JP6750831B2 - 非アルコール性脂肪性肝疾患の処置 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

本発明は、アルコールの乱用に起因しない肝臓における過剰な脂肪蓄積と関連する状態の予防、制御および／または処置のための薬剤としての、ビタミンＥおよび多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の混合物の使用に関する。これは、それを必要とする対象での − 非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）として公知の − 肝臓における非アルコール性脂肪症および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の予防、制御および／または処置を含む。特に、本発明は、ＮＡＦＬＤに関連する状態の予防、制御および／または処置のための医薬品の製造における活性成分としての、ビタミンＥおよびＰＵＦＡを含むこのような化合物の使用に関する。

脂肪肝の病態生理は完全に明らかにされてこなかったが、一般に認められている機序は、「ツーヒット」理論である（Ｄａｙ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ，１９９８ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１４：８４２−８４５）。第１のヒットは、肝臓における遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の蓄積に対応し、これは肥満症、またはより一般に、代謝症候群（糖尿病、高血圧症および異脂肪血症を含めた）と関連することができる。第２のヒットは、異なる要因によって生じる酸化ストレスによるこれらの脂肪酸の過酸化を指す（Ａｎｇｕｌｏ ａｎｄ Ｌｉｎｄｏｒ，２００１ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２０：１２８１−１２８５）。

第１のヒットの最終結果は、脂質ベータ酸化における供給過剰および／または不全からの過剰なＦＦＡバランスであり、これは肝臓における脂肪酸の蓄積を引き起こし、それによって最初の病変が生じる（Ｃｈａｒｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３５：８９８−９０４）。これらの最初のインパクトは、酸化ストレスおよび炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＩＬ−６、ＩＬ−８）によって媒介される第２のヒットの攻撃因子に対して肝臓をより脆弱なものとさせる。ＦＦＡは、いくつかのＦＦＡのβ−酸化に関与するミクロソーム酵素であるチトクロムＰ４５０ ２Ｅ１（ＣＹＰ２Ｅ１）の発現を増加させ、これによって活性酸素代謝物の放出がもたらされる（Ｗｅｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２７：１２８−１３３）。また、いくらかのＦＦＡは、ペルオキシソームのβ酸化によって代謝され、さらなる活性酸素代謝物（過酸化水素、ヒドロキシルラジカル）を生じさせる（Ｒａｏ ａｎｄ Ｒｅｄｄｙ，２００１ Ｓｅｍｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ ２１：４３−５５）。過剰なこれらの分子は、肝臓において天然抗酸化剤、例えば、グルタチオンおよびビタミンＥを枯渇させ、酸化ストレスを引き起こし、脂質過酸化がもたらされる（Ｎｅｕｓｃｈｗａｎｄｅｒ−Ｔｅｔｒｉ ａｎｄ Ｃａｌｄｗｅｌｌ，２００３ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３７：１２０２−１２１９）。結果的に、肝細胞小器官および肝細胞膜における損傷が起こり、肝細胞の変性および究極的に壊死をもたらす（Ｇａｒｃｉａ−Ｍｏｎｚｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ ３３：７１６−７２４）。ミトコンドリアにおける脂質過酸化は、活性酸素代謝物の余分な産生を結果として生じさせ、さらなる酸化ストレスをもたらす（Ｓｏｌｉｓ Ｈｅｒｒｕｚｏ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｒｅｖ Ｅｓｐ Ｅｎｆｅｒｍ Ｄｉｇ ９８：８４４−８７４）。

このような状態下で核因子κΒ（ＮＦ−κΒ）は活性化され、これによって炎症メディエーター、例えば、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＩＬ−８）の合成が刺激される（Ａｎｇｕｌｏ，２００２ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４６：１２２１−１２３１）。

これに加えて、脂質過酸化の最終アルデヒド副産物、例えば、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、および４−ヒドロキシノネナールは化学走性を示し、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＩＬ−６、ＩＬ−８）を活性化し、肝臓でコラーゲンを産生する星状細胞を刺激する（Ｐｅｓｓａｙｒｅ，２００７ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ ２２（Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ２０−Ｓ２７）。ＮＡＦＬＤを有する患者は、肝臓におけるＴＮＦ−αの発現が増加した（Ｃｒｅｓｐｏ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３４（６）：１１５８−１１６３）。最終結果である混合病変は、脂肪性肝炎として公知であり、これは肝臓組織の脂肪症、炎症性浸潤および線維性変性、ならびに最終的に肝細胞の壊死によって特徴付けられる。進行中の酸化ストレスおよび脂質過酸化は、連続的なコラーゲン産生を誘発し、これは線維症をもたらし、肝硬変の段階に達する（Ｃｈｉｔｔｕｒｉ ａｎｄ Ｆａｒｒｅｌｌ，２００１ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３６：４０３−４０９）。

肝臓特異的クッパー細胞は、脂肪肝疾患、例えば、ＮＡＳＨの病変形成において重要な役割を果たしているようである。クッパー細胞は、内毒素および門脈からの有害な外来性粒子に対する有意な保護を提供する、肝臓に常在するマクロファージである。ＮＡＳＨの病変形成は、クッパー細胞の損なわれた貪食機能の結果として（Ｌｏｆｆｒｅｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９８ ＦＡＳＥＢ Ｊ．１２：５７−６５）、高エンドトキシン血症を包含し得る（Ｃｒｅｅｌｙ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．２９２：Ｅ７４０−Ｅ７４７）。細菌の代謝物、内毒素、リポ多糖などのクリアランスの障害は、肝疾患の病変形成を加速し得る。クッパー細胞の活性化はさらなるストレス刺激をもたらし、生存からアポトーシスへの肝細胞の運命を決定し得る。クッパー細胞において、サイトカイン、例えば、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの過剰産生が起こる。同時に、クッパー細胞は、これらの分子に対してより感受性となる（Ｄｉｅｈｌ，２００２ Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８２：Ｇ１−Ｇ５）。活性化されたクッパー細胞によって産生された炎症メディエーターは、肝星細胞がコラーゲンを合成することを誘発し、これによって肝線維症および肝硬変がもたらされ得る。単純な脂肪肝の場合に見られるびまん性分布と比較して、肥大性クッパー細胞の凝集体は、ＮＡＳＨ患者の肝臓の細静脈周囲領域において観察することができる（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．２２：４９１−４９７）。

例えば、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨと関連する肝臓における炎症性事象に関して、ビタミンＥの効果が様々なヒト臨床研究において調査されてきた（Ｐａｃａｎａ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ Ｍｅｔａｂ Ｃａｒｅ ２０１２；１５：６４１−６４８）。ビタミンＥの摂取により、血漿サイトカインレベルの減少と共に肝酵素を改善させることができた。８００ＩＵ／日の１日用量で、生検診断によるＮＡＳＨを有する糖尿病でない成人における肝臓の組織構造を改善させることができた。しかし、ビタミンＥの使用は、ＮＡＳＨ、肝生検を伴わないＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ肝硬変または特発性肝硬変の処置として糖尿病患者において推奨されていない（Ｃｈａｌａｓａｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．５５，ｎｏ．６，２０１２）。

したがって、肝保護効果を有するが、弱い副作用を伴うか、または副作用を伴わない新規な薬剤が必要とされている。これらの薬剤は、アルコールの乱用に起因しない脂肪肝疾患の予防、制御および／または処置のために使用することができる。

本発明によると、特定の化合物は、ＮＡＦＬＤまたは肝臓の関連する機能不全に関与している炎症メディエーターの生合成／過剰産生をモジュレートし得ることが見出されてきており、前記メディエーターは、例えば、エイコサノイド（プロスタグランジン、ロイコトリエン）、サイトカイン、ケモカイン、核因子および／または一酸化窒素を含む。

驚くべきことに、ビタミンＥおよびＰＵＦＡの組合せは、肝保護効果を示し、およびいくつかの炎症誘発性メディエーター、例えば、サイトカインの生合成／過剰産生を相乗的にモジュレートし得ることが見出されてきた。したがって、このような化合物は、肝臓における脂肪の過剰な蓄積と関連する状態の予防、制御および／または処置、好ましくは、ＮＡＦＬＤの予防、制御および／または処置に有用である。

このように、本発明は、肝臓における肝臓炎症および細胞傷害の処置、制御および／または予防、より好ましくは、ＮＡＦＬＤおよび関連する疾患の予防、制御および／または処置のためのビタミンＥおよびＰＵＦＡを含む混合物の使用に関する。このように、一態様では、本発明は、肝細胞における炎症反応のモジュレーションを必要とする状態の予防、制御および／または処置、特に、ＮＡＦＬＤの処置および予防のための、医薬の製造におけるビタミンＥおよびＰＵＦＡの使用に関する。

ビタミンＥおよびＰＵＦＡを含む本発明による混合物は、栄養補助組成物として、すなわち、食事性組成物へのサプリメント、すなわち、（栄養強化）食物／食料もしくは飲料として、またはこれらに限定されないが、滑沢剤、着色剤、湿潤剤、充填剤、崩壊剤および香味剤を含めた薬学的に許容される担体、添加剤もしくは賦形剤をさらに含み得る、投与量単位形態の組成物、例えば、医薬組成物、例えば、錠剤、顆粒剤、ペーストもしくは発泡性製剤として使用し得る。ペーストは、硬質または軟質ゼラチンカプセル剤中に充填し得る。

本明細書において使用する場合、「ビタミンＥ」という用語は、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロールおよびδ−トコフェロールを含めた、トコフェロールの天然および合成の両方の混合物を含む。室温において液体であるトコフェロールは、一般式（Ｉ）

のメチル化フェノール化合物の群であり、式中、Ｒ１、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立に、水素またはメチル基であり、各^＊は、個々のキラル中心を表す。トコフェロールアイソフォームに関して、Ｒ１、Ｒ３およびＲ４は下記の通りである。α−トコフェロール（Ｒ１＝Ｒ３＝Ｒ４＝ＣＨ３）；β−トコフェロール（Ｒ１＝Ｒ４＝ＣＨ３、Ｒ３＝Ｈ）；γ−トコフェロール（Ｒ１＝Ｈ、Ｒ３＝Ｒ４＝ＣＨ３）；δ−トコフェロール（Ｒ１＝Ｒ３＝Ｈ、Ｒ４＝ＣＨ３）。

式（Ｉ）における置換基Ｒ１およびＲ３の少なくとも１つは、ＣＨ３であることが好ましく、より好ましいのは、α−トコフェロールおよび／またはγ−トコフェロールの使用である。

式（Ｉ）のトコフェロールは、式中のアスタリスク（^＊）によって示されるキラル炭素中心を有する。これらのキラル中心における配置は、当業者に公知の概念であるＲまたはＳのいずれかであると定義される。

残基Ｒ１、Ｒ３およびＲ４の所与の定義について、式（Ｉ）によるそれぞれのトコフェロールは、これらのキラル中心によって８つの異なる異性体で存在する（すなわち、（２Ｒ，４’Ｒ，８’Ｒ）−、（２Ｒ，４’Ｓ，８’Ｒ）−、（２Ｒ，４’Ｒ，８’Ｓ）−、（２Ｒ，４’Ｓ，８’Ｓ）−、（２Ｓ，４’Ｒ，８’Ｒ）−、（２Ｓ，４’Ｓ，８’Ｒ）−、（２Ｒ，４’Ｒ，８’Ｓ）−および（２Ｓ，４’Ｓ，８’Ｓ）−トコフェロール）。本明細書において使用する場合、トコフェロールは、前記キラル異性体の混合物または異性体的に純粋な形態で存在する。（２ＲＳ、４’ＲＳ、８’ＲＳ）トコフェロールはまた、（ａｌｌ−ｒａｃ）−トコフェロールとして公知である。

ビタミンＥの特に有用な形態は、ＰＵＦＡとの混合物中で使用されるα−トコフェロールである。

ＰＵＦＡは、ｎ−９、ｎ−６またはｎ−３ＰＵＦＡとして、分子の炭素鎖における二重結合の位置によって分類される。ｎ−６ＰＵＦＡの例は、リノール酸（Ｃ１８：２）、アラキドン酸（Ｃ２０：４）、γ−リノレン酸（ＧＬＡ、Ｃ１８：１３）およびジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ、Ｃ２０：３）である。ｎ−３ＰＵＦＡの例は、α−リノレン酸（Ｃ１８：１３）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、Ｃ２０：５）、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、Ｃ２２：６）である。特に、ＥＰＡおよびＤＨＡは、近年に至って食品産業の興味を引いてきた。これらの２つの脂肪酸の最も利用可能な源は、それらまたは微細藻類から抽出した魚油およびマリーン油である。

本明細書において使用する場合、１つまたは複数の「ＰＵＦＡ」という用語は、骨格中に１６個以上の炭素原子（例えば、１６個、１８個、２０個または２２個の炭素原子（それぞれＣ１６、Ｃ１８、Ｃ２０、またはＣ２２）、および２個以上の炭素−炭素二重結合を含む骨格を有する脂肪酸を指す。本明細書において使用する場合、「長鎖ＰＵＦＡ」（ＬＣ−ＰＵＦＡ）は、骨格中に１８個以上の炭素原子、および２個以上の炭素−炭素二重結合を含む骨格を有する脂肪酸、例えば、Ｃ１８：３ｎ−３（アルファ−リノレン酸またはＡＬＡ）を指す。メチレン中断型ＰＵＦＡについて表示法ＣＡ：Ｂｎ−Ｘが使用されるとき、「ＣＡ」は、炭素の数であり（例えば、Ｃ１８、Ｃ２０またはＣ２２）、Ｂは、二重結合の数であり、Ｘは、脂肪酸鎖のメチル末端から数えた最初の二重結合の位置である。

本明細書において使用する場合、ＰＵＦＡは、その遊離酸の形態、ならびにその塩およびエステルを包含する。本明細書において使用する場合、エステルという用語は、ＰＵＦＡ分子のカルボン酸基中の水素を別の置換基で置き換えることを指す。一般のエステルの例は、メチル、エチル、トリクロロエチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ｔｅｒｔブチル、ベンジル、ニトロベンジル、メトキシベンジルおよびベンズヒドリルを含む。ＰＵＦＡの他のエステルは、参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０−０１３０６０８Ａ１号明細書に記載されている。

本発明によって使用するためのＰＵＦＡは、オメガ−３、オメガ−６、およびオメガ９多価不飽和脂肪酸、ならびにこれらに由来するオキシリピンを含む。本発明により使用するための例示的なオメガ−３ＰＵＦＡには、これらに限定されないが、α−リノレン酸（Ｃ１８：３ｎ−３）、Ｃ１８：４ｎ−４、ω−３エイコサペンタエン酸（２０：５ｎ−３）（エイコサペンタエン酸）、ω−３ドコサペンタエン酸（ドコサペンタエン酸）、ω−３ドコサヘキサエン酸（２２：６ｎ−３）、ドコサテトラエン酸（２２：４ｎ−６）、およびこれらの組合せが含まれる。本発明によって使用するための例示的なオメガ−６ＰＵＦＡには、これらに限定されないが、γリノレン酸、リノール酸、共役リノール酸、アラキドン酸（２０：４ｎ−６）、ω−６ドコサペンタエン酸、およびこれらの組合せが含まれる。一部の実施形態では、本発明によって使用するためのＰＵＦＡ油は、ａｌｌ−ｃｉｓである。

一部の実施形態では、ＰＵＦＡは、その化学名（ａｌｌ−Ｚ）−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸によっても公知のＤＨＡ、および任意のその塩または誘導体を含む。このように、ＤＨＡという用語は、ＤＨＡエチルエステル（ＤＨＡ−ＥＥ）、およびＤＨＡ遊離脂肪酸、ＤＨＡを含有するリン脂質、他のエステル、モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリドを包含する。ＤＨＡは、ω−３ＰＵＦＡである。

さらなる実施形態では、ＰＵＦＡは、その化学名（ａｌｌ−Ｚ）−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸によって公知のＥＰＡ、および任意のその塩または誘導体を含む。このように、ＥＰＡという用語は、遊離酸ＥＰＡ、およびＥＰＡアルキルエステル、およびＥＰＡを含有するトリグリセリドを包含する。ＥＰＡは、ω−３ＰＵＦＡである。

一部の実施形態では、熱的に安定的なエマルジョンを作製するために使用されるＰＵＦＡ油は、１種または複数の特定の脂肪酸を実質的に含有しない。例えば、ＤＨＡ−ＥＥを含有するＰＵＦＡ油は、実質的にＥＰＡを含有しなくてもよい。他方、ＥＰＡ−ＥＥを含有するＰＵＦＡ油は、実質的にＤＨＡを含有しなくてもよい。

本発明によって使用するのに適した市販のＰＵＦＡには、これらに限定されないが、Ｍａｒｔｅｋ ＤＨＡ（商標）Ｓ油（Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．、コロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）、Ｍｄ．）、Ｒｏｓｅｍａｒｙ−Ｆｒｅｅ Ｍａｒｔｅｋ ＤＨＡ（商標）Ｓ油（Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．、コロンビア、Ｍｄ．）、Ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ ＤＨＡ（商標）油（Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．、コロンビア、Ｍｄ．）、ＯＭＥＧＡＰＵＲＥ（登録商標）油（Ｏｍｅｇａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｒｐ．、ヒューストン（Ｈｏｕｓｔｏｎ）、Ｔｅｘ．）、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標）油（Ｌｉｐｉｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、ウォルメルフェール（Ｗｏｒｍｅｒｖｅｅｒ）、ＮＬ）、ＭＥＧ−３油および粉末（Ｏｃｅａｎ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｃｏｒｐ．、ダートマス（Ｄａｒｔｍｏｕｔｈ）、ＣＡ）、Ｅｖｏｇｅｌ（Ｓｙｍｒｉｓｅ ＡＧ、ホルツミンデン（Ｈｏｌｚｍｉｎｄｅｎ）、ＤＥ）、マリーン油（Ａｒｉｓｔａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ウィルトン（Ｗｉｌｔｏｎ）、Ｃｏｎｎ．）、およびＯＭＥＧＡＳＯＵＲＣＥ（登録商標）油（Ｓｏｕｒｃｅ Ｆｏｏｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．、ローリー（Ｒａｌｅｉｇｈ）、Ｎ．Ｃ．）が含まれる。

ＰＵＦＡの特に有用な形態は、すなわち、アルコールの乱用に起因しない肝臓における過剰な脂肪蓄積と関連する状態の処置、制御および／または予防のための、本発明によるビタミンＥ、特に、α−コフェロールとの混合物中で使用されるω−３ＰＵＦＡである。

ＰＵＦＡは、好ましくは、ヒト成人（約７０ｋｇの重量）による１日の消費量が１０ｍｇ／日〜４０００ｍｇ／日、好ましくは、２００ｍｇ／日〜６００ｍｇ／日の範囲、より好ましくは、約４００ｍｇ／日であるような濃度で使用される。食物または飲料は、一人前の分量当たり約５ｍｇ〜約１０００ｍｇのＰＵＦＡを適切に含有する。栄養補助組成物が医薬製剤である場合、このような製剤は、投与量単位、例えば、カプセル剤もしくは錠剤１つ当たり約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇ、または液体製剤の１日用量当たり約１０ｍｇ〜１日用量当たり約４０００ｍｇの量でＰＵＦＡを含有し得る。

ビタミンＥまたはその誘導体は、好ましくは、ヒト成人（約７０ｋｇの重量）による１日の消費量が５ｍｇ／日〜２０００ｍｇ／日の範囲、好ましくは、１５〜５０ＩＵ／日、より好ましくは、３０ＩＵ／日であるような濃度で使用される。食物または飲料は、一人前の分量当たり約２ｍｇ〜約５００ｍｇのビタミンＥを適切に含有する。栄養補助組成物が医薬製剤である場合、このような製剤は、投与量単位、例えば、カプセル剤もしくは錠剤１つ当たり約５ｍｇ〜約１０００ｍｇ、または液体製剤１日用量当たり約５ｍｇ〜１日用量当たり約２０００ｍｇの量でビタミンＥを含有し得る。

「対象」という用語は、本明細書において使用する場合、炎症性事象が知られている全ての高等動物を含む。特に、対象は、動物またはヒトを含めた哺乳動物である。

本明細書において使用する場合、ＮＡＦＤＬまたはＮＡＳＨと関連する「脂肪肝」または「過剰な脂肪蓄積」は、肝臓が約５超〜約１０重量％の脂肪を含有することを意味する。

上述のように、本発明による化合物は、肝保護的特性を有し、ＮＡＦＬＤまたは肝臓の関連する機能不全に関与する状態の予防、制御および／または処置のために有用である。これらはまた、肝細胞における炎症メディエーターの生合成／過剰産生のモジュレーションを介した、肝臓における過剰な非アルコール性脂肪蓄積に起因する種々の疾患または障害の処置への補助として使用することができる。

特定の実施形態では、本発明の化合物は、アルコールの乱用に起因しない肝臓における過剰な脂肪蓄積と関連する状態の予防、制御および／または処置、好ましくは、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨの予防、制御および／または処置のために使用される。

このように、本発明は、特に、アルコールの消費／乱用に起因しない肝臓における脂肪の蓄積と関連する炎症反応のモジュレーションを必要とする状態、特に、上記のこれらの状態の予防、制御および／または処置のための、上記に定義されているようなビタミンＥおよびＰＵＦＡの組合せ（医薬／組成物の製造における）の使用を対象とする。

さらなる実施形態では、本発明の化合物／混合物は、本明細書に開示されているような化合物の投与前、それと同時、またはその後の投与による、肝臓における炎症性障害の処置、制御および／または予防のための当業者に公知の他の栄養補助組成物または治療剤と組み合わせて使用し得る。

投与のモードにより、本発明による化合物／混合物は、ビタミンＥおよびＰＵＦＡから実質的になり（すなわち、主要な活性成分である）、当業者に公知の水、グリセロールなどを含めた結合剤、充填剤、担体、添加剤の添加をさらに伴う。

本発明によれば、投与されるビタミンＥおよび多価不飽和脂肪酸の比は、重量比として計算して、約１：１〜約１：５の範囲、例えば、１：２、または約４：１、または約５：１〜約２０：１の範囲であり得る。特に、ビタミンＥは、α−トコフェロールとして計算される。有用な比は、一実施形態では、０．２：１、０．４：１、０．６：１、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、８：１、１０：１、１２：１、１４：１、１６：１、１８：１、２０：１、２５：１または３０：１の重量比として計算される多価不飽和脂肪酸およびビタミンＥであり得、ビタミンＥはα−トコフェロールとして計算される。

化合物またはこれらの組合せの抗炎症特性を決定するために、適当な細胞または細胞系（すなわち、全血、マクロファージ、白血球）を、化合物の存在下でｉｎ ｖｉｔｒｏで炎症刺激によって活性化させる。これは、炎症誘発性プロスタグランジンＥ_２（すなわち、シクロオキシゲナーゼ−２の産物）、一酸化窒素（誘導性一酸化窒素シンターゼによって合成される）ならびに様々なサイトカインおよびインターロイキンの分泌をもたらす。これらの抗炎症効果により、化合物は２つの代謝物のレベルを低減させる。同様に、炎症性経路の遺伝子の発現は、定量的ＰＣＲによってまたはマイクロアレイ分析によってモニターする。抗炎症性化合物は、これらの発現レベルを低減させる。化合物の相加効果および／または相乗効果は、特定の炎症パラメーターのレベルにおいて、およびより一般に細胞性炎症反応と関連する遺伝子発現プロファイルにおいての両方で同定される。

ビタミンＥおよびＰＵＦＡによる併用療法の抗炎症効果は、炎症反応を反映するサイトカインの合成の阻害を決定することにより、クッパー細胞を含めた刺激されたマクロファージにおいて示すことができる。

ＮＡＦＬＤと関連するｉｎ ｖｉｔｒｏでの「炎症反応」を誘発するために、クッパー細胞、すなわち肝臓に常在するマクロファージは、試験物質、例えば、本発明によるビタミンＥおよびＰＵＦＡの混合物の肝保護効果を研究する理想的な細胞型である。代わりに、マウスのマクロファージＲＡＷ２６４．７、またはさらに末梢血細胞中に存在する単球／マクロファージは、適当な代用モデルとして使用することができる（Ｒａｐｔｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６０，６２５−６３２，２０１４）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの実験のために、細胞をマイクロタイタープレートまたは１２ウェルプレート中に播種し、段階的な量の試験物質を伴うもしくは伴わないリポ多糖（ＬＰＳ）で刺激し得る。ビヒクル濃度（すなわち、ＤＭＳＯ）は一定に保たれる。培養上清は、適当な期間（例えば、２４時間）後に収集し得る。サイトカインおよびインターロイキンは、適当なＥＬＩＳＡをベースとするマルチプレックスアッセイによって測定することができる。所与の濃度の試験物質における、肝臓特異的細胞中に存在する記述した炎症メディエーターの阻害の百分率（ＬＰＳによって刺激された細胞による最大産生と比較した）を計算し、試験物質の推定上の相乗効果をコンピュータ処理する（下記を参照されたい）。

下記の実施例は単に例示的なものであり、本発明の範囲を限定することを決して意図するものではない。本出願を通して引用した全ての参照文献、特許出願、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

［実施例］
［実施例１：白血球におけるビタミンＥおよびＰＵＦＡの相乗効果］
［実験手順：］
白血球は、健康なドナーから得る。単核細胞（ＭＮＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｉｓｏｐａｑｕｅ勾配遠心分離によって精製する。細胞（３〜８×１０６個の細胞／ｍＬ）を、０．２５％ＦＢＳ、０．１ｍＭのＮＥＡＡ、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノールを補充したフェノールレッド非含有ＲＰＭＩ１６４０中で培養する。細胞をＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＩＦＮ−γ（２０Ｕ／ｍＬ）で２〜２４時間刺激する。サイトカインおよびケモカインの決定のためのマルチパラメトリックキットは、ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）、ＣＡ）から購入し、ＬｉｑｕｉＣｈｉｐワークステーションＩＳ２００（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））において使用する。データは、ＬｉｑｕｉＣｈｉｐ Ａｎａｌｙｓｅｒソフトウェア（Ｑｉａｇｅｎ）で評価する。

ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙによって開発されたアルゴリズムを使用して相乗効果を計算する（Ｃｈｏｕ，Ｔ−Ｃ．＆Ｔａｌａｌａｙ，Ｐ．Ａ ｓｉｍｐｌｅ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，６４３８−６４４２，１９７７；Ｃｈｏｕ，Ｔ−Ｃ．＆Ｔａｌａｌａｙ，Ｐ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｄｒｕｇ ｅｆｆｅｃｔｓ−Ａ ｎｅｗ ｌｏｏｋ ａｔ ａ ｖｅｒｙ ｏｌｄ ｐｒｏｂｌｅｍ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９８３，ｐ４５０−４５４，１９８３）。

相互作用は、組合せインデックス（ＣＩ）によって定量化する。手短に言えば、それぞれの単一の物質単独または両方の混合物の濃度の阻害の％を決定する。影響を受けた画分（ｆａ）（０〜１の値）および影響を受けない画分（ｆｕ）（１−ｆａ）をそれぞれ計算する。半数影響プロットについて、ｌｏｇ（ｆａ／ｆｕ）をｌｏｇ（Ｄ）に対してプロットし、式中、Ｄは、それぞれの単一の化合物単独または両方の混合物の濃度を表す。ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙによる方法をベースとするＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェア（Ｂｉｏｓｏｆｔ、ファーガソン（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ）、ＭＯ）を使用して、影響を受けた全ての画分についてＣＩをコンピュータ処理する。ＣＩ＜１は、それぞれの炎症パラメーターの相乗的阻害を反映する。ＣＩ＝１である場合、物質は、相加的相互作用を有する。ＣＩ＞１であるとき、物質の相互作用は拮抗を反映する。物質は、それぞれ所与の濃度または比で相乗的または拮抗的相互作用を有し得ることも観察されてきた（例えば、Ｐａｐｐａ ｅｔ ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｕｌｆｏｒａｐｈａｎｅ ａｎｄ ３，３’−ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｊ．ｄｉｉｎｄｏｌｙｌｍｅｔｈａｎｅ ｏｎ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２８，１４７１−７７，２００７を参照されたい）。

［結果：］
細胞は炎症反応を誘発する病原体に由来する構成要素であるＬＰＳによって刺激され、これは、炎症性遺伝子の発現、ならびにサイトカイン、インターロイキンおよびケモカインの分泌において反映される（表１）。ＬＰＳは、炎症メディエーター、例えば、ＴＮＦ−アルファの分泌の大きい増加を誘発する。随伴して、炎症メディエーターが分泌される。これらのパラメーターは、ＬＰＳによる刺激前に、細胞をα−トコフェロールまたはω−３ＰＵＦＡと共にプレインキュベートすることによってモジュレートされる。例えば、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−γは、それぞれ２９％および６４％低減する（表１ａ）。ＩＬ−１ベータおよびＣＣＬ４／ＭＩＰ−１ｂはまた、２つの物質によって有意に低減する（表１ｂ、１ｃ）。このように、これらの物質は、炎症刺激に応答する細胞における炎症ストレスの程度を低減させる。

α−トコフェロールおよびω−３ＰＵＦＡを異なる濃度および比で合わせたとき、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−アルファだけでなく、また炎症誘発性インターロイキンであるＩＬ−１ベータ、およびケモカインＣＣＬ４の産生の阻害において有意な相乗効果が観察される（表１ａ〜ｃ、右の欄を参照されたい）。相乗効果は、ＴＮＦ−アルファについて最も顕著である。

［実施例２：軟質ゼラチンカプセル剤］
軟質ゼラチンカプセル剤は、通常の手順によって調製し、５〜１０００ｍｇ、例えば、５０ｍｇのビタミンＥ（例えば、α−トコフェロール）、および１０〜１０００ｍｇ、例えば、２００ｍｇの上記に定義されているようなＰＵＦＡの群から選択される少なくとも１種の化合物（例えば、ＤＨＡ）の用量を提供し、量は、推奨される１日用量である。加える他の成分：グリセロール、水、ゼラチン、植物性油。

［実施例３：硬質ゼラチンカプセル剤］
硬質ゼラチンカプセル剤は、通常の手順によって調製し、５〜１０００ｍｇのビタミンＥ（例えば、α−トコフェロール）および１０〜１０００ｍｇの上記に定義されているようなＰＵＦＡの群から選択される少なくとも１種の化合物（例えば、ＤＨＡ）の用量を提供し、量は、推奨される１日用量である。加える他の成分：充填剤、例えば、ラクトースまたはセルロースまたはセルロース誘導体、適量；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、必要に応じて（０．５％）。

［実施例４：錠剤］
錠剤は、通常の手順によって調製し、活性成分として、錠剤毎に５〜１０００ｍｇ、例えば、２０ｍｇのビタミンＥ（例えば、α−トコフェロール）、および１０〜１０００ｍｇの上記に定義されているようなＰＵＦＡの群から選択される少なくとも１種の化合物（例えば、ＤＨＡ）、ならびに添加剤として、５００ｍｇの微結晶性セルロース、二酸化シリコーン（ＳｉＯ２）、ステアリン酸マグネシウム、クロスポビドンＮＦ（崩壊剤である）を提供する。

［実施例５：清涼飲料］
ベータカロテン１０％ＣＷＳで着色し、ビタミンＥ（例えば、α−トコフェロール）および上記に定義されているようなＰＵＦＡの群から選択される少なくとも１種の化合物（例えば、ＤＨＡ）を有するオレンジジュース飲料は、表２および３によって調製し得る。

最初に、安息香酸ナトリウムを、撹拌しながら水に溶解する。撹拌を続け、糖シロップ、アスコルビン酸、クエン酸、ペクチン溶液およびジュース化合物を次々と加える。高速ミキサーは使用しない。ビン詰めシロップを、１リットルの飲料まで（炭酸）水で希釈する。

ジュース化合物の調製のために、脱イオン水を、穏やかに撹拌しながら最初にジュース濃縮物に加え、ジュース濃縮物を水和させる。次いで、油性フレーバーおよびベータカロテン１０％ＣＷＳストック溶液を加え、ローターステーターホモジナイザー中で事前乳化する。均質化を高圧ホモジナイザーにおいて２００バールで行う。

清涼飲料の典型的な一人前の分量は２４０ｍｌでよく、約５〜１００ｍｇ／一人前の分量であるビタミンＥ（例えば、α−トコフェロール）の量、および約５〜５００ｍｇ／一人前の分量であるＰＵＦＡ（例えば、ＤＨＡ）の量を伴う。

［実施例６：クッパー細胞におけるビタミンＥおよびＰＵＦＡの相乗効果］
本研究は、マウスまたはヒトの肝臓から単離したマクロファージに拡大させる。接着細胞（すなわち、クッパー細胞）は、肝臓組織から得る。単離および培養は、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｏｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ １５８，５２−５６，２０１４に記載されている方法によって、または当技術分野において公知の任意の方法によって行う。これらの細胞を、上記のような化合物で処理する（実施例１を参照されたい）。これらの細胞を炎症性刺激で活性化させ、炎症反応の低減に対する物質およびこれらの組合せの効果を決定する。この設定で、血液細胞由来のマクロファージについて記載したものと同一の効果（実施例１を参照されたい）を得る。

Claims (5)

1. ビタミンＥおよびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の組合せであって、それを必要とする対象での肝臓における非アルコール性脂肪蓄積の予防、制御または処置のための組合せであって、ビタミンＥおよびドコサヘキサエン酸の比は、１：１で投与され、前記ビタミンＥはα−トコフェロールとして計算され、および前記比は重量比として計算される、組合せ。
2. 前記ビタミンＥは、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、δ−トコフェロールおよびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の組合せ。
3. ビタミンＥの量は１日当たり５〜２０００ｍｇであり、およびドコサヘキサエン酸の量は１日当たり１０ｍｇ〜４０００ｍｇである、請求項１または２に記載の組合せ。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の組合せから実質的になる、非アルコール性脂肪性肝疾患または非アルコール性脂肪性肝炎の予防、制御または処置のための組成物。
5. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の組合せによるドコサヘキサエン酸およびビタミンＥの有効量を、それを必要とする前記対象に投与することを含む、肝臓における非アルコール性脂肪蓄積と関連する疾患を処置または予防する方法（但し、ヒトの治療方法を除く）。