JP5099473B2

JP5099473B2 - ＴＮＦ−α産生抑制剤

Info

Publication number: JP5099473B2
Application number: JP2006291797A
Authority: JP
Inventors: 幸苗山崎; 泰広河野
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2006-10-26
Filing date: 2006-10-26
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2026-10-26
Also published as: JP2008106014A

Description

本発明は医薬品及び健康食品において有用な、炎症性サイトカインTNF-αの産生等を抑制する薬剤に関する。

TNF-αやIL-6などの炎症性サイトカインは、病原菌の侵入に対して免疫機能を賦活するなど本来は合目的な機能を有しているが、何らかの原因によって過剰に生産され続けるとリウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、2型糖尿病などさまざまな疾病を引き起こす。そのため、このような病態においてTNF-αなど炎症性サイトカインの生産を抑制する薬剤が開発されており、イブプロフェンやインドメタシン等既存の抗炎症剤の他、サリドマイド誘導体（非特許文献１参照）、ピラゾロン誘導体（非特許文献２参照）、合成クロメン誘導体（非特許文献３参照）、スベリヒユ科植物のアルカロイド（特許文献１参照）、クロモン誘導体（特許文献２参照）、肝実質細胞増殖因子（特許文献３参照）などがあるが、これらの疾病は慢性的な経過をたどることが多く治療は長期化することから、経口摂取が可能で副作用がなく安全な化合物が特に求められている。このような観点から、乳蛋白の断片ペプチド（特許文献４参照）、甘草やショウガの抽出物（特許文献５）、ドコサヘキサエン酸等の高度不飽和脂肪酸（特許文献６，７参照）など食品成分が注目されているが、より活性の強い化合物や当該活性のさらなる増強が必要である。

特開2003-26586号公報特開2005-247762号公報特開2000-239182号公報特開2004-196707号公報 WO2003/007974 特表2006-511514号公報特開2000-159667号公報 S. Niwayama et al., J. Med. Chem., 39, 3044-3045, 1996 M.P. Clark et al., J. Med. Chem., 47, 2724-2727, 2004 J-F. Cheng et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 13, 3647-3650, 2003

本発明の課題は、上記現状に鑑み、安全性が高く、しかもTNF-αなどの炎症性サイトカインの産生抑制作用が十分に強く、抗炎症剤等として有用な新規な薬剤を開発する点にある。

上記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討の結果、式（１）で示される化合物がマクロファージ様に分化した単球系培養細胞（急性単球性白血病細胞、THP-1）を大腸菌のリポ多糖（LPS）で刺激した時のTNF-α産生あるいは他の炎症性サイトカインを抑制することを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
下記式（１）で示される化合物を活性成分として含有することを特徴とする動物細胞におけるＴＮＦ−α産生抑制剤。

本発明において使用する、式（１）で表される化合物は、動物の免疫細胞におけるTNF-α等の炎症性サイトカインの産生を抑制する。その結果、個体レベルでは関節リウマチや潰瘍性大腸炎等の慢性炎症疾患の症状を緩和させる効果を有する。
一方、炎症性サイトカインの産生抑制物質として知られている従来のピラゾール誘導体等の物質は、安全性、副作用の問題を抱えているのに対し、本発明のカルコン誘導体は、これら自体は天然物ではないが、天然に広く分布し喫食・服用されてきたカルコン類の母核に相当するものであるから安全性は高いと考えられ、実際に動物試験において無毒性が確認されている。
ＴＮＦα等の炎症性サイトカインはリウマチや大腸炎ばかりでなく、肥満や誤嚥など色々な局面で過剰生産され、潜在的な疾病原因となっている。従って、このようなＴＮＦ−α等の炎症性サイトカインの恒常的なコントロールは健康維持にとり極めて重要な意義がある。本発明の薬剤は上述のように安全性が高いため、日常的かつ長期の摂取が可能と考えられ、治療剤としてばかりでなく、健康維持機能性食品添加物としても有用な薬剤である。

本発明のＴＮＦ−α産生抑制剤は、以下の式（１）で表される化合物を有効成分として含有するものである。

発明の式（１）の化合物のうち、好ましい化合物としては例えば以下の化合物が挙げられる。

上記カルコンあるいはその誘導体は、いずれも3〜10μM という低濃度で動物細胞におけるTNF-α産生を抑制する。
カルコン類として、例えば、キサントフモールについての動物における安全性試験のデータ（100mg/Kg・dayの投与でも安全；R. Hussong et al., Mol. Nutr. Food Res., 49, 861-867, 2005）やカルコン自体について急性毒性を示すLD50が500mg/Kg以上の値とされていること（MSDSに収録、また特開平4-202126にも記載）から、本願発明で使用するカルコンあるいは上記簡単な構造のモノヒドロキシカルコンも通常使用される濃度域では安全性は高いと考えられる。

さらに、本発明で使用する、式（１）で示される化合物は、TNF-αの産生を抑制するほか、ＩＬ−６，ＩＬ−１β等の炎症性サイトカインの産生も抑制し、さらに動物細胞における一酸化窒素（ＮＯ）の産生も抑制する。
一方、これら化合物のTNF−α産生抑制作用を含め炎症性サイトカインの産生抑制作用は、炭素数16〜２２の不飽和脂肪酸あるいはそのグリセリドまたは低級アルキルエステルとの併用により全般的に顕著に増大し、上記一酸化窒素（ＮＯ）の産生抑制も向上する。

このような炭素数１６〜２２の不飽和脂肪酸は、2重結合の数が１〜６の天然に広く分布している脂肪酸であり、具体的には、
ドコサヘキサエン酸(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-docosahexaenoic acid)、
(n-6)ドコサペンタエン酸(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z-docosapentaenoic acid)、
(n-3)ドコサペンタエン酸(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-docosapentaenoic acid)、
エイコサペンタエン酸(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-eicosapentaenoic acid)、
アラキドン酸(5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic acid)、
ステアリドン酸(6Z,9Z,12Z,15Z-octadecatetraenoic acid)、
ホモ-γ-リノレン酸(8Z,11Z,14Z-eicosatrienoic acid)、
α-リノレン酸(9Z, 12Z, 15Z-octadecatrienoic acid)、
γ-リノレン酸(6Z, 9Z, 12Z-octadecatrienoic acid)、
リノール酸(9Z,12Z-octadecadienoic acid)、
オレイン酸(9Z-octadecenoic acid)、
共役リノレン酸（10E,12Z-octadecadienoic acid
又は9Z,11E-octadecadienoic acid）などが挙げられる。これらのうちでは、とりわけ魚油に含まれるドコサヘキサエン酸やエイコサペンタエン酸等の高度不飽和脂肪酸が、高いTNF―α等の炎症性サイトカイン産生抑制効果をもたらす。

また、これらの不飽和脂肪酸はグリセリドであってもよく、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリドのいずれでもよく、また、グリセロール中の不飽和脂肪酸の結合位置は１、２、３位のいずれでもよく、さらにジグリセリド、トリグリセリドの場合には当該不飽和脂肪酸以外の脂肪酸、例えばパルミチン酸やステアリン酸が結合していても良い、また、低級アルキルエステルとしてはエチルエステルの他に、メチル、プロピル、もしくはブチルエステルであってもても良い。
一方、本発明に関わる式（１）で示される化合物は、それ自体公知であり、公知の方法で容易に合成できる。例えば特開平4-202126に記載される如く、保護基を有するヒドロキシベンズアルデヒド誘導体とアセトフェノンをアルカリで縮合させ、次いで保護基を酸性で除去して得ることができる。

本発明に用いる場合、式（１）の化合物の添加量は、化合物の種類、精製の方法や程度、求められる効果の程度により、生理的に安全な範囲で加減する。なお、安全性に関しては特開平4-202126記載の単純なカルコンではマウスの体重１Kg あたり500mg投与でも急性毒性は無いとされている。

次に、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。

ヒトTHP-1急性単球性白血病細胞（大日本製薬株式会社より購入）を10％の牛胎仔血清（FBS）を含むRPMI-1640培地で前培養後、1 x 10⁵ cells/mlの懸濁液とし、0.1μMのphorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) を添加してから0.1mlづつ96-wellプレートに分注した。2日間培養後、細胞がマクロファージ様に分化し底面に張り付いたことを検鏡・確認してから、各ウェルの培地を10μM のドコサヘキサエン酸（DHA、Cayman社製）を加えたかもしくは加えていない10％FBS入り新鮮培地の0.2mlづつに交換した。次いで各ウェルの培地に所定濃度（1〜10ｍM）のサンプルのエタノール溶液またはエタノールのみを2μl添加し、さらに3時間培養した。次いで、大腸菌細胞膜のリポ多糖（0127:B8、Sigma社製）を32μg/mlの濃度で含むリン酸緩衝液の6μlづつを各ウェルに添加し、20時間培養した。培地を回収し、ELISAキット（Endogen社製）でTNF-α濃度を測定した。培地を回収後ウェルに残った細胞は0.2％クリスタルバイオレット−20％メタノール液で染色し、十分水洗後、１％SDS水溶液の0.1mlづつを各ウェルに加えて色素を溶出させプレートリーダー（595nm）で吸光度を測定して細胞数の指標とした。用いたサンプルのうち、Ibp（イブプロフェン、東京化成製）、Cpz,（クロルプロマジン、和光純薬製）、Chal（trans-カルコン、Sigma社製）、4-OH-Chal（4-ヒドロキシカルコン、東京化成製）、2-OH-Chal（2-ヒドロキシカルコン、和光純薬製）はそれぞれ記載したメーカーから購入した。

結果を図１及び図２に示す。培養液中のサンプルの濃度（μM）は図中に示してある。これらの結果から、本発明のカルコンおよびカルコン誘導体が図中に表示された範囲で濃度依存的にTNF-αの産生を抑制し、さらに、培地にドコサヘキサエン酸が同時に添加されていると一層強く抑制することがわかる。なお、図１のBに示すように、細胞数の指標となる色素濃度は実験終了後にコントロールとサンプル間で通常１０％以下しか違いがなかったことから、TNF-α産生の大きな低下は細胞の逸失によるものではないことが確認された。

ドコサヘキサエン酸の代わりにエイコサペンタエン酸（EPA、Cayman社製）とα−リノレン酸（和光純薬製）を用いて実施例１と同様の実験を行なった。結果を図３に示す。この結果から、本発明のカルコンおよびカルコン誘導体によるTNF-α産生抑制作用がエイコサペンタエン酸やリノレン酸でも増強されることが確認された。

〔参考例１〕
炎症反応のシグナル分子として一酸化窒素(NO)も重要な役割を果たしており、NOの産生抑制も炎症の抑制につながる。マウスRAW264マクロファージ細胞株（理化学研究所から購入）を10％FBS入りのDMEM培地で前培養し、トリプシン処理で回収して2 x 10⁵ cells/mlの懸濁液とし、0.2mlづつ96-ウェルプレートに植え込んだ。2日間培養後、各ウェルの培地を10μM のドコサヘキサエン酸を加えたかもしくは加えていない10％FBS入り新鮮培地の0.2mlづつに交換した。次いで各ウェルの培地に所定濃度（1〜10ｍM）のサンプルのエタノール溶液またはエタノールのみを2μl添加し、さらに3時間培養した。次いで、330μg/mlの大腸菌細胞膜リポ多糖（0127:B8、Sigma社製）、3.2μg/mlのアルギニン、及び0.32μg/mlのIFN-γを含む水溶液を6μlづつ各ウェルに添加し、20時間培養した。培地を回収し、培地中でNOから転換生成した亜硝酸イオンをグリース試薬（Sigma社製）で定量した。また、細胞は実施例１と同様にクリスタルバイオレットで染色し吸光度を測定して細胞数の指標とした。図４のAに示した結果から、カルコンがLPSで刺激されたマクロファージ細胞におけるNO産生を抑制すること、さらに、ドコサヘキサエン酸が同時に添加されると一層強く抑制することがわかる。なお、図４のBに示すように、細胞数の指標となる色素濃度は実験終了後にコントロールとサンプル間で通常１０％以下しか違いがなかったことから、NO産生の大きな低下は細胞の逸失によるものではないことが確認された。

Aは、本発明の化合物、及該化合物とドコサヘキサエン酸（DHA）との併用によりTHP-1細胞におけるTNF-α産生が抑制されることを示すグラフである。縦軸の値は培地中のTNF-α濃度（2つのウェルの平均と標準偏差）であり、横軸に付した数字はサンプルの濃度（μM）である。Bは各ウェルの細胞をクリスタルバイオレットで染色し、洗浄後、色素を抽出して測定した吸光度（2つのウェルの平均と標準偏差）である。本発明の化合物、該化合物とドコサヘキサエン酸との併用によりTHP-1細胞におけるTNF-α産生が抑制されることを示すグラフである。縦軸の値はコントロールウェルにおけるTNF-α濃度を100としたときのサンプルウェルにおけるTNF-α濃度の相対値（2つのウェルの平均と標準偏差）であり、横軸に付した数字はサンプルの濃度（μM）である。本発明の化合物、該化合物とエイコサペンタエン酸（EPA）又はα-リノレン酸との併用によりTHP-1細胞におけるTNF-α産生が抑制されることを示すグラフである。縦軸の値は培地中のTNF-α濃度（2つのウェルの平均と標準偏差）であり、横軸に付した数字はサンプルの濃度（μM）である。図中でPUFAなしとはエイコサペンタエン酸もα-リノレン酸も添加されていないことを示す。 Aは、本発明の化合物、該化合物とドコサヘキサエン酸の併用によりマウスマクロファージRAW264細胞におけるNO産生が抑制されることを示すグラフである。縦軸の値はグリース試薬による発色の吸光度から求めたNOの相対生産量（LPSを加えたコントロールウェルの値を100％とする。各サンプルの各濃度について4ウェルの平均と標準偏差）であり、横軸に付した数字はサンプルの濃度（μM）である。Bは各ウェルの細胞をクリスタルバイオレットで染色し、洗浄後、色素を抽出して測定した吸光度（４つのウェルの平均と標準偏差）である。

Claims

カルコン又は下記式（１）で示される化合物と共に、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、α−リノレン酸又はそのグリセリドもしくは炭素数１〜４の低級アルキルエステルのうちの少なくとも１種を活性成分として含有することを特徴とする動物細胞におけるＴＮＦ−α産生抑制剤。
式（１）で示される化合物が、２−ヒドロキシカルコン又は４−ヒドロキシカルコンであることを特徴とする、請求項１に記載の動物細胞におけるＴＮＦ−α産生抑制剤。