JP4548339B2

JP4548339B2 - 高グルタミン・グルタミン酸含有ポリペプチド混合物及びその製造法

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Publication number: JP4548339B2
Application number: JP2005511029A
Authority: JP
Inventors: 軍喜船津; 渉釘宮; 恭江長尾; 忠久下田
Original assignee: Fuji Oil Co Ltd
Current assignee: Fuji Oil Co Ltd
Priority date: 2003-06-25
Filing date: 2004-06-24
Publication date: 2010-09-22
Anticipated expiration: 2024-06-24
Also published as: WO2005001106A1; JPWO2005001106A1

Description

本発明は大豆種子貯蔵蛋白質から高Ｇｌｘ含有ポリペプチド混合物と、これにＬｙｓとＡｒｇの豊富なペプチドが含まれるポリペプチド混合物を提供するものである。

植物種子を原料とした高Ｇｌｘ含有ペプチドの製造については、小麦グルテンからのものが報告されているに過ぎず（非特許文献１）、大豆蛋白からの製造の試みは全くなされていなかった。しかしながら、小麦グルテンからのものについても、これに含まれるＧｌｘが殆どグルタミンであるため、分子量の大きい水可溶性の高Ｇｌｘ含有ポリペプチドは得られず、従って、水可溶性の高Ｇｌｘ含有ペプチドは分子量の小さいオリゴペプチドで、Ａｓｘ，Ｌｙｓ，Ａｒｇを豊富に含むものではなかった。一方、大豆蛋白質からのペプチドの製造については、プロテアーゼ分解が主に中性〜酸性領域、３７〜５０℃、５〜６時間であったため、分解が不完全であったのに加え、混在するエキソペプチダーゼの作用もあって、高Ｇｌｘ含有ポリペプチドの集積が少なく、他のペプチドとの分別の試みもなされていなかった。

特開平１０−１０１５７６号公報鈴江緑衣朗：「たんぱく質・アミノ酸」，臨床栄養，Ｖｏｌ．８０，Ｎｏ．３，２８９−２９４（１９９２）．Ｆ．Ｌ．Ｓａｂａｓｔｉａｎｉ，ｅｔａｌ．：ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏ．，１５，１９７−２０１（１９９０）．Ｎ．Ｃ．Ｎｉｅｌｓｅｎｅｔａｌ．：Ｐｌａｎｔｃｅｌｌ，１，３１３−３２８（１９８９）．

本発明はグルタミンとグルタミン酸の豊富な水溶性の高分子量ポリペプチドを高い収量で得ることを目的とした。

本発明者らはこれらの問題を解決するために種々検討を行った。本発明者等は、大豆種子の貯蔵蛋白質は食品としてアミノ酸バランスのよい水溶性蛋白質で、２９２個のアミノ酸残基からなる酸性サブユニットと１８５個のアミノ酸残基からなる塩基性サブユニットから構成されるグリシニンと６２６個のアミノ酸残基から成るコングリシニンの会合体でグルタミン・グルタミン酸及び疎水性アミノ酸の連続した配列が随所に存在し、これらの間にＬｙｓとＡｒｇが点在する特徴あるアミノ酸配列を有することに着眼した。

本発明者らは、この大豆蛋白質の特徴あるアミノ酸配列より、分子量の大きい高Ｇｌｘ含有ポリペプチド混合物を簡便に収量よく製造するために、Ｇｌｘを多く含む領域のペプチド結合は切断せず、他のペプチド結合を切断するようなプロテアーゼと、それによる分解の条件を選定することが重要で、さらに不完全分解によって残存する分子量の大きい画分を高Ｇｌｘ含有ポリペプチド混合物から分別し、さらに多量に存在する低分子量のペプチドを除去することにより目的のポリペプチドを得ることが出来る知見を得て本発明を完成するに到った。

即ち、本発明は、大豆蛋白原料をプロテアーゼで処理し、疎水性アミノ酸の豊富な未分解の高分子画分を沈殿として除去する第１工程、残りの溶液にエタノールを添加して沈殿画分を得る第２工程を経て、該沈殿画分を乾燥することを特徴とする高グルタミン・グルタミン酸（Ｇｌｘ）含有ポリペプチド混合物の製造法である。

プロテアーゼ処理はアルカリ域を保持しながら基質特異性の低いプロテアーゼで加水分解することが好ましい。第１工程における未分解高分子画分の沈殿除去は酸性ｐＨ調節及び／又はエタノールの添加によることが好ましい。第２工程の後にゲル濾過により低分子ペプチドを除去することが好ましい。

また、本発明は、大豆蛋白由来であって、分子量が１〜１３ｋＤａ、Ｇｌｘの含有量が２７．４〜２７．８ｍｏｌ％であり，Ａｓｘ，Ｌｙｓ，Ａｒｇの含量がそれぞれ１１〜１３，９〜１１，１１〜１５ｍｏｌ％である高Ｇｌｘ含有ポリペプチド混合物（アスパラギンかアスパラギン酸か不明の際はＡｓｘと略する）である。また、本発明は、大豆蛋白由来であって、分子量が６〜１３ｋＤａ、Ｇｌｘの含量が３７〜３９ｍｏｌ％、Ａｓｘの含量が１５．４〜１６．２ｍｏｌ％である高Ｇｌｘ含有ポリペプチド混合物である。

本発明に係わるポリペプチド混合物は、大豆蛋白質由来のグルタミン・グルタミン酸の豊富なポリペプチド混合物で、多くの−ＣＯＯＨ基を有し、水にも５０％エタノールにも可溶な両親媒性であるため、新しい機能素材としての開発が期待できる。またエタノール沈殿法で得られた標品は、Ｇｌｘに加え、人の生理作用に重要な働きをもつＡｓｘ，Ｌｙｓ，Ａｒｇを多く含み、更なる酵素分解による生理機能性ペプチドの作出や、アミノ酸サプリメントとしての有効利用が期待できる。

本発明に用いる大豆蛋白原料としては分離大豆蛋白質や脱脂豆乳が好ましいが、脱脂大豆でも用いることが出来る。しかしながら、後者の場合は蛋白質以外の成分を多量に含むため、プロテアーゼによる分解度が悪く、またプロテアーゼ分解物からの未分解高分子画分の沈殿除去が酸性ｐＨ調節のみでは不充分で、エタノールの添加を必要とした。大豆蛋白原料に水を加えて攪拌し、ｐＨをアルカリ領域に調節した後、プロテアーゼを加えて酵素分解を開始するが、この場合、蛋白質は完全に溶解させる必要はなく（分解中に溶解する）、加える水の量は蛋白原料の５〜２０倍、好ましくは９〜１０倍がよい。

本発明に用いるプロテアーゼとしては、アルカリ側に最適ｐＨを持ち、高温で安定であり、ほとんどのペプチド結合を分解できる、基質特異性の低いプロテアーゼが好ましく、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｕｔｉｌｉｓ由来のアルカリプロテアーゼであるビオブラーゼなどを用いることが出来る。

大豆蛋白原料をプロテアーゼで処理する態様として、プロテアーゼ処理をアルカリ域を保持しながら基質特異性の低いプロテアーゼで加水分解することが好ましい。通常、大豆蛋白をアルカリ域で酵素分解すると加水分解が進むにつれてｐＨが低下し微酸性域に移行してしまう。本発明においてはアルカリ域を保ちながら酵素分解することによって目的のグルタミン酸の豊富な高分子のポリペプチドを得ることが出来る。微酸性域に移行したままで酵素分解を続けると低分子のオリゴペプチドにまで加水分解されるだけでなく、グルタミン酸の豊富なペプチド画分を得ることが困難となる。

かかるアルカリ域としてはｐＨ７．５〜１０、好ましくはｐＨ８〜９．５、より好ましくはｐＨ８．５〜９．０が適当である。このｐＨ調節には苛性ソーダ溶液などのアルカリ金属水酸化物を用いることも出来るが、アンモニア溶液（例えば５％溶液）などの有機アルカリを用いることが出来る。例えば、アンモニア溶液を用いると高濃度を使用できるので緩衝能が大きく、ｐＨ調節の頻度が少なくて済むことに加え、分解後の減圧濃縮により分解液から容易に除去でき、中和による塩の生成を避けることが出来る。

プロテアーゼ分解の温度は、分解過程における雑菌による汚染を避けるために高い方が望ましく、例えば、ビオブラーゼの場合、ｐＨ９で安定である４５〜５５℃を用いることが好適である。分解時間としては分解によるｐＨの低下が無くなるまで行うことが好ましく、大豆蛋白原料に対して１／１００重量の酵素を用いた場合１５〜２０時間とすることが出来る。

この酵素分解によって、大部分の蛋白質が小さいペプチドにまで分解されるが、大豆蛋白質中に存在する疎水性アミノ酸に富む固い高次構造部分は分解されにくく、分子量の大きいポリペプチドとして残存するので、目的とする高Ｇｌｘ含有ポリペプチドと分別することが出来る。
即ち、第１工程において、疎水性アミノ酸の豊富な未分解の高分子画分を沈殿として除去することが出来る。この未分解高分子画分の沈殿除去は酸性ｐＨ調節及び／又はエタノールの添加によって行うことが出来る。
このようにすると未分解の疎水性高分子ポリペプチドは沈殿するが、グルタミン酸の豊富な高Ｇｌｘ含有ポリペプチドは溶液中に残るため、両者を分別できる。

未分解の疎水性高分子ポリペプチドを沈殿させる酸性ｐＨ調節は、大豆蛋白の等電点近傍にすることが好ましく、例えば、ｐＨ３．５〜５．５、好ましくはｐＨ４．０〜５．０が適当である。
沈殿の程度は用いる蛋白原料（例えば分離大豆蛋白、濃縮大豆蛋白、豆乳、脱脂大豆など）により異なり、大豆蛋白の割合が低くなるほど沈殿度が悪くなるため、この場合はさらにエタノール添加をすることが好ましい。

エタノール添加により沈殿物と溶液を分別する場合、未分解の疎水性高分子ポリペプチドを沈殿させるエタノール濃度は、ｐＨによって異なり、中性の場合は酸性の場合より高いエタノール濃度を必要とするが、中和した分解液にエタノールを加える場合、５０％エタノール濃度までの低い濃度で殆ど沈殿するので、エタノール濃度は５０％以下とすることが出来る。大豆蛋白の割合が高い分離大豆蛋白を用いる場合でかつ等電点付近であればアルコールはほとんど必要とせず、等電点以外でも、大豆蛋白割合の高い分離大豆蛋白を用いる場合エタノール濃度は２０％〜５０％で未分解の疎水性高分子ポリペプチドを沈殿させることが出来る。

未分解の疎水性高分子ポリペプチドを沈殿として除去した第１工程の後、残りの溶液にさらにエタノールを加えると高Ｇｌｘ含有ポリペプチドを沈殿させることが出来る。加えるエタノールの量は溶液のエタノール濃度が７０〜８０％となるように加えることが好ましい。エタノールの濃度が低いと目的の高Ｇｌｘ含有ポリペプチドの収率が低下し、高いと低分子ペプチドまで沈殿してしまい目的の高Ｇｌｘ含有ポリペプチドの純度が低下する。

このようにして得られた高Ｇｌｘ含有ポリペプチドは、分子量が１〜１３ｋＤａでＧｌｘの含有が２７．４〜２７．８ｍｏｌ％（大豆蛋白質のＧｌｘ含有量より約８％高い）であり，Ａｓｘ，Ｌｙｓ，Ａｒｇの含量がそれぞれ１１〜１３，９〜１１，１１〜１５ｍｏｌ％である高Ｇｌｘ含有ポリペプチド混合物とすることができる。

第２工程の後にゲル濾過により低分子ペプチドを除去することが出来る。ゲル濾過剤としては、分子量３，０００〜１５，０００を分画できるものであればよく、例えばＢｉｏＧｅｌＰ−１０やＳｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−５０などを用いることが出来る。エタノールによって沈殿した高Ｇｌｘ含有ポリペプチドはエタノールを蒸散するなどして除去した後、該高Ｇｌｘ含有ポリペプチドに含まれる分子量の異なるペプチドをゲル濾過によって分画した場合分子量が６〜１３ｋＤａでＧｌｘの含量が３７〜３９ｍｏｌ％、アスパラギン酸・アスパラギン（Ａｓｘ）の含量が１５．４〜１６．２ｍｏｌ％である高Ｇｌｘ含有ポリペプチド混合物とすることが出来る。分子量の大きい画分ほどＧｌｘを多く含み、そのＧｌｘ含量は３９ｍｏｌ％まで上昇させることができる。なお、透析による分画では、高分子量画分（内液）と低分子量画分（外液）のＧｌｘ含量は殆ど同じで、ゲル濾過のような効果は認められない。

以上のように、ゲル濾過によって低分子画分を除去した高Ｇｌｘ含有ポリペプチド混合物は３７〜３９ｍｏｌ％のＧｌｘを含み、Ａｓｘも１５．４〜１６．２ｍｏｌ％と高い値を示したが、ＬｙｓとＡｒｇの含量はゲル濾過によって、それぞれ４．３４〜４．７１と４．６７〜５．７７ｍｏｌ％に減少し、事実、高Ｌｙｓ（２３．３７％ｍｏｌ％）含有画分と高Ａｒｇ（２７．９３ｍｏｌ％）含有画分が低分子量領域に得られる。

以下、実施例ににより本発明の実施態様を説明する。
［実施例１］
分離大豆蛋白質（ＳＰＩ）（不二製油（株）製「フジプロ−Ｒ」）３００ｇに脱イオン水を加えて３１とし、５％アンモニア溶液でｐＨ９に調整した後ビオブラーゼ６ｇを加え、攪拌しながら５０℃恒温槽中、同アンモニア溶液でｐＨ９に調節しながら２０時間インキュベートした。遠心分離して得られた上清をロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮した後、凍結乾燥し、２４１ｇ（収量＝８０．１％）のＳＰＩ−ビオブラーゼ分解物を得た。

ＳＰＩ−ビオブラーゼ分解物５０ｇを含む水溶液２５０ｍｌに２５０ｍｌのエタノールを加え、生じた沈殿を遠心分離によって除去した後、上清に７０％濃度にまでエタノールを添加した。生じた沈殿を５０〜７０％ＥｔＯＨ−Ｐｐｔ画分として遠心分離により分離し、さらに上清に８０％濃度にまでエタノールを加え、生じた沈殿を７０〜８０％ＥｔＯＨ−Ｐｐｔ画分とて遠心分離した。これらを脱イオン水に溶解して凍結乾燥した結果それぞれ１５．１ｇ〔収量＝３１．６％〕と６．１ｇ（収量＝１２．２％）でいずれもＡｓｘ，Ｌｙｓ，Ａｒｇを多く含む高Ｇｌｘ含有ポリペプチドであった。それらのアミノ酸組成を表１に示す。

得られた５０〜７０％ＥｔＯＨ−Ｐｐｔ画分２０ｍｇを脱イオン水に溶解して遠心分離後、上清をＢｉｏＧｅｌＰ−１０カラム（１．８×２０ｃｍ）に供し、脱イオン水で展開した結果、図１に示すように、２つの画分に分かれた。最初に溶出される分子量の大きい画分（画分１）のアミノ酸組成を表１に示すが、ゲル濾過により低分子成分が除去された結果、Ｇｌｘの含量が著しく高い高Ｇｌｘ含有ポリペプチド混合物が得られた。

［実施例２］
分離大豆蛋白質２００ｇに脱イオン水を加えて２ｌとし、アンモニア溶液でｐＨを９にした後、ビオブラーゼ４ｇを加え、５０℃で２０時間インキュベートした。分解液を減圧濃縮により１ｌまで濃縮した後、酢酸を加えてｐＨを５に調節して氷冷し、生じた沈殿を遠心分離によって除去した。先ず、得られた上清に同容量のエタノールを加えて冷却し、生じた沈殿をＳＰＩからのｐＨ５／０〜５０％ＥｔＯＨ−Ｐｐｔ画分とし遠心分離し、次いで上清に７０％濃度になるまでエタノールを加え、生じた沈殿をＳＰＩからのｐＨ５／５０〜７０％ＥｔＯＨ−Ｐｐｔ画分として分離した。脱イオン水に溶解後、凍結乾燥した結果１８．９ｇ〔収量＝９．５％〕のｐＨ５／０〜５０％ＥｔＯＨ−Ｐｐｔ画分と４７．４ｇ（収量＝２３．７％）のｐＨ５／５０〜７０％ＥｔＯＨ−Ｐｐｔ画分が得られ、表１に示すように、いずれもＬｙｓとＡｒｇを多く含む高Ｇｌｘ含有ポリペプチド混合物であった。

［実施例３］
ヘキサン脱脂大豆粉末３００ｇに脱イオン水を加えホモゲナイズし（約３１）、５％アンモニア溶液でｐＨ９に調節した後、３ｇビオブラーゼを加え、５０℃で２０時間分解した。遠心濾過して得られた濾液を減圧濃縮した後、凍結乾燥し１８８ｇの脱脂大豆−ビオブラーゼ分解物を得た。１０ｇの分解物に脱イオンス水１００ｍｌを加え、酢酸にてｐＨを５に調節して冷却した後、生じた沈殿を遠心分離によって除去した。得られた上清に同容量のエタノールを加え、生じた沈殿を脱脂大豆からのｐＨ５／０〜５０％ＥｔＯＨ−Ｐｐｔ画分とし、さらに７０％濃度までエタノールを加え、生じた沈殿を脱脂大豆からのｐＨ５／５０〜７０％ＥｔＯＨ−Ｐｐｔ画分として分離した。

両画分をＢｉｏＧｅｌＰ−１０カラムを用いたゲル濾過に供し、０．１％アンモニア溶液で展開した結果、図２に示すような２〜４個のピークが得られた。それらのアミノ酸組成を調べた結果、表２に示すように、高Ｇｌｘ含有ポリペプチドはｐＨ５／０〜５０％ＥｔＯＨ−Ｐｐｔ画分には含まれず、ｐＨ５／５０〜７０％ＥｔＯＨ−Ｐｐｔ画分の高分子画分（画分１）に含まれることがわかった。またその低分子画分（画分３と画分４）はそれぞれ高いＬｙｓとＡｒｇ含量を示し、これらを含むペプチドが分子量の大きい高Ｇｌｘ含有ポリペプチドと共存していたことがわかった。

分離大豆蛋白質のビオブラーゼ分解物から分画した５０〜７０％ＥｔＯＨ−ＰｐｔのＢｉｏＧｅｌＰ−１０〔１．８×２０ｃｍ〕によるゲル濾過パターンを示す。展開溶媒は脱イオン水。脱脂大豆のビオブラーゼ分解物をｐＨ５に調節し、生じた沈殿を除去した上清から分画した０〜５０％ＥｔＯＨ−Ｐｐｔ画分（Ａ）と５０〜７０％ＥｔＯＨ−Ｐｐｔ画分（Ｂ）のＢｉｏＧｅｌＰ−１０〔２×３５ｃｍ〕によるゲル濾過パターンを示す。展開溶媒は０．１％アンモニア溶液。

Claims

大豆蛋白原料をプロテアーゼで処理する際、ｐＨ７．５〜１０のアルカリ域を保持しながら加水分解し、加水分解後の溶液を、ｐＨ３．５〜５．５の酸性ｐＨ調節及び／又は、エタノール濃度が５０％以下になるようにエタノール添加することにより、疎水性アミノ酸の豊富な未分解の高分子画分を沈殿として除去する第１工程、残りの溶液にエタノール濃度が７０〜８０％となるようにエタノールを添加して沈殿画分を得る第２工程を経て、該沈殿画分を乾燥することを特徴とする高グルタミン・グルタミン酸（Ｇｌｘ）含有ポリペプチド混合物の製造法。
プロテアーゼ処理が、基質特異性の低いプロテアーゼで加水分解する請求項１の製造法。
第２工程の後にゲル濾過により低分子ペプチドを除去する請求項１又は請求項２の製造法。