JP4550394B2

JP4550394B2 - 筋変性疾患の治療用医薬組成物およびそのスクリーニング方法

Info

Publication number: JP4550394B2
Application number: JP2003353917A
Authority: JP
Inventors: 良博裏出; 直美江口; 浩介有竹; 陽佐藤; 雅子谷池; 育子毛利; 雅司宮野
Original assignee: Osaka Bioscience Institute
Current assignee: Osaka Bioscience Institute
Priority date: 2003-10-14
Filing date: 2003-10-14
Publication date: 2010-09-22
Anticipated expiration: 2023-10-14
Also published as: US7238718B2; US20050272767A1; JP2005119984A

Description

この発明は、筋変性疾患の治療剤およびそのスクリーニング方法に関する。詳しくは、筋ジストロフィー等の筋変性疾患の進行を防止したり、改善をはかる医薬組成物およびそのスクリーニング方法に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、筋ジストロフィー、肉離れ、カルディオミオパチー（心筋梗塞）、糖尿病性末梢血管障害（血管平滑筋障害）などの疾患による筋変性部位の筋繊維や集積したマクロファージや肥満細胞に誘導される造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（以下、「Ｈ−ＰＧＤＳ」ということがある）を阻害し、或いは変性部位周辺の血管や脂肪細胞あるいは集積したＴｈ２細胞に発現するプロスタグランジンＤ受容体（以下「ＤＰ受容体」ということがある）の活性化を阻害することにより、プロスタグランジンＤ_２が関与する筋変性の増悪を防ぎ、予後の改善をはかる化合物を含む医薬組成物に関する。本発明はまた、ヒト造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素大量発現トランスジェニックマウスを用いる筋変性疾患の治療剤のスクリーニング方法に関するものである。

筋変性疾患の典型的な例には筋ジストロフィーがある。筋ジストロフィーとは、進行性に筋肉が壊死・変性し、筋力がなくなってゆく難治性筋疾患の総称である。なかでもデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は最も頻度の高い筋ジストロフィーである。筋肉の細胞（筋細胞）の細胞骨格をつくるジストロフィンという遺伝子の異常で、ジストロフィンがほとんど作れなくなるのがＤＭＤである。ジストロフィンは筋細胞の骨格を保っているので、ＤＭＤでは筋細胞がその形を保てなくなり、容易に壊死を起しやすくなる病態である。筋力低下による呼吸障害や、心臓機能障害が死因になることが多い。この病気の治療方法として、遺伝子治療や再生移植治療が試みられているが根本的な治療法はまだ発見されていない。また、薬物治療としてはとして副腎皮質ホルモン（ステロイド）のパルス療法（非特許文献１参照）や抗生物質（ゲンタマイシン）の投与（非特許文献２参照）が行われているが、これらは対症療法であり、副作用が強く、長期投与を行うと薬効が低下する。特にＤＭＤでは１年程度の延命しか望めない。
Burrow KL, et al., Neurology, 41(5):661-6 Barton davis ER, Et al., J. Clin. Invest., 104(4):367-368

本発明は筋ジストロフィー等の筋変性疾患の進行を防止したり、改善に用いることのできる新しい医薬組成物を提供することを目的とする。
本発明はまた筋変性疾患を治療する化合物をスクリーニングする方法を提供することも目的とする。

上記目的を達成する本発明者は鋭意研究を行い、次のような知見を得たことに基づいて本発明を完成させた。
１）実験的筋壊死モデルを用いて筋変性を起した場合、Ｈ−ＰＧＤＳ及びＤＰ受容体の発現が増加する。
２）Ｈ−ＰＧＤＳは筋変性部位の筋繊維や集積したマクロファージや肥満細胞に発現が誘導される。
３）筋変性部位の周辺ではマクロファージの集積が顕著である。
４）Ｈ−ＰＧＤＳの阻害剤を投与すると壊死変性領域が小さくなる。
５）ＤＰ受容体の拮抗剤を投与すると壊死変性領域が小さくなる。
６）Ｈ−ＰＧＤＳ大量発現トランスジェニックマウスで損傷が増悪される。

即ち、本発明は筋壊死の増悪を防止し、予後の改善に用いる筋変性疾患治療用医薬組成物であって、Ｈ−ＰＧＤＳ阻害剤を有効成分として含む医薬組成物を要旨とする。
筋変性疾患には筋ジストロフィー、肉離れ、カルディオミオパチー（心筋梗塞）、糖尿病性末梢血管障害（血管平滑筋障害）などの疾患を含む。
Ｈ−ＰＧＤＳ阻害剤の例は、４−ベンズヒドリルオキシ−１−｛３−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−プロピル｝ピペリジン（ＨＱＬ−７９）、１−アミノ−４−｛４−［４−クロロ―６−（２−スルホ―フェニルアミノ）−［１，３，５］トリアジン―２−イルメチル］−３−スルホ―フェニルアミノ｝−９，１０−ジオキソー９，１０−ジヒドロ―アントラセン―２−スルホン酸（チバクローンブルー）、１−アミノ−４−（４−スルファモイルアニリノ）−アントラキノン―２−スルホン酸（ＰＧＤ−０４２）、２−（２’−ベンゾチアゾリル）−５−スチリル−３−（４’−フタルヒドラジティル）テトラゾリウム塩化物（ＰＧＤ−０１６）、および医薬的に許容し得るその塩を含む。

本発明はまた、筋ジストロフィー等の筋難治性疾患の進行を防止したり、改善をはかる筋変性疾患治療用医薬組成物であって、プロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬を有効成分として含む医薬組成物をも要旨とする。
プロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬の例は、３−ベンジル−５−（６−カルボキシヘキシル）１−（２−シクロヘキシル−２−ヒドロキシエチルアミノ）−ヒダントイン（ＢＷＡ８６８Ｃ）、（＋）−（３Ｒ）−３−（４−フルオロベンゼンスルホンアミド）−１，２，３，４−テトラヒドロカルバゾール−９−プロピオン酸（ラマトロバン）および医薬的に許容し得るその塩を含む。

本発明で使用する筋ジストロフィー等の筋変性疾患の進行を防止したり、改善に用いる化合物は上記のようにＨ−ＰＧＤＳ阻害剤又はプロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬からなるが、次のようにしてスクリーニングすることもできる。
すなわち、
１）Ｈ−ＰＧＤＳ大量発現トランスジェニックマウスに局所麻酔薬であるＮ−ブチルピペコリック酸−２，６−ジメチルアニリド塩酸−１水和物（塩酸ブピバカイン）を筋肉内に注射し、
２）筋変性を惹起する前あるいは後に候補化合物を該トランスジェニックマウスに投与し、
３）該マウスにおける筋変性の状態を、候補化合物を与えないトランスジェニックマウスにおける状態と比較する。
ヒトＨ−ＰＧＤＳ大量発現トランスジェニックマウスの製造方法は２０００年１０月５日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＪＰ００／０６９６３（ＷＯ０１／２４６２７）に記載されている。その記載は本明細書の一部を構成する。
Ｈ−ＰＧＤＳ大量発現トランスジェニックマウスにおいては筋変性がより増悪するので、候補化合物の効果を明確に判定できる。

実施例１

塩酸ブピバカインにより惹起された筋変性とＨＰＧＤＳ阻害剤による変性領域の軽減
筋ジストロフィーの実験モデルである塩酸ブピバカイン誘発筋変性モデル（Nonaka I, et al., Acta Neuropathol., 60:167-174, 1983）を用いて筋変性に対するＨＰＧＤＳ阻害剤の効果を調べた。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８週齢、オス）の腓腹筋に塩酸ブピバカイン（０．５％ｗ／ｖ、０．１ｍｌ）を注射して筋変性を誘導し、２４時間後にエバンスブルー染色液（１．０％ｗ／ｖ）を尾静脈から静注した。３０分後に過剰麻酔により屠殺し大過剰の生理食塩水で還流した後、腓腹筋を摘出し迅速凍結切片を作製してエバンスブルーの貯留を蛍光顕微鏡により観察した。壊死変性領域は蛍光により観察される。ＨＰＧＤＳ阻害剤ＨＱＬ−７９を経口投与（１０ｍｇ／ｋｇ）したマウスでは、壊死変性領域が小さくなっている（図１参照）。
実施例２

筋変性領域の定量化
実施例１で示した壊死変性領域の定量化を行った。凍結乾燥した腓腹筋から、ホルムアミドを用いてエバンスブルーを抽出した。抽出後、エバンスブルーの吸光度（６３０ｎｍ）を計測して、筋肉単位体積あたりのエバンスブルー量を比色定量した。ＨＱＬ−７９投与群では、有意にエバンスブルーの取込みが低下している（図２参照）。
実施例３

Ｘ線ＣＴを用いた壊死変性領域の非侵襲的観察
動物用Ｘ線−ＣＴを用いて、非侵襲的に壊死変性領域を観察した。塩酸ブピバカイン処置後１日目のマウスの尾静脈から尿路血管系造影剤Ｎ，Ｎ’−ビス〔２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）エチル〕−５−〔（２Ｓ）−２−ヒドロキシプロパノイルアミノ〕−２，４，６−トリヨードイソフタルアミド（イオパミドール）を静注し、その１５分後のＸ線ＣＴによる断層像を示す。腓腹筋の断層像（ｓ）に見られる高ＣＴ値領域（白色）はＨＱＬ−７９投与により減少している。造影剤の貯留が認められる領域は、筋肉破壊に伴う出血と浮腫を示している（図３参照）。
実施例4

ヒト型HPGDS大量発現トランスジェニックマウスでの筋変性の増悪
塩酸ブピバカインによる筋壊死を野生型マウスとヒト型HPGDS大量発現トランスジェニック (HPGDS-TG) マウスで比較した。塩酸ブピバカインを筋肉注射した2日後で、HPGDS-TGマウスでは野生型マウスに比べて壊死領域が広範囲に拡大していた(図4参照)。
実施例5

デュシェンヌ型筋ジストロフィーのモデル動物(mdxマウス)に対するHQL-79の治療効果
デュシェンヌ型筋ジストロフィーのモデル動物であるmdxマウス（Bogdanovich S, et al., Nature, Nov. 28, 2002, 420(6914):418-21）にHQL-79を2週間連続投与して筋変性に対するHPGDS阻害剤の効果を調べた。投薬開始から2週間後にエバンスブルー染色液（1.0 % w/v）を尾静脈から静注した。その1時間後に過剰麻酔により屠殺し大過剰の生理食塩水で還流した後、腓腹筋を摘出し迅速凍結切片を作製してエバンスブルーの貯留を蛍光顕微鏡により観察した。HQL-79投与群では溶媒投与群に比べて筋変性の指標である色素の貯留（灰白色領域）が減少していることがわかる(図５参照）。
実施例６

塩酸ブピバカイン誘発筋変性モデルに対するプロスタグランジンD受容体拮抗薬の効果
塩酸ブピバカイン誘発筋変性モデルを用いて筋変性に対するプロスタグランジンD受容体拮抗薬（ラマトロバン）の効果を調べた。C57BL/6マウス（8週齢、オス）の腓腹筋に塩酸ブピバカイン(1% w/v、0.05mL)を注射して筋変性を誘導した。ラマトロバンは30mg/kgの用量で、塩酸ブピバカインを筋肉注射する1時間前と、18時間後の計2回経口投与した。塩酸ブピバカインの筋肉注射から24時間後にエバンスブルー染色液（１％ｗ／ｖ）を尾静脈から注射した。その1時間後に過剰麻酔薬投与によって致死、全身を生理食塩水で還流した後、腓腹筋を摘出した。摘出組織を凍結乾燥後に、ホルムアミドを用いて組織に浸潤した色素を抽出し、色素量を吸光度（630ｎｍ）をから比色定量した。ラマトロバン投与群では、組織に浸潤したエバンスブルー量が低下していた。（図6参照）

本発明に係る造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）阻害剤および／またはプロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬を治療に用いるには、通常の経口又は非経口投与用の製剤として製剤化する。本発明に係る造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）阻害剤および／またはプロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬を含有する医薬組成物は、経口及び非経口投与のための剤形をとることができる。即ち、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口投与製剤、あるいは、静脈注射、筋肉注射、皮下注射などの注射用溶液又は懸濁液、吸入薬、点眼薬、点鼻薬、坐剤、もしくは軟膏剤、貼布剤、パップ剤などの経皮投与用製剤、経皮吸収剤などの非経口製剤とすることもできる。好ましくは、経口剤または注射用薬剤として用いる。

これらの製剤は当業者既知の適当な担体、賦形剤、溶媒、基剤等を用いて製造することができる。例えば、錠剤の場合、活性成分と補助成分を一緒に圧縮又は成型する。補助成分としては、製剤的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例、トウモロコシでん粉）、充填剤（例、ラクトース、微結晶性セルロース）、崩壊剤（例、でん粉グリコール酸ナトリウム）又は滑沢剤（例、ステアリン酸マグネシウム）などが用いられる。錠剤は、適宜、コーティングしてもよい。シロップ剤、液剤、懸濁剤などの液体製剤の場合、例えば、懸濁化剤（例、メチルセルロース）、乳化剤（例、レシチン）、保存剤などを用いる。注射用製剤の場合、溶液、懸濁液又は油性もしくは水性乳濁液の形態のいずれでもよく、これらは懸濁安定剤又は分散剤などを含有していてもよい。軟膏剤、貼布剤、パップ剤などの経皮投与用製剤、経皮吸収剤の場合は、水性基剤（水、低級アルコール、ポリオール）または油性基剤（高級脂肪酸エステル類（イソプロピルミリステート）、親油性アルコール）を用いて製剤化する。

本発明に係る造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）阻害剤および／またはプロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬は、投与形態、患者の症状、年令、体重、性別、あるいは併用される薬物（あるとすれば）などにより異なり、最終的には医師の判断に委ねられるが、経口投与の場合、体重１ｋｇあたり、１日０．０１−１００ｍｇ、好ましくは１〜１０ｍｇである。非経口投与の場合、体重１ｋｇあたり、１日０．０１−１０ｍｇ、好ましくは０．１−８ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ−１ｍｇを投与する。

製剤例１
常法により次の組成のゼラチン硬カプセル剤を調製した。
ＨＱＬ−７９１０ｍｇ
デンプン５０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム１０ｍｇ

製剤例２
常法により次の組成の錠剤を調製した。
ＨＱＬ−７９１０ｍｇ
セルロース、微晶質５００ｍｇ
二酸化ケイ素１０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム１０ｍｇ

以上詳述したように、筋ジストロフィー等の筋変性疾患において、筋変性部位の筋繊維や集積したマクロファージや肥満細胞に誘導されるＨ−ＰＧＤＳを阻害したり、変性部位周辺の血管や脂肪細胞、あるいは集積したＴｈ２細胞に発現するプロスタグランジンＤ受容体の活性化を阻害することにより、プロスタグランジンＤ_２が関与する筋変性の増悪を防ぎ、予後の改善をはかる治療用医薬組成物を提供する。またヒト造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素大量発現トランスジェニックマウスを用いて筋変性疾患の進行を防止したり改善することができる化合物をスクリーニングする方法をも提供する。

塩酸ブピバカインにより惹起された筋変性とＨＰＧＤＳ阻害剤ＨＱＬ−７９による変性領域の軽減を示す。塩酸ブピバカインによる筋壊死に対するＨＱＬ−７９の治療効果を定量化した結果を示す。塩酸ブピバカインによる筋壊死に対するＨＱＬ−７９の治療効果をＸ線ＣＴで観察した結果を示す。塩酸ブピバカインによる筋壊死を野生型マウスとヒト型HPGDS大量発現トランスジェニックマウスで比較した結果を示す。デュシェンヌ型筋ジストロフィーのモデル動物であるmdxマウスに対するHQL-79の治療効果を示す。塩酸ブピバカインによる筋壊死に対するラマトロバンの治療効果を定量化した結果を示す。

Claims

筋変性疾患を処置する医薬組成物であって、造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）の阻害剤として４−ベンズヒドリルオキシ−１−｛３−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−プロピル｝ピペリジン（ＨＱＬ−７９）または医薬的に許容し得るその塩を有効成分として含む医薬組成物。
筋変性疾患が筋ジストロフィー、肉離れ、カルディオミオパチー（心筋梗塞）、糖尿病性末梢血管障害（血管平滑筋障害）よりなる群から選択される請求項１に記載の医薬組成物。
筋変性疾患が筋ジストロフィーである請求項２に記載の医薬組成物。
１）ヒトＨ−ＰＧＤＳ大量発現トランスジェニックマウスの腓腹筋に局所麻酔薬である塩酸ブピバカイン（０．５％）を０．１ｍＬ筋肉内注射して筋変性を誘導し、
２）筋変性を誘導する前または後に候補化合物をトランスジェニックマウスに投与し、
３）候補化合物を投与したトランスジェニックマウスにおける筋変性の状態を、候補化合物を与えないトランスジェニックマウスにおける状態と比較し、候補化合物を投与したトランスジェニックマウスにおいて筋変性が軽減されている場合に候補化合物を造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）の阻害剤であると決定することを含む、Ｈ−ＰＧＤＳの阻害剤のスクリーニング方法。