JP2002531085A

JP2002531085A - ヒト・バニロイド受容体およびその使用

Info

Publication number: JP2002531085A
Application number: JP2000585397A
Authority: JP
Inventors: デラニー、ナタリー・サマンサ; サンソー、フィリップ; テイト、サイモン・ニコラス
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1998-12-01
Filing date: 1999-11-30
Publication date: 2002-09-24
Also published as: EP1517144A3; EP1135490A1; EP1517144A2; GB9826359D0; US20060099682A1; WO2000032766A1; AU1968400A

Abstract

(57)【要約】本発明は、新規ヒトバニロイド受容体（hVR）タンパク質、特にhVR1及びhVR3、新規hVRタンパク質をコードする核酸、並びにヒト患者のhVR活性調節に応答する疾患の治療または予防に有用な薬剤をスクリーニングする方法に使用するためのhVRタンパク質を提供する。本発明は、前記核酸を含む発現ベクター、前記発現ベクターを含む適切な細胞株、新規hVRタンパク質に特異的な抗体、hVR調節活性を示す化合物を同定する方法、このような方法によって同定可能で且つ同定された化合物、及びヒト患者のhVR活性調節に応答する疾患を治療または予防する方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】

本発明はヒト・バニロイド受容体（ｈＶＲ）タンパク質に関し、ヌクレオチド
配列、発現ベクター、細胞株、抗体スクリーニング方法、化合物、産出の方法お
よび処理の方法、そして他の関連する態様に関する。

【０００２】

【発明の背景】

唐辛子の中の刺激源でありバニロイドファミリーの一員であるカプサイシンは
、感覚ニューロンのサブグループである侵害受容器を活性化する。これらのニュ
ーロンは、侵害受容性および温度受容性の痛みの情報を、脊髄および脳のような
中枢神経系内の痛み産出中心に伝達する。これらはまた、末梢における前炎症性
メディエーターの放出のための部位でもある（１）。侵害受容体は、そのカプサ
イシンに対する感受性において異質性を示す。これらのニューロンのカプサイシ
ンへの刺激と長期の曝露は、それらがカプサイシンおよび他の有害刺激に不感受
性となる（３）脱感作として知られる難治性の状態を伴う（２）。不感受性に対
する長期応答は、侵害受容器の死またはその末梢末端の崩壊によって説明するこ
とができた（４）。この脱感作現象のために、カプサイシンは、広い範囲の障害
での痛みの処置のための鎮痛薬剤として数十年間治療的に使用されてきた。

【０００３】カプサイシンに関する内因性の標的が、痛み刺激の検出に重要な機能を果たし
ていることが推測されてきた。カプサイシンが、脊髄神経節（ＤＲＧ）ニューロ
ンでのカチオンの流出を誘導することが電気生理学的および生化学的研究によっ
て示されてきた（６、７）。他のバニロイド誘導体は、用量依存的様式で応答を
示し（８、９）、受容体は機構を説明するための最も可能性のある候補である。
したがって間接的な証拠に基づいて、カプサイシンのこれらの活性（興奮／脱感
作）が、バニロイド受容体と命名された特定の膜結合受容体によって仲介される
ことが予想されてきた（１０）。

【０００４】バニロイド受容体の存在の証拠は、カプサイシンの類似体であるレジニフェラ
トキシン（ＲＴＸ）での（１１）、そしてカプサイシンの競合的アンタゴニスト
であるカプサゼピンでの（１２）結合実験より得られた。バニロイド受容体は、
ヒトを含む様々な種の脊髄神経節（ＤＲＧ）および脊髄での（［^３Ｈ］−ＲＴＸ
）オートラジオグラフィーを用いて視覚化された（１３、１４）。

【０００５】最近、ＶＲ１と呼ばれるラットバニロイド受容体が、相当するタンパク質をコ
ードしている相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をラットＤＲＧｃＤＮＡライブラリー
から単離するための発現−クローニング戦略を使用して同定された（１５）。こ
のｃＤＮＡクローンは完全に配列決定された。ラットＶＲ１ｃＤＮＡは２，５
１４ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを持ち、９５，０００の予想
される分子量を持つ８３８アミノ酸のタンパク質をコードしている。アミノ酸配
列の解析により、膜貫通領域５および６の間に短い疎水性領域を持つ６つの潜在
的な膜貫通領域が同定された。Ｎ−末端（アミノ末端）は３つのアンキリン繰り
返し領域を含む。Ｃ−末端（カルボキシ末端）には如何なるモチーフも同定され
なかった。

【０００６】ラットＶＲ１をトランスフェクトした細胞が、熱処理の後にカルシウム濃度の
増加を示すことが注目され、ｉｎｖｉｖｏでＶＲ１およびバニロイド受容体が
（無害な熱ではなく）有害な熱の検出に関与することが示唆されてきた。また、
プロトンがバニロイド受容体のモジュレーターとして働き得ることが提唱されて
きた（１６、１７、１８）。

【０００７】ラットカプサイシン受容体ＶＲ１は、リガンドによってゲート制御される非選
択的イオンチャネルのファミリーの一員であり、痛覚に関与することが認識され
てきた一方で、ＶＲ１の本来のリガンドは未知のままである。したがって、ヒト
バニロイド受容体サブタイプは、新規の鎮痛薬剤（アゴニストおよびアンタゴニ
スト）および他の障害と相互作用する可能性のある薬剤の発展のための標的を提
供する可能性があることが示唆される。

【０００８】したがって、ヒトバニロイド受容体の位置を突き止め、特性を調べることが本
発明の目的である。本発明の他の目的は以下のその詳細な記述より明らかになる
であろう。

【０００９】

【発明の概要】

本発明の１つの実施様態にしたがえば、単離されたヒトバニロイド受容体（ｈ
ＶＲ）タンパク質またはその変種が提供される。好ましくは、ｈＶＲタンパク質
はｈＶＲ１またはｈＶＲ３タンパク質またはその変種である。本発明のとりわけ
好ましい態様において、ｈＶＲタンパク質は図３または図１８で示したようなア
ミノ酸配列を持つ。

【００１０】本発明の他の態様にしたがえば、ヒトの患者におけるｈＶＲ活性、好ましくは
ｈＶＲ１またはｈＶＲ３活性の調節感受性の障害の処置または予防で有用な薬剤
をスクリーニングする方法で使用するための、ヒトバニロイド受容体（ｈＶＲ）
タンパク質またはその変種、好ましくはｈＶＲ１またはｈＶＲ３またはその変種
が提供される。好ましくは、この障害は痛み、神経傷害性の痛み、炎症痛、慢性
痛、手術後の痛み、リウマチ様関節炎痛、神経障害、神経痛、痛覚過敏、神経変
質、神経損傷、発作、虚血性偏頭痛、過敏腸症候群（ＩＢＳ）、喘息または慢性
閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のような呼吸障害、糖尿病性神経障害のような泌尿器
障害、失禁および間質性膀胱炎または炎症障害である。

【００１１】本発明の他の態様にしたがえば、本明細書以上で記述したようなヒトバニロイ
ド受容体（ｈＶＲ）タンパク質またはその変種をコードしているヌクレオチド配
列、またはそれに相補的なヌクレオチド配列が提供される。好ましくはこのヌク
レオチド配列はｈＶＲ１、ｈＶＲ３タンパク質またはその変種またはそれに相補
的なヌクレオチド配列をコードしている。とりわけ好ましくは、このヌクレオチ
ド配列は図２および図１７で示したようなものである。

【００１２】本発明の他の態様にしたがえば、本明細書以上で記述したようなｈＶＲタンパ
ク質またはその変種、好ましくはｈＶＲ１またはｈＶＲ３またはその変種を発現
することが可能な以上で言及したような核酸配列を含む発現ベクターが提供され
る。好ましくはこの発現ベクターは図６または図２０で表示したようなものであ
る。

【００１３】本発明の他の態様にしたがえば、本明細書以上で記述したようなｈＶＲタンパ
ク質またはその変種、好ましくはｈＶＲ１またはｈＶＲ３またはその変種を発現
可能である以上で言及したような発現ベクターを含んでいる安定細胞株が提供さ
れる。この安定細胞株は好ましくは改変された哺乳動物細胞株、好ましくはＨＥ
Ｋ２９３、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａまたはＢＨＫであり、また一過性発現はア
フリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞で好ましい。

【００１４】本発明の他の態様にしたがえば、本明細書以上で記述したようなｈＶＲタンパ
ク質またはその変種に特異的な、好ましくはｈＶＲ１またはｈＶＲ３またはその
変種に特異的な抗体が提供される。

【００１５】本発明の他の態様にしたがえば、本明細書以上で記述したようなｈＶＲタンパ
ク質およびその変種、好ましくはｈＶＲ１またはｈＶＲ３またはその変種を試験
化合物と接触させ、調節活性または不活性を検出することを含む、ｈＶＲ調節活
性を示している化合物の同定のための方法が提供される。

【００１６】本発明の他の態様にしたがえば、以上で言及した方法によって同定可能である
ｈＶＲ活性、好ましくはｈＶＲ１またはｈＶＲ３の活性を調節する化合物が提供
される。

【００１７】本発明の他の態様において、ヒト患者での、ｈＶＲ活性、好ましくはｈＶＲ１
活性またはｈＶＲ３活性の調節に感受性の障害の処置または予防のための薬剤の
製造における、以上で言及した方法で同定可能であるｈＶＲ活性、好ましくはｈ
ＶＲ１またはｈＶＲ３の活性を調節する化合物の使用が提供される。好ましくは
この障害は痛み、神経傷害性の痛み、炎症痛、慢性痛、手術後の痛み、リウマチ
様関節炎痛、神経障害、神経痛、痛覚過敏、神経変質、神経損傷、発作、虚血性
偏頭痛、過敏腸症候群（ＩＢＳ）、喘息または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の
ような呼吸障害、糖尿病性神経障害のような泌尿器障害、失禁および間質性膀胱
炎または炎症障害である。

【００１８】本発明の他の態様にしたがえば、ヒト患者において、前記患者に、効果量の以
上で言及した方法によって同定可能な化合物を投与することを含む、ｈＶＲ活性
、好ましくはｈＶＲ１またはｈＶＲ３活性の調節に感受性の障害の処置または予
防の方法が提供される。好ましくはこの障害は痛み、神経傷害性の痛み、炎症痛
、慢性痛、手術後の痛み、リウマチ様関節炎痛、神経障害、神経痛、痛覚過敏、
神経変質、神経損傷、発作、虚血性偏頭痛、過敏腸症候群（ＩＢＳ）、喘息また
は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のような呼吸障害、糖尿病性神経障害のような
泌尿器障害、失禁および間質性膀胱炎または炎症障害である。

【００１９】本発明の他の態様したがえば、化合物カプサイシン、レシニフェラトキシン、
ピペリン、ジンゲロン、ポリドジアル、ワルブルガナル、アフラモジアル、シナ
モジアル、シナモスモリド、シナモリド、イソベレラル、スカララジアル、アン
シストロジアル、β−アカリジアル、スクチゲラル、メルリジアル、アナンダミ
ドおよびカプサゼピンを除く、以上で言及した方法によって同定可能な、ｈＶＲ
活性、好ましくはｈＶＲ１またはｈＶＲ３の活性を調節する化合物が提供される
。

【００２０】本発明の態様にしたがえば、治療での使用のために、化合物カプサイシン、レ
シニフェラトキシン、ピペリン、ジンゲロン、ポリドジアル、ワルブルガナル、
アフラモジアル、シナモジアル、シナモスモリド、シナモリド、イソベレラル、
スカララジアル、アンシストロジアル、β−アカリジアル、スクチゲラル、メル
リジアル、アナンダミドおよびカプサゼピンを除く、以上で言及した方法によっ
て同定可能な、ｈＶＲ活性、好ましくはｈＶＲ１またはｈＶＲ３の活性を調節す
る化合物が提供される。

【００２１】本発明の態様にしたがえば、ヒト患者において、ｈＶＲ活性、好ましくはｈＶ
Ｒ１活性またはｈＶＲ３活性の調節に感受性である障害の治療または予防のため
の薬剤の調製における、化合物カプサイシン、レシニフェラトキシン、ピペリン
、ジンゲロン、ポリドジアル、ワルブルガナル、アフラモジアル、シナモジアル
、シナモスモリド、シナモリド、イソベレラル、スカララジアル、アンシストロ
ジアル、β−アカリジアル、スクチゲラル、メルリジアル、アナンダミドおよび
カプサゼピンを除く、以上で言及した方法によって同定可能な、ｈＶＲ活性、好
ましくはｈＶＲ１またはｈＶＲ３の活性を調節する化合物の使用が提供される。
好ましくは、この障害は、痛み、神経傷害性の痛み、炎症痛、慢性痛、手術後の
痛み、リウマチ様関節炎痛、神経障害、神経痛、痛覚過敏、神経変質、神経損傷
、発作、虚血性偏頭痛、過敏腸症候群（ＩＢＳ）、喘息または慢性閉塞性肺疾患
（ＣＯＰＤ）のような呼吸障害、糖尿病性神経障害のような泌尿器障害、失禁お
よび間質性膀胱炎または炎症障害である。

【００２２】本発明の態様にしたがえば、ヒト患者での、化合物カプサイシン、レシニフェ
ラトキシン、ピペリン、ジンゲロン、ポリドジアル、ワルブルガナル、アフラモ
ジアル、シナモジアル、シナモスモリド、シナモリド、イソベレラル、スカララ
ジアル、アンシストロジアル、β−アカリジアル、スクチゲラル、メルリジアル
、アナンダミドおよびカプサゼピンを除く、以上で言及した方法によって同定可
能な、効果量の化合物を前記患者に投与することを含む、ｈＶＲ活性、好ましく
はｈＶＲ１活性またはｈＶＲ３活性の調節に感受性の障害の治療または予防の方
法が提供される。好ましくは、この障害は、痛み、神経傷害性の痛み、炎症痛、
慢性痛、手術後の痛み、リウマチ様関節炎痛、神経障害、神経痛、痛覚過敏、神
経変質、神経損傷、発作、虚血性偏頭痛、過敏腸症候群（ＩＢＳ）、喘息または
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のような呼吸障害、糖尿病性神経障害のような泌
尿器障害、失禁および間質性膀胱炎または炎症障害である。

【００２３】本発明の他の態様にしたがって、以上で言及した方法によって同定可能な化合
物が提供される。

【００２４】本発明の他の態様にしたがえば、治療での使用のための、以上で言及した方法
によって同定可能な化合物が提供される。

【００２５】本発明の他の態様にしたがえば、ヒト患者でのｈＶＲ活性、好ましくはｈＶＲ
１活性またはｈＶＲ３活性の調節に感受性の障害の治療または予防のための薬剤
の製造における以上で言及した方法によって同定可能な化合物の使用が提供され
る。好ましくはこの障害は、痛み、神経傷害性の痛み、炎症痛、慢性痛、手術後
の痛み、リウマチ様関節炎痛、神経障害、神経痛、痛覚過敏、神経変質、神経損
傷、発作、虚血性偏頭痛、過敏腸症候群（ＩＢＳ）、喘息または慢性閉塞性肺疾
患（ＣＯＰＤ）のような呼吸障害、糖尿病性神経障害のような泌尿器障害、失禁
および間質性膀胱炎または炎症障害である。

【００２６】本発明の他の態様にしたがえば、ヒト患者で、以上で言及した方法によって同
定可能な効果量の化合物を前記患者に投与することを含む、ｈＶＲ活性、好まし
くはｈＶＲ１活性またはｈＶＲ３活性の調節に感受性の障害の治療または予防の
方法が提供される。好ましくはこの障害は、痛み、神経傷害性の痛み、炎症痛、
慢性痛、手術後の痛み、リウマチ様関節炎痛、神経障害、神経痛、痛覚過敏、神
経変質、神経損傷、発作、虚血性偏頭痛、過敏腸症候群（ＩＢＳ）、喘息または
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のような呼吸障害、糖尿病性神経障害のような泌
尿器障害、失禁および間質性膀胱炎または炎症障害である。本発明の他の態様にしたがえば、ｈＶＲタンパク質またはその変種、好ましく
はｈＶＲ１またｈＶＲ３またはその変種の発現を得るのに好適な条件下で、好ま
しい細胞株内に、ｈＶＲタンパク質またはその変種、好ましくはｈＶＲ１または
ｈＶＲ３またはその変種をコードしているヌクレオチドを含む好適なベクターを
導入することを含む、本明細書以上で記述したようなｈＶＲタンパク質またはそ
の変種、好ましくはｈＶＲ１またはｈＶＲ３またはその変種を産出する方法が提
供される。

【００２７】

【発明の詳細な記述】

本明細書および請求の範囲を通して、「〜からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、
「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「〜からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「
〜からなっている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」
、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」のような言葉は、包括的に解釈される
べきである。つまり、これらの言葉は状況が許す限り、特に列挙した以外の他の
要素または完全体の可能な包含を意味するものである。

【００２８】上記のように、本発明は単離されたヒトバニロイド受容体（ｈＶＲ）タンパク
質に関連し、とりわけそれぞれヒトバニロイド受容体１および３（ｈＶＲ１、お
よびｈＶＲ３）と呼ばれるヒトバニロイド受容体に関し、その配列情報は図２（
ｈＶＲ１）および図１７（ｈＶＲ３）に示す。本発明に関しては「単離された（
ｉｓｏｌａｔｅｄ）」という言葉は、少なくともある程度まで精製されているか
またはたとえば組換え方法により合成的に生成されている範囲では、受容体タン
パク質が本来の状態にないことを意味しようとしている。したがって「単離され
た」という言葉は、受容体タンパク質が細胞、細胞または細胞断片の懸濁物、タ
ンパク質、ペプチド、有機または無機溶媒、または適切なその他の物質のような
他の生物学的または非生物学的物質と組み合わさっている可能性も含むが、受容
体タンパク質が本来の状態である場合は排除される。

【００２９】慣例の方法は、次の実験項でさらに記載したように、本発明にしたがって受容
体タンパク質を精製および／または合成するために採用され得る。そのような方
法は当業者によく知られており、参照のためにすべてが本明細書に含まれている
開示物、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔａｌ．（２８）に開示されている技術も
含む。

【００３０】「変種（ｖａｒｉａｎｔ）」という言葉が本明細書および請求項において意味
することは、配列情報が規定されているヒトバニロイド受容体の同様の本質的な
性質を保持する他のペプチドまたはタンパク質が、本発明の範囲内に含まれるこ
とである。例えば、提供された配列と８０％以上、好ましくは少なくとも９０％
、特に好ましくは少なくとも９５％の相同性を持つ他のペプチドまたはタンパク
質は、当該受容体タンパク質の変種とみなす。そのような変種は、ペプチドがヒ
トバニロイド受容体の生物学的機能を維持していれば、タンパク質配列中の単一
アミノ酸またはアミノ酸群の欠失、変異、付加を含んでよい。もちろん、この生
物学的機能はカプサイシン、カプサゼピン（１２）およびレジニフェラトキシン
（１１）のような公知のバニロイドモジュレーターを用いた伝導結合学により評
価することができる。

【００３１】ヒトＶＲ１はヒト脊髄神経節（ＤＲＧ）において選択的にみられ、ＶＲ３と相
関的であるが、ラットＶＲ１と高度な配列相同性を持つ。したがって、ｈＶＲ１
はラットＶＲ１に対しヒトオルトログである可能性がある。ｈＶＲ３はラットＶ
Ｒ１と同様性はほとんどなく、広範囲の組織でみられる。ｈＶＲ１のヌクレオチ
ド配列分析により８３９アミノ酸からなるタンパク質をコードしている２５１７
ｂｐのオープンリーディングフレームが明らかになった（図２、３および４を参
照のこと）。この導き出されたｈＶＲ１タンパク質配列はラットＶＲと１８６％
一致し（１５）、膜貫通領域５および６と３つのアンキリン繰り返し領域を含む
Ｎ−末端間に疎水性部をもつ６つの膜貫通領域のようなその多くの共通の性質を
共有している。同様に、ｈＶＲ３は９６３アミノ酸からなるタンパク質をコード
している２８８９ｂｐオープンリーディングフレームを持つ（図１７、１８およ
び１９を参照のこと）。導き出されたｈＶＲ３タンパク質はラットＶＲ１に４６
％一致し、ｈＶＲ１には４４％一致し、膜貫通領域５および６と３つのアンキリ
ン繰り返し領域を含むＮ−末端間に疎水性部をもつ６つの膜貫通領域のようなＶ
Ｒ１の性質を多く共有している。

【００３２】本発明はまた、ヒトバニロイド受容体タンパク質またはその変種、およびそれ
と相補的なヌクレオチド配列をコードしているヌクレオチド配列も含む。好まし
くはヌクレオチド配列はＤＮＡ配列であり、最も好ましくはｃＤＮＡ配列である
。好ましくはタンパク質はｈＶＲ１、ｈＶＲ３またはその変種である。そのよう
なヌクレオチドは当業者によく知られている方法に従って単離または合成するこ
とができる。その明細書は全て参照のために本明細書に含めた、参考文献２８を
参照のこと。

【００３３】本発明はまた、ｈＶＲ、好ましくはｈＶＲ１またはｈＶＲ３、受容体タンパク
質またはその変種をコードしているヌクレオチド配列からなる発現ベクターも含
む。本発明のさらなる態様は、ｈＶＲ１またはｈＶＲ３受容体タンパク質または
その変種をコードしているヌクレオチド配列からなる発現ベクターに関する。そ
のような発現ベクターは、分子生物学の領域において普通に構築され、例えばプ
ラスミドＤＮＡおよび適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサーおよ
び例えばタンパク質発現のために必要だと考えられ正しい位置にあるポリアデニ
ル化シグナルのようなその他の要素を用いてよい。本発明の実施に用いるのに公
的なベクターとしては、哺乳類発現に必要なｐＣＩＮ（３２）（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈよりｐｌＲＥＳ‐ｎｅｏとして得られる）、ｐＣＤＮＡ３，１（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ）またはｐＣｌｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を持つｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
、ｐＣＲ２，１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）があげ
られる。適切な方法は多くの標準研究法に記載されている以下のプロトコールに
より影響され得る（２８、２９）。

【００３４】本発明はまた、新規受容体を発現させるように改変した細胞系も含む。そのよ
うな細胞系は、哺乳類細胞または昆虫細胞のような一過性の、または好ましくは
安定した高等真核細胞系、酵母のような低等真核細胞または細菌細胞のような原
核細胞を含む。本発明にしたがって、受容体タンパク質をコードしているベクタ
ーの導入により改変した細胞の特定の例には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびツメガ
エル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞が含まれる。適切な宿主の典型的な例としては
、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＣＯＳ，ＨｅＬａおよびＢＨＫのような動物細胞があ
げられる。

【００３５】本発明の受容体は、例えバキュロウイルス発現系におけるような細胞系または
膜における一過性の発現が可能である。本発明にしたがって受容体の発現に利用
されるが、そのような系はまた本発明の範囲に含まれる。

【００３６】特に、機能的ｈＶＲタンパク質は、ｈＶＲ１およびｈＶＲ３または他のｈＶＲ
タンパク質亜種またはまだ同定されていない接合変種から選択されるｈＶＲ受容
体タンパク質を含んでよい。

【００３７】他の態様にしたがって、本発明はまた、標準の技術によって作製され、本発明
にしたがった受容体タンパク質またはその変種に特異的である抗体、好ましくは
モノクローナル抗体に関する。そのような抗体は、たとえば精製、単離または免
疫沈降を含むスクリーニングで有用でありえ、またｈＶＲタンパク質機能、好ま
しくはｈＶＲ１またはｈＶＲ３タンパク質機能をさらに解明するためのツールと
して、または実際にそれ自身治療薬剤として使用してよい。抗体は、本発明にし
たがった受容体の特異的エピトープに対して作製してもよい。

【００３８】本発明の重要な態様は、受容体リガンドとして働き、受容体活性の調節するの
に有用である可能性のある化合物を同定するために設計したスクリーニング方法
での、本発明にしたがった受容体タンパク質の使用である。一般的な用語では、
そのようなスクリーニング方法には、関連している受容体タンパク質、好ましく
はｈＶＲ１またはｈＶＲ３を、試験化合物と接触させ、次いで受容体の活性の調
節を検出するか、またはむしろ結果として受容体不活性を検出することを含む。
スクリーニング戦略のさらなる詳細は、図１５に記す。本発明はまた、その範囲
内に、以上で言及したスクリーニング方法によって、有用なｈＶＲ調節活性、好
ましくはｈＶＲ１またはｈＶＲ３調節活性を持つように同定される化合物を含む
。本発明に含まれるスクリーニング方法は、一般的に当業者によく公知である。
高処理量選別には、カルシウム感受性色素と共にＦｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃＩ
ｍａｇｉｎｇＰｌａｔｅＲｅａｄｅｒ（ＦＬＩＰＲ）を使用した蛍光に基づ
いたアッセイ、カルシウムの流出で光が発光され、イメージング系を使用して検
出可能であるカルシウム感受性光タンパク質を使用たレポーター遺伝子アッセイ
が含まれてよい。第二選別には、小分子、抗体、ペプチド、タンパク質または他
の型の活性を調節するためにｈＶＲ、好ましくはｈＶＲ１またはｈＶＲ３と結合
する化合物を同定するための、パッチクランプ技術を用いた電気生理学的アッセ
イが含まれてよい。第３選別には、よく特性化されたラットおよびマウスの傷み
モデルでのモジュレーターの研究が含まれてよい。これらの傷みのモデルには、
カラゲナン、ホルマリンおよび完全アジュバント（ＣＦＡ）のような炎症剤の移
植片注入が含まれるが、限定はしない。坐骨神経のルーズリガチャーのような神
経傷害性の痛みのモデルも含まれる。他の選別には、ヒトボランティア対象での
、局所適用カプサイシンに対するモジュレーターの研究が含まれてよい。

【００３９】本発明の他の態様は、ヒト患者でのｈＶＲ、好ましくはｈＶＲ１またはｈＶＲ
３受容体活性に感受性の障害の治療または予防での、以上で言及したスクリーニ
ング技術によって同定された化合物の使用である。語句「調節（ｍｏｄｕｌａｔ
ｉｏｎ）」によって意味することは、受容体での化合物のリガンド結合による受
容体部位でアゴニズムまたはアンタゴニスムのどちらかが存在するということで
ある。語句「調節」によって意味することは、化合物カプサイシン、レシニフェ
ラトキシン、ピペリン、ジンゲロン、ポリドジアル、ワルブルガナル、アフラモ
ジアル、シナモジアル、シナモスモリド、シナモリド、イソベレラル、スカララ
ジアル、アンシストロジアル、β−アカリジアル、スクチゲラル、メルリジアル
、アナンダミドおよびカプサゼピンを除く、受容体における化合物のリガンド結
合により受容体部位でアゴニズムまたはアンタゴニスムのどちらかが存在すると
いうことである。ｈＶＲ、好ましくはｈＶＲ１またはｈＶＲ３タンパク質は、中
枢神経系（ＣＮＳ）、胃腸（ＧＩ）管、肺および膀胱の障害に関連し、したがっ
て、これらの組織でのｈＶＲ、好ましくはｈＶＲ１またはｈＶＲ３受容体活性の
調節は、結果としてそのような障害に関連した陽性の治療結果となる可能性があ
る。とりわけ、本発明にしたがったスクリーニング技術を使用して同定される可
能性のある化合物は、痛み、神経傷害性の痛み、炎症痛、慢性痛、手術後の痛み
、リウマチ様関節炎痛、神経障害、神経痛、痛覚過敏、神経変質、神経損傷、発
作、虚血性偏頭痛、（ＩＢＳ）、喘息または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のよ
うな呼吸障害、糖尿病性神経障害のような泌尿器障害、失禁および間質性膀胱炎
または炎症障害のような障害の治療および／または予防に関して有用性を持つ可
能性がある。しかしながら、そのような障害の記載は例であるのみであり、本発
明の範囲を限定する意図はない。

【００４０】以上で概略したスクリーニング方法にしたがって同定した化合物は、薬理学の
分野では慣例であり、その開示が参考文献としてその全体が本明細書に含まれる
、Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ
ｓ，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，ＥａｓｔｅｒｎＰｅ
ｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１７ｔｈＥｄ，１９８５に完全に記述されたような、
標準の薬理学的に許容可能な担体および／または賦形剤と共に処方されてよい。

【００４１】化合物は、口、頬、肛門、肺、静脈、動脈、筋肉内、腹腔内、局所、または好
ましい投与経路のような内部または非経口経路を介して投与してよい。

【００４２】本発明は、さらに付随する実験項での例によってさらに説明されるであろう。
参照実施例を提供する。

【００４３】

【実施例】

参照実施例Ａ：ｉｎｓｉｌｉｃｏ解析によるラットＶＲ１配列に対する関連
ヒトＥＳＴ（発現配列タグ）（１９）の同定全長ラットＶＲ１アミノ酸配列（１５）を、ｔＢｌａｓｔｎ（２０）アライメ
ントプログラムを使用して探索配列として使用し、ｄｂＥＳＴ（２１）およびＩ
ｎｃｙｔｅ（ＩｎｃｙｔｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，３１
７４ＰｏｒｔｅｒＤｒｉｖｅ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
９４３０４，ＵＳＡ）データベースで関連ヒト遺伝子を同定した。いくつかの
ヒトＥＳＴｓが単離され、さらなる解析のために相同性が５０％以上であるもの
を選別した。これらのＥＳＴｓの１つは、すでに７０アミノ酸の領域上で６８％
のアミノ酸同一性、および８４％の類似性があることがすでに示された（１５）
Ｔ１２２５１であった。このクラスターによって発現された遺伝子の全長クロー
ニングおよび機能的特性化は完了している（３０）。この遺伝子はｈＶＲＬ−１
と表し、ラットＶＲ１タンパク質と４８％同一である７６４アミノ酸タンパク質
のタンパク質をコードしていた。両方のデータベースからのすべてのヒトＥＳＴ
ｓをクラスターし、同一の転写物に属している重複している同一のＥＳＴｓを同
定した。ＧＣＧパッケージ（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅＶｅｒｓｉ
ｏｎ９．０，ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ），
Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）および本研究所内で発展させたＥＳＴＢ
ｌａｓｔと呼ぶプログラムを使用し、これらのクラスターを構築した。合計で、
異なる組織源および両方のＥＳＴデータベースに由来する４３のＥＳＴｓを１０
の群にクラスターし、それらのクラスターの１つはｈＶＲＬ−１と表した。残り
の９つのクラスターはｈＶＲａ、ｈＶＲｂ、ｈＶＲｃ、ｈＶＲｄ、ｈＶＲｅ、ｈ
ＶＲｆ、ｈＶＲｇ、ｈＶＲｈおよびｈＶＲｉと命名した。それぞれのＥＳＴに関
して、組織源はｄｂＥＳＴおよびＩｎｃｙｔｅデータベースでの注釈に従って指
定した。明白な開始コドン存在せず、クラスター配列がラットＶＲ１転写物より
も短かったので、これらのクラスターはどれも全長バニロイド受容体転写物を表
している可能性はなかった。最終的に、ｈＶＲｇ、ｈＶＲｈおよびｈＶＲｉは単
一のコンティグ（contig）に崩壊した。配列解析により、これらのｃＤＮＡはキ
メラである可能性が示された。５’末端はラットＶＲ１遺伝子と弱い相同性を持
つが、３’末端はＤＮＡ結合タンパク質と同一である。その転写物に関してさら
なる研究は追跡しなかった。

【００４４】参照実施例Ｂ：ラットＶＲ１遺伝子に対するヒトオルトログの単離（参照実施
例Ｂ１−Ｂ４）参照実施例Ｂ１：ヒトＶＲ１のｉｎｓｉｌｉｃｏ組立１０のクラスターからのコンセンサスヌクレチド配列を、ラットＶＲ１配列に
対してｔＢｌａｓｔｘプログラム（２０）で探索し、最もありうるオープンリー
ディングフレームを同定した。配列トレースファイルが入手可能な場合、フレー
ムシフトを修正した。それぞれのクラスターをＢｌａｓｔｘの結果に従ったラッ
トＶＲ１アミノ酸配列に対して整列させた。Ｂｌａｓｔｘ整列プログラム（２０
）を使用し、全長ラットＶＲ１タンパク質と１０のクラスターのアミノ酸配列を
比較した。最も高い相同性を持つ３つのクラスターを図１に表示し、ラットＶＲ
１遺伝子と整列させた。

【００４５】クラスターｈＶＲａは、ラットＶＲ１配列の５’と高い相同性を持つが（１０
７アミノ酸配列領域上で７０％同一性および７５％類似性）、潜在的な開始コド
ンを持っているようには見られなかった。同一の組織である膀胱、および同一の
患者から由来した２つのＥＳＴｓ（ＥＳＴ１およびＥＳＴ２）が含まれた。この
クラスターがほとんどラットＶＲ１との高い相同性を持つ５’であり、膀胱組織
が感覚ニューロンが混ざる可能性があったので、これらの２つのＥＳＴｓをさら
なる調査のために選択した。両方のｃＤＮＡクローンを注文したが、ＥＳＴ２が
回収手順を失敗したので、クローンＥＳＴ１のみを得た。

【００４６】９０残基上で８９％同一性および９２％類似性を持つ２つのＥＳＴ（ＥＳＴ３
およびＥＳＴ４）からなるクラスターｈＶＲｂは、ネズミ配列に対して高い程度
の相同性を示した。両方の配列間の重なり合いは遺伝子の中央に向かって局在し
た。

【００４７】ｈＶＲｃ（ＥＳＴ５）はまた、ラットＶＲ１と高い相同性（６５残基上で７１
％同一性および７５％類似性）を持つが、ラットタンパク質配列のＣ−末端にと
ても関連した。

【００４８】参照実施例Ｂ２：クローンの配列決定すべてのＤＮＡ配列を、ＡＢＩ３７３Ａ／３７７シークエンサー（Ａｐｐｌ
ｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してジデオキシ鎖末端化方法に基づいて
自動化ＤＮＡシークエンシングによって決定した。配列特異的プライマーを、。
「Ｂｉｇ−Ｄｙｅ」ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎ
ｇキット（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に使用した。ヌクレ
オチド配列を、ウイスコンシン大学ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒ
ｏｕｐパッケージからのプログラムを用いて解析した。

【００４９】さらにとりわけ、ＥＳＴをシークエンシングする場合、以下のプロトコールを
適用した。ＥＳＴ１クローンを標準の手順を用いて増殖させ、Ｑｉａｇｅｎカラ
ムを用いてＤＮＡを単離した。クローニング部位に隣接するＳＰ６（５’ＡＴＴ
ＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ）およびＴ７（５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡ
ＣＴＡＴＡＧＧＧ）プライマーを使用して両末端を配列決定した。ダイターミネ
ーター反応のためにプラスミドＤＮＡ（０．６ｐｍｏｌ）をそれぞれ１０．０ｐ
ｍｏｌのプライマーと共に使用した。ＳＰ６末端はｉｎｓｉｌｉｃｏ由来ＥＳ
Ｔ配列に一致した（ＥＳＴ１と同一である）。Ｔ７末端はＶＲ１と相同性を持た
ず、長いリーディングフレームまたはポリアデニル化モチーフどちらも持たなか
った。挿入物の大きさをエンドヌクレアーゼＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩでのＤＮ
Ａの酵素消化によって決定し、およそ３ｋｂであると計算した。

【００５０】プラスミドＤＮＡ（５０ｎｇ）を使用し、Ｔ７およびＳＰ６をプライマーとし
たポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって挿入物を増幅させた。ＰＣＲ条件は
、初期ホットスタート９４℃２分間を含み、続いて３５サイクルの９４℃４５秒
間、５０℃４５秒間および７２℃１分間、そして７２℃５分間で終了した。得ら
れたＰＣＲ増幅物を１．２％アガロースゲル上で分離し、大きさとして〜３ｋｂ
であることが示された。

【００５１】ＰＣＲ産物を全配列決定するために、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を両方の末端か
ら分解するヌクレアーゼ−Ｂａｌ−３１技術を使用した（２３）。ＰＣＲ産物の
エタノール沈殿後、ペレットを（干渉液構成物を加えた）３０ｍｌの１×Ｂａｌ
−３１緩衝液内に再懸濁した。２ユニットのＢａｌ−３１酵素（ＲｏｃｈｅＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）での時間経過消化を９０分間か
けた１２の時点で行った（３０秒、１、２、３、５、７、１０、１５、２５、４
５、７５、９０分間）。３つのプールを消化１〜４、５〜８および９〜１２より
それぞれ作製した。それぞれのプールを平滑末端化し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅか
らのｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＳＫ（＋）プラスミド内にＳｒｆＩ部位でサブクロ
ーン化した。形質転換後、それぞれのプールからの１６コロニーを、隣接するＲ
ｅｖｅｒｓｅ（５’ＧＧＡＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ）およびＭ１３
−２０（５’ＧＴＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ）プライマーでのＰＣＲによっ
て選別した。プールあたり６つの陽性コロニーの単位複製配列を、Ｔ３（５’Ａ
ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ）およびＴ７プライマーを用いた直接
シークエンシング（２４）にかけた。得たＤＮＡ配列をＧＣＧパッケージを用い
て整理し、翻訳し、Ｂｌａｓｔツールを用いてラットＶＲ１遺伝子に対して整列
させた。解析後、３０７９ｂｐ単位複製配列が６０３ｂｐと１２２１ｂｐの２つ
のイントロンを持つことが示された。後者のイントロンはＰＣＲ産物の３’末端
に局在した。コード配列は１２５５ｂｐをおおい、前者イントロンによって分離
されていた。したがって、クローンＥＳＴ１は、部分的にスプライシングされた
、不完全なｃＤＮＡである可能性があった。

【００５２】クラスター１ｂ（ＥＳＴ３）に属する、腎臓ｃＤＮＡライブラリー由来のクロ
ーンを注文し、Ｂａｌ−３１技術を用いて配列決定した。ＧＣＧパッケージを使
用した配列の整理の後、同一重複をクラスターｈＶＲｃのＤＮＡ配列で同定した
。さらにポリアデニル化シグナルを持つ３’末端およびテールを同定した。結合
させたｈＶＲｂＢａｌ−３１由来配列およびｈＶＲｃの完全な配列は２０６３
ｂｐ（コード配列１０２０ｂｐおよび３’非転写配列の１０４３ｂｐ）であった
。

【００５３】参照実施例Ｂ３：ポリメラーゼ連鎖反応を用いたｈＶＲ１の中央部分の増幅本発明者らは、両方の配列（ｈＶＲａおよびｈＶＲｂ／ｃ）が共通の転写物の
部分であったという仮説を考えた。ヒトおよびラットＶＲ１が類似しているなら
ば、２つのｃｏｎｔｉｇｓはおよそ２７５ｂｐのギャップで分離されるべきであ
る。プライマーをギャップの両側で設計し、ギャップをクローン化するために脳
組織からのｍＲＮＡを増幅した。センスプライマー（５’ＴＣＴＡＣＴＴＣＧＧ
ＴＧＡＡＣＴＧＣＣＣ）およびアンチセンスプライマー（５’ＡＣＧＧＣＡＧＧ
ＧＡＧＴＣＡＴＴＣＴＴＣ）によってスメアを得た。特異性に関して５０ｎｇの
ＰＣＲ産物をネスト化したセンス（５’ＣＴＧＣＡＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＣＡＧ
Ａ）およびアンチセンス（５’ＧＴＣＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＴＧＧＡＡＡＡ）プ
ライマーで増幅した。９００ｂｐのネスト化した単位複製配列を配列決定し、１
つの末端でｈＶＲａと、そして他の末端でｈＶＲｂ／ｃと同一であることが示さ
れた。ＰＣＲ産物の中間部分はラットＶＲ１配列と相同的であった。この領域は
９１アミノ酸に相当した。ｈＶＲａ、ｈＶＲｂ／ｈＶＲｃの配列および内部単位
複製配列を結合した場合、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の総全長は
８２４アミノ酸であり、１０４３ｂｐの３’非転写配列が続いた。ヒトアミノ酸
配列はコード領域の部分上でラット配列に８７％同一である。この配列は、ラッ
トＶＲ１配列とのその高い同一性の程度によりｈＶＲ１と命名した。

【００５４】参照実施例Ｂ４：ＰＡＣ単離によるｈＶＲ１の５’末端の単離開始コドンが５’末端で同定されなかったので、全長配列を同定するためにさ
らなる戦略を設計した。２つのプライマー、センス（５’ＴＣＣＴＣＴＧＧＣＴ
ＴＣＣＡＡＣＣＣＧＴＴ）およびアンチセンス（５’ＧＡＡＣＴＧＧＧＣＡＧＡ
ＡＡＧＴＧＣＣＴ）を設計し、参照実施例Ｂ２で言及した第一イントロンから１
５０ｂｐ産物を増幅した。Ｐ１人工クロモソーム（ＰＡＣ）ゲノムクローン（２
５）をＰＡＣライブラリー（ＧｅｎｏｍｅＳｙｓｔｅｍｓ，ＳｔＬｏｕｉｓ
，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）のＰＣＲスクリーニングによって単離した。ＰＡＣＤＮ
Ａを標準のプラスミド単離プロトコール（２６）を使用することで回収した。ア
ンチセンスプライマーを設計し（５’ＣＴＧＧＡＧＴＴＡＧＧＧＴＣＴＣＣＡＴ
ＣＣ）、遺伝子の潜在的な５’末端に対するゲノムクローンを配列決定した。開
始コドンを持つオープンリーディングフレームを同定した。遺伝子構造を、Ｇｅ
ｎＳｃａｎソフトウェアを用いることで確かめた（２７）。完全な遺伝子は、２
５１７ｂｐのヌクレオチド配列を持ち（図２）、８３９アミノ酸タンパク質をコ
ードしていた（図３および４）。この遺伝子をｈＶＲ１と名付けた。ｈＶＲ１と
ラットＶＲ１のアミノ酸配列の多重整列化は、両方の配列間の明らかな程度の同
一性および類似性を示している（図５）。ｒＶＲ１およびｈＶＲ１アミノ酸配列
は８６％同一である。さらにタンパク質解析の後、６つの膜貫通領域および３つ
のアンキリン結合領域が、ラットＶＲ１遺伝子内のようにｈＶＲ１内で同定され
た。

【００５５】実施例１：ヒトＤＲＧからのｈＶＲ１の全長増幅およびクローニングベクター
内への組立ＨＶＲ１をヒトＤＲＧ鋳型から３つの部分でＰＣＲ増幅した。５’断片を、Ｎ
ｏｔＩ部位および強力なコザックモチーフ、続いて遺伝子特異的配列をコードし
ているセンスプライマー（５’ＧＴＣＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣ
ＣＡＴＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＣ）およびアンチセンスプライマー
（５’ＡＧＧＣＣＣＡＣＴＣＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣ）を用いて増幅した。本増幅
で使用した温度循環条件には、９４℃４分間でのホットスタート、続いて３５サ
イクルの、９４℃１分間、５４℃１分間、７２℃１分間が含まれる。７２℃にて
５分間の最終伸張工程で反応が完了した。得られたＰＣＲ産物を２％アガロース
ゲル上で分離し、ＴＯＰＯ^ＴＭＴＡＣｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に備えられた取扱説明書にしたがってｐＣＲ（登録商標）
ＩＩ−ＴＯＰＯ内にクローン化した。ｈＶＲ１の中間部分を、センスプライマー
：５’ＧＡＣＧＡＧＣＡＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡおよびアンチセンスプライマ
ー：５’ＧＴＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＴＧＧＡＡＡＡを用いてＰＣＲ増幅
した。循環条件には、９４℃４分間でのホットスタート、続いて３５サイクルの
、９４℃、５６℃および７２℃１分間が含まれる。７２℃にて５分間の最終伸張
工程で反応が完了した。およそ８７０ｂｐのバンドを２％アガロースゲルよりと
り、ＴＯＰＯ^ＴＭＴＡＣｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キットによって詳述され
たように、ベクターｐＣＲ２．１（登録商標）−ＴＯＰＯ内にクローン化した。
最後に３’末端をセンスプライマー：５’ＴＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＡＣＡＧＴＧ
ＡＧＡおよびクローニングのためのＥｃｏＲＩ部位をコードしているアンチセン
スプライマー：５’ＴＧＣＡＣＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＡＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣ
ＣＴＣＡＧを用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件には、９４℃での９０秒間のホ
ットスタート、引きつづく３５サイクルの９４℃５０秒間、５０℃５０秒間、７
２℃５０秒間が含まれる。循環は５分間の７２℃工程で完了した。ＰＣＲ産物を
２％アガロースゲル上で分離し、ベクターｐＣＲ２．１（登録商標）−ＴＯＰＯ
内にクローン化した。

【００５６】それぞれの３つのｈＶＲ１断片に関する得られたクローンを配列決定解析にか
け、コンセンサス配列をコードしている分離クローンを、遺伝子の全長組立で使
用した。ＮｏｔＩ／ＤｒａＩＩＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）
消化５’末端断片を、中央ＤｒａＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片とともにＮｏｔＩ／Ｅ
ｃｏＲＩ制限ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）内にライゲーションした。最後に、残っている３’末端を、ＭｓｃＩおよ
びＥｃｏＲＩ制限部位を介して得られた構造物内に導入し、得られた構造物のマ
ップは図６Ａで表示した。

【００５７】いくつかのクローンを配列解析のために選別し、構造がｈＶＲ１コンセンサス
配列をコードしていることを確かめた。ついでこれらをＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩで
消化し、図６Ｂで例示したように、哺乳動物発現ベクターｐＣＩＮ５−ｎｅｗ（
ＩＶＳ欠失およびＥＭＶＣＩＲＥＳ上流の直後のネオマイシンリン酸転移酵素
の開始コドンを保存している３６ｂｐ欠失を持つｐＣＩＮ（３２）の改変ベクタ
ー）内にライゲーションした。

【００５８】実施例２：クロモソームの局在化ＰＡＣクローンを単離するのに使用したプライマー（参照実施例Ｂ４）を、Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈＧｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａ）
より商業的に入手可能なスタンフォードからのＧ３放射ハイブリッドパネル上で
のＰＣＲのために選択した。陽性レーンおよび陰性パターンを、スタンフォード
大学の公的なウェブサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｓｇｈｃ．ｓｔａｎｆｏ
ｒｄ．ｅｄｕ）を用いて解析した。解析の後、ｈＶＲ１遺伝子はマーカーＳＨＧ
Ｃ−３６０７３（ロードスコア＝９．５５）の周囲のヒトクロモソーム１７に局
在することが明らかになった。

【００５９】実施例３：ｍＲＮＡ分布ｈＶＲ１の組織分布をスロット−ブロットハイブリッド形成にて確立した。Ｒ
ＮＡを、吸引ポンプを介した吸引によってスロットブロッター内でサンドイッチ
したＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎハイブリッド形成転写膜（ＤＵＰＯＮＴ）上に写した
。一回膜を２×ＳＳＣ（３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．３Ｍクエン酸ナトリウム
ｐＨ７）で２分間洗浄し、紫外線クロスリンカー（ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆ
ｅＳｃｉｅｎｃｅ）を使用して、１分間、１５０００ｕＷ／ｃｍ^２にてＵＶに
暴露し、膜上でのＲＮＡの架橋を可能にした。ブロット上のＲＮＡ量は未知であ
る。プローブを以下の２つのプライマー、５’ＴＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＡＣＡＧ
ＴＧＡＧＡおよび５’ＧＴＧＧＡＡＡＡＣＣＣＧＡＡＣＡＡＧＡで、ｈＶＲ１の
コード領域の２６０ｂｐ産物のＰＣＲ増幅によって得た。膜を４時間、１０％硫
酸デキストラン、１％ＳＤＳ（硫酸ドデシルナトリウム）および１ＭＮａＣｌ
溶液中で６０℃にて揺らしながらハイブリッド形成させた。プローブは、前ハイ
ブリッド形成溶液１ｍｌあたりおよそ５００，０００ｃｐｍの標識化プローブを
得るように、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ^ＴＭＤＮＡ標識化系（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を
用いて［α３２Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で標識化した。簡単には、総
量４５μｌ中で１００ｎｇのプローブを３分間煮沸し（変性）ついで氷上で２分
間冷却した。これを３μｌの３２ＰｄＣＴＰと共に、キットからの標識化チュ
ーブに加え、引きつづいて３７℃にて３０分間インキュベートした。８μｇ／ｍ
ｌの濃度での４００μｌのＨｅｒｒｉｎｇＳｐｅｒｍＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）
を標識化プローブに加え、９９℃にて３分間熱し、引きつづいてすぐに氷上で冷
却した。標識化したプローブを前ハイブリッド形成溶液に加え、よく混合した。
膜を５５℃にて一晩ハイブリッド形成させた。

【００６０】ついで膜を、まず室温にて２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中で５分間、ついで５
０℃にて２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中で３０分間洗浄した。必要ならば、１×
ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳまたは０．１×ＳＳＣおよび０．１％にて同一の温
度にて３０分間でさらなる洗浄を行った。ついで膜を−７０℃にて一晩、増強ス
クリーンを用いてＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｍａｇｉｎｇＦｉｌｍＡＲ（Ｋ
ｏｄａｋ）に感光させ、フィルムを現像した。

【００６１】結果を図７に示めす。強力なシグナルが陽性対照で観察された（スロット４Ｂ
および５Ｂ）。シグナルがヒトＤＲＧスロット上で検出された（１Ａおよび１Ｂ
）。水対照ではシグナルは検出されなかった（スロット３Ｂ）。広範囲の組織で
の３つの多重組織ノザンブロット（Ｃｌｏｎｔｈｅｃｈ）もまた同様のプローブ
でハイブリッド形成させたが、シグナルは検出されなかった。ＲＴ−ＰＣＲをさ
まざまな組織で、プローブを増幅するのに使用したプライマーの組み合わせで行
った。強いバンドがＤＲＧＲＮＡで検出された。これらのハイブリッド形成を
一緒に考えると、ｈＶＲ１はニューロン組織およびとりわけＤＲＧで特異的に発
現していることが示唆される。

【００６２】実施例４：高ｈＶＲ１抗体の設計と産出ペプチドＣＨＩＦＴＴＲＳＲＴＲＬＦＧＫＧＤＳＥＥＡＳＣ（ペプチド６８）
およびＣＧＳＬＫＰＥＤＡＥＶＦＫＤＳＭＶＰＧＥＫ（ペプチド６９）を、標準
の固相技術によって合成し、ゲル濾過クロマトグラフィーによって精製した。こ
れらのペプチドを、スルホ−ＳＭＣＣ（スフホサクシミジル４−［Ｎ−マレイ
ミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシレート）を用いてそのＣｙｓ残
基を介して担体タンパク質、ツベルクリンＰＰＤ（精製したタンパク質誘導体）
に結合させた。先にカルメット‐ゲラン杆菌（ＢａｃｉｌｌｕｓＣａｌｍｅｔ
ｔｅＧｕｅｒｉｎ、ＢＣＧ）で刺激したウサギに、およそ１か月周期で、フロ
イント不完全アジュバント中に懸濁させて得られた共役物を接種させた。血清を
、それぞれの免疫後７日目にとった血液試料から調製した。特異的抗体反応を、
抗原として自由ペプチドを使用して間接的な酵素結合イムノソルベントアッセイ
（ＥＬＩＳＡ）によっておった。免疫グロブリンを、固定化したペプチド親和性
カラム（ｓｕｌｐｈｏｌｉｎｋＰｉｅｒｃｅ）を用いて高力価血清より精製し
た。ペプチド６８共役物を与えたウサギをＭ１４３、１４４および１４５と表し
、ペプチド６９共役物を与えたウサギをＭ１４６、１４７、１４８と表した。

【００６３】抗体を、ＨＥＫ２９３細胞内で発現した組換え体タンパク質の特異的染色によ
って評価した。全細胞溶解物を、試料緩衝液（４ｍｌｄＨ_２Ｏ、１ｍｌ０．
５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、０．８ｍｌグリセロール、１．６ｍｌ
１０％ｗ／ｖＳＤＳ、０．４ｍｌ２−β メルカプトエタノールおよび
０．２ｍｌの０．０５％ｗ／ｖブロモフェノールブルー）中に調製し、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥによってタンパク質を分離し、エレクトロブロッティングによってニ
トロセルロースフィルターに写した。抗血清とのインキュベーションに続き、結
合した免疫グロブリンをＨＲＰ−共役二次抗体および増幅化学ルミネセンス（Ｅ
ＣＬ）検出を用いて明らかにした。抗血清は、ＶＲ１トランスフェクト細胞の抽
出物中の好ましい分子量のタンパク質（群）に特異的な結合を示したが、対照抽
出物では示さず、これは図８で例示した。

【００６４】実施例５：特異的抗体を用いたｈＶＲ１のインサイチュー局在化精製した免疫グロブリンを、ラットＤＲＧ組織切片の免疫組織化学的染色のた
めに使用した。固定化したＤＲＧの凍結切片を抗体と共に、０．１から０．５μ
ｇ／ｍｌの間の濃度で、４℃にて４８時間インキュベートした。洗浄工程に続い
て、結合した抗体を間接的免疫蛍光検査によって検出した。抗体は、図９で表示
したように、末梢感覚神経の小直径細胞体のみを認識した。この観察は、予想さ
れたようにヒト配列と交差反応を示している抗−ペプチド６８ペプチド抗体に対
してヒトＤＲＧでも見られた。図１０Ａは、ＤＲＧ細胞体の標識化を示しており
、矢印は、小直径神経細胞体を指し、図１０Ｂにおいては、矢印はヒト皮膚を刺
激する標識されたニューロンを示している。

【００６５】実施例６：哺乳動物細胞発現（実施例６ａ−６ｂ）実施例６ａ：哺乳動物細胞でのｈＶＲ１の一過性発現ＨＥＫ２９３細胞を、ポリ−ｌ−リジンコートカバーグラスを含む６ウェルプ
レート上に、ウェルあたり５×１０^４細胞まいた。翌日、新鮮な培地を細胞に加
えた（５０％コンフレント）。ＤＮＡトランスフェクションに関して、ＣａｌＰ
ｈｏｓＭａｍｍａｌｉａｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＰｒｏｔｏｃｏｌ（
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｋ２０５１−１）を使用した。細胞のそれぞれのウェルに対
して、溶液Ａを、８μｇｈＶＲ１ｐＣＩＮ５、２μｇｐＥＹＦＰ−Ｎ１レポ
ーターＤＮＡ、１２．４μｌカルシウム溶液を含めて作製し水で１００μｌにし
た。溶液Ｂ（ヘペス緩衝食塩水）をゆっくりと、溶液Ａを滴下して加えながらボ
ルテックスした。混合液を室温で２０分間インキュベートし、ついで細胞に加え
た。プレートをゆっくりとゆすり、溶液を分散させた。細胞を３７℃にて５時間
インキュベートし、ついで、リン酸緩衝食塩水で洗浄した。新鮮な培養培地を加
え、プレートを機能解析のために２４〜４８時間インキュベートした。

【００６６】実施例６ｂ：哺乳動物細胞でのｈＶＲ１の安定発現ＨＥＫ２９３細胞を、ウェルあたり１×１０^５細胞で、６ウェルプレート上に
まいた。翌日、新鮮な培地を細胞に加えた（５０％コンフレント）。ＤＮＡトラ
ンスフェクションに関して、ＣａｌＰｈｏｓＭａｍｍａｌｉａｎＴｒａｎｓ
ｆｅｃｔｉｏｎＰｒｏｔｏｃｏｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｋ２０５１−１）を使
用した。細胞のそれぞれのウェルに対して、溶液Ａを、２μｇｈＶＲ１ｐＣ
ＩＮ５、１２．４μｌ２Ｍカルシウム溶液を含み水で１００μｌにして作製し
た。溶液Ｂ（ヘペス緩衝食塩水）をゆっくりと、溶液Ａを滴下して加えながらボ
ルテックスした。混合液を室温で２０分間インキュベートし、ついで細胞に加え
た。プレートをゆっくりとゆすり、溶液を分散させた。細胞を３７℃にて５時間
インキュベートし、ついで、リン酸緩衝食塩水で洗浄した。新鮮な培養培地を加
え、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２にて４８時間インキュベートした。細胞を、
８００μｇ／ｍｌのジェネティシンをふくむ選択培地中で１００ｍｍディシュ内
に回収した。ついで細胞をインキュベートし、４日間の間隔で養分を与えた。合
計１０日間目に、視覚可能なクローンに増殖させるために、それぞれの単一細胞
に対して選別が必要である。よく分離したクローンをそれぞれ、保持培地（４０
０μｇ／ｍｌジェネティシン）を含む９６ウェルプレートの別々のウェルに（
ギルソンチップで）拾い上げた。細胞を、凍結保存および機能解析のためにフラ
スコ内に広げた。膜のカルシウムイメージングのために安定細胞を６ウェルプレ
ート中のポリ−ｌ−リジンコートカバーグラス上に１×１０^５細胞でまいてよい
。

【００６７】実施例７：ｈＶＲ１の機能解析（実施例７ａ−７ｃ）実施例７ａ：パッチクランプ法を用いた電気生理学ＨＥＫ２９３細胞に一過性に発現しているヒトＶＲ−１チャネルのカプサイシ
ンによる活性化を調査した。ポリ−ｌ−リジンコートカバーグラス上で増殖した
細胞を、記録チャンバー（０．５ｍｌ）に置き、細胞外溶液（２ｍｌ／ｍｉｎ）
を注いだ。細胞外溶液は、ＮａＣｌ（１４０ｍＭ）、ＫＣｌ（５ｍＭ）、ＭｇＣ
ｌ_２（２ｍＭ）、ＣａＣｌ_２（２ｍＭ）、４−（２−ヒドロエチル）−１−ピペ
ラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ）およびグルコース（１０ｍＭ
）が含まれる。ｐＨをＮａＯＨで７．４にあわせ、浸透圧は３１０−３２０ｍＯ
ｓｍ／ｌの範囲であった。パッチピペット（ボロシアン酸ガラス）をＳｕｔｔｅ
ｒＰ−９７電極引き具を用いて引いた。ピペットを、ＣｓＣｌ（１４０ｍＭ）
、エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’
−テトラ酢酸Ｃｓ塩（Ｃｓ−ＥＤＴＡ、５ｍＭ）およびＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）
からなる内部溶液で満たした。ｐＨをＣｓＯＨを用いて７．２５にあわせ、浸透
圧は２７５−２９０ｍＯｓｍの範囲であった。この内部溶液で満たしたときに、
パッチ電極は２−５ＭΩの抵抗を持った。電流を、Ａｘｏｐａｔｃｈ２００Ａ
増幅子を用いた標準全細胞電圧クランプ記録技術（３１）を用いて、室温（２１
−２３℃）で記録し、シグナルを２または０．１ｋＨｚでサンプリングした。多
くの連続した抵抗エラー（８０−８５％）を補正回路構成で最小化した。膜電位
は、連結電位（＜４ｍＶ）に関して校正しなかった。電圧をパルスし、データ回
収を、増幅器を備えたｐＣｌａｍｐ８ソフトウェア（ＡｘｏｎＩｎｓｔｒｕｍ
ｅｎｔｓ）を用いてオンラインで行った。膜電位はプロトコールの間、−６０ｍ
Ｖで保った。

【００６８】「ファスト−フロー系」を用いて、直接的に記録細胞上にカプサイシンまたは
カプサゼピン（ＣＰＺ）を与えた（平衡まで＜１ｓ）。カプサイシンの効果を、
内部電流を誘発するために膜電位を−６０ｍＶに保持しながらの一定の記録の間
に適用、またはカプサイシンの非存在下および存在下で、電圧勾配（−１００〜
＋６０ｍＶ）を適用することのいずれかで測定した。同様に、カプサイシンの適
用によって引き起こされた電流を記録するこれらの両方の方法を、アンタゴニス
ト（ＣＰＺ）による遮断を明らかにするために使用した。

【００６９】図１１Ａは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で一過性に発現したヒトＶＲ１チャネル上で
のカプサイシン（１μＭ）の適用により、膜が−６０ｍＶの電位で保持された場
合に、内部電流が産出されることを明らかにしている。この応答は、１μＭＣ
ＰＺでなくなり、この遮断は部分的に可逆であった。

【００７０】１μＭカプサイシンの存在下、電圧勾配（−１００〜＋７０ｍＶ）が、本質的
な外部整流を示している電流−電圧関係を産出した。１μＭのＣＰＺの添加は、
完全に電流を遮断した（図１１Ｂ）。また、部分的な回復のみが、とりわけ、陰
電位によって引き起こされた内部電流に対して観察された。

【００７１】２ｍＭ外部カルシウムの存在下でのヒトＶＲ−１チャネルのカプサイシン誘導
脱感作を図１２に例示する。電圧勾配（−１００〜＋７０）を適用し、カプサイ
シン（１μＭ）の添加により外部の整流電流が引き起こされた。カプサイシンの
繰り返し添加は、結果として、応答の大きさでの進行性「減少」となった（図１
２Ａ）。図１２Ｂは、電流の大きさの「減少」を示している、時間に対する＋６
５ｍＶの電位で誘発される電流のプロットを示す。電圧勾配は、毎２０秒適用し
、カプサイシンはおよそ４０秒の間隔で２分間加えた。６回目の添加によって、
電流は約４倍減少した。

【００７２】外部カルシウムを５ｍＭＥＤＴＡで置き換えた場合、電流の大きさは劇的に
増加した（図１２Ｃ）。しかしながら、カルシウムを外部溶液に再適用した場合
、カプサイシン（１μＭ）によって誘発された電流は、（図１２Ａ）で示した６
回目の添加でのものとほぼ同等であった。

【００７３】実施例７ｂ：ｈＶＲ１を発現しているＨＥＫ２９３でのカルシウムイメージン
グｈＶＲ１を一過性または安定に発現しているＨＥＫ２９３細胞を、ウェルあた
り１×１０^５細胞で、ポリ−ｌ−リジンコートカバーグラス上にまいた。これら
を、カルシウムイメージング（ＱｕａｎｔｉＣｅｌｌ７００、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｉｍａｇｉｎｇ）によって翌日解析した。実験の日に、ＷＡＳＨ緩衝液を、最
終濃度２ｍＭまで細胞外培地（ＥＣＭ）にＣａＣｌ_２を加えて調製した（ＥＣＭ
は、１２５ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、２ｍＭＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭ
ＮａＨ_２ＰＯ_４、５ｍＭＮａＨＣＯ_３、１０ｍＭＨｅｐｅｓ、１０ｍＭ
グルコース、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４を含む）。カルシウム感受性色素溶
液を、フラ２−ＡＭ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）のバイアルに、ＤＭ
ＳＯ中の５％プロニックＦ−１２７（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅ）を５０
μｌ加えることで調製した。混合した後、２０μｌのフラ２−ＡＭ溶液を１０ｍ
ｌＷＡＳＨに加えた。次いで１．５ｍｌを細胞に加え、３７℃にて３０分間イ
ンキュベートした。プレートを３回ＷＡＳＨで洗浄した。１ｍｌのＷＡＳＨを加
え、暗所で保存した。アゴニストおよびアンタゴニストをその必要とされるアッ
セイ濃度の５×でＷＡＳＨ中で調製した。試薬およびアッセイ温度は３７℃に保
持した。一過性にトランスフェクトした細胞に関しては、ＹＦＰレポーターＤＮ
Ａ蛍光（４９０ｎｍ励起）をトランスフェクトされた細胞を同定するのに使用し
た。細胞を最初に４００μｌＷＡＳＨ（または３００μｌＷＡＳＨ＋１００
μｌアゴニスト、たとえばカプサゼピン）中でイメージした。およそ１分後、望
ましい濃度の５×での１００μｌのアゴニスト、たとえばカプサイシン、アナダ
ミドまたはレシニフェラトキシン）を加え、最終１×濃度を得た。連続イメージ
（３４０／３８０ｎｍ励起）をとり、アゴニストの添加前（３０〜６０秒間）お
よび添加後（２〜５分間）での細胞内のカルシウム流量応答をモニタした。図１
３は、ラットＶＲ１アンタゴニスト、カプサゼピンの存在下または非存在下での
、以上で言及した異なるアゴニストの効果を見るように設定したそれぞれの試験
に関してとった時間経過を示している。Ｉｍａｇｅｒはまた、図１４に示したよ
うに、時間（秒）に対してそれぞれのカルシウム濃度（ｎＭ）のグラフをプロッ
トする。アゴニストの添加（たとえばカプサイシン、グラフ上で垂直矢印で示し
た）の後、ｈＶＲ１を発現している細胞をカルシウムを流入するように刺激した
。このことは、トレース上のピークの発現によって示される。ピークの高さはｈ
ＶＲ１発現レベルに関連する。発現のレベルの変化は時々、グラフのために選別
した細胞に依存するように見える。プロトンおよび熱の反応を試験するために同
様の実験を行ってよい。

【００７４】実施例７ｃ：ＶＲ１でのＦＬＩＰＲアッセイの使用ＦＬＩＰＲ（蛍光計イメージングプレートリーダー、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉ
ｃＩｍａｉｎｇＰｌａｔｅＲｅａｄｅｒ）は、機能的細胞解析のための高
出力の蛍光に基づいた薬物伝送ツールである。細胞内カルシウムを、カルシウム
感受性色素フロ３−ＡＭでモニタする。ラットＶＲ１を安定に発現しているＨＥ
Ｋ２９３細胞を、ウェルあたり３×１０^４細胞で、９６ウェル、ポリ−ｌ−リジ
ン処理ＦＬＩＰＲプレート内にまいた。翌日に、プレートをＦＬＩＰＲに関して
処理した。ＦＢＰ緩衝液を調製した（１×ＦＬＩＰＲ緩衝液（１４５ｍＭＮａ
Ｃｌ、５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ_２、２ｍＭＣａＣｌ_２、１０ｍＭ
グルコース、２０ｍＭＨｅｐｅｓ）中の１５μＭＰｒｏｂｅｎｅｃｉｄ（カ
ルシウムＡＴＰａｓｅポンプブロッカー））。次いでＦＢＰ緩衝液のｐＨをＮａ
ＯＨにて７．４にあわせた。４００μｌＤＭＳＯを、フロ３−ＡＭ（Ｃａｍｂ
ｒｉｄｇｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆ−１２４１）のバイアルに加えた。フロ
３−ＡＭ溶液を３７℃にて１０分間インキュベートし、ボルテックスした。ＬＯ
ＡＤを、２０μｌのフロ３−ＡＭ溶液およびＤＭＳＯ中の２０％プレウロニック
Ｆ−１２７（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐ−３０００）２０
μｌを１０ｍｌのＦＢＰ中に加えることで調製した。細胞を含む９６ウェルプレ
ートをはたき、細胞培養液を取り除いた。ウェルあたり１００μｌのＬＯＡＤを
加えた。次いで細胞を３７℃にて６０分間インキュベートした。カプサイシン（
ｒＶＲ１アゴニスト）およびカプサゼピン（ＣＰＺ、ｒＶＲ１アンタゴニスト）
を、望ましい最終アッセイ濃度の１０×で、ＦＢＰ中で調製した。プレートをは
たき、細胞からＬＯＡＤを取り除き、ウェルあたり１８０μｌのＦＢＰを加えた
。ＦＬＩＰＲ機械によりウェルあたり２０μｌのカプサイシンを加えて最終１×
濃度を得た。細胞を、アゴニスト添加後７０秒間モニタした。ＦＬＩＰＲトレー
ス（蛍光変化（回数）対時間（秒））をそれぞれのウェルに関して作製した。ピ
ークは、ｒＶＲ１を発現している細胞によるカプサイシンゲートカルシウム流束
を示唆している。ピークの高さはｒＶＲ１発現レベルに相関する。ＶＲ１応答の
アンタゴニズムを測定するために、２０μｌの１０×アンタゴニストＣＰＺをウ
ェル内に加え、最終１×濃度を得た。プレートをＦＬＩＰＲ内で読み取り前に、
室温にて１５分間インキュベートした。それぞれのウェルに対して記録したＦＬ
ＩＰＲトレースは、ピークの高さが、ＣＰＺでの前インキュベートで減少するこ
とを示している。同一のＦＬＩＰＲアッセイを、アゴニストまたはアンタゴニス
トへの曝露におけるヒトＶＲ１の反応をモニタするために使用してよい。

【００７５】実施例８：ヒトＶＲ１を用いた選別の例ＦＬＩＰＲアッセイ技術を、図１５で記述した手順に従ってｈＶＲ１モジュレ
ーターに関する選別で使用してよい。ヒトＶＲ１は、プロトン、カプサイシンま
たは温度でゲート開閉する可能性がある。

【００７６】参照実施例Ｃ：さらなるヒトバニロイド受容体の同定および部分的特性化（参
照実施例Ｃ１−Ｃ３）参照実施例Ｃ１：新規バニロイド様受容体、ｈＶＲ３の同定および特性化残りのクラスターに属しているＥＳＴｓをｉｎｓｉｌｉｃｏクローニングに
よってて特性化した（参照実施例Ａ）。以下のクローンを本処理の間に使用し
た。−ＥＳＴ６／ＥＳＴ７（ｈＶＲｄ）、−ＥＳＴ８（ｈＶＲｅ）、−ＥＳＴ９
／ＥＳＴ１０（ｈＶＲｆ）。これらのＥＳＴクラスターを、図１６でラットＶＲ
１と共に整列させ、この図がスケールでないことを認識する。

【００７７】参照実施例Ｃ２：クローンのシークエンシング参照実施例Ｂ２で詳述したような、さらなるシークエンシングおよびｉｎｓ
ｉｌｉｃｏクローニングによって、クラスターｈＶＲｄ、ｈＶＲｅおよびｈＶＲ
ｆを５８３アミノ酸の単一ｃｏｎｔｉｇを形成することを崩壊させることを可能
にした。この配列はｈＶＲ３と命名し、ラットＶＲ１配列と４９％の同一性を持
つ。この単一ｃｏｎｔｉｇは、明らかな開始コドンは存在せず、ラットＶＲ１転
写物より短かったので、全長バニロイド受容体ではあり得なかった。

【００７８】参照実施例Ｃ３：ｈＶＲ３の５’末端の同定ｈＶＲ３の３’末端およびその３’ｕｔｒに伸びている単位複製配列をＰＣＲ
増幅するように設計した２つのプライマー（センスプライマー５’ＡＴＧＧＣ
ＣＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＴＴＡＣおよびアンチセンスプライマー５’ＴＣＴＧ
ＣＣＡＧＧＴＴＣＣＡＧＣＴＧ）を、ゲノムＰＡＣクローンを単離するために使
用した（ＧｅｎｏｍｅＳｙｓｔｅｍｓ．ＳｔＬｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ
）。次いでｈＶＲ３特異的ＰＡＣクローンを鋳型として使用して、ライブラリー
を生成した。このことは６μｇのＱｉａｇｅｎ精製ＰＡＣ構造物を音波処理し、
５００−２０００ｂｐの断片化ＤＮＡをサイズ選別することで行った。次いでこ
れらの得られた断片を平滑末端化し、ＺｅｒｏＢｌｕｎｔ^ＴＭＰＣＲクロー
ニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で供給された取り扱いプロトコールで詳
述されたようにベクターｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔ内にクローン化した。
次いでクローンを配列決定し（参照実施例Ｂ２）、完全なｈＶＲ３転写部の５’
末端を同定した。ｈＶＲ３遺伝子の全長ヌクレオチド配列は図１７で表示した。
図１８はヒトＶＲ１のヌクレオチドおよびコードされたアミノ酸配列両方を示し
ており、図１９は予想される膜貫通領域（黒四角）およびアンキリン結合領域（
白四角）を示す領域を持っているｈＶＲ３遺伝子のアミノ酸配列を描写している
。

【００７９】実施例９：ヒト腎臓鋳型からのｈＶＲ１３の全長増幅ヒト腎臓をｈＶＲ３のＰＣＲ増幅のための鋳型の供給源として使用した。増幅
のために使用したプライマーは、３つの断片で遺伝子を単離するように設計した
。５’末端を単離するために設計したプライマーには、ＮｏｔＩ部位および強力
なコザックモチーフ、引き続いて遺伝子特異的配列をコードしているセンスプラ
イマー（５’ＧＴＣＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡＧ
ＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＣ）およびアンチセンスプライマー（５’ＣＡＣＣＴＣＴ
ＴＧＴＴＧＴＣＡＣＴＧＧＡ）が含まれる。使用したＰＣＲ条件は、９４℃４分
間でのホットスタート、続いて３５サイクルの、９４℃１分間、５６℃１分間、
７２℃１分間、そして最後に７２℃にて５分間の１サイクルであった。得られた
ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上で分離し、ＴＯＰＯ^ＴＭＴＡＣｌｏｎｉ
ｎｇ（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に備えられた取扱説明書にし
たがってｐＣＲ（登録商標）ＩＩ−ＴＯＰＯ内にクローン化した。中間断片を、
５％ＤＭＳＯの存在下でセンス、アンチセンスプライマー、それぞれ５’ＣＡＡ
ＡＴＣＴＧＣＧＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧおよび５’ＧＣＣＡＣＧＡＧＡＡＧ
ＴＴＣＣＡＣＧＴＡＧＴＧを用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ温度循環は、断片の
首尾のよい増幅のために３５サイクルの、９４℃、５８℃および７２℃１分間が
必要であり、次いでこの断片を２％アガロースゲルよりとり、ｐＣＲＩＩ（登録
商標）−ＴＯＰＯベクター内にクローン化した。最後に３’末端をセンスプライ
マー：５’ＧＣＴＧＣＴＣＣＣＡＴＴＣＴＴＧＣＴＧＡおよびＸｈｏＩ制限部位
をコードしているアンチセンスプライマー：５’ＴＧＣＡＣＴＣＴＣＧＡＧＡＡ
ＡＴＧＡＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧＡＡＧＣを用いてＰＣＲ増幅した。この断片は、
９４℃での４分間のホットスタート、引きつづく３５サイクルの９４℃５０秒間
、４８℃５０秒間、７２℃２分間を用いて首尾よく増幅した。循環は５分間の７
２℃工程で完了した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上で分離し、ベクターｐ
ＣＲＩＩ（登録商標）−ＴＯＰＯベクター内にクローン化した。

【００８０】それぞれの３つのＰＣＲ生成ｈＶＲ３−断片に関する得られたクローンを配列
決定解析にかけ、コンセンサス配列をコードしている分離クローンを、遺伝子の
全長組立で使用した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）ベクター（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ）のＤｒａＩＩＩ制限部位をまずＤｒａＩＩＩでの消化、次いでＴ _４ＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を用いた
平滑末端化工程によって取り除いた。次いでこの改変ベクターをＮｏｔＩ／Ｎｃ
ｏＩ５’断片およびＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ中央断片の両方をライゲーションで
きるように制限消化した。最後に、残っている３’末端を、ＤｒａＩＩＩおよび
ＸｈｏＩ制限部位を介して得られた構造物内に導入した（図２０Ａ）。

【００８１】いくつかのクローンを配列解析のために選別し、構造がｈＶＲ３コンセンサス
配列をコードしていることを確かめた。ついでこれらをＮｏｔＩ／ＸｈｏＩで消
化し、図２０Ｂで見られるように、哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（＋
）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にライゲーションした。得られたｈＶＲ３コンセ
ンサス配列は、図２１にてｈＶＲ１の全長配列および公表されたｈＶＲＬ−１と
一緒の多重整列で示す。

【００８２】実施例１０：クロモソーム局在化ｈＶＲ３の３’ＵＴＲ配列を含む３’末端を、３６０ｂｐの産物を増幅するた
めの２つのプライマーを設計するのに使用した。センスプライマー５’ＡＴＧ
ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＴＴＡＣおよびアンチセンスプライマー５’ＴＣ
ＴＧＣＣＡＧＧＴＴＣＣＡＧＣＴＧ。スタンフォード大学（Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａ）からのＧ３放射ハ
イブリッドパネルをＰＣＲにて選別した。陽性および陰性レーンを、スタンフォ
ード大学の公的なウェブサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｓｇｈｃ．ｓｔａｎ
ｆｏｒｄ．ｅｄｕ）を用いて解析した。解析の後、ｈＶＲ３遺伝子はマーカーＤ
１２Ｓ１７７Ｅ（ロードスコア＝１５）およびＤ１２Ｓ１８９３（ロードスコア
＝１４）の周囲のヒトクロモソーム１２に局在することが明らかになった。

【００８３】実施例１１：ｍＲＮＡ分布以下のプライマー（５’ＡＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧＧＡＣＡＴＧＣＧＧおよび５
’ＡＴＣＴＣＧＴＧＧＣＧＧＴＴＣＴＣＡＡＴ）を使用し、ｈＶＲ３のコード領
域からのＰＣＲ産物を得た。この単位複製配列を、多重組織ノザンブロット上の
プローブとして使用し、そのプロトコールは実施例３で詳述されており、遺伝子
の組織分布を決定した（図２２Ａ、２２Ｂおよび２２Ｃ）。およそ３．８ｋｂの
転写物を以下の組織で検出した（シグナルの強度を括弧で示した）。気管（とて
も強い）、腎臓（強い）、膵臓（強い）、前立腺（強い）、胎盤（強い）、骨髄
（弱い）、副腎（弱い）、リンパ管（弱い）、脊髄（弱い）、甲状腺（弱い）、
胃（弱い）、肺（弱い）および肝臓（弱い）。

【００８４】これらの商業的なブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，Ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）は、同量のＲＮＡを持つべきであり、気管レーンでの
とても強いシグナルに注目することが興味深い（図２２Ａ）。このことは、ｈＶ
Ｒ３の呼吸病理の標的としての潜在力を示唆している。遺伝子がＤＲＧで発現し
ていないことが、プローブを産出するために使用したプライマーの組合せでのＲ
Ｔ−ＰＣＲによって示された。

【００８５】実施例１２：ｈＶＲ３のインサイチュー局在に関するリボプローブ生成ノザンブロット解析（実施例１１）でｈＶＲ３に特異的であった同様のプライ
マーを、リボプローブを生成するのに使用した。このｈＶＲ３特異的プローブを
Ｔ７およびＳＰ６をコードしているｐＣＲＩＩ（登録商標）−ＴＯＰＯベクター
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローン化した。次いでこの構造物を、ＤＩＧ
ＲＮＡ標識化キット（ＲｏｃｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ）で詳述されたように取り扱い説明書で記述されたような、ベクタープロモ
ーターからのＤＩＧ標識化ＲＮＡ鎖のｉｎｖｉｔｒｏ転写で使用した。このリ
ボプローブは、気管、肺、膵臓、前立腺、胎盤および腎臓のような組織に存在す
るｈＶＲ３の細胞局在を同定するのに使用してよい。

【００８６】実施例１３：ｈＶＲ３の哺乳動物細胞発現ｈＶＲ３の発現は、ＨＥＫ２８３Ｔ、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬ
ａおよびＢＨＫのような哺乳動物細胞株をトランスフェクトすることで行ってよ
い。一過性および安定トランスフェクション両方の詳細な方法は実施例６で詳述
されている。

【００８７】実施例１４：ｈＶＲ３の機能解析ｈＶＲ３の機能解析は、実施例７ａ〜７ｃで詳述した電気生理学、カルシウム
イメージングおよびＦＬＩＰＲ方法を用いて研究してよい。

【００８８】実施例１５：ヒトＶＲ３を用いた薬物選別の例ｈＶＲ３を発現している安定細胞株を、ｈＶＲ１においてアゴニストまたはア
ンタゴニスト活性を持つように同定された試験化合物を使用した選択的選別のよ
うな薬物選別で使用してよい。ＦＬＩＰＲアッセイ技術を、図１５で提案したよ
うなｈＶＲ３モジュレーターの選別に使用してよい。

【００８９】

【参照文献】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ラットＶＲ１とのｈＶＲ１ｉｎｓｉｌｉｃｏ由来クラスターのア
ライメントである。

【図２−１】図２−１は、５’ＵＴＲ（ｎｔ−７７３からｎｔ０）、コード領域（ｎｔ１か
らｎｔ２５１７）および３’ＵＴＲ（ｎｔ２５１８からｎｔ３５６０）を含むヒ
トＶＲ１配列を表示している。

【図２−２】図２−１は、５’ＵＴＲ（ｎｔ−７７３からｎｔ０）、コード領域（ｎｔ１か
らｎｔ２５１７）および３’ＵＴＲ（ｎｔ２５１８からｎｔ３５６０）を含むヒ
トＶＲ１配列を表示している。

【図２−３】図２−３は、５’ＵＴＲ（ｎｔ−７７３からｎｔ０）、コード領域（ｎｔ１か
らｎｔ２５１７）および３’ＵＴＲ（ｎｔ２５１８からｎｔ３５６０）を含むヒ
トＶＲ１配列を表示している。

【図２−４】図２−４は、５’ＵＴＲ（ｎｔ−７７３からｎｔ０）、コード領域（ｎｔ１か
らｎｔ２５１７）および３’ＵＴＲ（ｎｔ２５１８からｎｔ３５６０）を含むヒ
トＶＲ１配列を表示している。

【図３−１】図３−１は、ヒトＶＲ１配列のヌクレオチドおよびコードされているアミノ酸
配列を図示している。

【図３−２】図３−２は、ヒトＶＲ１配列のヌクレオチドおよびコードされているアミノ酸
配列を図示している。

【図３−３】図３−３は、ヒトＶＲ１配列のヌクレオチドおよびコードされているアミノ酸
配列を図示している。

【図３−４】図３−４は、ヒトＶＲ１配列のヌクレオチドおよびコードされているアミノ酸
配列を図示している。

【図４】図４は、ｈＶＲ１遺伝子のアミノ酸配列を描写しており、斜線は予想される膜
貫通領域（黒四角）およびアンキリン結合領域（白四角）を示している。予測さ
れるリン酸化部位は下線を引いた。

【図５】図５は、ラット（ｒＶＲ１）とヒト（ｈＶＲ１）バニロイド受容体のアミノ酸
配列の比較である。

【図６】図６は、ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を介してクローン化した全長ｈＶ
Ｒ１遺伝子を持つ構造物ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）（Ａ）およびｐＣＩ
Ｎ５−ｎｅｗ（Ｂ）を図示している。

【図７】図７は、ラットおよびヒトＤＲＧｍＲＮＡ両方の陽性標識化するｈＶＲ１プ
ローブでのＳｌｏｔＢｌｏｔハイブリッド形成を示す。

【図８】図８は、抗ＶＲ１抗体でプローブ化したウエスタンブロットを示し、矢印はＶ
Ｒ１特異的タンパク質を示している。

【図９】図９は、ラットＤＲＧ切片でのＶＲ１の局在を示し、矢印は小直径（＜２５μ
ｎ）のニューロン細胞体を発現しているＶＲ１を示している。

【図１０】図１０は、ヒトＤＲＧ切片（Ａ）およびヒト皮膚（Ｂ）でのＶＲ１のインサイ
チュー局在を図示している。

【図１１】図１１は、カプサイシンに対する機能的応答およびカプサゼピン（ＣＰＺ）に
よる阻害を示し（Ａ）、（Ｂ）はＨＥＫ２９３Ｔ細胞で一過性に発現したヒトＶ
Ｒ−１チャネルでの電流電圧の関係をプロットした。

【図１２】図１２は、２ｍＭ外部カルシウムの存在下でのヒトＶＲ−１チャネルのカプサ
イシン誘導脱感作（Ａ）、時間に対する最大電流（６５ｍＶ）（Ｂ）およびＣａ ^２＋なしでの電流電圧の関係（Ｃ）を示している。

【図１３−１】図１３−１は、アンタゴニストであるカプセジピンの非存在下（Ａ、Ｂ、Ｄお
よびＦ）または存在下（Ｃ、Ｅ、Ｇ）で、カプサイシン、アナンダミドおよびレ
シニフェラトキシンの存在下での時間経過における一過性トランスフェクトＨＥ
Ｋ２９３Ｔ内へのカルシウムの流入を示している。

【図１３−２】図１３−２は、アンタゴニストであるカプセジピンの非存在下（Ａ、Ｂ、Ｄお
よびＦ）または存在下（Ｃ、Ｅ、Ｇ）で、カプサイシン、アナンダミドおよびレ
シニフェラトキシンの存在下での時間経過における一過性トランスフェクトＨＥ
Ｋ２９３Ｔ内へのカルシウムの流入を示している。

【図１３−３】図１３−３は、アンタゴニストであるカプセジピンの非存在下（Ａ、Ｂ、Ｄお
よびＦ）または存在下（Ｃ、Ｅ、Ｇ）で、カプサイシン、アナンダミドおよびレ
シニフェラトキシンの存在下での時間経過における一過性トランスフェクトＨＥ
Ｋ２９３Ｔ内へのカルシウムの流入を示している。

【図１４−１】図１４−１は、アンタゴニストであるカプセジピンの非存在下（Ａ、Ｂ、Ｄお
よびＦ）または存在下（Ｃ、Ｅ、Ｇ）で、アゴニスト、カプサイシン、アナンダ
ミドおよびレシニフェラトキシンに曝露する前後の時間経過におけるｈＶＲ１ト
ランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞応答を試験した図１３で示した結果の図表示
を示している。

【図１４−２】図１４−２は、アンタゴニストであるカプセジピンの非存在下（Ａ、Ｂ、Ｄお
よびＦ）または存在下（Ｃ、Ｅ、Ｇ）で、アゴニスト、カプサイシン、アナンダ
ミドおよびレシニフェラトキシンに曝露する前後の時間経過におけるｈＶＲ１ト
ランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞応答を試験した図１３で示した結果の図表示
を示している。

【図１４−３】図１４−３は、アンタゴニストであるカプセジピンの非存在下（Ａ、Ｂ、Ｄお
よびＦ）または存在下（Ｃ、Ｅ、Ｇ）で、アゴニスト、カプサイシン、アナンダ
ミドおよびレシニフェラトキシンに曝露する前後の時間経過におけるｈＶＲ１ト
ランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞応答を試験した図１３で示した結果の図表示
を示している。

【図１５】図１５は、薬物スクリーニングを行うための企画したアッセイ戦略を表示して
いる。

【図１６】図１６は、ラットＶＲ１とのｈＶＲ３ｉｎｓｉｌｉｃｏ由来特異的クラス
ターのアライメントを表している。

【図１７−１】図１７−１は、５’ＵＴＲ（ｎｔ−６８６からｎｔ０）、コード領域（ｎｔ１
からｎｔ２８８９）および３’ＵＴＲ（ｎｔ２８９０からｎｔ３４１８）を含む
ヒトＶＲ３配列を表示している。

【図１７−２】図１７−２は、５’ＵＴＲ（ｎｔ−６８６からｎｔ０）、コード領域（ｎｔ１
からｎｔ２８８９）および３’ＵＴＲ（ｎｔ２８９０からｎｔ３４１８）を含む
ヒトＶＲ３配列を表示している。

【図１７−３】図１７−３は、５’ＵＴＲ（ｎｔ−６８６からｎｔ０）、コード領域（ｎｔ１
からｎｔ２８８９）および３’ＵＴＲ（ｎｔ２８９０からｎｔ３４１８）を含む
ヒトＶＲ３配列を表示している。

【図１７−４】図１７−４は、５’ＵＴＲ（ｎｔ−６８６からｎｔ０）、コード領域（ｎｔ１
からｎｔ２８８９）および３’ＵＴＲ（ｎｔ２８９０からｎｔ３４１８）を含む
ヒトＶＲ３配列を表示している。

【図１８−１】図１８−１は、ｈＶＲ３のヌクレオチドおよびコードされているアミノ酸配列
を示している。

【図１８−２】図１８−２は、ｈＶＲ３のヌクレオチドおよびコードされているアミノ酸配列
を示している。

【図１８−３】図１８−３は、ｈＶＲ３のヌクレオチドおよびコードされているアミノ酸配列
を示している。

【図１８−４】図１８−４は、ｈＶＲ３のヌクレオチドおよびコードされているアミノ酸配列
を示している。

【図１９】図１９は、ｈＶＲ３のアミノ酸配列であり、斜線は予想される膜貫通領域（黒
四角）およびアンキリン結合領域（白四角）を示している。

【図２０】図２０は、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ制限部位を介してクローン化した全長ｈＶ
Ｒ３遺伝子を持つ構造物ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）（Ａ）およびｐＣＤ
ＮＡ３．１（Ｂ）を図示している。

【図２１−１】図２１−１はラットＶＲ１およびヒトバニロイド受容体：ｈＶＲ１、ｈＶＲＬ
−１、ｈＶＲ３のアミノ酸配列の多重比較を図示している。

【図２１−２】図２１−２はラットＶＲ１およびヒトバニロイド受容体：ｈＶＲ１、ｈＶＲＬ
−１、ｈＶＲ３のアミノ酸配列の多重比較を図示している。

【図２２Ａ】図２２ＡはｈＶＲ３プローブを用いたノザンブロットハイブリダイゼーション
であり、気管（Ａ）で検出される強いシグナルを有している。

【図２２Ｂ】図２２ＢはｈＶＲ３プローブを用いたノザンブロットハイブリダイゼーション
であり、前立腺（Ｂ）で検出される強いシグナルを有している。

【図２２Ｃ】図２２ＣはｈＶＲ３プローブを用いたノザンブロットハイブリダイゼーション
であり、胎盤、腎臓および膵臓（Ｃ）で検出される強いシグナルを有している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 13/00 Ａ６１Ｐ 19/00 ４Ｈ０４５ 19/00 25/04 25/04 25/06 25/06 25/28 25/28 29/00 29/00 １０１１０１Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 16/28 16/28 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:91） 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人ＧｌａｘｏＷｅｌｌｃｏｍｅＨｏｕｓｅ，ＢｅｒｋｅｌｅｙＡｖｅｎｕｅＧｒｅｅｎｆｏｒｄ，ＭｉｄｄｌｅｓｅｘＵＢ６０ＮＮ，ＧｒｅａｔＢｒｉｔａｉｎ (72)発明者サンソー、フィリップイギリス国、エスジー１・２エヌワイ、ハートフォードシャー、スティーブンエイジ、ガンネルズ・ウッド・ロード、グラクソ・ウェルカム・パブリック・リミテッド・カンパニー内（番地なし) (72)発明者テイト、サイモン・ニコラスイギリス国、エスジー１・２エヌワイ、ハートフォードシャー、スティーブンエイジ、ガンネルズ・ウッド・ロード、グラクソ・ウェルカム・パブリック・リミテッド・カンパニー内（番地なし) Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA63 CA01 DA02 DA03 GA11 GA18 4B063 QA01 QQ20 QQ61 QR48 QR77 QS32 QX01 4B064 AG20 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA91X AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA17 NA14 ZA022 ZA082 ZA152 ZA592 ZA662 ZA812 ZA892 ZB112 ZB152 4H045 AA10 AA11 AA20 BA10 CA40 DA50 DA75 EA20 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】単離されたヒト・バニロイド受容体（hVR）タンパク質また
はその変種。
【請求項２】 hVR1またはその変種である、請求項１に記載の単離されたヒ
ト・バニロイド受容体（hVR）タンパク質。
【請求項３】 hVR3またはその変種である、請求項１に記載の単離されたヒ
ト・バニロイド受容体（hVR）タンパク質。
【請求項４】図３に示したアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の単離
されたヒト・バニロイド受容体（hVR）タンパク質。
【請求項５】図１８に示したアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の単
離されたヒト・バニロイド受容体（hVR）タンパク質。
【請求項６】ヒト・バニロイド受容体（hVR）タンパク質またはその変種
をコードするヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列。
【請求項７】 hVR1タンパク質もしくはその変種、またはこれに相補的なヌ
クレオチド配列をコードする請求項６に記載のヌクレオチド配列。
【請求項８】 hVR3タンパク質もしくはその変種、またはこれに相補的なヌ
クレオチド配列をコードする請求項６に記載のヌクレオチド配列。
【請求項９】ヌクレオチド配列がcDNA配列である請求項６に記載のヌクレ
オチド配列。
【請求項１０】ヌクレオチド配列がcDNA配列である請求項７に記載のヌク
レオチド配列。
【請求項１１】ヌクレオチド配列がcDNA配列である請求項８に記載のヌク
レオチド配列。
【請求項１２】図２に示した請求項７に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１３】図１７に示した請求項８に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１４】請求項６〜１３のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列
を含む発現ベクターであって、hVRタンパク質またはその変種を発現することが
できる発現ベクター。
【請求項１５】請求項１４に記載の発現ベクターであって、hVR1タンパク
質またはその変種を発現することができる発現ベクター。
【請求項１６】請求項１４に記載の発現ベクターであって、hVR3タンパク
質またはその変種を発現することができる発現ベクター
【請求項１７】請求項１４に記載の発現ベクターを含む安定細胞株。
【請求項１８】請求項１５に記載の発現ベクターを含む安定細胞株。
【請求項１９】請求項１６に記載の発現ベクターを含む安定細胞株。
【請求項２０】修飾されたHEK293、CHO、COS、HeLa、またはBHK細胞株で
ある、請求項１７に記載の安定細胞株。
【請求項２１】修飾されたHEK293、CHO、COS、HeLa、またはBHK細胞株で
ある請求項１８に記載の安定細胞株。
【請求項２２】修飾されたHEK293、CHO、COS、HeLa、またはBHK細胞株で
ある、請求項１９に記載の安定細胞株。
【請求項２３】請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒト・バニロイド受
容体（hVR）タンパク質またはその変種に対して特異的な抗体。
【請求項２４】 hVR1またはその変種に対して特異的である、請求項２３に
記載の抗体。
【請求項２５】 hVR3またはその変種に対して特異的である、請求項２３に
記載の抗体。
【請求項２６】 hVR調節活性を示す化合物を同定する方法であって、請求
項１〜５のいずれか一項に記載のヒトバニロイド受容体（hVR）タンパク質また
はその変種をテスト化合物と接触させることと、調節の活性または不活性を検出
することを含む方法。
【請求項２７】請求項２６に記載の方法によって同定可能な、hVR活性を
調節する化合物。
【請求項２８】治療に使用するための、請求項２７に記載の化合物。
【請求項２９】ヒト患者のhVR活性調節に応答する疾患の治療または予防
のための薬剤製造における、請求項２７に記載の化合物の使用。
【請求項３０】請求項２８に記載の使用であって、前記疾患が疼痛、神経
系疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛、術後疼痛、慢性関節リュウマチ性疼痛、神経障
害(neuropathies)、神経痛、神経変性(neurodegeneration)、神経傷害、発作、
虚血、片頭痛、過敏性腸症候群(irritable boewl syndrome)（IBS）、呼吸器疾
患、喘息、慢性的閉塞性肺疾患（COPD）、泌尿器疾患、神経障害(neuropaty)、
失禁、間質性膀胱炎、または炎症性疾患である使用。
【請求項３１】ヒト患者のhVR活性調節に応答する疾患を治療または予防
する方法であって、前記患者に請求項２７に記載の化合物を有効量投与すること
を含む方法。
【請求項３２】請求項３１に記載の方法であって、前記疾患が疼痛、神経
系疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛、術後疼痛、慢性関節リュウマチ性疼痛、神経障
害(neuropathies)、神経痛、神経変性(neurodegeneration)、神経傷害、発作、
虚血、片頭痛、過敏性腸症候群(irritable boewl syndrome)（IBS）、呼吸器疾
患、喘息、慢性的閉塞性肺疾患（COPD）、泌尿器疾患、神経障害(neuropaty)、
失禁、間質性膀胱炎、または炎症性疾患である使用。
【請求項３３】請求項２６に記載の方法によって同定可能な、hVR活性を
調節する化合物であって、カプサイシン、リシニフェラトキシン（resiniferato
xin）、ピペリン（piperine）、ジンゲロン（zingerone）、ポリドジアル（poly
dodial）、ワーバーガナル（warburganal）、アフラモジアル（aframodial）、
シナモヂアル（cinnamodial）、シナモスモライド（cinnamosmolide）、シナモ
ライド（cinnamolide）、イソベレラル（isovelleral）、スカララジアル（scal
aradial）、アンシストロジアル（ancistrodial）、β―アカリジアル（β-acar
idial）、スクティゲラル(scutigeral)、メルリジアル（merulidial）、アナン
ドアミド（anandamide）、及びカプサゼピン（capsazepine）を除く化合物。
【請求項３４】治療に使用するための請求項３３に記載の化合物。
【請求項３５】ヒト患者のhVR活性調節に応答する疾患の治療または予防
のための薬剤の製造における、請求項３３に記載の化合物の使用。
【請求項３６】請求項３５に記載の使用であって、前記疾患が疼痛、神経
系疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛、術後疼痛、慢性関節リュウマチ性疼痛、神経障
害(neuropathies)、神経痛、神経変性(neurodegeneration)、神経傷害、発作、
虚血、片頭痛、過敏性腸症候群(irritable boewl syndrome)（IBS）、呼吸器疾
患、喘息、慢性的閉塞性肺疾患（COPD）、泌尿器疾患、神経障害(neuropaty)、
失禁、間質性膀胱炎、または炎症性疾患である使用。
【請求項３７】ヒト患者のhVR活性調節に応答する疾患を治療または予防
する方法であって、前記患者に請求項３３に記載の化合物を有効量投与すること
を含む方法。
【請求項３８】請求項３７に記載の方法であって、前記疾患が疼痛、神経
系疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛、術後疼痛、慢性関節リュウマチ性疼痛、神経障
害(neuropathies)、神経痛、神経変性(neurodegeneration)、神経傷害、発作、
虚血、片頭痛、過敏性腸症候群(irritable boewl syndrome)（IBS）、呼吸器疾
患、喘息、慢性的閉塞性肺疾患（COPD）、泌尿器疾患、神経障害(neuropaty)、
失禁、間質性膀胱炎、または炎症性疾患である方法。
【請求項３９】請求項２６に記載の方法によって同定される化合物。
【請求項４０】治療に使用するための請求項３９に記載の化合物
【請求項４１】ヒト患者のhVR活性調節に応答する疾患の治療または予防
のための薬剤の製造における、請求項３９に記載の化合物の使用。
【請求項４２】請求項４１に記載の使用であって、前記疾患が疼痛、神経
系疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛、術後疼痛、慢性関節リュウマチ性疼痛、神経障
害(neuropathies)、神経痛、神経変性(neurodegeneration)、神経傷害、発作、
虚血、片頭痛、過敏性腸症候群(irritable boewl syndrome)（IBS）、呼吸器疾
患、喘息、慢性的閉塞性肺疾患（COPD）、泌尿器疾患、神経障害(neuropaty)、
失禁、間質性膀胱炎、または炎症性疾患である使用。
【請求項４３】ヒト患者のhVR活性調節に応答する疾患を治療または予防
する方法であって、前記患者に請求項３９に記載の化合物を有効量投与すること
を含む方法。
【請求項４４】請求項４３に記載の方法であって、前記疾患が疼痛、神経
系疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛、術後疼痛、慢性関節リュウマチ性疼痛、神経障
害(neuropathies)、神経痛、神経変性(neurodegeneration)、神経傷害、発作、
虚血、片頭痛、過敏性腸症候群(irritable boewl syndrome)（IBS）、呼吸器疾
患、喘息、慢性的閉塞性肺疾患（COPD）、泌尿器疾患、神経障害(neuropaty)、
失禁、間質性膀胱炎、または炎症性疾患である方法。
【請求項４５】請求項１〜５のいずれか一項に記載のhVRタンパク質また
はその変種を生産する方法であって、適切な細胞株に、hVRタンパク質またはそ
の変種をコードするヌクレオチド配列を含有する適切なベクターを、hVRタンパ
ク質またはその変種を発現させるための適切な条件下で導入することを含む方法
。
【請求項４６】 hVR1タンパク質またはその変種を生産する方法であって、
適切な細胞株に、hVR1タンパク質またはその変種をコードするヌクレオチド配列
を含有する適切なベクターを、hVR1タンパク質またはその変種を発現させるため
の適切な条件下で導入することを含む方法。
【請求項４７】 hVR3タンパク質またはその変種を生産する方法であって、
適切な細胞株に、hVR3タンパク質またはその変種をコードするヌクレオチド配列
を含有する適切なベクターを、hVR3タンパク質またはその変種を発現させるため
の適切な条件下で導入することを含む方法。
【請求項４８】ヒト患者においてhVR活性調節に応答する疾患の治療また
は予防に有用な薬剤をスクリーニングする方法に使用するための、ヒトバニロイ
ド受容体（hVR）タンパク質またはその変種。
【請求項４９】請求項４８に記載のヒトバニロイド受容体（hVR）タンパ
ク質であって、前記疾患が疼痛、神経系疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛、術後疼痛
、慢性関節リュウマチ性疼痛、神経障害(neuropathies)、神経痛、神経変性(neu
rodegeneration)、神経傷害、発作、虚血、片頭痛、過敏性腸症候群(irritable
boewl syndrome)（IBS）、呼吸器疾患、喘息、慢性的閉塞性肺疾患（COPD）、泌
尿器疾患、神経障害(neuropaty)、失禁、間質性膀胱炎、または炎症性疾患であ
るタンパク質。
【請求項５０】ヒトバニロイド受容体（hVR）タンパク質がhVR1またはそ
の変種である、請求項４８または４９に記載のヒトバニロイド受容体（hVR）タ
ンパク質。
【請求項５１】ヒトバニロイド受容体（hVR）タンパク質がhVR3またはそ
の変種である、請求項４８または４９に記載のヒトバニロイド受容体（hVR）タ
ンパク質。