JP4635520B2 - 植物成長促進剤 - Google Patents

Description

本発明はDSP（Bacillus circulans HA12株を用い、大豆ミールを分解した植物成長促進ペプチド混合物）に優るとも劣らない植物成長促進剤を提供するものである。

現在、化学肥料・農薬の使用による土壌環境、人体への悪影響が報告されている。本発明者等はこの問題をバイオマス資源である大豆ミールを有効利用するとともに改善し、環境浄化を行うことにした。そして、大豆タンパク質を高速に分解する菌株B. circulans HA12を取得し、その分解物DSPの植物に対する生長促進効果を確認した。これらの大豆ミールから植物成長促進物質を製造することは以下のように試みられてきた。

特許文献１（特開平６−２３７７６０号公報）には、バチルス・サーキュランスＨＡ１２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２８）及び／又はバチルス・ステアロサーモフィルスＨＡ１９（ＦＥＲ Ｍ Ｐ−１３４２９）の新規微生物が産生するタンパク質分解酵素で大豆ミールを特異的に分解し大豆ミール由来有機肥料を製造することが開示されている。
特許文献２（特開２００２−３６２９８８号公報）には、大豆ミールのタンパク質をバチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）ＨＡ１２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２８）新規菌株の産出する酵素を用いて加水分解して根毛増殖を伴う植物成長肥料を製造する方法が開示されている。
特許文献３（特開２００２−９５４６８号公報）には、 バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）ＨＡ１９（ＦＥＲＭ Ｐ−１３ ４２９）新規菌株。の産出する蛋白分解酵素で大豆ミールの大豆蛋白を酵素分解して植物成長肥料を製造する方法が開示されている。
特許文献４（特開２００３−７３２１０号）には、（Bacillus circulans）ＨＡ１２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２８）によって産生される大豆ミール分解産物（ＤＳＰ）、または、Streptomyces SP．MF20によって産生される大豆ミール分解産物（ＳＷＳ）から親水性画分を回収する工程、および、該親水性画分から分子量約５００Ｄａ〜１０００Ｄａに相当する画分を精製する工程によって得られるペプチド様物質を植物の成長を促進するための組成物として開示している。

以上のように大豆ミールの微生物産生酵素による加水分解物である所謂ＤＳＰやＳＷＳが根毛増殖など植物成長を促進することが知られるようになってきた。また、DSPの生理活性因子は分子量1,000以下のペプチド性の物質であることが示唆されているが実態は未だ不明である。その主な理由は、酵素分解する原料である基質は大豆ミールであり、大豆蛋白の成分であるグリシニン、β-コングリシニン、ホエー蛋白、その他の微量大豆蛋白成分について酵素分解して各々からペプチドを採取し、その植物成長効果を開示するものではないからである。

ところで、大豆ミールは分離大豆蛋白の製造原料、豆乳や豆腐の製造原料として産業上の利用が出来るものの、大豆ホエーは脱脂豆乳から分離大豆蛋白を製造する際に副産されるバイプロダクトとして、その利用が模索されている。この大豆ホエーはイソフラボン、トリプシンインヒビター、β-アミラーゼなどの生理活性物質やビフィズス因子としてのオリゴ糖を含むなど近年その有効利用が研究されている。
この大豆ホエーの有効利用のひとつとして、大豆トリプシンインヒビターを工業的に製造する方法を本願出願人は特許文献５（中国公開番号1475504号公報） として出願している。またその他にも塩析など蛋白質の分画法を利用した、大豆トリプシンインヒビターの製造方法が知られている。
ところで、これらＤＳＰやＳＷＳはいろいろなペプチドの混合物である、果たして植物成長に効果のあるペプチドが大豆蛋白のどの種類のどれくらいの加水分解されたものか、あるいはどの程度の分子量のペプチドであるか、そのアミノ酸配列はどうなっているかなど実態はまだ知られていないのが現状である。

特開平６−２３７７６０号公報 特開２００２−３６２９８８号公報 特開２００２−９５４６８号公報 特開２００３−７３２１０号公報 中国公開第１４７５５０４号公報

本発明者等は、背景技術の項に開示されているＤＳＰやＳＷＳに含まれる根毛増殖などの植物成長促進効果を有する因子を探求しその実態を明らかにして植物成長促進剤を得ることを目的とした。
特に、この発明では大豆ミールより産業上ではバイプロダクトとしての大豆ホエーの有効利用のひとつとして、この大豆ホエーから植物成長促進剤を得ることを目的とした。なぜなら、大豆ミールに関する研究はされてきたが大豆ホエーに関する研究は未着手だからである。

本発明者等は前記課題を解決すべく研究するなかで以下の知見を得た。以下は大豆ミールに関する研究の知見である。
まず、DSPは大豆ミールの分解12時間以降から生理活性効果を示した。また、中性プロテアーゼ欠損株であるB. subtilis MT-2による大豆ミール分解物にも生理活性効果が確認できたことから、DSPの生理活性因子の生成にはアルカリプロテアーゼの関与が強く示唆された。そして、Bacillus属由来のアルカリプロテアーゼ、サチライシンによる大豆ミール分解物にも生理活性効果が確認できた。なかでも、HA12株のプロテアーゼを用いた場合に他のプロテアーゼを用いた場合より強い活性が見られた。
このHA12株のプロテアーゼは、最適温度は70 ℃、最適pH 10 、分子量約30,000ダルトンであり、PMSF（セリンプロテアーゼ阻害剤）で阻害されたことから、セリンプロテアーゼであることが確認された。

次に、大豆ミールから大豆ホエーや分離大豆蛋白、さらに分離大豆蛋白を７Ｓ成分や１１Ｓ成分に分画して、これらの酵素分解物について植物成長促進効果を研究した。そのなかで、β-コングリシニンの酵素分解物には植物成長促進効果はないのに、グリシニンとトリプシンインヒビター、それぞれ分解物にDSP様の生理活性効果が確認され、これらタンパク質がDSP生理活性因子の起源タンパク質であることが分かった。また、驚いたことに大豆ホエーの画分の中から大豆ミールより優れた植物成長促進効果を有するペプチドが生ずることを見出し本発明を完成するに到った。そして、この大豆ホエー中の植物成長因子であるペプチドのN末端アミノ酸配列10残基を調べたところ、大豆トリプシンインヒビター分解前のそれと一致し、そのＮ末端アミノ酸配列の１０残基がAsp-Phe-Val-Leu-Asp-Asn-Glu-Gly-Asn-Proのアミノ酸配列である知見を得て生理活性因子のひとつが大豆トリプシンインヒビターの分解物であることがわかった。更に研究するなかで、この大豆トリプシンインヒビターの分解物の生理活性因子は陰イオン交換樹脂や活性炭に吸着し、また分子量1,000以下のペプチドであることが示唆された。
一方、グリシニン分解物中の生理活性因子では分子量が1,000以上であることが示唆されており、DSP中には少なくとも2つ以上の生理活性因子の存在が示唆された。
このように、DSP中には生理活性因子が複数存在することが示唆された。以上のうち、大豆ホエーや大豆ホエー成分のひとつである大豆トリプシンインヒビター由来のペプチドに関する植物成長促進剤を得ることが出来て本発明を完成するに至ったものである。

即ち、本発明は、大豆ホエーまたは大豆トリプシンインヒビターをアルカリプロテアーゼを用いて加水分解したペプチドを有効成分とする植物成長促進剤である。大豆トリプシンインヒビターはクニッツ型が好ましい。アルカリプロテアーゼはセリンプロテアーゼが好ましく、B. circulans HA12の産生するプロテアーゼがより好ましい。

本発明により、大豆ホエーまたは大豆トリプシンインヒビターのアルカリプロテアーゼ分解物が従来知られていた大豆ミール由来のＤＳＰより強い植物成長促進効果を有する知見を得ることが出来た。このことにより従来バイプロダクトとしてその有効利用が模索されていた大豆ホエーの有効利用が拡大されたものである。
即ち、大豆ホエーは大豆蛋白製造工程で副産され、βアミラーゼなどが工業的に生産されている程度で、ホエー全体としてはその利用率が極めて低いものをかかる植物成長促進剤の原料として有効に利用することが出来るようになったものである。
また、大豆ホエーから粗大豆トリプシンインヒビターや粗クニッツ型大豆トリプシンインヒビターを製造する方法があるので、これらの方法を利用して粗大豆トリプシンインヒビターを用いて、アルカリプロテアーゼで酵素分解すれば優れた植物成長促進剤を工業的に製造することが出来るものであり、産業の発達に大いに寄与するものである。
従来は、大豆ミール由来の酵素分解物であったためＤＳＰのような種々のペプチドが混在した植物成長促進剤であったものを、本発明によりこのなかから特に根毛増殖効果、植物成長促進効果が該ＤＳＰより優れた大豆ホエーまたは大豆トリプシンインヒビター由来のペプチド混合物である植物成長促進剤を得ることが出来たものである。

本発明の植物成長促進剤について説明する。本発明は、大豆ホエーまたは大豆ホエー由来の大豆トリプシンインヒビターをアルカリプロテアーゼを用いて加水分解したペプチドを有効成分とする植物成長促進剤である。

本発明に用いる大豆ホエーは大豆ミールを水抽出して得た豆乳を酸などで等電点沈殿させて大豆蛋白を除いた残りの水溶液として得ることが出来る。多くは分離大豆蛋白の製造工程で大豆ホエーとして量産されるバイプロダクトである。
本発明に用いる大豆トリプシンインヒビターは主に大豆ホエーから塩析などして得ることが出来る。また、市販の大豆トリプシンインヒビターを用いることができる。大豆トリプシンインヒビターにはボーマンバーグ型とクニッツ型があるが、これらを分離していない大豆トリプシンインヒビターを用いることができるが好ましくはクニッツ型が適当である。市販大豆トリプシンインヒビターは、特に純度が高いほど一般に高価であるので工業的生産を考慮すると精製度が低くても安価な大豆トリプシンインヒビターが実用的である。例えば、大豆ホエーを用いて製造した粗大豆トリプシンインヒビターが工業的に適している。

粗大豆トリプシンインヒビターは、例えば特許文献５に記載の方法を用いて製造することが出来る。即ち、 大豆ホエーを濃縮し、ｐH２.０〜４.５で析出する凝集沈殿物を回収して粗大豆トリプシンインヒビターとして利用することができる。このとき、大豆ホエーの濃縮がｐＨ３．５〜８．５で固形分３０％〜５０％の範囲まで行うことが好ましい。また、この凝集沈殿物へ加水してｐＨ２.０〜４.８の範囲で部分的再溶解を行い、更に固液分画することができる。
そしてこの固液分画で得られる液体部がＢＢＩ（ボーマンバーグ）型トリプシンインヒビター濃縮物、固体部物がKunitz（クニッツ）型トリプシンインヒビター濃縮物であるので、好ましくは後者のKunitz（クニッツ）型トリプシンインヒビターを本発明のアルカリプロテアーゼで酵素分解することが好ましい。

また、大豆ホエーに塩を加えて大豆トリプシンインヒビターを塩析させて得られる粗大豆トリプシンインヒビターを用いることが出来る。また、前記大豆ホエーの濃縮を半分程度にし、塩を加えてｐH２.０〜４.５で塩析させて得られる粗大豆トリプシンインヒビターを用いることが出来る。

本発明の大豆ホエーや大豆トリプシンインヒビターを加水分解するアルカリプロテアーゼはセリンプロテアーゼが好ましく、B. circulans HA12の産生するプロテアーゼ、中性プロテアーゼ欠損株であるB. subtilis MT-2の産生するプロテアーゼ、またはBacillus属由来のアルカリプロテアーゼ、サチライシンを利用することもできる。

以上のように大豆ホエー、大豆トリプシンインヒビターあるいは大豆トリプシンインヒビターに富む画分（粗大豆トリプシンインヒビター）をアルカリプロテアーゼで加水分解したペプチド混合物を植物成長促進剤とすることが出来る。これは大豆ミールを同様に酵素分解したものよりも植物成長促進効果に優れるものである。

そして、好ましくは、該大豆ホエー酵素分解物や大豆トリプシンインヒビター酵素分解物を陰イオン交換樹脂に吸着して吸着画分を採取したり、大豆トリプシンインヒビター加水分解物を活性炭に吸着して吸着画分を採取したり、更に、その後ゲル濾過で分画して分子量１０００以下のペプチド画分を採取するなどして得られたペプチド画分が適当である。
このようにして分画されたペプチド画分は従来知られていたＤＳＰより優れた植物成長促進効果を有するものである。

以下、実施例により本発明の実施態様を説明する。

なお、以下の実施例における根毛増殖活性の測定は、小松菜を用いた。その植物根の撮影法は以下である。
メチレンブルーで染色した植物根を、実体顕微鏡（Stereo-Microscope Model DAW、ケニス株式会社、大阪）を用いて60倍で撮影した。また、各サンプルの根毛密度の評価は、得られた根毛写真の中心部分（縦1/2×横1/2）の明るさをPhotoshop 5.0 Adobe（CA、USA）を用いて評価し、比較を行った。

実施例１ （ホエー画分分解物の生理活性効果）
低変性脱脂大豆60 g（不二製油株式会社製造）に15 倍量の蒸留水（900 ml）を加え、よく撹拌した。それをpH 7.5に調整後、1時間静置した。静置後、9,000 G、30分遠心分離し、その上清画分を脱脂豆乳とした。得られた脱脂豆乳をpH 4.5に調整後、10,000 rpm、10分遠心分離し、その上清画分をホエー画分とした。

分離したホエー画分をHA12株のプロテアーゼを用いて37 ℃、5時間分解し、その分解物の生理活性効果を確認することにした。この結果、ホエー画分分解物にDSP様の主根の短縮、根毛形成の促進といった生理活性効果が見られ、DSPの生理活性因子がホエー画分分解物から生成されるということが確認された。また、生理活性効果はDSPよりも、ホエー画分分解物では強い生理活性効果が確認された。

実施例２ （陰イオン交換クロマトグラフィーによるホエー画分の分離）
実施例１と同様にしてホエー画分を得た。
実験条件 ：陰イオン交換樹脂 DEAE-650Cを用い、ホエー画分をpH 8.0で吸着及び非吸着画分に分離した。

クロマトグラムを図１に示す。各フラクションを分画後、HA12のプロテアーゼで分解し、根毛活性を調べたところ、図２に示す通り、図１の（５）のピークから得られた分解物に強い根毛活性が認められた。このピークのSDS-PAGE分析を行ったところ、図３に示すとおり、約２０ｋDaのタンパク質であることが明らかとなった。そこで、このタンパク質のN末端アミノ酸を解析したところ（１０残基）、Asp-Phe-Val-Leu-Asp-Asn-Glu-Gly-Asn-Proと決定された。これは、クニッツ型大豆トリプシンインヒビターのそれと完全に一致した。

実施例３（大豆トリプシンインヒビター分解物の生理活性効果）
大豆トリプシンインヒビター（和光純薬工業株式会社、「クニッツ型大豆トリプシンインヒビター」）をHA12株のプロテアーゼを用いて37 ℃、5時間分解し、その分解物の生理活性効果を確認することにした。確認は前記の植物根の撮影法を用いた。
この結果、トリプシンインヒビター分解物（以下DTIPと略す）にDSP様の主根の短縮、根毛形成の促進といった生理活性効果が確認された。また、DSPよりも濃度が低いのにもかかわらず、DSP並みの強い生理活性効果を示した。

実施例４（トリプシンインヒビター分解物中に含まれる根毛形成促進因子の解析）
実施例３で得たトリプシンインヒビター分解物を活性炭処理後、吸着した画分をゲルろ過クロマトグラフィー（カラム：G2000SW、溶媒：20mM Tris-HCl (pH7.0)、検出：UV220nm、温度：35℃）を行った結果を図４に示す。縦軸がA220、横軸が時間を示している。この大きく分けて３つのフラクションのうち、（３）のフラクションに根毛形成促進因子が含まれていることを確認した。ただし、Ａ２２０とは220nmにおける吸光度を示す。

ホエー画分を陰イオン交換クロマトグラフィーに供したときのクロマトグラムを示すグラフである。 図１のピーク（５）の根毛形成促進活性を示すグラフである。 図１のピーク（５）のSDS-PAGE分析を示すグラフである。 トリプシンインヒビター分解物を活性炭処理後、ゲルろ過クロマトグラフィーを行った結果を示すグラフである。縦軸がA220、横軸が時間を示している。

Claims (4)

1. 大豆ホエーまたは大豆トリプシンインヒビターをアルカリプロテアーゼを用いて加水分解することにより，植物成長促進剤を製造する方法。
2. 大豆トリプシンインヒビターがクニッツ型である請求項１の植物成長促進剤を製造する方法。
3. アルカリプロテアーゼがセリンプロテアーゼである請求項１または２の植物成長促進剤を製造する方法。
4. セリンプロテアーゼがB.circulans HA12の産生するプロテアーゼである請求項３の植物成長促進剤を製造する方法。