JP4558045B2 - アレルギー疾患の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法 - Google Patents
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Description
インタールは、抗原抗体反応に伴って起こるマスト細胞からのヒスタミンやSRS−A等の化学伝達物質の遊離(すなわち、脱顆粒)を抑制する作用を有すること等が知られている(例えば、治療薬マニュアル2004,医学書院,p301参照)。
これまで、その作用メカニズムに関しては、ホスホリパーゼA刺激によるヒスタミン等の分泌を阻害するメカニズム(例えば、Orr TS.ら、Nature,1969,223(202),pp.197−198);カルシウムチャンネルを担うタンパク質が関与するメカニズム(例えば、Mazurek N.ら、Proceedings of the National Academy of Sciences USA.,1984,81(21),pp.6841−6845);細胞内タンパク質のリン酸化酵素が関与するメカニズム(例えば、Theoharides TC.ら、Science,1980,207(4426),pp.80−82)等が報告されている。
しかし、上記のような多大な努力にもかかわらず、インタールが直接作用し、かつその薬理活性を十分に説明し得るターゲットの同定は、未解決な問題であった。
そのため、インタールの効果を超える又はその代替となる医薬の創出は困難を極めてきた。このことから、該医薬を創出するために、インタールと同様の作用メカニズムおよび薬理活性を有する化合物をスクリーニングする効率的な方法の開発が必要とされている。
本発明者らは、上記課題を解決すべく、インタールが特異的に結合するタンパク質の探索を行い、その結果、中間径フィラメントの一種であるVimentinが、インタールに特異的に結合することを見出した。このVimentinは、そのヘッド部分に、cdc 2 kinase、PKA、PKC、CaMK II、Rho kinase等によって位置特異的にリン酸化されるSer残基が存在することが知られている(例えば、シグナル伝達、pp.235−241)。このことから、本発明者らは、Vimentinのリン酸化が、脱顆粒における細胞内シグナル伝達に関与すると考え、さらに鋭意研究して、Vimentinを用いてアレルギー疾患の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法を開発し、本発明を完成するに至った。
即ち本発明は下記の通りである:
〔1〕試験化合物が、Vimentin又はその機能的断片に特異的に結合するか否かを判定する工程を含む、アレルギー疾患の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法。
〔2〕アレルギー疾患の治療に有用な化合物をスクリーニングする為の方法であって、以下の工程を含む方法;
(1)Vimentin又はその機能的断片を試験化合物に接触させる工程、
(2)該試験化合物が、Vimentin又はその機能的断片に特異的に結合するか否かを判定する工程、及び
(3)上記(2)の工程においてVimentin又はその機能的断片に特異的に結合する試験化合物を選択する工程。
〔3〕アレルギー疾患の治療に有用な化合物をスクリーニングする為の方法であって、以下の工程を含む方法;
(1)配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその機能的断片を試験化合物に接触させる工程、
(2)該試験化合物が、該タンパク質又はその機能的断片に特異的に結合するか否かを判定する工程、及び
(3)上記(2)の工程において該タンパク質又はその機能的断片に特異的に結合する試験化合物を選択する工程。
〔4〕アレルギー疾患の治療に有用な化合物をスクリーニングする為の方法であって、以下の工程を含む方法;
(1)配列番号2のアミノ酸配列において1又は2以上のアミノ酸を欠失、置換又は付加してなるアミノ酸配列を有し、以下の化合物と結合する、という特徴を有するタンパク質又はその機能的断片を試験化合物に接触させる工程、
(2)該試験化合物が、該タンパク質又はその機能的断片に特異的に結合するか否かを判定する工程、及び
(3)上記(2)の工程において該タンパク質又はその機能的断片に特異的に結合する試験化合物を選択する工程。
〔5〕上記〔1〕〜〔4〕の何れか1項に記載のスクリーニング方法によって得られるアレルギー疾患の治療に有用な化合物。
〔6〕Vimentinと特異的に結合する化合物を有効成分として含有する医薬組成物。
〔7〕Vimentinの発現を制御する化合物を有効成分として含有する医薬組成物。
〔8〕Vimentinの活性を制御する化合物を有効成分として含有する医薬組成物。
〔9〕アレルギー疾患の治療用である、上記〔6〕〜〔8〕の何れか1項に記載の医薬組成物。
〔10〕式(I)で表される化合物又はその医薬上許容される塩:
[式中、R1は、置換されていてもよい2価の炭化水素であり;
R2およびR2 ,は、同一または異なって、カルボン酸、アミドもしくはエステル(これらは、低級アルキルで置換されていてもよい)、またはテトラゾールであり;
Q1およびQ1 ,は、同一または異なって、O、S、NH、またはCH2であり;
Q2およびQ2 ,は、同一または異なって、C=O、C=S、C=NH、C=NOH、C=NOR3、O、アルキレンまたはNHであり;
Xは、CH2、O、S、NHまたはNR3(ここで、R3は、置換されていてもよいアルキルまたはシクロアルキルである)である]
ただし、以下の化合物を除く:
〔11〕上記〔10〕記載の化合物又はその医薬上許容される塩を含有する、アレルギー疾患の治療剤。
本発明は、Vimentinを用いてアレルギー疾患の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法、ならびに該スクリーニングによって得られ得る化合物を有効成分として含む新しいタイプの抗アレルギー剤を提供する。
本明細書において、「核酸分子」とは、一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNAのことを意味する。本明細書において、「ヌクレオチド配列」とは、特に言及しない限り、デオキシリボヌクレオチド(A、G、C、およびTで表す)の配列、またはリボヌクレオチド(A、G、C、およびUで表す)の配列を意味する。本明細書中において、特に言及しない限り、一本鎖ヌクレオチド配列は、左端が5’末端、右端が3’末端を表す。
本明細書において、特に言及しない限り、アミノ酸の表記は、アミノ酸に関する標準的な表記である1文字略号または3文字略号を使用する。本明細書において、特に言及しない限り、アミノ酸配列は、左端がN末端(アミノ末端)、右端がC末端(カルボキシル末端)を表す。
本明細書において、スクリーニングの標的タンパク質として用いる「Vimentin」とは、好ましくは、ヒト由来のVimentinを意味する。ヒトVimentinとしては、例えば、GenPept登録番号AAA61279(配列番号2)に表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質が例示されるが、インタールと特異的に結合し得る(即ち、インタールのターゲットとしての役割を果たし得る)限り、配列番号2のアミノ酸配列において、1又は2以上(好ましくは、1〜30個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜5個)のアミノ酸を欠失、置換、及び/又は付加してなるアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
あるいは、ヒトVimentinとしては、例えば、配列番号2のアミノ酸配列と、60%以上、70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上の相同性を有するアミノ酸配列で表わされるタンパク質であり、かつ、インタールと特異的に結合し得るタンパク質が挙げられる。
本明細書において、「相同性」とは、二つのポリペプチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものである。二つのポリペプチド配列間の相同性を測定する方法は数多く知られており、「相同性」(「同一性」とも言われる)なる用語は、当業者には周知である。例えば、二つの配列の相同性を測定するのに用いる一般的な方法には、Martin,J.Bishop(Ed.),Guide to Huge Computers,Academic Press,San Diego,(1994);Carillo,H.&Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)等に開示されている方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
相同性を測定するための好ましい方法としては、試験する二つの配列間の最も大きな適合関係部分を得るように設計したものが挙げられる。このような方法は、コンピュータープログラムとして構築されているものが挙げられる。二つの配列間の相同性を測定するための好ましいコンピュータープログラム法としては、GCG プログラムパッケージ(Devereux,J.et al.,Nucleic Acids Research,12(1):387(1984))、BLASTP、FASTA等が挙げられるが、これらに限定されるものでなく、当該分野で公知の方法を使用することができる。
さらに、本発明においてスクリーニングの標的タンパク質として用いる「Vimentin」は、インタールと特異的に結合するという特徴を有する限り、Vimentinの任意の断片であってもよい(以下、このような断片を、「機能的断片」ともいう)。
Vimentin又はその機能的断片が、インタールと特異的に結合するか否かを確認するためにインタールが使用され得る。インタールは、商業的に入手可能であり、また、公知技術に従って製造することもできる。
本明細書において、「特異的に結合する」とは、例えば、アゴニストあるいはアンタゴニストに対する特異的受容体、基質に対する酵素[例えば、FK506(リガンド)に対するFK506結合タンパク質(ターゲット分子)、ステロイドホルモンに対するステロイドホルモン受容体(例えば、dexamathasonとglucocorticoid receptor)、抗がん剤trapoxinに対するHDAC]等の関係として例示されるものであり、競合実験等により、Kd、Ka等の数値として確認することができる。また、特異的な結合は、上記のような具体的数値として表わす以外に、電気泳動法等の視覚的手段により確認することもできる。
本発明はまた、Vimentin及びその機能的断片に特異的に結合する化合物を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。
Vimentin又はその機能的断片に結合し得る化合物は、インタールと同様に、ヒトまたは非ヒト哺乳動物(例えば、サル、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、モルモットなど)に対して、優れた抗アレルギー作用を有し得る。従って、本発明の医薬組成物は、種々のアレルギー性疾患(例えば、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、花粉症等)の治療剤として有用である。
さらに、Vimentinの発現や活性を直接的または間接的に制御する化合物もまた、アレルギー性疾患の治療に有用であり得る。
Vimentinの発現や活性を制御する化合物または物質としては、例えば、VimentinをコードするDNA、VimentinをコードするDNAが挿入されたベクター、Vimentinタンパク質等が挙げられる。
Vimentin又はその機能的断片に結合し得る化合物としては、例えば、以下の式(I)で表される化合物又はその医薬上許容され得る塩(以下、まとめて「化合物(I)」ともいう)が挙げられる。
[式中、R1は、2価の炭化水素であり;
R2およびR2 ,は、同一または異なって、カルボン酸、アミドもしくはエステル(これらは、低級アルキルで置換されていてもよい)、またはテトラゾールであり;
Q1およびQ1 ,は、同一または異なって、O、S、NH、またはCH2であり;
Q2およびQ2 ,は、同一または異なって、C=O、C=S、C=NH、C=NOH、C=NOR3、O、CH2またはNHであり;
Xは、CH2、O、S、NHまたはNR3(ここで、R3は、置換されていてもよいアルキルまたはシクロアルキルである)である]
上記「2価の炭化水素基」としては、例えば「2価の非環式炭化水素基」、「2価の環式炭化水素基」、または1種以上の「2価の非環式炭化水素基」と1種以上の「2価の環式炭化水素基」とを組み合わせることによって得られる2価基が挙げられる。
ここで、「2価の非環式炭化水素基」としては、例えば炭素数1ないし20のアルキレン、炭素数2ないし20のアルケニレン、炭素数2ないし20のアルキニレンなどが挙げられる。
「2価の環式炭化水素基」としては、炭素数5ないし20のシクロアルカン、炭素数5ないし20のシクロアルケンまたは炭素数6ないし18の芳香族炭化水素(例、ベンゼン、ナフタレン、インデン、アントラセンなど)から任意の2個の水素原子を除いて得られる2価基などが挙げられる。具体例としては、1,2−シクロペンチレン、1,3−シクロペンチレン、1,2−シクロヘキシレン、1,3−シクロヘキシレン、1,4−シクロヘキシレン、1,2−シクロヘプチレン、1,3−シクロヘプチレン、1,4−シクロヘプチレン、3−シクロヘキセン−1,4−イレン、3−シクロヘキセン−1,2−イレン、2,5−シクロヘキサジエン−1,4−イレン、1,2−フェニレン、1,3−フェニレン、1,4−フェニレン、1,4−ナフチレン、1,6−ナフチレン、2,6−ナフチレン、2,7−ナフチレン、1,5−インデニレン、2,5−インデニレンなどが挙げられる。
上記「低級アルキル」としては、例えば、炭素数1乃至6の直鎖状または分枝状のアルキル基を示し、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、n−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、n−ヘキシル、イソヘキシル等の炭素数1乃至10のアルキル基等が挙げられる。
上記「シクロアルキル基」としては、例えば、炭素数3乃至6の環状のアルキル基を示し、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等が挙げられる。
上記「置換されていてもよいアルキルまたはシクロアルキル」の置換基としては、特に限定されないが、例えば、飽和もしくは不飽和の環状炭化水素基、飽和もしくは不飽和の複素環基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、水酸基、置換されていてもよいカルボキシル基、置換されていてもよいアミド基、置換されていてもよい低級アルキル基、置換されていてもよいアロキシ基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいアルコキシ基等が挙げられる。
これらの置換基は、該鎖状炭化水素基上に化学的に許容される範囲において置換される。ただし、置換基の数が2個以上の場合は同一または相異なっていてもよい。
「飽和もしくは不飽和の環状炭化水素基」とは、炭素数3乃至18の飽和若しくは不飽和の環状炭化水素基、具体的には、例えば、脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素基等が挙げられる。
「脂環式炭化水素基」としては、例えば3乃至10個の炭素原子から構成される単環式または縮合多環式の基、具体的にはシクロアルキル基、シクロアルケニル基およびこれらと炭素数6乃至14のアリール基(例えば、ベンゼン等)等との2または3環式縮合環等が挙げられる。該「シクロアルキル基」としては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等の炭素数3乃至6のシクロアルキル基等が挙げられる。また、該「シクロアルケニル基」としては、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等炭素数3乃至6のシクロアルケニル基等が挙げられる。
「芳香族炭化水素基」としては、例えば6乃至18個の炭素原子から構成される単環式芳香族炭化水素基、縮合多環式芳香族炭化水素基等が挙げられ、具体的には、フェニル、1−ナフチル、2−ナフチル、2−インデニル、2−アンスリル等の炭素数6乃至14のアリール基が挙げられる。
当該環状炭化水素基は、飽和もしくは不飽和の環状炭化水素基、飽和もしくは不飽和の複素環基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、オキソ基、置換されていてもよいカルボキシル基、置換アミド基、置換されていてもよい低級アルキル基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいアルコキシ基等の置換基で置換されていてもよく、これらの置換基は、該環状炭化水素基上に化学的に許容される範囲において置換される。ただし、置換基の数が2個以上の場合は同一または相異なっていてもよい。
「飽和もしくは不飽和の複素環基」とは、例えば窒素原子を1〜2個含む5〜6員単環式の基、窒素原子を1〜2個と酸素原子を1個もしくは硫黄原子を1個含む5〜6員単環式の基、酸素原子を1個もしくは硫黄原子を1個含む5員単環式の基、窒素原子1〜4個を含み、6員環と5または6員環が縮合した二環式の基等が挙げられ、具体的には、例えば、ピリジル、チエニル、オキサジアゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、フリル、ピロリル、キノリル、キナゾリニル、プリニル、ピラゾリル、チオフェニル等が挙げられる。当該複素環基は、飽和もしくは不飽和の環状炭化水素基、飽和もしくは不飽和の複素環基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、オキソ基、置換されていてもよいカルボキシル基、置換アミド基、置換されていてもよい低級アルキル基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいアルコキシ基等の置換基で置換されていてもよく、これらの置換基は、該複素環基上に化学的に許容される範囲において置換される。置換基の数が2個以上の場合は同一または相異なっていてもよい。
「ハロゲン原子」としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が挙げられる。
「置換されていてもよいカルボキシル基」としては、低級アルキル基、低級アルカノイル基(例えばホルミル、アセチル、プロピオニル等の炭素数1乃至6のアルカノイル基)等で置換されていてもよいカルボキシル基等が挙げられる。
「置換されていてもよいアミド基」としては、無置換のアミド基、置換アミド〔N置換アミド基又はN,N’ジ置換アミド基、具体的には低級アルキル基で置換されたアミド基等〕が挙げられる。
「低級アルキル基」としては、例えば、炭素数1乃至6の直鎖状、分枝状または環状のアルキル基を示し、具体的にはメチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、ヘキシル、シクロプロピル、シクロブチル等が挙げられる。
「置換されていてもよい低級アルキル基」における「置換基」としては、カルボキシル基、置換アミド基、シアノ基、水酸基、ハロゲン原子等が挙げられる。
「アロキシ基」としては例えば酸素原子をはさんで6員単環式の基(例えばフェニル基)が挙げられ、具体的には、例えば、フェノキシ等が挙げられる。
当該単環基は、飽和もしくは不飽和の環状炭化水素基、飽和もしくは不飽和の複素環基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、置換されていてもよいカルボキシル基、置換アミド基、置換されていてもよい低級アルキル基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいアルコキシ基等の置換基で置換されていてもよく、これらの置換基は、該環基上に化学的に許容される範囲において置換される。置換基の数が2個以上の場合は、同一または相異なっていてもよい。
さらに当該単環基は、飽和もしくは不飽和の環状炭化水素基あるいは飽和もしくは不飽和の複素環基と縮合して縮合環を形成していてもよい。縮合環としては、インデン、ナフタレン、フルオレイン、フェナントレン、アントラセン、インドール、イソインドール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、インドリジン、クロメン、キノリン、イソキノリン、インダゾール、キナゾリン、シンノリン、キノキサリン、フタラジン等が挙げられる。
「置換されていてもよいアミノ基」としては、低級アルキル基、低級アルカノイル基(例えばホルミル、アセチル、プロピオニル等の炭素数1乃至6のアルカノイル基)等で置換されていてもよいアミノ基等が挙げられる。
「アルコキシ基」とは、炭素数1〜6の直鎖又は分枝状のアルコキシ基を意味し、具体的には、メトキシ基、エトキシ基、n−プロポキシ基、イソプロポキシ基、n−ブトキシ基、イソブトキシ基、sec−ブトキシ基、tert−ブトキシ基、n−ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、tert−ペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、2−ペンチルオキシ基、3−ペンチルオキシ基、n−ヘキシルオキシ基、2−ヘキシルオキシ基等が挙げられる。
「置換されていてもよいアルコキシ基」の置換基としては、特に限定されないが、例えば、飽和もしくは不飽和の環状炭化水素基、飽和もしくは不飽和の複素環基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、水酸基、置換されていてもよいカルボキシル基、置換アミド基、置換されていてもよい低級アルキル基、置換されていてもよいアロキシ基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいアルコキシ基等が挙げられる。これらの置換基は、該アルコキシ基上に化学的に許容される範囲において置換される。ただし、置換基の数が2個以上の場合は同一または相異なっていてもよい。
本発明の式(I)で表わされる化合物は、その基本骨格あるいは置換基の種類に基づく特徴を利用し、種々の公知の合成方法を適用して製造することができる。例えばアルキル化、アシル化、アミノ化、イミノ化、ハロゲン化、還元、酸化、縮合等が挙げられ、通常当分野で用いられる反応または方法が利用できる。
本発明の式(I)で表わされる化合物は、医薬上許容され得る塩を形成していてもよく、該塩としては酸付加塩、例えば、無機酸塩(例えば、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩等)、有機酸塩(例えば、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩等)等が挙げられる。
また、本発明の式(I)で表わされる化合物又はその塩は、水和物等の溶媒和物であってもよい。
本発明の式(I)で表わされる化合物および本発明のスクリーニング方法によって得られる化合物(これらをまとめて、「本発明の化合物」ともいう)を、アレルギー疾患の治療薬として使用する場合には、一般的な医薬製剤として調製され得、そして経口又は非経口的に投与され得る。
経口的に投与する場合、通常当分野で用いられる投与形態で投与することができる。非経口的に投与する場合には、局所投与剤(経皮剤等)、直腸投与剤、注射剤、経鼻剤等の投与形態で投与することができる。
経口剤又は直腸投与剤としては、例えばカプセル、錠剤、ピル、散剤、ドロップ、カシェ剤、坐剤、液剤等が挙げられる。注射剤としては、例えば、無菌の溶液又は懸濁液等が挙げられる。局所投与剤としては、例えば、クリーム、軟膏、ローション、経皮剤(通常のパッチ剤、マトリクス剤)等が挙げられる。
上記の剤形は当分野で通常行われている手法により、薬学的に許容される賦形剤、添加剤とともに製剤化され得る。薬学的に許容される賦形剤、添加剤としては、担体、結合剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられる。
薬学的に許容される担体としては、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバター等が挙げられる。
錠剤は、必要に応じて通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、腸溶性コーティング錠、フィルムコーティング錠あるいは二層錠、多層錠とすることができる。
散剤は、薬学的に許容される散剤の基剤と共に製剤化される。基剤としては、タルク、ラクトース、澱粉等が挙げられる。
ドロップは水性又は非水性の基剤と一種又はそれ以上の薬学的に許容される拡散剤、懸濁化剤、溶解剤等と共に製剤化できる。
カプセルは、有効成分となる化合物を薬学的に許容される担体と共に中に充填することにより製造できる。当該化合物は薬学的に許容される賦形剤と共に混合し、又は賦形剤なしでカプセルの中に充填することができる。
カシェ剤も同様の方法で製造できる。本発明を坐剤として調製する場合、植物油(ひまし油、オリーブ油、ピーナッツ油等)や鉱物油(ワセリン、白色ワセリン等)、ロウ類、部分合成もしくは全合成グリセリン脂肪酸エステル等の基剤と共に通常用いられる手法によって製剤化される。
注射用液剤としては、溶液、懸濁液、乳剤等が挙げられる。例えば、水溶液、水−プロピレングリコール溶液等が挙げられる。液剤は、水を含んでも良い、ポリエチレングリコール及び/又はプロピレングリコールの溶液の形で製造することもできる。
経口投与に適切な液剤は、有効成分となる化合物を水に加え、着色剤、香料、安定化剤、甘味剤、溶解剤、増粘剤等を必要に応じて加え製造することができる。また経口投与に適切な液剤は、当該化合物を分散剤とともに水に加え、粘重にすることによっても製造できる。増粘剤としては、例えば、薬学的に許容される天然又は合成ガム、レジン、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース又は公知の懸濁化剤等が挙げられる。
局所投与剤としては、上記の液剤及び、クリーム、エアロゾル、スプレー、粉剤、ローション、軟膏等が挙げられる。上記の局所投与剤は、有効成分となる化合物と薬学的に許容される希釈剤及び担体とを混合することによって製造できる。軟膏及びクリームは、例えば、水性又は油性の基剤に増粘剤及び/又はゲル化剤を加えて製剤化する。該基剤としては、例えば、水、液体パラフィン、植物油等が挙げられる。増粘剤としては、例えばソフトパラフィン、ステアリン酸アルミニウム、セトステアリルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ラノリン、水素添加ラノリン、蜜蝋等が挙げられる。局所投与剤には、必要に応じて、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、クロロクレゾール、ベンザルコニウムクロリド等の防腐剤、細菌増殖防止剤を添加することもできる。ローションは、水性又は油性の基剤に、一種類又はそれ以上の薬学的に許容される安定剤、懸濁化剤、乳化剤、拡散剤、増粘剤、着色剤、香料等を加えることができる。
投与量、投与回数は使用する化合物の種類、患者の症状、年齢、体重、投与形態等によって異なり、それらに応じて適宜設定する。
本発明はまた、Vimentin又はその機能的断片と特異的に結合し得るか否かを指標として、アレルギー疾患の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法を提供する。
本発明に用いられる「試験化合物」は、いかなる公知化合物でも新規化合物でもよく、これらとしては、特に制限はされないが、例えば、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、抗体、有機もしくは無機の低分子化合物、有機もしくは無機の高分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物等由来の天然成分等が挙げられる。
本スクリーニング方法において、Vimentin又はその機能的断片は、精製あるいは未精製のタンパク質(ポリペプチド)又はその(機能的)断片として用いることもできるし、細胞内で発現した状態で使用することもできる。
Vimentin又はその(機能的)断片は、(1)それらを産生する細胞の培養物又は組織を原料として単離精製する方法、(2)化学的に合成する方法、又は(3)遺伝子組換え技術等によりVimentin又はその(機能的)断片を発現するように操作された細胞から精製する方法等の公知手法を適宜用いることによって取得することができる。
本発明のVimentin又はその(機能的)断片の単離精製は、例えば、以下のようにして行うことができる。すなわち、Vimentin又はその(機能的)断片を発現している組織、あるいは適当な液体培地中でVimentin又はその(機能的)断片を発現している細胞を培養して得られる培養物から公知の方法で抽出、精製される。当該抽出、精製の方法は目的生成物の存在する画分に応じて適宜公知の手法が用いられる。
該方法は、具体的には以下のようにして行なわれる。
まず、組織あるいは培養物をそのまま濾過又は遠心分離等の常法に付して組織もしくは細胞あるいは上清を回収する。細胞中に所望するタンパク質が蓄積されている場合には、当該回収した細胞を適当な緩衝液剤中に懸濁して、さらに界面活性剤を適当な濃度で加えて膜を可溶化する。界面活性剤としてはドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド(CTAB)等が挙げられるが、これらは強力なタンパク質変性作用を有するので、タンパク質が生物活性を持つように折り畳まれるためには、例えばTritonX−100等の穏やかな非イオン性界面活性剤を用いることが好ましい。
次いで、得られる粗抽出液を、必要ならば界面活性剤の存在下で、一般に用いられる方法を適宜組み合わせることによって該タンパク質又はその機能的断片を単離精製する。一般に用いられる方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、SDS−PAGE等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動等の等電点の差を利用する方法等が挙げられる。より具体的には、例えば、減圧濃縮、凍結乾燥、常用の溶媒による抽出、pH調整、陰イオン交換樹脂又は陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂等の常用の吸着剤による処理、結晶化、再結晶化等の慣用の方法によって分離、精製することができる。
化学合成による本発明のVimentin又はその(機能的)断片の製造は、例えば、配列番号2に示されるアミノ酸配列情報を基に、ペプチド合成機を用いて合成あるいは半合成することにより行うことができる。
また、遺伝子組換え技術等によりVimentin又はその(機能的)断片を発現するように操作された細胞から取得する場合には、具体的には以下のようにして行う。
まず、Vimentin又はその機能的断片をコードする遺伝子を機能的に含有する発現ベクターを調製する。
Vimentin又はその機能的断片をコードする遺伝子は、いかなる方法で得られるものであってもよい。例えば、mRNAから調製される相補DNA(cDNA)、ゲノミックライブラリーから調製されるゲノミックDNA、化学的に合成されるDNA、RNA又はDNAを鋳型としてPCR法により増幅させて得られるDNA及びこれらの方法を適当に組み合わせて構築されるDNA等が含まれる。
例えば、配列番号1(GenBank登録番号M14144)に示されるヒトVimentinの全コード領域の塩基配列から実質的になるDNAの全部又は一部を含むDNA等が例示される。また、上記塩基配列中の任意の塩基を置換、欠失させる技術(例えばインビトロ突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発等)を利用することもできる。
ここで、「実質的になるDNA」とは、上記特定の塩基配列からなるDNAに加えて、ストリンジェントな条件(本発明では、塩基配列において約60%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上の相同性を有するDNAがハイブリダイズし得る条件をいい、ストリンジェンシーはハイブリダイズ反応や洗浄の際の温度、塩濃度等を適宜変化させることにより調節することができる)において、上記の特定塩基配列からなるDNAとハイブリダイズし得る塩基配列からなるDNAを意味する。
ストリンジェントな条件は、所望する相同性やオリゴヌクレオチドの長さ等をもとに適宜当分野で利用されている計算式に当てはめて算出することができる。例えば、42℃でのハイブリダイゼーション、及び1×SSC、0.1%のSDSを含む緩衝液による42℃での洗浄処理や、65℃でのハイブリダイゼーション、及び0.1×SSC、0.1%のSDSを含む緩衝液による65℃での洗浄処理等が例示される。
得られたDNAを原核細胞及び/又は真核細胞の各種の宿主内で複製保持又は自律増殖できるプラスミドベクター及びファージベクター等に適当な制限酵素部位を利用して挿入することによってVimentin又はその機能的断片をコードする遺伝子を機能的に含有する発現ベクターを得ることができる。
ここで「機能的に」とは、そのベクターに適合する宿主細胞内で該遺伝子(DNA)が転写され、それにコードされるタンパク質が産生され得るように該遺伝子が配置されていることを意味する。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、Vimentin又はその機能的断片をコードする遺伝子、終止コドン及びターミネーター領域が連続的に配列された発現カセットを有するベクターである。形質転換体選択のためには選択マーカー遺伝子をさらに含有することが好ましい。
例えば哺乳動物細胞を形質転換する場合、動物ウイルス、例えばSV40、RSV、MMLV等のプロモーター及びポリアデニル化シグナルが制限酵素部位、好ましくはマルチクローニング部位を介して連結したプラスミドに、pSV2−neo、pSV2−dhfr等のプラスミド由来の選択マーカー遺伝子(ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素等)を挿入したプラスミドが使用できる。
宿主細胞は使用する発現ベクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞或いは人工的に樹立された組換え細胞等種々の細胞が利用できる。具体的には、大腸菌、枯草菌等の細菌、酵母等の真菌類、動物細胞又は昆虫細胞等が例示される。好ましくは哺乳動物細胞、特にラット由来細胞、ハムスター由来細胞(CHO、BHK等)、マウス由来細胞(COP、L、C127、Sp2/0、NS−1、NIH T3等)、サル由来細胞(COS1、COS3、COS7、CV1、Velo等)及びヒト由来細胞(HeLa、2倍体線維芽細胞由来細胞、ミエローマ細胞、Namalwa、Jurkat細胞等)が挙げられる。
発現ベクターの宿主細胞への導入は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、哺乳動物細胞に導入する場合、リン酸カルシウム共沈澱法、プロトプラスト融合法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、リソソーム法等が挙げられる。
Vimentin又はその機能的断片は上記のごとく調製される発現ベクターを含む形質転換体を培養することによっても製造することができる。培地は、宿主細胞(形質転換体)の生育に必要な炭素源、無機もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストリン、可溶性デンプン、ショ糖等が、窒素源としては、例えばアンモニウム塩、硝酸塩、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、馬鈴薯抽出液等が例示される。また所望により他の栄養素〔例えば、無機塩(塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム等)、ビタミン類、抗生物質(テトラサイクリン、ネオマイシン、カナマイシン、アンピシリン等)〕を含んでいてもよい。
培養は当分野において知られている方法により行われる。培養条件はタンパク質の発現が可能な条件であって、例えば温度、培地のpH及び培養時間は当該タンパク質が大量に生産されるように適宜選択される。
例えば、宿主が動物細胞である場合、培地としては例えば約5〜20%のウシ胎児血清(FCS)を含む最小必須培地(MEM)、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)、RPMI−1640培地、199培地等を用いることができる。培地のpHは約6〜8であることが好ましく、培養は通常30〜40℃で約15〜72時間行われ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
本発明のVimentin又はその機能的断片は上記培養により得られる培養物から、前述のVimentin又はその機能的断片を発現している細胞あるいは組織からの抽出・単離・精製と同様にして採取することができる。
かくして得られたVimentin又はその機能的断片と、試験化合物との接触処理は、通常当分野で実施されている結合実験に準じて行うことができる。具体的にはVimentin又はその機能的断片、あるいは試験化合物のいずれかを固相担体に固定化し、Vimentin又はその機能的断片を固定化した場合には試験化合物を含有する溶液を、試験化合物を固相担体に固定化した場合にはVimentin又はその機能的断片を含有する溶液(精製タンパク質溶液あるいは細胞抽出液や組織抽出液などの粗精製タンパク質溶液)を、該固相担体に接触させる。カラム法やバッチ法等が利用できる。
試験化合物がVimentin又はその機能的断片に特異的に結合するか否かを判定する工程は、試験化合物とVimentin又はその機能的断片とを接触させる工程をどのようにして行ったかによって適宜変更し得るが、例えば試験化合物が固定化された固相担体(例えばビーズ樹脂)を充填してなるカラムを用いた場合、続くVimentin又はその機能的断片を含有する溶液(試料)の添加により、両者の間に特異的な親和性がある場合にはVimentin分子が固相担体上に結合する(特異的な親和性がない場合には結合しない)。結合したVimentin又はその機能的断片を緩衝液の極性を変える、あるいは過剰の試験化合物をさらに加える等の処理によって固相上から解離させ、その後同定したり、あるいは固相上の試験化合物と結合した状態でそのまま界面活性剤等によって抽出して同定したりすることもできる。同定方法としては具体的には電気泳動法、免疫学的反応を用いたイムノブロッティングや免疫沈降法、クロマトグラフィー、マススペクトラム、アミノ酸シーケンス、NMR等の公知の手法により、またこれらの方法を組み合わせて実施する。Vimentin又はその機能的断片が固相上に捕捉されるかあるいはカラムの素通り画分中に含まれるか否か、あるいはその程度等を測定することによって、試験化合物がVimentinに特異的に結合し得るか否かを判定し、結合する化合物を選択する。
また、本工程は自動化されていてもよい。例えば2次元電気泳動で得られた種々の分子のデータを直接読み取り、既存のデータベースに基づいて分子の同定を行うことも可能である。
さらに、Vimentin又はその機能的断片を細胞内で発現した状態で使用する場合には、RI標識や蛍光標識等の各種のラベリング技術を駆使してVimentin又はその機能的断片と試験化合物との結合の有無、結合の程度を測定することもできる。本発明のスクリーニング方法における「Vimentin又はその機能的断片と試験化合物との接触」にはこのような態様も含まれる。細胞と試験化合物との接触条件は使用する細胞やVimentin又はその機能的断片の細胞内での発現状況等の要因により適宜設定される。また、Vimentin又はその機能的断片が細胞内で発現しているか否かはそれらに対する抗体等を用いて予め確認しておくことが好ましい。
上記の手順により得られた化合物の抗アレルギー剤としての効果は、例えば、文献:Cell Calcium 26(6),261−269(1999):に見られるような炎症メディエーターの分泌作用の抑制効果等によって確認することができる。
[実施例1]インタール固定化樹脂の合成
(1)1,3−ビス(2−カルボキシクロモン−5−イルオキシ)−2−ハイドロオキシプロパンの合成
1,3−ビス(2−カルボキシクロモン−5−イルオキシ)−2−ハイドロオキシプロパンのジナトリウム塩(1g)を水50mlに溶解させ、希塩酸を加えpHを3とする。析出した白色結晶を濾取し、水、エタノール、エーテルで洗浄した。減圧下で乾燥し、1,3−ビス(2−カルボキシクロモン−5−イルオキシ)−2−ハイドロオキシプロパンの白色結晶(600mg、収率66%)を得た。
1H−NMR(DMSO−d6) δ:4.30(4H,d),4.36(1H,t),5.32(1H,bs),6.86(2H,s),7.11(2H,d),7.17(2H,d),7.71(2H,t).
(2)1,3−ビス(2−カルボキシクロモン−5−イルオキシ)−2−ハイドロオキシプロパン固定化樹脂の合成
(a)1,3−ビス(2−カルボキシクロモン−5−イルオキシ)−2−ハイドロオキシプロパンの固定化
1,3−ビス(2−カルボキシクロモン−5−イルオキシ)−2−ハイドロオキシプロパン(187.3mg,0.4mmol)のアセトニトリル懸濁液(4.8ml)にホスゲンのトルエン溶液(1.65mol/l,24μl)を加えた。得られた反応液をそのまま室温において1時間攪拌した。スピードバック装置(approx.−90kPa)で5分間減圧濃縮後、得られた濃縮液をTOYOパール樹脂(TSKgel AF−amino,1ml)、ジイソプロピルエチルアミン(35μl,0.2mmol)のアセトニトリル懸濁液(5ml)に加え、室温で終夜攪拌させた。得られた樹脂をアセトニトリル、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水の順にそれぞれ5回ずつ洗浄した。
(b)アセチルキャッピング
(a)の工程で得られた樹脂に無水酢酸(2ml)、DMF(8ml)を加え、1時間室温で処理させた後、DMF、20%エタノール水溶液で5回洗浄した。反応終点はニンヒドリン反応で残存アミノ基が観測できなくなることで確認した。最後にTOYOパール樹脂を5回洗浄した。
[実施例2]結合実験
(1)RBL−2H3細胞ライセートの調製
RBL−2H3細胞(250mg)を混合液A(2.5ml,50mM Sucrose,300μM N,N−ジエチルジチオカルバメートナトリウム塩,25mM Urea,2mM ジチオスレイトール,1μM CaCl2,25mM Tris−HCl pH7.5)に混ぜ、超音波により破砕した。9,000rpmで10分間遠心分離し、得られた上清をライセートとして使用した。なお、実験はすべて4℃あるいは氷上で行った。
(2)結合実験
製造例1で調製した試験化合物が固定化された固定化樹脂および実施例2(1)で調製したRBL−2H3細胞ライセートを用い、下記に示す手順で結合実験を行った。
樹脂(10μl)とライセート(1ml)を4℃で約1時間、静かに振とうした。その後、遠心分離操作を行い、各々の上澄みを注意深く採集した。そして、各上澄み液を再びフレッシュな化合物結合樹脂(10μl)と混合した。この時、分離した化合物結合樹脂を1回目の結合実験樹脂として4℃にて静かに保存しておく。1時間ほど静かに撹拌した後に、遠心分離操作を行い、上澄み液を除去した。こうして2回目の結合実験で得られた化合物結合樹脂と1回目で得られた樹脂とを混合液Aにて5回程度丁寧に洗浄し、樹脂上に結合するタンパク質以外を出来る限り除いた。こうして得られた各化合物結合樹脂に30μLのSDS用loading buffer(nakalai Cat.NO=30566−22、電気泳動用sample buffer solution with 2−ME(2−mercaptoethanol)(2X)for SDS PAGE)を加え、25℃で10分間撹拌した。こうして得られたサンプル液を市販のSDSゲル(BioRad readyGel J,10%SDS,cat.NO=161−J371V)で分離し、そのSDSゲルを解析した(図1)。1回目で得られた結合樹脂上に結合するタンパク質を含むサンプル液の電気泳動像(図1、レーン1)、および2回目で得られた結合樹脂上に結合するタンパク質を含むサンプル液の電気泳動像(図1、レーン2)とを比較した。
その結果、インタールを固定した樹脂にVimentinが結合し、しかもその結合は、化合物結合樹脂との1回目の結合実験で顕著に確認され、2回目の結合実験では殆ど観察されないことから特異的な結合であることが示された。
[実施例3]BiacoreによるVimentinとインタールとのKd値測定
<インタールPEGアミンの合成>
1,3−ビス(2−カルボキシクロモン−5−イルオキシ)−2−ハイドロオキシプロパン(117mg,0.25mmol)のジメチルホルムアミド溶液(2ml)にPEGアミン(80mg,0.25mmol)、水溶性カルボジイミド(WSCD;44μl,0.25mmol)、HOBt(34mg,0.25mmol)を加え終夜室温にて攪拌した。反応粗生成物を抽出した後、薄層クロマトグラフィーにて精製した。PEG体の白色固体(130mg,0.17mmol、収率67%)を得た。
PEG体(130mg,0.17mmol)の水−テトラヒドロフラン溶液(1.5ml;1:2)に濃塩酸(0.5ml)を加え室温で2時間攪拌した。減圧濃縮後、反応粗生成物をHP20にて分離精製した。PEG体の白色固体(67mg,0.1mmol、収率59%)を得た。
1H−NMR(CD3OD) δ:1.77−1.84(4H,m),3.01(2H,t),3.40(2H,t),3.46−3.53(12H,m),4.30−4.32(5H,m),6.90(1H,d),6.92(1H,d),7.04(1H,d),7.05(1H,d),7.49−7.66(2H,m).
LC−MS:671.1,純度99%(254nm)
<インタール固定化チップの合成>
Biacore社CM5チップ(#BR−1000−14)に、BIAapplications Handbook(Biacore刊)記載の方法で、上記で合成したインタールPEGアミンを固定化した。なお、対照データは、同じ方法で2−エタノールアミンを固定化したチップを用いることによって得た。
<Vimentinサンプル作製>
Vimentinは、PROGEN Biotechnik社より購入したStandard Human Vimentin(cat.No.62015)を、Runningバッファー(0.25M Sucrose,25mM Tris−HCl pH7.5,0.3mM N,N−ジエチルジチオカルバメートナトリウム,25mM ウレア、1mM 塩化カルシウム)でバッファー交換をしてKd測定に用いた。
<Kd値測定>
Kdの測定は、Biacore3000(Biacore)を用いたSPR(表面プラズモン共鳴)スペクトル測定によって行った。上記の手順で作製したCM5上にインタールを固定化したチップに、上記のRunningバッファーを毎分20μlで流した。ここに、上記の手順で作製したVimentinを段階的に希釈したサンプル(0.29nM−4.6μM)を各5分間注入し、得られたSPRスペクトルをBIAevaluation software Ver.4.1(Biacore)で解析することにより、Kd:56nMを得た。
以上の結果より、インタールとVimentinとの相互作用は特異的結合であることが証明された。
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