JP4653079B2 - 精製手段 - Google Patents
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Description
(A)n−C
式I
式中、Aは捕獲部分(capture moiety)であり、
nは1以上、例えば、1、2、3または4であり、
Cは、式IIまたは式IIAで表されるペプチド結合部分であり、
Cが式IIAで表されるペプチド結合部分である場合、R2およびR3の一方、好ましくはR2は、前記結合部分をAに連結するリンカー部分Bであり、R2およびR3のもう一方、ならびにR1、R4、R5、R6、R7およびR8は、それぞれ独立に、Hまたは任意のC1〜6アルキル基である。
a)本発明の第1の態様によるタグ分子をアミノ酸のN末端基に結合させるステップと、
b)ステップ(a)で形成されたタグ付きアミノ酸をペプチドとカップリングさせるステップと、
を含む、ペプチドの精製を容易にするためにペプチドを修飾する方法を提供する。
a)本発明の第2の態様によるタグ付きペプチド、または本発明の第3、第6もしくは第7の態様に従って調製されるタグ付きペプチドを含むサンプルを提供するステップと、
b)前記サンプルを、捕獲部分が親和性を有する捕獲受容体と接触させるステップと、
c)非結合分子を、例えば洗浄によって除去するステップと、
d)場合によって、捕獲受容体から結合したタグ付きペプチドを取り外すステップと、
e)ペプチドをタグ分子の結合部分から開裂するステップと、
を含む、ペプチドの精製方法が提供される。
a)本発明の第2の態様によるタグ付きペプチド、または本発明の第3、第6もしくは第7の態様に従って調製されるタグ付きペプチドを提供するステップと、
b)このタグ付きペプチドを、捕獲部分が親和性を有する捕獲受容体と接触させるステップと、
c)このタグ付きペプチドを、捕獲部分と捕獲受容体との相互作用によって表面に結合させることを可能にするステップと、
を含む、表面上でペプチドを実質的に均一な方向に空間的に配向させる方法が提供される。
a)本発明の第1の態様による分子タグ、または本発明の第5の態様によるタグ付きアミノ酸と、
b)分子タグの捕獲部分と結合することができる捕獲受容体と、
を含む。
捕獲部分は、対応するリガンド結合分子に結合する任意の適切なリガンドを含むことができる。本出願において、文脈上別の意味が要求されるのでない限り、リガンドには、ハプテン、抗体および親油性分子が含まれ得るが、それだけには限定されない。好ましくは、リガンドおよび対応するリガンド結合分子は互いに結合特異性を有する。こうした結合対のメンバーは、天然物に由来するものでもよく、あるいは完全または部分的に合成による生成物でもよい。1対の分子のメンバーの一方は、その表面上に、突起または空隙となり得る領域を有することができ、具体的には1対の分子のメンバーのもう一方と結合し、したがって1対の分子のうちのもう一方のメンバーの特定の空間および極性構成と相補的である。したがって、対になっているメンバーは、互いに特異的に結合する性質を有し得る。
前記結合部分は、式IIIで表される構造の中央のフェニル基の5位に位置するリンカー部分に連結される。
捕獲部分の選択は、タグ分子が一緒に使用されると想定されている捕獲受容体に基づいて当業者によって決定される。捕獲受容体は、捕獲部分がそれと相互作用でき、タグ付きペプチドをタグの付いていない他のペプチドから分離するのに使用できる、どんな分子、構造または表面も包含する。
本発明のタグ分子の具体的な利点は、タグ分子に結合したペプチドを、ペプチドに損傷を与えずに容易に開裂でき、このペプチドを容易に精製し回収するのが可能なことである。通常、開裂は、水性アセトニトリル中20%ピペリジン、または水性アセトニトリル中20%ピペリジンと1%DBUなどの塩基性条件を使用して実現することができる。
6−(ジ−(2−ピコリル)アミン)−ヘキサノイル[2−(2−ヒドロキシ−エタンスルホニル)−5−ニトロ−フェニル]−アニリド [DPHSA]の合成を図1に示す。簡潔に述べると、タグDPHSAは、6−ブロモヘキサン酸から6ステップで調製され、まずKOH水溶液で滴定した後にカリウム塩を形成する。次いで、凍結乾燥した塩を塩化チオニルと反応させて酸塩化物2を形成し、これをその場で熱トルエン中2−クロロ−5−ニトロアニリンと反応させてブロモアニリド4を形成した。カルボン酸の活性エステルを経る直接アミド形成(例えば、DIC、HOBtで処理)はうまくいかないことが分かった。ジ−(2−ピコリル)アミンの4によるアルキル化は、アセトニトリル中DIEAと還流することによって実施した。炭酸カリウムや水素化ナトリウムなど他の塩基を使用すると、複雑な副生成物が生じた。5のスルファニル化は、β−メルカプトエタノールと反応させ、過酸化水素水との穏やかな反応によって選択的に酸化させてスルホン7にすることによって実施した。室温条件でH2O2を少量ずつ加え、触媒を注意して選択することにより、ピリジンのN酸化物への過酸化を回避した。
DHPSAでタグを付けたペプチドの合成経路を図2Aに示す。
凍結乾燥した粗ペプチドを、緩衝液1(8M尿素、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris−Cl、pH 6.5)に溶解し、捕獲樹脂(capture resin)(NTAで連結されたNi2+(またはZn2+)を含有するアガロース)と一緒に撹拌する。
DPHSAを使用してタグ付きアミノ酸を精製するのに使用した、図1および図2Aに示したのとは別の経路を、図3に示す。
図4は、例としてグリシンを使用してアミノ酸/ペプチドにタグを付けるのに、ヘキサヒスチジンタグを使用する本発明の態様を示す。Fmocプロトコルを用いた標準的な固相ペプチド合成を使用して、側鎖16上にトリチル保護基を備える、樹脂に結合したヘキサヒスチジンを形成する。これを、N末端が修飾されたアミノ酸t−ブチルエステル(例えば、グリシン15)とカップリングさせる。95%TFAでの処理により、タグ付きアミノ酸が樹脂から開裂され、同時に側鎖トリチル基およびt−ブチルエステルが開裂されて、18が形成される(18は必要に応じてHPLCによって精製することができる)。弱酸性条件中での酸化により、目的分子19が得られる。次いで、ヘキサヒスチジングリシンタグを、標準的なアミド結合法(例えば、DIC、HOCt、DMF)によってペプチドまたはタンパク質のN末端に直接結合させる。
3,5−(ジフェナントレン−9−イル)−ベンゾイル[2−(2−ヒドロキシ−エタンスルホニル)−5−ニトロ−フェニル]−アニリド [DPBSA]の合成を図6に示す。簡潔に述べると、タグDPBSAは、9−ブロモフェナントレン27から、まず対応するボロン酸28を形成し、3,5−ジブロモ安息香酸とパラジウムカップリングさせることによって、5ステップで調製される。酸塩化物29を、2−クロロ−5−ニトロアニリン3と速やかに反応させて、アミド30を形成する。スルファニル化は、β−メルカプトエタノールと反応させ、過酸化水素水との穏やかな反応によって選択的に酸化させてスルホン32を形成することによって実施する。
DPBSAを、活性物質、例えば、ホスゲン、炭酸ビス(4−ニトロフェニル)、炭酸ビス(ペンタフルオロフェニル)または炭酸N,N’−ジスクシンイミジルと塩基性条件下で反応させて、実施例2で述べたものと類似した反応性部分中間体を形成する。
疎水性捕獲部分、3−(アントラセン−9−イル)−プロピオニル、式IIIA、および3−(アントラセン−9−イル)−2−(アントラセン−9−イルメチル)−プロピオニル、式IIIBを、ペプチド用の化学タグとして使用した。捕獲部分の疎水性が、逆相HPLCシステムでの物質Pの保持時間を増大させることが分かった。それはまた、365nmで特有のUV吸収をもたらし、タグ付きペプチド種が簡単に識別できるようになる。
ヘキサヒスチジンタグ付きのフルオレニルメタノールタグの合成を図8に示す。フルオレニルメタノール33をニトロ化し、アルコールを、例えばシリル基で保護する。ニトロ基を還元してアミン35を形成し、グルタル酸無水物と反応させて酸36を形成する。次いで、この酸を、樹脂に結合したヘキサヒスチジン(側鎖上にトリチル保護基を持つ)とカップリングさせ、95%TFAで処理し、同時に樹脂と側鎖を開裂することによって最終的なタグ38を調製する。
Claims (31)
- 式Iで表されるタグ分子であって、
(A)n−C
式I
式I中、
Aは、捕獲部分であり、
nは、1、2、3または4であり、
Cは、式IIで表されるペプチド結合部分であり、
前記捕獲部分が、
(i)金属結合部分、
(ii)式IIIで表される疎水性部分、
または
(iii)式IIIAで表される環状構造を含む疎水性部分
である、タグ分子。 - 前記捕獲部分が、(i)金属結合部分である、請求項1に記載のタグ分子。
- 前記金属結合部分が、ポリヒスチジン、イミノ二酢酸(IDA)、ニトロロ三酢酸(NTA)、8−ヒドロキシキノリン、O−ホスホセリン基および1又は2以上のピリジル基からなる群より選択される、請求項2に記載のタグ分子。
- 前記金属結合部分が、ピリジル基である、請求項3に記載のタグ分子。
- 前記捕獲部分が、少なくとも1個の2−ピリジル基を含む、請求項4に記載のタグ分子。
- 前記捕獲部分が式Vで表される、請求項5に記載のタグ分子。
- 式VIで表される、請求項6に記載のタグ分子。
- 前記捕獲部分が、(ii)式IIIで表される疎水性部分である、請求項1に記載のタグ分子。
- 式IVで表される、請求項8に記載のタグ分子。
- 前記捕獲部分が、(iii)式IIIAで表される環状構造を含む疎水性部分である、請求項1に記載のタグ分子。
- 前記捕獲部分が、式IIIBで表される環状構造を含む疎水性部分である、請求項10に記載のタグ分子。
- 前記電子吸引基が、I、Br、Cl、NO 2 、CF 3 およびSO 2 Meからなる群より選択される、請求項1〜11のいずれか一項に記載のタグ分子。
- 前記電子吸引基が、NO 2 である、請求項12に記載のタグ分子。
- 前記リンカー部分Bが、アミド、アミン、エーテル、エステル、ヒドラジド、ケトンまたはイミン基を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載のタグ分子。
- ペプチド分子に結合した請求項1〜14のいずれか一項に記載のタグ分子を含む、タグ付きペプチド。
- 前記ペプチドが、カルバメート結合を介して前記タグ分子に結合し、式IIBで表される、請求項15に記載のタグ付きペプチド。
- ペプチド分子にタグを付ける方法であって、
式IIのヒドロキシ基が反応性部分で置換されている請求項1〜14のいずれか一項に記載のタグ分子を提供するステップと、置換されているタグ分子をペプチド分子と反応させるステップと、を含み、
前記反応性部分が、式VIIで表される部分であるか、
または、
前記反応性部分が、カルボニルジオキシ部分を含む、
方法。 - 前記ハロゲンがClである、請求項17に記載の方法。
- ペプチドの精製を容易にするためにペプチドを修飾する方法であって、ペプチド鎖の合成中にペプチド鎖の末端に請求項1〜14のいずれか一項に記載のタグ分子を結合させるステップを含む方法。
- アミノ酸に結合した請求項1〜14のいずれか一項に記載のタグ分子を含む、タグ付きアミノ酸。
- 前記アミノ酸が、カルバメート結合を介して前記タグ分子に結合し、式IICで表される、請求項20に記載のタグ付きアミノ酸。
- アミノ酸にタグを付ける方法であって、
a)式IIのヒドロキシ基が反応性部分で置換されている請求項1〜14のいずれか一項に記載のタグ分子を提供するステップと、b)置換されているタグ分子をアミノ酸のN末端と反応させるステップと、を含み、
前記反応性部分が、式VIIで表される部分であるか、
または、
前記反応性部分が、カルボニルジオキシ部分を含む、
方法。 - 前記ハロゲンがClである、請求項22に記載の方法。
- c)前記アミノ酸を別のアミノ酸またはペプチド分子と結合させるステップ、をさらに含む、請求項22または23に記載の方法。
- 前記置換されているタグ分子が、タグ分子を、ホスゲン、炭酸ビス(4−ニトロフェニル)、炭酸ビス(ペンタフルオロフェニル)または炭酸N,N’−ジスクシンイミジルと、適切な条件下で反応させることによって形成される、請求項17、22または24に記載の方法。
- ペプチドの精製を容易にするためにペプチドを修飾する方法であって、
a)請求項1〜14のいずれか一項に記載のタグ分子をアミノ酸のN末端に結合させるステップと、
b)ステップ(a)で形成されたタグ付きアミノ酸をペプチド分子に結合させるステップと、
を含む方法。 - ペプチドの精製方法であって、
a)請求項15もしくは16に記載のタグ付きペプチド、または請求項17、19、24もしくは26のいずれか一項に記載の方法に従って調製されるタグ付きペプチドを含むサンプルを提供するステップと、
b)前記サンプルを、前記捕獲部分が親和性を有する捕獲受容体と接触させるステップと、
c)非結合分子を、除去するステップと、
d)場合によっては、結合したタグ付きペプチドを捕獲受容体から取り外すステップと、
e)ペプチドをタグ分子の結合部分から切り離すステップと、
を含む方法。 - 表面上でペプチドを均一な方向に空間的に配向させる方法であって、
a)請求項15もしくは16に記載のタグ付きペプチド、または請求項17、19、24もしくは26のいずれか一項に記載の方法に従って調製されるタグ付きペプチドを提供するステップと、
b)ステップa)のタグ付き分子を、前記捕獲部分が親和性を有する捕獲受容体と接触させるステップと、
c)前記タグ付き分子を、前記捕獲部分と前記捕獲受容体との相互作用によって表面に結合させるステップと、
を含む方法。 - 前記表面がマルチウェルプレートの表面である、請求項28に記載の方法。
- ペプチドの検出用または精製用の診断キットであって、
a)請求項1〜14のいずれか一項に記載のタグ分子、または請求項20もしくは21に記載のタグ付きアミノ酸と、
b)前記タグ分子の前記捕獲部分と結合できる捕獲受容体と、
を含むキット。 - 式Iで表されるタグ分子であって、
(A) n −C
式I
式I中、
Aは、捕獲部分であり、
nは、1、2、3または4であり、
Cは、式IIDで表されるペプチド結合部分であり、
(a)Yがハロゲンである、式VIIで表される部分、
(b)カルボニルジオキシ部分を含む反応性部分、
であり、
R 1 およびR 3 は、それぞれ独立に、H、任意のC 1〜6 アルキル基または電子吸引基であり、R 2 は、Hまたは任意のC 1〜6 アルキル基であり、R 4 およびR 5 の一方は、前記結合部分をAに連結するリンカー部分Bであり、R 4 は、リンカー部分Bでない場合は、Hまたは任意のC 1〜6 アルキル基であり、R 5 は、リンカー部分Bでない場合は、電子吸引基、Hまたは任意のC 1〜6 アルキル基であり、R 1 、R 3 およびR 5 のうちの少なくとも一つは電子吸引基であり、
前記捕獲部分が、
(i)金属結合部分、
(ii)式IIIで表される疎水性部分、
または
(iii)式IIIAで表される環状構造を含む疎水性部分、
である、タグ分子。
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