JP5110536B2 - 筋萎縮性側索硬化症治療薬 - Google Patents

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Description

本発明は、筋萎縮性側索硬化症の治療薬に関する。
筋萎縮性側索硬化症（以下、ＡＬＳ）は、有効な治療法確立が強く希求されている致死的神経変性疾患の代表で、日本においては厚生労働省の特定難病疾患に指定されている。ＡＬＳの有病率は１０万人口当たり約３人から５人とされ、現在日本では約４，０００から５，０００人の患者がいると考えられている。尚かつ、本疾患は働き盛りである中年以降に発症する。従って、ＡＬＳの新規治療法の開発は、極めて重要である。
歴史的には、ＡＬＳは１８６９年にＣｈａｒｃｏｔとＪｏｆｆｒｏｙにより記載された一つの疾患単位である（非特許文献１）。主に上位運動ニューロンと下位運動ニューロンの両者が障害される進行性の原因不明の疾患であり呼吸筋麻痺により死亡する運動ニューロン疾患として位置づけられる（非特許文献２）。この疾患が初めて記載されて以来、約１３０年経過した現在尚、その有効な治療法は確立していない。治療剤として神経栄養因子、神経保護効果、カスパーゼ抑制、銅キレート作用、グルタミン酸抑制作用、抗酸化剤等に基づいた薬剤の効果についての検討がなされている。しかし、現在、ＡＬＳ治療薬として販売されているのは、グルタミン酸受容体のアゴニストとしてグルタミン酸抑制作用のあるリルゾールのみである（特許文献１）。
抗酸化剤、すなわちフリーラジカルスカベンジャーであるビタミンＥ及びキサンチンオキシダーゼ阻害剤であるアロプリノールが、ＡＬＳ患者由来の脳脊髄液の神経毒をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害することが知られている（非特許文献３）。
ＡＬＳのうち約５から１０％は家族性筋萎縮性側索硬化症（以下、ＦＡＬＳ）である（非特許文献４、５）。ＡＬＳの病因解明の一つの糸口として、１９９３年にＦＡＬＳのうち約２０％に、銅・亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ｃｏｐｐｅｒ／ｚｉｎｃ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ；ＳＯＤ１）遺伝子に異常を持つ家系が存在することが報告された（非特許文献２、６、７）。この発見に基づいて、ヒト変異ＳＯＤ１遺伝子を高発現するトランスジェニックマウスが遺伝子工学的に開発されている（非特許文献８）。このトランスジェニックマウスは、ヒトＡＬＳと同様に運動ニューロン障害による運動麻痺症状を呈し、やがて四肢麻痺、最終的には呼吸筋麻痺を惹起させ瀕死状態に陥り死亡する。尚かつ病理学的にもヒトと同様の運動ニューロン障害の病理組織像を示す。従って、このトランスジェニックマウスはヒトＡＬＳ動物モデルとして有用である。最近、ＨＳＰ（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）誘導作用を有するヒドロキシルアミン誘導体である、アリモクロモル（ａｒｉｍｏｃｌｏｍｏｌ）が、このＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）Ｔｇマウスにおいて運動ニューロン退縮と延命作用を有し、ＡＬＳに有効であることが報告された（非特許文献９）。
特許第２７１３３８４号公報 Ｃｈａｒｃｏｔ ＪＭ ＆ Ｊｏｆｆｒｏｙ Ａ．Ａｒｃｈ Ｐｈｙｓｉｏｌ（Ｐａｒｉｓ）１８６９；２：７４４−７６０ Ｋａｔｏら．Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｅｍｅｎｔｉａ ａｎｄ Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．ＩＳＮ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ Ｐｒｅｓｓ，２００３：ｐｐ３５０−３６８ Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，Ｖｏｌ７，Ｎｏ．１２，ｐ１９７０−１９７２，１２，Ａｕｇｕｓｔ，１９９６ Ｈｕｄｓｏｎ ＡＪ．Ｂｒａｉｎ １９８１；１０４：２１７−２４７ Ｊｕｎｅｊａ Ｔら．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １９９７；４８：５５−５７ Ｄｅｎｇ ＨＸら．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３；２６１：１０４７−１０５１ Ｒｏｓｅｎ ＤＲら．Ｎａｔｕｒｅ １９９３；３６２：５９−６２ Ｇｕｒｎｅｙ ＭＥ ら．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４；２６４：１７７２−１７７５ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０：４０２−４０５，２００４
しかしながら、リルゾールのＡＬＳに対する治療効果は十分とはいえず、またビタミンＥやアロプリノール等の抗酸化剤はＡＬＳの治療に有効とはいえない。また、アリモクロモルの治療効果についてもその有効性は十分とはいえない。
従って、さらに新たなＡＬＳ治療薬の開発が望まれている。
かかる実状において、本発明者は、ヒト変異ＳＯＤ１過剰発現トランスジェニックマウスを使用し、種々の薬物についてのＡＬＳ治療作用を検討してきたところ、全く意外にも、キサンチン脱水素酵素阻害作用を有しかつプリンサルベージ回路の基質とならない化合物が、アロプリノールと比較して顕著に優れたＡＬＳ治療作用を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、キサンチン脱水素酵素阻害作用を有しかつプリンサルベージ回路の基質とならない化合物を含有するＡＬＳ治療薬を提供するものである。
また、本発明は、キサンチン脱水素酵素阻害作用を有しかつプリンサルベージ回路の基質とならない化合物の、ＡＬＳ治療薬製造のための使用を提供するものである。
さらに、本発明は、キサンチン脱水素酵素阻害作用を有しかつプリンサルベージ回路の基質とならない化合物の有効量を投与することを特徴とするＡＬＳの予防又は治療方法を提供するものである。
本発明によれば、キサンチン脱水素酵素阻害作用を有する前記化合物を投与することにより、ＡＬＳの発症防止、進行の遅延及び延命作用が得られ、ＡＬＳの治療が可能となる。
また、本発明の前記化合物のＡＬＳ治療効果は、同じキサンチン脱水素酵素阻害剤であるアロプリノールに比べて顕著に強力である。また、アリモクロモルのＡＬＳ治療効果は、本発明の化合物とその作用機序が異なることから、投与方法が異なり、非特許文献９によれば、１０ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与で有効とされているのに対し、本発明の前記化合物は、５ｍｇ／ｋｇの経口投与でも有効であり、アリモクロモルに比べても極めて強力なＡＬＳ治療効果を有することは明らかである。
プラセボ投与実験群における各Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの臨床症候学的評価を示す図である。縦軸は臨床症候学ステージの度数を表し、横軸は生後日数を示す。 発症前化合物（ａ）投与治療実験群における各Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの臨床症候学的評価を示す図である。縦軸は臨床症候学ステージの度数を表し、横軸は生後日数を示す。 発症後化合物（ａ）投与治療実験群における各Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの臨床症候学的評価を示す図である。縦軸は臨床症候学ステージの度数を表し、横軸は生後日数を示す。 発症前化合物（ｂ）投与治療実験群における各Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの臨床症候学的評価を示す図である。縦軸は臨床症候学ステージの度数を表し、横軸は生後日数を示す。 発症前化合物（ｃ）投与治療実験群における各Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの臨床症候学的評価を示す図である。縦軸は臨床症候学ステージの度数を表し、横軸は生後日数を示す。 プラセボ投与実験群と発症前化合物（ａ）投与治療実験群の発症日におけるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法のＬｏｇｒａｎｋ検定を示す図である。縦軸は発症確率を表し、横軸は生後日数を示す。 プラセボ投与実験群と発症前化合物（ａ）投与治療実験群の生存期間におけるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法のＬｏｇｒａｎｋ検定を示す図である。縦軸は生存確率を表し、横軸は生後日数を示す。 プラセボ投与実験群と発症前化合物（ａ）投与治療実験群の病悩期間におけるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法のＬｏｇｒａｎｋ検定を示す図である。縦軸は生存確率を表し、横軸は病悩期間の日数を示す。 プラセボ投与実験群と発症後化合物（ａ）投与治療実験群の生存期間におけるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法のＬｏｇｒａｎｋ検定を示す図である。縦軸は生存確率を表し、横軸は生後日数を示す。 プラセボ投与実験群と発症後化合物（ａ）投与治療実験群の病悩期間におけるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法のＬｏｇｒａｎｋ検定を示す図である。縦軸は生存確率を表し、横軸は病悩期間の日数を示す。 プラセボ投与実験群と発症前化合物（ｂ）投与治療実験群の発症日におけるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法のＬｏｇｒａｎｋ検定を示す図である。縦軸は発症確率を表し、横軸は生後日数を示す。 プラセボ投与実験群と発症前化合物（ｂ）投与治療実験群の生存期間におけるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法のＬｏｇｒａｎｋ検定を示す図である。縦軸は生存確率を表し、横軸は生後日数を示す。 プラセボ投与実験群と発症前化合物（ｂ）投与治療実験群の病悩期間におけるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法のＬｏｇｒａｎｋ検定を示す図である。縦軸は生存確率を表し、横軸は病悩期間の日数を示す。 プラセボ投与実験群と発症前化合物（ｃ）投与治療実験群の発症日におけるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法のＬｏｇｒａｎｋ検定を示す図である。縦軸は発症確率を表し、横軸は生後日数を示す。 プラセボ投与実験群と発症前化合物（ｃ）投与治療実験群の生存期間におけるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法のＬｏｇｒａｎｋ検定を示す図である。縦軸は生存確率を表し、横軸は生後日数を示す。 プラセボ投与実験群と発症前化合物（ｃ）投与治療実験群の病悩期間におけるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法のＬｏｇｒａｎｋ検定を示す図である。縦軸は生存確率を表し、横軸は病悩期間の日数を示す。 発症後化合物（ｃ）投与治療実験群における各Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの臨床症候学的評価を示す図である。縦軸は臨床症候学ステージの度数を表し、横軸は生後日数を示す。 プラセボ投与実験群と発症後化合物（ｃ）投与治療実験群の生存期間におけるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法のＬｏｇｒａｎｋ検定を示す図である。縦軸は生存確率を表し、横軸は生後日数を示す。 プラセボ投与実験群と発症後化合物（ｃ）投与治療実験群の病脳期間におけるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法のＬｏｇｒａｎｋ検定を示す図である。縦軸は生存確率を表し、横軸は病脳期間の日数を示す。 アロプリノール投与治療実験群における各Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの臨床症候学的評価を示す図である。縦軸は臨床症候学ステージの度数を表し、横軸は生後日数を示す。 プラセボ投与実験群と発症前アロプリノール投与治療実験群の発症確率におけるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法のＬｏｇｒａｎｋ検定を示す図である。縦軸は発症確率を表し、横軸は生後日数を示す。 プラセボ投与実験群と発症前アロプリノール投与治療実験群の生存確率におけるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法のＬｏｇｒａｎｋ検定を示す図である。縦軸は生存確率を表し、横軸は生後日数を示す。 プラセボ投与実験群と発症前アロプリノール投与治療実験群の病悩期間におけるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法のＬｏｇｒａｎｋ検定を示す図である。縦軸は生存確率を表し、横軸は病悩期間の日数を示す。
本発明のＡＬＳ治療薬の有効成分である、キサンチン脱水素酵素阻害作用を有しかつプリンサルベージ回路の基質とならない化合物としては、当該作用を有する限り、その化学構造には影響されない。従って、従来既知の化合物を用いることができる。
例えば、フェニル−イミダゾール構造、フェニル−チアゾール構造、フェニル−トリアゾール構造、ピリジル−トリアゾール構造等の２つの芳香環と芳香族複素環とを有する構造を有するキサンチン脱水素酵素阻害剤等が挙げられる。本発明において、ＡＬＳ治療薬としてより好ましい化合物は、次の式（１）、（２）又は（３）で表される化合物又はその塩である。
Figure 0005110536
（式中、Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子又はアミノ基を示し；
Ｒ２はカルボキシル基又はＣ１−４アルコキシカルボニル基を示し；
Ｒ３はハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルコキシ、カルボキシ、Ｃ１−４アルコキシカルボニル及びアシルオキシから選ばれる１〜２個の置換基を有していてもよいＣ４−６アルキル基、Ｃ３−６シクロアルキル基又はＣ３−６シクロアルキル−Ｃ１−４アルキル基を示し；
Ｒ４は、ハロゲン、シアノ及びフェニルから選ばれる１〜２個の置換基を有していてもよいピリジル基；又はシアノ、ニトロ、Ｃ１−４アルコキシ、Ｎ−Ｃ１−４アルキルピペラジノ、Ｃ１−４アルキルチオ、フェニルチオ及びＣ１−４アルキルアミノから選ばれる１〜２個の置換基を有していてもよいフェニル基を示し；
Ｒ５はシアノ、Ｃ１−４アルキル、ハロゲン、Ｃ１−４アルコキシ及びＣ１−４アルキルチオから選ばれる置換基を有していてもよいピリジル基を示し；
Ｒ６は水素原子、又はピバロイルオキシ−Ｃ１−４アルキル基を示し；
Ｒ７はカルボキシル基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、又はモノ−もしくはジ−Ｃ１−６アルキルアミノカルボニル基を示し；
Ｒ８は水素原子、Ｃ１−６アルキル基又はフェニル基を示し；
Ｒ９は水素原子又はＣ１−１０アルキル基を示す。）
これらの化合物は、前記のように２つの芳香環と芳香族複素環の構造の共通構造を有している。
これら式（１）、（２）及び（３）で表される化合物は、特許第３２２０９８７号公報、特許第３６００８３２号公報、特開２００５−４１８０２号公報、特開平６−２９３７４６号公報、特開２００２−１０５０６７号公報等に記載されており、優れたキサンチン脱水素酵素阻害作用を有することが知られている。しかし、これらの化合物がＡＬＳ治療作用を有することは全く知られていない。
式（１）中、Ｒ１で示されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。Ｒ１としては水素原子が特に好ましい。
Ｒ２で示されるＣ１−４アルコキシカルボニル基としては、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基等が挙げられる。Ｒ２としては、カルボキシル基が特に好ましい。
Ｒ３で示されるＣ４−６アルキル基としては、直鎖又は分岐鎖のＣ４−６アルキル基が挙げられ、例えばｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ネオペンチル基（２，２−ジメチルプロピル）基、ｎ−ヘキシル基等が挙げられるが、このうちネオペンチル基が特に好ましい。Ｒ３で示されるＣ３−６シクロアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。また、Ｃ３−６シクロアルキル−Ｃ１−４アルキル基としては、シクロプロピルメチル基、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、シクロペンチルエチル基、シクロキシルエチル基等が挙げられる。Ｒ３としては、Ｃ４−６アルキル基がより好ましく、分岐鎖Ｃ４−６アルキル基がさらに好ましく、ネオペンチル基が特に好ましい。
Ｒ３で示されるＣ４−６アルキル基、Ｃ３−６シクロアルキル基又はＣ３−６シクロアルキル−Ｃ１−４アルキル基には、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルコキシ、カルボキシ、Ｃ１−４アルコキシカルボニル及びアシルオキシから選ばれる１〜２個の置換基が置換していてもよい。ここでハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素が挙げられる。Ｃ１−４アルコキシとしてはメトキシ、エトキシ等が挙げられる。Ｃ１−４アルコキシカルボニルとしてはメトキシカルボニル、エトキシカルボニル等が挙げられる。またアシルオキシとしてはアセトキシ、プロピオニルオキシ等が挙げられる。
式（１）の化合物のうち、より好ましい化合物は、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がカルボキシル基であり、Ｒ３がＣ４−６アルキル基である化合物である。式（１）の化合物のうち、最も好ましい化合物は、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がカルボキシル基であり、Ｒ３がネオペンチル基（２，２−ジメチルプロピル）である化合物（１−（３−シアノ−４−（２，２−ジメチルプロポキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸）である。
式（２）中、Ｒ４で示されるピリジル基は、ハロゲン、シアノ及びフェニルから選ばれる１又は２個の置換基を有していてもよい。ここで、ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等が挙げられる。
Ｒ４で示されるフェニル基は、シアノ、ニトロ、Ｃ１−４アルコキシ、Ｎ−Ｃ１−４アルキルピペラジノ、Ｃ１−４アルキルチオ、フェニルチオ及びＣ１−４アルキルアミノから選ばれる１〜２個の置換基を有していてもよい。ここでＣ１−４アルコキシとしてはメトキシ、エトキシ等が挙げられる。Ｎ−Ｃ１−４アルキルピペラジノとしてはＮ−メチルピペラジノ、Ｎ−エチルピペラジノ等が挙げられる。Ｃ１−４アルキルチオとしてはメチルチオ、エチルチオ等が挙げられる。Ｃ１−４アルキルアミノとしては、メチルアミノ、エチルアミノ、イソプロピルアミノ等が挙げられる。
Ｒ４のうち、シアノピリジル基が好ましく、特に２−シアノピリジン−４−イル基が好ましい。
Ｒ５で示されるピリジル基は、シアノ基、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ基及びＣ１−６アルキルチオ基から選ばれる１又は２個の置換基を有していてもよい。ここで、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキルチオ基の例としては、前記Ｒ４の場合と同じものが挙げられる。Ｒ５としては、ピリジル基が好ましく、特にピリジン−４−イル基が好ましい。
Ｒ６で示されるピバロイルオキシ−Ｃ１−４アルキル基としては、ピバロイルオキシメチル基、ピバロイルオキシエチル基等が挙げられる。Ｒ６としては水素原子が好ましい。
式（２）の化合物のうち、より好ましい化合物はＲ４がシアノピリジル基であり、Ｒ５がピリジル基であり、Ｒ６が水素原子である化合物である。式（２）の化合物のうち、最も好ましい化合物は、Ｒ４が２−シアノピリジン−４−イル基であり、Ｒ５がピリジン−４−イル基であり、Ｒ６が水素原子である化合物（４−（５−ピリジン−４−イル−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−イル）ピリジン−２−カルボニトリル）である。
式（３）中で、Ｒ７で示されるＣ１−６アルコキシカルボニル基としてはメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、イソプロピルオキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基等が挙げられる。モノ−もしくはジ−Ｃ１−６アルキルアミノカルボニル基としては、メチルアミノカルボニル基、エチルアミノカルボニル基、ジメチルアミノカルボニル基、ジエチルアミノカルボニル基等が挙げられる。Ｒ７のうち、カルボキシル基又はＣ１−６アルコキシカルボニル基がより好ましく、カルボキシル基が特に好ましい。
Ｒ８で示されるＣ１−６アルキル基としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ブチル基、ペンチル基等が挙げられる。Ｒ８としてはＣ１−６アルキル基が好ましく、メチル基が特に好ましい。
Ｒ９のＣ１−６アルキル基としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基（２−メチルプロピル基）、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基、オクチル基等が挙げられる。Ｒ９としては、Ｃ１−８アルキル基が好ましく、Ｃ２−６アルキル基がより好ましく、イソブチル基（２−メチルプロピル基）が特に好ましい。
式（３）の化合物のうち、Ｒ７がカルボキシル基、Ｒ８がメチル基、Ｒ９がイソブチル基である化合物（２−［３−シアノ−４−（２−メチルプロポキシ）フェニル］−４−メチル−５−チアゾールカルボン酸）が特に好ましい。
式（１）、（２）又は（３）で表される化合物の塩としては、薬学的に許容される塩が挙げられる。例えば、カルボキシル基における金属（ナトリウム、カリウム、カルシウム等）塩、有機酸塩基（ジエタノールアミン、トリメチルアミン）との塩が挙げられる。またアミノ基における酸付加塩、例えば塩酸塩、硫酸塩等の鉱酸塩、酢酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。また、式（１）、（２）又は（３）の化合物には、水和物等の溶媒和物が含まれる。また、これらの化合物には、光学異性体も含まれる。
キサンチン脱水素酵素阻害作用を有しかつプリンサルベージ回路の基質とならない化合物、特に式（１）、（２）及び（３）の化合物は、後述の実施例に示すように、優れたＡＬＳの発症防止作用、ＡＬＳ症状の進行遅延作用及びＡＬＳによる死亡に対する延命作用を有し、ＡＬＳ治療薬として有用である。そして、その作用はキサンチン脱水素酵素阻害作用を有し、プリンサルベージ回路の基質になるアロプリノールに比べて顕著に強力である。また、式（２）及び（３）の化合物は、既に尿酸生成阻害剤として開発が進んでおり、安全性も高いことが知られている。ＡＬＳの発症は、突然に、持っている物を落としたり、足がもつれたり、ろれつが回らなくなるなどの初期症状で気づかれることがある。ＡＬＳの基本的症状は、筋肉の線維束性収縮症状、筋萎縮・筋力低下症状、球麻痺症状、錐体路症状である。筋肉の線維束性収縮症状は筋肉のピクツキとして認められる。筋萎縮・筋力低下症状に関しては、多くの場合、上肢や下肢の遠位部の筋萎縮・筋力低下から始まり、やがて両肢の近位部筋の障害に及ぶ。初期は握力低下（持っている物を落とす等）、足底の挙上困難（足首が上がらない等）であるが、やがて上肢挙上困難や歩行障害（足のもつれ・転倒等）を来たし、日常生活動作が困難・不可能になり、寝たきり状態となる。寝たきり状態になるとさらに筋肉を動かさなくなり、二次的な筋肉の廃用萎縮を来たし、筋萎縮・筋力低下を加速する。球麻痺症状とは咽喉頭筋・舌・咬筋・顔面筋等の筋萎縮・筋力低下徴候によるもので、発声・発語障害に基づく言語障害（言葉の不明瞭性等）や嚥下困難をきたす。やがて経口摂取困難状態になる。錐体路症状に関しては、四肢において筋肉の緊張が強くなり、つっぱって動かし難い等の異常筋緊張亢進を伴う運動麻痺（痙性麻痺）を生ずる。ＡＬＳではそれぞれの症状の程度と進展は様々であるが、予後はきわめて不良で、病期の進行は比較的速く、最終的には呼吸筋麻痺による呼吸不全を来たし、人工呼吸器を用いなければ通常２−３年で死亡する。現在では気管切開後の人工呼吸器使用による呼吸管理により、生命そのものの延命は可能となった。しかし、患者の“生活の質（Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ，ＱＯＬ）”の高度の低下、経済的な保障不安、在宅療養での介護者（マンパワー）の不足等の問題要素があり、患者のみならず家族全員・全体に重大な社会的障害と苦痛を与える。しかも、患者の意識は最後まで正常で、一般に知能も障害されないため、患者は常に死の恐怖と向き合わなければならない過酷な状況となる。本発明の治療薬を用いることにより、ＡＬＳにおけるこれらの臨床症状が改善され、人工呼吸器装着までの期間を延長でき、患者の”ＱＯＬ“を維持できる期間が長くなることが期待される。
本発明の医薬の投与経路は特に限定されず、経口的又は非経口的に投与することができる。非経口投与としては髄腔内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下又は皮内等への注射、吸入、直腸内、鼻腔内投与及び点鼻、点耳、点眼、外用投与等が挙げられる。
本発明の医薬としては、有効成分である前記化合物をそのまま患者に投与してもよいが、好ましくは、有効成分と薬学的に許容し得る添加物とを含む医薬組成物の形態の製剤として投与すべきである。薬学的に許容し得る添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を用いることができる。
経口投与に適する製剤の例としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、又はシロップ剤等を挙げることができ、非経口投与に適する製剤としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、点鼻剤、点耳剤、点眼剤、又は外用剤（貼付、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、スプレーなどを含む）などを挙げることができる。
経口投与に適する製剤には、添加物として、例えば、ブドウ糖、乳糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、又は結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤を用いることができる。注射、点滴用、点鼻剤、点耳剤又は点眼剤に適する製剤には、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等の水性あるいは用時溶解型注射剤を構成し得る溶解剤又は溶解補助剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、Ｄ−マンニトール、グリセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のｐＨ調節剤等の製剤用添加物を用いることができる。坐剤に適する製剤には、例えば、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセリド等の基剤、及び必要に応じて非イオン界面活性剤のような界面活性剤等の添加物を用いることができる。
軟膏剤に適する製剤には、通常使用される基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等が必要に応じて用いられる。基剤としては、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等が挙げられる。保存剤としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が挙げられる。
貼付剤に適する製剤としては、通常の支持体に前記軟膏、クリーム、ゲル、ペースト等を常法により塗布したものが挙げられる。支持体としては、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布や軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルムあるいは発泡体シートが適当である。
本発明の医薬の投与量は、疾患の進行状況又は症状の程度、患者の年齢や体重などの諸条件に応じて適宜選択可能である。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
Ｉ．材料及び方法
１．薬剤
以下の４種類のキサンチン脱水素酵素阻害剤を用いた。
すなわち、１−［３−シアノ−４−（２，２−ジメチルプロポキシ）フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸（化合物（ａ））と、４−（５−ピリジン−４−イル−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−イル）ピリジン−２−カルボニトリル（化合物（ｂ））と２−［３−シアノ−４−（２−メチルプロポキシ）フェニル］−４−メチル−５−チアゾールカルボン酸（化合物（ｃ））とアロプリノールの４種類を用いた。
１）化合物（ａ）の濃度調整と投与量・投与方法は次の要領で行った。基剤として、０．５％メチルセルロースを作製する。化合物（ａ）５ｍｇを瑪瑙製の乳鉢にてすりつぶした後、少量の０．５％メチルセルロースを加え、完全に懸濁させる。その後、徐々に少量の０．５％メチルセルロースを加え、最終的に１０ｍＬの０．５％メチルセルロースに化合物（ａ）５ｍｇを懸濁させる。以上の方法により、５ｍｇ化合物（ａ）・０．５％メチルセルロース１０ｍＬ（５ｍｇ／１０ｍＬ）を作製し、化合物（ａ）をマウス体重１ｋｇ当たり５ｍｇ（５ｍｇ／ｋｇ）を１日１回経口的に投与した。
２）化合物（ｂ）の濃度調整と投与量・投与方法は化合物（ａ）と同様にして行った。この方法により、５ｍｇ化合物（ｂ）・０．５％メチルセルロース１０ｍＬ（５ｍｇ／１０ｍＬ）を作製し、化合物（ｂ）をマウス体重１ｋｇ当たり５ｍｇ（５ｍｇ／ｋｇ）を１日１回経口的に投与した。
３）化合物（ｃ）の濃度調整と投与量・投与方法は化合物（ａ）と同様にして行った。この方法により、５ｍｇ化合物（ｃ）・０．５％メチルセルロース１０ｍＬ（５ｍｇ／１０ｍＬ）を作製し、化合物（ｃ）をマウス体重１ｋｇ当たり５ｍｇ（５ｍｇ／ｋｇ）を１日１回経口的に投与した。
４）アロプリノールの濃度調整と投与量の投与方法は化合物（ａ）と同様にして行った。この方法により、５ｍｇアロプリノール・０．５％メチルセルロース１０ｍＬ（５ｍｇ／１０ｍＬ）を作製し、アロプリノールをマウス体重１ｋｇ当たり５ｍｇ（５ｍｇ／ｋｇ）を１日１回経口的に投与した。
５）プラセボとしては、基剤である０．５％メチルセルロースのみをマウス体重１ｋｇ当たり１０ｍＬ（１０ｍＬ／ｋｇ）、すなわち、薬剤投与マウスの基剤と等容量を１日１回経口投与した。
６）経口投与の方法は、プラスチックシリンジにて正確に容量を測量し、プラスチックシリンジに直接マウス用胃ゾンデをつなげ、経口・経食道的に確実に投与した。
２．実験動物
実験動物には、Ｇ９３Ａ点変異のヒト変異ＳＯＤ１遺伝子を高コピー数（２０−４０コピー）過剰発現させた雄トランスジェニックマウスＢ６ＳＪＬ−ＴｇＮ［ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ］１Ｇｕｒ（Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス，ＪＲ２７２６；Ｈｅｍｉｚｙｇｏｔｅ）（Ｇｕｒｎｅｙ ＭＥら．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４，１７７２−１７７５，１９９４）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，米国）から購入し、使用した。同時に、その雄の野生型同腹仔マウスＢ６ＳＪＬ−ＴｇＮ［ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ］１Ｇｕｒ（Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）もＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、使用した。
３．マウスの臨床症候学的評価
マウスは毎日臨床症候学的評価を行った。臨床症候学的評価は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから到着１週間後から施行した。マウスの臨床症候学的評価は、次に示した基準にて行った。ステージ０度＝野生型同腹仔と同一俊敏性の行動をとれる。ステージ１度＝俊敏性の欠如、小刻みなふるえ（ｊｉｔｔｅｒｉｎｇ）、尻尾挙上不全（ｌｉｍｐ ｔａｉｌ）、筋力低下を伴う緩徐歩行のいずれか一つ以上の臨床症状を呈す。ステージ２度＝一側あるいは両側の後肢不完全麻痺を呈するが、前肢は正常。ステージ３度＝両側後肢高度麻痺を呈するが、前肢はほぼ正常。ステージ４度＝一側あるいは両側の前肢不完全麻痺を呈し、かつ両側後肢高度麻痺を呈する。ステージ５度＝高度四肢麻痺を呈しているか、もしくは瀕死状態。発症日、生存期間及び病悩期間については日数を持って表示した。病悩期間の日数表示については、１日間（１病日間）とは発症（臨床症候学的評価のステージ１度を持って発症したとする）より２４時間以内に相当し、２日間（２病日間）とは発症より２４時間を過ぎてから４８時間以内に相当するものとし、以下同様にして、発症後の病悩日数を決定した。
４．マウスの運動負荷試験
生後７０日目より５日目ごとに、以下の５種類の運動負荷試験を施行し、各運動負荷試験における運動能力を評価した。すなわち、運動負荷試験施行日は、生後７０日、７５日、８０日、８５日・・・と５日目ごとであり、生存期間中は運動負荷試験を施行し、死後の評価は以下の５種類の各運動負荷試験の定義に基づいた。
１）伸展反射試験
正常のマウスは、尾を持って空中に持ち上げると、両後肢の伸展反射が認められる。
マウスの伸展反射試験の評価は、次に示した基準にて行った。スコアー０＝両後肢の伸展反射が認められる。スコアー１＝どちらか一方の後肢の伸展反射が認められるのみで、反対側の後肢の伸展反射は認められない。スコアー２＝両後肢の伸展反射が認められない。死後の伸展反射試験評価はスコアー２と定義する。
２）傾斜面角度試験
傾斜面角度試験に用いた装置は、木製のボードを水平面より、それぞれ４５度、６５度、８０度の各角度に固定可能な装置である。各角度に傾けた木製ボードの上に頭を上方に向けてマウスを置き、下方に落ちることなく、そのポジションを５秒間維持させる。マウスの傾斜面角度試験の評価方法は、４５度、６５度、８０度の各角度（Ａ度）において、下方に落ちることないポジションを維持できた秒数（ＴＡ秒：５秒以下）を測定した後、角度（Ａ度）と維持できた秒数（ＴＡ秒）との掛けた数値の総和：Σ（ＡｘＴＡ）を算定する。正常のマウスは、各角度に傾けた木製ボード上でそのポジションを５秒間維持可能であるので、Σ（ＡｘＴＡ）＝８０×５＋６５×５＋４５×５＝９５０の値となる。マウスの傾斜面角度試験の評価は、次に示した基準にて行った。スコアー０＝９５０。スコアー１＝５５０を超え９５０未満。スコアー２＝２２５を超え５５０以下。スコアー３＝２２５以下。死後の傾斜面角度試験評価はスコアー３と定義する。
３）フットプリント試験
マウスの両後肢を黒インク瓶の中に浸し、その後に白い紙の上を歩かせる。歩行後のマウスの両後肢のフットプリントを解析する。マウスのフットプリント試験の評価は、次に示した基準にて行った。スコアー０＝両後肢の歩幅がそれぞれ６ｃｍを超え、且つ両後肢を引きずった所見を認めない。スコアー１＝両後肢を引きずった所見を認めないが、両後肢の歩幅がそれぞれ６ｃｍを超えない。スコアー２＝一側の後肢を引きずった所見を認める。スコアー３＝両後肢を引きずった所見を認める。スコアー４＝歩行ができない状態。死後のフットプリント試験評価はスコアー４と定める。
４）ロタロッド試験
ロタロッド試験に用いた装置（Ｒｏｔａ Ｒｏｄ Ｔｒｅａｄｍｉｌｌ ７６００型、Ｕｇｏｂａｓｉｌｅ社、ミラノ、イタリア）は、直径３．６ｃｍの回転軸であり、１分間にこの回転軸が１６回転（１回転：３．７５秒）するように設定してある。マウスをこの条件設定で作動させているロタロッド試験装置の回転軸上に置き、この回転軸から落下するまでの時間を測定する。ただし、６０秒を超える時間に達したときは、ロタロッド試験を中止する。マウスのロタロッド試験の評価は、次に示した基準にて行った。スコアー０＝６０秒を超える。スコアー１＝３０秒を超え６０秒以下。スコアー２＝４秒を超え３０秒以下。スコアー３＝４秒以下。死後のロタロッド試験評価はスコアー３と定める。
５）ビームバランス試験
ビームバランス試験に用いた装置は、直径１．５ｃｍの木製の円柱（梁：ビーム）を水平に保ち、３０ｃｍの距離にそれぞれ足場となるプラットホームを設置したものである。マウスを一方のプラットホーム上に置き、３０ｃｍの長さのビームを渡りきり反対側のプラットホームに達する時間を測定する。マウスのビームバランス試験の評価は、次に示した基準にて行った。スコアー０＝１０秒以下。スコアー１＝１０秒を超え１５秒以下。スコアー２＝１５秒を超えるか、あるいは落下する。死後のビームバランス試験評価はスコアー２と定める。
５．プラセボ・薬剤投与方法による実験デザイン
プラセボ投与と化合物（ａ）、化合物（ｂ）、化合物（ｃ）及びアロプリノール投与方法とにより、７群に分けて実験を行った。すなわち、プラセボ投与実験群、発症前化合物（ａ）投与治療実験群、発症後化合物（ａ）投与治療実験群、発症前化合物（ｂ）投与治療実験、発症前化合物（ｃ）投与治療実験、発症後化合物（ｃ）投与治療実験、発症前アロプリノール投与治療群の７群である。各群の詳細については以下に述べる。
１）プラセボ投与実験群：
Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス１０匹と野生型同腹仔マウス１０匹とを使用した。両者ともに生後８０日よりプラセボとして０．５％メチルセルロース（１０ｍＬ／ｋｇ）を経口的に投与した。経口投与期間は、Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスにおいて運動麻痺が発症し、四肢麻痺及び瀕死状態に至るまで、連日投与した。野生型同腹仔マウス１０匹は、プラセボである０．５％メチルセルロース（１０ｍＬ／ｋｇ）を連日経口投与した。０．５％メチルセルロース（１０ｍＬ／ｋｇ）を経口投与した野生型同腹仔マウス１０匹は正常対照群として使用した。
２）化合物（ａ）投与治療実験群
（１）発症前化合物（ａ）投与治療実験群：
Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス１０匹を使用した。生後８０日より５ｍｇ／ｋｇの化合物（ａ）を連日経口に投与した。投与期間はそれぞれのＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスが四肢麻痺を呈し瀕死状態に至るまでの期間である。
（２）発症後化合物（ａ）投与治療実験群：
Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス１０匹を使用した。臨床症候学的評価のステージ１度（＝俊敏性の欠如、小刻みなふるえ（ｊｉｔｔｅｒｉｎｇ）、尻尾挙上不全（ｌｉｍｐ ｔａｉｌ）、緩徐歩行のいずれか一つ以上の臨床症状を呈す）を持って発症したと捉え、この時点を含む日より５ｍｇ／ｋｇの化合物（ａ）を連日経口に投与した。投与期間はそれぞれのＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスが四肢麻痺を呈し瀕死状態に至るまでの期間である。
３）化合物（ｂ）投与治療実験群
（１）発症前化合物（ｂ）投与治療実験群：
Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス１０匹を使用した。生後８０日より５ｍｇ／ｋｇの化合物（ｂ）を連日経口に投与した。投与期間はそれぞれのＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスが四肢麻痺を呈し瀕死状態に至るまでの期間である。
４）化合物（ｃ）投与治療実験群
（１）発症前化合物（ｃ）投与治療実験群：
Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス１０匹を使用した。生後８０日より５ｍｇ／ｋｇの化合物（ｃ）を連日経口に投与した。投与期間はそれぞれのＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスが四肢麻痺を呈し瀕死状態に至るまでの期間である。
（２）発症後化合物（ｃ）投与治療実験群：
Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス１０匹を使用した。臨床症候学的評価のステージ１度（＝俊敏性の欠如、小刻みなふるえ（ｊｉｔｔｅｒｉｎｇ）、尻尾挙上不全（ｌｉｍｐ ｔａｉｌ）、緩徐歩行のいずれか一つ以上の臨床症状を呈す）を持って発症したと捉え、この時点を含む日より５ｍｇ／ｋｇの化合物（ｃ）を連日経口に投与した。投与期間はそれぞれのＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスが四肢麻痺を呈し瀕死状態に至るまでの期間である。
５）アロプリノール投与治療実験群
（１）発症前アロプリノール投与治療実験群：
Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス１０匹を使用した。生後８０日より５ｍｇ／ｋｇのアロプリノールを連日経口に投与した。投与期間はそれぞれのＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスが四肢麻痺を呈し瀕死状態に至るまでの期間である。
６．病理組織学的検索
実験に供するマウスは、マウス体重１ｋｇ当たり１ｍＬのペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射にて、麻酔を施行する。完全に麻酔下にあることを確認した後、開腹・開胸を行い、左心室・大動脈経由にて、３７℃の生理的食塩水の灌流にて全身臓器の血液を完全に除去する。全身臓器血液の完全除去は、胸部・腹部の大動脈、腸間膜動脈、肝臓、腎臓、胃・小腸・大腸表面の小動脈の血液の完全除去を直視下にて確認後、さらに５０ｍＬの３７℃生理的食塩水の灌流を施行する。その後直ちに、４％パラホルムアルデヒド・０．１Ｍカコジル酸緩衝液にて灌流固定した後、脊髄を取り出し１８時間４％パラホルムアルデヒド・０．１Ｍカコジル酸緩衝液にて再固定する。脊髄組織固定後、脊髄組織を検索するために、脊髄組織の各髄節部位を切り出す。検索した脊髄髄節組織は、脊髄の各部位の長さを考慮して、頸髄２部位（上部頸髄、下部頸髄）、胸髄３部位（上部胸髄、中部胸髄、下部胸髄）、腰髄２部位（上部腰髄、下部腰髄）を切り出し、合計７カ所を切り出し部位とした。切り出した各脊髄髄節組織はそれぞれパラフィン包埋し、パラフィンブロックを作製した後、ミクロトームにて５μｍ厚のパラフィン切片とする。パラフィン切片にはヘマトキシリン染色を施し、その後にエオシン染色をも行い、ヘマトキシリン・エオシン染色切片とする。
定量的解析には、各脊髄髄節パラフィンブロックから、５μｍ厚のパラフィン切片を連続２５枚作製し、１枚目、７枚目，１３枚目，１９枚目，２５枚目を選抜して、ヘマトキシリン・エオシン染色を施した。すなわち、２５μｍ間隔をあけて、１枚ごとのパラフィン切片を選び、一つの脊髄髄節パラフィンブロックから、５枚のヘマトキシリン・エオシン染色を作製した。従って、頸髄全体では２部位１０枚のヘマトキシリン・エオシン染色、胸髄全体では３部位１５枚のヘマトキシリン・エオシン染色、腰髄全体では２部位１０枚のヘマトキシリン・エオシン染色を作製した。
前角運動ニューロンの数を算定するために、すべてのヘマトキシリン・エオシン染色切片について、顕微鏡用３ＣＣＤデジタルカラーカメラシステム（ＦＸ３８０：オリンパス社、東京、日本）の装着された光学顕微鏡（ＢＸ４１：オリンパス社、東京、日本）にて観察した後、各脊髄髄節組織のヘマトキシリン・エオシン染色切片の脊髄前角領域（Ｒｅｘｅｄ分類におけるＶＩＩ，ＶＩＩＩ，ＩＸに相当する領域）を撮影し、撮影された画像を画像解析・ファイリングソフトウエア（ＦＬＶＦＳ−ＬＳ Ｖｅｒ．１．１２：オリンパス社、東京、日本）にて解析した。脊髄前角運動ニューロン（脊髄前角細胞）の定義については、ヘマトキシリン・エオシン染色切片上にて、明確な核小体を持つ核を有し、かつ直径が２５μｍ以上の細胞体を含む細胞を脊髄前角細胞とした（Ｋｌｉｖｅｎｙｉ Ｐら．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ １９９９；５：３４７−３５１、Ｋｏｎｇ Ｊ ＆ Ｘｕ Ｚ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １９９８；１８：３２４１−３２５０、Ｓｔｅｐｈｅｎｓ Ｂら．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ａｐｐｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ２００１；２７：３５２−３６１）。この定義に基づいて、各ヘマトキシリン・エオシン染色切片につき、脊髄前角細胞数を算定した。一匹のマウスの頸髄、胸髄、腰髄のそれぞれの脊髄前角細胞数は、５枚のヘマトキシリン・エオシン染色切片の脊髄前角細胞数をすべて合計した全脊髄前角細胞数として算定した。すなわち、頸髄脊髄前角細胞数は、頸髄２部位１０枚のヘマトキシリン・エオシン染色切片の脊髄前角細胞数をすべて合計した全脊髄前角細胞数を測定した後、５切片当たりの脊髄前角細胞数として算定した。胸髄脊髄前角細胞数は、胸髄３部位１５枚のヘマトキシリン・エオシン染色切片の脊髄前角細胞数をすべて合計した全脊髄前角細胞数を測定した後、５切片当たりの脊髄前角細胞数として算定した。腰髄脊髄前角細胞数は、腰髄２部位１０枚のヘマトキシリン・エオシン染色切片の脊髄前角細胞数をすべて合計した全脊髄前角細胞数を測定した後、５切片当たりの脊髄前角細胞数として算定した。
７．統計解析法
臨床症候学的評価の結果については、発症日、生存期間（四肢麻痺を呈し瀕死状態に至るまでの日数）、病悩期間（発症日を含め、四肢麻痺を呈し瀕死状態に至るまでの日数）、臨床症候学的評価の各ステージ度数の期間の各データ値は平均値±標準偏差で表示した。運動負荷試験の結果については、伸展反射試験、傾斜面角度試験、フットプリント試験、ロタロッド試験、ビームバランス試験の各運動負荷試験の各スコアー値を平均値±標準偏差で表示した。病理組織学的検索結果については、算定した脊髄前角細胞数を平均値±標準偏差で表示した。
すべての統計解析はマッキントッシュソフトウエアのＳｔａｔｖｉｅｗ（Ｖｅｒ．５．０，ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．，カリフォルニア、米国）を用いて実施した。有意差検定にはＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定とＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法のＬｏｇｒａｎｋ検定とを用い、危険率Ｐ＜０．０５を持って統計的有意差があると判定した。
ＩＩ．結果
１．プラセボ・薬剤投与の各実験群の臨床症候学的評価の結果
１）プラセボ投与実験群：
プラセボ投与実験群におけるＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの発症日は、９９．９±２．４日、生存期間は、１１９．７±３．３日、病悩期間２０．８±２．３日であった（表１Ａ、２Ａ，３Ａ、４Ａ）。プラセボ投与実験群におけるマウスの臨床症候学的評価の各ステージ度数の期間は、それぞれステージ１度＝６．６±０．７日、ステージ２度＝５．４±０．８日、ステージ３度＝４．３±０．８日、ステージ４度＝２．８±０．６日、ステージ５度＝１．７±０．５日であった（表１Ｂ、２Ｂ、３Ｂ, ４Ｂ）（図１）。プラセボ投与実験群の正常対照群である野生型同腹仔マウスでは、１０匹全例臨床症候学的評価のステージは全経過を通じて０度であった。
２）発症前化合物（ａ）投与治療実験群：
発症前化合物（ａ）投与治療実験群におけるＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの発症日は、１１３．０±４．８日、生存期間は、１３６．９±３．８日、病悩期間２４．９±３．１日であった（表１Ａ）。発症前化合物（ａ）投与治療実験群におけるマウスの臨床症候学的評価の各ステージ度数の期間は、それぞれステージ１度＝７．５±０．７日、ステージ２度＝６．６±１．２日、ステージ３度＝５．４±１．１日、ステージ４度＝３．６±０．７日、ステージ５度＝１．８±０．４日であった（表１Ｂ）（図２）。
３）発症後化合物（ａ）投与治療実験群：
発症後化合物（ａ）投与治療実験群におけるＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの発症日は、９９．８±２．４日、生存期間は、１２２．７±２．１日、病悩期間２３．９±１．７日であった（表２Ａ）。発症後化合物（ａ）投与治療実験群におけるマウスの臨床症候学的評価の各ステージ度数の期間は、それぞれステージ１度＝７．３±０．７日、ステージ２度＝６．０±０．７日、ステージ３度＝５．３±０．９日、ステージ４度＝３．５±０．５日、ステージ５度＝１．８±０．４日であった（表２Ｂ）（図３）。
４）発症前化合物（ｂ）投与治療実験群：
発症前化合物（ｂ）投与治療実験群における発症日は、１１１．６±３．７日、生存期間は、１３４．９±３．４日、病悩期間２４．３±３．４日であった（表３Ａ）。発症前化合物（ｂ）投与治療実験群におけるマウスの臨床症候学的評価の各ステージ度数の期間は、それぞれステージ１度＝７．４±０．７日、ステージ２度＝６．４±１．２日、ステージ３度＝５．３±１．２日、ステージ４度＝３．５±０．５日、ステージ５度＝１．７±０．５日であった（表３Ｂ）（図４）。
５）発症前化合物（ｃ）投与治療実験群：
発症前化合物（ｃ）投与治療実験群におけるＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの発症日は、１１２．０±４．６日、生存期間は、１３６．４±３．３日、病悩期間２５．４±３．２日であった（表４Ａ）。発症前化合物（ｃ）投与治療実験群におけるマウスの臨床症候学的評価の各ステージ度数の期間は、それぞれステージ１度＝７．５±０．９日、ステージ２度＝６．７±１．２日、ステージ３度＝５．４±１．１日、ステージ４度＝３．９±１．１日、ステージ５度＝１．９±０．３日であった（表４Ｂ）（図５）。
６）発症後化合物（ｃ）投与治療実験群：
発症後化合物（ｃ）投与治療実験群におけるＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの発症日は、１００．７±４．３日、生存期間は、１２３．９±３．２日、病悩期間２４．２±３．２日であった（表５Ａ）。発症後化合物（ｃ）投与治療実験群におけるマウスの臨床症候学的評価の各ステージ度数の期間は、それぞれステージ１度＝７．６±１．２日、ステージ２度＝６．２±０．８日、ステージ３度＝５．４±１．１日、ステージ４度＝３．５±０．５日、ステージ５度＝１．５±０．５日であった（表５Ｂ）（図１７）。
７）発症前アロプリノール投与治療実験群：
発症前アロプリノール投与治療実験群におけるＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの発症日は、１０２．２±４．４日、生存期間は、１２２．２±１．３日、病悩期間２１．０±３．６日であった（表６Ａ）。発症前アロプリノール投与治療実験群におけるマウスの臨床症候学的評価の各ステージ度数の期間は、それぞれステージ１度＝６．８±１．１日、ステージ２度＝５．４±１．３日、ステージ３度＝４．４±１．２日、ステージ４度＝２．９±０．７日、ステージ５度＝１．５±０．５日であった（表６Ｂ）（図２０）。
２．薬剤の有効性の臨床症候学的解析結果
１）発症前化合物（ａ）投与治療の臨床症候学的有効性：
Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスに、生後８０日より５ｍｇ／ｋｇの化合物（ａ）を連日経口に投与することにより、プラセボ投与群より、発症日を有意に遅延させる発症遅延効果（Ｐ＜０．００１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）、生存期間を有意に延長させる生存期間延長効果（Ｐ＜０．００１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）、病悩期間を有意に延長させる病悩期間延長効果（Ｐ＜０．０１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）を認めた（表１Ａ）。さらに、プラセボ投与群と比較した発症前化合物（ａ）投与治療群の発症日（図６）、生存期間（図７）、病悩期間（図８）における各項目におけるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法のＬｏｇｒａｎｋ検定を施行したところ、各項目においてそれぞれ有意差を持って延長していた。すなわち、発症前化合物（ａ）投与によって、発症遅延効果、生存期間延長効果、病悩期間延長効果の各効果の明らかな有効性を認めた。臨床症候学的評価の各ステージ度数の期間に関して、発症前化合物（ａ）投与群はプラセボ投与群と比して、ステージ１度（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）、ステージ２度（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）、ステージ３度（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）、ステージ４度（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）の各項目においてそれぞれ有意差を持って延長していた（表１Ｂ）。
Figure 0005110536
２）発症後化合物（ａ）投与の臨床症候学的有効性：
Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスに、発症日より５ｍｇ／ｋｇの化合物（ａ）を連日経口に投与することにより、プラセボ投与群より、病悩期間を有意に延長させる病悩期間延長効果（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）を認めたことにより、生存期間を有意に延長させる生存期間延長効果（Ｐ＜０．００５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）をも示した（表２Ａ）。加えて、プラセボ投与群と比較した発症後化合物（ａ）投与群の生存期間（図９）と病悩期間（図１０）の２項目におけるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法のＬｏｇｒａｎｋ検定を施行したところ、両項目においてそれぞれ有意差を持って延長していた。すなわち、発症後化合物（ａ）投与によって、病悩期間延長効果に基づく生存期間延長効果の明らかな有効性を認めた。臨床症候学的評価の各ステージ度数の期間に関して、発症後化合物（ａ）投与群はプラセボ投与群と比して、ステージ３度（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）とステージ４度（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）の両項目においてそれぞれ有意差を持って延長していた（表２Ｂ）。
Figure 0005110536
３）発症前化合物（ｂ）投与治療の臨床症候学的有効性：
Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスに、生後８０日より５ｍｇ／ｋｇの化合物（ｂ）を連日経口に投与することにより、プラセボ投与群より、発症日を有意に遅延させる発症遅延効果（Ｐ＜０．００１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）、生存期間を有意に延長させる生存期間延長効果（Ｐ＜０．００１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）、病悩期間を有意に延長させる病悩期間延長効果（Ｐ＜０．０１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）を認めた（表３Ａ）。さらに、プラセボ投与群と比較した発症前化合物（ｂ）投与群の発症日（図１１）、生存期間（図１２）、病悩期間（図１３）における各項目におけるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法のＬｏｇｒａｎｋ検定を施行したところ、各項目においてそれぞれ有意差を持って延長していた。すなわち、発症前化合物（ｂ）投与によって、発症遅延効果、生存期間延長効果、病悩期間延長効果の各効果の明らかな有効性を認めた。臨床症候学的評価の各ステージ度数の期間に関して、発症前化合物（ｂ）投与群はプラセボ投与群と比して、ステージ１度（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）、ステージ２度（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）、ステージ３度（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）、ステージ４度（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）の各項目においてそれぞれ有意差を持って延長していた（表３Ｂ）。
Figure 0005110536
４）発症前化合物（ｃ）投与治療の臨床症候学的有効性：
Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスに、生後８０日より５ｍｇ／ｋｇの化合物（ｃ）を連日経口に投与することにより、プラセボ投与群より、発症日を有意に遅延させる発症遅延効果（Ｐ＜０．００１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）、生存期間を有意に延長させる生存期間延長効果（Ｐ＜０．００１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）、病悩期間を有意に延長させる病悩期間延長効果（Ｐ＜０．０１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）を認めた（表４Ａ）。さらに、プラセボ投与群と比較した発症前化合物（ｃ）投与治療群の発症日（図１４）、生存期間（図１５）、病悩期間（図１６）における各項目におけるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法のＬｏｇｒａｎｋ検定を施行したところ、各項目においてそれぞれ有意差を持って延長していた。すなわち、発症前化合物（ｃ）投与によって、発症遅延効果、生存期間延長効果、病悩期間延長効果の各効果の明らかな有効性を認めた。臨床症候学的評価の各ステージ度数の期間に関して、発症前化合物（ｃ）投与群はプラセボ投与群と比して、ステージ１度（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）、ステージ２度（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）、ステージ３度（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）、ステージ４度（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）の各項目においてそれぞれ有意差を持って延長していた（表４Ｂ）。
Figure 0005110536
５）発症後化合物（ｃ）投与の臨床症候学的有効性：
Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスに、発症日より５ｍｇ／ｋｇの化合物（ｃ）を連日経口に投与することにより、プラセボ投与群より、病悩期間を有意に延長させる病悩期間延長効果（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）を認めたことにより、生存期間を有意に延長させる生存期間延長効果（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）をも示した（表５Ａ）。加えて、プラセボ投与群と比較した発症後化合物（ｃ）投与群の生存期間（図１８）と病悩期間（図１９）の２項目におけるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法のＬｏｇｒａｎｋ検定を施行したところ、両項目においてそれぞれ有意差を持って延長していた。すなわち、発症後化合物（ｃ）投与によって、病悩期間延長効果に基づく生存期間延長効果の明らかな有効性を認めた。臨床症候学的評価の各ステージ度数の期間に関して、発症後化合物（ｃ）投与群はプラセボ投与群と比して、ステージ３度（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）とステージ４度（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）の両項目においてそれぞれ有意差を持って延長していた（表５Ｂ）。
Figure 0005110536
６）発症前アロプリノール投与治療の臨床症候学的有効性：
Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスに、生後８０日より５ｍｇ／ｋｇのアロプリノを連日経口に投与することにより、プラセボ投与群より、発症日を有意に遅延させる発症遅延効果（Ｐ＞０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）、生存期間を有意に延長させる生存期間延長（Ｐ＞０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）、病脳期間を有意に延長させる病悩期間延長効果（Ｐ＞０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）を認めなかった（表６Ａ）。さらに、プラセボ投与群と比較したアロプリノール投与治療群の発症日（図２１）、生存期間（図２２）、病脳期間（図２３）における各項目におけるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法のＬｏｇｒａｎｋ検定を施行したところ、各項目においてそれぞれ有意な延長を認めなかった。すなわち、発症前アロプリノール投与によって、発症遅延効果、生存期間延長効果、病脳期間延長効果の各効果の明らかな有効性を認めなかった。臨床症候学的評価の各ステージ度数の期間に関して、発症前アプリノール投与群はプラセボ投与群と比して、ステージ１度（Ｐ＞０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）、ステージ２度（Ｐ＞０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）、ステージ３度（Ｐ＞０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）、ステージ４度（Ｐ＞０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）、ステージ５度（Ｐ＞０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）の各項目においてそれぞれ有意差を認めなかった（表６Ｂ）。
Figure 0005110536
３．プラセボ・薬剤投与の各実験群の運動負荷試験の結果
１）プラセボ投与実験群：
プラセボ投与実験群の正常対照群である野生型同腹仔マウスでは、伸展反射試験、傾斜面角度試験、フットプリント試験、ロタロッド試験、ビームバランス試験の各運動負荷試験において、それぞれのスコアーは全経過を通じて１０匹全例スコアー＝０であった。
プラセボ投与実験群におけるＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの各運動負荷試験の評価に関しては、以下の如くである。すなわち、伸展反射試験のスコアーは、生後７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日ではスコアー＝０．０±０．０、１００日ではスコアー＝０．４±０．５、１０５日ではスコアー＝１．０±０．０、１１０日ではスコアー＝１．４±０．５、１１５日ではスコアー＝１．９±０．３、１２０日以降１４０日まではスコアー＝２．０±０．０であった（表７〜表９）。傾斜面角度試験のスコアーは、生後７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日、１００日ではスコアー＝０．０±０．０、１０５日ではスコアー＝０．２±０．４、１１０日ではスコアー＝１．０±０．８、１１５日ではスコアー＝２．３±０．５、１２０日以降１４０日まではスコアー＝３．０±０．０であった（表１０〜表１２）。フットプリント試験のスコアーは、生後７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日ではスコアー＝０．０±０．０、１００日ではスコアー＝０．４±０．５、１０５日ではスコアー＝１．４±０．５、１１０日ではスコアー＝２．３±０．５、１１５日ではスコアー＝３．３±０．５、１２０日以降１４０日まではスコアー＝４．０±０．０であった（表１３〜表１５）。ロタロッド試験のスコアーは、生後７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日ではスコアー＝０．０±０．０、１００日ではスコアー＝０．７±０．８、１０５日ではスコアー＝２．１±０．９、１１０日以降１４０日まではスコアー＝３．０±０．０であった（表１６〜表１８）。ビームバランス試験のスコアーは、生後７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日ではスコアー＝０．０±０．０、１００日ではスコアー＝０．４±０．５、１０５日ではスコアー＝１．４±０．５、１１０日以降１４０日まではスコアー＝２．０±０．０であった（表１９〜表２１）。
２）発症前化合物（ａ）投与治療実験群：
発症前化合物（ａ）投与治療実験群におけるＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの各運動負荷試験の評価に関しては、以下の如くである。すなわち、伸展反射試験のスコアーは、生後７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日、１００日、１０５日ではスコアー＝０．０±０．０、１１０日ではスコアー＝０．１±０．３、１１５日ではスコアー＝０．５±０．５、１２０日ではスコアー＝０．９±０．７、１２５日ではスコアー＝１．５±０．５、１３０日ではスコアー＝１．９±０．３、１３５日及び１４０日まではスコアー＝２．０±０．０であった（表７）。傾斜面角度試験のスコアーは、生後７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日、１００日、１０５日、１１０日ではスコアー＝０．０±０．０、１１５日ではスコアー＝０．１±０．３、１２０日ではスコアー＝０．４±０．５、１２５日ではスコアー＝１．１±０．９、１３０日ではスコアー＝２．１±０．９、１３５日ではスコアー＝２．７±０．５、１４０日ではスコアー＝３．０±０．０であった（表１０）。フットプリント試験のスコアーは、生後７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日、１００日、１０５日ではスコアー＝０．０±０．０、１１０日ではスコアー＝０．１±０．３、１１５日ではスコアー＝０．６±０．７、１２０日ではスコアー＝１．８±０．９、１２５日ではスコアー＝２．８±０．４、１３０日ではスコアー＝３．４±０．５、１３５日ではスコアー＝３．９±０．３、１４０日ではスコアー＝４．０±０．０であった（表１３）。ロタロッド試験のスコアーは、生後７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日、１００日、１０５日ではスコアー＝０．０±０．０、１１０日ではスコアー＝０．３±０．７、１１５日ではスコアー＝１．２±１．３、１２０日ではスコアー＝２．２±０．９、１２５日ではスコアー＝２．７±０．５、１３０日以降１４０日まではスコアー＝３．０±０．０であった（表１６）。ビームバランス試験のスコアーは、生後７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日、１００日、１０５日ではスコアー＝０．０±０．０、１１０日ではスコアー＝０．１±０．３、１１５日ではスコアー＝０．７±０．８、１２０日ではスコアー＝１．２±０．９、１２５日ではスコアー＝１．７±０．５、１３０日以降１４０日まではスコアー＝２．０±０．０であった（表１９）。
３）発症前化合物（ｂ）投与治療実験群：
発症前化合物（ｂ）投与治療実験群におけるＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの各運動負荷試験の評価に関しては、以下の如くである。すなわち、伸展反射試験のスコアーは、生後７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日、１００日、１０５日ではスコアー＝０．０±０．０、１１０日ではスコアー＝０．１±０．３、１１５日ではスコアー＝０．５±０．５、１２０日ではスコアー＝１．３±０．５、１２５日ではスコアー＝１．８±０．４、１３０日以降１４０日まではスコアー＝２．０±０．０であった（表８）。傾斜面角度試験のスコアーは、生後７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日、１００日、１０５日、１１０日ではスコアー＝０．０±０．０、１１５日ではスコアー＝０．１±０．３、１２０日ではスコアー＝０．６±０．７、１２５日ではスコアー＝１．４±０．７、１３０日ではスコアー＝２．３±０．７、１３５日ではスコアー＝２．９±０．３、１４０日ではスコアー＝３．０±０．０であった（表１１）。フットプリント試験のスコアーは、生後７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日、１００日、１０５日ではスコアー＝０．０±０．０、１１０日ではスコアー＝０．１±０．３、１１５日ではスコアー＝０．６±０．７、１２０日ではスコアー＝１．８±１．０、１２５日ではスコアー＝２．８±０．４、１３０日ではスコアー＝３．４±０．５、１３５日ではスコアー＝３．９±０．３、１４０日ではスコアー＝４．０±０．０であった（表１４）。ロタロッド試験のスコアーは、生後７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日、１００日、１０５日ではスコアー＝０．０±０．０、１１０日ではスコアー＝０．５±０．７、１１５日ではスコアー＝１．３±１．１、１２０日ではスコアー＝２．５±０．５、１２５日以降１４０日まではスコアー＝３．０±０．０であった（表１７）。ビームバランス試験のスコアーは、生後７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日、１００日、１０５日ではスコアー＝０．０±０．０、１１０日ではスコアー＝０．１±０．３、１１５日ではスコアー＝０．６±０．７、１２０日ではスコアー＝１．５±０．５、１２５日以降１４０日まではスコアー＝２．０±０．０であった（表２０）。
４）発症前化合物（ｃ）投与治療実験群：
発症前化合物（ｃ）投与治療実験群におけるＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの各運動負荷試験の評価に関しては、以下の如くである。すなわち、伸展反射試験のスコアーは、生後７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日、１００日、１０５日ではスコアー＝０．０±０．０、１１０日ではスコアー＝０．１±０．３、１１５日ではスコアー＝０．５±０．５、１２０日ではスコアー＝１．１±０．６、１２５日ではスコアー＝１．７±０．５、１３０日以降１４０日まではスコアー＝２．０±０．０であった（表９）。傾斜面角度試験のスコアーは、生後７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日、１００日、１０５日、１１０日ではスコアー＝０．０±０．０、１１５日ではスコアー＝０．１±０．３、１２０日ではスコアー＝０．８±０．６、１２５日ではスコアー＝１．２±０．８、１３０日ではスコアー＝２．３±０．７、１３５日ではスコアー＝２．９±０．３、１４０日ではスコアー＝３．０±０．０であった（表１２）。フットプリント試験のスコアーは、生後７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日、１００日、１０５日ではスコアー＝０．０±０．０、１１０日ではスコアー＝０．１±０．３、１１５日ではスコアー＝０．７±０．８、１２０日ではスコアー＝１．６±１．０、１２５日ではスコアー＝２．７±０．５、１３０日ではスコアー＝３．３±０．５、１３５日ではスコアー＝３．９±０．３、１４０日ではスコアー＝４．０±０．０であった（表１５）。ロタロッド試験のスコアーは、生後７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日、１００日、１０５日ではスコアー＝０．０±０．０、１１０日ではスコアー＝０．４±０．８、１１５日ではスコアー＝１．３±１．３、１２０日ではスコアー＝２．５±０．５、１２５日以降１４０日まではスコアー＝３．０±０．０であった（表１８）。ビームバランス試験のスコアーは、生後７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日、１００日、１０５日ではスコアー＝０．０±０．０、１１０日ではスコアー＝０．１±０．３、１１５日ではスコアー＝０．７±０．８、１２０日ではスコアー＝１．４±０．７、１２５日以降１４０日まではスコアー＝２．０±０．０であった（表２１）。
４．薬剤の有効性の運動負荷試験の解析結果
１）発症前化合物（ａ）投与治療の運動負荷試験における有効性：
Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスに、生後８０日より５ｍｇ／ｋｇの化合物（ａ）を連日経口に投与することにより、伸展反射試験に関しては、プラセボ投与群に比べて、１０５日、１１０日、１１５日、１２０日において、有意な有効効果（Ｐ＜０．００５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）を示した（表７）。傾斜面角度試験に関しては、プラセボ投与群に比べて、１１０日、１１５日、１２０日、１２５日、１３０日において、有意な有効効果（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）を示した（表１０）。フットプリント試験に関しては、プラセボ投与群に比べて、１０５日、１１０日、１１５日、１２０日、１２５日、１３０日において、有意な有効効果（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）を示した（表１３）。ロタロッド試験に関しては、プラセボ投与群に比べて、１０５日、１１０日、１１５日において、有意な有効効果（Ｐ＜０．００５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）を示した（表１６）。ビームバランス試験に関しては、プラセボ投与群に比べて、１０５日、１１０日、１１５日において、有意な有効効果（Ｐ＜０．００５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）を示した（表１９）。
２）発症前化合物（ｂ）投与治療の運動負荷試験における有効性：
Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスに、生後８０日より５ｍｇ／ｋｇの化合物（ｂ）を連日経口に投与することにより、伸展反射試験に関しては、プラセボ投与群に比べて、１０５日、１１０日、１１５日、１２０日において、有意な有効効果（Ｐ＜０．０１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）を示した（表８）。傾斜面角度試験に関しては、プラセボ投与群に比べて、１１０日、１１５日、１２０日、１２５日、１３０日において、有意な有効効果（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）を示した（表１１）。フットプリント試験に関しては、プラセボ投与群に比べて、１０５日、１１０日、１１５日、１２０日、１２５日、１３０日において、有意な有効効果（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）を示した（表１４）。ロタロッド試験に関しては、プラセボ投与群に比べて、１０５日、１１０日、１１５日において、有意な有効効果（Ｐ＜０．００１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）を示した（表１７）。ビームバランス試験に関しては、プラセボ投与群に比べて、１０５日、１１０日、１１５日において、有意な有効効果（Ｐ＜０．００１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）を示した（表２０）。
３）発症前化合物（ｃ）投与治療の運動負荷試験における有効性：
Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスに、生後８０日より５ｍｇ／ｋｇの化合物（ｃ）を連日経口に投与することにより、伸展反射試験に関しては、プラセボ投与群に比べて、１０５日、１１０日、１１５日、１２０日において、有意な有効効果（Ｐ＜０．００５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）を示した（表９）。傾斜面角度試験に関しては、プラセボ投与群に比べて、１１０日、１１５日、１２０日、１２５日、１３０日において、有意な有効効果（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）を示した（表１２）。フットプリント試験に関しては、プラセボ投与群に比べて、１０５日、１１０日、１１５日、１２０日、１２５日、１３０日において、有意な有効効果（Ｐ＜０．０１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）を示した（表１５）。ロタロッド試験に関しては、プラセボ投与群に比べて、１０５日、１１０日、１１５日において、有意な有効効果（Ｐ＜０．００５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）を示した（表１８）。ビームバランス試験に関しては、プラセボ投与群に比べて、１０５日、１１０日、１１５日において、有意な有効効果（Ｐ＜０．００５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）を示した（表２１）。
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５．プラセボ・薬剤投与の各実験群の病理組織学的検索結果
１）プラセボ投与実験群：
プラセボ投与実験群におけるＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスにおいては、頸髄における脊髄細胞数＝４．３±３．５、胸髄における脊髄細胞数＝２．５±４．３、腰髄における脊髄細胞数＝３．７±２．４であった。（表２２、２３、２４、２５）。
２）発症前化合物（ａ）投与治療実験群：
発症前化合物（ａ）投与治療実験群におけるＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスにおいては、頸髄における脊髄細胞数＝３．３±３．１、胸髄における脊髄細胞数＝１．６±２．１、腰髄における脊髄細胞数＝３．７±３．３であった（表２２）。
３）発症後化合物（ａ）投与治療実験群：
発症後化合物（ａ）投与治療実験群におけるＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスにおいては、頸髄における脊髄細胞数＝４．８±３．７、胸髄における脊髄細胞数＝２．３±２．２、腰髄における脊髄細胞数＝４．１±４．４であった（表２３）。
４）発症前化合物（ｂ）投与治療実験群：
発症前化合物（ｂ）投与治療実験群におけるＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスにおいては、頸髄における脊髄細胞数＝４．６±２．０、胸髄における脊髄細胞数＝１．９±１．７、腰髄における脊髄細胞数＝５．３±２．７であった（表２４）。
５）発症前化合物（ｃ）投与治療実験群：
発症前化合物（ｃ）投与治療実験群におけるＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスにおいては、頸髄における脊髄細胞数＝５．２±４．３、胸髄における脊髄細胞数＝１．６±１．７、腰髄における脊髄細胞数＝４．１±３．８あった（表２５）。
６．薬剤投与治療による病理組織学的解析結果
１）発症前化合物（ａ）投与治療による病理組織学的解析結果：
Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスに生後８０日より５ｍｇ／ｋｇの化合物（ａ）を連日経口に投与した治療実験群の終末病理組織像の脊髄前角細胞数とプラセボ投与実験群の終末病理組織像の脊髄前角細胞数との間には、頸髄、胸髄、腰髄において、それぞれ有意差は見られなかった（表２２）（Ｐ＞０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）。
２）発症後化合物（ａ）投与治療による病理組織学的解析結果：
Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスに発症日より５ｍｇ／ｋｇの化合物（ａ）を連日経口に投与した治療実験群の終末病理組織像の脊髄前角細胞数とプラセボ投与実験群の終末病理組織像の脊髄前角細胞数との間には、頸髄、胸髄、腰髄において、それぞれ有意差は見られなかった（表２３）（Ｐ＞０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）。
３）発症前化合物（ｂ）投与治療による病理組織学的解析結果：
Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスに生後８０日より５ｍｇ／ｋｇの化合物（ｂ）を連日経口に投与した治療実験群の終末病理組織像の脊髄前角細胞数とプラセボ投与実験群の終末病理組織像の脊髄前角細胞数との間には、頸髄、胸髄、腰髄において、それぞれ有意差は見られなかった（表２４）（Ｐ＞０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）。
４）発症前化合物（ｃ）投与治療による病理組織学的解析結果：
Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスに生後８０日より５ｍｇ／ｋｇの化合物（ｃ）を連日経口に投与した治療実験群の終末病理組織像の脊髄前角細胞数とプラセボ投与実験群の終末病理組織像の脊髄前角細胞数との間には、頸髄、胸髄、腰髄において、それぞれ有意差は見られなかった（表２５）（Ｐ＞０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）。
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Claims (4)

  1. 次の一般式（１）、（２）又は（３）で表される化合物又はその塩を含有することを特徴とする筋萎縮性側索硬化症治療薬。
    Figure 0005110536
    （式中、Ｒ1は水素原子、ハロゲン原子又はアミノ基を示し；
    Ｒ2はカルボキシル基又はＣ1-4アルコキシカルボニル基を示し；
    Ｒ3はハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ1-4アルコキシ、カルボキシ、Ｃ1-4アルコキシカルボニル及びアシルオキシから選ばれる１〜２個の置換基を有していてもよいＣ4-6アルキル基、Ｃ3-6シクロアルキル基又はＣ3-6シクロアルキル−Ｃ1-4アルキル基を示し；
    Ｒ4は、ハロゲン、シアノ及びフェニルから選ばれる１〜２個の置換基を有していてもよいピリジル基；又はシアノ、ニトロ、Ｃ1-4アルコキシ、Ｎ−Ｃ1-4アルキルピペラジノ、Ｃ1-4アルキルチオ、フェニルチオ及びＣ1-4アルキルアミノから選ばれる１〜２個の置換基を有していてもよいフェニル基を示し；
    Ｒ5はシアノ、Ｃ1-4アルキル、ハロゲン、Ｃ1-4アルコキシ及びＣ1-4アルキルチオから選ばれる置換基を有していてもよいピリジル基を示し；
    Ｒ6は水素原子、又はピバロイルオキシ−Ｃ1-4アルキル基を示し；
    Ｒ7はカルボキシル基、Ｃ1-6アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、又はモノ−もしくはジ−Ｃ1-6アルキルアミノカルボニル基を示し；
    Ｒ8は水素原子、Ｃ1-6アルキル基又はフェニル基を示し；
    Ｒ9は水素原子又はＣ1-10アルキル基を示す。）
  2. 式（１）中のＲ1が水素原子、ハロゲン原子又はアミノ基であり；Ｒ2がカルボキシル基又はＣ1-4アルコキシカルボニル基であり；Ｒ3がＣ4-6アルキル基、Ｃ3-6シクロアルキル基又はＣ3-6シクロアルキル−Ｃ1-4アルキル基であり；
    式（２）中のＲ4がシアノ、ハロゲン、Ｃ1-6アルコキシ及びＣ1-6アルキルチオから選ばれる１又は２個の置換基を有するピリジル基であり；Ｒ5がシアノ、ハロゲン、Ｃ1-6アルコキシ及びＣ1-6アルキルチオから選ばれる１又は２個の置換基を有していてもよいピリジル基であり；Ｒ6が水素原子であり；
    式（３）中のＲ7がカルボキシル基又はＣ1-6アルコキシカルボニル基であり；
    Ｒ8が水素原子又はＣ1-6アルキル基であり；
    Ｒ9がＣ1-8アルキル基である請求項１記載の筋萎縮性側索硬化症治療薬。
  3. 式（１）中のＲ1が水素原子、Ｒ2がカルボキシル基、Ｒ3がＣ4-6アルキル基であり；式（２）中のＲ4がシアノピリジル基、Ｒ5がピリジル基、Ｒ6が水素原子であり；式（３）中のＲ7がカルボキシル基、Ｒ8がＣ1-6アルキル基であり、Ｒ9がＣ2-6アルキル基である請求項１又は２記載の筋萎縮性側索硬化症治療薬。
  4. 式（１）中のＲ1が水素原子、Ｒ2がカルボキシル基、Ｒ3がネオペンチル基であり；式（２）中のＲ4が２−シアノピリジン−４−イル基であり、Ｒ5がピリジン−４−イル基、Ｒ6が水素原子であり；式（３）中のＲ7がカルボキシル基、Ｒ8がメチル基、Ｒ9がイソブチル基である請求項１〜３のいずれか１項記載の筋萎縮性側索硬化症治療薬。
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JPN7012003210; ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ ７, 1996, ｐ．１９７０-１９７２ *

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