JP4755586B2 - ペプチド開裂部位を用いる単一ベクターからの免疫グロブリン発現を強化する組成物及び方法 - Google Patents

Description

本発明は、自己プロセシング遺伝子組換え全長免疫グロブリン又はその断片を発現するように設計された新しいベクター又はプラスミド構造に関する。この構造は、ex vivo又はin vivoで、細胞又は器官への非相同免疫グロブリンのコーディング配列を送出又は発現するために、又はin vitroで、ベクター移入された細胞による遺伝子組換え免疫グロブリンの産生のために用いられる。

診断手段及び治療方法としての抗体の利用は最近ますます増加している。FDAが承認した最初のモノクローナル抗体、Rituxan（登録商標）(Rituximab)、は1997年に非ホジキン・リンパ腫の患者の治療のために承認され、そのすぐ後、1998年に、ヒト化モノクローナル抗体、Herceptin（登録商標）、も転移性乳癌の患者の治療のために承認された。抗体をベースとする多数の治療法が臨床開発のいろいろな段階で有望な期待がもたれている。抗体技術の広範な臨床応用における一つの制約は、治療の効力をたかめるには普通大量の抗体が必要であるが、十分な生産にかかるコストが相当に大きくなると言うことである。抗体などグリコシル化されたヒトタンパク質の商業規模の生産で最も多く用いられる哺乳類細胞株は、Chinese Hamster Ovarian (CHO)細胞とNSO2骨髄腫細胞である。哺乳類細胞株の生産では、普通、50-250 mg/Lが5-7日間のバッチ発酵装置での培養で、300-600 mg/Lが7-12日間の流加培養（fed）バッチ発酵装置での培養で得られる。非グリコシル化タンパク質は、酵母で（例えば、Novo Nordiskによるインスリン生産）又はE. Coliで（例えば、Eli Lillyによるインスリン生産、及びCelltech によるFab生産）十分生産できる。

単一ベクターを用いる遺伝子組換えDNA技術によって全長抗体／免疫グロブリン分子を発現させる従来の試みは限られた成功しか収められなかった；結果は、普通、抗体／免疫グロブリン分子の重鎖と軽鎖の発現レベルが等しくなく、さらに詳しく言うと、第二の遺伝子の発現レベルが低くなる。細胞内で重鎖と軽鎖の発現レベルが等しくないことは、全長抗体の全体的な収量を低下させる。単一ベクターから完全な生物的機能を有する抗体を高レベルで発現させるためには、重鎖と軽鎖の等モル発現が必要である。さらに、遺伝子発現でジュアル・プロモーター制御に頼る通常のベクターは、常にプロモーター相互作用（すなわち、プロモーターの干渉）に影響されて遺伝子の等モル発現が損なわれる。単一ベクターからの二つ以上のコーディング配列を発現する能力を制限する別の要因としては、ベクター自身のパッケージングの限界がある。例えば、適当なベクター／コーディング配列を考える場合、考慮すべき因子として：ベクターのパッケージング容量（例えば、AAVでは約4,500 bp）、これは発現可能なコーディング配列のサイズを制限することがある；ベクター移入された細胞又は器官による組換えタンパク質のin vivo/in vitro発現の持続時間（例えば、アデノウイルス・ベクターの場合短期的な発現）；ウイルス・ベクターを用いる場合はベクターが移入された細胞タイプ；及び生成される遺伝子産物の所望発現レベル、などがある。二つ以上の遺伝子産物をコントロールして発現する必要は、アデノウイルスやAAVなどのウイルス・ベクターのパッケージング制限と合わせて、免疫グロブリン又はその断片を発現するためのベクター構造及びシステムの選択を制約する。

単一ベクターから二つ以上のタンパク質又はポリペプチド配列を発現させるためには、二つ以上のプロモーター又はリボソーム内部進入部位（IRES）配列を用いて個々の遺伝子の発現を推進する。単一ベクター内の二つ以上のプロモーターの使用は、プロモーターの干渉のためにタンパク質の発現が低く成る可能性がある。二つの遺伝子がIRES配列によってリンクされている場合、第二の遺伝子の発現レベルはしばしば第一の遺伝子の発現レベルよりも著しく弱くなる（Furler et al., Gene Therapy, 8:864-873, 2001）。

単一オープンリーディングフレームにおけるポリタンパク質の形でタンパク質を連結することは、ピコルナウイルスなど多くのウイルスの複製で用いられる戦略である。翻訳後、ウイルスにコードされたプロテイナーゼが急速なポリタンパク質の分子内（cis）開裂を誘発してばらばらの成熟したタンパク質産物を生ずる。口蹄疫ウイルス（FMDV）は、ピコルナウイルス科の中で、約225 kDのポリタンパク質をコードする単一の長いオープンリーディングフレームを発現させるグループである。全長の翻訳産物は、カプシドタンパク質前駆体（P1-2A）とポリタンパク質の複製ドメイン2BCとP3の間に生ずる2A領域のC-末端で急速な分子内（cis）開裂を受け、この開裂は2A領域自身のプロテイナーゼ様の活性で媒介される（Ryan et al., J. Gen. Virol. 72: 2727-2732, 1991; Vakharia et al., J. Virol. 61: 3199-3207, 1987）。Ryanは、FMDV 2A領域による開裂活性の発現に不可欠なアミノ酸残基を同定する構造を考案した。2A領域は、また、ピコルナウイルス属のaphthoviridea そしてcardioviridae から特徴付けられた（Donnelly et al., J. Gen. Virol. 78: 13-21, 1997）。

全長免疫グロブリン及びその断片を発現するための、現在利用される技術（すなわち、IRESの利用、又は二つ以上のプロモーター）に比べて利点がある改良された遺伝子発現システムに対するニーズが依然としてある。

本発明は、免疫グロブリン又はその断片などの生物的機能を有するポリペプチドの発現のための、自己プロセシング・ペプチドをコードする単一ベクター構造の可能性と利用を実証することによってこのニーズに応えるものである。

発明の要約
本発明は、全長免疫グロブリン又はその断片を、単一プロモーターの転写制御の下で重鎖及び軽鎖コーディング配列の本質的に等しい発現に基づいて発現させるためのシステムであって、翻訳が自己プロセシング開裂部位、例えば2A又は2A様配列、によって媒介されるシステムを提供する。

一つの観点では、本発明は遺伝子組換え免疫グロブリンの発現のためのベクターであって、免疫グロブリン分子又はその断片の第一の鎖のコーディング配列、自己プロセシング開裂部位をコードする配列、及び免疫グロブリン分子又はその断片の第二の鎖のコーディング配列、に作用可能式にリンクされたプロモーターを含み、自己プロセシング開裂部位をコードする配列が免疫グロブリン分子の第一の鎖のコーディング配列と免疫グロブリン分子の第二の鎖のコーディング配列の間に挿入されていることを特徴とするベクターを提供する。免疫グロブリン分子の第一の又は第二の鎖は、重鎖又は軽鎖であってよく、遺伝子組換え免疫グロブリンをコードする配列は全長コーディング配列であってもその断片であってもよい。

ベクターは、全長免疫グロブリン分子又はその断片を発現することができる任意の遺伝子組換えベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、レンチウイルス・ベクター、レトロウイルス・ベクター、増殖性アデノウイルス・ベクター、非増殖性アデノウイルス・ベクター、及び減弱(gutless)アデノウイルス・ベクター、ヘルペスウイルス・ベクター、又は非ウイルス・ベクター（プラスミド）である。

好ましい自己プロセシング開裂部位は、2A配列、例えば口蹄疫ウイルス（FMDV）から得られる2A配列、などである。

別の好ましい観点では、ベクターは、免疫グロブリン分子又はその断片の第一の鎖のコーディング配列と免疫グロブリン分子又はその断片の第二の鎖のコーディング配列の間に位置する（すなわち、2A開裂部位などの自己プロセシング開裂部位の配列に隣接する）追加のタンパク質分解開裂部位をコードする配列を含む。ある例示的なアプローチでは、追加のタンパク質分解開裂部位は、コンセンサス配列RXK(R)R (SEQ ID NO: 10)を有するフリン開裂部位である。

自己プロセシング・ペプチドを用いる組換え免疫グロブリン発現のためのベクターは多くのプロモーターのいずれを含んでもよく、プロモーターは構成的（constitutive）、制御又は誘導可能、細胞タイプ特異的、組織特異的、又は種特異的である。

ベクターはさらに、コーディング配列のシグナル配列を含むことができる。

本発明のある好ましい観点では、重鎖及び軽鎖免疫グロブリン（抗体）コーディング配列は等モル比で、又は等モル比に近く、発現される。

本発明はさらに、（i）免疫グロブリン（すなわち、抗体）の重鎖と軽鎖をコードする配列；（ii）自己プロセシング開裂部位をコードする配列；を含み、さらに（iii）追加のタンパク質分解開裂部位をコードする配列；を含むことができるベクターに感染した宿主細胞又は宿主細胞の安定なクローンを提供する。全長組換え免疫グロブリン又はその断片の生成におけるこのような細胞又はクローンの利用も本発明の範囲に含まれる。

関連した観点で、本発明はこのような細胞又はクローンによって生成され、自己プロセシング開裂部位から得られるアミノ酸を含む組換え免疫グロブリン分子又はその断片、及びそれを生成する方法、を提供する。

本発明のその他の観点、特徴及び利点は、発明を開示するための以下の説明を、添付された図面と合わせて考察すれば明らかである。

発明の詳細な説明
本発明は、免疫グロブリン分子又はその断片を発現する単一ベクター構造、及びそのin vitro又はin vivoでの利用方法を提供する。このベクターは、第一の及び第二の免疫グロブリン・コーディング配列の間に自己プロセシング開裂配列を有し、単一プロモーターを用いて機能的抗体分子の発現を可能にする。例示されるベクター構造は、オープンリーディングフレームの間に自己プロセシング開裂部位をコードする配列を有し、さらに、開裂の後で自己プロセシング開裂部位を構成するアミノ酸を除去するための追加のタンパク質分解（proteolytic）開裂部位を含むことができる。このベクター構造は、生物活性を有する全長免疫グロブリン又はその断片のin vitro及びin vivoでの生産強化に関連する方法で利用できる。

本発明のいろいろな組成物及び方法が以下で記述される。本明細書では特定の組成物及び方法が例示されるが、多くの代替的な組成物及び方法のいずれも用いることができ、本明細書を実施するのに利用するのに適していることは言うまでもない。また、本発明の免疫グロブリンを発現する構造（ベクター）及び方法の評価は、当業界で標準となっている手順で実行できることも言うまでもない。特に断りのない限り、本発明の実施では、細胞生物学、分子生物学（遺伝子組換え法を含む）、微生物学、生化学、及び免疫学の当業者の技術の範囲内にある通常の方法が用いられる。これらの方法は以下の文献に十分に記述されている、すなわち；”Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” 2^nd edition (Sambrook et al., 1989); “Oligonucleotide Synthesis,” (M.J.Gait,ed.,1984); “Animal Cell Culture” (R.I.Freshney,ed., 1987); “Methods in Enzymology” (Academic Press,Inc.); “Handbook of Experimental Immunology”(D.M.Weir & C.C.Blackwell,eds.);“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”(J.M.Miller & M.P.Calos,eds.,1987);“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987);“PCR:The Polymerase Chain Reaction”,(Mullis et al.,eds.,1994);and“Current Protocols in Immunology”(J.E.Coligan et al.,eds.,1991)、であり、これらはそれぞれ参照によって本明細書に明記して組み込まれる。

定義
特に断りのない限り、本明細書で用いられるすべての用語は、当業者に公知の用語と同じ意味を有し、本発明の実施では当業者の知識の範囲内にある微生物学と遺伝子組換えDNA技術の通常の方法が用いられる。

本明細書で用いる場合、“ベクター”という用語は、プラスミド、ウイルス、又はその他のビヒクルなどのDNA又はRNA分子であって、一つ以上の非相同又は組換えDNA配列を含み、異なる宿主細胞に導入するように設計されたものを指す。“発現ベクター”及び“遺伝子治療ベクター”という用語は、ある細胞で非相同DNA断片を取り込み発現させるのに有効な任意のベクターを指す。クローニング又は発現ベクターは、別の要素を含むことができる、例えば、発現ベクターは二つの複製システムを有し、二つの生物で、例えば、発現のためにヒト細胞で、クローニングと増幅のために原核生物の宿主で、維持されるようにすることができる。タンパク質又はポリペプチド発現が得られるように細胞に核酸を導入するのに有効な任意の適当なベクター、例えばウイルス・ベクター又は非ウイルスのプラスミド・ベクター、を用いることができる。本発明の実施では、発現に効果的などんな細胞も、例えば昆虫細胞及び酵母や哺乳類細胞などの真核細胞も有用である。

“非相同DNA”及び“非相同RNA”とは、それらが存在する細胞又はゲノムの部分に内因性（天然）ではないヌクレオチドを指す。一般に、非相同DNA又はRNAは、以下でさらに詳述するように、導入、感染、移入、変換、などによって細胞に付加される。このようなヌクレオチドは、一般に、少なくとも一つのコーディング配列を含むが、そのコーディング配列は発現されなくてもよい。“非相同DNA”は“非相同コーディング配列”又は“導入遺伝子”を指すこともある。

本明細書で用いる場合、“タンパク質”及び“ポリペプチド”という用語は交換可能に用いることができ、普通、本発明の自己プロセシング開裂部位を含むベクターを用いて発現される問題の“タンパク質”及び“ポリペプチド”を指す。このような“タンパク質”及び“ポリペプチド”は、以下でさらに詳述するように、研究、診断又は治療の目的に有用な任意のタンパク質又はポリペプチドである。

本発明のウイルス遺伝子治療ベクターに関連して用いる場合、“非複製(replication defective)”という用語は、そのウイルス・ベクターが独立にそれ以上そのゲノムを複製しパッケージすることができないということを意味する。例えば、ある被験者の細胞にrAAVビリオンが感染した場合、感染した細胞で非相同遺伝子は発現されるが、感染した細胞がAAV rep及びcap遺伝子及びアクセサリー機能遺伝子を欠いているのでrAAVは複製できない。

本明細書で用いる場合、“レトロウイルス導入ベクター” とは、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含み、さらにベクターのパッケージングに必要なヌクレオチド配列を含む発現ベクターを指す。好ましくは、レトロウイルス導入ベクター、また、細胞で導入遺伝子を発現するために必要な配列も含む。

本明細書で用いる場合、“パッケージング・システム”とは、組換えウイルスのパッケージングに関与するウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含むウイルス構造のセットを指す。普通、パッケージング・システムの構造は最終的にパッケージング細胞に組み込まれる。

本明細書で用いる場合、“第二世代” レンチウイルス・ベクター・システムとは、アクセサリー遺伝子、vif, vpr, vpu, 及びnefが欠失又は不活性化されたものなど、機能的アクセサリー遺伝子を欠くレンチウイルス・パッケージング・システムを指す。例えば、Zufferey et al., 1997, Nat. Biotechnol. 15: 871-875を参照。

本明細書で用いる場合、“第三世代” レンチウイルス・ベクター・システムとは、第二世代ベクター・システムの特性を有し、さらに機能的tat遺伝子を欠くレンチウイルス・パッケージング・システム、例えばtat遺伝子が欠失又は不活性化されたもの、を指す。普通、revをコードする遺伝子は別の発現構造に設けられている。例えば、Dull et al., 1998, J. Virol. 72(11): 8463-8471,を参照。

本明細書で用いる場合、“偽型(pseudotyped)”とは、天然のエンベロープタンパク質を非相同又は機能的に修飾されたエンベロープタンパク質で置き換えることを指す。

本明細書で組換えDNA構造又はベクターに関して用いる場合、“作用可能式にリンクされた”という用語は、その組換えDNA構造又はベクターのヌクレオチド成分が選ばれたコーディング配列を作用可能式にコントロールするように互いに機能的に関連していることを意味する。一般に、“作用可能式にリンクされた”DNA配列は、連続しており、分泌リーダー（secretory leader）の場合、連続し、リーディング・フレーム中にある。しかし、エンハンサーは連続している必要はない。

本明細書で用いる場合、“遺伝子”又は“コーディング配列” とは、適当な調節配列と作用可能式にリンクされていると、in vitro 又はin vivoで転写され（DNA）、翻訳されて（mRNA）ポリペプチドになる核酸配列を意味する。遺伝子は、コーディング領域の前又は後の領域、例えば5'非翻訳（5'UTR）又は“リーダー”配列及び3'UTR又は“トレーラー”配列、並びに個々のコーディングセグメント（エキソン）の間の介在配列（イントロン）を含むことも、又は含まないこともある。

“プロモーター”とは、RNAポリメラーゼの結合を指示してRNA合成を促進するDNA配列、すなわち、転写を指示するのに十分な最小配列である。プロモーターと対応するタンパク質又はポリペプチドの発現は、細胞タイプ特異的、組織特異的、又は種特異的であり得る。また、本発明の核酸構造又はベクターには、エンハンサー配列が含まれ、これはプロモーター配列に連続していることも連続していないこともある。エンハンサー配列はプロモーターに依存する遺伝子発現に影響を及ぼし、天然遺伝子の5’又は3’領域に位置することがある。

“エンハンサー”とは、隣接遺伝子の転写を刺激又は抑制するシス作用エレメントである。転写を抑制するエンハンサーは“サイレンサー”と呼ばれることもある。エンハンサーは、コーディング配列から、そして転写される領域の下流のある位置から、どちらの方向にも数キロ塩基対（kb）に至るまで機能する（すなわち、コーディング配列と関わる）ことができる。

“調節プロモーター”とは、その活動がcis又はtrans作用因子（例えば、外部シグナル又は因子などの誘導プロモーター）によって影響されるプロモーターである。

“構成性（constitutive）プロモーター”とは、ほとんどの時間、多くの又はすべての組織／細胞タイプでRNA生成を指示する任意のプロモーターである、例えばヒトCMV前初期(immediate early)エンハンサー／プロモーター領域、これは哺乳動物細胞中に挿入するクローン化DNAの構成的発現を促進する。

“転写調節タンパク質”、“転写調節因子”、及び“転写因子”という用語は本明細書で交換可能に用いられ、DNA応答エレメントと結合し、関連する遺伝子（単数又は複数）の発現を転写的に調節する核タンパク質である。転写調節タンパク質は一般にDNA応答エレメントに直接結合するが、場合によっては、DNAとの結合は別のタンパク質と結合してそれがDNA応答エレメントと結合するという形で間接的になり得る。

本明細書で用いる場合、“リボソーム内部進入部位”又は“IRES”とは、あるシストロン（あるタンパク質をコードする領域）の開始コドン、例えばATG、への直接の内部リボソーム進入を促進してcap非依存的な遺伝子翻訳に導くエレメントを指す。例えば、Jackson R J, Howell M T, Kaminski A (1990) Trends Biochem. Sci 15 (12) : 477-83 及びJackson R J and Kaminski A. (1995) RNA 1(10): 985-1000を参照。本明細書に記述される例は、シストロンの開始コドンへの直接の内部リボソーム進入を促進することができる任意のIRESエレメントの利用に関連している。本明細書で用いる場合、“IRESの翻訳制御の下で”とは、翻訳がIRESと結びついており、cap-非依存的に進行することを意味する。

本明細書では、“自己プロセシング開裂部位”又は“自己プロセシング開裂配列”とは、翻訳後又は翻訳時（co-translational）プロセシング開裂部位配列と定義される。このような“自己プロセシング開裂”部位又は配列は、本明細書では2A部位、配列、又は領域、又は2A様部位、配列、又は領域によって例示されるようなDNA又はアミノ酸配列を指す。本明細書で用いる場合、“自己プロセシング・ペプチド”とは、自己プロセシング開裂部位又は配列をコードするDNA配列のペプチド発現産物であって、翻訳されると自己プロセシング開裂部位を含むタンパク質又はポリペプチドの急速な分子内（cis）開裂を誘発してばらばらの成熟タンパク質又はポリペプチド産物を生ずるものと定義される。

本明細書で用いる場合、“追加のタンパク質分解（proteolytic）開裂部位”とは、本発明の発現構造に、2A又は2A様配列などの自己プロセシング開裂部位に隣接して組み込まれる配列であって、自己プロセシング開裂配列による開裂の後に残る付加的なアミノ酸を除去する手段を提供するものである。本明細書で記述される“追加のタンパク質分解開裂部位”の例としては、コンセンサス配列RXK(R)R(SEQ ID NO：10)を含むフリン開裂部位があるが、それだけに限定されない。このようなフリン開裂部位は、タンパク質分泌経路内のフリンやその他のセリンプロテアーゼなど、内因的なサブチリシン様プロテアーゼによって開裂される。

本明細書で用いる場合、“免疫グロブリン”及び“抗体”という用語は、抗原決定基と結合できる無傷の分子、並びにその断片、例えばFa、F(ab')2、及びFvなどを指す。このような“免疫グロブリン”及び“抗体”は、二つの同一な、分子量が約23,000ダルトンのポリペプチド軽鎖と、二つの同一な、分子量が53,000-70,000ダルトンの重鎖から構成されている。四つの鎖は、ジスルフィド結合で“Y”形態に結合されている。重鎖はガンマ（IgG）、ミュー（IgM）、アルファ（IgA）、デルタ（IgD）、又はイプシロン（IgE）と分類され、免疫グロブリンのクラス名称の基礎であり、ある与えられた抗体のエフェクター機能を決定する。軽鎖はカッパ又はラムダと分類される。本明細書で“免疫グロブリン又はその断片”に言及する場合、かかる“この断片”は免疫的に機能を有する免疫グロブリン断片であることは言うまでもない。

“ヒト化抗体”という用語は、抗原と結合しない領域で一つ以上のアミノ酸を置き換えてヒト抗体ともっと良く似るようにし、しかも抗体の元の結合活性を保持するようにした抗体分子を指す。例えば、米国特許No.6,602,503を参照。

本明細書で用いる場合、“抗原決定基”という用語は、ある特定抗体と接触する分子の断片（すなわち、エピトープ）を指す。あるタンパク質又はタンパク質の断片の多くの領域が、そのタンパク質のある領域又は三次元構造と特異的に結合する抗体の産生を誘発できる。これらの領域又は構造は抗原決定基と呼ばれる。抗原決定基は、ある抗体との結合に関して無傷の抗体（すなわち、免疫応答を誘発するために使用されるイムノゲン）と競合することができる。

本発明の組換えタンパク質又はポリペプチドに関して言う場合、“断片”という用語は、対応する全長タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列の、全部ではなく、一部と同じであるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、対応する全長タンパク質又はポリペプチドの機能又は活性の少なくとも一つを保持するポリペプチドを指す。断片は、好ましくは、全長タンパク質又はポリペプチドの少なくとも20-100の連続するアミノ酸残基を含む。

本明細書で用いる場合、“投与する”又は“導入する”という用語は、組換えタンパク質発現のためのベクターを細胞（単数又は複数）及び／又は被験者の器官に送り込むことを指す。このような投与又は導入は、in vivo、in vitro、又はex vivoで行ってよい。組換えタンパク質又はポリペプチド発現のためのベクターは、形質移入（transfection）によって（これは普通、物理的手段（例えば、リン酸カルシウム移入、エレクトロポレーション、ミクロ注入、又はリポフェクション）による非相同DNAの細胞への挿入を意味する）；感染によって（これは普通、感染因子、すなわち、ウイルスによる導入を指す）；又はトランスダクションによって（これは普通、ウイルスによる細胞の安定な感染を意味する）、又はウイルス（例えば、バクテリオファージ）によるある微生物から他の微生物への遺伝物質の移動によって、細胞に導入してよい。

“形質転換（transformation）”は、普通、非相同DNAを含むバクテリア、又は腫瘍細胞など腫瘍遺伝子を発現して連続成長形態に変換された細胞を言うために使用される。“形質転換する”のに用いられるベクターは、プラスミド、ウイルス、又はその他のビヒクルであってよい。

普通、細胞は、細胞への非相同DNA（すなわち、ベクター）の投与、導入、又は挿入に用いられる手段によって、“形質導入された”、“感染した”、“形質移入された”、又は“形質転換された”と呼ばれる。非相同DNAの導入方法に関わりなく、本明細書では、“形質導入された”、“形質移入された”、及び“形質転換された”という用語は交換可能に使用してよい。

本明細書で用いる場合、“安定に形質転換された”、“安定に形質移入された”及び“トランスジェニック”という用語は、非天然（非相同）核酸配列がゲノムに組み込まれた細胞を指す。安定な形質移入は、そのゲノムに安定に組み込まれた形質移入されたDNAを含む娘細胞の集団を含む細胞株又はクローンの確立によって実証される。場合によって、“形質移入”は安定でない、すなわち、一時的である。一時的な形質移入の場合、外因性、又は非相同DNAは発現されるが、導入された配列はゲノムに組み込まれず、エピソームであると考えられる。

本明細書で用いる場合、“ex vivo投与”とは、一次細胞が被験者から採取され、ベクターが細胞に投与されて導入形質された、感染した、又は形質移入された組換え細胞となり、その組換え細胞が同じ又は異なる被験者に再投与されるプロセスを指す。

“マルチシストロン転写”とは、一つよりも多くのタンパク質コーディング領域、又はシストロン、を含むmRNA分子を指す。二つのコーディング領域を含むmRNAは“バイシストロン転写”と呼ばれる。“5'-近位”コーディング領域又はシストロンとは、その翻訳開始コドン（通常はAUG）がマルチシストロンmRNA分子の5'-末端に最も近いコーディング領域である。“5'-遠位”コーディング領域又はシストロンとは、その翻訳開始コドン（通常はAUG）がmRNA分子の5'-末端に最も近い開始コドンでないものである。“5'-遠位”と“下流”という用語はmRNA分子の5'-末端に隣接していないコーディング領域を指すものとして同義的に用いられる。

本明細書で用いる場合、“共転写”とは、二つ（以上）のコーディング領域又はポリヌクレオチドが単一の転写制御又は調節エレメントの転写コントロールの下にあることを意味する。

本明細書で用いる場合、“宿主細胞”という用語は、ベクターで形質導入、感染、形質移入、又は形質転換された細胞を指す。ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等であってよい。温度、pH、などの培養条件は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前に用いられたものであり、当業者には明らかであるだろう。“宿主細胞”という用語は、形質導入、感染、形質移入、又は形質転換された元の細胞、及びその子孫、を指すことは理解されるであろう。

本明細書で用いる場合、“生物活性”及び“生物的に活性な”という用語は、培養されている細胞系統、又は細胞を含まないシステム、例えばELISAプレートにおけるリガンド−受容体アッセイにおける特定タンパク質に基因する活性を指す。“免疫グロブリン”、“抗体”、又はその断片、の“生物活性”とは、抗原決定基に結合して免疫機能を助ける能力を指す。

本明細書で用いる場合、“腫瘍”及び“癌”とは、成長の制御が失われて異常に大きな細胞クローンを形成する細胞を指す。腫瘍又は癌細胞は、一般に、接触阻止を失っており、侵襲的であり、及び／又は転移する能力を有する。

免疫グロブリンとその断片
抗体は、重鎖と軽鎖のヘテロダイマーである免疫グロブリンタンパク質であり、哺乳類細胞培養発現システムで単一ベクターから全長形態で発現させることはきわめて難しいことが分かっている。現在、脊椎動物の抗体の生産には次の３つの方法が用いられている、すなわち、動物をin vivoで免疫化して“ポリクローナル”抗体を生産させる方法、B-細胞ハイブリドーマをin vitroで細胞培養してモノクローナル抗体を生産させる方法（Kohler, et al., Eur. J. Immunol., 6: 511, 1976; Antibodies: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; 参照によって本明細書に組み込まれる）、及び遺伝子組換えDNA技術（例えば、Cabilly et al., US Pat. No. 6,331,415に記載されており、参照によって本明細書に組み込まれる）、である。

免疫グロブリン・ポリペプチドの基本分子構造は、周知のように、二つの同一な、分子量が約23,000ダルトンの軽鎖と、二つの同一な、分子量が53,000-70,000の重鎖を含み、４つの鎖はジスルフィド結合によって“Y”形態に結合している。アミノ酸配列は、YのトップのN-末端から各鎖の最下部のC-末端へ続いている。N-末端には（長さが約100アミノ酸の）可変領域があり、それが抗原との結合の特異性を定めている。

本発明は、すべてのタイプの免疫グロブリンを生産する改良された方法に向けられ、それは次のようなタイプ、すなわち、天然配列（すなわち、抗原による刺激に応答して生成された配列）を有する全長抗体及び抗体断片、重鎖と軽鎖の抗原結合可変領域を単一の安定に折り畳まれたポリペプチド鎖に組み合わせた単一鎖抗体；一価抗体（これは、重鎖／軽鎖ダイマーが第二の重鎖のFc領域に結合している）；“Fab断片”、これは免疫グロブリン分子の“Y”領域の全体、すなわち、“Y”の分枝、その軽鎖又は重鎖のみ、又はその部分、を含む（すなわち、一つの重鎖と一つの軽鎖の集合体，よくFab’と呼ばれるもの）；“ハイブリッド免疫グロブリン”、これは二つ以上の異なる抗原に対する特異性を有する（例えば、クアドローマ(quadromas)又は二重特異性抗体、例えば米国特許No.6,623,940に記載されているようなもの）；“複合免疫グロブリン”、これは重鎖と軽鎖が異なる種又は特異性のものを模倣する；及び“キメラ抗体”、ここでは重鎖と軽鎖の各アミノ酸配列の部分が二つ以上の種から由来する（すなわち、可変領域がある源、例えばマウス抗体、から由来し、定常領域が別の源、例えばヒト抗体、から由来する）、を含むがそれだけに限定されない。

本発明の組成物及び方法は、免疫グロブリン又はその断片の生産に有用であり、重鎖又は軽鎖が“哺乳類”、“キメラ”又はその効力を強化するように修飾される。修飾された抗体は、修飾されない形態の同一の生物活性を保持するアミノ酸及び核酸配列バリアントと、活性が変化するように修飾されたアミノ酸及び核酸配列バリアント、すなわち、補体固定、膜との相互作用、その他のエフェクター機能を改良する定常領域の変化、又は抗原結合特性を改善する可変領域の変化、を含む。本発明の組成物と方法は、さらに、触媒的な免疫グロブリン又はその断片を含む。

“バリアント”免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチド配列は、一つ以上のアミノ酸が基準のポリペプチド配列から変化した“バリアント”免疫グロブリン・アミノ酸配列をコードし得る。バリアント・ポリヌクレオチド配列は、置換されたアミノ酸が置き換えたアミノ酸と同様の構造的又は化学的性質を有する“保存的(conservative)”置換を含むバリアント・アミノ酸配列をコードすることがある。さらに、又は、そうではなく、バリアント・ポリヌクレオチド配列は、置換されたアミノ酸が置き換えたアミノ酸と異なる構造的又は化学的性質を有する“非保存的”置換を含むバリアント・アミノ酸配列をコードすることがある。バリアント免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチドは、また、アミノ酸挿入又は欠失、又はその両方、を含むバリアント・アミノ酸配列をコードすることがある。さらに、バリアント免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチドは、対照ポリヌクレオチド配列と同じポリペプチドをコードするが、遺伝コードの縮重のために対照ポリヌクレオチド配列と一つ以上の塩基が変化したポリヌクレオチド配列を有することもある。

本発明の遺伝子組換え免疫グロブリンに関して言う場合、“断片”という用語は、対応する全長免疫グロブリンタンパク質のアミノ酸配列の一部、全部ではない、と同じアミノ酸配列を有し、対応する全長タンパク質と本質的に同じ生物的機能又は活性を保持するか、又は対応する全長タンパク質の機能又は活性の少なくとも一つを保持するポリペプチドを意味する。好ましくは、断片は全長免疫グロブリンの少なくとも20-100の連続するアミノ酸残基を含む。

治療方法としての抗体の可能性は、現在、現行技術の生産能力と過大なコストによって制約されている。免疫グロブリンの生産のための改良されたウイルス又は非ウイルスの単一発現ベクターは、二つ以上のコーディング配列の発現、すなわち、単一ベクターからの二重又は多重特異性を有する免疫グロブリンの発現、を可能にする。本発明はこれらの制約を克服し、以下で詳述するように、単一鎖抗体、全長抗体、又は抗体断片などの遺伝子工学的な抗体を含む任意の免疫グロブリン（すなわち、抗体）又はそれらの断片に適用可能である。

リボソーム内部進入部位（IRES）
IRESエレメントは最初、ピコルナウイルスmRNAで発見された（Jackson RJ,Howell MT, Kaminski A(1990)Trends Biochem Sci 15(12)：477-83)及びJackson R J and Kaminski,A.(1995)RNA 1(10)：985-1000)。当業者が一般に用いるIRESの例としては、表１にあげたようなもの、及び米国特許No.6,692,736に記載されているものがある。当業者に公知の“IRES”の例としては、ピコルナウイルスから得られるIRES（Jackson et al., 1990）、ウイルス又は細胞のmRNA源から得られるIRES、例えば免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（BiP）、血管内皮成長因子（VEGF）（Huez et al.,(1998)Mol.Cell.Biol.18(11)：6178-6190）、繊維芽細胞成長因子２（FGF-2）、及びインスリン様成長因子（IGFII）、翻訳開始因子elF4G及び酵母転写因子TFIID及びHAP4、脳心筋ウイルス（EMCV）、これはNovagenから商業的に入手できる（Duke et al.,(1992)J. Virol.66(3)：1602-9）及びVEGF IRES (Huez et al., (1998) Mol Cell Biol 18(11): 6178-90)、などがあるがそれだけに限定されない。IRESは、また、いろいろなウイルスで、例えばカルディオウイルス、ライノウイルス、アフトウイルス、HCV、Friendマウス白血病ウイルス（FrMLV）、Moloneyマウス白血病ウイルス（MoMLV）、などである。本明細書で用いる場合、“IRES”はIRES配列の機能的バリエーションも、そのバリエーションがあるシストロンの開始コドンへの直接のリボソーム内部進入を促進できる限り、包含する。IRESは、哺乳類、ウイルス、又は天然動物のものがある。

IRESはある下流シストロンの開始コドンへの直接のリボソーム内部進入を促進して、cap-非依存的翻訳に導く。したがって、バイシストロン性（又はマルチシストロン性）mRNAから下流シストロンの産物を発現させることができ、ポリタンパク質の開裂やモノシストロン性mRNAの生成を必要としない。リボソーム内部進入部位は、長さが約450ヌクレオチドで、一次配列の適度な保存と二次構造の強い保存で特徴づけられる。IRESの最も顕著な一次配列の特徴は、ピリミジン-リッチな部位であり、そのスタートはIRESの3'末端から約25ヌクレオチド上流に位置している。Jackson et al.(1990)を参照。

ピコルナウイルスIRESの３つの主要なクラスが同定され、特徴化された：すなわち、（１）カルディオ及びアフトウイルス・クラス（例えば、脳心筋ウイルス、Jang et al.(1990） Gene Dev 4: 1560-1572)；（２）エンテロ及びライノウイルス・クラス（例えば、ポリオウイルス、Borman et al.(1994)EMBO J.13:314903157）；及び（３）A型肝炎ウイルス（HAV）クラス（Glass et al.(1993) Virol. 193:842-852）。最初の二つのクラスでは、二つの一般原理があてはまる。第一に、IRESの450ヌクレオチドの大部分が特定の二次及び三次構造を維持し、リボソームへの結合と翻訳開始を導くように機能する。第二に、リボソーム進入部位はIRESの3'末端で、保存されたオリゴピリミジン区域の約25ヌクレオチド下流に位置するAUGトリプレットである。翻訳開始はリボソーム進入部位（カルディオウイルス）又は次の下流のAUG（エンテロ／ライノウイルスクラス）で起こる。アフトウイルスでは開始は両方の部位で起こる。

HCVとペスティウイルス、例えばウシ・ウイルス性下痢ウイルス（BVDV）又は豚コレラ・ウイルス（CSFV）は、それぞれ、341 nt及び370 ntの長さの5'-UTRを有する。これらの5'-UTR断片は同じ様なRNA二次構造を形成し、かなり効率的なIRES機能を有することができる（Tsukiyama-Kohara et al.(1992)J.Virol.66：1476-1483；Frolov I et al.,(1998)RNA 4：1418-1435）。最近の研究は、Friendマウス白血病ウイルス（MLV）5'-UTRとラット・レトロトランスポゾン・ウイルス様30S(VL30)配列はレトロウイルス起源のIRES構造を含むことを示した（Torrent et al.,(1996)Hum Gene Ther 7：603-612）。

真核細胞では、翻訳は通常、開始因子の制御の下でキャップされたmRNA5'末端からのリボソーム走査によって開始される。しかし、いくつかの細胞mRNAsはcap-非依存的な翻訳を誘発するIRES構造を有することが見出された（van der Velde, et al. (1999) Int. J. Biochem Cell Biol. 31:87-106）。例としては、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（BiP）（Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94）、DrosophilanのアンテナペディアmRNA（Oh et al. (1992) Gene and Dev 6:1643-1653）、繊維芽細胞成長因子-2（FGF-2）（Vagner et al. (1995) Mol Cell Biol 15:35-44）、血小板由来成長因子B（PDGF-B）（Bernstein et al. (1997) J Biol Chem 272:9356-9362）、インスリン様成長因子II（Teerink et al. (1995) Biochim Biophys Acta 1264:403-408）、及び翻訳開始因子elF4G（Gan et al. (1996) J Biol Chem 271:623-626）。最近、血管内皮成長因子（VEGF）もIRESエレメントを有することが見出された（Stein et al.(1998)Mol Cell Biol 18：3112-3119；Huez et al.(1998) Mol Cell Biol 18：6178-6190）。

IRES配列は、実施例１に示すように2A配列に対してテストして比較することができる。ある例示的な手順では、テスト・ベクター又はプラスミドが一つのトランスジーン、例えばPF-4又はVEGF-TRAP、を含んで生成され、テストされるIRES、2A、又は2A様配列の翻訳制御の下に置かれる。細胞にIRES-又は2A-レポーター遺伝子配列を含むベクター又はプラスミドを移入し、分析を行ってトランスジーンの存在を検出する。ある例では、テスト・プラスミドは、CMVプロモーターによって転写的に駆動される共転写されるPF-4及びVEGF-TRAPコーディング配列を含み、PF-4又はVEGF-TRAPコーディング配列はテストされるIRES、2A、又は2A様配列によって翻訳的に駆動される。宿主細胞には当業者に公知の手段によってテスト・ベクター又はプラスミドが一時的に移入され、トランスジーンの発現が分析される。

IRESは、当業者に公知の標準的な遺伝子組換え及び合成方法を用いて調製され得る。クローニングの便宜のために、制限酵素切断部位は、用いるIRES断片の端に組み込むことができる。

単一ウイルス又は非ウイルス・ベクターから二つ以上のタンパク質を発現させるために、リボソーム内部進入部位（IRES）配列が第二、第三、第四の遺伝子、等の発現を推進するためによく用いられる。IRESの利用は標準技術であると多くの人たちが考えているが、二つの遺伝子がIRESを介してリンクされると、しばしば第二の遺伝子の発現レベルは著しく低くなる（Furler et al. Gene Therapy 8:864-873 (2001)）。実際、同じプロモーターに作用可能式にリンクされた二つ以上の遺伝子の転写をIRESを用いてコントロールすると、プロモーターに隣接する遺伝子に比べて第二、第三、等の遺伝子の発現を低レベルにすることができる。さらに、IRES配列が長くてベクターのパッケージング限界に対して問題を生ずる可能性がある、例えばeCMV IRESは長さが507塩基対になる。

ポリタンパク質の形にタンパク質をリンクすることは、ピコルナウイルス科を含めて多くのウイルスの複製で用いられる戦略である。翻訳後、ウイルスにコードされた自己プロセシング・ペプチドが、ポリタンパク質の急速な分子内（cis）開裂を誘発して、離散的な成熟したタンパク質産物を生ずる。本発明は、単一プロモーターを用いて二つ以上のタンパク質又はポリペプチド・コーディング配列を容易に発現できる自己プロセシング・ペプチド（ここでは2Aペプチドによって例示される）を含む組換えタンパク質又はポリペプチド発現のためのベクターが提供され、そこでは二つ以上のタンパク質又はポリペプチドが実質的に等モル比で発現されるという点で、IRESの利用に比べて利点がある。

自己プロセシング開裂部位又は配列
上で定義される“自己プロセシング開裂部位”又は“自己プロセシング開裂配列”とは、翻訳後に、その自己プロセシング開裂部位を含むポリペプチドの急速な分子内（cis）開裂が起こって離散的な成熟タンパク質産物が生ずるようなDNA又はアミノ酸配列を指す。このような“自己プロセシング開裂部位”は、また、翻訳後又は翻訳時プロセシング開裂部位と呼ばれることもあり、本明細書では2A部位、配列、又はドメインによって例示される。2A部位、配列、又はドメインは、エステル・リンケージの加水分解を促進するリボソームの活性を修飾して、不連続の下流の翻訳産物の合成が進行するのを可能にするような仕方でポリペプチドを翻訳複合体から放出することによって翻訳後の効果を発揮する（Donnelly,2001）。あるいはまた、2A部位、配列、又はドメインは、自身のC-末端をcisで開裂して一次開裂産物を生ずることによって“自己タンパク質分解”又は“開裂”を実証する（Furler；Palmenberg,Ann.Rev.Microbiol.44：603-623(1990)）。

メカニズムは本発明の一部ではないが、2Aの活性は、ペプチド結合の形成を妨げるコドンの間のリボソームのスキッピングに関わっている可能性がある（de Felipe et al, Human Gene Therapy 11:1921-1931(2000)；Donnelly et al. J. Gen. Virol. 82：1013-1025(2001)；ただし、このドメインはむしろ自己切断酵素のように働くという考えもある（Ryan et al. Virol. 173:35-45 (1989））。口蹄疫ウイルス（FMDV）2Aコーディング領域が発現ベクターにクローン化され標的細胞に形質移入された研究から、広範な非相同発現システムにおいて人工レポーター・ポリタンパク質のFMDV 2A開裂が効率的であることが確立された（コムギ胚芽溶解物及びトランスジェニック・タバコ・プラント（Halpin et al. USPN 5,846,767 (1998) 及びHalpin et al. The Plant Journal 17:453-459 (1999)）; Hs 683ヒト・グリオーマ細胞株（de Felipe et al, Gene Therapy 6:198-208 (1999); 以下では“de Felipe II”と呼ぶ）;ウサギ網状赤血球溶解物及びヒトHTK-143細胞（Ryan et al. EMBO J. 13:928-933 (1994); 及び昆虫細胞（Roosien et al. J. Gen. Virol. 71:1703-1711 (1990)）。生物的に重要な分子に関する非相同ポリタンパク質のFMDV 2Aに媒介される開裂はIL-12について示されている（p40/p35ヘテロダイマー；Chaplin et al., J. Interferon Cytokine Res. 19:235-241 (1999)）。形質移入されたCOS-7細胞、FMDV 2Aは、p40-2A-p35ポリタンパク質のIL-12に関連した活性を有する生物的に機能的なサブユニットp40とp35への開裂を媒介した。

FMDV 2Aは、バイシストロン性、トリシストロン性、及びテトラシストロン性ベクターを構築するために、単独で又はいろいろなIRES配列と組み合わせて、レトロウイルス・ベクターに組み込まれた。動物における2A媒介される遺伝子発現の効率性は、α-synuclein及びEGFP又はCu/Znスーパーオキシド・ジスムターゼ（SOD-1）及びEGFPがFMDV 2A配列によってリンクされたものをコードする組換えアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを用いてFurler(2001)によって実証された。EGFP及びα-synucleinは、2A配列を含むベクターから、対応するIRESベースのベクターに比べて実質的に高いレベルで発現されたが、SOD-1は同程度、又はわずかに高いレベルで発現された。Furlerは、また、2Aを含むAAVベクターをラットの黒質に注射したときに、2A配列がin vivoでのバイシストロン性遺伝子発現を生ずることを実証した。

本発明では、自己プロセシング開裂部位をコードするDNA配列は、エンテロ−、ライノ−、カルディオ−、アフト−、又は口蹄疫ウイルス（FMDV）など、それだけに限定されないが、ピコルナウイルス由来のウイルス配列によって例示される。ある好ましい態様では、自己プロセシング開裂部位をコードする配列はFMDV由来のものである。自己プロセシング開裂部位は2A及び2A様ドメインを含むがそれだけに限定されない（Donnelly et al., J. Gen. Virol. 82:1027-1041 (2001)、これは参照によって明確に全体が本明細書に組み込まれる）。

本発明のベクター構造で二つ以上の非相同DNA配列の間で2A配列を位置的にサブクローニングすることにより、単一の発現ベクターによって二つ以上の遺伝子を送り込み発現させることが可能になる。好ましくは、FMDV 2A配列などの自己プロセシング開裂部位が、単一ウィルスベクターから、例えば抗体、ヘテロダイマー受容体、ヘテロダイマータンパク質、などの個々の部分であり得る二つ以上のタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを発現して供給するユニークな手段を提供する。

FMDV 2Aは、FMDVゲノムでそれ自身のC-末端で単一開裂を誘導するように機能し、したがって、cisで機能するポリタンパク質領域である。FMDV 2Aドメインは、普通、長さが約19アミノ酸であると報告されている（LLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:1)；TLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:2)；Ryan et al.,J. Gen. Virol.72：2727-2732(1991)）、しかし、14アミノ酸残基という短いオリゴペプチド(LLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:3))は、天然のFMDVポリタンパク質のプロセシングにおける役割と類似した仕方で2A C-末端における開裂を媒介することが示されている。

2A配列のバリエーションが、ポリタンパク質の効率的なプロセシングを媒介する能力があるか、研究された（Donnelly MLL et al. 2001）。2A配列の相同体とバリアントは本発明の範囲に含まれ、以下の表２に示す配列が含まれるがそれだけに限定されない：

表２．2A配列の例
LLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:1)
TLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:2)
LLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:3)
NFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:4)
QLLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:5)
APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:6)
VTELLYRMKRAETYCPRPLLAIHPTEARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:7)
LLAIHPTEARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:8)
EARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:9)

2A配列とそのバリアントの明らかな利点は、自己プロセシング・ポリタンパク質を発現するベクターを生成するのに利用されることである。本発明は、自己プロセシング開裂部位、例えば、2Aドメイン、の存在によってポリタンパク質の開裂後に個々のタンパク質が等モル又は等モルに近い量で発現されるように自己プロセシング開裂部位によってリンクされたタンパク質又はポリペプチドのコーディング配列を含む任意のベクター（プラスミド又はウイルス・ベースのベクター）を含む。これらのタンパク質は、ベクター自身、互いに、又は自己プロセシング開裂部位、例えばFMDV、に非相同であり、したがって、本発明を実施するのに用いる自己プロセシング開裂部位は、非相同タンパク質と、自己プロセシング開裂部位と同じ起源に由来するコーディング配列とを、機能する又は開裂を媒介する能力において区別しない。

2Aコーディング配列の小さなサイズは、さらに、AAVなどコーディング配列のためのパッキング容量が限られているベクターでの使用も可能にする。AAVベクターの有用性は、2A配列がジュアル・プロモーターを不必要にすることでさらに拡がる。二つ以上のコーディング配列を含む単一オープンリーディングフレームを駆動するプロモーターからの個々の蛋白質、ポリペプチド、又はペプチドの発現レベルは、IRES配列又はジュアル・プロモーターを用いて得られる発現レベルに比べて等モルに近くなる。ジュアル・プロモーターがなくなると、各コーディング配列の発現レベルの低下及び／又は欠陥を生ずる可能性があるプロモーターの干渉も減る。

ある好ましい態様では、本発明によるベクターに含まれるFMDA 2A配列は、LLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:1)を含むアミノ酸残基をコードする。あるいはまた、本発明によるベクターは、Donnelly et al., J. Gen. Virol. 82:1027-1041 (2001)で論じられた、そしてピコルナウイルス、昆虫ウイルス、Type Cロタウイルス、トリパノソーマ反復配列、又はバクテリア、Thermatoga maritima、からの2A様ドメインを含むがそれだけに限定されない他の2A様領域、のアミノ酸残基をコードする。

本発明は、2A又は2A様ポリペプチドをコードする核酸配列バリアント、例えば親ヌクレオチドに対して一つ以上のアミノ酸に異なるコドンを有する2A又は2A様ポリペプチドの核酸コーディング配列、の使用を意図する。このようなバリアントは本発明によって特に対象とされ包含される。2Aペプチド及びポリペプチドの配列バリアントも本発明の範囲に含まれる。

本明細書で用いる場合、“配列同一性”という用語は、配列整列プログラムを用いて整列されたときの二つ以上の整列された配列における核酸又はアミノ酸配列の同一性を意味する。本明細書における“％相同性”という用語は、本明細書における“％同一性”という用語と交換可能に用いられ、配列整列プログラムを用いて整列されたときの二つ以上の整列された配列における核酸又はアミノ酸配列の同一性のレベルを指す。例えば、本明細書で用いる場合、80%相同性とは、ある定められたアルゴリズムによって決定された80%配列同一性と同じことを意味し、したがって、ある配列の相同体（homologue）は、与えられた配列のある長さにわたって80%より大きな配列同一性を有する。

比較のための配列の最適整列は、例えば、Smith & Waterman, Adv.Appl.Math.2：482(1981)の局所相同性アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)の相同性整列アルゴリズムによって、Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性探索法によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施によって（GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr.,Madison,Wis.）によって、BLASTアルゴリズム、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)によって、National Center for Biotechnology Information を通して一般に利用できるソフトウエアで（http://www.ncbi.nlm.nih.gov./）、又は肉眼検査によって（一般に、ausubel et al.前記参照）、実行できる。本発明の目的には、比較のための配列の最適整列は、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)の局所相同性アルゴリズムによって実行することが最も好ましい。また、Altschul,S.F.et al.1990及びAltschul,S.F.et al.1997を参照。

二つ以上の核酸又はタンパク質配列という文脈で“同一の”又はパーセント“同一性”という用語は、同じである二つ以上の配列又はサブ配列、又は、最大の対応になるように整列させて比較したとき、本明細書で記載した配列比較アルゴリズム、例えばSmith-Watermanアルゴリズム、又は肉眼検査によって測定して、定められたパーセンテージのアミノ酸残基又はヌクレオチドが同じである二つ以上の配列又はサブ配列、を指す。

本発明によれば、自己プロセシング開裂ポリペプチドと天然配列と80, 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%以上の配列同一性を有するポリペプチド自身をコードする配列バリアントも包含される。

核酸配列は、対照核酸配列に対して、二つの配列が中乃至高ストリンジェンシー・ハイブリダイゼーション及び洗浄条件の下で互いに特異的にハイブリダイズする場合、“選択的にハイブリダイズ可能”であると見なされる。ハイブリダイゼーション条件は核酸結合コンプレックス又はプローブの融点（Tm）に基づく。例えば、“最高ストリンジェンシー”は、普通、約Tm-5℃（プローブのＴｍの5°未満）で起こり；“高ストリンジェンシー”は、Tmより約5-10°未満で；“中ストリンジェンシー”は、プローブのＴｍの約10−20°未満で；そして、“低ストリンジェンシー”は、プローブのＴｍより約20−25°未満で起こる。機能的には、最高ストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーション・プローブと厳密な又は厳密に近い同一性を有する配列を同定するために用いられ；高ストリンジェンシー条件は、プローブと約80%以上の配列同一性を有する配列を同定するために用いられる。

中及び高ストリンジェンシー・ハイブリダイゼーション条件は当業者に良く知られている（例えば、Sambrook,et al.1989, Chapter 9 and 11,及びAusubel,F.M.et al.,1993参照）。高ストリンジェンシー条件の例としては、50%ホルムアミド、5X SSC, 5X Denhardt溶液、0.5%SDS及び100μg/ml変性キャリアDNA、中の約42℃でのハイブリダイゼーション、続いて室温で2X SSC及び0.5% SDS中の２回の洗浄、及び42℃で0.1X SSC及び0.5% SDS中のさらに２回の洗浄、などがある。本明細書に記載された2Aポリペプチドと同じ生物活性を有するポリペプチドをコードする2A配列バリアントで、中乃至高ストリンジェンシー・ハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズするものは本発明の範囲内にあると見なされる。

遺伝コードの縮重の結果として、同じ2A又は2A様ポリペプチドをコードする多くのコーディング配列を作ることができる。例えば、トリプレットCGTはアミノ酸アルギニンをコードする。アルギニンは、別にCGA, CGC, CGG, AGA, 及びAGGによってもコードされる。したがって、コーディング領域におけるこのような置換は、本発明の範囲内の配列バリアントになることは理解される。

さらに、このような配列バリアントは高ストリンジェンシーの条件の下で親配列とハイブリダイズすることもハイブリダイズしないこともあるということも理解されるであろう。これは、例えば、配列バリアントが親ヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の各々に対して異なるコドンを含む場合に起こりうる。しかし、このような配列バリアントは、それでもやはり、本発明によって特に意図され包含される。

自己プロセシング・ペプチド配列の除去
2A又は2A様配列等の自己プロセシングペプチドの使用に関連した問題の一つは、第一のポリペプチドのN末端が自己プロセシング・ペプチドに由来するアミノ酸、すなわち、2A-由来のアミノ酸残基、を含むということである。これらのアミノ酸残基は、宿主に対しては“異物”であり、組換えタンパク質がin vivoで発現又は送り込まれると（すなわち、遺伝子治療との関連でウイルス又は非ウイルス・ベクターから発現されると、又はin vitroで生成された組換えタンパク質として投与されると）、免疫応答を誘発する可能性がある。さらに、除去されない場合、2A-由来のアミノ酸残基は、産生細胞におけるタンパク質分泌に干渉し及び／又はタンパク質のコンフォメーションを変化させて、組換えタンパク質の発現レベルが最適でなくなったり及び／又は生物活性が低下したりする可能性がある。

本発明は、遺伝子発現構造であって、ポリペプチド・コーディング配列と自己プロセシング開裂部位（すなわち、2A-配列）の間に、開裂後に残る自己プロセシング開裂部位に由来するアミノ酸を除去するための手段として追加のタンパク質分解開裂部位を設けるように設計された遺伝子発現構造を含む。

追加のタンパク質分解開裂部位の例は、コンセンサス配列RXK(R)R(SEQ ID NO:10)を有するフリン開裂部位である。これは、タンパク質分泌経路にあるフリン及びその他のセリン・プロテアーゼなどの内因性のサブチリシン様プロテアーゼによって開裂され得る。実施例５で示されるように、本発明者等は、第一のタンパク質のN-末端における2A残基は、第一のポリペプチドと2A配列の間にフリン開裂部位RAKR(SEQ ID NO:15)を導入することによって効率的に除去できることを実証した。さらに、2A配列と、2A部位に隣接するフリン開裂部位を含むプラスミドの使用により、2A配列のみを含むプラスミドに比べて高レベルのタンパク質発現が得られることが示された。この改良は、2A残基をタンパク質のN-末端から除去するときには、より長い2A又は2A様配列又は他の自己プロセシング配列を使用できるという別の利点がある。このような長い自己プロセシング配列、例えば2A又は2A様配列、は単一プロモーターによる二つ以上のポリペプチドの等モル発現を促進し得る。

完全にヒト特性を有する抗体又はそのアナログを用いることは好都合である。これらは、非ヒト種に由来する抗体又はアナログによって誘発される所望されない免疫応答を回避できる。自己プロセシング・ペプチドに由来するアミノ酸残基に対する宿主の免疫応答という問題に対処するために、第一のタンパク質のコーディング配列と自己プロセシング・ペプチドのコーディング配列の間に（当業者に公知の標準的方法によって）タンパク質分解開裂部位のコーディング配列を挿入して、発現されたペプチド、すなわち、抗体、から自己プロセシング・ペプチド配列を除去することができる。in vivoで使用する治療又は診断用の抗体ではこれは特に有用である。

組換えDNA技術を用いて発現できる当業者に公知の任意の更なるタンパク質分解開裂部位も、本発明を実施するのに用いることができる。ポリペプチド又はタンパク質コーディング配列と自己プロセシング開裂配列（2A配列など）の間に挿入できる追加タンパク質分解開裂部位の例としては以下があるが、それだけに限定されない：
a). フリン開裂部位：RXK(R)R(SEQ ID NO:10)
b). Xa因子開裂部位：IE(D)GR(SEQ ID NO:11)
c). シグナルペプチダーゼI開裂部位：例えば、LAGFATVAQA(SEQ ID NO:12)及び
d). トロンビン開裂部位：LVPRGS(SEQ ID NO:13)。

発明の実施に用いるベクター
本発明は、二つ以上のポリペプチド又はタンパク質のコーディング配列及び自己プロセシング開裂配列を含む構造を細胞に導入するために任意の多様なベクターの使用を意図する。遺伝子発現ベクターの多数の例が当業者には公知であり、ウイルス起源のものも非ウイルス起源のものもある。本発明を実施するのに用いることができる非ウイルス遺伝子運搬方法としては、プラスミド、リポソーム、核酸／リポソーム複合体、カチオン性脂質、などがあるが、それだけに限定されない。

ウイルス・ベクターは効率的に細胞に移入して自身のDNAを宿主細胞に導入することができる。組換えウイルス・ベクターを生成する際に非本質的な遺伝子は、重要なタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子に置き換えられる。ベクターの例としては、ウイルス及び非ウイルス・ベクターがあるが、それだけに限定されず、レトロウイルス・ベクター（レンチウイルス・ベクターを含む）、複製可能、非複製、及び弱い形態を含むアデノウイルス（Ad）ベクター、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、シミアンウイルス40 (SV-40)ベクター、ウシ・パピローマ・ベクター、Epstein-Barrベクター、ヘルペスベクター、ワクシニア・ベクター、Moloneyマウス白血病ベクター、Harveyマウス肉腫ウイルス・ベクター、マウス乳腫瘍ウイルス・ベクター、Rous肉腫ウイルス・ベクター、及び非ウイルス・プラスミド、などがある。

ベクターは普通、複製の原点を含み，その他にベクターを同定し選択できる“マーカー”又は“選択マーカー”機能を含むことも含まないこともある。任意の選択マーカーも使用できるが、組換えベクターで使用される選択マーカーは一般に当業者には公知であり、適切な選択マーカーの選定は、宿主細胞に依存する。抗生物質やその他の毒素に対する耐性を付与するタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子としては：アンピシリン、メトトレキセート、テトラサイクリン、ネオマイシン（Southern et al.,J.,J Mol Appl Genet.1982；1(4):327-41(1982)）、マイコフェノール酸（Mulligan et al.Science 209:1422-7(1980)）、プロマイシン、ゼオマイシン、ハイグロマイシン（Sugden et al.Mol Cell Biol 5(2):410-3(1985)）、及びG418、などがあるがそれだけに限定されない。当業者には理解されるように、発現ベクターは普通、複製の原点、発現すべきコーディング配列（単数又は複数）と作用可能式にリンクされたプロモーター、並びにリボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネーター配列、などを発現すべきコーディング配列にとっての必要に応じて含む。

ベクター又はその他のDNA配列に関して言う“組換え”とは、単に、普通は隔離されて又は天然に見られる状態で作用可能式にリンクしていないDNA配列が作用可能式にリンクしていることを認めているだけである。調節（発現及び／又は制御）配列は、その発現及び／又は制御配列が、ある核酸配列の転写、及び必要に応じ翻訳、を調節するとき、その核酸配列と作用可能式にリンクしている。したがって、発現及び／又は制御配列は、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、コーディング配列へ5'の開始コドン(即ち、ATG)、イントロンへのスプライシングシグナル、終止コドン、を含むことができる。

アデノウイルス遺伝子治療ベクターは、強い一時的発現、優れた力価(titer)、そしてin vivoで分裂細胞及び非分裂細胞に移入する能力を示す（Hitt et al.,Adv.in Virus Res 55：479-505(2000)）。本発明の組換えAdベクターは：（１）非複製Adビリオンにベクターを組み込むことを可能にするパッケージング部位；（２）重要な二つ以上のポリペプチド又はタンパク質、例えば重要な免疫グロブリンの重鎖と軽鎖、のコーディング配列；及び（３）自己プロセシング開裂部位を、単独で又は追加のタンパク質分解開裂部位と組み合わせて、コードする配列、を含む。感染ビリオンに組み込むことが必要又は有益な他のエレメントとしては、5’及び3’Ad ITRs、E2遺伝子、E4遺伝子の部分、及び任意にE3遺伝子、などがある。

本発明の組換えAdベクターをカプセルに収めた非複製Adビリオンは、Adパッケージング細胞とパッケージング・技術を用いて当業者に公知の標準的方法によって作られる。これらの方法の例は、例えば米国特許No.5,872,005に見られる。重要な二つ以上のポリペプチド又はタンパク質のコーディング配列は、普通、アデノウイルスに、ウイルス・ゲノムが欠失されたE3領域に挿入される。本発明を実施するのに使用することが好ましいアデノウイルスは、野生型Ad遺伝子産物、例えばE1a, E1b, E2, E3, 及びE4の一つ以上を発現しない。好ましい態様は、普通、E1, E2A, E4, 及び任意にE3遺伝子領域の機能を補うパッケージング細胞株と一緒に用いられるビリオンである。例えば米国特許Nos.5,872,005、5,994,106、6,133,028、及び6,127,175を参照。したがって、本明細書で用いる場合、“アデノウイルス”及び“アデノウイルス粒子”は、ウイルス自身又はその誘導体を指し、特に断わりのない限り、すべての血清型（serotype）とサブタイプ、そして天然に見られるものと遺伝子組換え形態の両方をカバーする。このようなアデノウイルスは野生型であっても、当業者に公知のいろいろな仕方で修飾されていても、又は本明細書に開示されるようなものであってもよい。その修飾は、感染性ウイルスとするために粒子にパッケージされたアデノウイルス・ゲノムへの修飾を含む。その修飾は、当業者に公知の欠失、例えばE1a, E1b, E2a, E2b, E3, 及びE4の一つ以上における欠失、を含む。パッケージング細胞と生産細胞の例は、239, A549, 又はHeLa細胞から得られる。アデノウイルス・ベクターは当業者に公知の標準的方法で精製され調製される。

アデノ随伴ウイルス（AAV）は、ヘルパー依存的なヒト・パルボウィルスであり、染色体組み込みによって潜伏的に細胞に感染できる。染色体に組み込むことができることと非病原的な性質のため、AAVはヒト遺伝子治療ベクターとして大きな可能性を有する。本発明を実施するのに使用する場合、rAAVビリオンは当業者に公知の標準的な方法によって生成することができ、転写の方向に作用可能式にリンクした成分として、転写開始及び終止配列などの制御配列及び重要なコーディング配列を含むように構築される。より詳細には、本発明の遺伝子組換えAAVベクターは以下を含む：（１）非複製ビリオンにベクターを組み込むことを可能にするパッケージング部位；（２）重要な二つ以上のポリペプチド又はタンパク質、例えば重要な免疫グロブリンの重鎖と軽鎖、のコーディング配列；及び（３）自己プロセシング開裂部位を、単独で又は追加のタンパク質分解開裂部位と組み合わせて、コードする配列。本発明を実施するのに用いるAAVベクターは、転写の方向に作用可能式にリンクした成分として、転写開始及び終止配列などの制御配列も含むように構築される。これらの成分は、機能的AAV ITR配列によって5’末端及び3’末端に隣接させられる。“機能的AAV ITR配列”とは、ITR配列がAAVビリオンのレスキュー、複製、及びパッケージングのために意図したように機能するということを意味する。

組換えAAVベクターはまた、選ばれた組換えポリペプチド又はタンパク質産物の標的細胞での発現と生産を指示できるという特徴がある。すなわち、組換えベクターは、組換えAAV（rAAV）ビリオンの感染のためのキャプシド形成と物理的構造のために必要な少なくともすべてのAAVの配列を含む。したがって、本発明のベクターで用いるAAV ITRsは野生型ヌクレオチド配列（例えば、Kotin, Hum. Gen. Ther. 5:793-801, 1994に記載されているようなもの）を有する必要はなく、ヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換によって変えることができ、或いはAAV ITRsは任意のいくつかのAAV血清型に由来するものであってもよい。一般に、AAVベクターはアデノ随伴ウイルス血清型、例えば、それだけに限定されないが、AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, など、に由来するベクターである。好ましいrAAVベクターは野生型REP及びCAP遺伝子が全部又は一部欠失しているが、機能的な隣接しているITR配列を保持している。

普通、AAV発現ベクターが生産細胞に導入され、続いてAAVヘルパー構造が導入される。ここでヘルパー構造は、生産細胞で発現でき、AAVベクターに欠けているAAVヘルパー機能を補うAAVコーディング領域を含む。ヘルパー構造は、大きなRepタンパク質（Rep78とRep68）の発現を、米国特許No.6,548,286に記載されているように、普通はATGからACGへp5に続いて開始コドンを突然変異させることによってダウンレギュレートするように設計できる。この特許は参照によって明記して本明細書に組み込まれる。これに続いてヘルパー・ウイルス及び／又は別のベクターを生産細胞に導入し、そこでヘルパー・ウイルス及び／又は別のベクターが効率的なrAAVウイルス生産をサポートするアクセサリー機能を提供する。次に生産細胞を培養してrAAVを生産する。これらのステップは標準的な方法で行われる。本発明の組換えAAVベクターをカプセル封入した非複製AAVビリオンは、AAVパッケージング細胞とパッケージング・技術を用いて当業者に公知の標準的方法によって作られる。これらの方法の例は、例えば、米国特許Nos.5,436,146、5,753,500、6,040,183、6,093,570及び6,548,286に見られる、これらの特許は参照によって明記して全体が本明細書に組み込まれる。パッケージングのためのその他の組成物や方法は、Wang et al.(US2002/0168342)に記載されており、これも参照によって全体が本明細書に組み込まれ、当業者の知識の範囲にある方法が含まれる。

本発明を実施する際、rAAVビリオンを生産するための宿主細胞としては、哺乳類細胞、昆虫細胞、微生物及び酵母、などがある。宿主細胞は、また、AAV rep及びcap遺伝子が安定に宿主細胞内に維持されるパッケージング細胞であっても、又はAAVベクターゲノムが安定に保持されパッケージされる生産細胞であってもよい。典型的なパッケージング細胞及び生産細胞は、293,A549、又はHeLa細胞から得られる。AAVベクターは、当業者に公知の標準的な方法で精製され調製される。

レトロウイルスも遺伝子運搬のためによく用いられる手段である（Miller, 1992, Nature, 357:455-460）。レトロウイルス・ベクターは、さらに詳しくはレンチウイルス・ベクターは本発明を実施するために使用できる。したがって、本明細書で用いる場合、“レトロウイルス”又は“レトロウイルス・ベクター”はそれぞれ“レンチウイルス”及び“レンチウイルス・ベクター”を含むものとする。レトロウイルス・ベクターはテストされて、関心ある遺伝子を広範囲の標的細胞のゲノムに安定して導入するために適当な送達ビヒクルであることが見出されている。レトロウイルス・ベクターが、並べ変えられないシングルコピーの導入遺伝子を細胞に送り込む能力は、レトロウイルス・ベクターを細胞に遺伝子を送り込むために最適なものにしている。さらに、レトロウイルスは、宿主細胞の特異的な細胞表面の受容体にレトロウイルスのエンベロープの糖タンパク質を結合させて宿主細胞に入り込む。したがって、天然エンベロープタンパク質が、天然エンベロープタンパク質と異なる細胞特異性を有する（例えば、天然エンベロープタンパク質と異なる細胞表面の受容体に結合する）非相同エンベロープタンパク質で置き換えられた偽型のレトロウイルス・ベクターは本発明を実施するのに有用であろう。一つ以上の標的タンパク質コーディング配列をコードするレトロウイルス・ベクターを特定の標的細胞に向けて送り込むことができる能力は本発明を実施するために望ましい。

本発明は、例えば一つ以上の導入遺伝子配列を含むレトロウイルス送達ベクターと一つ以上のパッケージング・エレメントを含むレトロウイルス・パッケージング・ベクターを含むレトロウイルス・ベクターを提供する。特に、本発明は、偽型レトロウイルスを生産するための非相同又は機能的に修飾されたエンベロープタンパク質をコードする偽型レトロウイルス・ベクターを提供する。

本発明のレトロウイルス・ベクターのコア配列は、例えば、B, C, 及びDタイプのレトロウイルス、並びにスプマウイルスとレンチウイルス、などの多様なレトロウイルスから容易に得られる（RNA Tumor Viruses, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985,参照）。本発明の組成物と方法で用いるのに適当なレトロウイルスの例としてレンチウイルスがあげられるが、それだけに限定されない。本発明の組成物と方法で用いるのに適当なレトロウイルスのその他の例として、鳥白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、mink-cell focus-inducing virus、マウス肉腫ウイルス、網膜内皮症ウイルス、及びRous肉腫ウイルス、などがあるがそれだけに限定されない。特に好ましいマウス白血病ウイルスとしては、4070A及び1504A(Hartley and Rowe, J. Virol. 19:19-25,1976)、Abelson (ATCC No.VR-999)、Friend(ATCC No.VR-245)、Graff,Gross(ATCC NO.VR-590)、Kirsten,Harvey Sarcoma Virus and Rauscher(ATCC-No.VR-998)及びMolonyマウス白血病ウイルス(ATCC No.VR-190)、などがある。このようなレトロウイルスは、American Type Culture Collection (“ATCC”,Rockville,Md.)などの受託者又はコレクションから容易に入手したり、普通に利用できる方法で公知の起源から単離できる。

本発明のレトロウイルス・ベクター配列はレンチウイルス由来のものであることが好ましい。好ましいレンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス、例えばタイプ1又は2（すなわち、HIV-1又はHIV-2、ここでHIV-1は以前はリンパ節症随伴ウイルス3 (HTLV-III)及び後天性免疫不全症候群（AIDS）関連ウイルス（ARV）と呼ばれていた）、又はHIV-1又はHIV-2に関連し、AIDS又はAIDS様疾病に関連する別のウイルスである。その他のレンチウイルスとしては、ヒツジ乳頭腫ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（FIV）、ウシ・レンチウイルス、サル免疫不全ウイルス（SIV）、及びウマ伝染性貧血症ウイルス（EIAV）、及びヤギ関節炎脳脊髄炎ウイルス（CAEV）などがある。

組成物と方法で用いるのに適したレトロウイルスのいろいろな属や系統は当業者には周知である（例えば、Fields Virology, Third Edition, edited by B. N. Fields et al., Lippincott Raven Publishers (1996)を参照、例えばChapter 58, Retroviridae: The Viruses and Their Replication, Classification, p. 1768-1771,を表１も含めて参照、これは参照によって本明細書に組み込まれる）。

本発明は、レトロウイルスを生産する生産細胞及び生産細胞株を生成するためのレトロウイルス・パッケージング・システム及びそのようなパッケージング・システムを作る方法、を提供する。したがって、本発明はまた、レトロウイルス送達ベクターをそのようなパッケージング・システムに導入することによって（例えば、形質移入又は感染によって）生成される生産細胞と生産細胞株、及びそのようなパッケージング細胞と細胞株を作る方法、を提供する。

本発明のパッケージング・システムは、少なくとも二つのパッケージング・ベクターを含む：すなわち、gag, pol, 又はgagとpol遺伝子を含む第一のヌクレオチド配列を含む第一のパッケージング・ベクター；及び非相同又は機能的に修飾されたエンベロープ遺伝子を含む第二のヌクレオチド配列を含む第二のパッケージング・ベクター、である。ある好ましい態様では、レトロウイルス・エレメントはHIVなどのレンチウイルスに由来する。好ましくは、ベクターは機能的tat遺伝子及び／又は機能的アクセサリー遺伝子（vif, vpr, vpu, vpx, nef）を欠いている。別の好ましい態様では、システムはさらに、rev遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む第三のパッケージング・ベクターを含む。パッケージング・システムは第一、第二、及び任意に第三のヌクレオチド配列を含むパッケージング細胞という形態で提供できる。

本発明は、いろいろなレトロウイルス・システムに適用でき、当業者は異なるグループのレトロウイルスの間で共有される共通エレメントを認識できるであろう。本明細書における記述はレンチウイルス・システムを代表的な例として用いている。しかし、すべてのレトロウイルスが、表面突起を有するビリオンで、線状の正の向きの一本鎖RNAの一分子、ダイマーから成るゲノム、及び共通のタンパク質、gag、pol及びenv、を含むという特徴を共有している。

レンチウイルスは、いくつかの構造上のビリオンタンパク質を共有する、すなわち、env遺伝子によってコードされるエンベロープ糖タンパク質SU(gp120)及びTM(gp41)；gag遺伝子によってコードされるCA(p24)、MA(p17)、及びNC(p7-11)；及びpol遺伝子によってコードされるRT、PR、及びIN、などである。HIV-1とHIV-2はウイルスRNAの合成と処理及びその他の複製機能の調節に関与するアクセサリータンパク質やその他のタンパク質を含む。vif、vpr、vpu/vpx、及びnef遺伝子によってコードされるアクセサリータンパク質は組換えシステムから省く（又は不活性化する）ことができる。さらに、tatとrevも、例えば突然変異又は欠失によって省く、又は不活性化する、ことができる。

第一世代のレンチウイルス・ベクターは、gag/polとenvについて別々のパッケージング構造を与え、普通、安全上の理由から非相同又は機能的に修飾されたエンベロープタンパク質を用いている。第二世代のレンチウイルス・ベクター・システムでは、アクセサリー遺伝子vif、vpr、vpu、及びnefは欠失又は不活性化されている。第三世代のレンチウイルス・ベクター・システムは、tat遺伝子が欠失又は不活性化されている（例えば、突然変異によって）ものである。

通常tatによって得られる転写の調節に関する補償は、ヒトサイトメガロウイルス即時型（immediate early）（HCMV-IE）エンハンサー／プロモーターなど強い構成性プロモーターを使用することによって得られる。その他のプロモーター／エンハンサーも、構成性プロモーターの活性、標的組織への特異性（例えば、肝特異的プロモーター）、又は当業者に理解されるような、発現の望ましいコントロールに関連する他の因子、に基づいて選択される。例えば、ある態様では、コントロールされた発現を達成するためにtetなどの誘導プロモーターを用いることが望ましい。好ましくは、revをコードする遺伝子を別の発現構造に設けて、典型的な第三世代レンチウイルス・ベクター・システムが四つのプラスミドを、gagpol、rev、エンベロープ、及び導入ベクターに各一つ、用いるようにする。

普通、パッケージング・ベクターパッケージングシステムはパッケージング細胞に含められ、その細胞に形質移入、形質導入、又は感染によって導入される。形質移入、形質導入、又は感染の方法は当業者には周知である。本発明のレトロウイルス導入ベクターは、形質移入、形質導入、又は感染によってパッケージング細胞株に導入されて、生産細胞又は細胞株を生成する。本発明のパッケージング・ベクターは、標準的な方法、例えばリン酸カルシウム・トランスフェクション、リポフェクション、又はエレクトロポレーション、によってヒト細胞又は細胞株に導入できる。ある態様では、パッケージング・ベクターは、例えばneo、DHFR、Glnシンテターゼ、又はADAなどの優性選択マーカーと共に細胞に導入され、続いて適当な薬物の存在下での選択とクローンの単離が行われる。選択マーカー遺伝子は、パッケージング・ベクターによってコードする遺伝子に物理的にリンクすることができる。

適当なパッケージング細胞によってパッケージング機能が発現されるように構成された安定な細胞株は公知である。例えば、パッケージング細胞を記載している米国特許No.5,686,279;及びOry et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(1996)93:11400-11406、を参照。安定な細胞株の生成についてさらに詳しくは、Dull et al.,1998,J.Virology 72(11)：8463-8471；及びZufferey et al.,1998,J.Virology 72(12):9873-9880に見出すことができる。

Zufferey et al., 1997, Nature Biotechnology 15:871-875は、HIV-1エンベロープ遺伝子を含むpolの配列3’が欠失したレンチウイルス・パッケージング・プラスミドを教示している。この構造はtat及びrev配列を含み、3’LTRがポリA配列によって置き換えられている。5’LTR及びpsi配列は、別のプロモーター、例えば誘導プロモーター、で置き換えられる。例えばCMVプロモーター又はその誘導体を用いることができる。

重要なパッケージング・ベクターは、レンチウイルスタンパク質発現を強化し安全性を強化するためにパッケージング機能に追加される変更を含むことができる、例えば、gagの上流のすべてのHIV配列を除去することができる。また、エンベロープの下流の配列を除去することもできる。さらに、ベクターを修飾して、RNAのスプライシングと翻訳を強化する手段を講ずることができる。

任意に、Dull et al., 1998, J. Virology 72(11):8463-8471に記載されているような条件付きパッケージング・システムが用いられる。また、自己不活性化ベクター（SIN）の使用も好ましい。これは、例えばZufferey et al., 1998, J. Virology 72(12):9873-9880に記載されているように、HIV-1の長い末端反復（LTR）の欠失によってベクターの生物安全性を改善する。tet誘導LTRなどによって誘導ベクターを用いることもできる。

本発明のベクターは、普通、非相同制御配列を含み、それはサイトメガロウイルス（CMV）即時型（immediate early）プロモーター、RSV LTR、MoMLV LTR、及びPGKプロモーター、などの構成性プロモーター；mTTR、TK、HBV、hAAT、などの組織又は細胞タイプ特異的プロモーター、調節又は誘導プロモーター、エンハンサー、等を含むが、それだけに限定されない。好ましいプロモーターとしては、LSPプロモーター（Ill et al. Blood Coagul. Fibrinolysis 8S2:23-30 (1997)）、EF-1アルファ・プロモーター（Kim et al. Gene 91(2):217-23 (1990)）、及びGuo et al. Gene Ther. 3(9):802-10(1996)、などである。最も好ましいプロモーターは、伸長因子1-アルファ(EF 1a)プロモーター、ホスホグリセレート・キナーゼ-1(PGK)プロモーター、サイトメガロウイルス即時型（immediate early）遺伝子（CMV）プロモーター、キメリック肝特異的プロモーター(LSPs)、サイトメガロウイルス・エンハンサー／チキン・ベータアクチン(CAG)プロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター(TRE)、トランスチレチン・プロモーター(TTR)、シミアンウイルス-40 (SV40)プロモーター、及びCK6プロモーター、である。これらの及び多数のその他のプロモーターの配列は当業者に公知である。関連配列は公共のデータベースから容易に入手し、本発明の実施で用いるベクターに組み込むことができる。

本発明は、また、重要な二つ以上のポリペプチド又はタンパク質のコーディング配列の制御された発現のための遺伝子調節システムを含めることを意図する。遺伝子調節システムは特定遺伝子（単数又は複数）の調節された発現のために有用である。ある例示的なアプローチでは、遺伝子調節システム又はスイッチは、リガンド結合ドメイン、転写活性化ドメイン、及びDNA結合ドメインを有するキメラ転写因子を含む。ドメインは、ほぼどんな起源からも得ることができ、多くの方法のいずれかで組み合わされて新規タンパク質が得られる。調節可能な遺伝子システムは、またキメラ転写因子と相互作用するDNA応答エレメントを含む。このエレメントは調節される遺伝子に隣接して位置する。

本発明を実施するのに用いることができる遺伝子調節システムの例としては、Drosophilaエクジソン・システム（Yao et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.,93:3346(1996)）、Bombyxエクジソン・システム（Suhr et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,95:7999(1998)）、RU-486を誘導物質として用いるValentis GeneSwitch（登録商標）合成プロゲステロン受容体システム（Osterwalder et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,98(22):12596-601(2001)）；Tet（商標）&RevTet（商標）システム（BD Biosciences Clontech）、これはテトラサイクリン（Tc）又はアナログ、例えばドキシサイクリン、などの小さな分子を用いて標的の転写を調節する（オン、又はオフする）（Knott et al., Biotechniques 32(4):796, 798, 800 (2002)）；ARIAD Regulation Technology、これは小さな分子を用いて、それぞれが転写アクチベーター又はDNA結合タンパク質とリンクしている細胞内の二つの分子を一緒にする。これらの成分が一緒になると、重要な遺伝子の転写が活性化される。Ariadは二つの主なシステムを有する：すなわち、ホモ二量体化に基づくシステム、及びヘテロ二量体化に基づくシステム、である（Rivera et al., Nature Med. 2(9):1028-1032 (1996); Ye et al., Science 283:88-91 (2000)）。

本発明を実施するのに好ましい遺伝子調節システムは、ARIAD Regulation TechnologyとTet（商標）&RevTet（商標）システムである。

免疫グロブリン・コーディング配列を含む核酸構造の細胞への運搬
抗体又はその断片又は自己プロセシング組換えポリペプチドという形の非相同タンパク質をコードする核酸配列を含む本発明のベクター構造は、in vitro、ex vivo、又はin vivoで細胞に導入して、外来の、治療用の、又は導入遺伝子を細胞、例えば体細胞に注入したり、ベクター導入細胞によって組換えポリペプチドを生産したりできる。

本発明のベクター構造は、当業者に公知の標準的な方法によってin vitro又はex vivoで細胞に導入できる。そのような方法としては、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、培養された細胞へのマイクロインジェクション（Capecchi, Cell 22:479-488 (1980)）、エレクトロポレーション（Shigekawa et al., BioTech.,6:742-751(1988)）、リポソームによる遺伝子注入（Mannino et al., Bio. Tech. 6:682-690 (1988)）、脂質による導入（Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417 (1987)）、及び高速マイクロプロジェクタイルを用いる核酸注入（Klein et al., Nature 327:70-73 (1987)）がある。

In vitro又はex vivo発現には、機能的なタンパク質産物を発現するのに効果的な任意の細胞を用いてもよい。タンパク質発現に用いられる細胞及び細胞株の多数の例が当業界において公知である。例えば、原核細胞及び昆虫細胞を発現に使用できる。さらに、酵母などの真核微生物も用いることができる。原核細胞、昆虫細胞、及び酵母システムにおける組換えタンパク質の発現は一般に当業者には公知であり、本発明の組成物と方法を用いる抗体発現に応用できる。

発現に有用な細胞の例としては、さらに、哺乳類細胞、例えば繊維芽細胞、非ヒト哺乳類からの細胞、例えばヒツジ、ブタ、マウス、及びウシの細胞、昆虫細胞、などがある。哺乳類細胞の具体的な例としては、COS細胞、VERO細胞、HeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、293細胞、NSO細胞、3T3繊維芽細胞、W138細胞、BHK細胞、HEPG2細胞、DUX細胞、及びMDCK細胞、などがある。

宿主細胞は通常の栄養培地を、プロモーターを誘導するのに、形質転換体を選択するのに、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに、適宜修飾して培養される。哺乳類宿主細胞はいろいろな培地で培養される。商業的に入手可能な培地、例えばHam’s 10 (Sigma)、Minimal Essential Medium ((MEM), Sigma)、RPMI 1640 (Sigma)、及びDulbecco’s Modified Eagle’s Medium ((DMEM), Sigma)が、普通、宿主細胞を培養するのに適当である。ある与えられた培地は一般に必要に応じて、ホルモン及び／又はその他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、又は上皮成長因子など）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩）、緩衝液（HEPESなど）、ヌクレオシド（アデノシンやチミジン）、抗生物質、微量元素、及びグルコース又は同等のエネルギー源、で補われる。他の任意の必要なサプリメントも当業者に公知の適当な濃度で含めることができる。ある特定細胞株に適当な培養条件、例えば温度、pH、などは、一般に当業者には公知であり、多くの細胞株の培養に示唆される培養条件は、例えばATCC Catalogueで、http://www.atcc.org/Search Catalogs/AllCollections.cfmにおいてオンラインで利用できる。

ベクターを、いろいろなルートによって（例えば、皮内に、静脈内に、腫瘍内に、脳に、門脈内に、腹腔内に、筋肉内に、膀胱に、など）in vivoで投与して自己プロセシング開裂配列で結合された複数の遺伝子を運搬し、動物モデル又はヒト被験者で二つ以上のタンパク質又はポリペプチドを発現することができる。投与ルートによって、治療タンパク質は局所的に（脳又は膀胱で）効果を発揮するか、全身的に（その他の投与ルート）効果を発揮する。オープンリーディングフレームへの組織特異的なプロモーター5’を用いると、全オープンリーディングフレームがコードするタンパク質又はポリペプチドの組織特異的な発現が得られる。

標的細胞へ導入遺伝子を運ぶ組換えベクターをin vitro、ex vivo、又はin vivoで導入する多様な方法は前に説明しており、当業者には周知である。本発明は、標的細胞に重要な二つ以上のタンパク質又はポリペプチドのコーディング配列を含む組換えベクターを感染させて、そのタンパク質又はポリペプチドを標的細胞で発現させることによる治療方法、ワクチン、及び癌治療法を提供する。

例えば、本発明の組換えベクターのin vivo運搬は、脳、肝臓、血管、筋肉、心臓、肺、及び皮膚など、それだけに限定されないが、多様な器官タイプを標的にすることができる。

ex vivo遺伝子運搬の場合、標的細胞を宿主から取り出し、本発明の組換えベクターと当業者に周知の方法を用いて実験室で遺伝的に修飾する。

本発明の組換えベクターは、上述の形態を含むがそれだけに限定されない通常の投与形態によって投与できる。本発明の組換えベクターは、液体溶液及び懸濁液、微小胞、リポソーム及び注射液又は灌流液など、それだけに限定されない多様な製剤にすることができる。好ましい形態は投与形態と治療用途によって決まる。

本発明の組換えベクター構造をin vivoでの免疫グロブリン生産に用いて得られるいろいろな利点として、長期間の単一ベクター投与と患者における持続した抗体の発現；完全な生物活性を有する抗体又はその断片のin vivo発現；及びヒト細胞で生成された抗体の自然な翻訳後修飾、などがある。

本発明の組換えベクター構造は、更に治療に用いられる組換え抗体のin vitro産生にも有用である。組換えタンパク質産生の方法は当業者に周知であり、本明細書に記載された自己プロセシング開裂部位を含むベクター構造を用いる組換え抗体の発現に利用できる。

ある観点では、本発明は、上述のような発現ベクターを細胞に導入して形質移入された細胞を得ることによって組換え免疫グロブリン又はその断片を生産する方法を提供し、ベクターは5’から3’の方向へ：免疫グロブリン重鎖及び軽鎖又はその断片のコーディング配列と作用可能式にリンクしたプロモーター2A又は2A様配列などの自己プロセシング配列、及び免疫グロブリン重鎖及び軽鎖又はその断片のコーディング配列、を含み、自己プロセシング開裂配列が第一及び第二の免疫グロブリン・コーディング配列の間に挿入されている。与えられたベクター構造で、免疫グロブリン重鎖のコーディング配列又は免疫グロブリン軽鎖のコーディング配列は、2A配列に対して5’である（すなわち、first）ことは理解されるであろう。

関連した観点で、本発明は組換え免疫グロブリン又はその断片を、上述のような発現ベクターを細胞に導入することによって生成する方法を提供し、ベクターはさらに第一及び第二の免疫グロブリン・コーディング配列の間に追加のタンパク質分解開裂部位を含む。好ましい追加のタンパク質分解開裂部位は、コンセンサス配列RXK(R)R(SEQ ID NO：10)を有するフリン開裂部位である。

本発明のある例示的な観点では、細胞へのベクター導入又は投与の後に次のステップの一つ以上が続く：
（１）形質移入された細胞を、免疫グロブリン又はその断片を発現する細胞を選択する条件の下で培養するステップ；
（２）免疫グロブリン又はその断片の発現を測定するステップ；及び
（３）免疫グロブリン又はその断片を集めるステップ。

本発明の別の観点は、組換え免疫グロブリン又はその断片を発現する細胞を提供し、この細胞は二つ以上の免疫グロブリン鎖又はその断片を発現するための発現ベクターを含み、プロモーターが免疫グロブリン鎖又はその断片の第一のコーディング配列、2A又は2A様配列などの自己プロセシング開裂配列、及び免疫グロブリン鎖又はその断片の第二のコーディング配列、と作用可能式にリンクしており、自己プロセシング開裂配列が第一及び第二のコーディング配列の間に挿入されている。関連する観点では、細胞は上述のような発現ベクターを含み、発現ベクターはさらに、第一及び第二の免疫グロブリン・コーディング配列の間に追加のタンパク質分解開裂部位を含む。好ましい追加のタンパク質分解開裂部位はコンセンサス配列RXK(R)R (SEQ ID NO:10)を有するフリン開裂部位である。

抗体産生
本明細書で用いる場合、“免疫グロブリン分子の第一の鎖又はその断片のコーディング配列”とは、抗体又は免疫グロブリンの軽鎖又は重鎖、又はその断片、を含むがそれだけに限定されないタンパク質分子をコードする核酸配列を指す。

本明細書で用いる場合、“免疫グロブリン分子の第二の鎖又はその断片のコーディング配列”とは、抗体又は免疫グロブリンの軽鎖又は重鎖、又はその断片、を含むがそれだけに限定されないタンパク質分子をコードする核酸配列を指す。

抗体又は免疫グロブリンの第一又は第二の鎖又はその断片をコードする配列は、IgG、IgM、IgD、IgE、又はIgAの軽鎖又は重鎖又はその断片を含む。抗体又は免疫グロブリンの鎖又はその断片をコードする配列は、また、IgG、IgM、IgD、IgE、又はIgAの軽鎖又はその断片を含む。抗体分子全体並びにその修飾された又は誘導された形態の遺伝子は、Fab、単一鎖Fv(scFv)及びF(ab’)₂のような断片を含む。抗体及び断片は、動物由来、ヒト−マウス・キメラ、ヒト化、Delmmunized（商標）又は完全にヒト由来であってよい。抗体は、二重特異的であってもよく、二重特異性抗体、クアドローマ（quadroma）、ミニ抗体、ScBs抗体、及びknobs-into-hole抗体を含むがそれだけに限定されない。

抗体自身の産生と回収は当業者に公知のいろいろな仕方で実行できる（Harlow et al., “Antibodies, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Lab, (1988)）。

本発明を実施する場合、組換えDNA技術を用いる抗体又はそのバリアント（アナログ）の産生は、宿主細胞の増殖とコーディング配列の発現に適当な培養条件の下で修飾された組換え宿主細胞を培養することによって達成され得る。発現の成功をモニターするために、抗原に対する抗体のレベルをELISA、RIA、などの標準的方法によってモニターすることができる。抗体は、培養上澄みから当業者に公知の標準的方法によって回収される。これらの抗体の精製された形は、もちろん、標準的な精製方法によって、好ましくはプロテインA、プロテインG、又はプロテインLカラムによるアフィニティー・クロマトグラフィーによって、又は特定な抗原に関して、又は特異性が望まれる抗原の特定エピトープに関しても、容易に調製できる。抗体はまた、通常のクロマトグラフィー、例えばイオン交換又はサイズ排除カラム、を他の技術、例えば硫酸アンモニウム沈殿及びサイズ制限膜濾過、と合わせて用いて精製できる。好ましい発現システムは、生じた抗体が培地又は上澄みに分泌されるようにシグナルペプチドを含むように設計されるが、細胞内の産生も可能である。

ヒトIg遺伝子座で遺伝子組換えされたマウスからの抗原特異的な完全ヒト化モノクローナル抗体の産生と選択は以前に発表されている（Jakobovits A, et al., Advanced Drug Delivery Reviews, Vol.31, pp:33-42(1998);Mendez M, et al., Nature Genetics Vol. 15,pp:146-156 (1997);Jakobovits A,et al., Current Opinion in Biotechnology Vol.6, No.5, pp:561-566(1995);Green L,et al., Nature Genetics Vol.7, N0.1, pp13-21(1994）。

治療用のモノクローナル抗体の高レベルの発現はトランスジェニックヤギのミルクで実証に成功しており、抗原結合レベルは従来の細胞培養技術を用いて産生されるモノクローナル抗体と同等であることが示された。この方法はトランスジェニック動物のミルクにおけるヒト治療タンパク質の生成に基づいており、動物に導入された遺伝情報によってその動物のミルクにヒト治療タンパク質を発現させることが可能になる。一度産生されると、この組換えタンパク質は標準技術によってミルクから効率的に精製できる。例えば、Pollock, D. P. et al., Journal of Immunological Methods, 231:147-157, 1999; and Young, M. W. et al., Res. Immunol. Jul-Aug; 149(6): 609-610, 1998；を参照。トランスジェニック動物からの動物のミルク、卵白、血液、尿、精漿、及びカイコまゆ、は工業規模での組換えタンパク質の生産の源としての可能性が実証された（Houdebin LM, Curr Opin Biotechnology, 13:625-629, 2002; Little M, et al., Immunol. Today, 21(8):364-70, 2000；及びGura T. Nature, 417:584-586,2002）。本発明は、本発明の自己プロセシング開裂部位をコードするベクターを用いて遺伝子組換え抗体又はそのバリアント（アナログ）を発現するトランスジェニック動物発現システムの利用を意図する。

植物における組換えタンパク質の産生も実証に成功しており、アグロバクテリア感染によって形質転換されたコメ、トランスジェニックタバコの種子での組換えヒトGM-CSFの発現、及び植物における単鎖抗体などの抗体の発現、などがあげられるが、それだけに限定されない。例えば、Streatfield SJ, Howard JA, Int J Parasitol. 33(5-6): 479-93, 2003; Schillberg et al., Cell Mol Life Sci. 60(3): 433-45, 2003; Pogue GP et al., Annu Rev Phytopathol. 40: 45-74, 2002; and McCormick AA et al., J Immunological Methods, 278(1-2): 95-104, 2003、参照。本発明は、本発明の自己プロセシング開裂部位をコードするベクターを用いて遺伝子組換え免疫グロブリン又はその断片を発現するトランスジェニック植物発現システムの利用を意図する。

昆虫細胞と組み合わせたバキュロウイルス・ベクター発現システムも、組換えタンパク質の生産のための有力なプラットホームとしての地歩を築きつつある。バキュロウイルス・ベクター発現システムは、培養の容易さ、及び高い発現レベルなど、哺乳類細胞培養に比べて利点があると報告されている。例えばGhosh S et al., Mol Ther. 2002 Jul;6(1):5-11, 2002及びIkonomou L et al., Appl Microbiol Biotechnol.62(1):1-20,2003、参照。本発明はさらに、本発明の自己プロセシング開裂部位をコードするベクターを用いて遺伝子組換え免疫グロブリン又はその断片を発現するバキュロウイルス・ベクター発現システムの利用を意図する。

酵母をベースとするシステムも、本発明の自己プロセシング開裂部位をコードするベクターを用いて遺伝子組換え免疫グロブリン又はその断片を発現するために用いることができる。例えば、Stuart, WD (1997):“ヘテロカリオンで産生される非相同ダイマータンパク質”；米国特許No.5,643,745、これは参照によって明記して本明細書に組み込まれる。

自己プロセシング・ペプチドのコーディング配列を、単独で又はタンパク質分解開裂部位に関する追加のコーディング配列と組み合わせて含む本発明のベクターは、任意のタンパク質発現システムにおいて遺伝子組換え免疫グロブリン又はその断片の発現に利用できることは理解されるであろう。そのいくつかは当業者に公知であり、その例は本明細書に記載されている。当業者は、任意のタンパク質発現システムにおいて使用できるように本発明のベクターを容易に適合させることができるであろう。

本発明の目的は一連の実験によって達成され、以下にそのいくつかを非限定的な実施例として記述する。

AAV 2A発現構造の構成
ラット抗-FLK-1モノクローナル抗体の全長重鎖及び軽鎖と自己プロセシング2A開裂配列をコードするAAVベクターが構成された。抗体重鎖及び軽鎖の可変及び定常領域が、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって親ハイブリドーマ細胞のcDNAからクローン化された。cDNAはQiagenの総RNA精製キットを用いてハイブリドーマ細胞から単離された総RNAから逆転写酵素によって合成された。モノクローナル抗体のヌクレオチド配列は自動配列決定システム（Applied Biosystems）を用いて分析され、コンセンサス配列が複数の独立なPCR反応から得られた配列決定データから得られた。

ラット抗体重鎖、2A配列、及び抗体軽鎖をコードするDNA断片がPCR伸長によってリンクして一緒にされた。人工FMDV 2Aオリゴヌクレオチドが2Aペプチド配列APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:6)に基づいて合成された。重鎖及び軽鎖断片は、それぞれ全長抗体重鎖及び軽鎖をコードするクローニングされたプラスミドから増幅された。PCRの際、Hind III制限エンドヌクレオチダーゼ部位が重鎖の5’-prime端に付加され、Not I部位が軽鎖の3’-prime端に付加された。融合された重鎖−2A−軽鎖DNA断片はHind IIIとNot Iによって消化され、アガロースゲルから精製された。精製されたDNA断片はAAVプラスミドのバックボーンに挿入され、T4 DNAリガーゼを用いてHind IIIとNot Iを隣接させた。抗体重鎖−2A配列−軽鎖の発現を推進するEF1-アルファ・プロモーター又はCAGプロモーターを含むAAV構造が調製された。バリアント形態では、天然のシグナルペプチド（リーダー）が重鎖又は軽鎖に含められ、それぞれ合成された後のポリペプチドの分泌を容易にする。さらに、構造は、高レベルの遺伝子発現を確保するために、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)とポリA配列を含む（図１）。

293T細胞に形質移入されたAAV H2ALプラスミドからのラットIgGの発現
マウスFLK-1に対するモノクローナルIgG抗体の重鎖と軽鎖をコードし、FMDV 2A配列の挿入によってリンクされたAAVベクター構造（AAV H2AL）が、60%コンフルエントな293T細胞に一時的に形質移入された。細胞は、10%胎児ウシ血清、1%L-グルタミン、及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液（Invitrogen）によって補われたIscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM)で育成された。形質移入は、脂質をベースとするトランスフェクション試薬を含み、哺乳類細胞への外来DNAの取り込みを生ずるFuGENE 6トランスフェクション・キット（Roche）を用いて行われた。AAV H2ALプラスミドDNAがトランスフェクション試薬にメーカーの指示に従って混合され、DNA−脂質混合物が細胞培地に加えられた。形質移入された細胞は48又は72時間培養され、上澄みで抗体発現が分析された。mAb濃度がラットIgG ELISA分析（Bethyl Laboratories）を用いて決定された。この分析では、mAb IgGタンパク質がELISAプレート上に固定された抗ラットIgG抗体で捕捉され、標準分析条件を用いてHRPと結合した抗ラットIgG Fc抗体によって検出された。ELISAプレートを現像し、既知のラットIgG 濃度による標準曲線に基づくサンプルのOD読み取り値に基づいてmAb濃度が計算された。ELISA分析の結果は、組換えラットIgG抗体が、2A配列を含むAAVプラスミドで形質移入された293T細胞の上澄みに高レベルで発現されていることを示した。

抗体の生物活性は、VEGF-FLK-1結合分析における中和活性に関して評価された。この分析では、組換えVEGF（血管内皮細胞成長因子、R&D Systemsから）がELISAプレート（Nunc）にコーティングされ、次いで5%ミルクでブロックされた。ラット抗FLK-1抗体は組換えFLK-1-Fc（R&D Systems）と共にいろいろな濃度で前培養された。抗体／FLK-1混合物をELISAウエルに移し、プレートを培養してVEGF-FLK-1結合を行わせた。平衡溶液で洗浄した後、ビオチンを接合したヤギ抗FLK-1抗体を用いて結合したFLK-1を検出し、HRP基質を用いて色を発生させてストレプトアビジン−HRP（PharMingen）によって視覚化させた。

VEGF/FLK-1（リガンド−受容体）結合分析によって、一時的な形質移入の後で293T細胞から発現された抗体が、親ハイブリドーマ細胞によって発現される天然の抗体と同様の完全な生物活性を発揮することがはっきりと示された（図５）。

2A配列を用いて発現された抗体はさらにウエスタン・ブロット分析によって調べられた。一時的に形質移入された293T細胞（AAV H2ALプラスミドで形質移入）の上澄み、又は親ハイブリドーマ細胞の上澄みからのタンパク質が、還元又は非還元条件の下でポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によって分離された。還元ゲルでは、タンパク質サンプルは2 x LDSサンプル・バッファー（Invitrogen）と混合され、煮沸され、プレキャスト12%トリス-グリシンゲル（Invitrogen）にロードされ、トリス-グリシンSDSランニング・バッファーで処理された。非還元ゲルでは、タンパク質サンプルは2 x 天然トリスGlyサンプル・バッファー（Invitrogen）と混合され、プレキャスト12%トリス-グリシンゲル（Invitrogen）にロードされ、トリス-グリシン天然ランニング・バッファー（Invitrogen）で処理された。電気泳動の後、タンパク質は20%メタノールを含むトリス-グリシントランスファー・バッファー中でニトロセルロース膜に移された。膜はブロッキング溶液でブロックされ、HRP接合抗ラットIgGで染色された。膜ブロットはSuperSignal West Chemiliminescence基質キット（Pierce）によって処理され、タンパク質の帯がBiomeフィルム（Kodak）を用いて視覚化された。

ウエスタン・ブロット分析は、親ハイブリドーマ細胞株からの抗体及び形質移入された293T細胞からの抗体は、共に非還元ゲルで約160 kDのバンドとして現れることを明らかにした。このことは、何も他のバンド（例えば、重鎖対軽鎖の比２：１を示す約133 kDのバンド）が見られないことを考えると、2A開裂部位を介して生成された重鎖と軽鎖は重鎖対軽鎖の比１：１で正しく二量体化したことを示している。還元ゲルでは、ハイブリドーマ細胞からの抗体及び形質移入された293T細胞からの抗体は、共に約55kDのバンド（重鎖）と23kDのバンド（軽鎖）として現れた。開裂していない78kDの前駆ポリタンパク質は全く検出されず、2Aペプチドによる開裂が効率的におこなわれたことを示した（図６B）。H2AL構造から発現された抗体の方が、分子量が少し大きいように見えたが、これはおそらく2A配列からのアミノ酸残基が付け加わったためであろう。

これらの結果は、2A配列が“開裂”部位となって293T細胞における翻訳プロセスでIgG分子の二つの鎖の生成を容易にすることをはっきりと示している。キメラH2ALポリタンパク質は自己分解的な開裂を行って、二量体化によって二つの重鎖と軽鎖を有する全長の無傷の抗体（Ig）を生じた。

AAV H2AL構造からのヒト免疫グロブリンの発現
本発明の別の実施例では、AAV H2AL構造を用いてKDRに対するヒト・モノクローナル抗体の重鎖と軽鎖を発現させた。新規ヒト抗-VEGFR2(KDR)mAbの重鎖、2A、及び軽鎖をコードするAAVベクターが、実施例１での説明と同じ戦略によって構成された。AAVベクターは、EF1-アルファ又はCAGプロモーター、WPRE、及びポリA配列を含んでいる。実施例１と同様に、293T細胞にFugen 6キットによってこのAAVプラスミドを形質移入し、形質移入から72時間後に細胞上澄み液を採取した。293T細胞の上澄み液におけるmAbの濃度はBethyl LaboratoriesからのサンドイッチELISA分析を用いて決定された。この分析では、ヒトIgGがELISAプレート上の固定された抗ヒトIgG抗体によって捕捉され、HRPが接合された抗ヒトIgG Fc抗体によって検出された。ウエルに基質溶液を加えた後に色が発現し、mAb濃度が、標準曲線としての既知の濃度のヒトIgGサンプルのOD読み取りに基づいて計算された。

結果は、2A配列によってリンクされたヒト抗体の重鎖と軽鎖をコードするAAVプラスミドの293T細胞への形質移入によって細胞培養上澄みに高レベルの全長抗体が得られることをはっきりと示した（図７）。したがって、2A配列自己開裂によって抗体の重鎖と軽鎖が単一オープンリーディングフレームから生成できる。さらに、重鎖と軽鎖は正しく折り曲げられて分泌される。

プラスミドの流体力学的遺伝子運搬によるヌードマウスにおけるAAV H2ALベクター由来のラット抗-FLK-1 MABの発現

この実験は、FMDV 2A配列によってリンクされるラット抗-FLK-1 mAb重鎖と軽鎖をコードするAAVプラスミドが形質導入されたマウスの血清で高レベルの抗体発現が達成できることを実証するのに役立つ。AAVプラスミドは実施例１と２で説明したように構成され、導入遺伝子の発現はEF1-アルファ・プロモーターによって駆動された。プラスミドはQiagen’s MegaプラスミドDNA精製キットをメーカーの指示に従って用いて精製された。プラスミドDNAは25ug/mlでPBSに溶解され、NCR nu/nuマウスの尾の静脈を介して、10秒以内に1ml/10g体重という流量で流体力学的遺伝子運搬法によって注入された。流体力学的遺伝子運搬は、Zhang et al., Human Gene Ther. 10:1735-1737, 1999 及びLiu et al., Gene Ther., 6:1258-1266, 1999,に記述されている。眼窩洞血液は3、10、及び17日目に採取された。

プラスミドDNA又はPBS対照を注入されたマウスからの血清について、実施例２で説明したようにラットIgGキットを用いて抗体濃度が分析された。ラットmAbの高レベルの発現がマウスの血清で検出された。対照的に、PBSのみを注入された場合はラット抗体は何も存在しなかった（図８）。

さらに、マウス血清で発現された抗体は、実施例２で記述されたようなVEGF-FLK-1結合分析の抗体の中和効果によって測定して、親ハイブリドーマ細胞で発現された抗体と同等の生物活性を保持していた（図９）。

2A配列の開裂効率及びin vivoで発現された抗体の重鎖と軽鎖のモル比率を評価するために、ベクターを注入した又は注入しないマウスの血清からのIgGが、実施例２で記述されたような非変性条件の下で12%トリス-グリシンゲルで分離された。分離されたタンパク質は、実施例２で記述されたようなウエスタン・ブロット手順を用いてニトロセルロース膜に移された。図１０に示されているように、約160 kDにおけるタンパク質バンドがAAV H2ALベクターを注入されたマウスの血清で認められたが、PBSを注入された対照マウスの血清では認められなかった。このサイズは、非変性条件の下で二量体化の後に二つの抗体重鎖と二つの軽鎖から構成されるこの抗体に予測される分子量と合致している。このラットIgGバンドは、一時的に形質移入された293T細胞から2A配列を含む構造（実施例２で記述されたもの）を用いて発現された抗体（IgG）と同じ速さで移動しており、したがって、同じサイズであるが、親ハイブリドーマ細胞から発現されるIgGよりも少し大きい。これはおそらく、2A配列に由来する、又は翻訳後の修飾による、付加的なアミノ酸残基のためであろう。

全体として結果は、単一プロモーターから免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖のcDNAの単一オープンリーディングフレームを駆動するAAVベクターによって、自己プロセシング（2A）開裂配列が二つの鎖の間に設けられていると、全長の機能的抗体が高レベルでin vivoで発現できるということを示している。

自己プロセシング開裂配列は、二つのペプチドの効率的な開裂を促進する。抗体の重鎖と軽鎖は正しく折り曲げられて分泌され、親ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体（mAb）と同じ強い生物活性を有する機能的抗体を形成する。分泌された抗体は二つの重鎖ペプチドの間で正しいホモダイマーを形成し、重鎖と軽鎖の間で、非還元タンパク質ゲルにおける単一バンドで判定して明らかに1 : 1という比のヘテロダイマーを形成する。

AAV HF2ALベクターによって発現される抗体からの2A開裂部位残基の除去

上述したH2AL構造を用いて発現される抗体重鎖は、そのC-末端に、2A又は2A様配列などの自己プロセシング開裂配列から生じて自己開裂の後も残るアミノ酸残基を運搬する。発現システムをさらに最適化するために、第一のポリペプチド、すなわち、この特定構造における抗体重鎖，と2A配列の間にプロテア−ゼ開裂部位を含むベクター構造が構成された。この構造で用いられた開裂部位は、RAKR (SEQ ID NO:11)であった。これはフリン・コンセンサス開裂配列のカテゴリーに属する。予測される開裂はこの開裂部位におけるAとKの間でフリン又はその他のプロテアーゼによって起こる。この構造は、5’から3’の方向へ：CAGプロモーター、抗体重鎖コーディング配列、フリン開裂部位コーディング配列、2A開裂部位コーディング配列、抗体軽鎖コーディング配列、そしてポリA配列、で構成される（CAG HF2AL）（図１１）。

CAG HF2AL構造から抗体を発現させるために、プラスミドDNAはQiagenプラスミドDNA精製キットを用いて精製され、それが、FuGENE 6キット（Roeche）を用いて6ウエルの組織培養プレートで293T細胞に形質移入するために用いられた。次の日、細胞に血清を含まない培地を供給し、48時間後に調整済みの培地が採取された。ある対照実験では、293T細胞に、同じ抗体と2A配列を含むが重鎖と2A配列の間にフリン開裂部位を欠くH2ALプラスミドが形質移入された。第二の対照実験では、293T細胞に、抗体重鎖、フリン開裂部位、及び抗体軽鎖を含むが2A配列を欠くHFLプラスミドが形質移入された。調整済み培地の抗体濃度はELISAによって決定された。図１２に示されているように、HF2AL構造は形質移入された細胞からの上澄みでH2AL構造よりも高い抗体発現レベルを示した。他方、HFL構造が形質移入された293T細胞の上澄みでは、非常に限られた量の抗体しか検出されなかった。

抗体の重鎖から付加的な2Aアミノ酸を除去するためのフリン開裂部位の効率を評価するために、HF2AL及びH2ALが形質移入された細胞の上澄みにおける抗体が還元条件の下で12%トリス-グリシンSDS-PAGEゲルで分離された。分離されたタンパク質はニトロセルロース膜に移され、抗体重鎖のタンパク質バンドがウサギ抗-ラット抗体によって検出された。このウエスタン・ブロット分析は、HF2ALプラスミドから発現された抗体重鎖は、H2AL構造から発現された重鎖よりも小さな、しかし親ハイブリドーマ細胞によって発現された抗体重鎖と同様の分子量で単一バンドとして移動した（図１３）。この結果はHF2AL構造の内部のフリン開裂部位が残っている2A由来のアミノ酸を除去する効率的な手段となることを示唆する。

2A部位及びフリン開裂部位を含むAAVプラスミドによる形質移入後のフリン-/-細胞における抗体の発現

フリンは偏在的なズブチリシン関連のセリン・プロテアーゼであり、ほとんどすべての細胞タイプで発現される。二つの細胞株、LoVoとCHO突然変異型RPE.40、が突然変異のために機能的なフリンを欠いていることが見出された。CAG HF2AL構造（実施例５）で用いられたフリン開裂部位RAKRはフリン並びに同じ系列のプロテアーゼの他の多くのメンバーによって開裂されることを考えて、CAG HF2AL構造から発現された抗体でRAKRの開裂を実際に生ずる酵素を同定するために実験が行われた。フリン開裂部位を有する又は有しないプラスミド（HF2AL又はH2AL）を用いてLoVo細胞に形質移入が行われた。LoVoはヒト結腸癌腫細胞株であり、RXK(R)Rに対するエンド型タンパク質分解活性に不可欠なホモBドメインをカバーする領域におけるヌクレオチドの欠失のために機能的なフリンを何も含まない（Takahashi et al., Biochem. Biophys Res Commun. 195:1019-26 (1993)）。

FuGENE 6キットを用いたLoVo細胞へのHF2AL及びH2ALプラスミドの形質移入の後、組織培養皿から細胞培養上澄みを採取した。実施例２で記述されたように、タンパク質が12%トリス-グリシンSDS-PAGEゲルにおいて還元条件の下で分離され、ウエスタン・ブロット分析で分析された。結果は、HF2ALプラスミドから発現された抗体重鎖が、H2AL構造から発現された重鎖と同様の分子量で、しかし親ハイブリドーマ細胞によって発現された抗体重鎖よりも大きな分子量で移動することを示した（図１４）。この結果は、フリン活性を欠くLoVo細胞では2A開裂部位に由来する付加的なアミノ酸が抗体重鎖のC-末端にとどまることを示し、タンパク質分解酵素フリンが、293T細胞などのフリン含有細胞で発現されたときに抗体からの2A残基の除去を実際に生じている酵素であることを裏付ける。

HF2Aベクターから発現される重鎖のC-末端における2Aペプチド配列からの残留アミノ酸の除去を更に確認するために、抗体重鎖のC-末端断片が質量スペクトル分析によって分析された。ラット抗体重鎖、2A開裂部位に隣接するフリン開裂部位（RAKR）、抗体軽鎖，及び6 hisアミノ酸、を含む発現ベクター（HF2AL 6H）、“His-Tag”と呼ばれる、が構成された。プラスミドは、実施例４で記述されたような流体力学的遺伝子運搬によってマウスに注入された。His-tagされたモノクローナル抗体は、天然の条件の下でマウス血清からニッケル・カラム（Qiagen）を用いて精製された。抗体の重鎖と軽鎖はクーマシーブルーで染色された10% SDS-PAGEゲルにおいて分離された。抗体重鎖バンドはSDS-PAGEゲルから単離され、トリプシン消化の後、質量スペクトル分析が行われた。質量スペクトルのデータは、抗体重鎖のC-末端における2A/フリン配列から由来する二つを除くすべてのアミノ酸の除去を確認した。更に、質量スペクトルとPSD(MS/MS)配列決定分析の組合せを利用することによって、HF2AL構造から発現される抗体重鎖はC-末端配列“SLSHSPGKRA”(SEQ ID NO:14)を有し、これは天然ラットIgG重鎖C-末端アミノ酸プラス二つのフリン開裂部位から由来する付加的なアミノ酸（RA）を有することが示された。

要約すると、我々の研究は、2A配列の5’端に位置するタンパク質に付着した残留2A配列由来アミノ酸は、追加のタンパク質分解開裂部位（すなわち、フリン開裂部位）を2A開裂部位に隣接して導入することにより、タンパク質の発現と分泌の際に効率的に除去されることを示している。2A配列由来アミノ酸の除去によって、そうしなかった場合にin vivoで使用されたときに免疫応答を誘発する可能性がある外来配列を欠く産物が得られる。更に、これらのデータはまた、2Aを含む構造にフリン開裂部位を付加することで、おそらく2A残基が除去されて抗体の分泌が改善されることによって、全体的に改善された抗体発現レベルが得られるということを示唆する。

図１は、実施例１に記述されるような抗体の重鎖と軽鎖をコードするAAV発現カセットを示す。 図２は、ある抗体の重鎖と軽鎖をコードするレンチウイルス発現カセットを示す。 図３は、あるポリタンパク質のバイオ処理の一例を示す概略図であり、H2AL（重鎖−2A配列−軽鎖）構造を用いて全長抗体（免疫グロブリン）が生成される。 図４は、抗-FLK-1 Ig/AAV H2AL（重鎖−2A配列−軽鎖）プラスミドが移入された293T細胞の上澄みにおけるラット抗-FLK-1モノクローナル抗体の発現レベルを示す。 図５は、抗-FLK-1 IgG H2ALプラスミドが移入された293T細胞によって生成される抗-FLK-1モノクローナル抗体の生物活性を示す。 図６AとBは、抗-FLK-1 Ig/AAV H2ALプラスミドの移入の後の293T細胞の上澄みにおけるラット抗-FLK-1抗体（IgG）のウエスタン・ブロット分析の結果を示す。図６Aは、12%天然ゲルを用いたPAGEの結果を示し、図６Bは、12%還元（reducing）ゲルを用いたPAGEの結果を示し、レーン１はハイブリドーマから生成されるIgGを示し、レーン２は293T細胞で2A配列を用いて発現されたIgGを示し、レーン３は273T疑似対照（mock control）である。 図７は、抗-KDR Ig/AAV H2ALプラスミドが形質移入された239T細胞の上澄みにおけるヒト抗-KDRモノクローナル抗体の発現を示す。 図８は、in vivoでの抗-FLK-1 Ig/AAV H2ALプラスミドの流体力学的な遺伝子運搬（流体力学的アプリケーションとも呼ばれる）の後のマウス血清におけるラット抗-FLK-1抗体（IgG）の発現を示す。 図９は、抗-FLK-1 Ig/AAV H2ALプラスミドによるin vivo遺伝子導入（流体力学的アプリケーションによる）の後のマウス血清で発現されたラット抗-FLK-1 IgGの生物活性を示す。 図１０は、12%天然ゲルを用いたPAGEによる抗-FLK-1 Ig/AAV H2AL構造のin vivo遺伝子運搬後のマウス血清におけるラット抗-FLK-1免疫グロブリンのウエスタン・ブロット分析の結果を示すもので、レーン１はハイブリドーマ細胞から発現されたIgGを示し；レーン２はin vitroで2A配列を用いて発現されたIgGを示し；レーン３はin vivo遺伝子運搬後のマウス血清における2A配列を用いて発現されたIgGを示し；レーン４はナイーブ（未使用）マウス血清である。 図１１は、ラット抗-FLK-1抗体の抗体重鎖、フリン開裂部位、2A配列、及び抗体軽鎖、をコードするAAV発現カセット（HF2AL）を示す。 図１２は、AAV HF2AL及びAAV H2ALプラスミドが導入された239T細胞におけるラット抗-FLK-1抗体の発現を示す。 図１３は、HF2AL又はH2ALプラスミドが導入された239T細胞と比べたハイブリドーマ細胞からのラット抗-FLK-1抗体重鎖の相対的な発現を示すウエスタン・ブロット分析の結果を示す。 図１４は、実施例６と７で記述されるH2AL及びHF2AL構造が導入された239T（フリン＋）及びLoVo （フリン−）細胞から発現された抗体重鎖のウエスタン・ブロット特性を示す。

Claims (22)

1. 遺伝子組換え免疫グロブリンの発現のためのベクターであって：
   5’から3’方向へ、免疫グロブリン分子の第一の鎖又はその断片のコーディング配列に作用可能式にリンクされたプロモーター、フリン開裂部位、２Ａ自己プロセシング開裂配列、及び免疫グロブリン分子の第二の鎖又はその断片のコーディング配列を含んで成ることを特徴とするベクター。
2. 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、レンチウイルス・ベクター、レトロウイルス・ベクター、複製可能アデノウイルス・ベクター、複製欠損アデノウイルス・ベクター、及び減弱（gutless）アデノウイルス・ベクター、ヘルペスウイルス・ベクター、及び非ウイルス・プラスミドから成る群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のベクター。
3. 前記2A自己プロセシング開裂配列が口蹄疫ウイルス（FMDV）配列であることを特徴とする請求項１または２に記載のベクター。
4. 前記2A自己プロセシング開裂配列が、SEQID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8およびSEQID NO:9に示される配列からなる群より選択される２Ａ開裂部位をコードすることを特徴とする請求項４に記載のベクター。
5. 前記２Ａ自己プロセシング開裂配列が、APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:6)に示される配列を有する２Ａ開裂部位をコードすることを特徴とする請求項４に記載のベクター。
6. 前記フリン開裂部位が、コンセンサス配列RXK(R)R(SEQ ID NO:10)をコードすることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のベクター。
7. 前記免疫グロブリン分子の前記第一の鎖又はその断片のコーディング配列が免疫グロブリン重鎖をコードすることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のベクター。
8. 前記コーディング配列が免疫グロブリン重鎖の全長コーディング配列であることを特徴とする請求項７に記載のベクター。
9. 前記プロモーターが、伸長因子1-アルファ・プロモーター（EF1a）、ホスホグリセレート・キナーゼ-1プロモーター（PGK）、サイトメガロウイルス即時型（immediateearly）遺伝子プロモーター（CMV）、キメラ肝特異的プロモーター（LSP）サイトメガロウイルス・エンハンサー／チキン・ベータ-アクチン・プロモーター（CAG）、テトラサイクリン応答プロモーター（TRE）、トランスサイレチン・プロモーター（TTR）、シミアンウイルス40プロモーター（SV40）及びCK6プロモーターから成る群から選択されることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載のベクター。
10. さらにシグナル配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のベクター。
11. 前記免疫グロブリン分子の前記第一の鎖又はその断片及び前記免疫グロブリン分子の前記第二の鎖又はその断片のコーディング配列が等モル比で発現されることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載のベクター。
12. 前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターであることを特徴とする請求項２〜５のいずれか１項に記載のベクター。
13. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のベクターで形質移入された宿主細胞。
14. 免疫グロブリン分子又はその断片を産生する方法であって：
    （i）単一宿主細胞に遺伝子組換え免疫グロブリンを発現させるためのベクターを導入するステップ、ここで該ベクターは：
    5’から3’方向へ、免疫グロブリン分子の第一の鎖又はその断片のコーディング配列に作用可能式にリンクされたプロモーター、フリン開裂部位、２Ａ自己プロセシング開裂配列、及び免疫グロブリン分子の第二の鎖又はその断片のコーディング配列を含む；及び
    （ii）該遺伝子組換え免疫グロブリンを該形質転換した単一宿主細胞で発現させるステップ、ここで該免疫グロブリン分子の第一の鎖及び第二の鎖、又はその断片は等モル比で発現される、
    を含む方法。
15. 前記2A自己プロセシング開裂配列が口蹄疫ウイルス（FMDV）配列であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
16. 前記2A自己プロセシング開裂配列が、SEQID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8およびSEQID NO:9に示される配列からなる群より選択される２Ａ開裂部位をコードすることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
17. 前記２Ａ自己プロセシング開裂配列が、APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:6)に示される配列を有する２Ａ開裂部位をコードすることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
18. 前記フリン開裂部位が、コンセンサス配列RXK(R)R(SEQ ID NO:10)をコードすることを特徴とする請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記プロモーターが、伸長因子1-アルファ・プロモーター（EF1a）、ホスホグリセレート・キナーゼ-1プロモーター（PGK）、サイトメガロウイルス即時型遺伝子プロモーター（CMV）、キメラ肝特異的プロモーター（LSP）サイトメガロウイルス・エンハンサー／チキン・ベータ-アクチン・プロモーター（CAG）、テトラサイクリン応答プロモーター（TRE）、トランスサイレチン・プロモーター（TTR）、シミアンウイルス40プロモーター（SV40）及びCK6プロモーターから成る群から選択されることを特徴とする請求項１４〜１８
    のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記ベクターがさらにシグナル配列を含む、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記免疫グロブリン分子の該第一の鎖又はその断片のコーディング配列が免疫グロブリン重鎖をコードすることを特徴とする請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記免疫グロブリン分子の該第一の鎖又はその断片のコーディング配列が免疫グロブリン軽鎖をコードすることを特徴とする請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。

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