KR100597871B1

KR100597871B1 - 방향환을 함유하는 신규 프로페논 유도체 및 이를 함유하는 항염증제

Info

Publication number: KR100597871B1
Application number: KR1020040041723A
Authority: KR
Inventors: 이응석; 장현욱; 장영동
Original assignee: 학교법인 영남학원
Priority date: 2004-06-08
Filing date: 2004-06-08
Publication date: 2006-07-06
Also published as: KR20050116598A; WO2005121129A1

Abstract

본 발명은 방향환을 함유하는 프로페논 유도체 및 이를 함유하는 염증 질환의 치료 및 예방을 위한 약학 조성물에 관한 것으로서, 본 화합물은 COX 및 5-LOX 효소 저해활성, NO 생성 및 TNF-α, IL1-β 의 생성에 대한 억제 활성이 우수하고 항염증 활성이 탁월하므로, 이를 포함하는 조성물은 염증 질환의 치료 및 예방을 위한 약학 조성물로써 의약품에 사용할 수 있다.

프로페논 유도체, 제조방법, 항염증, 약학조성물

Description

방향환을 함유하는 신규 프로페논 유도체 및 이를 함유하는 항염증제 {Novel propenone derivatives containing aromatic rings and a composition containing the same using as an antiinflammatory agent}

도 1은 BMMC(bone marrow derived mast cells)에서 COX-2 단백질 발현 및 PGD₂ 생성에 FPP-3가 미치는 효과를 나타낸 도이고,

도 2는 BMMC에서 5-LOX에 의한 LTC₄생성에 FPP-3가 미치는 효과를 나타낸 도이며,

도 3은 NO생성에 17종의 프로페논 유도체가 미치는 저해 효과를 나타낸 도이고,

도 4는 Raw 264.7세포에서 iNOS 단백질 발현 및 NO생성에 FPP-3가 미치는 효과를 나타낸 도이며,

도 5는 FPP-3의 세포 독성을 나타낸 도이고,

도 6는 Raw 264.7세포에서 LPS 자극에 의해 유도된 TNF-α 생성에 FPP-3가 미치는 효과를 나타낸 도이며,

도 7는 Raw 264.7세포에서 LPS 자극에 의해 유도된 IL1-β 생성에 FPP-3가 미치는 효과를 나타낸 도이고,

도 8은 Raw 264.7세포에서 LPS 자극에 의해 유도된 IkB-α 감소에 FPP-3가 미치는 효과를 나타낸 도이며,

도 9는 Raw 264.7세포에서 타이로신 키나아제의 활성에 FPP-3가 미치는 효과를 나타낸 도이고,

도 10은 Raw 264.7세포에서 NF-kB 전사 활성에 FPP-3가 미치는 효과를 나타낸 도이며,

도 11는 Raw 264.7세포에서 COX-2 단백질 발현 및 PGE₂ 생성에 FPP-3가 미치는 효과를 나타낸 도이다.

본 발명은 방향환을 함유하는 프로페논 유도체 및 이를 함유하는 항염증제에 관한 것이다.

염증과 통증은 인류를 괴롭히고 있는 대표적 병적 증상으로 직접적 증상 혹은 감염에 수반되는 2차적 증상으로 발현되고 있는데 근대에 이것이 아라키돈산 (arachidonic acid) 대사물 생성과 관계된 것이 밝혀지면서 이들에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 세포에 자극이 가해지면 포스포리파아제 (phospholipase), 특히 세균에서 고등동물에 이르기까지 세포막, 과립, 분비액 등에 광범위하게 존재하는 포스포리파아제 (phospholipase A_2,이하 PLA₂)는 세포막 인지질의 글리세로인지질의 sn-2 위치에 에스테르 결합된 지방산을 가수 분해하여 불포화 지방산 및 라이소포스포리피드 (lysophospholipid)를 생성한다. 특히, 세포 내에서는 유리 상태로 존재하지 않고 생체막 인지질의 2번 위치에 에스테르형으로 결합되어 있는 아라키돈산 (A.A)의 유리에는 PLA₂가 율속 효소로 작용함이 알려져 있으며, A.A는 대사되어 프로스타글란딘 (Prostaglandins, 이하 PGs), 트롬복산 (Thromboxanes, 이하 TXs), 루코트리엔 (Leukotrienes, 이하 LTs) 등과 같은 에이코사노이드(Eicosanoids)로 변환된다 (Murakami M et al., Crit. Rev. Immunol., 17(3-4), pp225-283, 1997; Verheij HM et al., Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol., 91, pp91-203, 1981). 에이코사노이드는 염증 부위에서 혈관 확장 작용, 혈관 투과성 증가, 기관지 천식, 호중구, 마크로파지 등과 같은 염증성 세포에 대한 주화성의 활성, 아나필락시스 (anaphylaxis, Lynn WS et al., Am. J. Phthol., 96(3), pp663-672, 1979; Vadas P and Hay JB et al., Life Sci., 26(20), pp1721-1729, 1980), 그리고 위장관의 점막 보호나 레닌 유리와 같은 정상적인 신장 조절에 관여하고, 생식계 등에서 다양한 생리 활성을 나타낸다고 알려져 있다 (Kam PC and See AU, Anaesthesia, 55(5), pp442-449, 2000; Cellotti F and Laufer S, Pharmacol. Res., 43(5), pp429-436, 2001). 한편 PLA₂ 작용으로 유리된 라이소포스포리피드는 중성구와 같은 염증성 세포에 라이소 PAF 아세틸환원효소에 의해 sn-2 위치에 아세틸기가 결합되어 혈소판 활성인자 (Platelet activating factor, 이하 PAF)로 전환되어 염증 매개체로 작용한다.

PGs, TXs 의 생성은 사이클로옥시게나아제 (cyclooxygenases, 이하 COXs)에 의해서 유도되는데 (Urade Y et al., J. Biol. Chem., 262(8), pp3820-3825, 1987; Urade Y et al., J. Immunol., 143(9), pp2982-2989, 1989), COXs는 두 종류의 이소형태 (isoform), 즉, COX-1 및 COX-2가 존재함이 보고되어 있다. 이들의 분자량은 모두 약 70kDa 정도이고 두 동질효소는 약 60%의 아미노산 유사성을 가진다.

세포에서의 COX-1 역할은 그들의 생체내 유지 활성 (house keeping activity)를 조절하는데 필요한 프로스타노이드 (prostanoid)를 생산하는 것으로, 예를 들어 혈소판에 의한 TXA₂의 생산이나, 혈관 내피 세포 (vascular endothelial cells)에 의한 항 트롬보겐성 프로스타사이클린 (anti-thrombogenic prostacycline)의 생산, 신장에서의 신장 혈류 조절 프로스타노이드의 생성 등이다 (Kramer SA et al., Arch. Biochem. Biophys., 293(2), pp391-400, 1992).

COX-2는 염증 부위에서 PG를 생성하는 유도성 효소로서 전염증성 (proinflammatory) 사이토카인, 성장인자, LPS (lipopolysaccharide), 포볼 에스테르 (phorbol ester), cAMP-상승요인 그리고 몇몇 G-단백질 결합 효능제 (coupled agonist) 등에 반응하여 즉각적으로 유도되어진다 (Xie WL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88(7), pp2692-2696, 1991; Jones DA et al., J. Biol. Chem., 268(12), pp9049-9054, 1993). 현재 전세계적으로 널리 사용되는 항염증제 중 비 스테로이드계 항염증제 (Nonsteroidal antiinflammatory drugs, NSAIDs)의 항염, 진통 및 해열 작용은 바로 이 COX-2에 대한 억제 작용의 결과인 반면 이들 약물의 부작용인 위장 장해 등은 COX-1의 억제 효과에 따른 것으로 알려져 있다 (Seeds MC et al., Clin. Rev. Allergy Immunol., 17(1-2), pp5-26, 1999).

세포막 인지질에서 유리된 아라키돈산(A.A)은 COXs 이외에도 분자량 78kDa 정도의 5-리폭시게나아제(5-lipoxygenase, 이하 5-LOX)에 의해 SRA-A(Slow Reacting Substance of Anaphylaxis)로 밝혀진 류코트리엔을 합성하며, LOXs의 경우는 기질의 산화작용기의 위치에 따라 8-LOX, 12-LOX, 15-LOX 등이 알려져 있다(Silverman ES and Drazen JM, Proc. Assoc. Am. Physicians, 111(6), pp525-536, 1999).

한편, 산화질소 (NO)는 산화질소 신타아제 (NOS)의 활성으로부터 L-아르기닌 (L-arginine)에서 L-시트룰린 (L-citrulline)으로 전환됨으로써 생성되고, NOS는 내피성 NOS (eNOS), 신경성 NOS (nNOS) 및 유도성 NOS (iNOS)와 같이 세 종류로 나뉘어진다 (Nathan C, FASEB J., 6(12), pp3051-3064, 1992). 각종 사이토카인이나 그램 음성 세균 (Gram-negative bacteria) 바깥 세포막에 존재하는 균체내독소인 LPS 자극에 의한 유도 산화질소 신타아제 (iNOS)의 활성으로부터 유도된 NO는 가스상의 자유 라디칼로서 신경전달, 혈관 유지, 종양 제거 등 많은 생리작용에 관여하기도 하지만 과다발생시에 폐혈성 쇼크 또는 희소돌기아교세표의 퇴화나 신경퇴행성질환과 같은 탈수초성 질환, 다발성 경화증(MS)과 알레르기성 뇌척수염(EAE)과 같은 질병들을 유발시킨다 (Nathan C and Xie QW, J. Biol. Chem., 269(19), pp13725-13728, 1994; Lin HY et al., Biochem. Pharmacol., 66(9), pp1821-1832, 2003).

또한 LPS 자극에 의해 염증성 사이토카인인 종양괴사인자-α(TNF-α)나 인터류킨(Interleukin) 1β(IL1-β)등이 유도 된다. TNF-α는 면역계에 있어서 염증(inflammation)을 일으키는 주요 사이토카인이다. 발열작용 (fever) 및 쇼크를 발생시키고 대식세포(macrophage)를 활성화시키며 혈관생성(angiogenesis)이나 골재흡수(bone resorption), 다른 세포들을 죽이는 작용(cytotoxic to the many cells) 및 다핵형 백혈구 케모톡신(chemotoxin)을 자극한다.

IL1-β또한 각종 염증 발현에 관계한다. 사이토카인을 매개로 한 iNOS의 기전은 완벽하게 확립되지 않았다. 염증성 사이토카인 (TNF-α, IL1-β)는 그들과 관계된 수용기와 결합해 NF-κB의 활성을 통해 iNOS를 발현시킨다는 보고가 있다 (Han YJ et al., NITRIC OXIDE, 5(5), pp504-513, 2001). NF-κB는 IκBα 단백질의 결합에 의해 비활성 상태에 있다가 LPS와 같은 자극에 의한 신호 전달이 각종 미토겐-활성 단백질 (MAPKs)들을 활성화 시키고 IκBα의 분해에 의해 활성화된 NF-κB가 핵 내로 들어가 전사 인자로서 사이토카인뿐 아니라 iNOS를 비롯한 각종 유전자의 발현을 조절한다 (Siebenlist U et al., Annu. Rev. Cell. Biol., 10, pp405-455, 1994; Lukiw WJ and Bazan NG, J. Neurosci. Res., 53(5), pp583-592, 1998).

이에, 본 발명자들은 신규 항염증제 개발을 목적으로 COX-2에 선택적으로 작용하는 셀레브렉스의 구조를 단순화한 방향성 헤테로 고리를 함유하는 프로페논 유도체를 합성하여 COX 및 5-LOX 효소 저해활성, NO 생성 및 TNF-α, IL1-β 의 생성 에 대한 억제 활성을 측정한 결과, 우수한 항염증작용을 나타냄을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 방향환을 함유하는 프로페논 유도체 및 이를 함유하는 염증 질환의 치료 및 예방을 위한 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 일반식 (Ⅰ)으로 표기되는 방향환을 함유하는 프로페논 유도체 화합물을 제공한다:

(Ⅰ)

상기 식에서,

A 및 B는 각각 독립적으로 하나 이상의 R``로 치환된 5원 또는 6원 방향환 또는 N, O, S로 치환된 헤테로환이고,

R` 및 R``는 각각 독립적으로 하나 이상의 수소원자, 할로겐원자, C₁-C₄ 저급 알킬 또는 C₁-C₄ 저급 알킬기로 치환된 케톤기이다.

상기 일반식 (I) 화합물군 중 바람직한 화합물들은 A 및 B 치환기가 각각 독립적으로, R``로 치환된 벤젠, 2-치오펜, 3-치오펜, 2-퓨란, 3-퓨란, 2-피리딜 또는 3-피리딜이고; R` 및 R``는 각각 독립적으로 하나 이상의 수소원자, 할로겐원자, 메틸기, 에틸기, 메틸옥소기, 에틸옥소기인 화합물군이다.

또한 본 발명은 하기 일반식 (Ⅰa)으로 표기되는 방향환을 함유하는 프로페논 유도체 화합물을 제공한다:

(Ⅰa)

상기 식에서,

P 및 Q는 황원자, 산소원자 또는 W로 표시되는 라디칼이며;

W는 CH=CH 또는 CH=N이고;

R₁내지 R₆및 R`은 각각 독립적으로 하나 이상의 수소원자, 할로겐 원자, C ₁-C₄ 저급 알킬 또는 C₁-C₄ 저급 알킬기로 치환된 케톤기이다.

상기 일반식 (Ia) 화합물군 중 바람직한 화합물들은 R₁내지 R₆및 R`은 각각 독립적으로 할로겐원자, 메틸기, 에틸기, 메틸옥소기, 에틸옥소기인 화합물군이다.

보다 구체적으로 상기 일반식 (I)의 화합물 중에서 특히 바람직한 일군의 화합물로는 다음과 같은 화합물들을 포함한다:

3-페닐-1-피리딘-2-일-프로페논, 3-퓨란-2-일-1-피리딘-2-일-프로페논, 3-퓨란-3-일-1-피리딘-2-일-프로페논, 1-피리딘-2-일-3-치오펜-2-일-프로페논, 1-피리딘-2-일-3-치오펜-3-일-프로페논, 3-퓨란-2-일-1-피리딘-3-일-프로페논, 3-퓨란-3-일-1-피리딘-3-일-프로페논, 1-피리딘-3-일-3-치오펜-3-일-프로페논, 1,3-디페닐프로페논, 1-페닐-3-치오펜-2-일-프로페논, 1,3-디-치오펜-2-일-프로페논, 3-치오펜-3-일-1-치오펜-2-일-프로페논, 3-퓨란-2-일-1-치오펜-2-일 프로페논, 1,3-디-퓨란-2-일-프로페논, 1-퓨란-2-일-3-피리딘-2-일-프로페논, 3-(3-메틸-치오펜-2-일)-1-피리딘-2-일-프로페논, 1-(5-클로로-치오펜-2-일)-3-퓨란-2-일-프로페논인 화합물.

또한, 본 발명은 하기 일반식(Ⅱ)의 케톤화합물과 일반식(Ⅲ)의 알데히드화합물을 수산화칼륨 등의 염기 하에 반응시킴을 특징으로 하는 상기 일반식(Ⅰ)의 프로페논 유도체를 제조하는 제조방법을 제공한다.

(Ⅱ)

(Ⅲ)

상기 식에서 A, B, R` 및 R``는 상기 일반식 (I) 화합물에서 정의된 바와 동일하다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 일반식 (I)의 신규 화합물들은 하기와 같이 제조될 수 있으며, 하기의 반응식은 본 발명의 대표적인 화합물들의 제조방법을 제조 단계별로 나타내는 것으로, 본 발명의 여러 화합물들은 반응식의 합성과정에서 사용되는 시약, 용매 및 반응 순서를 바꾸는 등의 작은 변경으로 제조될 수 있다.

예를 들어, 본 발명은 하기 반응식 1에 도시한 바와 같이, 수산화칼륨, 수산화나트륨 등과 같은 강염기, 바람직하게는 수산화나트륨을 메탄올 및 수 혼합용매, 바람직하게는 1∼8:1, 보다 바람직하게는 3∼5:1의 혼합비를 갖는 혼합용매에 녹인 용액 상에서 알데히드 화합물(Ⅲ)과 케톤화합물(Ⅱ)을 반응시키는 공정을 통하여 상기 일반식 (Ⅰ)으로 표기되는 프로페논 유도체를 제조할 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기의 제조방법으로 제조된 일반식 (I)의 프로페논의 유도체 화합물들을 제공한다.

상기 일반식 (I)의 프로페논 유도체 화합물을 대상으로 염증성 질환의 기전에 관여하는 COX-2 및 5-LOX 효소에 대한 억제활성실험에서 강력한 억제활성을 나타냈으며, LTC₄ 의 생성 억제, RAW264.7 대식세포주를 이용한 NO 생성량 측정실험, RAW264.7 대식세포에 대한 MTT 어세이 실험, PGD₂의 생성량 측정 실험, RAW 264.7 세포에서 COX-2 단백질 발현 및 PGE₂생성에 미치는 억제 효과실험, RAW264.7 세포에서 iNOS 단백질 발현 및 NO 생성에 미치는 억제 효과실험 등의 약효 시험 등을 통하여 본 발명의 화합물들의 염증에 대한 탁월한 억제 활성을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 상기 일반식 (I)의 프로페논의 유도체 화합물 또는 그 유도체를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 염증성 질환의 치료 및 예방에 효과적인 약학조성물을 제공한다.

상기의 염증성 질환은 염증반응에 의해 발생하는 위염, 대장염, 류마티스성 관절염, 골관절염, 관절염증관련 질환, 신장염, 간염, 동맥경화, 암 또는 퇴행성 질환임을 포함한다.

본 발명의 상기 일반식 (I)의 프로페논 유도체를 포함하는 약학조성물은 그 적용량 및 적용방법은 제형 및 사용목적에 따라 다를 수 있다.

본 발명에 있어서, 프로페논 유도체를 함유하는 염증 질환의 치료 및 예방을 위한 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50 중량 %로 포함한다.

또한, 본 발명의 프로페논 유도체를 포함하는 조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상 기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 제라틴 등을 섞어 조제한다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 화합물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 화합물 자체는 1000 ㎎/㎏ 용량으로 쥐에게 경구투여 하였을 때 독성이 거의 없는 것으로 나타났고, 또한, 간을 비롯한 장기의 기능에 어떠한 부작용도 나타내지 않았으므로, 예방 목적으로 일정범위 내에서 장기간 복용 시에도 안 심하고 사용할 수 있는 약제이다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예, 제형예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 제형예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 제형예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 3-페닐-1-피리딘-2-일-프로페논(1)

2.12 g의 벤즈알데히드(benzaldehyde, 20 mM)를 메탄올 40 mL 및 수용액 8 mL에 녹인 빙냉 상태의 수산화칼륨(1.32 g, 20 mM)용액에 넣어 반응시켰다. 여기에 2-아세틸 피리딘(2-Acetyl pyridine, 20 mM) 2.42 g을 10분 내에 가한 후, 빙욕조(ice-bath)상에서 3시간동안 교반시켰다. 이를 여과한 후, 잔사를 냉메탄올 40 mL로 세척한 후, 실리카켈 컬럼 크로마토그래피(정제용매 EtOAc:n-hexane = 1:4, v:v) 방법으로 정제하여 3.20 g의 하기 물성치를 갖는 황녹색 고체상의 3-페닐-1-피리딘-2-일-프로페논(1) (15.29 mM, 수득율 76.45 %)을 수득하였다.

mp 74.7-75.3 ℃

TLC (EtOAc:n-hexane = 1:2, v:v), R_f = 0.464

¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃): δ 8.74 (ddd, J = 4.8, 1.7, 1.0 Hz, 1 H, 피리딘 H-6), 8.31 (d, J = 16.1 Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 8.19 (dt, J = 7.8, 1.0 Hz, 1 H, 피리딘 H-3), 7.94 (d, J = 16.1 Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 7.87 (dt, J = 7.8, 1.7 Hz, 1 H, 피리딘 H-4), 7.75-7.72 (m, 2 H, 페닐 H-2 & H-6), 7.48 (ddd, J = 7.6, 4.8, 1.2 Hz, 1 H, 피리딘 H-5), 7.43-7.40 (m, 3 H, 페닐 H-3, H-4 & H-5)

실시예 2 : 3-퓨란-2-일-1-피리딘-2-일-프로페논(2)

1.92 g의 2-퓨르알데히드(2-furaldehyde, 20 mM)를 메탄올 40 mL 및 수용액 8 mL에 녹인 빙냉 상태의 수산화칼륨(1.32 g, 20 mM)용액에 넣어 반응시켰다. 여기에 2-아세틸 피리딘(2-Acetyl pyridine, 20 mM) 2.42 g을 10분 내에 가한 후, 빙욕조(ice-bath)상에서 3시간동안 교반시켰다. 이를 여과한 후, 잔사를 냉메탄올 40 mL로 세척한 후, 실리카켈 컬럼 크로마토그래피(정제용매 EtOAc:n-hexane = 1:4, v:v) 방법으로 정제하여 2.92 g의 하기 물성치를 갖는 노란색 고체상의 3-페닐-1-피리딘-2-일-프로페논(2) (14.66 mM, 수득율 73.3 %)을 수득하였다.

mp 51-53 ℃

TLC (EtOAc:n-hexane = 1:2, v:v), R_f = 0.402

¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃) δ 8.74 (ddd, J = 4.8, 1.7, 1.0 Hz, 1 H, 피리 딘 H-6), 8.17 (dt, J = 7.8, 1.0 Hz, 1 H, 피리딘 H-3), 8.14 (d, J = 15.8 Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 7.87 (dt, J = 7.8, 1.7 Hz, 1 H, 피리딘 H-4), 7.70 (d, J = 15.8 Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 7.54 (d, J = 1.8 Hz, 1 H, 퓨란 H-5), 7.48 (ddd, J = 7.6, 4.8, 1.2 Hz, 1 H, 피리딘 H-5), 6.77 (d, J = 3.4 Hz, 1 H, 퓨란 H-3), 6.52 (dd, J = 3.4, 1.8 Hz, 1 H, 퓨란 H-4)

실시예 3 : 3-퓨란-3-일-1-피리딘-2-일-프로페논(3)

1.92 g의 3-퓨르알데히드(3-furaldehyde, 20 mM)를 메탄올 70 mL 및 수용액 10 mL에 녹인 빙냉 상태의 수산화칼륨(2.64 g, 40 mM)용액에 넣어 반응시켰다. 여기에 2-아세틸 피리딘(2-Acetyl pyridine, 40 mM) 4.85 g을 10분 내에 가한 후, 빙욕조(ice-bath)상에서 3시간동안 교반시켰다. 이를 여과한 후, 잔사를 냉메탄올 40 mL로 세척한 후, 정제용매(EtOAc:n-hexane, v:v)의 비율을 각각 1:3, 1:1, 2:1의 차례로 실행하는 실리카켈 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제하여 7.65 g의 하기 물성치를 갖는 연노란색 고체상의 3-퓨란-3-일-1-피리딘-2-일-프로페논(3) (38.4 mM, 수득율 96 %)을 수득하였다.

mp 74.2-75.2 ℃

TLC (EtOAc:n-hexane = 1:2, v:v), R_f = 0.415

¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃) δ 8.74 (ddd, J = 4.8, 1.7, 1.0 Hz, 1 H, 피리딘 H-6), 8.17 (dt, J = 7.9, 1.0 Hz, 1 H, 피리딘 H-3), 7.99 (d, J = 15.8 Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 7.87 (dt, J = 7.7, 1.7 Hz, 1 H, 피리딘 H-4), 7.84-7.82 (m, 1 H, 퓨란 H-2), 7.81 (d, J = 15.8 Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 7.48 (ddd, J = 7.6, 4.8, 1.2 Hz, 1 H, 피리딘 H-5), 7.47-7.46 (m, 1 H, 퓨란 H-5), 6.81 (dd, J = 1.3, 0.6 Hz, 1 H, 퓨란 H-4)

실시예 4 : 1-피리딘-2-일-3-치오펜-2-일-프로페논(4)

1.92 g의 2-치오펜 카르복스알데히드(2-thiophene carboxaldehyde, 20 mM)를 메탄올 40 mL 및 수용액 8 mL에 녹인 빙냉 상태의 수산화칼륨(1.32 g, 20 mM)용액에 넣어 반응시켰다. 여기에 2-아세틸 피리딘(2-Acetyl pyridine, 20 mM) 2.42 g을 10분 내에 가한 후, 빙욕조(ice-bath)상에서 3시간동안 교반시켰다. 이를 여과한 후, 잔사를 냉메탄올 40 mL로 세척한 후, 실리카켈 컬럼 크로마토그래피(정제용매 EtOAc:n-hexane = 1:4, v:v) 방법으로 정제하여 3.83 g의 하기 물성치를 갖는 노란색 고체상의 1-피리딘-2-일-3-치오펜-2-일-프로페논(4) (17.8 mM, 수득율 89%)을 수득하였다.

mp 75.2-75.8 ℃

TLC (EtOAc:n-hexane = 1:2, v:v), R_f = 0.44

¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃) δ 8.75 (ddd, J = 4.8, 1.7, 0.9 Hz, 1 H, 피리딘 H-6), 8.18 (dt, J = 7.7, 1.1 Hz, 1 H, 피리딘 H-3), 8.07 (d, J = 0.4 Hz, 2 H, -CH=CH-), 7.87 (dt, J = 7.7, 1.7 Hz, 1 H, 피리딘 H-4), 7.48 (ddd, J = 7.7, 4.8, 1.2 Hz, 1 H, 피리딘 H-5), 7.44 (dd, J = 5.0, 1.1 Hz, 1 H, 치오펜 H-5), 7.42 (dd, J = 3.7, 1.1 Hz, 1 H, 치오펜 H-3), 7.09 (dd, J = 5.0, 3.7 Hz, 1 H, 치오펜 H-4)

실시예 5 : 1-피리딘-2-일-3-치오펜-3-일-프로페논(5)

2.24 g의 3-치오펜 카르복스알데히드(3-thiophene carboxaldehyde, 20 mM)를 메탄올 40 mL 및 수용액 8 mL에 녹인 빙냉 상태의 수산화칼륨(1.32 g, 20 mM)용액에 넣어 반응시켰다. 여기에 2-아세틸 피리딘(2-Acetyl pyridine, 20 mM) 2.42 g을 10분 내에 가한 후, 빙욕조(ice-bath)상에서 3시간동안 교반시켰다. 이를 여과한 후, 잔사를 냉메탄올 40 mL로 세척한 후, 실리카켈 컬럼 크로마토그래피(정제용매 EtOAc:n-hexane = 1:4, v:v) 방법으로 정제하여 3.06 g의 하기 물성치를 갖는 연노란색 고체상의 1-피리딘-2-일-3-치오펜-3-일-프로페논(5) (14.2 mM, 수득율 71%)을 수득하였다.

mp 74.1-74.9℃

TLC (EtOAc:n-hexane = 1:2, v:v), R_f = 0.488

¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃) δ 8.74 (ddd, J = 4.8, 1.7, 0.9 Hz, 1 H, 피리딘 H-6), 8.17 (dt, J = 7.7, 1.1 Hz, 1 H, 피리딘 H-3), 8.09 (d, J = 15.9 Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 7.93 (d, J = 15.9 Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 7.87 (dt, J = 7.7, 1.7 Hz, 1 H, 피리딘 H-4), 7.48 (ddd, J = 7.7, 4.8, 1.2 Hz, 1 H, 피리딘 H-5), 7.68-7.66 (m, 1 H, 치오펜 H-2), 7.54-7.52 (m, 1 H, 치오펜 H-5), 7.36 (dd, J = 5.1, 2.4 Hz, 1 H, 치오펜 H-4)

실시예 6 : 3-퓨란-2-일-1-피리딘-3-일-프로페논(6)

1.32 g의 2-퓨르알데히드(2-furaldehyde, 20 mM)를 메탄올 40 mL 및 수용액 8 mL에 녹인 빙냉 상태의 수산화칼륨(1.32 g, 20 mM)용액에 넣어 반응시켰다. 여기에 3-아세틸 피리딘(3-Acetyl pyridine, 20 mM) 2.42 g을 10분 내에 가한 후, 빙욕조(ice-bath)상에서 3시간동안 교반시켰다. 이를 여과한 후, 잔사를 냉메탄올 40 mL로 세척한 후, 실리카켈 컬럼 크로마토그래피(정제용매 EtOAc:n-hexane = 1:2, v:v) 방법으로 정제하여 2.23 g의 하기 물성치를 갖는 오렌지색 고체상의 3-퓨란-2-일-1-피리딘-3-일-프로페논(6) (11.2 mM, 수득율 56.0%)을 수득하였다.

mp 84.2-84.7℃

TLC (EtOAc:n-hexane = 1:2, v:v), R_f = 0.184

¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃) δ 9.24 (dd, J = 2.2, 0.7 Hz, 1 H, 피리딘 H-2), 8.80 (dd, J = 4.8, 1.7 Hz, 1 H, 피리딘 H-6), 8.30 (dt, J = 8.0, 2.0 Hz, 1 H, 피리딘 H-4), 7.64 (d, J = 15.3 Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 7.56 (d, J = 1.8 Hz, 1 H, 퓨란 H-5), 7.46 (ddd, J = 8.0, 4.9, 0.8 Hz, 1 H, 피리딘 H-5), 7.42 (d, J = 15.3 Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 6.78 (d, J = 3.4 Hz, 1 H, 퓨란 H-3), 6.54 (dd, J = 3.4, 1.8 Hz, 1 H, 퓨란 H-4)

실시예 7 : 3-퓨란-3-일-1-피리딘-3-일-프로페논(7)

1.32 g의 3-아세틸 피리딘(3-Acetyl pyridine, 20 mM)를 메탄올 40 mL 및 수용액 8 mL에 녹인 빙냉 상태의 수산화칼륨(1.32 g, 20 mM)용액에 넣어 반응시켰다. 여기에 3-아세틸 피리딘(3-Acetyl pyridine, 20 mM) 2.42 g을 10분 내에 가한 후, 빙욕조(ice-bath)상에서 3시간동안 교반시켰다. 이를 여과한 후, 잔사를 냉메탄올 40 mL로 세척한 후, 실리카켈 컬럼 크로마토그래피(정제용매 EtOAc:n-hexane = 1:2, v:v) 방법으로 정제하여 2.43 g의 하기 물성치를 갖는 노란색 고체상의 3-퓨란-3-일-1-피리딘-3-일-프로페논(7) (12.2 mM, 수득율 61.0%)을 수득하였다.

mp 95.2-95.7℃

TLC (EtOAc:n-hexane = 1:2, v:v), R_f = 0.15

¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃) δ 9.20 (dd, J = 2.2, 0.7 Hz, 1 H, 피리딘 H-2), 8.80 (dd, J = 4.8, 1.7 Hz, 1 H, 피리딘 H-6), 8.30 (dt, J = 8.0, 2.0 Hz, 1 H, 피리딘 H-4), 7.80- 7.78 (m, 1 H, 퓨란 H-2), 7.77 (d, J = 15.4 Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 7.51-7.49 (m, 1 H, 퓨란 H-5), 7.45 (ddd, J = 8.0, 4.9, 0.8 Hz, 1 H, 피리딘 H-5), 7.21 (d, J = 15.4 Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 6.73 (dd, J = 1.3, 0.6 Hz, 1 H, 퓨란 H-4)

실시예 8 : 1-피리딘-3-일-3-치오펜-3-일-프로페논(8)

2.24 g의 3-치오펜 카르복스알데히드(3-thiophene carboxaldehyde, 20 mM)를 메탄올 40 mL 및 수용액 8 mL에 녹인 빙냉 상태의 수산화칼륨(1.32 g, 20 mM)용액에 넣어 반응시켰다. 여기에 3-아세틸 피리딘(3-Acetyl pyridine, 20 mM) 2.42 g을 10분 내에 가한 후, 빙욕조(ice-bath)상에서 3시간동안 교반시켰다. 이를 여과한 후, 잔사를 냉메탄올 40 mL로 세척한 후, 실리카켈 컬럼 크로마토그래피(정제용매 EtOAc:n-hexane = 1:2, v:v) 방법으로 정제하여 2.6 g의 하기 물성치를 갖는 노란색 고체상의 1-피리딘-3-일-3-치오펜-3-일-프로페논(8) (12.1 mM, 수득율 60.5%)을 수득하였다.

mp 90.6-91.0℃

TLC (EtOAc:n-hexane = 1:2, v:v), R_f = 0.16

¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃): δ 9.21 (dd, J = 2.2, 0.7 Hz, 1 H, 피리딘 H-2), 8.80 (dd, J = 4.8, 1.7 Hz, 1 H, 피리딘 H-6), 8.28 (dt, J = 8.0, 2.0 Hz, 1 H, 피리딘 H-4), 7.84 (d, J = 15.5 Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 7.66 (m, 1 H, 치오펜 H-2), 7.46 (ddd, J = 8.0, 4.9, 0.8 Hz, 1 H, 피리딘 H-5), 7.45-7.43 (m, 2 H, 치오펜 H-4 & H-5), 7.31 (d, J = 15.5 Hz, 1 H, -CH=CH-CO-)

실시예 9 : 1,3-디페닐프로페논(9)

벤즈알데히드(Benzaldehyde, 2.03ml, 20 mM)를 메탄올 30 mL 및 수용액 5 mL에 녹인 빙냉 상태의 수산화칼륨(1.32 g, 20 mM)용액에 넣어 반응시켰다. 이를 용 해한 후, 아세토페논(acetophenone, 2.33ml, 20mM)을 10분 내에 가하고 빙욕조(ice-bath)상에서 3시간동안 교반시킨 후 여과하였다. 잔사를 냉메탄올 40 mL로 세척한 후, 감압건조하여 4.1 g의 하기 물성치를 갖는 연황녹색 침상의 1,3-디페닐프로페논(9)(수득율 98.4%)을 수득하였다.

mp 57.0-58.7℃

TLC (EtOAc:n-hexane = 1:5, v:v), R_f = 0.3

¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃) δ 8.04-8.01 (m, 2 H, 1-페닐 H-2, H-6), 7.82 (d, J = 15.7Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 7.66-7.63 (m, 2 H, 3-페닐 H-2, H-6), 7.60-7.47 (m, 3 H, 3-페닐 H-3, H-4, H-5), 7.53 (d, J = 15.7Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 7.43-7.40 (m, 3 H, 1- 페닐 H-3, H-4, H-5)

실시예 10 : 1-페닐-3-치오펜-2-일-프로페논(10)

2-벤즈알데히드(2-Benzaldehyde, 1.87ml, 20 mM)을 메탄올 30 mL 및 수용액 5 mL에 녹인 빙냉 상태의 85% 수산화칼륨(1.32 g, 20 mM)용액에 넣어 반응시켰다. 이를 용해한 후, 아세토펜(acetophene, 2.33ml, 20mM)을 10분 내에 가하고 빙욕조(ice-bath)상에서 3시간동안 교반시킨 후 여과하였다. 잔사를 냉메탄올 40 mL로 세척한 후, 감압건조하여 4.2 g의 하기 물성치를 갖는 연황녹색 침상의 1,3-디페닐프로페논(10)(수득율 98.4%)을 수득하였다.

mp 58.1-59.8℃

TLC (EtOAc:n-hexane = 1:5, v:v), R_f = 0.3

¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃): δ 8.03-7.99 (m, 2 H, 페닐 H-2, H-6), 7.95 (d, J= 15.5Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 7.61-7.47 (m, 3 H, 페닐 H-3, H-4, H-5), 7.42 (d, J= 5.0Hz, 1 H, 치오펜 H-3), 7.36 (d, J = 3.7Hz, 1 H, 치오펜 H-5), 7.34 (d, J=15.5Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 7.09 (dd, J = 5.0, 3.7Hz, 1 H, 치오펜 H-4)

실시예 11 : 1,3-디-치오펜-2-일-프로페논(11)

1.32 g의 2-치오펜카르복스알데히드(2-thiophenecarboxaldehyde, 1.87ml, 20 mM)을 메탄올 30 mL 및 수용액 5 mL에 녹인 빙냉 상태의 85% 수산화칼륨(1.32 g, 20 mM)용액에 넣어 반응시켰다. 이를 용해한 후, 2-아세틸치오펜(2-acetylthiophene, 2.33ml, 20mM)을 10분 내에 가하고 빙욕조(ice-bath)상에서 3시간동안 교반시킨 후 여과하였다. 잔사를 냉메탄올 40 mL로 세척한 후, 감압건조하여 3.6 g의 하기 물성치를 갖는 황녹색 침상의 1,3-디-치오펜-2-일-프로페논(11)(수득율 81.7%)을 수득하였다.

mp 98-99.5℃

TLC (EtOAc:n-hexane = 1:5, v:v), R_f = 0.2

¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃) δ 7.97 (d, J = 15.4Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 7.84 (dd, J = 3.7, 0.9Hz, 1 H, 1-치오펜 H-5), 7.67 (dd, J = 5.0, 0.9Hz, 1 H, 1-치 오펜 H-3), 7.43 (d, J = 5.0Hz, 1 H, 3-치오펜 H-3), 7.36 (d, J = 3.7Hz, 1 H, 3-치오펜 H-5), 7.21 (d, J = 15.4Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 7.18 (dd, J = 5.0, 3.7Hz, 1 H, 1-치오펜 H-4), 7.09 (dd, J = 5.0, 3.7Hz, 1 H, 3-치오펜 H-4)

실시예 12 : 3-치오펜-3-일-1-치오펜-2-일-프로페논(12)

2-치오펜카르복스알데히드(2-thiophenecarboxaldehyde, 1.85ml, 20 mM)을 메탄올 30 mL 및 수용액 5 mL에 녹인 빙냉 상태의 85% 수산화칼륨(1.32 g, 20 mM)용액에 넣어 반응시켰다. 이를 용해한 후, 2-아세틸치오펜(2-acetylthiophene, 2.16ml, 20mM)을 10분 내에 가하고 빙욕조(ice-bath)상에서 3시간동안 교반시킨 후 여과하였다. 잔사를 냉메탄올 40 mL로 세척한 후, 감압건조하여 3.72 g의 하기 물성치를 갖는 황녹색 침상의 3-치오펜-3-일-1-치오펜-2-일-프로페논(12) (수득율 84.4%)을 수득하였다.

TLC (EtOAc:n-hexane = 1:5, v:v), R_f = 0.2

¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃) δ 7.85 (d, J = 3.8Hz, 1 H, 1-치오펜 H-5), 7.84 (d, J = 15.4Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 7.67 (d, J= 4.9Hz, 1 H, 1-치오펜 H-3), 7.62 (d, J = 1.5Hz, 1 H, 3-치오펜 H-2), 7.43-7.36 (m, 2 H, 3-치오펜 H-4, H-5), 7.24 (d, J = 15.4Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 7.18 (dd, J= 4.9, 3.8Hz, 1 H, 1-치오펜 H-4)

실시예 13 : 3-퓨란-2-일-1-치오펜-2-일-프로페논(13)

2-퓨르알데히드(2-furaldehyde, 1.66ml, 20 mM)을 메탄올 30 mL 및 수용액 5 mL에 녹인 빙냉 상태의 85% 수산화칼륨(1.32 g, 20 mM)용액에 넣어 반응시켰다. 이를 용해한 후, 2-아세틸치오펜(2-acetylthiophene, 2.16ml, 20mM)을 10분 내에 가하고 빙욕조(ice-bath)상에서 3시간동안 교반시킨 후 여과하였다. 잔사를 냉메탄올 40 mL로 세척한 후, 감압건조하여 3.95 g의 하기 물성치를 갖는 노란색 침상의 3-퓨란-2-일-1-치오펜-2-일-프로페논(13)(수득율 96.7%)을 수득하였다.

mp 68.4-69.9℃

TLC (EtOAc:n-hexane = 1:5, v:v), R_f = 0.2,

¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃) δ 7.86 (dd, J = 3.8, 1.1Hz, 1 H, 치오펜 H-5), 7.68 (dd, J = 4.9, 1.1Hz, 1 H, 치오펜 H-3), 7.61 (d, J = 15.3Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 7.54 (d, J = 1.8Hz, 1 H, 퓨란 H-5), 7.33 (d, J = 15.3Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 7.18 (d, J = 4.9, 3.8Hz, 1 H, 치오펜 H-4), 6.73 (d, J= 3.4Hz, 1 H, 퓨란 H-3), 6.52 (dd, J = 3.4Hz, 1.8Hz, 1 H, 퓨란 H-4)

실시예 14 : 1,3-디-퓨란-2-일-프로페논(14)

2-퓨르알데히드(2-furaldehyde, 3.32ml, 40mM)을 메탄올 60 mL 및 수용액 10mL에 녹인 빙냉 상태의 85% 수산화칼륨(2.64 g, 40 mM)용액에 넣어 반응시켰다. 이를 용해한 후, 2-아세틸퓨란(2-acetylfuran, 4.0ml, 40mM)을 10분 내에 가하고 빙욕조(ice-bath)상에서 3시간동안 교반시킨 후 여과하였다. 잔사를 냉메탄올 10 mL로 세척한 후, 실리카켈 컬럼 크로마토그래피(정제용매 EtOAc:n-hexane = 1:4, v:v) 방법으로 정제하여 6.41 g의 하기 물성치를 갖는 연노란색 침상의 1,3-디-퓨란-2-일-프로페논(14)(수득율 85.4%)을 수득하였다.

mp: 88.2 89.6℃

TLC(EtOAc: n-Hexane = 1:2, v:v), R_f =0.39

¹H-NMR ( 250MHz, CDCl₃ ) : δ 7.65 (dd, J = 1.7Hz, 0.7Hz, 1H, 1-퓨란 H4 ) 7.63 ( d, J = 15.4Hz, 1H, -CH=CH-CO- ) 7.53 ( d, J = 1.7Hz, 1H, 3-퓨란 H4 ) 7.32 ( dd, J = 3.6Hz, 0.7Hz, 1H, 1-퓨란 H-2 ) 7.31 ( d, J = 15.4Hz, 2H, -CH=CH-CO- ) 6.73 ( d, J = 3.4, 3-퓨란 H-2) 6.59 ( dd, J = 3.6Hz, 1.7Hz, 1H, 1-퓨란 H3 ) 6.52 ( dd, J = 3.4Hz, 1.7Hz, 1H, 3-퓨란 H3 )

실시예 15 : 1-퓨란-2-일-3-피리딘-2-일-프로페논(15)

2-피리딘카르복스알데히드 (2-pyridinecarboxaldehyde, 5.2ml, 54.85mM) 을 25℃의 온도에서 질소 하에서 에탄올에 녹인 34mg의 고체상 수산화나트륨 용액에 넣어 반응시켰다. 이를 용해한 후, 2-아세틸퓨란(2-acetylfuran5ml, 49.86mmol)을 25℃온도 하에서 3시간동안 교반시킨 후, 그 혼합물에 80ml의 물을 넣은 후, 120ml의 CH₂Cl₂로 추출하고, 유기층은 80mlⅹ2의 물 및 포화된 80ml의 NaCl 용매로 세정하고, Na₂SO₄로 건조시켰다. 용매는 감압건조하고, 잔사는 실리카켈 컬럼 크로마토그래피(정제용매 EtOAc:n-hexane = 1:2, v:v) 방법으로 정제하여 3.84 g의 하기 물성치를 갖는 노란색 결정의 1-퓨란-2-일-3-피리딘-2-일-프로페논(15)(수득율 38.7%)을 수득하였다.

TLC(EtOAc: n-Hexane = 1:2, v:v), R_f =0.167

¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃): δ 8.70 (ddd, J = 4.8, 1.7, 0.9Hz, 1 H, 피리딘 H-6), 7.97 (d, J = 15.4Hz, 1 H, -CH=CH-CO), 7.84 (d, J= 15.4Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 7.75 (dt, J = 7.7, 1.8Hz, 1 H, 피리딘 H-4), 7.68 (dd, J = 1.7, 0.7Hz, 1 H, 퓨란 H-5), 7.48 (dt, J = 7.8, 1.2Hz, 1 H, 피리딘 H-3), 7.42 (dd, J = 3.6, 0.7Hz, 1 H, 퓨란 H-3), 7.31 (ddd, J = 7.6, 4.8, 1.1Hz, 1 H, 피리딘 H-5), 6.61 (dd, J = 3.6, 1.7Hz, 1 H, 퓨란 H-4)

실시예 16 : 3-(3-메틸-치오펜-2-일)-1-피리딘-2-일-프로페논(16)

3-메틸-2-치오펜-카르복스알데히드(3-methyl-2-thiophene-carboxaldehyde, 3.85ml, 35.66mM)을 메탄올 60 mL 및 수용액 10 mL에 녹인 빙냉 상태의 85% 수산화칼륨(2.35 g, 35.66mM)용액에 넣어 반응시켰다. 이를 용해한 후, 2-아세틸피리딘(2-acetylpyridine, 4.0ml, 35.66mM)을 10분 내에 가하고 빙욕조(ice-bath)상에서 3시간동안 교반시킨 후 여과하였다. 잔사를 냉메탄올 40 mL로 세척한 후, 실리카켈 컬럼 크로마토그래피(정제용매 EtOAc:n-hexane = 1:3, v:v) 방법으로 정제하여 6.43 g의 하기 물성치를 갖는 녹색 결정의 3-(3-Methyl-치오펜-2-일)-1-피리딘-2-일-프로페논(16)(수득율 78.6%)을 수득하였다.

mp: 100.1 111.6℃

TLC(EtOAc: n-Hexane = 1:2, v:v), R_f =0.60

¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃): δ 8.74 (ddd, J = 4.8, 1.7, 0.9Hz, 1 H, 피리딘 H-6), 8.18 (dt, J = 8.0, 1.0Hz, 1 H, 피리딘 H-3), 8.15 (d, J = 15.7Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 8.02 (d, J = 15.6Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 7.87 (dt, J = 7.7, 1.7Hz, 1 H, 피리딘 H-4), 7.48 (ddd, J = 7.5, 4.8, 1.2Hz, 1 H, 피리딘 H-5), 7.33 (d, J = 5.1Hz, 1 H, 치오펜 H-5), 6.91 (d, J = 5.1Hz, 1 H, 치오펜 H-4)

실시예 17 : 1-(5-클로로-치오펜-2-일)-3-퓨란-2-일-프로페논(17)

2-퓨르알데히드(2-furaldehyde, 2.10ml, 24.9mM)을 메탄올 40 mL 및 수용액 7 mL에 녹인 빙냉 상태의 85% 수산화칼륨(1.64 g, 24.9 mM)용액에 넣어 반응시켰다. 이를 용해한 후, 2-아세틸-5-클로로치오펜(2-acetyl-5-chlorothiophene, 4.0g, 24.9mM)을 10분 내에 가하고 빙욕조(ice-bath)상에서 3시간동안 교반시킨 후 여과하였다. 잔사를 냉메탄올 40 mL로 세척한 후, 실리카켈 컬럼 크로마토그래피(정제용매 EtOAc:n-hexane = 1:10, v:v) 방법으로 정제하여 5.47 g의 하기 물성치를 갖는 노란색 결정의 1-(5-클로로-치오펜-2-일)-3-퓨란-2-일-프로페논(17)(수득율 92%)을 수득하였다.

mp: 85.5 87.0℃

TLC(EtOAc: n-Hexane = 1:5, v:v), R_f =0.41

¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃): δ 7.63 (d, J = 4.1Hz, 1 H, 치오펜 H-3), 7.59 (d, J = 15.3Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 7.54 (d, J = 1.3Hz, 1 H, 퓨란 H-5), 7.23 (d, J = 15.2Hz, 1 H, -CH=CH-CO-), 7.00 (d, J = 4.1Hz, 1 H, 치오펜 H-3), 6.74 (d, J = 3.4Hz, 1 H, 퓨란 H-3), 6.53 (dd, J = 3.4, 1.8Hz, 1 H, 퓨란 H-4)

참고예 1. 실험재료 및 시약, 기기 분석

Balb/c 수컷 마우스는 효창 사이언스(서울, 대한민국)에서 구입하여 사용하였으며, 설치류 대식세포인 RAW264.7 세포는 ATTC(American Type Culture Collection)사에서 구입하였다.

1-팔미토일-2-[1-¹⁴C]아라키도닐-포스파티딜에탄올아민 (1-Palmitoyl-2-[1-¹⁴C]arachidonyl-Phosphatidylethanolamine)은 NEN사, [³H]-아세틸 조효소 A는 아머샴 바이오사이언스(Amersham Biosciences)사, n-헵탄은 야쿠리 퓨어 케미컬(Yakuri Pure Chemical)사, 아세틸 조효소A와 소 혈청 알부민(BSA, bovine serum albumin), 아스피린, MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide), N-(1-나프틸)에틸렌디아민(N-(1-Naphthyl)ethylenediamine)은 시그마 케미컬(Sigma Chemical)사, 재조합 마우스 c-키트 리간드(KL, recombinant mouse c-kit ligand)는 본 연구실에서 제조하였으며, 브래드포드 단백질 분석 시약(Bradford protein assay reagent)은 바이오-래드(BIO-RAD)사로부터 구입하여 사용하였다. PGD₂ 및 LTC₄ 효소 연결성 면역분석(EIA, Enzyme linked immunoassay) 키트는 카이만 케미컬(Cayman Chemical)사, TNF-α 및 IL1-β ELISA 키트는 R&D사, PGE₂ 효소 연결성 면역분석 키트는 아머샴 바이오사이언스(Amersham Biosciences)사의 것을 사용하였으며, 배양액인 RPMI-1640, 리포펙트아민2000, Opti-MEM은 GIBCO BRL사, 우태아 혈청(FBS, fetal bovine serum)는 JBI사, DMSO(dimethylsulfoxide)는 머크(Merck)사,POPOP(1,4-bis[2-(phenyloxazolyl)]-benzene), DPO(2,5-diphenyl-oxazole)는 도진(Dojin)사, 메탄올, 에탄올 및 이소프로판올은 카이만 케미컬(Cayman Chemical)사, 클로로포름은 준세이(Junsei)사의 것을 사용하였다. iNOS 항체와 IκBα항체는 산타-크루즈(Santa-Cruz)사로부터 COX-2 항체는 카이만 케미컬(Cayman Chemical)사, PERK와 PP38 항체는 셀 시그날링(Cell Signaling)사 제품을 사용하였다.

합성된 물질의 구조 규명에는 Bruker AMX250 모델이 사용되어 ¹H-NMR과 ¹³C-NMR을 얻었고 액체크로마토그래피/질량분석기(LC/Mass Spectrometry)는 피니간 LCQ 어드벤티지^®(Finnigan LCQ Advantage^® ) LC/MS/MS 분광계(spectrometry)를 엑스칼리버(Xcalibur)^®프로그램을 이용하여 분석하였다. TLC(Thin-layer chromatography)와 컬럼 크로마토그래피(column chromatography)는 머크사 (Merck) 의 키젤겔(Kieselgel) 60 F₂₅₄와 실리카겔 키젤겔 (Silicagel Kieselgel) 60 (240 ~ 400 mesh)을 사용하였다. 액체고속크로마토그래피는 시마쯔 (Shimadzu) 제품의 SPD M10A 다이오드 시스템을 사용하여 물질의 확인과 순도 측정 및 정량 등의 분석에 이용하였다.

참고예 2. 세포 배양

수컷 Balb/c 마우스로부터 채취한 골수세포를 10% FBS, 100U/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신, 100μM MEM 비필수 아미노산 용액이 포함된 RPMI1640 배지에 IL-3(마우스 비장 세포 상등액)의 최종 농도가 10ng/ml되도록 넣은 배양액으로 약 3주 정도 배양하여 90% 이상의 균질 BMMC (Bone Marrow-derived mast cell)를 얻었다. RAW264.7 세포는 10% FBS, 100 U/ml 페니실린, 100 mg/ml 스트렙토마이신이 포함된 RPMI1640 배지로 배양하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였고 배양된 세포는 6-웰 또는 12-웰, BMMC의 경우 96-웰에서 일정한 수의 세포를 분주하여 실험하였다.

실험예 1. 아라키돈산 대사계 효소 활성에 미치는 영향

1-1. 라이소 PAF-아세틸전이효소(lyso PAF-acetyltransferase)저해 활성 측정

야노시타 (Yanoshita)등의 문헌 (Yanoshita R et al., Inflamm. Res., 45(11), pp546-549, 1996)에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.

10μM 라이소 PAF와 200μM [³H]-아세틸 조효소 A를 기질로 사용하고, 효소원으로는 랫트 호염기구 유래의 세포주인 RBL-2H3를 대량 배양하여 균질화시킨 후, 이를 펠렛을 사용하여 원심분리(100,000×g)한 후 최종 농도 100 mM 트리스(Tris)-HCl (pH 6.9)를 넣고 일정 농도의 프로페논 유도체를 함유한 반응액을 37℃에서 10분간 반응시킨 뒤, 클로로포름 및 메탄올 혼합액(1:2)을 1.5 ml, 아세트산 30 ㎕를 가하여 반응을 정지시킨 후, 클로로포름 및 증류수 적당량을 넣어 원심분리하고 유기 용매층을 취하여 생성된 [³H]-PAF를 액체섬광계수기(Liquid Scintillation Counter, (LSC), 베크만 (Beckman), 독일)로 측정하였다.

1-2. PLA ₂ 저해 활성 측정

1-팔미토일-2-[1-¹⁴C]아라키도닐-포스파티딜에탄올아민(NEN사, 미국) 적당량을 시험관에 분취한 후, 질소가스로 용매를 휘발시켜 얻은 지질 필름에 적당량의 증류수를 가하여 초음파 처리(Branson 2200, USA)하여 기질로 사용한다. 4 mM CaCl₂, 100mM Tris-HCl (pH 9.0), 기질 (0.3 nmol), 효소 및 프로페논 유도체액을 일정농도 함유한 반응액을 37℃에서 일정시간 동안 반응시킨 뒤, 돌스 시약(Dole's reagent)으로 반응을 정지시키고 원심분리 하였다. 상층부에 혼입된 라이소체를 실리카겔로 제거한 후, 액체섬광계수기(BECKMAN)를 사용하여 유리된 [¹⁴C]-아라키돈산 를 측정하여 PLA₂ 활성으로 환산하였다.

1-3. 프로페논 유도체들의 아라키돈산 대사계 효소 활성 측정

실험결과, 상기 실시예 1 내지 17의 프로페논 유도체들은 염증 및 알러지 질환에 직,간접적으로 관여하는 지질성 매개체인 혈소판 활성인자 (PAF) 생합성의 율속 효소인 라이소 PAF-아세틸전이효소 (lyso PAF-AT)의 활성(최종 농도 50 μg/ml) 및 sPLA₂ IIA 활성(최종 농도 2.5 μg/ml) 탈과립의 척도로서 β-헥소시미니다제의 양을 측정한 결과(최종 농도 25 μg/ml) 하기 표 1에서 보는 바와 같이 다수의 화합들이 큰 활성을 나타내지 않았다.

화합물	PLA₂	라이소PAF	β-hex
화합물1	1.50	30.79	23.94
화합물2	0>	1.74	0>
화합물3	0>	0>	0>
화합물4	0>	25.15	0>
화합물5	11.9	16.98	0>
화합물6	0>	5.99	0>
화합물7	0>	11.63	3.29
화합물8	0>	0>	2.35
화합물9	20	33.23	0>
화합물10	0>	12.37	0>
화합물11	0>	42.16	13.62
화합물12	0>	3.59	0>
화합물13	0>	0>	0>
화합물14	0>	0>	0>
화합물15	52.12	16.32	22.07
화합물16	43.56	44.47	33.33
화합물17	0>	2.70	14.56

실험예 2. 프로페논 유도체들의 COX-1과 COX-2에 의한 PGD ₂ 생성에 미치는 영향

2-1. PGD ₂ 생성 어세이

BMMC를 1×10⁶ 세포/ml 농도로 하여 자극제로는 100 ng/ml KL (c-kit ligand), 100 U/ml IL-10 및 100 ng/ml LPS를 처리하며, 프로페논 유도체는 일정 농도로 하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 8시간 동안 배양한 후 PGD₂의 생성량을 측정하여 COX-2 활성으로 판정하였다. 이때 COX-2의 효소활성은 미리 10μg/ml 아스피린을 2시간 처리하여 COX-1을 불활성시킨 후에 실험에 사용하였다. 반응이 끝난 후 120×g, 4℃에서 5분간 원심분리하여 상등액을 PGD₂ 생성량의 측정에 이용하며, PGD₂는 PGD₂어세이 키트 (Cayman 사)를 이용하여 측정하였다.

2-2. 프로페논 유도체들의 COX-1 및 COX-2에 의한 PGD ₂ 생성 저해 효과

상기 실험예 2-1의 실험결과, BMMC에 상기 실시예 1 내지 17의 프로페논 유도체들을 1시간 전 처리(최종 농도 12.5μg/ml)한 후 KL, LPS 및 IL-10를 이용하여 COX-1 활성에 의한 PGD₂및COX-2 활성에 의한 PGD₂를 정량한 결과, 하기 표 2에서 보는 바와 같이 COX-2 활성의 저해 효과가 강하게 나타났으며, 반면 COX-1은 비교적 낮은 활성을 나타내었다. 그 중 특히 화합물 12 및 화합물 15(이하 FPP-3)가 선택성이 있음을 확인하였고, IC₅₀값은 표 3에 나타난 바와 같다.

화합물	PGD₂(COX-1)	PGD₂(COX-2)
화합물1	41.88	42.63
화합물2	39.02	91.18
화합물3	31.46	93.02
화합물4	51.72	93.44
화합물5	63.57	95.42
화합물6	43.11	91.79
화합물7	40.67	79.71
화합물8	7.28	43.65
화합물9	50.72	94.61
화합물10	53.03	95.42
화합물11	61.51	93.84
화합물12	5.99	94.37
화합물13	62.04	94.16
화합물14	15.20	85.95
화합물15	5.99	91.10
화합물16	30.04	90.44
화합물17	27.09	93.44

화합물	COX-1 IC₅₀(μg/㎖)	COX-2 IC₅₀(μg/㎖)
화합물1	7.7	5.0
화합물2	8.1	1.5
화합물3	9.1	2.4
화합물4	4.8	1.9
화합물5	1.9	1.1
화합물6	7.2	2.4
화합물7	8.7	1.6
화합물8	17.1	4.0
화합물9	4.6	2.3
화합물10	9.9	2.0
화합물11	2.0	0.8
화합물12	13.3	6.0
화합물13	12.4	2.8
화합물14	15.2	5.5
화합물15	28.1	5.6
화합물16	9.25	5.4
화합물17	13.8	3.4

2-3. FPP-3가 BMMC에서 COX-2 단백질 발현 및 PGD ₂ 생성에 대한 효과

상기 실험예 2-1의 실험결과, 미리 아스피린으로 (10μg/ml)으로 COX-1을 불활성 시킨 BMMC에 FPP-3를 처리하고, KL, LPS 및 IL-10를 이용하여 8시간 동안 활성화 시킨 후 세포는 단백질 발현을 보았으며, 상청액은 EIA 키트를 사용하여 PGD₂를 정량한 결과, FPP-3는 BMMC에서 용량 의존적으로 COX-2 단백질 발현을 억제하여 PGD₂의 생성을 저해함을 확인할 수 있었고, COX-2의 IC₅₀값은 28.1μM 이었다(도 1 참조). 세포의 단백질 발현의 관찰을 위해 웨스턴 블랏(Western Blot)방법을 사용하였는데, 전기 영동을 통하여 분리한 COX-2는 20% 메탄올, 25 mM Tris, 192 mM 글리신이 포함된 완충액을 사용하여 니트로셀룰로오스 막으로 이동시켰다. 단백질이 이동된 막은 폰소(Ponceau) 용액으로 이동유무를 확인한 후, 5% 탈지분유 용액으로 30분간 실온에서 반응하여 차단하고 차단용 완충액으로 희석한 1차 항체 및 막을 4시간 이상 반응하였다. 반응이 끝난 후 TTBS(Tris-Tween buffer saline)를 사용하여 5분 간격으로 6회 세척하였으며, 호오스 래디쉬 퍼옥시다제(HRP, horse radish peroxidase)가 부착된 2차 항체와 반응시킨 후 다시 한번 TTBS로 6회 세척하였다. 세척이 끝나면 증류수로 세척하고 ECL 용액으로 2분간 반응하여 필름에 감광하여 나타난 밴드의 두께를 비교하여 단백질 발현 유무 및 그 차이를 확인하였다(도 1 참조).

실험예 3. 프로페논 유도체들의 5-LOX에 의한 LTC ₄ 생성에 미치는 영향

3-1. LTC ₄ 생성 어세이

1×10⁶ 세포/ml 농도의 BMMC에 일정 농도의 프로페논 유도체를 가하여 30분간 37℃, 5% CO₂ 조건에서 전배양한 후, 100 ng/ml인 KL (c-kit ligand)를 처리하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 20분간 배양하여 원심 분리한 후, 그 상층액을 취하여 배양 상층액내의 LTC₄를 LTC₄어세이 키트(Cayman 사)를 이용하여 측정하였다.

3-2. 프로페논 유도체들의 5-LOX에 의한 LTC ₄ 생성에 미치는 영향

상기 실험예 3-1의 방법에 따라, KL로 BMMC를 활성화 시킨 후 비만 세포에 존재하는 5-LOX의 활성에 미치는 프로페논 유도체들(최종 농도 25μg/ml)의 영향을 알아보기 위해 5-LOX의 대사 산물인 LTC₄ 생성 억제 기능을 검토한 결과, 하기 표 4에서 보는 바와 같이 매우 높은 활성을 나타내었다.

3-3. FPP-3가 BMMC에서 5-LOX에 의한 LTC ₄ 생성에 미치는 효과

상기 실험예 3-2의 실험결과, KL로 BMMC를 활성화시킨 후 비만세포에 존재하는 5-LOX의 활성에 미치는 FPP-3의 영향을 알아보기 위해 5-LOX의 대사 산물인 LTC₄ 생성 억제능을 검토한 결과, 농도 의존적으로 LTC₄의 생성을 억제시켰으며, 도 2에서 보는 바와 같이 IC₅₀값은 1.6μM 임을 확인하였고, FPP-3가 5-LOX를 강하게 억제함을 확인하였다.

화합물	LTC₄(5-LOX)	IC₅₀(μM)(5-LOX)
화합물1	92.37	8.13
화합물2	96.27	13.5
화합물3	96.58	13.8
화합물4	95.55	10.0
화합물5	96.37	7.60
화합물6	97.20	12.0
화합물7	95.38	13.4
화합물8	94.31	10.0
화합물9	95.40	12.2
화합물10	93.76	9.50
화합물11	91.60	4.80
화합물12	93.93	5.90
화합물13	96.98	14.0
화합물14	97.65	12.8
화합물15	96.05	0.37
화합물16	94.92	6.51
화합물17	96.16	7.52
AA861^a		0.032

^a: 5-LOX에 대한 양성대조군(positive control) (Yoshimoto T et al., Biochim. Biophys. Acta., 713(2), pp470-473, 1982).

실험예 4. 프로페논 유도체들의 NO 생성 및 iNOS 단백질 발현에 미치는 영향

4-1. PGE ₂ 생성 어세이

RAW264.7 세포를 12-웰 플레이트(plate)에 5×10⁵개로 분주하고 6시간 이상 안정화시킨 다음 FPP-3를 30분 전처리 한 후, LPS를 12시간 처리하고, 상등액 내의 PGE₂를 PGE₂어세이 키트 (Amersham Biosciences 사)를 이용하여 측정하였다.

4-2. NO 생성 측정

대식세포 활성화에 미치는 영향을 검토하기 위해 RAW264.7 대식세포주를 사용하여 각 프로페논 유도체들을(최종 10μg/ml) 30분 전처리하고, LPS를 24시간 처리한 후 NO 생성을 측정한 결과, FPP-3가 NO 생성을 효과적으로 억제함을 확인하였다(도 3 참조).

4-3. RAW264.7 세포에서 FPP-3의 NO 생성 저해 효과

FPP-3의 NO의 양은 배양된 상등액에서 아질산염을 분석함으로써 확인하였다. 100㎕ 그리에스(Griess) 시약 (1% 술파닐아마이드(sulfanilamide), 0.1% 나프틸에틸렌디아민 디하이드로클로라이드(naphthylethylenediamine dihydrochloride), 2.5% 포스포릭산(phosphoric acid))과 동량의 세포 배양액을 혼합하여 암실에서 10분 반응한 후 발색된 흡광도는 ELISA를 사용하여 570 nm 파장에서 측정하였고, 새로운 배양용 배지는 모든 실험에서 공 시료로 사용하였으며 아질산염의 농도는, NaNO₂ 반응으로부터 얻어진 표준 곡선으로부터 환산하여 측정하였다.

실험결과 도 4에서 보는 바와 같이, RAW264.7 세포에서 FPP-3의 NO 생성은 농도 의존적으로 감소되었으며, NO의 IC₅₀농도는 10.1μM임을 확인하였다.

4-4. FPP-3가 RAW264.7 세포에서 iNOS 단백질 발현 감소 효과

FPP-3가 대식 세포 활성화에 미치는 영향을 검토하기 위해 RAW264.7 세포를 사용하였으며 각각 6.25μM, 12.5μM, 25μM 및 50μM의 농도 별로 30분동안 전처리한 후 LPS 200 ng/ml을 24시간동안 처리하였다. 상기 실험예 2-3에서와 같이 iNOS 단백질의 발현 양상을 웨스턴 블랏 분석을 통해 관찰한 결과, 아질산염(nitrite)의 생성 및 iNOS 발현이 농도의존적으로 감소됨을 확인하였다(도 4 참조).

실험예 5. 프로페논 유도체들의 세포독성 실험

5-1. MTT 어세이

1×10⁶ 세포/ml 농도의 RAW264.7 세포에 일정농도의 프로페논 유도체를 가하여 8시간 동안 전배양한 후, 약 0.5 mg/ml 농도의 MTT를 처리하여 37℃, 5% CO₂조건에서 20분간 배양하여 0.04 N-HCl/이소프로판올을 가하여 완전히 세포를 용해시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

5-2. FPP-3의 세포독성 실험

FPP-3를 최대 25μM 농도에서 RAW264.7 대식세포에 대한 세포 독성을 알아보기 위해 MTT 법를 이용한 실험을 하였다.

실험결과, 대조군 세포와 FPP-3를 50μM, 25μM, 12.5μM 농도로 처리한 세포를 ELISA를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하여 비교한 결과 세포 독성이 없음을 확인하였고, 수컷 Balb/c 마우스 골수 유래 비만 세포에 대한 세포 독성 여부 를 알아보기 위해 세포 착색을 한 후 계수하여, 대조군 세포와 FPP-3를 50μM, 25μM, 12.5μM 농도로 처리한 세포를 착색한 후 계수한 결과, 세포 독성이 없음을 확인하였다(도 5 및 표 5참조).

총세포수	세포수	생존율(%)
444	20	95.5	-
432	19	95.6	DMSO (0.05%)
428	32	92.3	FPP-3 (50μM)
430	35	91.9	FPP-3 (25μM)
426	28	93.5	FPP-3 (12.5μM)

실험예 6. 프로페논 유도체들의 전염증성(proinflammatory) 사이토카인인 TNF-α 생성에 미치는 영향

6-1. TNF-α 생성 어세이

RAW264.7 세포를 12-웰 플레이트에 5×10⁵개로 분주하고 6시간 이상 안정화시킨 다음 FPP-3를 30분 전처리 한 다음 LPS를 1시간 처리한 후 상등액 내의 TNF-α를 TNF-α어세이 키트 (R&D사)를 이용하여 측정하였다.

6-2. RAW264.7 세포에서 FPP-3의 전염증성(proinflammatory) 사이토카인인 TNF-α 생성 저해 효과

FPP-3가 LPS 자극에 의해 유도되는 TNF-α 생성에 미치는 영향을 확인하기 위해 RAW264.7 세포를 사용하였으며, 각각 0μM, 6.25μM, 12.5μM , 17.5μM , 25 μM의 농도별로 30분동안 전처리한 후 LPS 200 ng/ml을 1시간동안 처리하여 관찰한 결과, FPP-3가 농도의존적으로 TNF-α 생성을 감소 시켰으며 TNF-α의 IC₅₀ 농도가 48.9 μM 임을 확인하였다(도 6 및 표 6 참조).

FPP-3(μM) + LPS 200ng/ml	TNF-α 생성량(pg/ml)
0	1498.43±110.6
6.25	1493.137±98.8
12.5	1252.451±32.1
17.5	1071.078±30.1
25	705.9±25.7

실험예 7. 프로페논 유도체들의 전염증성(proinflammatory) 사이토카인인 IL1-β 생성에 미치는 영향

7-1. IL1-β 생성 어세이

RAW264.7 세포를 12-웰 플레이트에 5×10⁵개로 분주하고 6시간 이상 안정화시킨 다음 FPP-3를 30분동안 전처리한 후, LPS를 48시간 처리하고 상등액 내의 IL1-β를 IL1-β 어세이 키트(R&D사)를 이용하여 측정하였다.

7-2. RAW264.7 세포에서 FPP-3가 전염증성(proinflammatory) 사이토카인인 IL1-β 생성 저해 효과

FPP-3가 LPS 자극에 의해 유도되는 IL1-β 생성에 미치는 영향을 확인하기 위해 RAW264.7 세포를 사용하여 각각 0μM, 12.5μM, 25μM , 35μM , 50μM의 농 도별로 30분동안 전처리한 후 LPS 200 ng/ml을 1시간동안 처리하여 관찰한 결과, FPP-3는 농도의존적으로 IL1-β 생성을 감소 시켰으며 IL1-β IC₅₀ 농도는 18.7 μM 임을 확인하였다(도 7 참조).

실험예 8. 프로페논 유도체들의 RAW264.7 세포에서 FPP-3가 LPS 자극에 의한 IκBα의 분해에 미치는 영향

8-1. RAW264.7 세포에서 FPP-3가 LPS 자극에 의한 IκBα의 분해 억제 효과

FPP-3가 LPS에 의한 IκBα의 인산화에 미치는 영향을 확인하기 위해 RAW264.7 세포를 각각 5분, 10분, 20분, 30분, 1시간, 2시간 및 3시간의 LPS 처리 시간에 따른 IκBα의 감소 및 FPP-3를 각각 12.5, 25, 35, 50μM의 농도별로 전처리한 후 LPS 처리 시간에 따른 IκBα의 감소를 도 8에 나타내었다. 상기 실험예 2-3에서와 같이 IκBα의 발현 양상을 웨스턴 블랏 분석을 통해 관찰하여, FPP-3 전처리에 의해 IκBα의 감소가 억제되었고, FPP-3 농도의존적으로 억제 효과가 높음을 확인하였다(도 8 참조).

실험예 9. 프로페논 유도체들의 Raw 264.7 세포에서 FPP-3가 LPS 자극에 의한 타이로신 키나아제들의 활성에 미치는 영향

9-1. FPP-3가 Raw 264.7 세포에서 LPS 자극에 의한 타이로신 키나아제들의 활성 저해 효과

LPS 자극에 의한 NO 생성과 iNOS 발현 각종 염증 단백질과 사이토카인의 생성에 관여하는 신호 전달 단백체 중 세포외 조절 키나제(ERK, Extracellular Regulated Kinase)의 활성형인 pERK와 pP38의 단백질 발현에 FPP-3가 미치는 영향을 상기 실험예 2-3에서와 같이 웨스턴 블랏 분석을 통해 관찰한 결과, FPP-3가 pERK의 인산화를 억제하는 반면, pP38의 인산화는 억제하지 않음을 확인하였다(도 9 참조).

실험예 10. FPP-3가 RAW264.7 세포에서 LPS 자극에 의한 NF-κB 전사 활성에 미치는 영향

10-1. 형질전환(transfection) 및 루시페라아제 활성 분석

RAW264.7 세포를 12-웰 플레이트에 2×10⁵개로 분주하고 루시페라아제가 연결된 NF-κB 프로모터 DNA는 리포펙트아민 2000을 사용하여 세포에 형질전환하였다. 형질전환한 세포는 16시간 동안 충분히 배지에서 배양하고 FPP-3을 30분동안 전처리한 후 LPS를 24시간 동안 처리하였다. 세포를 수확한 후 한차례 수세하고 세포 용해 완충액(report lysis buffer)으로 용해한 후, 루시페라아제 분석 기질과 반응하여 루미노미터(luminometer)를 이용하여 활성을 측정하였다.

10-2. FPP-3가 RAW264.7 세포에서 LPS 자극에 의한 NF-κB 전사 활성에 미치는 영향

FPP-3가 RAW264.7 세포에서 LPS에 의해 활성되는 NF-κB의 전사 활성에 미치는 영향을 검토하기 위해 루시페라아제 어세이(assay)를 실시하였다. 루시페라아제가 부착된 NF-κB 프로모터 DNA를 얻어 RAW264.7 세포에 일시적인 형질전환 발현을 유도한 다음, FPP-3를 전처리한 후, LPS를 처리하고 세포 용출액(cell lysate)을 분리하여 형광 단백인 루시페라아제 활성을 측정한 결과, FPP-3의 활성도가 농도의존적으로 저해됨을 확인하였다(도 10 참조).

실험예 11. FPP-3가 RAW 264.7 세포에서 COX-2 단백질 발현과 PGE ₂ 생성에 미치는 효과

11-1. FPP-3가 RAW 264.7 세포에서 COX-2 단백질 발현과 PGE ₂ 생성에 미치는 효과

RAW 264.7 세포를 6시간 이상 안정화시킨 다음 각각 12.5, 25, 35, 50 μM의 농도로 FPP-3를 전처리한 후 LPS를 12시간 처리하여 상기 실험예 2-3에서와 같이 COX-2 단백질의 발현 양상을 웨스턴 블랏 분석을 통해 관찰하고, 상등액내의 PGE₂는 PGE₂어세이 키트를 이용하여 측정한 결과, FPP-3는 RAW264.7 세포에서 용량의존적으로 COX-2단백질 발현을 억제하여 PGE₂의 생성을 억제함을 확인하였으며, IC₅₀값은 33.7μM 이었다(도 11 참조).

실험예 12. 급성 독성 실험

25±5g의 ICR계 마우스(대한실험동물)와 235±10g의 특정병원부재(SPF) 스프라그-도올리(Sprague Dawley, Biogenomics사) 래트를 각각 10마리씩 4군으로 나누어 본 발명의 프로페논 유도체 화합물을 각각 20mg/㎏, 10mg/㎏, 1mg/㎏의 용량으로 복강투여한 후 24시간 동안 독성여부를 관찰하였다.

실험 결과, 4군 모두에서 사망한 예를 전혀 관찰할 수 없었고, 체중 증가, 사료 섭취량 등에서 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다. 따라서 본 발명의 조성물은 급성독성이 거의 없음이 확인되었다.

본 발명의 프로페논 유도체를 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

FPP-3 300 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

FPP-3 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

FPP-3 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

FPP-3 50 mg

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

FPP-3 100 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 신규한 프로페논 유도체를 제공하며, 또한 본 발명의 신규한 프로페논 유도체 화합물은 COX 및 5-LOX 효소 저해활성, NO 생성 및 TNF-α, IL1-β 의 생성에 대한 억제 활성이 우수하고 항염증 활성이 탁월하므로, 이를 포함하는 조성물은 염증 질환의 치료 및 예방을 위한 약학 조성물로써 의약품에 유용하게 이용할 수 있다.

Claims

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3-페닐-1-피리딘-2-일-프로페논, 3-퓨란-2-일-1-피리딘-2-일-프로페논, 3-퓨란-3-일-1-피리딘-2-일-프로페논, 1-피리딘-2-일-3-치오펜-2-일-프로페논, 1-피리딘-2-일-3-치오펜-3-일-프로페논, 3-퓨란-2-일-1-피리딘-3-일-프로페논, 3-퓨란-3-일-1-피리딘-3-일-프로페논, 1-피리딘-3-일-3-치오펜-3-일-프로페논, 1,3-디페닐프로페논, 1-페닐-3-치오펜-2-일-프로페논, 1,3-디-치오펜-2-일-프로페논, 3-치오펜-3-일-1-치오펜-2-일-프로페논, 3-퓨란-2-일-1-치오펜-2-일프로페논, 1,3-디-퓨란-2-일-프로페논, 1-퓨란-2-일-3-피리딘-2-일-프로페논, 3-(3-메틸-치오펜-2-일)-1-피리딘-2-일-프로페논 또는 1-(5-클로로-치오펜-2-일)-3-퓨란-2-일-프로페논.
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제 5항의 화합물을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하며, 염증반응에 의해 발생하는 류마티스성 관절염 또는 골관절염의 치료 및 예방에 효과적인 약학조성물.
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