JP4717340B2 - ラミニン5産生促進剤 - Google Patents
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Description
Rousselle ら J. Cell Biol.114,567,1991 Fine ら J.Am.Acad.Dermatol.,24,119,1991 Aberdam ら,Nat. Genet. 6,299,1994 Schmidhauser ら,Proc. Natn. Acad.U.S.A., 87,9118,1990 Schmidhauser ら,Proc. Natn. Acad.U.S.A., 87,9118,1990 Lavker ら,J. Invest. Dermatol., 73,59,1979 azquez, Maturitas,25,209,1996
本発明に従う大豆由来の調製物とは、それらがヒト表皮角化細胞におけるラミニン5の産生能を亢進(または向上)せしめる活性を有するものを全て包含する。したがって具体的には、大豆由来の調製物としては大豆の粉砕物それ自体であってもよいし、さらに粉砕物から適当な溶媒で抽出して得られる抽出物が挙げられる。かような抽出物には、限定されるものでないが、含水低級アルコール、低級アルコール、低級アルキルケトン、低級アルキルエーテル、多価アルコールおよびこれらの2種以上の混合溶媒を用いて抽出されたものを挙げることができる。
ラミニン5の産生能の測定試験:
(1) 表皮角化細胞の培養
表皮角化細胞はヒト包皮より単離し、カルシウム濃度の低い表皮角化細胞増殖培地(KGM)にて培養した。この培地には牛脳下垂体抽出液とEGFを添加した。細胞は第4代までKGMで培養後、トリプシ−EDTA処理によって接着細胞を浮遊させ、ろ過によって細胞のアグリゲートを除き、均一な細胞懸濁液を得た。遠心分離によって細胞を集め、DMEM−F12(2:1)−0.1%BSAに8×104/mlとなるように再懸濁させた。この細胞懸濁液を0.5ml、2倍濃度の薬剤を含む同培地0.5mlに加えた。培養は24穴プレートを用いて、37℃にて24時間行った。培養終了時に、培養上清をエッペンドルフチューブに移し、15000rpm5分間遠心分離し、上清を新たなチューブに移し、ラミニン5の測定の日まで−20℃に保存した。細胞内と培養プラスチック上に結合したラミニン5を可溶化するため、各種の界面活性剤を含むトリス塩酸緩衝液pH7.4を各穴に添加し、一晩−20℃に保存した。翌日、超音波処理を行い、再度凍結した。翌日、再度溶解後、15000rpm5分間遠心分離し、上清をチューブに移し、ラミニン5の測定の日まで−20℃に保存した。
培養上清、細胞層に存在するラミニン5はサンドイッチELISA法にて測定した。96穴ELISAプレートの固層にラミニン5のラミニンα3鎖に対するモノクローナル抗体、BM165、を結合させた。ラミニン5をサンドイッチして測定するため、もう一種の抗体としてラミニンβ3鎖に対するモノクローナル抗体である6F12を予めビオチン化(b−6F12)して用いた。本法では、機能を発揮しうるヘテロトリマー体(α3β3γ2)のみを測定し、ヘテロダイマー(β3γ2)を検出しない。b−6F12を含む3%ゼラチン・リン酸緩衝溶液を予め入れておいた各穴に試料を添加する。試料の穴内での最終希釈率は培養液が1/4、細胞層が1/10とした。抗原抗体反応は37℃2時間行い、洗浄した後、アビヂンHRP(ホースラディシュパーオキシダーゼ)溶液を添加し、更に、30分から1時間反応させた。洗浄後、HRPの基質であるABTS溶液を加え、405nmの吸光度をELISAプレートリーダーを用いて測定した。検量線は0〜40ng/mlの範囲で作成した。
結果を下記表1に示す。
ポリオキシエチレン(20モル付加)セチルアルコールエーテル 1.0
メチルフェニルポリシロキサン(20cs) 2.0
流動パラフィン 3.0
2−ヒドロキシ−4−メトキシベンゾフェノン 5.0
大豆サポニン(サポニン、大豆製:和光純薬(株)製) 0.2
プロピレングリコール 5.0
グリセリン 2.0
エチルアルコール 15.0
カルボキシビニルポリマー 0.3
ヒドロキシプロピルセルロース 0.1
2−アミノメチルプロパノール 0.1
防腐剤 適量
香料 適量
イオン交換水 適量
(製造方法)
イオン交換水に、プロピレングリコール、グリセリン、エチルアルコール、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルセルロース、2−アミノメチルプロパノールを加え70℃に加熱調整する(水相)。
処方例2:クリーム
ポリオキシエチレン(20モル付加)セチルアルコールエーテル 1.0
メチルフェニルポリシロキサン(20cs) 2.0
流動パラフィン 3.0
2−ヒドロキシ−4−メトキシベンゾフェノン 5.0
大豆レシチン(レシチン、大豆製:和光純薬(株)製) 0.2
プロピレングリコール 5.0
グリセリン 2.0
エチルアルコール 15.0
カルボキシビニルポリマー 0.3
ヒドロキシプロピルセルロース 0.1
2−アミノメチルプロパノール 0.1
防腐剤 適量
香料 適量
イオン交換水 適量
(製造方法)
イオン交換水に、プロピレングリコール、グリセリン、エチルアルコール、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルセルロース、2−アミノメチルプロパノールを加え70℃に加熱調整する(水相)。
Claims (3)
- 大豆の抽出物を有効成分とするラミニン5産生促進剤。
- 大豆の抽出物が、含水低級アルコールを用いて大豆粉砕物から抽出される請求項1記載の産生促進剤。
- 大豆の抽出物が、大豆サポニン画分もしくは大豆レシチン画分またはそれらの混合物である請求項1記載の産生促進剤。
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2003
- 2003-11-07 JP JP2003378742A patent/JP4717340B2/ja not_active Expired - Lifetime
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