JP4757911B2

JP4757911B2 - マグノリアの皮質又はマグノリアの根からのマグノロールの大量分離方法

Info

Publication number: JP4757911B2
Application number: JP2008514537A
Authority: JP
Inventors: スークキム，ジン; ミリー，ユン; シクジャン，ダエ
Original assignee: コリアインスティテュートオブオリエンタルメディシン
Priority date: 2005-05-30
Filing date: 2005-06-21
Publication date: 2011-08-24
Anticipated expiration: 2025-06-21
Also published as: WO2006129898A1; US7608741B2; JP2008542361A; US20080188693A1

Description

本発明は、マグノリアの皮質又はマグノリアの根から少ない費用と簡単な分離工程段階により、マグノロールを大量に分離することを可能にする、マグノリアの皮質又はマグノリアの根からのマグノロールの大量分離方法に関する。

マグノリアの皮質(Magnoliae cortex)とマグノリアの根(Magnoliae radix)は、落葉喬木科であるモクレン科(Magnoliaceae)に属する多年生草本であるコウボク(Magnolia officinalis REHD. Et WILS)及び同属近縁種の樹皮と根を乾燥したもので、漢方的に燥濕消痰、下気除満の効能を有し、濕滯傷中、緩脾吐瀉、食積気滯、腹脹便秘、痰飮喘咳を治療すると知られている（国家薬典委員会、中華民国共和国薬典、I部、204, 化学工業出版社、北京）。

マグノリアの皮質の成分としては、 a、b、g-ユーデスモール（a、b、g−eudesmol）などの精油、マグノロール(magnolol)、ホノキオール(honokiol)、テトラハイドロマグノロール(tetrahydromagnolol)、マグノクラリン(magnocurar in)、オボバトール(obovatol)、オボバタルデハイド(obovataldehyde)、アルカロイド、サポニンなどが含有されている。マグノリアの皮質の指標物質はマグノロールに決定された。 (大韓薬典第7改定、782ページ、保健福祉部、大韓保健公定書協会)

マグノリアの皮質の薬理効果に関する研究を見ると、マグノリアの皮質の水抽出物が即時型過敏反応に対し、抗アレルギー効能があることが試験管実験及び動物実験で証明されたことがあり（Shin, T. Y., et al., 200l, Arch. Pharm., Res., 24: 249-255）、細胞死滅効果（Park, H. J., et a1., 2001, Arch. Pharm., Res., 24: 342-348）、ＮＯ合成抑制効果、ＴＮＦ−α発現抑制効果（Son, H. J., et al., 2000, Planata med., 66:467-47l ）、抗真菌効果（Bang, K. H., et al., 2000, Arch. Pharm, Res., 23: 46-49）、精神安定効果（Kuribara, H., et a1, l999, J. Pharm. Pharmacol., 51: 97-103）、及び皮膚癌抑制効果（Komoshima, T. et al., 1991, J. Nat. Prod., 54: 816-822）などの多様な効能があることが報告されている。

マグノロールは、強力な抗酸化効能が立証されており(Li, C.et al.,2003,Biorganic & Medicinal Chemistry, 11(17):3665-3671;Ogata, M., et al., 1997, J.of the American oil Chemist'Society, 74(5), 557-562)、D-ガラクトサミン(D-galactosamine)により傷害された肝細胞(hepatocyte)に予防効能(Park, E.et al., 2003, Planta Medica, 69(1):33-37)、抗凝固効能(Pyo, M.et al., Archieves of Pharmacal. Research, 2002, 25(3), 325-328)、抗真菌(antifungal)効果(Bang, K. et al., 2000, Archieves of Pharmacol. Research, 23(1), 46-49)、抗不安改善効能(Maruyama, Y, et al., 1998, /. Nat. Prod.,6l(l): 135-138)、アセチルコエー(Acetyl-CoA)阻害効能(Kwon, B., et al., 1997, Planta Medica, 63(6), 550-551)、及びコレステロール吸収阻害効能(Zhao, C, et al., 1994, Huazhong Nongye Daxue Xuebao, 13(4), 373-377)があると報告されている。これ以外にも本研究チームにより、糖尿病性合併症治療効能があると報告されている(大韓民国特許出願第10-2003-39241号)

従来の一般的なマグノロール分離方法は下記のようである。マグノリアの皮質をメタノールで室温において、24時間冷浸し抽出し、抽出液をろ過し、余液を減圧下で濃縮し、暗褐色のメタノールエキスを得る。メタノールエキスは、ベンゼンと水で溶媒分画し、ベンゼン分画物を得る。ベンゼン分画物をシリカゲルカラムにかけて、ベンゼン-エチルアセテート(1：0〜5：1)で溶出し、分画1、2、3を得る。上記分画3をシリカゲルカラムにかけて、ベンゼン-エチルアセテート(20：1)溶出し、マグノロールが多く含有された分画物得る。これをまた、シリカゲルカラムにかけて、ベンゼン-エチルアセテート(20：1)で精製して、粗結晶体を得る。それから、上記粗結晶体をエチルアセテートで再結晶させ、純粋なマグノロールを得る。(生薬、漢薬剤品質標準化研究、1996年、保健福祉部、p.201-202)

しかし、上記方法は、系統分離をした後、シリカゲルカラムクロマトグラフィを最小限３回程度実施して、粗結晶体のマグノロールを得て、これをまた、再結晶をしなければならないので、いろいろな段階を経なければならない問題点があった。

また、上記方法以外にも、超臨界流体二酸化炭素抽出法（Supercritical Fluid CO_２ extraction；SFE）(Zhang, Z. et al., Zhongguo yiyuan Yapxue Zazhi, 21(7), 401-402, 2001)、毛細管電気泳動（capillary electrophoresis；CE）（Zhang, H., et al., 1997, Analytical Letters, 30(13), 2327-2339）などが報告されている。しかし、このような方法には、高価な装備が必須的であり、少量分離にのみ適合した方法である。

上記のように分離されるマグノロールは、標準試薬販売会社である日本和光（WAKO）社で20ｍgに8万8千ウォンする大変高価な物質(WAKO no.137-09081； Catalog 2004年度版, pp. 1196)であるため、利用するには非経済的である。

このように、マグノロールは、いろいろな方面に優れた効能を持っているが、高価で、分離方法が複雑であり、分離する工程に高価な装備が必要とされるため、今まで、マグノロールの大量分離方法についての報告はなされてない。従って、経済的で、簡単な分離方法により、マグノロールを大量分離する方法についての必要性が要求されている。

よって、本発明者らは、高価な装備を使用せずに、分離工程段階を最小化し、時間と経費を大幅に減少させれるように、マグノロールを分離する方法について研究し、マグノリアの皮質又はマグノリアの根からマグノロールを大量に分離できることを確認し、本発明を完成した。

本発明の目的は、分離工程段階を大幅短縮し、時間と費用を節減できるようにするマグノリアの皮質又はマグノリアの根からのマグノロールの大量分離方法を提供することにある。

本発明は、マグノリアの皮質又はマグノリアの根からのマグノロールの大量分離方法を提供する。
以下、本発明について、詳細に説明する。
図１に図示したように、本発明のマグノリアの皮質又はマグノリアの根からのマグノロールの大量分離方法は、1）マグノリアの皮質又はマグノリアの皮質根を粉砕し、有機溶媒で抽出して抽出物を得た後、n-へキサン（ノルマルヘキサン）を加えてn-へキサン層を得る段階；2）上記n-へキサン層をウォーターバス30〜40℃、回転速度40〜200RPMで減圧下で濃縮し、粗結晶体を形成する段階；及び3）上記粗結晶体からn-へキサン除去した後、クロロホルムで上記粗結晶体を完全に溶かした後、n-へキサンを添加し、常温で再結晶が起こるようにする再結晶する段階からなる。

本発明による、マグノリアの皮質又はマグノリアの根からのマグノロールの大量分離方法は、一般的な分離過程では必須的に実施されるカラムクロマトグラフィ過程を省略することにより、分離工程段階が段縮され時間が節約でき、また、カラムクロマトグラフィ、超臨界抽出機、HPLCなどの高価な装備が必要でないため、費用が少なく掛かり経済的であるので、高価であるマグノロールを大量に分離するのに効率的である。また、分離工程中、再結晶する段階を繰り返すことにより、より純度の高いマグノロールを分離できる効果がある。

本発明のマグノリアの皮質又は、マグノリアの根からのマグノロールの大量分離方法を詳細に説明する。

（１）マグノリアの皮質又は、マグノリアの根を粉砕機でひいて抽出袋に入れ、80％エタノールを入れ冷蔵状態（4℃）で、24時間程度抽出する。このような過程を5回繰り返し実施する。

本発明では、マグノリアの皮質又は、マグノリアの根を抽出するため、使用する溶媒として抽出効率を考慮し、水溶性アルコール中、エタノールを使用するのが好ましいが、マグノリアの皮質又は、マグノリアの根の抽出物を得られるのであれば、水溶性アルコールを含む、他のどんな有機溶媒を使用しでも構わない。

（２）抽出液をろ過した後、ろ過液を濃い状態になるまで、減圧状態で濃縮する。

（３）ここに、蒸留水とn-へキサンを加えて、分液漏斗でn-へキサン層を分離する。上記 n-へキサンは、石油エーテル、クロロホルム又は、デクロロメタンで代替され使用できるが、本発明ではn-へキサンが好ましい。

（４）n-へキサン層を減圧状態で濃縮し、ある程度濃縮が進行されたら、粗結晶体が生じ始める。この時の、ウォーターバスの温度は約30〜40℃であり、回転速度は40〜200RPMである。この時、温度が高かったり、回転速度が遅かったり、早ければ、結晶は生成されない。

（５）粗結晶体がある程度、生成されたら、上澄み液であるn-へキサンを除去し、最小量のクロロホルムで粗結晶体を完全に溶かす。n-へキサンをゆっくり添加しながら、溶液が濁るように変わり始める時、n-へキサンの添加を止め、常温で30分間放置し、再結晶が起こるようにする。

（６）上澄み液（n-へキサン）を除去した後、残った粗結晶を再度、最小量のクロロホルムに溶かし、純粋な白色の結晶が得られるまで段落（５）、（６）の過程を繰り返す。

上記分離された結晶体をTLC及びHPLCで分析した結果、日本の標準試薬会社
である和光社で販売しているマグノロールと同一な化合物であることを確認した。

本発明による、マグノロールの大量分離方法は、一般的な分離過程では必須的に実施されるカラムクロマトグラフィ過程を省略することにより、分離工程段階が段縮され時間が節約でき、高価な装備が必要でないため、費用が少なく掛かり経済的である。従って、高価であるマグノロールを大量に分離するのに適合した方法である。

以下、本発明の理解を深めるため、好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより、簡単に理解するために提供されるものであり、実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。

マグノリアの皮質又はマグノリアの根からのマグノロールの分離方法について説明する。

マグノリアの皮質又は、マグノリアのの根5Kgを粉砕機でひいて抽出袋に入れ、80％エタノール10ｌを入れ冷蔵状態（4℃又は常温）で、24時間程度抽出した。このような過程を5回繰り返し実施した。抽出液をろ過した後、ろ過液を濃い状態になるまで、減圧状態で濃縮した。ここに、蒸留水とn-へキサンを加えて、分液漏斗でn-へキサン層を分離した。

それから、n-へキサン層を減圧状態で濃縮したら、ある程度濃縮が進行されながら、粗結晶体が生じ始めた。この時の、ウォーターバスの温度は約40℃であり、回転速度は100RPMであった。

このように、結晶体がある程度、生成されたら、上澄み液であるn-へキサンを除去し、最小量のクロロホルムで粗結晶体を完全に溶かした後、再度n-へキサンをゆっくり添加しながら、溶液が濁るように変わり始める時に止めた後、常温で30分間放置し、再結晶が起こるようにする。

この時、純粋な白色の結晶が得られるまで、上澄み液であるn-へキサンを除去した後、残った粗結晶を再度、最小量のクロロホルムに溶かし、また、 n-へキサンをゆっくり添加した後、常温で放置し、再結晶を得る過程を繰り返す。（マグノリアの皮質又は、マグノリアの根5Kgからマグノロール60ｇを分離し、1.2％の収得率を示した。）

この時、上記のように上澄み液であるn-へキサンを除去した後、残った粗結晶を再度、最小量のクロロホルムに溶かし、また、 n-へキサンをゆっくり添加した後、常温で放置し、再結晶を得る過程を繰り返し、純粋な白色結晶を得るのは、より純度の高い結晶体を得るためである。

このように繰り返された再結晶過程から得られる結晶体の純度を比較するため、分離された結晶体の再結晶する前（A）と再結晶後（B）をTLCで確認し、その結果を図２に示した。図２で示したように、Aの粗結晶体の状態は不純物を含有されているが、Bの粗結晶体の状態は不純物が著しく減っていることを確認できることから、再結晶過程から分離された結晶体の純度が高くなることを確認した。

次に、マグノロールの構造分析について説明する。

上記分離された結晶体は、日本の標準試薬会社である和光社で販売しているマグノロールと比較し、TLC、HPLCで確認し、VG高分解能GC/MS（VG high resolution GC/MS spectrometer、Election Ionization MS、 Autospec-Ultima）を使用し、分子量及び分子式を決定した。また、NMR (¹H-NMR、DEPT 135、 ¹³C-NMR, など)からデータを得て、分子構造を決定した。

測定結果は、下記のようであり、上記実施例によるマグノリアの皮質又はマグノリアの皮質根から分離した物質が下記化学式1のマグノロールであることが確認できた。

化学式1
マグノロールの構造

1) 分子量: 266
2) 分子式: C₁₈H₁₈O₂
3) ¹H-NMR(3OOMHz, CDCl₃):σ(ppm)3.39 (4H, d, J=6.9 Hz, H-7,7'), 5.12 (4H, m, H-9,9'), 5.86 (2H, d, J=2.4 Hz, OH-2,2'), 6.00 (2H, m, H-8,8'), 6.96 (2H, d, J=8.1 Hz, H-3,3'), 7.12 (2H, d, J=2.4 Hz, H-6,6'), 7.14 (2H, dd, J=8.1, 2.4 Hz, H-4,4')
4) ¹³C-NMR(75MHz, CDCl₃ ):σ(ppm) 39.8 (C-7,7'), 116.3 (C-9,9'), 117.1
(C-3,3'), 124.4 (C-1,1'), 130.3 (C-4,4'), 131.7 (C-6,6'), 133.7 (C-5,5'), 137.9 (C-8,8'), 151.4 (C-2,2')

次に、マグノロールの結晶体の生成実験について説明する

本発明による、マグノリアの皮質又はマグノリアの根からのマグノロールの分離条件を確立するため、ウォーターバス温度と回転速度の条件のみ変化をさせながら、下記のような実験を行った。

上記実施例で得られた有機溶媒層を減圧濃縮する時、ウォーターバス温度と回転速度の条件のみ変化をさせながら、上記実施例と同一な方法で製造し、結晶体の生成可否を確認した。

結果は表1に示した。

○：結晶体生成、△：若干スラリー状態である、X：結晶体生成されない

表1に示したように、本発明による、マグノリアの皮質又はマグノリアの根からのマグノロールの大量分離方法おいて、ウォーターバスの温度が約30〜40℃で、回転速度40〜200RPMの時、結晶体が生成され、結晶体を生成するための最も最適な条件であることがわかる。

マグノロールは、糖尿病性合併症を引き起こす典型的なメカニズムの一つである、タンパク質の非酵素的糖化反応の結果によって不可逆的に生成された糖化最終産物（advanced glycation end products、AGEs）の生成を抑制できると知られている。

しかし、マグノロールは、高価であり、その使用には限界があったが、本発明による、マグノリアの皮質又はマグノリアの根からのマグノロールの大量分離方法によって、マグノロールの分離工程が段縮及び単純化され、マグノロールを低価で大量に分離できるようになり、マグノロールを糖尿病性合併症の防止及び治療のための薬学的組成物及び機能性食品において、幅広く応用できる。

本発明によるマグノリアの皮質又はマグノリアの根からのマグノロールの大量分離方法を示したフローチャート図である。は、本発明により分離されたマグノロールのTLC実験結果である。

Claims

１）マグノリアの皮質又はマグノリアの根を粉砕し、有機溶媒で抽出して抽出物を得た後、n-へキサンを加えてn-へキサン層を得る段階；
２）上記n-へキサン層をウォーターバス30〜40℃、回転速度40〜200RPMで減圧下で濃縮し、粗結晶体を形成する段階；
３）上記粗結晶体からn-へキサン除去した後、クロロホルムで上記粗結晶体を完全に溶かした後、n-へキサンを添加し、常温で再結晶が起こるようにする段階からなるマグノリアの皮質又はマグノリアの根からのマグノロールの大量分離方法。
前記1）段階における有機溶媒が水溶性アルコールであることを特徴とする、請求項1に記載のマグノリアの皮質又はマグノリアの根からのマグノロールの大量分離方法。
前記3）段階が、純度の高い結晶体を得るため、繰り返されることを特徴とする、請求項1に記載のマグノリアの皮質又はマグノリアの根からのマグノロールの大量分離方法。