JP2009297142A - リン酸カルシウム系顆粒上での効率的３次元高密度培養による培養人工骨及びその作成方法 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞の増殖が速く、しかも、取り扱いが容易な人工骨と、その作成方法とを開発する。
【解決手段】本発明は、多孔質の顆粒状担体と、該担体を収容する生体吸収性ポリマー製容器とを含む人工骨基材を提供する。本発明の人工骨基材において、前記担体は顆粒状リン酸カルシウムの場合がある。前記容器は前記生体吸収性ポリマーからなる繊維によるメッシュ状の袋の場合がある。本発明は、前記細胞及び担体が前記容器に収容された状態で前記人工骨を生体内の骨欠損部に移植するための人工骨の調製方法を提供する。本発明の人工骨の調製方法は、硬組織に分化することができる細胞と、本発明の人工骨基材とを用意するステップと、前記細胞を付着させた前記担体を前記容器に密封するステップと、前記細胞を培養下で増殖し骨芽細胞へ分化させるために誘導前記細胞が前記容器に収容された状態で培養するステップとを含む。
【選択図】なし

Description

本発明は、培養人工骨及びその作成方法に関し、具体的には、リン酸カルシウム系顆粒上での効率的３次元高密度培養による培養人工骨及びその作成方法に関する。

骨は、コラーゲンなどの有機成分にリン酸カルシウムが石灰化して形成されている。正常な骨には骨芽（造骨）細胞と破骨細胞が存在し、ホルモンやビタミンの調節を受けて骨の形成と破壊（吸収）が常に繰り返されている。

一方、歯周病（歯槽膿漏）は、歯と歯肉の隙間で歯周病菌が増殖して炎症を起こす疾患で、年齢とともにその罹患率は高くなっている。歯周病で特に問題となるのは、炎症に伴い骨の吸収が昂進し、歯槽骨が欠損して歯が抜けることである。歯槽骨の修復は、欠損部にリン酸カルシウムを埋め込み、骨と一体化するのを待つことになるが、移植したリン酸カルシウムが異物として認識され、一体化されない場合がある。

そこで、生体との親和性を高めるため、多孔質ブロックや顆粒状としたリン酸カルシウムの表面に、患者の骨膜細胞や歯根膜細胞を定着させたのち移植させる方法が開発された。例えば、特許文献１には、多孔質ハイドロキシアパタイト・ブロック体に細胞を播種、培養し石灰化を誘導することを特徴とする培養人工骨の作成方法が説明される。
特願２００７−０５１１５３明細書

しかし、多孔質ブロックは取り扱いが楽であるが内部まで細胞が定着しにくい。顆粒状リン酸カルシウムでは細胞の増殖は速いが、３次元細胞集団を形成させることが困難であるとともに、移植前に顆粒を集める操作が煩雑である。そこで、細胞の増殖が速く、しかも、取り扱いが容易な人工骨と、その作成方法とを開発する必要がある。

本発明は、多孔質の顆粒状担体と、該担体を収容する生体吸収性ポリマー製容器とを含む人工骨基材を提供する。

本発明の人工骨基材において、前記担体は顆粒状リン酸カルシウムの場合がある。

本発明の人工骨基材において、前記容器は前記生体吸収性ポリマーからなる繊維によるメッシュ状の袋の場合がある。

本発明は、前記細胞及び担体が前記容器に収容された状態で前記人工骨を生体内の骨欠損部に移植するための人工骨の調製方法を提供する。本発明の人工骨の調製方法は、硬組織に分化することができる細胞と、本発明の人工骨基材とを用意するステップと、前記細胞を付着させた前記担体を前記容器に密封するステップと、前記細胞を培養下で増殖し骨芽細胞へ分化させるために誘導前記細胞が前記容器に収容された状態で培養するステップとを含む。

本発明の人工骨の調製方法において、前記細胞は骨膜又は歯根膜組織に由来し、前記骨欠損部は歯槽骨の欠損部の場合がある。

本発明は、前記細胞及び担体が前記容器に収容された状態で前記人工骨を生体内の骨欠損部に移植するための人工骨を提供する。本発明の人工骨は本発明の方法で調製される。

本発明は回転培養システムを提供する。本発明の回転培養システムは、硬組織に分化することができる細胞と、本発明の人工骨基材と、キャップ付の試験管と、該試験管の１本又は２本以上を装架することができるローテータと、該ローテータを駆動するモータとを含む回転培養装置とを含み、前記試験管の側壁には１個又は２個以上の貫通孔が設けられ、該貫通孔は、通気性があり、かつ、透水性のない膜で閉塞されている。

本発明の回転培養システムは電源としての電池を含む場合がある。

本発明の回転培養システムは、前記試験管及び回転培養装置を収容する気密容器と、該気密容器内のガス組成及び／又は圧力の制御装置と、前記気密容器内温度の制御装置とを含む場合がある。

本発明の回転培養システムは、前記試験管及び気密容器はプラスチックでできており、前記ガス組成及び圧力の制御装置はガス発生剤又はガス吸収剤の場合がある。

本発明は、前記細胞及び担体が前記容器に収容された状態で前記人工骨を生体内の骨欠損部に移植するための人工骨を提供する。本発明の人工骨は、本発明の回転培養システムを用いて調製される。

本発明の人工骨において、前記細胞は骨膜又は歯根膜組織に由来し、前記骨欠損部は歯骨の欠損部の場合がある。

以下に説明する本発明の実施態様は例示であって、本発明の特許請求の範囲はこれらの説明により何ら制限されるものではない。

本発明の人工骨基材に含まれる担体は、多孔質の顆粒状担体で、硬組織に分化することができる細胞が定着すること、かつ、前記細胞が定着した担体を生体内に移植するとき、移植された硬組織と一体化することを条件として、いかなる材料でできていてもかまわない。前記担体は水酸アパタイト等のリン酸カルシウム系の材料でできていることが好ましい。顆粒状リン酸カルシウムであることがより好ましい。商業的に入手可能な顆粒状リン酸カルシウムには、アパセラム（登録商標、ＨＯＹＡ株式会社）、オスフェリオン（登録商標、オリンパス光学工業株式会社）等がある。本発明の顆粒状担体の粒径は、本発明の人工骨基材に含まれる容器から漏出しないこと、及び、流動状態で取扱い可能なこと、移植された硬組織と一体化することを条件としていかなるサイズであってもかまわない。

本発明の人工骨基材に含まれる容器は、生体吸収性ポリマーを材料とするものであって、本発明の人工骨基材に含まれる担体を漏出することなく収容し、硬組織に分化することができる細胞を前記担体に定着させた状態で培養することができ、前記担体に定着した前記細胞が培養条件下で増殖し、骨芽細胞へ分化することができるようことを条件として、いかなる形状・構造の容器であってもかまわない。前記容器は、生体吸収性ポリマーを含むか、あるいは生体吸収性ポリマーからなる繊維によるメッシュ状の袋であることが好ましい。前記容器は、前記担体と前記細胞とを収容した後で密封される。密封は例えば加熱によって行われる場合がある。前記容器の材料の生体吸収性とは、前記細胞が増殖し、骨芽細胞へ分化する期間中培養条件下で前記細胞を定着させた担体を漏出することなく収容することができ、かつ、生体内の骨欠損部に移植された後は分解して担体が骨と一体化することができる性質をいう。本発明の生体吸収性ポリマーは、ポリ乳酸及びポリグリコール酸を含むが、これらに限定されない。商業的に入手可能な生体吸収性ポリマー製容器には、例えばＶＩＣＲＹＬ（ポリグラクチン９１０、登録商標、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）がある。

本発明において、硬組織に分化することができる細胞とは、胚性幹細胞及び体性幹細胞のような多分化能幹細胞と、骨芽細胞、象牙芽細胞、エナメル芽細胞等の硬組織のみに分化することができる細胞とを含む。本発明の人工骨に用いられる硬組織に分化することができる細胞は、骨膜又は歯根膜の組織由来の細胞であることが好ましい。本発明の人工骨を移植する生体内の骨欠損部は、歯槽膿漏の結果生じた歯槽骨の欠損部の場合がある。

本発明の回転培養システムに含まれるキャップ付の試験管は、キャップと、試験管本体とを含む。前記キャップは前記試験管本体に固定されて試験管内部を無菌状態に保つ。前記キャップはねじ込み式で前記試験管本体に固定される場合がある。前記キャップは、可撓性又は弾性のある材料でできていて、前記試験管本体との摩擦係合によって前記試験管本体に固定されるプッシュオン式の場合もある。

前記試験管は、細胞培養に使用できるものであればいかなる材料でできていてもかまわないが、プラスチックでできていることが好ましい。好ましい試験管は、当業者に周知の使い捨て可能なプラスチック製品と同様に製造される。試験管のサイズはいかなるものでもかまわないが、汎用の１５ｍＬ又は５０ｍＬの使い捨てプラスチック製試験管と互換性のある外部寸法を有することが好ましい。前記試験管本体の内壁は、本発明の担体を含む容器が付着しないように表面処理されていることが好ましい。

本発明の試験管の本体には、試験管内外のガス交換のために１個又は２個以上の貫通孔が設けられる。該貫通孔が設けられる位置は、前記試験管本体の側壁である。前記貫通孔は膜で閉塞される。前記貫通孔の孔径、数及び配置は、前記膜によって試験管内部へのガス交換はできるが、前記試験管内部の培養液の漏出が起こらず、かつ、前記試験管内部の無菌状態が維持されることを条件としていかなるものであってもかまわない。

前記試験管本体の貫通孔を閉塞する膜は、通気性があり、かつ、透水性のないことを条件として、いかなるものであってもかまわない。好ましい膜は、米国マサチューセッツ州ボストン市のダイバーシファイド・バイオテク（Diversified Biotech）社のカタログ番号ＢＥＭ−１のように、通気性があって、透水性がないだけでなく、膜の一方の面が無菌で、かつ、粘着性があって、前記貫通孔を覆うように封止できるものである。しかしながら、前記膜は前記試験管本体の外壁又は内壁に圧着又は融着される場合がある。

本発明の回転培養装置は、本発明の試験管を１本又は２本以上、好ましくは、２〜６本装架して回転することにより、前記試験管内部の培養液を攪拌させてガス交換を促進させる。前記回転培養装置はローテータと、電動モータから前記ローテータへの駆動伝達機構とを含む。前記ローテータの回転速度は特に限定されないが、４〜８ｒｐｍの速度で回転することが好ましい。前記ローテータは単一の棒又は筒状の形状をとる場合の他、中空の筒か、回転軸に平行に配置された複数の棒かの形状をとる場合がある。前記ローテータが単一の棒又は筒状の形状をとる場合には、前記試験管を前記ローテータに装架する手段は、クランプ等で試験管の側面を把持する態様や、前記ローテータの回転軸に対して放射方向に延びる部材が、試験管のキャップと試験管の底部とを保持する態様をとる。これらの態様では、前記電動モータへの負担を低減するために、2本又は３本以上の試験管を回転軸に対して対称に配置することが好ましい。本発明の試験管かこれと同じ重量の物体をバランス用に装架する場合もある。ローテータが、中空の筒か、回転軸に平行に配置された複数の棒かの形状をとる場合には、１本の試験管を、該試験管の長手方向の軸が回転軸に一致するように装架することができる。また、本発明の回転培養装置のローテータは、本発明の試験管に外接して該試験管を摺動させて回転させる態様をとることもある。試験管の回転培養装置は、さらに、電源としての電池を含む場合がある。前記電池を含む回転培養装置は密閉容器に収容できるため、好ましい。前記電池は充電式の場合がある。前記電池は、回転培養装置を少なくとも１日間、好ましくは３日間連続して運転することができることが望ましい。また、前記回転培養装置は、培養液又は電池の交換のための一時的停止を挟んで、少なくとも１ヶ月、好ましくは2ヶ月ないし３ヶ月の間連続して運転することができる程度の信頼性及び耐久性があることが好ましい。

本発明の回転培養システムは、１本又は２本以上の試験管を装架した回転培養装置が収容された気密容器と、該気密容器内のガス組成及び／又は圧力の制御装置と、前記気密装置内の温度の制御装置とを含む。前記気密容器内のガス組成は、水蒸気、酸素、窒素及び／又は二酸化炭素の濃度を任意に調整し維持できるものであればいかなるものでもかまわない。前記ガス組成及び／又は圧力の制御装置は、例えば、前記気密容器の容積に対して所定のガス濃度になる量のガス発生剤の場合がある。あるいは、特定のガス組成、例えば酸素を吸収するガス吸収剤の場合がある。前記ガス組成及び／又は圧力の制御装置は、前記気密容器の内部に収容される場合の他、前記気密容器の外部にあって、前記気密容器と連絡する圧力及び／又はガス流量の調節器と、前記気密容器内部の気圧を調整するための通気口又は圧力弁と、酸素、窒素及び／又は二酸化炭素の高圧ガスボンベとを含む場合がある。前記気密容器内の温度の制御装置は、前記気密容器全体を収容するインキュベータの場合がある。本発明のガス組成及び／又は圧力の制御装置は、本発明の温度の制御装置と一体となったＣＯ₂インキュベータとして、１個又は２個以上の気密容器を収容する場合がある。この場合、前記気密容器はガス交換のために貫通孔が設けられることがある。前記気密容器の貫通孔は、通気性のある膜で閉塞されることもある。

本発明の回転培養装置のローテータの回転軸は水平方向と垂直方向との間のいずれの方向にあってもよい。試験管の長手方向の軸とローテータの軸とは、平行の場合と、交差する場合と、同一平面には属さない場合とがある。好ましくは、本発明の試験管は、水平な回転軸を有するローテータを含む回転培養装置に装架される。この場合には、ローテータの回転につれて前記試験管の内部の培養液は前記試験管本体の側壁全周に接するように移動する。本発明の試験管の長手方向の軸がローテータの回転軸と交差する場合又は同一平面に属さない場合には、ローテータの回転に伴って前記試験管内部の培養液は試験管の長手方向を往復するので培養液が攪拌され、ガス交換が促進される。本発明の試験管の側壁には貫通孔が設けられているが、膜で閉塞されるため、培養液が漏出することはない。

本発明の回転培養システムでは、複数個の気密容器が単一の温度制御装置に収容される場合がある。この場合には、気密容器ごとに異なるガス組成及び／又は圧力を設定することが可能になる。

本発明の回転培養システムは、試験管及び気密容器がプラスチックでできており、回転培養装置が電源としての電池を含み、ガス組成及び／又は圧力の制御装置がガス発生剤又はガス吸収剤の場合がある。この場合には、ガスボンベや圧力調整器のような高額の設備がなくても、ヒト正常細胞の３次元高密度培養を行うことが可能になる。そこで、本発明の回転培養システムは、施設及び予算の制約が厳しい中小病院や診療所における再生医療の普及を促進するのに役立つ。

本発明の人工骨は以下の手順で調製される場合がある。（１）メッシュからヒートシーラーを用いて袋状のパウチを作る。（２）その開口部からミクロスパーテルでセラミックス顆粒を充填して、ヒートシーラーで封をする。（３）滅菌する。滅菌は、例えば、消毒用アルコールで何回かリンスして風乾することによって行う場合がある。その後、使用するまで、清潔な状態で保存する。（４）細胞は０．２％アテロコラーゲンを含むＤＭＥＭ溶液（ＫＯＫＥＮＣＥＬＬＧＥＮ、高研）に培養液１０μＬあたり細胞１ｘ１０⁴個程度の高密度に懸濁し、パウチの上からピペットで載せるように播種する。そうすると、細胞の懸濁液はパウチに吸い込まれる。（５）細胞の懸濁液が吸い込まれたパウチを３７°Ｃ、５％ＣＯ₂を含む飽和水蒸気下のインキュベータ内で３０分程度保ちコラーゲンをゲル化させる。（６）その後通常の培養液（１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ等）を添加して、一晩静置培養する。（７）次の日から、振盪培養あるいは回転培養に移す。（８）その後、２５μｇ／ｍＬのビタミンＣを添加した前記培養液を用いて約１週間培養することによって、細胞を増殖させる。（９）さらにデキサメサゾン及びビタミンＣを含むＫＥ−２００（ＤＳファーマ）を５％添加した前記培養液を用いて約１ないし２週間培養することによって、細胞を骨芽細胞に分化誘導させる。

Claims (12)

1. 多孔質の顆粒状担体と、該担体を収容する生体吸収性ポリマー製容器とを含むことを特徴とする、人工骨基材。
2. 前記担体は顆粒状リン酸カルシウムであることを特徴とする、請求項１に記載の人工骨基材。
3. 前記容器は前記生体吸収性ポリマーからなる繊維によるメッシュ状の袋であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の人工骨基材。
4. 硬組織に分化することができる細胞と、請求項１ないし３のいずれかの人工骨基材とを用意するステップと、前記細胞を付着させた前記担体を前記容器に密封するステップと、前記細胞を培養下で増殖し骨芽細胞へ分化させるために誘導前記細胞が前記容器に収容された状態で培養するステップとを含むことを特徴とする、前記細胞及び担体が前記容器に収容された状態で前記人工骨を生体内の骨欠損部に移植するための人工骨の調製方法。
5. 前記細胞は骨膜又は歯根膜組織に由来し、前記骨欠損部は歯槽骨の欠損部であることを特徴とする、請求項４に記載の人工骨の調製方法。
6. 請求項４又は５に記載の方法で調製されることを特徴とする、前記細胞及び担体が前記容器に収容された状態で前記人工骨を生体内の骨欠損部に移植するための人工骨。
7. 硬組織に分化することができる細胞と、請求項１ないし３のいずれかの人工骨基材と、キャップ付の試験管と、該試験管の１本又は２本以上を装架することができるローテータと、該ローテータを駆動するモータとを含む回転培養装置とを含み、前記試験管の側壁には１個又は２個以上の貫通孔が設けられ、該貫通孔は、通気性があり、かつ、透水性のない膜で閉塞されていることを特徴とする、回転培養システム。
8. 前記回転培養装置は電源としての電池を含むことを特徴とする、請求項７に記載の回転培養システム。
9. 前記試験管及び回転培養装置を収容する気密容器と、該気密容器内のガス組成及び／又は圧力の制御装置と、前記気密容器内温度の制御装置とを含むことを特徴とする、請求項７又は８に記載の回転培養システム。
10. 前記試験管及び気密容器はプラスチックでできており、前記ガス組成及び圧力の制御装置はガス発生剤又はガス吸収剤であることを特徴とする、請求項９に記載の回転培養システム。
11. 請求項７ないし１０のいずれかに記載の回転培養システムを用いて調製されることを特徴とする、前記細胞及び担体が前記容器に収容された状態で前記人工骨を生体内の骨欠損部に移植するための人工骨。
12. 前記細胞は骨膜又は歯根膜組織に由来し、前記骨欠損部は歯槽骨の欠損部であることを特徴とする、請求項１１に記載の人工骨。