JP5099781B2 - 顆粒型培養骨用培養容器 - Google Patents

Description

本発明は、顆粒型培養骨用培養容器、特に顆粒型培養骨を効率的に製造することのできる培養容器に関する。

歯科口腔外科領域などで認められる、比較的小さく複雑な形態の骨欠損を回復する際には、ブロックタイプの培養骨よりも顆粒型培養骨の方が骨再生材料として適切である。この顆粒型培養骨を製造する際には、シャーレ等の中に顆粒を手作業で入れて、その上に細胞を播種、培養する方法が一般的である。さらに、１５ｍｌ程度の容量の遠心用チューブに手作業で擬似骨顆粒を入れ、その上に細胞を播種し、遠心を行う方法も用いられており、このチューブは汎用されているチューブラックに立てかけて使用されている。（非特許文献１）。
しかしながら、前記のチューブおよびチューブ立ては顆粒型人工骨用に設計されておらず、静電気等による顆粒の飛散、取り出し時の顆粒の分散など操作性の悪さと、作業中のコンタミネーションの可能性など、実際に医療現場で培養し、施術に用いるには不適当であった。
Matsubara et al. J Bone Miner Res. 20,3(2005), 399-409

本発明は上記従来技術に鑑み行われたものであり、その解決すべき課題は顆粒型培養骨を効率的に製造することのできる顆粒型培養骨用培養容器を提供することにある。

前記課題を解決するために本発明者らが鋭意研究を行った結果、深底培養容器に誘導溝を備えた培養チューブおよびチューブ立てを備え、培養チューブ内に滅菌された多孔質擬似骨顆粒を入れることにより、培養チューブに均等に振動を与えられ、かつ静置を行うことができ、効率的に顆粒型培養骨を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明の顆粒型培養骨用培養容器は、顆粒型培養骨を培養する培養チューブが、顆粒型培養骨を培養する培養チューブが、ぐらつかないようにチューブ立てに立てられている培養容器であって、該培養チューブは高さが７０ｍｍ以上の深底容器であり、かつ、底部より上部開口に至る誘導溝を備え、チューブの中に滅菌された多孔質擬似骨顆粒が入っていることを特徴とする。
前記多孔質擬似骨顆粒は乾燥時みかけ比重が培養液よりも小さく、培養液中で該培養液を吸液し、沈降する多孔質体であることが好適である。
前記多孔質擬似骨顆粒は培養チューブの培養液中を１分以上、３０分以下で沈降することが好適である。
前記多孔質擬似骨顆粒がβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）、ハイドロキシアパタイト、乾燥骨粉を含む多孔質生体吸収性顆粒より選択される一種または二種以上であることが好適である。
前記容器は、細胞を播種する工程において、培養液投入の際に２０〜１２０Ｈｚでの振動播種に用いられることが好適である。

本発明によれば、すべてのチューブに均等に振動および静置を与えられる顆粒型培養骨用培養容器を得ることができる。また、滅菌された多孔質擬似骨顆粒が入っている該培養容器により、顆粒型培養骨を効率的に製造することができる。

以下、本発明の好適な実施形態について説明する。はじめに、本発明の培養容器により効率的に製造が可能である顆粒型培養骨について説明する。顆粒型培養骨は、骨髄液の採取、骨髄由来間葉系幹細胞の培養、間葉系幹細胞の播種、培養骨芽細胞様細胞への分化誘導を行うことにより製造することができる。
なお、以下の工程は、骨髄液を用いた形態を示しているが、本発明の培養容器は、骨髄液以外にも、骨膜、脂肪、末梢血等から分離培養し、同様の方法で培養骨芽細胞様細胞へと分化誘導することによって作製される顆粒型培養骨においても、好適に使用することができる。

・骨髄液の採取
骨髄液は、手術の約１ヶ月前に採取する。まず、骨髄液採取部に麻酔を行い、後上腸骨陵より無菌的に吸引して回収する。

・骨髄由来間葉系幹細胞の培養
細胞培養用培地で４倍希釈した骨髄液１０を細胞培養用フラスコ１２に播いて、図１（Ａ）のように炭酸ガス培養を始め、培養開始後４日目に全量培地替えを行う。なお、細胞培養用培地には、一次培養、分化培養ともに、血清入りαＭＥＭまたは無血清培地のいずれも使用できる。
培養過程における一般細菌および真菌に感染していないことの確認は、培地交換毎の培地の観察（感染していれば培地が濁る）により行うとともに、培養開始時、分化誘導前および培養骨芽細胞様細胞の回収時に無菌試験（日本薬局方の基準を満たすかどうか）で確認する。
その後、週２回全量培地交換を行う。継代のタイミングは細胞の状態を見て判断するが、培養開始から約２１〜２８日後に行う。継代時には生細胞数および細胞数を計測する。

・間葉系幹細胞の播種
継代は以下のように行う。フラスコの培地を吸い取った後、ダルベコリン酸バッファー（Ｄ−ＰＢＳ）にて洗浄し、その後、Ｄ−ＰＢＳを吸い取り、細胞解離剤を加え、３７℃で１０分間培養する。細胞がはがれていることを確認したのち、Ｄ−ＰＢＳまたは培地を加え細胞を回収した後、遠心する。培地に再サスペンドして細胞数を計測する。計測後、図１（Ｂ）のような多孔質擬似骨顆粒１４があらかじめ入っている培養チューブ１６に、培養した骨髄液１０を投入する。５０ｍｇの多孔質擬似骨顆粒１４に対し、100,000〜1,000,000の細胞を播種するが、500,000程度の細胞を播種することが好ましい。多孔質擬似骨顆粒１４の入った培養チューブ１６に、培養した骨髄液１０を投入すると、図１（Ｃ）のように細胞は浮遊し、多孔質擬似骨顆粒１４は浮揚する。
培養した骨髄液１０の投入の際には、培養チューブ１６に緩やかな振動を与えることが好適である。培養チューブ１６に加える振動数を調整することにより、細胞と擬似骨顆粒１４との沈降速度を適合させ、擬似骨顆粒１４上に細胞が適切に播種することができる。特に２０〜１２０Ｈｚ程度の振動をバイオシェーカー等により与えることが好適であるが、その他の機器を用いて同等の振幅を与えてもよい。全く振動を与えないと、擬似骨顆粒が培養液と分離してしまい、沈降に長い時間を有する場合がある。

・培養骨芽細胞様細胞への分化誘導
多孔質擬似骨顆粒１４に細胞を播種してから細胞の機能回復のために一晩静置する。１日後には、図１（Ｄ）のように骨形成に関与する細胞等の細胞および多孔質擬似骨顆粒１４は培養チューブ１６の下部に沈んでいる。このことを確認した後、培地を分化誘導培地に交換する。分化誘導期間は１〜３週間で、培地交換は週２回程度行う。分化誘導が進んでいくと、図１（Ｅ）のように、擬似骨顆粒１４のまわりに培養骨芽細胞様細胞が集まっていく。
分化確認試験（ＡＬＰ活性測定）を行い、分化していることを確認して、培養骨芽細胞様細胞を得る。

本発明の顆粒型培養骨用培養容器は、多孔質擬似骨顆粒に培養した間葉系幹細胞を播種し、分化誘導を行い、培養骨芽細胞様細胞を得る際に使用される。図２、図３は本発明の顆粒型培養骨用培養容器１８を示した図である。本発明における顆粒型培養骨用培養容器１８は、培養チューブ１６およびチューブ立て２０から構成される。

培養チューブ
本発明の培養チューブ１６は、樹脂、ガラスなど通常チューブに用いられる材料からなる深底容器である。
すなわち、本実施形態にかかる培養チューブ１６は、図４に示すように、円筒状深底容器であり、その容量は１０〜２０ｍｌ、高さは７０ｍｍ〜１５０ｍｍであることが好適である。高さがあまりに低いと擬似骨顆粒による細胞担持が十分に行われない場合がある。また、高さがあまりに高いと取り扱い性が悪く、特に培養終了時に培養骨の取り出しが困難となる場合がある。

また、本実施形態にかかる培養チューブ１６は、その側壁内面に底部より上部開口に至る誘導溝２２を有している。誘導溝２２の幅は擬似骨顆粒の量により左右されるが、５０ｍｇの擬似骨顆粒では３〜５ｍｍであることが好適である。
培養終了時には、培養骨は骨芽細胞等が出す細胞間物質（膠原線維等）により粘着性を有しており、過度の撹拌は細胞にストレスを与えることとなる。また、取り出し後の培養骨塊は、そのまま施術に用いられるよう、塊状を維持していることが好ましい。このため、培養骨塊をばらけさせることなく取り出しやすいように、誘導溝２２を設けているのである。

また、本発明の培養チューブ１６の中には、あらかじめ高圧蒸気により滅菌された多孔質擬似骨顆粒１４が入っている。この多孔質擬似骨顆粒１４は、乾燥時みかけ比重が培養液よりも小さい擬似骨顆粒を好適に使用することができる。すなわち、多孔質擬似骨顆粒１４は、β−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）、ハイドロキシアパタイト、乾燥骨粉ないしこれらの混合物等であることが好適であり、β−リン酸三カルシウムであることが特に好適である。β−リン酸三カルシウムは市販品としてアパセラム、ボーンセラム、ボーンフィル、セラタイト、骨補填剤オスフェリオン（オリンパステルモバイオマテリアル社）などとして入手することができる。本発明の培養容器で製造する培養骨は、β−リン酸三カルシウムを骨補填剤としてではなく細胞の足場として検討している。β−リン酸三カルシウムの顆粒径は、０．１〜１．５ｍｍであることが好適である。

本発明にかかる顆粒型培養骨用培養容器１８は、顆粒型培養骨製造の際の間葉系幹細胞を播種する工程において使用されるが、多孔質擬似骨顆粒１４は、培養チューブ１６内で滅菌された乾燥状態にある。ここに培養した骨髄液１０を投入すると、図１（Ｃ）に示すように、多孔質擬似骨顆粒１４が培養液中に浮揚する。その後、多孔質擬似骨顆粒１４は培養液を吸液し、徐々に沈降し、図１（Ｄ）に示すように沈殿する。このように、多孔質擬似骨顆粒１４を一時的に浮揚状態とし、その後数分間かけて沈降させることにより、多孔質擬似骨顆粒１４への細胞付着が極めて効率的に行われ、培養骨の収率および骨再生確率の大幅な向上が可能となる。

多孔質擬似骨顆粒１４に浮遊状態の幹細胞を高密度で担持させるため、培養チューブ１６は７０ｍｍ以上の深さを有することが好適であり、また、多孔質擬似骨顆粒１４は、培養液中を１〜３０分程度で沈降することが好ましい。沈降速度があまりに速いと、細胞担持が十分に行われない場合があり、沈降速度があまりに遅いと、長時間の浮遊による細胞活性の低下が大きくなる場合がある。

本発明にかかる顆粒型培養骨用培養容器１８には、培養チューブ１６にあらかじめ滅菌された多孔質擬似骨顆粒１４が入っていることにより、培養骨を製造する際に、容器および顆粒を滅菌する手間がかからなくなり、顆粒型培養骨を効率的に製造することができる。また、チューブ用キャップ２４を備えることにより、容易に顆粒型培養骨を移動および保存することができる。

チューブ立て
本発明のチューブ立て２０は、チューブ立て下部２６、チューブ立て用フタ２８からなり、各種プラスチックなど通常チューブ立てに用いられる材料からなっている。チューブ立て２０に収容できる培養チューブ１６の数は特に限定はないが１〜２４本収容できることが好適である。
チューブ立て下部２６は本発明の培養チューブ１６の形状に合わせて作られており、培養チューブ１６を固定することができる。このため、培養液投入の際の振動を均等に与えることも可能であるし、静置も容易にすることができる。

顆粒型培養骨製造方法の概略工程図。 本発明の顆粒型培養骨用培養容器の構成図。 顆粒型培養骨用培養容器を横から見た図。

符号の説明

１０…骨髄液
１２…細胞培養用フラスコ
１４…多孔質擬似骨顆粒
１６…培養チューブ
１８…顆粒型培養骨用培養容器
２０…チューブ立て
２２…誘導溝
２４…チューブ用キャップ
２６…チューブ立て下部
２８…チューブ立て用フタ

Claims (5)

1. 顆粒型培養骨を培養する培養チューブが、ぐらつかないようにチューブ立てに立てられている培養容器であって、
   該培養チューブは高さが７０ｍｍ以上の深底容器であり、かつ、底部より上部開口に至る誘導溝を備え、チューブの中に滅菌された多孔質擬似骨顆粒が入っていることを特徴とする顆粒型培養骨用培養容器。
2. 多孔質擬似骨顆粒は乾燥時みかけ比重が培養液よりも小さく、培養液中で該培養液を吸液し、沈降する多孔質体であることを特徴とする請求項１に記載の顆粒型培養骨用培養容器。
3. 多孔質擬似骨顆粒は培養チューブの培養液中を１分以上、３０分以下で沈降することを特徴とする請求項１または２に記載の顆粒型培養骨用培養容器。
4. 多孔質擬似骨顆粒がβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）、ハイドロキシアパタイト、乾燥骨粉を含む多孔質生体吸収性顆粒より選択される一種または二種以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の顆粒型培養骨用培養容器。
5. 細胞を播種する工程において、培養液投入の際に２０〜１２０Ｈｚでの振動播種に用いられることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の顆粒型培養骨用培養容器。

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