JP4558045B2 - アレルギー疾患の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法 - Google Patents

Description

本発明は、アレルギー疾患の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法、及びアレルギー疾患の治療に用いられる医薬組成物に関する。より詳しくは、インタール（登録商標、以下同じ）が抗アレルギー剤としての有効性を発揮する場合にターゲットとなる分子（以下、ターゲットという）を同定し、該ターゲットを用いてアレルギー疾患の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法に関する。

ヒトゲノムの塩基配列が解読されるのに伴い、研究の対象はゲノム創薬、創薬ターゲットの探索及び／又は同定へと移行している。その中で、抗アレルギー剤であるインタールのターゲットの同定も、研究対象の一つとして注目されている。
インタールは、抗原抗体反応に伴って起こるマスト細胞からのヒスタミンやＳＲＳ−Ａ等の化学伝達物質の遊離（すなわち、脱顆粒）を抑制する作用を有すること等が知られている（例えば、治療薬マニュアル２００４，医学書院，ｐ３０１参照）。
これまで、その作用メカニズムに関しては、ホスホリパーゼＡ刺激によるヒスタミン等の分泌を阻害するメカニズム（例えば、Ｏｒｒ ＴＳ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，１９６９，２２３（２０２），ｐｐ．１９７−１９８）；カルシウムチャンネルを担うタンパク質が関与するメカニズム（例えば、Ｍａｚｕｒｅｋ Ｎ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ．，１９８４，８１（２１），ｐｐ．６８４１−６８４５）；細胞内タンパク質のリン酸化酵素が関与するメカニズム（例えば、Ｔｈｅｏｈａｒｉｄｅｓ ＴＣ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８０，２０７（４４２６），ｐｐ．８０−８２）等が報告されている。
しかし、上記のような多大な努力にもかかわらず、インタールが直接作用し、かつその薬理活性を十分に説明し得るターゲットの同定は、未解決な問題であった。
そのため、インタールの効果を超える又はその代替となる医薬の創出は困難を極めてきた。このことから、該医薬を創出するために、インタールと同様の作用メカニズムおよび薬理活性を有する化合物をスクリーニングする効率的な方法の開発が必要とされている。

本発明は、インタールが抗アレルギー剤としての有効性を発揮する場合にターゲットとなる分子を同定し、該ターゲットを用いてアレルギー疾患の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法、ならびに該スクリーニングによって得られ得る化合物を有効成分として含む新しいタイプのアレルギー疾患治療用の医薬組成物を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく、インタールが特異的に結合するタンパク質の探索を行い、その結果、中間径フィラメントの一種であるＶｉｍｅｎｔｉｎが、インタールに特異的に結合することを見出した。このＶｉｍｅｎｔｉｎは、そのヘッド部分に、ｃｄｃ ２ ｋｉｎａｓｅ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＣａＭＫ ＩＩ、Ｒｈｏ ｋｉｎａｓｅ等によって位置特異的にリン酸化されるＳｅｒ残基が存在することが知られている（例えば、シグナル伝達、ｐｐ．２３５−２４１）。このことから、本発明者らは、Ｖｉｍｅｎｔｉｎのリン酸化が、脱顆粒における細胞内シグナル伝達に関与すると考え、さらに鋭意研究して、Ｖｉｍｅｎｔｉｎを用いてアレルギー疾患の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法を開発し、本発明を完成するに至った。
即ち本発明は下記の通りである：
〔１〕試験化合物が、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片に特異的に結合するか否かを判定する工程を含む、アレルギー疾患の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法。
〔２〕アレルギー疾患の治療に有用な化合物をスクリーニングする為の方法であって、以下の工程を含む方法；
（１）Ｖｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片を試験化合物に接触させる工程、
（２）該試験化合物が、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片に特異的に結合するか否かを判定する工程、及び
（３）上記（２）の工程においてＶｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片に特異的に結合する試験化合物を選択する工程。
〔３〕アレルギー疾患の治療に有用な化合物をスクリーニングする為の方法であって、以下の工程を含む方法；
（１）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその機能的断片を試験化合物に接触させる工程、
（２）該試験化合物が、該タンパク質又はその機能的断片に特異的に結合するか否かを判定する工程、及び
（３）上記（２）の工程において該タンパク質又はその機能的断片に特異的に結合する試験化合物を選択する工程。
〔４〕アレルギー疾患の治療に有用な化合物をスクリーニングする為の方法であって、以下の工程を含む方法；
（１）配列番号２のアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸を欠失、置換又は付加してなるアミノ酸配列を有し、以下の化合物と結合する、という特徴を有するタンパク質又はその機能的断片を試験化合物に接触させる工程、

（２）該試験化合物が、該タンパク質又はその機能的断片に特異的に結合するか否かを判定する工程、及び
（３）上記（２）の工程において該タンパク質又はその機能的断片に特異的に結合する試験化合物を選択する工程。
〔５〕上記〔１〕〜〔４〕の何れか１項に記載のスクリーニング方法によって得られるアレルギー疾患の治療に有用な化合物。
〔６〕Ｖｉｍｅｎｔｉｎと特異的に結合する化合物を有効成分として含有する医薬組成物。
〔７〕Ｖｉｍｅｎｔｉｎの発現を制御する化合物を有効成分として含有する医薬組成物。
〔８〕Ｖｉｍｅｎｔｉｎの活性を制御する化合物を有効成分として含有する医薬組成物。
〔９〕アレルギー疾患の治療用である、上記〔６〕〜〔８〕の何れか１項に記載の医薬組成物。
〔１０〕式（Ｉ）で表される化合物又はその医薬上許容される塩：

［式中、Ｒ_１は、置換されていてもよい２価の炭化水素であり；
Ｒ_２およびＲ_２ ^，は、同一または異なって、カルボン酸、アミドもしくはエステル（これらは、低級アルキルで置換されていてもよい）、またはテトラゾールであり；
Ｑ_１およびＱ_１ ^，は、同一または異なって、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＣＨ_２であり；
Ｑ_２およびＱ_２ ^，は、同一または異なって、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＨ、Ｃ＝ＮＯＨ、Ｃ＝ＮＯＲ_３、Ｏ、アルキレンまたはＮＨであり；
Ｘは、ＣＨ_２、Ｏ、Ｓ、ＮＨまたはＮＲ_３（ここで、Ｒ_３は、置換されていてもよいアルキルまたはシクロアルキルである）である］
ただし、以下の化合物を除く：

〔１１〕上記〔１０〕記載の化合物又はその医薬上許容される塩を含有する、アレルギー疾患の治療剤。
本発明は、Ｖｉｍｅｎｔｉｎを用いてアレルギー疾患の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法、ならびに該スクリーニングによって得られ得る化合物を有効成分として含む新しいタイプの抗アレルギー剤を提供する。

図１は、実施例２における結合実験の結果を示す図であり、インタールとＶｉｍｅｎｔｉｎとの特異的な結合を示すものである。

以下、本発明の内容を詳細に説明する。
本明細書において、「核酸分子」とは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡのことを意味する。本明細書において、「ヌクレオチド配列」とは、特に言及しない限り、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴで表す）の配列、またはリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵで表す）の配列を意味する。本明細書中において、特に言及しない限り、一本鎖ヌクレオチド配列は、左端が５’末端、右端が３’末端を表す。
本明細書において、特に言及しない限り、アミノ酸の表記は、アミノ酸に関する標準的な表記である１文字略号または３文字略号を使用する。本明細書において、特に言及しない限り、アミノ酸配列は、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）を表す。
本明細書において、スクリーニングの標的タンパク質として用いる「Ｖｉｍｅｎｔｉｎ」とは、好ましくは、ヒト由来のＶｉｍｅｎｔｉｎを意味する。ヒトＶｉｍｅｎｔｉｎとしては、例えば、ＧｅｎＰｅｐｔ登録番号ＡＡＡ６１２７９（配列番号２）に表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質が例示されるが、インタールと特異的に結合し得る（即ち、インタールのターゲットとしての役割を果たし得る）限り、配列番号２のアミノ酸配列において、１又は２以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸を欠失、置換、及び／又は付加してなるアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
あるいは、ヒトＶｉｍｅｎｔｉｎとしては、例えば、配列番号２のアミノ酸配列と、６０％以上、７０％以上、８０％以上、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列で表わされるタンパク質であり、かつ、インタールと特異的に結合し得るタンパク質が挙げられる。
本明細書において、「相同性」とは、二つのポリペプチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものである。二つのポリペプチド配列間の相同性を測定する方法は数多く知られており、「相同性」（「同一性」とも言われる）なる用語は、当業者には周知である。例えば、二つの配列の相同性を測定するのに用いる一般的な方法には、Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ（Ｅｄ．），Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，（１９９４）；Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）等に開示されている方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
相同性を測定するための好ましい方法としては、試験する二つの配列間の最も大きな適合関係部分を得るように設計したものが挙げられる。このような方法は、コンピュータープログラムとして構築されているものが挙げられる。二つの配列間の相同性を測定するための好ましいコンピュータープログラム法としては、ＧＣＧ プログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ等が挙げられるが、これらに限定されるものでなく、当該分野で公知の方法を使用することができる。
さらに、本発明においてスクリーニングの標的タンパク質として用いる「Ｖｉｍｅｎｔｉｎ」は、インタールと特異的に結合するという特徴を有する限り、Ｖｉｍｅｎｔｉｎの任意の断片であってもよい（以下、このような断片を、「機能的断片」ともいう）。
Ｖｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片が、インタールと特異的に結合するか否かを確認するためにインタールが使用され得る。インタールは、商業的に入手可能であり、また、公知技術に従って製造することもできる。
本明細書において、「特異的に結合する」とは、例えば、アゴニストあるいはアンタゴニストに対する特異的受容体、基質に対する酵素［例えば、ＦＫ５０６（リガンド）に対するＦＫ５０６結合タンパク質（ターゲット分子）、ステロイドホルモンに対するステロイドホルモン受容体（例えば、ｄｅｘａｍａｔｈａｓｏｎとｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、抗がん剤ｔｒａｐｏｘｉｎに対するＨＤＡＣ］等の関係として例示されるものであり、競合実験等により、Ｋｄ、Ｋａ等の数値として確認することができる。また、特異的な結合は、上記のような具体的数値として表わす以外に、電気泳動法等の視覚的手段により確認することもできる。
本発明はまた、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ及びその機能的断片に特異的に結合する化合物を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。
Ｖｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片に結合し得る化合物は、インタールと同様に、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えば、サル、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、モルモットなど）に対して、優れた抗アレルギー作用を有し得る。従って、本発明の医薬組成物は、種々のアレルギー性疾患（例えば、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、花粉症等）の治療剤として有用である。
さらに、Ｖｉｍｅｎｔｉｎの発現や活性を直接的または間接的に制御する化合物もまた、アレルギー性疾患の治療に有用であり得る。
Ｖｉｍｅｎｔｉｎの発現や活性を制御する化合物または物質としては、例えば、ＶｉｍｅｎｔｉｎをコードするＤＮＡ、ＶｉｍｅｎｔｉｎをコードするＤＮＡが挿入されたベクター、Ｖｉｍｅｎｔｉｎタンパク質等が挙げられる。
Ｖｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片に結合し得る化合物としては、例えば、以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその医薬上許容され得る塩（以下、まとめて「化合物（Ｉ）」ともいう）が挙げられる。

［式中、Ｒ_１は、２価の炭化水素であり；
Ｒ_２およびＲ_２ ^，は、同一または異なって、カルボン酸、アミドもしくはエステル（これらは、低級アルキルで置換されていてもよい）、またはテトラゾールであり；
Ｑ_１およびＱ_１ ^，は、同一または異なって、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＣＨ_２であり；
Ｑ_２およびＱ_２ ^，は、同一または異なって、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＨ、Ｃ＝ＮＯＨ、Ｃ＝ＮＯＲ_３、Ｏ、ＣＨ_２またはＮＨであり；
Ｘは、ＣＨ_２、Ｏ、Ｓ、ＮＨまたはＮＲ_３（ここで、Ｒ_３は、置換されていてもよいアルキルまたはシクロアルキルである）である］
上記「２価の炭化水素基」としては、例えば「２価の非環式炭化水素基」、「２価の環式炭化水素基」、または１種以上の「２価の非環式炭化水素基」と１種以上の「２価の環式炭化水素基」とを組み合わせることによって得られる２価基が挙げられる。
ここで、「２価の非環式炭化水素基」としては、例えば炭素数１ないし２０のアルキレン、炭素数２ないし２０のアルケニレン、炭素数２ないし２０のアルキニレンなどが挙げられる。
「２価の環式炭化水素基」としては、炭素数５ないし２０のシクロアルカン、炭素数５ないし２０のシクロアルケンまたは炭素数６ないし１８の芳香族炭化水素（例、ベンゼン、ナフタレン、インデン、アントラセンなど）から任意の２個の水素原子を除いて得られる２価基などが挙げられる。具体例としては、１，２−シクロペンチレン、１，３−シクロペンチレン、１，２−シクロヘキシレン、１，３−シクロヘキシレン、１，４−シクロヘキシレン、１，２−シクロヘプチレン、１，３−シクロヘプチレン、１，４−シクロヘプチレン、３−シクロヘキセン−１，４−イレン、３−シクロヘキセン−１，２−イレン、２，５−シクロヘキサジエン−１，４−イレン、１，２−フェニレン、１，３−フェニレン、１，４−フェニレン、１，４−ナフチレン、１，６−ナフチレン、２，６−ナフチレン、２，７−ナフチレン、１，５−インデニレン、２，５−インデニレンなどが挙げられる。
上記「低級アルキル」としては、例えば、炭素数１乃至６の直鎖状または分枝状のアルキル基を示し、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル等の炭素数１乃至１０のアルキル基等が挙げられる。
上記「シクロアルキル基」としては、例えば、炭素数３乃至６の環状のアルキル基を示し、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等が挙げられる。
上記「置換されていてもよいアルキルまたはシクロアルキル」の置換基としては、特に限定されないが、例えば、飽和もしくは不飽和の環状炭化水素基、飽和もしくは不飽和の複素環基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、水酸基、置換されていてもよいカルボキシル基、置換されていてもよいアミド基、置換されていてもよい低級アルキル基、置換されていてもよいアロキシ基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいアルコキシ基等が挙げられる。
これらの置換基は、該鎖状炭化水素基上に化学的に許容される範囲において置換される。ただし、置換基の数が２個以上の場合は同一または相異なっていてもよい。
「飽和もしくは不飽和の環状炭化水素基」とは、炭素数３乃至１８の飽和若しくは不飽和の環状炭化水素基、具体的には、例えば、脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素基等が挙げられる。
「脂環式炭化水素基」としては、例えば３乃至１０個の炭素原子から構成される単環式または縮合多環式の基、具体的にはシクロアルキル基、シクロアルケニル基およびこれらと炭素数６乃至１４のアリール基（例えば、ベンゼン等）等との２または３環式縮合環等が挙げられる。該「シクロアルキル基」としては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等の炭素数３乃至６のシクロアルキル基等が挙げられる。また、該「シクロアルケニル基」としては、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等炭素数３乃至６のシクロアルケニル基等が挙げられる。
「芳香族炭化水素基」としては、例えば６乃至１８個の炭素原子から構成される単環式芳香族炭化水素基、縮合多環式芳香族炭化水素基等が挙げられ、具体的には、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、２−インデニル、２−アンスリル等の炭素数６乃至１４のアリール基が挙げられる。
当該環状炭化水素基は、飽和もしくは不飽和の環状炭化水素基、飽和もしくは不飽和の複素環基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、オキソ基、置換されていてもよいカルボキシル基、置換アミド基、置換されていてもよい低級アルキル基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいアルコキシ基等の置換基で置換されていてもよく、これらの置換基は、該環状炭化水素基上に化学的に許容される範囲において置換される。ただし、置換基の数が２個以上の場合は同一または相異なっていてもよい。
「飽和もしくは不飽和の複素環基」とは、例えば窒素原子を１〜２個含む５〜６員単環式の基、窒素原子を１〜２個と酸素原子を１個もしくは硫黄原子を１個含む５〜６員単環式の基、酸素原子を１個もしくは硫黄原子を１個含む５員単環式の基、窒素原子１〜４個を含み、６員環と５または６員環が縮合した二環式の基等が挙げられ、具体的には、例えば、ピリジル、チエニル、オキサジアゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、フリル、ピロリル、キノリル、キナゾリニル、プリニル、ピラゾリル、チオフェニル等が挙げられる。当該複素環基は、飽和もしくは不飽和の環状炭化水素基、飽和もしくは不飽和の複素環基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、オキソ基、置換されていてもよいカルボキシル基、置換アミド基、置換されていてもよい低級アルキル基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいアルコキシ基等の置換基で置換されていてもよく、これらの置換基は、該複素環基上に化学的に許容される範囲において置換される。置換基の数が２個以上の場合は同一または相異なっていてもよい。
「ハロゲン原子」としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が挙げられる。
「置換されていてもよいカルボキシル基」としては、低級アルキル基、低級アルカノイル基（例えばホルミル、アセチル、プロピオニル等の炭素数１乃至６のアルカノイル基）等で置換されていてもよいカルボキシル基等が挙げられる。
「置換されていてもよいアミド基」としては、無置換のアミド基、置換アミド〔Ｎ置換アミド基又はＮ，Ｎ’ジ置換アミド基、具体的には低級アルキル基で置換されたアミド基等〕が挙げられる。
「低級アルキル基」としては、例えば、炭素数１乃至６の直鎖状、分枝状または環状のアルキル基を示し、具体的にはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、シクロプロピル、シクロブチル等が挙げられる。
「置換されていてもよい低級アルキル基」における「置換基」としては、カルボキシル基、置換アミド基、シアノ基、水酸基、ハロゲン原子等が挙げられる。
「アロキシ基」としては例えば酸素原子をはさんで６員単環式の基（例えばフェニル基）が挙げられ、具体的には、例えば、フェノキシ等が挙げられる。
当該単環基は、飽和もしくは不飽和の環状炭化水素基、飽和もしくは不飽和の複素環基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、置換されていてもよいカルボキシル基、置換アミド基、置換されていてもよい低級アルキル基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいアルコキシ基等の置換基で置換されていてもよく、これらの置換基は、該環基上に化学的に許容される範囲において置換される。置換基の数が２個以上の場合は、同一または相異なっていてもよい。
さらに当該単環基は、飽和もしくは不飽和の環状炭化水素基あるいは飽和もしくは不飽和の複素環基と縮合して縮合環を形成していてもよい。縮合環としては、インデン、ナフタレン、フルオレイン、フェナントレン、アントラセン、インドール、イソインドール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、インドリジン、クロメン、キノリン、イソキノリン、インダゾール、キナゾリン、シンノリン、キノキサリン、フタラジン等が挙げられる。
「置換されていてもよいアミノ基」としては、低級アルキル基、低級アルカノイル基（例えばホルミル、アセチル、プロピオニル等の炭素数１乃至６のアルカノイル基）等で置換されていてもよいアミノ基等が挙げられる。
「アルコキシ基」とは、炭素数１〜６の直鎖又は分枝状のアルコキシ基を意味し、具体的には、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、２−ペンチルオキシ基、３−ペンチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、２−ヘキシルオキシ基等が挙げられる。
「置換されていてもよいアルコキシ基」の置換基としては、特に限定されないが、例えば、飽和もしくは不飽和の環状炭化水素基、飽和もしくは不飽和の複素環基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、水酸基、置換されていてもよいカルボキシル基、置換アミド基、置換されていてもよい低級アルキル基、置換されていてもよいアロキシ基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいアルコキシ基等が挙げられる。これらの置換基は、該アルコキシ基上に化学的に許容される範囲において置換される。ただし、置換基の数が２個以上の場合は同一または相異なっていてもよい。
本発明の式（Ｉ）で表わされる化合物は、その基本骨格あるいは置換基の種類に基づく特徴を利用し、種々の公知の合成方法を適用して製造することができる。例えばアルキル化、アシル化、アミノ化、イミノ化、ハロゲン化、還元、酸化、縮合等が挙げられ、通常当分野で用いられる反応または方法が利用できる。
本発明の式（Ｉ）で表わされる化合物は、医薬上許容され得る塩を形成していてもよく、該塩としては酸付加塩、例えば、無機酸塩（例えば、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩等）、有機酸塩（例えば、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等）等が挙げられる。
また、本発明の式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩は、水和物等の溶媒和物であってもよい。
本発明の式（Ｉ）で表わされる化合物および本発明のスクリーニング方法によって得られる化合物（これらをまとめて、「本発明の化合物」ともいう）を、アレルギー疾患の治療薬として使用する場合には、一般的な医薬製剤として調製され得、そして経口又は非経口的に投与され得る。
経口的に投与する場合、通常当分野で用いられる投与形態で投与することができる。非経口的に投与する場合には、局所投与剤（経皮剤等）、直腸投与剤、注射剤、経鼻剤等の投与形態で投与することができる。
経口剤又は直腸投与剤としては、例えばカプセル、錠剤、ピル、散剤、ドロップ、カシェ剤、坐剤、液剤等が挙げられる。注射剤としては、例えば、無菌の溶液又は懸濁液等が挙げられる。局所投与剤としては、例えば、クリーム、軟膏、ローション、経皮剤（通常のパッチ剤、マトリクス剤）等が挙げられる。
上記の剤形は当分野で通常行われている手法により、薬学的に許容される賦形剤、添加剤とともに製剤化され得る。薬学的に許容される賦形剤、添加剤としては、担体、結合剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられる。
薬学的に許容される担体としては、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバター等が挙げられる。
錠剤は、必要に応じて通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、腸溶性コーティング錠、フィルムコーティング錠あるいは二層錠、多層錠とすることができる。
散剤は、薬学的に許容される散剤の基剤と共に製剤化される。基剤としては、タルク、ラクトース、澱粉等が挙げられる。
ドロップは水性又は非水性の基剤と一種又はそれ以上の薬学的に許容される拡散剤、懸濁化剤、溶解剤等と共に製剤化できる。
カプセルは、有効成分となる化合物を薬学的に許容される担体と共に中に充填することにより製造できる。当該化合物は薬学的に許容される賦形剤と共に混合し、又は賦形剤なしでカプセルの中に充填することができる。
カシェ剤も同様の方法で製造できる。本発明を坐剤として調製する場合、植物油（ひまし油、オリーブ油、ピーナッツ油等）や鉱物油（ワセリン、白色ワセリン等）、ロウ類、部分合成もしくは全合成グリセリン脂肪酸エステル等の基剤と共に通常用いられる手法によって製剤化される。
注射用液剤としては、溶液、懸濁液、乳剤等が挙げられる。例えば、水溶液、水−プロピレングリコール溶液等が挙げられる。液剤は、水を含んでも良い、ポリエチレングリコール及び／又はプロピレングリコールの溶液の形で製造することもできる。
経口投与に適切な液剤は、有効成分となる化合物を水に加え、着色剤、香料、安定化剤、甘味剤、溶解剤、増粘剤等を必要に応じて加え製造することができる。また経口投与に適切な液剤は、当該化合物を分散剤とともに水に加え、粘重にすることによっても製造できる。増粘剤としては、例えば、薬学的に許容される天然又は合成ガム、レジン、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース又は公知の懸濁化剤等が挙げられる。
局所投与剤としては、上記の液剤及び、クリーム、エアロゾル、スプレー、粉剤、ローション、軟膏等が挙げられる。上記の局所投与剤は、有効成分となる化合物と薬学的に許容される希釈剤及び担体とを混合することによって製造できる。軟膏及びクリームは、例えば、水性又は油性の基剤に増粘剤及び／又はゲル化剤を加えて製剤化する。該基剤としては、例えば、水、液体パラフィン、植物油等が挙げられる。増粘剤としては、例えばソフトパラフィン、ステアリン酸アルミニウム、セトステアリルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ラノリン、水素添加ラノリン、蜜蝋等が挙げられる。局所投与剤には、必要に応じて、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、クロロクレゾール、ベンザルコニウムクロリド等の防腐剤、細菌増殖防止剤を添加することもできる。ローションは、水性又は油性の基剤に、一種類又はそれ以上の薬学的に許容される安定剤、懸濁化剤、乳化剤、拡散剤、増粘剤、着色剤、香料等を加えることができる。
投与量、投与回数は使用する化合物の種類、患者の症状、年齢、体重、投与形態等によって異なり、それらに応じて適宜設定する。
本発明はまた、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片と特異的に結合し得るか否かを指標として、アレルギー疾患の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法を提供する。
本発明に用いられる「試験化合物」は、いかなる公知化合物でも新規化合物でもよく、これらとしては、特に制限はされないが、例えば、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、抗体、有機もしくは無機の低分子化合物、有機もしくは無機の高分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物等由来の天然成分等が挙げられる。
本スクリーニング方法において、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片は、精製あるいは未精製のタンパク質（ポリペプチド）又はその（機能的）断片として用いることもできるし、細胞内で発現した状態で使用することもできる。
Ｖｉｍｅｎｔｉｎ又はその（機能的）断片は、（１）それらを産生する細胞の培養物又は組織を原料として単離精製する方法、（２）化学的に合成する方法、又は（３）遺伝子組換え技術等によりＶｉｍｅｎｔｉｎ又はその（機能的）断片を発現するように操作された細胞から精製する方法等の公知手法を適宜用いることによって取得することができる。
本発明のＶｉｍｅｎｔｉｎ又はその（機能的）断片の単離精製は、例えば、以下のようにして行うことができる。すなわち、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ又はその（機能的）断片を発現している組織、あるいは適当な液体培地中でＶｉｍｅｎｔｉｎ又はその（機能的）断片を発現している細胞を培養して得られる培養物から公知の方法で抽出、精製される。当該抽出、精製の方法は目的生成物の存在する画分に応じて適宜公知の手法が用いられる。
該方法は、具体的には以下のようにして行なわれる。
まず、組織あるいは培養物をそのまま濾過又は遠心分離等の常法に付して組織もしくは細胞あるいは上清を回収する。細胞中に所望するタンパク質が蓄積されている場合には、当該回収した細胞を適当な緩衝液剤中に懸濁して、さらに界面活性剤を適当な濃度で加えて膜を可溶化する。界面活性剤としてはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）等が挙げられるが、これらは強力なタンパク質変性作用を有するので、タンパク質が生物活性を持つように折り畳まれるためには、例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００等の穏やかな非イオン性界面活性剤を用いることが好ましい。
次いで、得られる粗抽出液を、必要ならば界面活性剤の存在下で、一般に用いられる方法を適宜組み合わせることによって該タンパク質又はその機能的断片を単離精製する。一般に用いられる方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動等の等電点の差を利用する方法等が挙げられる。より具体的には、例えば、減圧濃縮、凍結乾燥、常用の溶媒による抽出、ｐＨ調整、陰イオン交換樹脂又は陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂等の常用の吸着剤による処理、結晶化、再結晶化等の慣用の方法によって分離、精製することができる。
化学合成による本発明のＶｉｍｅｎｔｉｎ又はその（機能的）断片の製造は、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列情報を基に、ペプチド合成機を用いて合成あるいは半合成することにより行うことができる。
また、遺伝子組換え技術等によりＶｉｍｅｎｔｉｎ又はその（機能的）断片を発現するように操作された細胞から取得する場合には、具体的には以下のようにして行う。
まず、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片をコードする遺伝子を機能的に含有する発現ベクターを調製する。
Ｖｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片をコードする遺伝子は、いかなる方法で得られるものであってもよい。例えば、ｍＲＮＡから調製される相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノミックライブラリーから調製されるゲノミックＤＮＡ、化学的に合成されるＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅させて得られるＤＮＡ及びこれらの方法を適当に組み合わせて構築されるＤＮＡ等が含まれる。
例えば、配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１４１４４）に示されるヒトＶｉｍｅｎｔｉｎの全コード領域の塩基配列から実質的になるＤＮＡの全部又は一部を含むＤＮＡ等が例示される。また、上記塩基配列中の任意の塩基を置換、欠失させる技術（例えばインビトロ突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発等）を利用することもできる。
ここで、「実質的になるＤＮＡ」とは、上記特定の塩基配列からなるＤＮＡに加えて、ストリンジェントな条件（本発明では、塩基配列において約６０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上の相同性を有するＤＮＡがハイブリダイズし得る条件をいい、ストリンジェンシーはハイブリダイズ反応や洗浄の際の温度、塩濃度等を適宜変化させることにより調節することができる）において、上記の特定塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズし得る塩基配列からなるＤＮＡを意味する。
ストリンジェントな条件は、所望する相同性やオリゴヌクレオチドの長さ等をもとに適宜当分野で利用されている計算式に当てはめて算出することができる。例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理や、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理等が例示される。
得られたＤＮＡを原核細胞及び／又は真核細胞の各種の宿主内で複製保持又は自律増殖できるプラスミドベクター及びファージベクター等に適当な制限酵素部位を利用して挿入することによってＶｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片をコードする遺伝子を機能的に含有する発現ベクターを得ることができる。
ここで「機能的に」とは、そのベクターに適合する宿主細胞内で該遺伝子（ＤＮＡ）が転写され、それにコードされるタンパク質が産生され得るように該遺伝子が配置されていることを意味する。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片をコードする遺伝子、終止コドン及びターミネーター領域が連続的に配列された発現カセットを有するベクターである。形質転換体選択のためには選択マーカー遺伝子をさらに含有することが好ましい。
例えば哺乳動物細胞を形質転換する場合、動物ウイルス、例えばＳＶ４０、ＲＳＶ、ＭＭＬＶ等のプロモーター及びポリアデニル化シグナルが制限酵素部位、好ましくはマルチクローニング部位を介して連結したプラスミドに、ｐＳＶ２−ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ等のプラスミド由来の選択マーカー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素等）を挿入したプラスミドが使用できる。
宿主細胞は使用する発現ベクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞或いは人工的に樹立された組換え細胞等種々の細胞が利用できる。具体的には、大腸菌、枯草菌等の細菌、酵母等の真菌類、動物細胞又は昆虫細胞等が例示される。好ましくは哺乳動物細胞、特にラット由来細胞、ハムスター由来細胞（ＣＨＯ、ＢＨＫ等）、マウス由来細胞（ＣＯＰ、Ｌ、Ｃ１２７、Ｓｐ２／０、ＮＳ−１、ＮＩＨ Ｔ３等）、サル由来細胞（ＣＯＳ１、ＣＯＳ３、ＣＯＳ７、ＣＶ１、Ｖｅｌｏ等）及びヒト由来細胞（ＨｅＬａ、２倍体線維芽細胞由来細胞、ミエローマ細胞、Ｎａｍａｌｗａ、Ｊｕｒｋａｔ細胞等）が挙げられる。
発現ベクターの宿主細胞への導入は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、哺乳動物細胞に導入する場合、リン酸カルシウム共沈澱法、プロトプラスト融合法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、リソソーム法等が挙げられる。
Ｖｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片は上記のごとく調製される発現ベクターを含む形質転換体を培養することによっても製造することができる。培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストリン、可溶性デンプン、ショ糖等が、窒素源としては、例えばアンモニウム塩、硝酸塩、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、馬鈴薯抽出液等が例示される。また所望により他の栄養素〔例えば、無機塩（塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム等）、ビタミン類、抗生物質（テトラサイクリン、ネオマイシン、カナマイシン、アンピシリン等）〕を含んでいてもよい。
培養は当分野において知られている方法により行われる。培養条件はタンパク質の発現が可能な条件であって、例えば温度、培地のｐＨ及び培養時間は当該タンパク質が大量に生産されるように適宜選択される。
例えば、宿主が動物細胞である場合、培地としては例えば約５〜２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０培地、１９９培地等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であることが好ましく、培養は通常３０〜４０℃で約１５〜７２時間行われ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
本発明のＶｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片は上記培養により得られる培養物から、前述のＶｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片を発現している細胞あるいは組織からの抽出・単離・精製と同様にして採取することができる。
かくして得られたＶｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片と、試験化合物との接触処理は、通常当分野で実施されている結合実験に準じて行うことができる。具体的にはＶｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片、あるいは試験化合物のいずれかを固相担体に固定化し、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片を固定化した場合には試験化合物を含有する溶液を、試験化合物を固相担体に固定化した場合にはＶｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片を含有する溶液（精製タンパク質溶液あるいは細胞抽出液や組織抽出液などの粗精製タンパク質溶液）を、該固相担体に接触させる。カラム法やバッチ法等が利用できる。
試験化合物がＶｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片に特異的に結合するか否かを判定する工程は、試験化合物とＶｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片とを接触させる工程をどのようにして行ったかによって適宜変更し得るが、例えば試験化合物が固定化された固相担体（例えばビーズ樹脂）を充填してなるカラムを用いた場合、続くＶｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片を含有する溶液（試料）の添加により、両者の間に特異的な親和性がある場合にはＶｉｍｅｎｔｉｎ分子が固相担体上に結合する（特異的な親和性がない場合には結合しない）。結合したＶｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片を緩衝液の極性を変える、あるいは過剰の試験化合物をさらに加える等の処理によって固相上から解離させ、その後同定したり、あるいは固相上の試験化合物と結合した状態でそのまま界面活性剤等によって抽出して同定したりすることもできる。同定方法としては具体的には電気泳動法、免疫学的反応を用いたイムノブロッティングや免疫沈降法、クロマトグラフィー、マススペクトラム、アミノ酸シーケンス、ＮＭＲ等の公知の手法により、またこれらの方法を組み合わせて実施する。Ｖｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片が固相上に捕捉されるかあるいはカラムの素通り画分中に含まれるか否か、あるいはその程度等を測定することによって、試験化合物がＶｉｍｅｎｔｉｎに特異的に結合し得るか否かを判定し、結合する化合物を選択する。
また、本工程は自動化されていてもよい。例えば２次元電気泳動で得られた種々の分子のデータを直接読み取り、既存のデータベースに基づいて分子の同定を行うことも可能である。
さらに、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片を細胞内で発現した状態で使用する場合には、ＲＩ標識や蛍光標識等の各種のラベリング技術を駆使してＶｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片と試験化合物との結合の有無、結合の程度を測定することもできる。本発明のスクリーニング方法における「Ｖｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片と試験化合物との接触」にはこのような態様も含まれる。細胞と試験化合物との接触条件は使用する細胞やＶｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片の細胞内での発現状況等の要因により適宜設定される。また、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ又はその機能的断片が細胞内で発現しているか否かはそれらに対する抗体等を用いて予め確認しておくことが好ましい。
上記の手順により得られた化合物の抗アレルギー剤としての効果は、例えば、文献：Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ ２６（６），２６１−２６９（１９９９）：に見られるような炎症メディエーターの分泌作用の抑制効果等によって確認することができる。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。また、用いる各化合物や試薬等は特に言及しない限り、商業的に入手可能であるか、また既知の報告等に基づいて調製することができる。
［実施例１］インタール固定化樹脂の合成
（１）１，３−ビス（２−カルボキシクロモン−５−イルオキシ）−２−ハイドロオキシプロパンの合成

１，３−ビス（２−カルボキシクロモン−５−イルオキシ）−２−ハイドロオキシプロパンのジナトリウム塩（１ｇ）を水５０ｍｌに溶解させ、希塩酸を加えｐＨを３とする。析出した白色結晶を濾取し、水、エタノール、エーテルで洗浄した。減圧下で乾燥し、１，３−ビス（２−カルボキシクロモン−５−イルオキシ）−２−ハイドロオキシプロパンの白色結晶（６００ｍｇ、収率６６％）を得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６） δ：４．３０（４Ｈ，ｄ），４．３６（１Ｈ，ｔ），５．３２（１Ｈ，ｂｓ），６．８６（２Ｈ，ｓ），７．１１（２Ｈ，ｄ），７．１７（２Ｈ，ｄ），７．７１（２Ｈ，ｔ）．
（２）１，３−ビス（２−カルボキシクロモン−５−イルオキシ）−２−ハイドロオキシプロパン固定化樹脂の合成

（ａ）１，３−ビス（２−カルボキシクロモン−５−イルオキシ）−２−ハイドロオキシプロパンの固定化
１，３−ビス（２−カルボキシクロモン−５−イルオキシ）−２−ハイドロオキシプロパン（１８７．３ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル懸濁液（４．８ｍｌ）にホスゲンのトルエン溶液（１．６５ｍｏｌ／ｌ，２４μｌ）を加えた。得られた反応液をそのまま室温において１時間攪拌した。スピードバック装置（ａｐｐｒｏｘ．−９０ｋＰａ）で５分間減圧濃縮後、得られた濃縮液をＴＯＹＯパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ，１ｍｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（３５μｌ，０．２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル懸濁液（５ｍｌ）に加え、室温で終夜攪拌させた。得られた樹脂をアセトニトリル、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水の順にそれぞれ５回ずつ洗浄した。
（ｂ）アセチルキャッピング
（ａ）の工程で得られた樹脂に無水酢酸（２ｍｌ）、ＤＭＦ（８ｍｌ）を加え、１時間室温で処理させた後、ＤＭＦ、２０％エタノール水溶液で５回洗浄した。反応終点はニンヒドリン反応で残存アミノ基が観測できなくなることで確認した。最後にＴＯＹＯパール樹脂を５回洗浄した。
［実施例２］結合実験
（１）ＲＢＬ−２Ｈ３細胞ライセートの調製
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞（２５０ｍｇ）を混合液Ａ（２．５ｍｌ，５０ｍＭ Ｓｕｃｒｏｓｅ，３００μＭ Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートナトリウム塩，２５ｍＭ Ｕｒｅａ，２ｍＭ ジチオスレイトール，１μＭ ＣａＣｌ_２，２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５）に混ぜ、超音波により破砕した。９，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた上清をライセートとして使用した。なお、実験はすべて４℃あるいは氷上で行った。
（２）結合実験
製造例１で調製した試験化合物が固定化された固定化樹脂および実施例２（１）で調製したＲＢＬ−２Ｈ３細胞ライセートを用い、下記に示す手順で結合実験を行った。
樹脂（１０μｌ）とライセート（１ｍｌ）を４℃で約１時間、静かに振とうした。その後、遠心分離操作を行い、各々の上澄みを注意深く採集した。そして、各上澄み液を再びフレッシュな化合物結合樹脂（１０μｌ）と混合した。この時、分離した化合物結合樹脂を１回目の結合実験樹脂として４℃にて静かに保存しておく。１時間ほど静かに撹拌した後に、遠心分離操作を行い、上澄み液を除去した。こうして２回目の結合実験で得られた化合物結合樹脂と１回目で得られた樹脂とを混合液Ａにて５回程度丁寧に洗浄し、樹脂上に結合するタンパク質以外を出来る限り除いた。こうして得られた各化合物結合樹脂に３０μＬのＳＤＳ用ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ｎａｋａｌａｉ Ｃａｔ．ＮＯ＝３０５６６−２２、電気泳動用ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ２−ＭＥ（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）（２Ｘ）ｆｏｒ ＳＤＳ ＰＡＧＥ）を加え、２５℃で１０分間撹拌した。こうして得られたサンプル液を市販のＳＤＳゲル（ＢｉｏＲａｄ ｒｅａｄｙＧｅｌ Ｊ，１０％ＳＤＳ，ｃａｔ．ＮＯ＝１６１−Ｊ３７１Ｖ）で分離し、そのＳＤＳゲルを解析した（図１）。１回目で得られた結合樹脂上に結合するタンパク質を含むサンプル液の電気泳動像（図１、レーン１）、および２回目で得られた結合樹脂上に結合するタンパク質を含むサンプル液の電気泳動像（図１、レーン２）とを比較した。
その結果、インタールを固定した樹脂にＶｉｍｅｎｔｉｎが結合し、しかもその結合は、化合物結合樹脂との１回目の結合実験で顕著に確認され、２回目の結合実験では殆ど観察されないことから特異的な結合であることが示された。
［実施例３］ＢｉａｃｏｒｅによるＶｉｍｅｎｔｉｎとインタールとのＫｄ値測定
＜インタールＰＥＧアミンの合成＞

１，３−ビス（２−カルボキシクロモン−５−イルオキシ）−２−ハイドロオキシプロパン（１１７ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（２ｍｌ）にＰＥＧアミン（８０ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣＤ；４４μｌ，０．２５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３４ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を加え終夜室温にて攪拌した。反応粗生成物を抽出した後、薄層クロマトグラフィーにて精製した。ＰＥＧ体の白色固体（１３０ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ、収率６７％）を得た。

ＰＥＧ体（１３０ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）の水−テトラヒドロフラン溶液（１．５ｍｌ；１：２）に濃塩酸（０．５ｍｌ）を加え室温で２時間攪拌した。減圧濃縮後、反応粗生成物をＨＰ２０にて分離精製した。ＰＥＧ体の白色固体（６７ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ、収率５９％）を得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ） δ：１．７７−１．８４（４Ｈ，ｍ），３．０１（２Ｈ，ｔ），３．４０（２Ｈ，ｔ），３．４６−３．５３（１２Ｈ，ｍ），４．３０−４．３２（５Ｈ，ｍ），６．９０（１Ｈ，ｄ），６．９２（１Ｈ，ｄ），７．０４（１Ｈ，ｄ），７．０５（１Ｈ，ｄ），７．４９−７．６６（２Ｈ，ｍ）．
ＬＣ−ＭＳ：６７１．１，純度９９％（２５４ｎｍ）
＜インタール固定化チップの合成＞
Ｂｉａｃｏｒｅ社ＣＭ５チップ（＃ＢＲ−１０００−１４）に、ＢＩＡａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｂｉａｃｏｒｅ刊）記載の方法で、上記で合成したインタールＰＥＧアミンを固定化した。なお、対照データは、同じ方法で２−エタノールアミンを固定化したチップを用いることによって得た。
＜Ｖｉｍｅｎｔｉｎサンプル作製＞
Ｖｉｍｅｎｔｉｎは、ＰＲＯＧＥＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ社より購入したＳｔａｎｄａｒｄ Ｈｕｍａｎ Ｖｉｍｅｎｔｉｎ（ｃａｔ．Ｎｏ．６２０１５）を、Ｒｕｎｎｉｎｇバッファー（０．２５Ｍ Ｓｕｃｒｏｓｅ，２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，０．３ｍＭ Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートナトリウム，２５ｍＭ ウレア、１ｍＭ 塩化カルシウム）でバッファー交換をしてＫｄ測定に用いた。
＜Ｋｄ値測定＞
Ｋｄの測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いたＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）スペクトル測定によって行った。上記の手順で作製したＣＭ５上にインタールを固定化したチップに、上記のＲｕｎｎｉｎｇバッファーを毎分２０μｌで流した。ここに、上記の手順で作製したＶｉｍｅｎｔｉｎを段階的に希釈したサンプル（０．２９ｎＭ−４．６μＭ）を各５分間注入し、得られたＳＰＲスペクトルをＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ．４．１（Ｂｉａｃｏｒｅ）で解析することにより、Ｋｄ：５６ｎＭを得た。
以上の結果より、インタールとＶｉｍｅｎｔｉｎとの相互作用は特異的結合であることが証明された。

本発明のスクリーニング方法は、インタールと同様の作用メカニズムおよび薬理活性を有する化合物を効率的にスクリーニングすることができる。本発明のスクリーニング方法により得られ得る化合物は、インタールの効果を超える又はその代替となる医薬として有用であり得る。
本出願は、日本で出願された特願２００５−３１８８３３を基礎としており、その内容は全て本明細書に包含される。
［配列表］

Claims (2)

1. アレルギー疾患の治療に有用な化合物をスクリーニングする為の方法であって、以下の工程を含む方法；
   （１）配列番号２のアミノ酸配列を有し、以下の化合物と結合する、という特徴を有するタンパク質を試験化合物に接触させる工程、
   

   

   （２）該試験化合物が、該タンパク質に特異的に結合するか否かを判定する工程、及び
   （３）上記（２）の工程において該タンパク質に特異的に結合する試験化合物を選択する工程。
2. アレルギー疾患の治療に有用な化合物をスクリーニングする為の方法であって、以下の工程を含む方法；
   （１）配列番号２のアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸を欠失、置換又は付加してなるアミノ酸配列を有し、以下の化合物と結合する、という特徴を有するタンパク質を試験化合物に接触させる工程、
   

   

   （２）該試験化合物が、該タンパク質に特異的に結合するか否かを判定する工程、及び
   （３）上記（２）の工程において該タンパク質に特異的に結合する試験化合物を選択する工程。

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