un anticuerpo quimerico bivalente.

[0133] Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los metodos para preparar anticuerpos monovalentes se conocen bien en el sector. Por ejemplo, un metodo implica la expresion recombinante de cadena ligera de inmunoglobulina y cadena pesada modificada. La cadena pesada se trunca generalmente en cualquier punto en la region Fc para impedir la reticulacion de la cadena pesada. Como alternativa, los residuos de cisteina relevantes se sustituyen por otro residuo de aminoacido o se eliminan para impedir la reticulacion.

[0134] Los metodos in vitro tambien son adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestion de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente, fragmentos Fab, puede conseguirse usando tecnicas rutinarias conocidas en el sector.

[0135] Tambien pueden generarse anticuerpos cribando bibliotecas de expresion en fagos para anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que se unen con afinidad adecuada/deseable a la cadena β de HGF (o equivalente). Dichas tecnicas se conocen bien en el sector, por ejemplo, tal como se describen en las patentes de Estados Unidos N°. 5.750.373; 5.780.279; 5.821.047; 6.040.136; 5.427.908; 5.580.717, y referencias en esos documentos.

3. Anticuerpos humanos y humanizados

[0136] Los anticuerpos contra la cadena β de HGF pueden comprender ademas anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quimericas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos de union al antigeno) que contienen una minima secuencia obtenida de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que residuos de una region determinante de la complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donador), tal como raton, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos del armazon Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados tambien pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias CDR o de armazon importadas. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todos de por lo menos uno, y habitualmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado tambien comprendera de forma optima por lo menos una parte de una region constante de inmunoglobulina (Fc), habitualmente la de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)].

[0137] Los metodos para humanizar anticuerpos no humanos son conocidos en el sector. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o mas residuos de aminoacidos introducidos en el mismo de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoacidos no humanos a menudo se denominan como residuos "importados", que habitualmente se toman de un dominio variable "importado". La humanizacion puede realizarse esencialmente siguiendo el metodo de Winter y colaboradores [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature,

332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)], sustituyendo CDR o secuencias de CDR de roedor por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quimericos (Patente de Estados Unidos N° 4.816.567), donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la practica, los anticuerpos humanizados son habitualmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR son sustituidos por residuos de puntos analogos en anticuerpos de roedor.

[0138] Los anticuerpos humanos tambien pueden producirse usando diversas tecnicas conocidas en el sector, incluyendo bibliotecas de expresion en fagos [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)]. Las tecnicas de Cole et al., y Boerner et al., tambien estan disponibles para la preparacion de anticuerpos humanos monoclonales (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) y Boerner et al., J. lmmunol., 147(1):86-95 (1991)]. Analogamente, pueden prepararse anticuerpos humanos mediante la introduccion de loci de inmunoglobulina humana en animales transgenicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endogenos se han inactivado parcial o completamente. Despues de la estimulacion, se observa la produccion de anticuerpos humanos, que se parece mucho a la observada en seres humanos en todos los aspectos, incluyendo la reordenacion genica, el ensamblaje, y el repertorio de anticuerpos. Esta estrategia se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N° 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y en las siguientes publicaciones cientificas: Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg y Huszar, lntern. Rev. lmmunol. 13 65-93 (1995).

[0139] Los anticuerpos tambien pueden madurar su afinidad usando metodos de seleccion y/o mutagenesis conocidos, como se ha descrito anteriormente. Los anticuerpos de afinidad madurada preferidos tienen una afinidad que es cinco veces, mas preferentemente 10 veces, aun mas preferentemente 20 o 30 veces mayor que el anticuerpo de partida (generalmente murino, humanizado o humano) a partir del cual se prepara el anticuerpo madurado.

4. Anticuerpos biespecificos

[0140] Los anticuerpos biespecificos son anticuerpos monoclonales, preferentemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de union por al menos dos antigenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de union es por la cadena β de HGF, la otra es por cualquier otro antigeno, y preferentemente por una proteina o receptor o subunidad receptora de la superficie celular.

[0141] Los metodos para preparar anticuerpos biespecificos se conocen en el sector. Tradicionalmente, la produccion recombinante de anticuerpos biespecificos se basa en la coexpresion de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades [Milstein y Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)]. Debido a la variedad aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moleculas de anticuerpo diferentes, de las que solamente una tiene la estructura biespecifica correcta. La purificacion de la molecula correcta se realiza habitualmente mediante etapas de cromatografia de afinidad. En el documento WO 93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991) se describen procedimientos similares.

[0142] Los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de union deseadas (puntos de combinacion de anticuerpo-antigeno) pueden fusionarse a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusion preferentemente es con un domino constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de las regiones bisagra, CH2, y CH3. Se prefiere tener la primera region constante de cadena pesada (CH1) que contiene el punto necesario para la union a la cadena ligera, presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresion diferentes, y se cotransfectan en un organismo huesped adecuado. Para mas detalles de la generacion de anticuerpos biespecificos vease, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).

[0143] Segun otra estrategia descrita en el documento WO 96/27011, el interfaz entre un par de moleculas de anticuerpo puede manipularse para maximizar el porcentaje de heterodimeros que se recuperan del cultivo de celulas recombinantes. El interfaz preferido comprende por lo menos una parte de la region CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este metodo, una o mas pequenas cadenas laterales de aminoacidos del interfaz de la primera molecula de anticuerpo se sustituyen por cadenas laterales mas grandes (por ejemplo tirosina o triptofano).

Se crean "cavidades" compensatorias de tamano identico o similar a la cadena o cadenas laterales grandes en el interfaz de la segunda molecula de anticuerpo sustituyendo grandes cadenas laterales de aminoacidos por otras mas pequenas (por ejemplo alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar la produccion del heterodimero sobre otros productos finales no deseados, tales como homodimeros.

[0144] Los anticuerpos biespecificos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo anticuerpos biespecificos F(ab')2). Las tecnicas para generar anticuerpos biespecificos a partir de fragmentos de anticuerpo se han descrito en la bibliografia. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos biespecificos usando un enlace quimico. Brennan et al., Science 229: 81 (1985) describen un procedimiento en el que anticuerpos intactos se escinden proteoliticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol, arsenito sodico, para estabilizar ditioles vecinales e impedir la formacion de puentes disulfuro intermoleculares. Los Fragmentos Fab' generados se convierten a continuacion en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'-TNB se reconvierte a continuacion en Fab'-tiol mediante reduccion con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecifico. Los anticuerpos biespecificos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilizacion selectiva de enzimas.

[0145] Los fragmentos Fab' pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse quimicamente para formar anticuerpos biespecificos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) describen la produccion de una molecula de anticuerpo biespecifico completamente humanizado de F(ab')2. Cada fragmento Fab' se secreto por separado de

E. coli y se sometio a acoplamiento quimico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecifico. El anticuerpo biespecifico formado de este modo era capaz de unirse a celulas que sobreexpresan el receptor ErbB2 y celulas T humanas normales, asi como de desencadenar la actividad litica de linfocitos citotoxicos humanos contra dianas tumores de mama humanos.

[0146] Tambien se han descrito diversas tecnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpo biespecificos directamente del cultivo celular recombinante. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecificos usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. lmmunol. 148(5): 1547-1553 (1992). Los peptidos de la cremallera de leucina de las proteinas Fos y Jun se unieron a las partes Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusion genica. Los homodimeros del anticuerpo se redujeron en la region bisagra para formar monomeros y a continuacion se reoxidaron para formar los heterodimeros de anticuerpo. Este metodo tambien puede utilizarse para la produccion de homodimeros de anticuerpo. La tecnologia de "diacuerpos" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) proporciono un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpos biespecificos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Por consiguiente, se fuerza a los dominios VH y VL de un fragmento a emparejarse con los dominios complementarios VL y VH de otro fragmento, formando de este modo dos puntos de union al antigeno. Tambien se ha descrito otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpos biespecificos mediante el uso de dimeros Fv de cadena sencilla (sFv). Vease, Gruber et al., J. lmmunol. 152: 5368 (1994).

[0147] Se contemplan los anticuerpos con mas de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecificos. Tutt et al., J. lmmunol. 147:60 (1991).

[0148] Los anticuerpos biespecificos de ejemplo pueden unirse a dos epitopos diferentes en la cadena β de HGF o a un epitopo en la cadena β de HGF y a un epitopo en otro polipeptido (por ejemplo, c-met o cadena a de HGF).

5. Anticuerpos heteroconjugados

[0149] Los anticuerpos heteroconjugados tambien se describen en el presente documento. Los anticuerpos heteroconjugados se componen de dos anticuerpos unidos covalentemente. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir celulas del sistema inmune a celulas no deseadas [Patente de Estados Unidos N° 4.676.980], y para el tratamiento de infeccion por VlH [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]. Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vitro usando metodos conocidos en quimica de proteinas sinteticas, incluyendo los que implican agentes reticulantes. Por ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas usando una reaccion de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioeter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este fin incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los descritos, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N°

4.676.980.

6. Manipulacion de la funcion efectora

[0150] Puede ser deseable modificar el anticuerpo con respecto a la funcion efectora, para potenciar, por ejemplo, la eficacia del anticuerpo en el tratamiento de cancer. Por ejemplo, pueden introducirse un residuo o residuos de cisteina en la region Fc, permitiendo de este modo la formacion de puentes disulfuro intercatenarios en esta region. El anticuerpo homodimerico generado de este modo puede tener una capacidad de internalizacion mejorada y/o una mayor destruccion celular mediada por el complemento y mayor citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Vease Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, J. lmmunol., 148: 2918-2922 (1992).

Los anticuerpos homodimericos con actividad anti-tumoral aumentada tambien pueden prepararse usando reticulantes heterobifuncionales, tal como se describe en Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993). Como alternativa, puede disenarse un anticuerpo que tenga regiones Fc dobles y de este modo pueda tener capacidades potenciadas de lisis del complemento y ADCC. Vease Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989).

7. lnmunoconjugados

[0151] En el presente documento se describen inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotoxico, tal como un agente quimioterapeutico, toxina (por ejemplo, una toxina enzimaticamente activa de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isotopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).

[0152] Los agentes quimioterapeuticos utiles en la generacion de dichos inmunoconjugados se han descrito anteriormente. Entre las toxinas enzimaticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden usarse se incluyen cadena A de difteria, fragmentos activos no enlazantes de toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteinas de Aleurites fordii, proteinas de diantina, proteinas de Phytolaca americana (PAPl, PAPll, y PAPS), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos. Estan disponibles diversos radionucleidos para la produccion de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi, 131l, 131ln, 90Y, y 186Re. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotoxico se preparan usando diversos agentes de acoplamiento a proteinas bifuncionales, tales como Nsuccinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (lT), derivados bifuncionales de imidoesteres (tales como dimetil adipimidato HCL), esteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehidos (tales como glutaraldehido), compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como, 2,6-diisocianato de tolueno), y compuestos de fluor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina tal como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El acido 1isotiocianatobenzil-3-metildietilen triaminopentaacetico marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante de ejemplo para la conjugacion de radionucleotidos al anticuerpo. Vease el documentoW094/ 11026.

[0153] En otra realizacion, el anticuerpo puede conjugarse a un "receptor" (como estreptavidina) para la utilizacion en el prereconocimiento de tumores donde el conjugado de anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido de la retirada del conjugado no unido de la circulacion usando un agente de eliminacion y a continuacion la administracion de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga a un agente citotoxico (por ejemplo, un radionucleotido).

8. lnmunoliposomas

[0154] Los anticuerpos descritos en este documento tambien pueden formularse como inmunoliposomas. Se preparan liposomas que contienen el anticuerpo mediante metodos conocidos en el sector, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); y patente de Estados Unidos Nos. 4,485,045 y 4,544,545. Los liposomas con un tiempo de circulacion aumentado se describen en la patente de Estados Unidos N° 5.013.556.

[0155] Pueden generarse liposomas particularmente utiles mediante el metodo de evaporacion en fase inversa con una composicion de lipidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol, y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a traves de filtros de un tamano de poro definido para producir liposomas con el diametro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invencion pueden conjugarse a los liposomas, tal como se describe en Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) mediante una reaccion de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapeutico (tal como Doxorrubicina) esta contenido opcionalmente dentro del liposoma. Vease Gabizon et al., J. National Cancer lnst., 81(19); 1484 (1989).

9. Composiciones farmaceuticas de anticuerpos

[0156] Los anticuerpos pueden administrarse para el tratamiento de diversos trastornos en forma de composiciones farmaceuticas.

[0157] Si se usan anticuerpos completos como inhibidores, se prefieren anticuerpos de internalizacion. Sin embargo, tambien pueden usarse lipofecciones o liposomas para liberar anticuerpos de la invencion en celulas cuando esto sea deseable. Cuando se usan fragmentos de anticuerpo, se prefiere el fragmento inhibidor mas pequeno. Por ejemplo, en base a las secuencias de region variable de un anticuerpo, pueden disenarse moleculas de peptido o polipeptido que conservan su capacidad de unirse a la cadena β de HGF y/o interferir con la interaccion entre la cadena β de HGF y c-met. Dichos peptidos y polipeptidos pueden sintetizarse quimicamente y/o producirse mediante tecnologia de ADN recombinante. Vease, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993). La formulacion en este documento tambien puede contener mas de un compuesto activo segun sea necesario para la afeccion particular que se trata, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no

se afectan de forma adversa entre si. Como alternativa, o ademas, la composicion puede comprender un agente que potencia su funcion, tal como, por ejemplo, un agente citotoxico, citoquina, agente quimioterapeutico, o agente inhibidor del crecimiento. Dichas moleculas estan presentes adecuadamente en combinacion en cantidades que son eficaces para el fin pretendido.

[0158] Los principios activos tambien pueden estar atrapados en microcapsulas preparadas, por ejemplo, mediante tecnicas de coacervacion o mediante polimerizacion interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcapsulas de gelatina y microcapsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de liberacion de farmacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nanoparticulas, y nanocapsulas) o en macroemulsiones. Dichas tecnicas se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.

[0159] Las formulaciones para usar para administracion in vivo deben ser esteriles. Esto se consigue facilmente mediante filtracion a traves de membranas de filtracion esteriles.

[0160] Pueden prepararse preparaciones de liberacion sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberacion sostenida incluyen matrices semipermeables de polimeros hidrofobicos solidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices estan en forma de articulos conformados, por ejemplo, peliculas o microcapsulas. Los ejemplos de matrices de liberacion sostenida incluyen poliesteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato), o alcohol poli(vinilico), polilactidos (patente de Estados Unidos N°. 3.773.919), copolimeros de acido Lglutamico y γ-etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolimeros degradables de acido lacticoacido glicolico, tales como LUPRON DEPOTT (microesferas intyectables compuestas de copolimero de acido lactico-acido glicolico y acetato de leuprolido), y acido poli-D-(-)-3-hidroxibutirico. Mientras que polimeros tales como etileno-acetato de vinilo y acido lactico-acido glicolico permiten la liberacion de moleculas durante mas de 100 dias, algunos hidrogeles liberan proteinas durante periodos de tiempo mas cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un periodo largo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposicion a la humedad a 37'C, dando como resultadouna perdida de actividad biologicayposibles cambios de inmunogenicidad. Pueden disenarse estrategias racionales para la estabilizacion dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregacion es la formacion de puentes S-S intermoleculares a traves de intercambio tio-disulfuro, la estabilizacion puede conseguirse modificando residuos sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones acidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matriz polimerica especificas.

[0161] Los siguientes son ejemplos de los metodos y composiciones de la invencion. Se entiende que diversas realizaciones mas pueden ponerse en practica, dada la descripcion general proporcionada anteriormente.

EJEMPLOS

MATERlALES Y METODOS

[0162] Se generaron mutantes de HGF esencialmente tal como se describe en Kirchhofer et al., J Biol. Chem. (2004), 279:39915-24; Starnos et al. (2004) EMBO J. 23: 2325-35. Los ensayos de union a Met y migracion de celulas MDA-MB435 se realizaron utilizando reactivos y metodos tal como se describe en Kirchhofer et al., supra. y Stamos et al., supra. Los ensayos de fosforilacion de Met se llevaron acabo utilizando celulas A549 esencialmente tal como se describe en Kirchhofer et al., supra. La inhibicion de la fosforilacion de Met se llevo a cabo de manera similar, a excepcion de que se anadieron mutantes de HGF de una manera dependiente con la dosis para inhibir la fosforilacion utilizando HGF 50 ng/ml. La inhibicion de la proliferacion celular se llevo a cabo en ensayos BxPC3 esencialmente tal como se describe en Kirchhofer et al., FEBS Lett. (2005) 579: 1945-50. El ensayo de angiogenesis in vitro se llevo a cabo esencialmente tal como se describe por Nakatsu et al. (Microvasc.Res. 66: 102, 2003). Los mutantes de HGF se anadieron al medio de cultivo a una concentracion de 10 μg/ml cada dos dias durante un experimento de 6 dias. Al final del experimento se cuantifico el numero de brotes por particula y se expreso como el promedio ± SD de 4 experimentos independientes.

RESULTADOS

[0163] Los mutantes de la cadena de HGF (como cadena sola y HGF de longitud completa), que tienen las mutaciones indicadas, se caracterizaron por la capacidad de unirse a MetlgG, en comparacion con la cadena de HGF de tipo natural (cadena sola y HGF de longitud completa) utilizando un ensayo ELlSA de competicion. A efectos de minimizar cualquier potencial formacion de dimeros unidos a disulfuro, se produjeron cadena de HGF de tipo natural y mutantes de de cadena de HGF en la base de C604S; de este modo, la cadena de HGF de tipo natural es realmente C604S con cadena de HGF. Ademas, se evaluaron mutantes de HGF de 2 cadenas de longitud completa en un ensayo de migracion celular para determinar los efectos, si los hay, sobre la funcion biologica, como resultado de las mutaciones en la cadena β. Los resultados se representan en la figura 1A,B,C. El mutante de HGF G498l inhibia la fosforilacion dependiente de HGF de Met de una manera dependiente de la dosis tal como se representa en la figura 2; tambien se muestran los resultados para el mutante de HGF R424A:R494E (HGF de cadena sencilla). Los mutantes de HGF G498l y G498P activan Met significativamente menos bien en comparacion con el HGF de tipo natural en el ensayo de fosforilacion de Met tal como se representa en la figura 3; ;

tambien se muestran los resultados para el mutante de HGF R424A:R494E. La fosforilacion dependiente de HGF de Met se modulo de una manera dependiente de la dosis. Los mutantes de HGF G498l y G498P tambien inhibieron la proliferacion de celulas BxPC3, que tenian un 2,5% y un 56% de la actividad de HGF de tipo natural. Ademas, los mutantes de HGF de longitud completa seleccionados a una concentracion de 10 μg/ml (D672N, V495G, G498l, R424A:R494E) inhibieron la angiogenesis en un ensayo in vitro (Figura 4), confirmando adicionalmente de este modo la significancia de la cadena de HGF (y las mutaciones seleccionadas de la misma) en la funcion biologica general de HGF.

LlSTA PARClAL DE REFERENClAS

[0164]

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Claims

REIVINDICACIONES

1.

Molecula antagonista de HGF/C-Met que comprende un mutante de HGF que comprende una mutacion en la cadena β de HGF en la posicion V495, G498, R502 mas T503, o D672, en la que la mutacion en la cadena β de HGF impide la insercion del extremo N terminal de la cadena β de HGF en un bolsillo de union a HGF, y en la que el mutante de HGF resultante presenta una funcion biologica reducida en comparacion con el HGF de tipo natural.
2.

Molecula antagonista, segun la reivindicacion 1, en la que la funcion biologica es la proliferacion celular, la migracion celular, la fosforilacion de Met o la angiogenesis.
3.

Molecula antagonista, segun la reivindicacion 1 o 2, en la que el mutante de HGF resultante se une a C-Met con una afinidad de union sustancialmente reducida en comparacion con el HGF de tipo natural.
4.

Molecula antagonista, segun la reivindicacion 1 o 2, en la que el mutante de HGF resultante se une a C-met con una afinidad sustancialmente equivalente a la del HGF de tipo natural.
5.

Molecula antagonista, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la mutacion en la cadena β de HGF es V495G, V495A, G498l, G498P, G498V, R502del mas T503del, o D672N.
6.

Molecula antagonista, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la molecula comprende aminoacidos de tipo natural en las posiciones 534, 578, 619, 673, 692, 693, 694, 695, 696, 699 y/o 702.
7.

Molecula antagonista, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la molecula presenta una capacidad de senalizacion de C-met reducida en comparacion con el HGF de tipo natural.
8.

Molecula antagonista, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la molecula presenta una capacidad reducida para estimular la migracion celular en comparacion con el HGF de tipo natural.
9.

Molecula antagonista, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la molecula presenta una capacidad reducida para estimular la proliferacion celular en comparacion con el HGF de tipo natural.
10.

Molecula antagonista, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la molecula presenta una capacidad reducida para estimular la angiogenesis en comparacion con el HGF de tipo natural.
11.

Molecula antagonista de HGF/c-met, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para utilizar en un metodo de reduccion de la activacion de c-Met en un sujeto.
12.

Molecula antagonista para utilizar, segun la reivindicacion 11, para reducir la proliferacion de una celula en un sujeto.
13.

Molecula antagonista para utilizar, segun la reivindicacion 11, para reducir la migracion de una celula en un sujeto.
14.

Molecula antagonista para utilizar, segun la reivindicacion 11, para reducir la actividad angiogenica de una celula en un sujeto.
15.

Molecula antagonista de HGF/c-met, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para utilizar en un metodo de tratamiento de una afeccion patologica asociada con la activacion de c-Met en un sujeto.
16.

Molecula antagonista para utilizar, segun la reivindicacion 15, en la que la afeccion patologica es cancer.
17.

Utilizacion de una molecula antagonista de HGF/c-Met, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la preparacion de un medicamento para el tratamiento de una afeccion patologica asociada con la activacion de c-Met en un sujeto, en la que la afeccion patologica es cancer.
18.

Acido nucleico que codifica la molecula antagonista de HGF/c-Met, segun cualquiera de las reivindicaciones 1
10.
19.

Celula huesped, que comprende el acido nucleico segun la reivindicacion 18.
20.

Articulo de fabricacion que comprende un recipiente que comprende una o mas moleculas antagonista de HGF/c-Met segun cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
21.

Metodo de produccion de la molecula antagonista de HGF/c-Met, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-10, comprendiendo dicho metodo expresar en una celula huesped un acido nucleico que codifica la molecula antagonista, y recuperar la molecula antagonista de la celula.

Figura 1A

Figura 1B

Union de mutantes de HGF de longitud completa a Met en un ensayo de union de competicion

Mutante de HGF Union de competicion HGF/Met [numeracion de quimiotripsinogeno] lC50(mut)/lC50(wt) WT 1 V495A [c16] 0,8 ± 0,1 V495G [c16] 1,7 ± 0,1 V495del [c16del] 0,7 ± 0,2 D672N [c194] 2,0 ± 0,8 G498A [c19] 0,7 ± 0,2 G498l [c19] 1,1 ± 0,5 G498P [c19] 1,1 ± 0,2 G498V [c19] 1,3 ± 0,4 Figura 1C

lnhibicion de la migracion de celulas MDA-MB435 y la proliferacion de BxPC3 por mutantes de HGF de longitud completa (n = 4)

Mutante de HGF

Migracion de MDA-MB435 Proliferacion de BxPC3

HGFmut 200 nM

HGFmut 20 nM

HGFmut 200 nM

% de control ± SD

% de control ± SD

% de control ± SD

V495G

28,0 ± 19,5 63,4 ± 15,5 -5,3 ± 6,6

D672N

26,0 ± 7,4 57,4 ± 14,1 4,4 ± 9,3

G498l

21,1 ± 17,6 38,5 ± 20,7 -12,0 ± 11,2

scHGF

15,2 ± 6,1 46,5 (n = 2) 9,3 (n = 2)

Figura 2A Figura 2B Figura 3A Figura 3B Figura 4