JP4455335B2 - 核酸増幅方法及び一塩基多型検出方法 - Google Patents
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Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲにより核酸を増幅させる核酸増幅方法、及び、ＰＣＲにより一塩基多型を検出するための一塩基多型検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、ＰＣＲにより核酸を増幅させる核酸増幅方法が知られている。即ち、反応液中に、鋳型DNA、プライマーDNA、DNAポリメラーゼ等を混合して、鋳型DNAのうち、２種類のプライマーDNAによって挟まれた領域を特異的に増幅させ、特定の核酸を得るものである。
このような核酸増幅方法には、大腸菌（E.coli）等のRecAタンパク質を用いる方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
【特許文献１】
特許第３０１０７３８号公報（第１−４頁）
【０００４】
しかしながら、ＰＣＲ反応を行うと、所望の核酸（正しい特異的なＰＣＲ産物）だけでなく、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）も増幅される場合がある。さらに、このような場合において、ＰＣＲの条件を適宜変更しても、上記のような従来の方法では、なお副産物が増幅されることも少なくない。
【０００５】
本発明はかかる現状に鑑みてなされたものであって、ＰＣＲ反応において副産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅することができる核酸増幅方法、及び、ＰＣＲ反応において副産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅することができることを利用して一塩基多型を検出する一塩基多型検出方法を提供することを目的とする。
【発明の開示】
【０００６】
前記目的を達成するための解決手段は、ＰＣＲにより核酸を増幅させる核酸増幅方法であって、ＰＣＲ反応液中に、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）に由来するRecAタンパク質を含む相同的組換えタンパク質を混合すると共に、前記ＰＣＲ反応液中に、複数セットのプライマーDNAを加え、前記ＰＣＲ反応液中に、ATP-γSを加えて、ＰＣＲを行うことを特徴とする核酸増幅方法である。
【０００７】
本発明によれば、ＰＣＲ反応液中に、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）に由来するRecAタンパク質等の相同組み換えタンパク質を混合して、ＰＣＲを行い、所望の核酸を増幅させる。
このようにＰＣＲを行えば、所望の核酸（正しい特異的なＰＣＲ産物）の収量を減少させることなく、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。より具体的には、本発明によれば、ＰＣＲの条件を適宜変更することにより、プライマーDNAと鋳型DNAとの塩基のミスマッチが３塩基以内の場合においてのみ、特異的に核酸を増幅させるようにすることができる。さらには、ＰＣＲの条件を適宜変更することにより、プライマーDNAと鋳型DNAとの塩基のミスマッチが２塩基以内の場合においてのみ、特異的に核酸を増幅させるようにすることができる。またさらには、ＰＣＲの条件を適宜変更することにより、プライマーDNAと鋳型DNAとの塩基のミスマッチが１塩基の場合においてのみ、特異的に核酸を増幅させるようにすることも可能である。
【０００８】
また、本発明の核酸増幅方法によれば、ＰＣＲ反応液中に加えるプライマーDNAの濃度を低く抑えても、十分な量の核酸を増幅させることができ、しかも、プライマーDNAの濃度を低くすることにより、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸だけをより特異的に増幅させることが可能となる。
また、この核酸増幅方法は、上記のように特異性が高いため、アニーリング温度等、プライマー伸長反応の温度条件を変えても、所望の核酸を特異的に増幅させることができる。即ち、従来の核酸増幅方法では、アニーリング温度等、プライマー伸長反応の温度を低く設定すると、目的とする核酸だけでなく、副産物も多量に増幅されることとなるが、本発明によれば、目的とする核酸をより特異的に増幅させることが可能となる。
また、この核酸増幅方法では、ＰＣＲ反応液中に加えるDNAポリメラーゼの添加量を低く抑えても、従来の方法に比して、十分な量の核酸を増幅させることができる。
このように、本発明の核酸増幅方法では、所望の核酸をより特異的に増幅することができる。
【０００９】
さらに、本発明によれば、ＰＣＲ反応液中に複数の標的DNAのプライマーセットを混合し、同時に複数の異なったDNAを増幅するＰＣＲを行う。
従来の核酸増幅方法では、プライマーDNAの濃度をある程度高くしないと所望の核酸を増幅することが難しかったため、複数セットのプライマーDNAを加えることが困難であった。
これに対し、本発明では、上述した相同組み換えタンパク質を加えることにより、各プライマーDNAの濃度を低くしても、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸だけをより特異的に増幅させることができる。従って、複数の標的DNAのプライマーセットを混合することができ、しかも、このようにしてＰＣＲを行っても、副産物の増幅を抑えつつ、各プライマーセットに対応した所望の核酸だけをより特異的に増幅させることができる。
さらに、本発明によれば、ＰＣＲ反応液中に、前述の相同組換えタンパク質を混合した上、さらに、ATP-γSも加えて、ＰＣＲを行う。
このようにＰＣＲを行えば、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができる。なお、ATP-γSを加えた場合と同様に、ATPを加えても、ＰＣＲの特異性が増すと推測される。しかし、ATPは、上記の相同組み換えタンパク質によりADPに分解され、ADPは、上記の相同組み換えタンパク質がプライマーDNA等に結合するのを阻害する。このため、ATPを加えても、ＰＣＲの特異性が上がりにくい。従って、本発明のように、ADPに分解されないATP-γSをＰＣＲ反応液に加えるのが良い。
【００１０】
なお、上記の相同組み換えタンパク質は、プライマーDNA１μgあたり、０．１μg〜１００μgの範囲で混合するのが好ましく、更には１μg〜１０μgの範囲で混合するのが好ましい。このような範囲でＰＣＲを行えば、より効率よく特異的に、所望の核酸の増幅させることができるからである。
【００１１】
以下に、ＰＣＲ反応で用いられる種々の試薬について説明する。
鋳型DNAは、直鎖状で有れば、いかなるものを用いてもよい。即ち、いかなる塩基配列からなるものであってもよく、また、それらの鎖長に上限は存在しない。従って、例えば、３０００Mbpといわれるヒトゲノムの全長を持つような巨大なDNAであっても構わない。勿論、その由来は問われない。従って、ウィルスや微生物、動植物のゲノム由来のDNAやそれらを改変したDNAであっても、微生物等のもつプラスミド等やプラスミド等に異種のDNA断片を挿入したキメラDNA等であっても、あるいは、人工的に合成したオリゴヌクレオチドなどであっても構わない。また、鋳型DNAとしては、２本鎖DNAでも１本鎖DNAでも利用することができる。さらに、RNAを逆転写することで得られるcDNAを鋳型DNAとして利用することもできる。
【００１２】
プライマーDNAは、鋳型DNAのうち増幅すべき配列（領域）の両端に位置する相当数の配列と実質的に相補的であれば、いかなる塩基配列からなるものであってもよく、その由来も問われない。実質的に相補的な程度は、鋳型DNAに対する塩基のミスマッチが３塩基以内であるのが好ましく、さらには、塩基のミスマッチが２塩基以内、またさらには、塩基のミスマッチが１塩基以内、特に、１００％の相補性を有するのが好ましい。前述したように、T.th. RecAタンパク質等の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、プライマーDNAの相補性が低いと、所望の核酸が増幅されにくくなるからである。
【００１３】
なお、プライマーDNAは、各々のプライマーDNAあたり、最終濃度で０．０１μM〜１０μMの範囲で混合するのが好ましく、さらには、０．１μM〜１μMの範囲で混合するのが特に好ましい。このような範囲でＰＣＲを行えば、より効率よく特異的に、所望の核酸の増幅させることができるからである。また、プライマーDNAの濃度を従来よりも低くすることにより、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸だけをより特異的に増幅させることができる。
【００１４】
DNAポリメラーゼは、ＰＣＲにおいてDNA鎖を変性させる際の高温に短時間加熱されても永久的には不活性化されず、しかも、高温における活性を有するものが好適である。例えば、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、メタノサーマス・フェルビドゥス（Methanothermus fervidus）、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）、T.フラブス（T.flavus）、T.ラクテウス（T.lacteus）、T.ルベンス（T.rubens）、T.ルバー（T.ruber）及び T.サーモフィルス（T.thermophilus）などの高熱菌由来のDNAポリメラーゼや、デスルフロコッカス・モビリス（Desulfurococcus mobilis）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィルクム（Methanobacterium thermoautotrophilcum）、スルホロブス・ソルファタリクス（Sulfolobus solfataricus）、S.アシドカルダリウス（S.acidocaldarius）及びサーモプラスマ・アシドフィルム（Thermoplasma acidophilum）などの高熱性古細菌由来のDNAポリメラーゼなどが挙げられる。このうち、入手容易性等の理由から、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）由来のDNAポリメラーゼ（Taq DNAポリメラーゼ）や、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）由来のDNAポリメラーゼ（T.th. DNAポリメラーゼ）、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来のDNAポリメラーゼを利用するのが好ましい。
【００１５】
なお、例えば、Taq DNAポリメラーゼを使用する場合には、１００μl あたり、０．０５unit〜５０unitの範囲で混合するのが好ましく、さらには、０．５unit〜５unitの範囲で混合するのが特に好ましい。このような範囲でＰＣＲを行えば、より効率よく特異的に、所望の核酸の増幅させることができるからである。また、DNAポリメラーゼの添加量を低く抑えても、従来の方法に比して、十分な量の核酸を増幅させることができる。
【００１６】
さらに、上記のDNAポリメラーゼによる核酸増幅工程前の活性を阻害するために、DNAポリメラーゼに特異的な抗体をＰＣＲ反応液に混合するようにしてもよい。この抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え法により製造された抗体、化学的または組換え法により製造された抗体フラグメント（例えば、Fabフラグメント）が挙げられる。このうち、モノクローナル抗体を用いるのが特に好ましい。例えば、Taq DNAポリメラーゼに対する公知のモノクローナル抗体を用いれば、約２０℃〜４０℃の温度においてTaq DNAポリメラーゼの酵素活性を阻害することができると共に、ＰＣＲの熱的サイクルにおける高温によって不活性化される。
【００１７】
また、ＰＣＲは、一般に、４種類のdNTP、即ち、dATP、dCTP、dGTP及びdTTPの存在化において行う。
さらに、ＰＣＲは、一般に、適当な緩衝剤を含むＰＣＲ反応液中で行われる。効率よく核酸を増幅させるためである。緩衝液は、使用する相同組み換えタンパク質やDNAポリメラーゼ等により、反応の最適条件を得るため適宜変更することできる。例えば、ｐＨを適当に調整したトリス系の緩衝液に、塩化カリウムや塩化マグネシウムを加えた緩衝液を利用することができる。
【００１８】
また、ＰＣＲ反応液には、５％〜１０％のDMSOと１％〜２％のベタインを添加してもよい。鋳型DNAの二字構造により目的とする産物が増幅されにくい問題を最小限に留める効果を有するものである。このような変性剤に対し、大腸菌由来のRecAタンパク質等は耐性を有しないが、サーマス・サーモフィルスに由来するRecAタンパク質等は耐性を有するので、本発明において使用することが可能である。
また、ＰＣＲ反応液には、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）に由来するRecAタンパク質等の相同組み換えタンパク質に対する抗体を加えてもよい。
【００２１】
なお、ＰＣＲ反応液を調製する際には、T.th. RecAタンパク質をＰＣＲ反応液に加えた状態で、dNTPを加える前に、ATP-γSを加えるのが好ましい。このようにすることで、より効率よく所望の核酸を特異的に増幅することができる。その理由としては、先にdNTPを加えると、dNTPがT.th. RecAタンパク質が結合し、後から加えたATP-γSがT.th. RecAタンパク質に結合しにくくなるためであると考えられる。
ここで、ATP-γSの濃度は、目的に応じて適宜変更すればよいが、通常、０．０１mM〜１０mM、好ましくは、０．１mM〜１mMとするのが良い。
【００２２】
さらに、上記のいずれかに記載の核酸増幅方法であって、鋳型DNAが阻止的または抑制的２次構造の区域を有することを特徴とする核酸増幅方法とすると良い。
【００２３】
本発明によれば、鋳型DNAが阻止的または抑制的二次構造の区域を有する。即ち、鋳型DNAは、一般的なＰＣＲを行った場合に、核酸の増幅が阻止または抑制される２次構造をなす区域を有する。従って、従来のＰＣＲでは、このような区域を有する所望の核酸を、効率よく特異的に増幅させることは困難であった。
これに対し、本発明では、前述の相同組換えタンパク質を混合してＰＣＲを行うので、鋳型DNAにこのような阻止的または抑制的２次構造の区域がある場合であっても、所望の核酸を効率よく特異的に増幅させることができる。その理由は、相同組み換えタンパク質が、鋳型DNAに結合することにより、阻止的または抑制的２次構造が解かれるためであると考えられる。
【００２４】
さらに、上記のいずれかに記載の核酸増幅方法であって、前記ＰＣＲ反応液中に、KClを加えて、ＰＣＲを行うことを特徴とする核酸増幅方法とすると良い。
【００２５】
本発明によれば、ＰＣＲ反応液中にKClを加えて、ＰＣＲを行う。このようにＰＣＲを行えば、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができる。
ここで、KClの濃度は、目的に応じて適宜変更すればよいが、通常、１mM〜１０００mM、好ましくは、１０mM〜１００mMとするのが良い。
【００２６】
さらに、上記のいずれかに記載の核酸増幅方法であって、前記ＰＣＲ反応液中に、Mg2+ を加えて、ＰＣＲを行うことを特徴とする核酸増幅方法とすると良い。
【００２７】
本発明によれば、ＰＣＲ反応液中にMg2+ を加えて、ＰＣＲを行う。このようにＰＣＲを行えば、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができる。Mg2+ を加えることで、上述した相同組み換えタンパク質のDNAに対する親和性が向上するためであると考えられる。
ここで、Mg2+ の濃度は、目的に応じて適宜変更すればよいが、通常、０．１mM〜１００mM、好ましくは、３mM〜１０mMとするのが良い。
【００２８】
また、他の解決手段は、一塩基多型を検出するための一塩基多型検出方法であって、鋳型DNAのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAを用い、ＰＣＲ反応液に、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）のRecAタンパク質を含む相同的組換えタンパク質を混合すると共に、前記ＰＣＲ反応液中に、ATP-γSを加えて、ＰＣＲを行い、所望の核酸の増幅により一塩基多型を検出することを特徴とする一塩基多型検出方法である。
【００２９】
本発明によれば、プライマーDNAの１つには、鋳型DNAのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAを用いる。そして、ＰＣＲ反応液中に、T.th. RecAタンパク質等の相同組み換えタンパク質を混合して、ＰＣＲを行う。このようにＰＣＲを行えば、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全に相補的である場合に、所望の核酸を増幅させるようにすることができる。一方、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全には相補的ではない場合、即ち、一塩基多型をなす塩基がプライマーDNAと相補的でない場合に、所望の核酸が増幅しない、または、抑制されるようにすることができる。このため、ＰＣＲによる所望の核酸の増幅により、一塩基多型を検出することが可能である。
【００３１】
さらに、本発明によれば、ＰＣＲ反応液中に、前述の相同組換えタンパク質を混合した上、さらに、ATP-γSも加えて、ＰＣＲを行う。このようにＰＣＲを行えば、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができるため、一塩基多型をより確実に検出することが可能となる。
【００３２】
さらに、上記のいずれかに記載の一塩基多型検出方法であって、前記ＰＣＲ反応液中に、KClを加えて、ＰＣＲを行うことを特徴とする一塩基多型検出方法とすると良い。
【００３３】
このようにＰＣＲを行えば、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができるため、一塩基多型をより確実に検出することが可能となる。
【００３４】
さらに、上記のいずれかに記載の一塩基多型検出方法であって、前記ＰＣＲ反応液中に、Mg2+ を加えて、ＰＣＲを行うことを特徴とする一塩基多型検出方法とすると良い。
【００３５】
このようにＰＣＲを行えば、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができるため、一塩基多型をより確実に検出することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下、本発明の実施例を、図を参照しつつ説明する。
【実施例１】
第１図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA（Promega）を用意した。また、プライマーDNAとして１６種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド１〜１６）を用意した。これらのプライマーDNAは、Homo sapiens PAC clone RP5-852P6 from 7p11.2-p21, complete sequence.（ACCESSION AC006454）を参考にして設計した。なお、ACCESSION ナンバーは、Gene Bankのアクセスナンバーを示している（以下同様）。各プライマーDNAは、任意のプライマー設計の可能性を示すため、それぞれ位置をずらして設計してある。また、各プライマーDNAは、鋳型DNAと１００％相補的な２０merの塩基配列からなる。なお、各プライマーDNAは、鋳型DNAの塩基配列に基づいて公知の手法により合成すればよい。
【００３７】
オリゴヌクレオチド１：
5'-ggtgcactcc atcatgctta-3'
オリゴヌクレオチド２：
5'-catcagt cagaggggct cac-3'
オリゴヌクレオチド３：
5'-cccacatccc tggcaggaat-3'
オリゴヌクレオチド４：
5'-tgcaggt gtgggcctag ctg-3'
オリゴヌクレオチド５：
5'-tgtcctgggc cccagcagga-3'
オリゴヌクレオチド６：
5'-ggggtct tgctgtgggc agg-3'
オリゴヌクレオチド７：
5'-gagatgcccc cccatactgc-3'
オリゴヌクレオチド８：
5'-atctgtc ccctctcctc ctg-3'
オリゴヌクレオチド９：
5'-aggtgtgcag agtgcaaagc-3'
オリゴヌクレオチド１０：
5'-gcttcaa ggcagaggcc agg-3'
オリゴヌクレオチド１１：
5'-tccaggtggc ccccaagcag-3'
オリゴヌクレオチド１２：
5'-atctctc ttgccttggg gtg-3'
オリゴヌクレオチド１３：
5'-gtgtgctggg aggaggggcc-3'
オリゴヌクレオチド１４：
5'-gtcacta aacaggggct caa-3'
オリゴヌクレオチド１５：
5'-cgtgtgggag gagcaggcag-3'
オリゴヌクレオチド１６：
5'-gccagaa tgttcccctg gag-3'
【００３８】
また、相同組み換えタンパク質としてサーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）のRecAタンパク質を用意し、DNAポリメラーゼとしてサーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）由来のDNAポリメラーゼ（TaKaRa Taq（タカラバイオ））を用意した。また、４種類のdNTP、即ち、dATP、dCTP、dGTP及びdTTPを用意し、緩衝剤としてｐＨを調整したトリス系の緩衝液に、塩化カリウムや塩化マグネシウムを加えた緩衝液を用意した。
なお、DNAポリメラーゼと、４種類のdNTPと、緩衝液と、T.th. RecAタンパク質等の相同組換えタンパク質とは、核酸増幅用試薬キットとして用意しておくのが便利である。このようなキットを利用すれば、DNAポリメラーゼ、４種類のdNTP、緩衝液、及び、T.th. RecAタンパク質等の相同的組換えタンパク質を反応液に加え、さらに、目的に応じた鋳型DNAとプライマーDNAを用意して反応液に加えるだけで、容易にＰＣＲを行うことができるからである。
【００３９】
次に、ＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。具体的には、１０μlのＰＣＲ反応液中に、０．０６μM（最終濃度）の２種類のオリゴヌクレオチドと、４０ngのヒトゲノムDNAと、１．０unitの TaKaRa Taq と、０．２mMのdNTP混合液と、１．２μgのT.th. RecAタンパク質を、１０mMの Tris-HCl Buffer（pH８．３）、５０mMのKCl、１．５mMのMgCl2 に混合した。そして、ＰＣＲ反応を、１サイクル（７０℃，１０分間、９４℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、６０℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）で行った。
次に、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、アガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してゲル中のDNAを染色し、その後、染色されたDNAを写真に記録した。その結果を第２図に示す。
【００４０】
レーン１は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド１とオリゴヌクレオチド２を加えたものである。
レーン２は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド３とオリゴヌクレオチド４を加えたものである。
レーン３は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド５とオリゴヌクレオチド６を加えたものである。
レーン４は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド７とオリゴヌクレオチド８を加えたものである。
レーン５は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド９とオリゴヌクレオチド１０を加えたものである。
レーン６は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド１１とオリゴヌクレオチド１２を加えたものである。
レーン７は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド１３とオリゴヌクレオチド１４を加えたものである。
レーン８は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド１５とオリゴヌクレオチド１６を加えたものである。
レーン９は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１３は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１４は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１５は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１６は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１７は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１８は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１９は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２０は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２１は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２２は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２３は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２４は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２５は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２６は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２７は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２８は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２９は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン１３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３０は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン１４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３１は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン１５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３２は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン１６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【００４１】
第２図（Ａ）の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン８では、所望の核酸（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）の増幅はほとんど検出されなかった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン９〜レーン１６では、所望の核酸のみならず副産物も多量に検出された。また、所望の核酸の増幅がほとんど検出されないものもあった（レーン１５，１６等）。この理由としては、鋳型DNAのうち増幅されるべき領域が、阻止的または抑制的２次構造を有するためと考えられる。
また、第２図（Ｂ）の結果から明らかなように、プライマーDNAの濃度を増加させ、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１７〜レーン２４でも、所望のDNAの増幅が検出された。しかし、レーン１〜レーン８の結果に比べると、副産物が若干検出されたものも多い。
一方、プライマーDNAの濃度を増加させ、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン２５〜レーン３２では、対応するレーン９〜レーン１６の結果に比べ、副産物がさらに多量に検出された。
【００４２】
これらのことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、T.th. RecAタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
また、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、鋳型DNAに阻止的または抑制的２次構造を有する場合であっても、所望の核酸を効率よく特異的に増幅させることができる。相同組み換えタンパク質が、鋳型DNAに結合することにより、阻止的または抑制的２次構造が解かれるためと考えられる。
また、反応液中に加えるプライマーDNAの濃度（０．０６μM）を低く抑えても、十分な量の核酸を増幅させることができ、しかも、プライマーDNAの濃度を低くすることにより、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸だけをより特異的に増幅させることが可能となる。
【００４３】
【実施例２】
次いで、第２の実施例について説明する。なお、上記実施例１と同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第３図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNAを、プライマーDNAとして１２種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド１７〜２８）を用意した。これらのプライマーDNAは、Homo sapiens BAC clone RP11-16P10 from 7, complete sequence.（ACCESSION AC093734 AC011786）を参考にして設計した。各プライマーDNAは、任意のプライマー設計の可能性を示すため、それぞれ位置をずらして設計してある。なお、各プライマーDNAは、鋳型DNAと１００％相補的な２０merの塩基配列からなる。
【００４４】
オリゴヌクレオチド１７：
5'-cgggtgc acacaaaggc tgg-3'
オリゴヌクレオチド１８：
5'-tctctggcca ggtgcctggc-3'
オリゴヌクレオチド１９：
5'-cgccccg acaaccctga ccc-3'
オリゴヌクレオチド２０：
5'-cttgggaaga tcctgagact-3'
オリゴヌクレオチド２１：
5'-tcggtaa acgctggctc ccg-3'
オリゴヌクレオチド２２：
5'-caaaacgccc cccaccgccc-3'
オリゴヌクレオチド２３：
5'-ggtttac cagcacctgg gga-3'
オリゴヌクレオチド２４：
5'-cccatcgtgg tctaggggat-3'
オリゴヌクレオチド２５：
5'-gaagtgg cccggaagac ggt-3'
オリゴヌクレオチド２６：
5'-gcagcgccct tcccacccct-3'
オリゴヌクレオチド２７：
5'-gcacacg ccttgtagac agc-3'
オリゴヌクレオチド２８：
5'-ctgattctcc agggtgggct-3'
【００４５】
次に、上記実施例１のレーン１等と同様な条件でＰＣＲ反応を行った。そして、その反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第４図に示す。
【００４６】
レーン１は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド１７とオリゴヌクレオチド１８を加えたものである。
レーン２は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド１９とオリゴヌクレオチド２０を加えたものである。
レーン３は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド２１とオリゴヌクレオチド２２を加えたものである。
レーン４は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド２３とオリゴヌクレオチド２４を加えたものである。
レーン５は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド２５とオリゴヌクレオチド２６を加えたものである。
レーン６は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド２７とオリゴヌクレオチド２８を加えたものである。
レーン７は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【００４７】
第４図の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン６では、所望の核酸（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、多くのレーンでは、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）はほとんど検出されなかった。また、副産物が検出されたレーンでも、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーンに比べれば、副産物の生成が大幅に抑制された。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン７〜レーン１２では、所望の核酸のみならず副産物も多量に検出された。
このことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、T.th. RecAタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
また、反応液中に加えるプライマーDNAの濃度（０．０６μM）を低く抑えても、十分な量の核酸を増幅させることができ、しかも、プライマーDNAの濃度を低くすることにより、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸だけをより特異的に増幅させることが可能となる。
【００４８】
【実施例３】
次いで、第３の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
第５図及び第６図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNAを、プライマーDNAとして８種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド２９〜３６）を用意した。これらのプライマーDNAは、ヒトゲノムDNAの single copy gene について設計した。具体的には、オリゴヌクレオチド２９とオリゴヌクレオチド３０は、Human DNA sequence from clone RP5-1013A22 on chromosome 20 Contains the HNF4A (hepatic nuclear factor 4, alpha) gene, part of a novel gene encoding a protein similar to cellular retinaldehyde-binding protein, a RPL37A (ribosomal protein L37a) pseudogene, parts of 2 novel genes, ESTs, STSs and GSSs, complete sequence.（ACCESSION AL132772）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド３１とオリゴヌクレオチド３２は、Homo sapiens 3q BAC RP11-529F4 (Roswell Park Cancer Institute Human BAC Library) complete sequence.（ACCESSION AC080007）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド３３とオリゴヌクレオチド３４は、Homo sapiens genomic beta globin region (HBB@) on chromosome 11.（ACCESSION NG_000007）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド３５とオリゴヌクレオチド３６は、Homo spaiens HPFH6OR gene for olfactory receptor.（ACCESSION X81445 X91835）を参考にして設計した。各プライマーDNAは、鋳型DNAと１００％相補的な２０mer〜２５merの塩基配列からなる。
【００４９】
オリゴヌクレオチド２９：
5'-gcatctgggg cctgggattt ag-3'
オリゴヌクレオチド３０：
5'-tacaaggcag gcatcatgac tcacg-3'
オリゴヌクレオチド３１：
5'-aggagcttag gagggggagg t-3'
オリゴヌクレオチド３２：
5'-cattgacagg acaggagaag gga-3'
オリゴヌクレオチド３３：
5'-ctttttgttc ccccagacac tc-3'
オリゴヌクレオチド３４：
5'-gcactggctt aggagttgga ct-3'
オリゴヌクレオチド３５：
5'-gttaatacct aaggctctac tgca-3'
オリゴヌクレオチド３６：
5'-aggcaatggc ggcacccatc-3'
【００５０】
次に、プライマーDNAの濃度以外は上記実施例１等と同じ条件で反応液を作成した。そして、ＰＣＲ反応を、１サイクル（９４℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、６０℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）で行った。その後、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１等と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第７図及び第８図に示す。
【００５１】
レーン１は、プライマーDNAとして、０．３μM（最終濃度）のオリゴヌクレオチド２９と０．３μM（最終濃度）のオリゴヌクレオチド３０を加えたものである。
レーン２は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３は、オリゴヌクレオチド２９とオリゴヌクレオチド３０の濃度をそれぞれ０．１μM（最終濃度）に減らして、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン５は、オリゴヌクレオチド２９とオリゴヌクレオチド３０の濃度をそれぞれ０．０３μM（最終濃度）に減らして、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、オリゴヌクレオチド２９とオリゴヌクレオチド３０の濃度をそれぞれ０．０１μM（最終濃度）に減らして、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、オリゴヌクレオチド２９とオリゴヌクレオチド３０の濃度をそれぞれ０．００３μM（最終濃度）に減らして、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、プライマーDNAとして、０．３μM（最終濃度）のオリゴヌクレオチド３１と０．３μM（最終濃度）のオリゴヌクレオチド３２を加えたものである。
レーン１２は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１３は、オリゴヌクレオチド３１とオリゴヌクレオチド３２の濃度をそれぞれ０．１μM（最終濃度）に減らして、レーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１４は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１５は、オリゴヌクレオチド３１とオリゴヌクレオチド３２の濃度をそれぞれ０．０３μM（最終濃度）に減らして、レーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１６は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１７は、オリゴヌクレオチド３１とオリゴヌクレオチド３２の濃度をそれぞれ０．０１μM（最終濃度）に減らして、レーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１８は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１９は、オリゴヌクレオチド３１とオリゴヌクレオチド３２の濃度をそれぞれ０．００３μM（最終濃度）に減らして、レーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２０は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２１は、プライマーDNAとして、０．３μM（最終濃度）のオリゴヌクレオチド３３と０．３μM（最終濃度）のオリゴヌクレオチド３４を加えたものである。
レーン２２は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２３は、オリゴヌクレオチド３３とオリゴヌクレオチド３４の濃度をそれぞれ０．１μM（最終濃度）に減らして、レーン２１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２４は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２５は、オリゴヌクレオチド３３とオリゴヌクレオチド３４の濃度をそれぞれ０．０３μM（最終濃度）に減らして、レーン２１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２６は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２７は、オリゴヌクレオチド３３とオリゴヌクレオチド３４の濃度を０．０１μM（最終濃度）に減らして、レーン２１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２８は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２９は、オリゴヌクレオチド３３とオリゴヌクレオチド３４の濃度を０．００３μM（最終濃度）に減らして、レーン２１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３０は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３１は、プライマーDNAとして、０．３μM（最終濃度）のオリゴヌクレオチド３５と０．３μM（最終濃度）のオリゴヌクレオチド３６を加えたものである。
レーン３２は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３３は、オリゴヌクレオチド３５とオリゴヌクレオチド３６の濃度をそれぞれ０．１μM（最終濃度）に減らして、レーン３１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３４は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３５は、オリゴヌクレオチド３５とオリゴヌクレオチド３６の濃度をそれぞれ０．０３μM（最終濃度）に減らして、レーン３１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３６は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３７は、オリゴヌクレオチド３５とオリゴヌクレオチド３６の濃度をそれぞれ０．０１μM（最終濃度）に減らして、レーン３１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３８は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３９は、オリゴヌクレオチド３５とオリゴヌクレオチド３６の濃度をそれぞれ０．００３μM（最終濃度）に減らして、レーン３１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４０は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【００５２】
第７図（Ａ）の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１，３，５，７，９のうち、レーン９を除くレーンでは、所望の核酸（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）はほとんど検出されなかった。特に、プライマーDNAの濃度が低くなるほど、副産物の生成は抑制される傾向にあった。また、レーン９では、プライマーDNAの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。また、プライマーDNAの濃度が同じであれば、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったものに比べ、所望の核酸の増幅量が多くなった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン２，４，６，８，１０のうち、レーン１０を除くレーンでは、所望の核酸のみならず副産物も検出された。また、レーン１０では、プライマーDNAの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
【００５３】
第７図（Ｂ）の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１１，１３，１５，１７，１９のうち、レーン１９を除くレーンでは、所望の核酸の増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。特に、プライマーDNAの濃度が低くなるほど、副産物の生成は抑制される傾向にあった。また、レーン１９では、プライマーDNAの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。また、プライマーDNAの濃度が同じであれば、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったものに比べ、所望の核酸の増幅量が多くなった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン１２，１４，１６，１８，２０のうち、レーン２０を除くレーンでは、所望の核酸のみならず副産物も検出された。また、レーン２０では、プライマーDNAの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
【００５４】
第８図（Ａ）の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン２１，２３，２５，２７，２９のうち、レーン２９を除くレーンでは、所望の核酸の増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。特に、プライマーDNAの濃度が低くなるほど、副産物の生成は抑制される傾向にあった。また、レーン２９では、プライマーDNAの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。また、プライマーDNAの濃度が同じであれば、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったものに比べ、所望の核酸の増幅量が多くなる傾向にあった。
一方、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン２２，２４，２６，２８，３０のうち、レーン２２，２４，２６では、所望の核酸のみならず副産物も検出された。また、レーン２８，３０では、プライマーDNAの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
【００５５】
第８図（Ｂ）の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン３１，３３，３５，３７，３９のうち、レーン３９を除くレーンでは、所望の核酸の増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。特に、プライマーDNAの濃度が低くなるほど、副産物の生成は抑制される傾向にあった。また、レーン３９では、プライマーDNAの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。また、プライマーDNAの濃度が同じであれば、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったものに比べ、所望の核酸の増幅量が多くなる傾向にあった。
一方、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン３２，３４，３６，３８，４０のうち、レーン４０を除くレーンでは、所望の核酸のみならず副産物も検出された。また、レーン４０では、プライマーDNAの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
【００５６】
これらのことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、T.th. RecAタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
また、反応液中に加えるプライマーDNAの濃度を低く抑えても、十分な量の核酸を増幅させることができ、しかも、プライマーDNAの濃度を低くすることにより、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸だけをより特異的に増幅させることが可能となる。
【００５７】
【実施例４】
次いで、第４の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
第９図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNAを用意し、プライマーDNAとして５種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド３７〜４１）を用意した。これらのプライマーDNAは、Homo sapiens PAC clone RP5-1142J19 from 7q35-q36, complete sequence.（ACCESSION AC004975）を参考にして設計した。
プライマーDNAのうち、オリゴヌクレオチド３７，３８は、鋳型DNAと１００％相補的な２０merまたは２１merの塩基配列からなる。一方、オリゴヌクレオチド３９は、鋳型DNAと１塩基だけ異なる塩基配列からなり、それ以外の部分はオリゴヌクレオチド３７と同様である。また、オリゴヌクレオチド４０は、鋳型DNAに対し３塩基について異なる塩基配列からなり、それ以外の部分はオリゴヌクレオチド３７と同様である。また、オリゴヌクレオチド４１は、鋳型DNAに対し５塩基について異なる塩基配列からなり、それ以外の部分はオリゴヌクレオチド３７と同様である。
【００５８】
オリゴヌクレオチド３７：
5'-gcaggcacca agaactactg c-3'
オリゴヌクレオチド３８：
5'-gcctaaggtc acgttgtccc-3'
オリゴヌクレオチド３９：
5'-gcaggcacca ggaactactg c-3'
オリゴヌクレオチド４０：
5'-gcaggcgcca ggaagtactg c-3'
オリゴヌクレオチド４１：
5'-gcgggcgcca ggaagtacgg c-3'
【００５９】
次に、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．３μM（最終濃度）とし、それ以外は上記実施例３と同様にしてＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。そして、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１等と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第１０図に示す。
【００６０】
レーン１は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド３７とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン２は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド３９とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン３は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド４０とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン４は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド４１とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン５は、１mM（最終濃度）のATP-γS（ロッシュ）をさらに加えて、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【００６１】
第１０図の結果から明らかなように、ATP-γSを加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン４について見ると、レーン１〜レーン３では、所望のDNA（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）はほとんど検出されなかった。一方、レーン４では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
これに対し、ATP-γSを加えてＰＣＲ反応を行ったレーン５〜レーン８について見ると、レーン５とレーン６では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。一方、レーン７とレーン８では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
【００６２】
このことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
具体的には、ATP-γSの非存在下では、プライマーDNAと鋳型DNAとの塩基のミスマッチが３塩基以内の場合においてのみ、特異的に核酸を増幅させるようにすることができる。従って、T.th. RecAタンパク質を反応液に加えることにより、所望の核酸をより特異的に増幅することができる。
一方、ATP-γSの存在下では、プライマーDNAと鋳型DNAとの塩基のミスマッチが１塩基以内の場合においてのみ、特異的に核酸を増幅させるようにすることができる。従って、ATP-γSを反応液に加えることにより、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができる。
なお、DNAポリメラーゼと、４種類のdNTPと、緩衝液と、T.th. RecAタンパク質等の相同組換えタンパク質とを核酸増幅用試薬キットとして用意する場合には、さらに、ATP-γSも、そのキットに加えるのが好ましい。上記の実施例４で明らかなように、ATP-γSを加えてＰＣＲ反応を行えば、さらに特異的に所望の核酸を増幅させることができるからである。
【００６３】
また、上記実施例４の結果より、一塩基多型を検出することが可能である。即ち、プライマーDNAの１つに、鋳型DNAのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAを用いてＰＣＲを行えば、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全に相補的である場合に、所望の核酸を増幅させるようにすることができる。一方、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全には相補的ではない場合、即ち、一塩基多型をなす塩基がプライマーDNAと相補的でない場合に、所望の核酸が増幅しない、または、抑制されるようにすることができる。このため、ＰＣＲによる所望の核酸の増幅により、一塩基多型を検出することが可能である。
【００６４】
さらに、ATP-γSを加えた場合には、より特異的に核酸を増幅することができるため、所望の核酸の増幅により、より確実に一塩基多型を検出することが可能となる。
なお、DNAポリメラーゼと、４種類のdNTPと、緩衝液と、T.th. RecAタンパク質等の相同的組換えタンパク質とは、一塩基多型検出用試薬キットとして用意しておくのが便利である。このようなキットを利用すれば、DNAポリメラーゼ、４種類のdNTP、緩衝液、及び、T.th. RecAタンパク質等の相同的組換えタンパク質を反応液に加え、さらに、目的に応じた鋳型DNAとプライマーDNAを用意して反応液に加えるだけで、容易にＰＣＲにより一塩基多型を検出することができるからである。
そしてさらに、上記キットには、ATP-γSも加えるのが好ましい。上記の実施例４で明らかなように、ATP-γSを加えてＰＣＲ反応を行えば、さらに特異的に所望の核酸を増幅させることができるため、より確実に一塩基多型を検出することが可能となるからである。
【００６５】
【実施例５】
次いで、第５の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
第１１図及び第１２図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNAを、プライマーDNAとして１２種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド４２〜５３）を用意した。具体的には、オリゴヌクレオチド４２とオリゴヌクレオチド４３は、Homo sapiens PAC clone RP5-1142J19 from 7q35-q36, complete sequence.（ACCESSION AC004975）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド４４とオリゴヌクレオチド４５は、Homo sapiens PAC clone RP5-852P6 from 7p11.2-p21, complete sequence.（ACCESSION AC006454）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド４６とオリゴヌクレオチド４７は、Homo sapiens PAC clone RP5-912I13 from 7, complete sequence.（ACCESSION AC008060）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド４８とオリゴヌクレオチド４９は、Homo sapiens BAC clone RP11-16P10 from 7, complete sequence.（ACCESSION AC093734 AC011786）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド５０とオリゴヌクレオチド５１は、Homo sapiens BAC clone CTB-135C18 from 7q11.2-q22, complete sequence.（ACCESSION AC005164）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド５２とオリゴヌクレオチド５３は、Homo sapiens PAC clone RP5-852P6 from 7p11.2-p21, complete sequence.（ACCESSION AC006454）を参考にして設計した。各プライマーDNAは、鋳型DNAと１００％相補的な１８mer〜２２merの塩基配列からなる。
【００６６】
オリゴヌクレオチド４２：
5'-gcaggcacca agaactactg c-3'
オリゴヌクレオチド４３：
5'-gcctaaggtc acgttgtccc-3'
オリゴヌクレオチド４４：
5'-catggcacct gctctgagac-3'
オリゴヌクレオチド４５：
5'-ggcactttgt gcctctctcc-3'
オリゴヌクレオチド４６：
5'-ccgagtcgca tgggtgag-3'
オリゴヌクレオチド４７：
5'-tttgtgcaag gaattgtggg-3'
オリゴヌクレオチド４８：
5'-atctgtgtgg ttcggctctg-3'
オリゴヌクレオチド４９：
5'-ctcccttaac agcagcctcc-3'
オリゴヌクレオチド５０：
5'-caaagctact ttcacagcct cc-3'
オリゴヌクレオチド５１：
5'-ggcatattca gccaaggatt tc-3'
オリゴヌクレオチド５２：
5'-tttctggaag ggactgggtc-3'
オリゴヌクレオチド５３：
5'-tcccaggatc catggagaag-3'
【００６７】
次に、上記実施例４と同様な条件でＰＣＲ反応を行い、核酸を増幅させた。そして、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１等と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第１３図及び第１４図に示す。
なお、このＰＣＲの温度条件、即ち、１サイクル（９４℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、６０℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）を温度条件１とする。アニーリング温度は６０℃である。
【００６８】
レーン１は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド４２とオリゴヌクレオチド４３を加えたものである。
レーン２は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド４４とオリゴヌクレオチド４５を加えたものである。
レーン３は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド４６とオリゴヌクレオチド４７を加えたものである。
レーン４は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド４８とオリゴヌクレオチド４９を加えたものである。
レーン５は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド５０とオリゴヌクレオチド５１を加えたものである。
レーン６は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド５２とオリゴヌクレオチド５３を加えたものである。
レーン７は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１３〜レーン２４は、ＰＣＲの温度条件を、１サイクル（９４℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、５５℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）とした。これを温度条件２とする。アニーリング温度は５５℃である。
レーン１３は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１４は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１５は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１６は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１７は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１８は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１９は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２０は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２１は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２２は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２３は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２４は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２５〜レーン３６は、ＰＣＲの温度条件を、１サイクル（９４℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、５０℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）とした。これを温度条件３とする。アニーリング温度は５０℃である。
レーン２５は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２６は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２７は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２８は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２９は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３０は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３１は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３２は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３３は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３４は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３５は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３６は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３７〜レーン４８は、ＰＣＲの温度条件を、１サイクル（９４℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、４５℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）とした。これを温度条件４とする。アニーリング温度は４５℃である。
レーン３７は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３８は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３９は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４０は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４１は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４２は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４３は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４４は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４５は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４６は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４７は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４８は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【００６９】
第１３図（Ａ）の結果から明らかなように、アニーリング温度が６０℃の場合、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン６では、所望の核酸（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）はほとんど検出されなかった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン７〜レーン１２のうち、一部のレーンでは、所望の核酸のみならず副産物も若干検出された。また、一部のレーンでは、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。これは、鋳型DNAの増幅領域に阻止的または抑制的２次構造を有するためと考えられる。
【００７０】
また、第１３図（Ｂ）の結果から明らかなように、アニーリング温度が５５℃の場合でも、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１３〜レーン１８では、所望の核酸の増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン１９〜レーン２４のうち、一部のレーンでは、所望の核酸のみならず副産物も若干検出された。また、一部のレーンでは、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。これは、鋳型DNAの増幅領域に阻止的または抑制的２次構造を有するためと考えられる。
【００７１】
第１４図（Ａ）の結果から明らかなように、アニーリング温度が５０℃の場合、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン２５〜レーン３０のうち、一部のレーンでは、所望の核酸の増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。また、一部のレーンでは、所望の核酸の増幅のみならず副産物も検出された。但し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったものと比べると、副産物の増幅量は少なかった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン３１〜レーン３６のうち、一部のレーンでは、所望の核酸のみならず副産物も多量に検出された。また、一部のレーンでは、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。これは、鋳型DNAの増幅領域に阻止的または抑制的２次構造を有するためと考えられる。
【００７２】
また、第１４図（Ｂ）の結果から明らかなように、アニーリング温度が４５℃の場合、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン３７〜レーン４２では、所望の核酸の増幅が見られたが、副産物も検出された。但し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったものと比べると、副産物の増幅量は少なかった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン４３〜レーン４８のうち、一部のレーンでは、所望の核酸のみならず副産物も多量に検出された。また、一部のレーンでは、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。これは、鋳型DNAの増幅領域に阻止的または抑制的２次構造を有するためと考えられる。
【００７３】
これらのことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲを行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
また、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、鋳型DNAに阻止的または抑制的２次構造を有する場合であっても、所望の核酸を効率よく特異的に増幅させることができる。相同組み換えタンパク質が、鋳型DNAに結合することにより、阻止的または抑制的２次構造が解かれるためと考えられる。
また、ＰＣＲの特異性が高いため、プライマー伸長反応の温度条件（アニーリング温度）を変えても、所望の核酸を特異的に増幅させることができる。即ち、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行った場合には、プライマー伸長反応の温度（アニーリング温度）を低く設定すると、目的とする核酸だけでなく、副産物も多量に増幅されることとなるが、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、目的とする核酸をより特異的に増幅させることが可能となる。
【００７４】
【実施例６】
次いで、第６の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
鋳型DNAとしてヒトゲノムDNAを用意し、プライマーDNAとして、上記実施例４と同様な５種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド３７〜４１）（第９図参照）と、第１５図に示すように５種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド５４〜５８）を用意した。
第１５図に示すように、後者の５種類のプライマーDNAは、Homo sapiens BAC clone CTB-135C18 from 7q11.2-q22, complete sequence.（ACCESSION AC005164）を参考にして設計した。これらのプライマーDNAのうち、オリゴヌクレオチド５４とオリゴヌクレオチド５５は、鋳型DNAと１００％相補的な２２merの塩基配列からなる。一方、オリゴヌクレオチド５６は、鋳型DNAと１塩基だけ異なる塩基配列からなり、それ以外の部分はオリゴヌクレオチド５４と同様である。また、オリゴヌクレオチド５７は、鋳型DNAに対し３塩基について異なる塩基配列からなり、それ以外の部分はオリゴヌクレオチド５４と同様である。また、オリゴヌクレオチド５８は、鋳型DNAに対し５塩基について異なる塩基配列からなり、それ以外の部分はオリゴヌクレオチド５４と同様である。
【００７５】
オリゴヌクレオチド５４：
5'-caaagctact ttcacagcct cc-3'
オリゴヌクレオチド５５：
5'-ggcatattca gccaaggatt tc-3'
オリゴヌクレオチド５６：
5'-caaagctact tgcacagcct cc-3'
オリゴヌクレオチド５７：
5'-caaagctgct tgcacggcct cc-3'
オリゴヌクレオチド５８：
5'-caaggctgct tgcacggccg cc-3'
【００７６】
次に、上記実施例４等と同様な条件でＰＣＲ反応を行い、核酸を増幅させた。そして、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１等と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第１６図に示す。
【００７７】
レーン５は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド３７とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン６は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド３９とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン７は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド４０とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン８は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド４１とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン９は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、かつ、１mM（最終濃度）のATP-γSを加えて、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、かつ、１mM（最終濃度）のATP-γSを加えて、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、かつ、１mM（最終濃度）のATP-γSを加えて、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、かつ、１mM（最終濃度）のATP-γSを加えて、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１７は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド５４とオリゴヌクレオチド５５を加えたものである。
レーン１８は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド５６とオリゴヌクレオチド５５を加えたものである。
レーン１９は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド５７とオリゴヌクレオチド５５を加えたものである。
レーン２０は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド５８とオリゴヌクレオチド５５を加えたものである。
レーン２１は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン１７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２２は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン１８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２３は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン１９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２４は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン２０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１３は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、かつ、１mM（最終濃度）のATP-γSを加えて、それ以外はレーン１７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１４は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、かつ、１mM（最終濃度）のATP-γSを加えて、それ以外はレーン１８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１５は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、かつ、１mM（最終濃度）のATP-γSを加えて、それ以外はレーン１９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１６は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、かつ、１mM（最終濃度）のATP-γSを加えて、それ以外はレーン２０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【００７８】
第１６図（Ａ）の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加え、かつ、ATP-γSを加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン５〜レーン８について見ると、所望のDNA（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）はほとんど検出されなかった。また、レーン５及びレーン６に比べ、レーン７では所望の核酸の増幅が少なく、さらに、レーン８では所望の核酸の増幅が少なかった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加え、かつ、ATP-γSも加えてＰＣＲ反応を行ったレーン９〜レーン１２について見ると、レーン９〜レーン１１では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。一方、レーン１２では、核酸の増幅が検出できなかった。また、レーン９及びレーン１０に比べ、レーン１１では、所望の核酸の増幅が少なかった。さらに、このレーン１１は、上記レーン７と比べても、所望の核酸の増幅が少なかった。
他方、T.th. RecAタンパク質を加えずに、ATP-γSを加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン４について見ると、所望のDNAの増幅のみならず副産物も多量に増幅された。
【００７９】
また、第１６図（Ｂ）の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加え、かつ、ATP-γSを加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン１７〜レーン２０について見ると、レーン１７〜レーン１９では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。一方、レーン２０では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。また、レーン１７及びレーン１８に比べ、レーン１９では、所望の核酸の増幅が少なかった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加え、かつ、ATP-γSも加えてＰＣＲ反応を行ったレーン２１〜レーン２４について見ると、レーン２１では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。一方、レーン２２〜レーン２４では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
他方、T.th. RecAタンパク質を加えずに、ATP-γSを加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１３〜レーン１６について見ると、所望のDNAの増幅のみならず副産物も多量に増幅された。
【００８０】
これらのことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
具体的には、ATP-γSの非存在下では、プライマーDNAと鋳型DNAとの塩基のミスマッチが３塩基以内の場合においてのみ、特異的に核酸を増幅させるようにすることができる。従って、T.th. RecAタンパク質を反応液に加えることにより、所望の核酸をより特異的に増幅することができる。
一方、ATP-γSの存在下では、プライマーDNAと鋳型DNAとの塩基のミスマッチが１塩基以内の場合においてのみ、特異的に核酸を増幅させるようにすることができる。従って、ATP-γSを反応液に加えることにより、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができる。
また、ATP-γSは、T.th. RecAタンパク質を加えたときには、ＰＣＲの特異性を向上させることができるが、T.th. RecAタンパク質の非存在下、即ち、ATP-γSだけでは、ＰＣＲの特異性を向上させることができないと言える。
【００８１】
また、本実施例の結果より、一塩基多型を検出することが可能である。即ち、プライマーDNAの１つに、鋳型DNAのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAを用いてＰＣＲを行えば、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全に相補的である場合に、所望の核酸を増幅させるようにすることができる。一方、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全には相補的ではない場合、即ち、一塩基多型をなす塩基がプライマーDNAと相補的でない場合に、所望の核酸が増幅しない、または、抑制されるようにすることができる。このため、ＰＣＲによる所望の核酸の増幅により、一塩基多型を検出することが可能である。
さらに、ATP-γSを加えた場合には、より特異的に核酸を増幅することができるため、所望の核酸の増幅により、より確実に一塩基多型を検出することが可能となる。
【００８２】
【実施例７】
次いで、第７の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
鋳型DNAとしてヒトゲノムDNAを、プライマーDNAとして上記実施例４で用いたオリゴヌクレオチドの一部（オリゴヌクレオチド３８〜４０）を用意した（第９図参照）。
次に、上記実施例４等と同様な条件でＰＣＲ反応を行い、核酸を増幅させた。そして、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１等と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第１７図〜第１９図に示す。
【００８３】
レーン１は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド３９とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン２は、T.th. RecAタンパク質の代わりに大腸菌（E.coli）のRecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３は、T.th. RecAタンパク質の代わりに T.th.のSSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン５は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド４０とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン６は、T.th. RecAタンパク質の代わりに E.coli RecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、T.th. RecAタンパク質の代わりに T.th.のSSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、プライマー伸長反応の１サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、プライマー伸長反応の１サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、プライマー伸長反応の１サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、プライマー伸長反応の１サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１３は、プライマー伸長反応の１サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１４は、プライマー伸長反応の１サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１５は、プライマー伸長反応の１サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１６は、プライマー伸長反応の１サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１７は、プライマー伸長反応の３サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１８は、プライマー伸長反応の３サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１９は、プライマー伸長反応の３サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２０は、プライマー伸長反応の３サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２１は、プライマー伸長反応の３サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２２は、プライマー伸長反応の３サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２３は、プライマー伸長反応の３サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２４は、プライマー伸長反応の３サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２５は、プライマー伸長反応の６サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２６は、プライマー伸長反応の６サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２７は、プライマー伸長反応の６サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２８は、プライマー伸長反応の６サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２９は、プライマー伸長反応の６サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３０は、プライマー伸長反応の６サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３１は、プライマー伸長反応の６サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３２は、プライマー伸長反応の６サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３３は、プライマー伸長反応の１０サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３４は、プライマー伸長反応の１０サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３５は、プライマー伸長反応の１０サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３６は、プライマー伸長反応の１０サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３７は、プライマー伸長反応の１０サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３８は、プライマー伸長反応の１０サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３９は、プライマー伸長反応の１０サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４０は、プライマー伸長反応の１０サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４１は、プライマー伸長反応の１５サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４２は、プライマー伸長反応の１５サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４３は、プライマー伸長反応の１５サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４４は、プライマー伸長反応の１５サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４５は、プライマー伸長反応の１５サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４６は、プライマー伸長反応の１５サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４７は、プライマー伸長反応の１５サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４８は、プライマー伸長反応の１５サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【００８４】
第１７図（Ａ）の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１では、所望のDNA（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン２では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物の増幅も若干見られた。また、レーン３では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。また、レーン４では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
同様に、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン５では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン６では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物の増幅も見られた。また、レーン７では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。また、レーン８では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
【００８５】
また、第１７図（Ｂ）の結果から明らかなように、プライマー伸長反応の１サイクル終了後にプライマーDNAを加えた場合であっても、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン９では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン１０では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物の増幅も見られた。また、レーン１１では、核酸の増幅が僅かに検出された。また、レーン１２では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
同様に、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１３では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン１４では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物の増幅も見られた。また、レーン１５では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。また、レーン１６では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
【００８６】
また、第１８図（Ａ）の結果から明らかなように、プライマー伸長反応の３サイクル終了後にプライマーDNAを加えた場合であっても、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１７では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン１８では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物の増幅も見られた。また、レーン１９では、所望の核酸の増幅が僅かに検出できた。また、レーン２０では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
一方、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン２１では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン２２では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物の増幅も僅かに見られた。また、レーン２３では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。また、レーン２４では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
【００８７】
また、第１８図（Ｂ）の結果から明らかなように、プライマー伸長反応の６サイクル終了後にプライマーDNAを加えた場合であっても、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン２５では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン２６では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物の増幅も見られた。また、レーン２７では、所望の核酸の増幅が見られたが、副産物はほとんど検出されなかった。また、レーン２８では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
一方、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン２９では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン３０では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物の増幅も見られた。また、レーン３１では、所望の核酸の増幅が見られたが、副産物はほとんど検出されなかった。また、レーン３２では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
【００８８】
また、第１９図（Ａ）の結果から明らかなように、プライマー伸長反応の１０サイクル終了後にプライマーDNAを加えた場合であっても、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン３３では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン３４では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物の増幅も若干見られた。また、レーン３５では、所望の核酸の増幅が見られたが、副産物はほとんど検出されなかった。また、レーン３６では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
一方、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン３７では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン３８では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物の増幅も見られた。また、レーン３９では、所望の核酸の増幅が見られたが、副産物はほとんど検出されなかった。また、レーン４０では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
【００８９】
また、第１９図（Ｂ）の結果から明らかなように、プライマー伸長反応の１５サイクル終了後にプライマーDNAを加えた場合であっても、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン４１では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン４２では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物の増幅も若干見られた。また、レーン４３では、所望の核酸の増幅が見られたが、副産物はほとんど検出されなかった。また、レーン４４では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
一方、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン４５では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン４６では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物の増幅も若干見られた。また、レーン４７では、所望の核酸の増幅が見られたが、副産物はほとんど検出されなかった。また、レーン４８では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
【００９０】
まず、第１７図（Ａ）の結果より、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲを行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
一方、E.coli RecAタンパク質を加えてＰＣＲを行った場合には、これを加えない場合よりは、ＰＣＲの特異性が向上するものの、副産物が若干生成されることにより、T.th. RecAタンパク質を加える場合ほどＰＣＲの特異性は向上しない。
なお、E.coli RecAタンパク質はＰＣＲサイクル中にかかる熱によって変性しやすい。このため、E.coli RecAタンパク質の効果が減少しやすいと考えられる。また、E.coli RecAタンパク質が変性した（１本鎖の）鋳型DNAに結合した状態で熱変性を起こすと、E.coli RecAタンパク質が鋳型DNAから離れなくなる。その結果、ＰＣＲ反応を阻害することになる。なお、E.coli のSSBタンパク質を加えた場合も、これと同様な現象でＰＣＲ反応が阻害されると考えられる。
他方、T.th.のSSBタンパク質を加えてＰＣＲを行っても、所望の核酸は増幅されない。
【００９１】
次に、第１７図（Ｂ）、第１８図及び第１９図の結果より、プライマー伸長反応を繰り返した後にプライマーDNAを加えても、即ち、プライマーDNAを加える前に反応液が繰り返し高温状態に置かれても、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲを行ったときに、ＰＣＲの特異性が劣ることがない。従って、T.th. RecAタンパク質は、高温においても不活性化せず安定であると考えられる。
【００９２】
【実施例８】
次いで、第８の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
鋳型DNAとしてヒトゲノムDNAを用意し、プライマーDNAとして上記実施例４と同様に５種類のオリゴヌクレオチド３７〜４１を用意した（第９図参照）。
次に、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．３μMし、それ以外は上記実施例１と同様にしてＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。なお、このＰＣＲの温度条件、即ち、１サイクル（７０℃，１０分間、９４℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、６０℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）を温度条件５とする。１サイクル目の最初の温度（初期温度）は７０℃である。そして、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１等と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第２０図に示す。
【００９３】
レーン５は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド３７とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン６は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド３９とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン７は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド４０とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン８は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド４１とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン１は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、T.th. RecAタンパク質の代わりに E.coli RecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、T.th. RecAタンパク質の代わりに E.coli RecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、T.th. RecAタンパク質の代わりに E.coli RecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、T.th. RecAタンパク質の代わりに E.coli RecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１３〜レーン２４は、ＰＣＲの温度条件を、１サイクル（８０℃，１０分間、９４℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、６０℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）とした。これを温度条件６とする。１サイクル目の最初の温度（初期温度）は８０℃である。
レーン１３は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１４は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１５は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１６は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１７は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１８は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１９は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２０は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２１は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２２は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２３は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２４は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【００９４】
第２０図（Ａ）の結果から明らかなように、初期温度が７０℃の場合、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン５〜レーン８のうち、レーン５〜レーン７では、所望のDNA（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン８では、核酸の増幅がほとんど検出されなかった。
これに対し、E.coli RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン９〜レーン１２のうち、レーン９〜レーン１１では、所望のDNAの増幅が見られたが、副産物も若干検出された。また、レーン１２では、核酸の増幅がほとんど検出されなかった。
他方、RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン４では、所望のDNAの増幅が見られたが、それ以外に副産物も多量に検出された。
なお、初期温度が７０℃の場合、E.coli RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行った場合には、初期温度をかけない場合に比べ、副産物が多く検出された。従って、E.coli RecAタンパク質は、７０℃で不活性化しやすいと考えれる。
一方、初期温度７０℃をかけ、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行っても、初期温度をかけない場合と同様に、副産物はほとんど検出されなかった。従って、T.th. RecAタンパク質は、７０℃でも不活性化しにくいと考えれる。
【００９５】
第２０図（Ｂ）の結果から明らかなように、初期温度が８０℃の場合、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１７〜レーン２０のうち、レーン１７〜レーン１９では、所望のDNAの増幅が見られたが、副産物が若干検出された。また、レーン２０では、核酸の増幅がほとんど検出されなかった。
これに対し、E.coli RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン２１〜レーン２４のうち、レーン２１〜レーン２３では、所望のDNAの増幅が見られたが、副産物も検出された。この副産物の量は、T.th. RecAタンパク質を加えた場合に比べて多かった。また、レーン２４では、核酸の増幅がほとんど検出されなかった。
他方、RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン１３〜レーン１６では、所望のDNAの増幅が見られたが、それ以外に副産物も多量に検出された。
【００９６】
まず、第２０図（Ａ）の結果より、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲを行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
一方、E.coli RecAタンパク質を加えてＰＣＲを行った場合には、これを加えない場合よりは、ＰＣＲの特異性が向上するものの、副産物が若干生成されることにより、T.th. RecAタンパク質を加える場合ほどＰＣＲの特異性は向上しない。
次に、第２０図（Ｂ）の結果より、初期温度を８０℃に上げると、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲを行っても、ＰＣＲの特異性が若干低下する。従って、初期温度を８０℃に上げることにより、T.th. RecAタンパク質の一部が不活性化するものと考えられる。
【００９７】
【実施例９】
次いで、第９の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
第２１図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNAを、プライマーDNAとして５種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド５９〜６３）を用意した。これらのプライマーDNAは、Homo sapiens BAC clone CTB-135C18 from 7q11.2-q22, complete sequence.（ACCESSION AC005164）を参考にして設計した。
プライマーDNAのうち、オリゴヌクレオチド６０とオリゴヌクレオチド６１は、鋳型DNAと１００％相補的な２２merの塩基配列からなる。一方、オリゴヌクレオチド５９は、オリゴヌクレオチド６１のうち一の塩基をＣからＡに変えたものであり、オリゴヌクレオチド６２は、オリゴヌクレオチド６１のうち一の塩基をＣからＧに変えたものであり、オリゴヌクレオチド６３は、オリゴヌクレオチド６１のうち一の塩基をＣからＴに変えたものである。
【００９８】
オリゴヌクレオチド５９：
5'-caaagctact tgcacagcct cc-3'
オリゴヌクレオチド６０：
5'-ggcatattca gccaaggatt tc-3'
オリゴヌクレオチド６１：
5'-caaagctact ttcacagcct cc-3'
オリゴヌクレオチド６２：
5'-caaagctact tacacagcct cc-3'
オリゴヌクレオチド６３：
5'-caaagctact tccacagcct cc-3'
【００９９】
次に、上記実施形態４と同様な条件でＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。そして、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１等と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第２２図に示す。
【０１００】
レーン１は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド５９とオリゴヌクレオチド６０を加えたものである。
レーン２は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド６１とオリゴヌクレオチド６０を加えたものである。
レーン３は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド６２とオリゴヌクレオチド６０を加えたものである。
レーン４は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド６３とオリゴヌクレオチド６０を加えたものである。
レーン５は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【０１０１】
第２２図の結果から明らかなように、ATP-γSを加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン４について見ると、すべてのレーンについて、所望のDNA（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）はほとんど検出されなかった。
一方、ATP-γSを加えてＰＣＲ反応を行ったレーン５〜レーン８について見ると、レーン６では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン５とレーン７とレーン８では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
【０１０２】
このことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
そしてさらに、ATP-γSの存在下では、プライマーDNAと鋳型DNAが１００％相補的である場合にのみ、特異的に核酸を増幅させるようにすることができる。従って、ATP-γSを反応液に加えることにより、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができる。
また、上記の結果より、一塩基多型を検出することが可能である。即ち、プライマーDNAの１つに、鋳型DNAのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAを用いてＰＣＲを行えば、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全に相補的である場合に、所望の核酸を増幅させるようにすることができる。一方、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全には相補的ではない場合、即ち、一塩基多型をなす塩基がプライマーDNAと相補的でない場合に、所望の核酸が増幅しない、または、抑制されるようにすることができる。このため、ＰＣＲによる所望の核酸の増幅により、一塩基多型を検出することが可能である。
【０１０３】
【実施例１０】
次いで、第１０の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
第２３図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNAを、プライマーDNAとして５種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド６４〜６８）を用意した。これらのプライマーDNAは、Homo sapiens PAC clone RP5-1142J19 from 7q35-q36,
complete sequence.（ACCESSION AC004975）を参考にして設計した。
プライマーDNAのうち、オリゴヌクレオチド６５とオリゴヌクレオチド６８は、鋳型DNAと１００％相補的な２０merまたは２１merの塩基配列からなる。一方、オリゴヌクレオチド６４は、オリゴヌクレオチド６８のうち３’末端から３塩基目の一の塩基をＴからＡに変えたものであり、オリゴヌクレオチド６６は、オリゴヌクレオチド６８のうち３’末端から３塩基目の一の塩基をＴからＣに変えたものであり、オリゴヌクレオチド６７は、オリゴヌクレオチド６８のうち３’末端から３塩基目の一の塩基をＴからＧに変えたものである。
【０１０４】
オリゴヌクレオチド６４：
5'-gcaggcacca agaactacag c-3'
オリゴヌクレオチド６５：
5'-gcctaaggtc acgttgtccc-3'
オリゴヌクレオチド６６：
5'-gcaggcacca agaactaccg c-3'
オリゴヌクレオチド６７：
5'-gcaggcacca agaactacgg c-3'
オリゴヌクレオチド６８：
5'-gcaggcacca agaactactg c-3'
【０１０５】
またさらに、第２４図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNAを、プライマーDNAとして５種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド６９〜７３）を用意した。これらのプライマーDNAは、Homo sapiens BAC clone CTB-135C18 from 7q11.2-q22, complete sequence.（ACCESSION AC005164）を参考にして設計した。
これらのプライマーDNAのうち、オリゴヌクレオチド７０とオリゴヌクレオチド７１は、鋳型DNAと１００％相補的な２２merの塩基配列からなる。一方、オリゴヌクレオチド６９は、オリゴヌクレオチド７１のうち３’末端から４塩基目の一の塩基をＣからＡに変えたものであり、オリゴヌクレオチド７２は、オリゴヌクレオチド７１のうち３’末端から４塩基目の一の塩基をＣからＧに変えたものであり、オリゴヌクレオチド７３は、オリゴヌクレオチド７１のうち３’末端から４塩基目の一の塩基をＣからＴに変えたものである。
【０１０６】
オリゴヌクレオチド６９：
5'-caaagctact ttcacagcat cc-3'
オリゴヌクレオチド７０：
5'-ggcatattca gccaaggatt tc-3'
オリゴヌクレオチド７１：
5'-caaagctact ttcacagcct cc-3'
オリゴヌクレオチド７２：
5'-caaagctact ttcacagcgt cc-3'
オリゴヌクレオチド７３：
5'-caaagctact ttcacagctt cc-3'
【０１０７】
次に、DNAポリメラーゼとして TaKaRa Taq（タカラバイオ）の代わりに Ex Taq（タカラバイオ）を用い、さらに１mM（最終濃度）のATP-γSを加えて、それ以外は上記実施形態４等と同様な条件でＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。なお、この Ex Taqは、通常（従来）のＰＣＲの条件下では、プライマーDNAの３’末端の塩基配列を認識しないことが知られているものである。そして、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１等と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第２５図に示す。
【０１０８】
レーン９は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド６４とオリゴヌクレオチド６５を加えたものである。
レーン１０は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド６６とオリゴヌクレオチド６５を加えたものである。
レーン１１は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド６７とオリゴヌクレオチド６５を加えたものである。
レーン１２は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド６８とオリゴヌクレオチド６５を加えたものである。
レーン１３は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド６９とオリゴヌクレオチド７０を加えたものである。
レーン１４は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド７１とオリゴヌクレオチド７０を加えたものである。
レーン１５は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド７２とオリゴヌクレオチド７０を加えたものである。
レーン１６は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド７３とオリゴヌクレオチド７０を加えたものである。
レーン１は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン５は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１７は、T.th. RecAタンパク質の代わりにT.th. SSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１８は、T.th. RecAタンパク質の代わりにT.th. SSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１９は、T.th. RecAタンパク質の代わりにT.th. SSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２０は、T.th. RecAタンパク質の代わりにT.th. SSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２１は、T.th. RecAタンパク質の代わりにT.th. SSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン１３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２２は、T.th. RecAタンパク質の代わりにT.th. SSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン１４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２３は、T.th. RecAタンパク質の代わりにT.th. SSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン１５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２４は、T.th. RecAタンパク質の代わりにT.th. SSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン１６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【０１０９】
第２５図（Ｂ）の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質とATP-γSを加えた場合には、まず、レーン９〜レーン１２について見ると、レーン１２では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン９〜レーン１１では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。なお、写真に映っているのは、バックグラウンドであると考えられる。また、レーン１３〜レーン１６について見ると、レーン１４では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン１３とレーン１５とレーン１６では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
これらに対し、第２５図（Ａ）の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えない場合には、レーン１〜レーン４についてもレーン５〜レーン８についても、プライマーDNAに対応するDNAの増幅が検出され、また、副産物も検出された。
また、第２５図（Ｃ）の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質の代わりにT.th. ＳＳＢタンパク質を加えた場合には、レーン１７〜レーン２０についてもレーン２１〜レーン２４についても、プライマーDNAに対応するDNAの増幅が検出され、また、副産物も検出された。
【０１１０】
これらのことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
そしてさらに、ATP-γSの存在下では、プライマーDNAと鋳型DNAが１００％相補的である場合にのみ、特異的に核酸を増幅させるようにすることができる。従って、ATP-γSを反応液に加えることにより、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができる。
また、上記の結果より、一塩基多型を検出することが可能である。即ち、プライマーDNAの１つに、鋳型DNAのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAを用いてＰＣＲを行えば、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全に相補的である場合に、所望の核酸を増幅させるようにすることができる。一方、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全には相補的ではない場合、即ち、一塩基多型をなす塩基がプライマーDNAと相補的でない場合に、所望の核酸が増幅しない、または、抑制されるようにすることができる。このため、ＰＣＲによる所望の核酸の増幅により、一塩基多型を検出することが可能である。
【０１１１】
【実施例１１】
次いで、第１１の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第２６図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA（Promega）を、プライマーDNAとして６種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド７４〜７９）を用意した。オリゴヌクレオチド７４とオリゴヌクレオチド７５は、Human S100 protein beta-subunit gene, exon 1 (ACCESSION M59486 J05600) を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド７６とオリゴヌクレオチド７７は、Homo sapiens blue cone opsin gene, complete cds (ACCESSION L32835) を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド７８とオリゴヌクレオチド７９は、Homo sapiens beta globin region (HBB@) on chromosome 11 (ACCESSION NG_000007) を参考にして設計した。各プライマーDNAは、鋳型DNAと１００％相補的な２０〜２５merの塩基配列からなる。
【０１１２】
オリゴヌクレオチド７４：
5'-gactactctagcgactgtccatctc-3'
オリゴヌクレオチド７５：
5'-gacagccaccagatccaatc-3'
オリゴヌクレオチド７６：
5'-ggcagctttcatgggcactgt-3'
オリゴヌクレオチド７７：
5'-gacagggctggactgacatttg-3'
オリゴヌクレオチド７８：
5'-ctgctgaaagagatgcggtgg-3'
オリゴヌクレオチド７９：
5'-aggaaaacagcccaagggacag-3'
【０１１３】
次に、ＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。具体的には、５０μlのＰＣＲ反応液中に、各々０．５μM（最終濃度）の２種類のオリゴヌクレオチドと、２００ngのヒトゲノムDNA（Promega）と、１．０unitの TaKaRa ExTaq-HS Polymerase（タカラバイオ）と、０．２mMのdNTP混合液と、１．０μgのT.th. RecAタンパク質を、１×Ex-Taq buffer（タカラバイオ）に混合した。そして、ＰＣＲ反応を、１サイクル（９０℃，３０秒間）、３０サイクル（９４℃，１５秒間、５５℃，３０秒間、７２℃，１分間）、１サイクル（７２℃，７分間、４℃，１分間）で行った。
次に、反応液の１μlについて１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、アガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してゲル中のDNAを染色し、その後、染色されたDNAを写真に記録した。その結果を第２７図に示す。
【０１１４】
レーン１は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド７４とオリゴヌクレオチド７５を加えたものである。
レーン２は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド７６とオリゴヌクレオチド７７を加えたものである。
レーン３は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド７８とオリゴヌクレオチド７９を加えたものである。
レーン４は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン５は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、T.th. RecAタンパク質の代わりに同量の大腸菌（E.coli）のRecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、T.th. RecAタンパク質の代わりに同量の大腸菌（E.coli）のRecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、T.th. RecAタンパク質の代わりに同量の大腸菌（E.coli）のRecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【０１１５】
第２７図の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン３では、所望の核酸（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）の増幅はほとんど検出されなかった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン４〜レーン６では、所望の核酸のみならず副産物も多量に検出された。
また、T.th. RecAタンパク質の代わりにE.coli RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン７〜レーン９では、所望の核酸の他、レーン４〜レーン６ほどではないが、副産物も検出された。
【０１１６】
このことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、T.th. RecAタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
一方、E.coli RecAタンパク質を加えてＰＣＲを行った場合には、これを加えない場合よりは、ＰＣＲの特異性が向上するものの、副産物が若干生成されることにより、T.th. RecAタンパク質を加える場合ほどＰＣＲの特異性は向上しない。
【０１１７】
【実施例１２】
次いで、第１２の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第２８図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA（Promega）を、プライマーDNAとして５種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド８０〜８４）を用意した。これらのプライマーDNAは、Homo sapiens BAC clone CTB-135C18 from 7q11.2-q22, complete sequence (ACCESSION AC005164) 及び Homo sapiens chromosome 19 clone CTD-2166J9, complete sequence (ACCESSION AC010412) を参考にして設計した。フォワード側のプライマーDNA（オリゴヌクレオチド８０〜８３）は、任意のプライマー設計の可能性を示すため、それぞれ位置をずらして設計してある。一方、リバース側のプライマーDNA（オリゴヌクレオチド８４）は、共通のものである。各プライマーDNAは、鋳型DNAと１００％相補的な２２merの塩基配列からなる。
【０１１８】
オリゴヌクレオチド８０：
5'-caaagctactttcacagcctcc-3'
オリゴヌクレオチド８１：
5'-caaagctactgtcacagcctcc-3'
オリゴヌクレオチド８２：
5'-caaagcgactgtcagagcctcc-3'
オリゴヌクレオチド８３：
5'-cagagcgactgtcagagcgtcc-3'
オリゴヌクレオチド８４：
5'-ggcatattcagccaaggatttc-3'
【０１１９】
次に、上記実施例１１のレーン１等と同様な条件でＰＣＲ反応を行った。そして、その反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１１と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第２９図に示す。
【０１２０】
レーン１は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド８０とオリゴヌクレオチド８４を加えたものである。
レーン２は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド８１とオリゴヌクレオチド８４を加えたものである。
レーン３は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド８２とオリゴヌクレオチド８４を加えたものである。
レーン４は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド８３とオリゴヌクレオチド８４を加えたものである。
レーン５は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、T.th. RecAタンパク質の代わりに同量の大腸菌（E.coli）のRecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、T.th. RecAタンパク質の代わりに同量の大腸菌（E.coli）のRecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、T.th. RecAタンパク質の代わりに同量の大腸菌（E.coli）のRecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、T.th. RecAタンパク質の代わりに同量の大腸菌（E.coli）のRecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【０１２１】
第２９図の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン４では、所望の核酸（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）の増幅はほとんど検出されなかった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン５〜レーン８では、所望の核酸のみならず副産物も多量に検出された。
また、T.th. RecAタンパク質の代わりにE.coli RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン９〜レーン１２では、所望の核酸の他、レーン５〜レーン８ほどではないが、副産物も検出された。
【０１２２】
このことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、T.th. RecAタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
一方、E.coli RecAタンパク質を加えてＰＣＲを行った場合には、これを加えない場合よりは、ＰＣＲの特異性が向上するものの、副産物が若干生成されることにより、T.th. RecAタンパク質を加える場合ほどＰＣＲの特異性は向上しない。
【０１２３】
【実施例１３】
次いで、第１３の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第３０図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA（Promega）を、プライマーDNAとしてオリゴヌクレオチド８５とオリゴヌクレオチド８６を用意した。これらのプライマーDNAは、ヒトゲノムDNAの single copy gene について設計した。具体的には、Homo sapiens PAC clone RP5-1142J19 from 7q35-q36, complete sequence (ACCESSION AC004975) を参考にして設計した。各プライマーDNAは、鋳型DNAと１００％相補的な２０〜２１merの塩基配列からなる。
【０１２４】
オリゴヌクレオチド８５：
5'-gcaggcaccaagaactactgc-3'
オリゴヌクレオチド８６：
5'-gcctaaggtcacgttgtccc-3'
【０１２５】
次に、ＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。具体的には、５０μlのＰＣＲ反応液中に、各々１．０μM（最終濃度）の２種類のオリゴヌクレオチドと、２００ngのヒトゲノムDNA（Promega）と、１．０unitの TaKaRa Taq-HS（タカラバイオ）と、０．２mMのdNTP混合液と、１．０μgのT.th. RecAタンパク質を、１０mMの Tris-HCl Buffer（pH８．３）、５０mMのKCl、１．５mMのMgCl2 に混合した。そして、ＰＣＲ反応を、１サイクル（９０℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、６０℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）で行った。
次に、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、アガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してゲル中のDNAを染色し、その後、染色されたDNAを写真に記録した。その結果を第３１図に示す。
【０１２６】
レーン１は、上記のように、プライマーDNAの濃度をそれぞれ１．０μM（最終濃度）として、ＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．３μM（最終濃度）に減らして、それ以外はレーン１と同様なＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．１μM（最終濃度）に減らして、それ以外はレーン１と同様なＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．０３μM（最終濃度）に減らして、それ以外はレーン１と同様なＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン５は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．０１μM（最終濃度）に減らして、それ以外はレーン１と同様なＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．００３μM（最終濃度）に減らして、それ以外はレーン１と同様なＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．００１μM（最終濃度）に減らして、それ以外はレーン１と同様なＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．０００３μM（最終濃度）に減らして、それ以外はレーン１と同様なＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１３は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１４は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１５は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１６は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【０１２７】
第３１図の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン８のうち、レーン７，８を除くレーンでは、所望の核酸（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）はほとんど検出されなかった。また、レーン７及びレーン８では、プライマーDNAの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン９〜レーン１６のうち、レーン９〜レーン１２では、所望の核酸のみならず副産物も検出された。また、レーン１３及びレーン１４では、所望の核酸の増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。また、レーン１５及びレーン１６では、プライマーDNAの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
このことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、T.th. RecAタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
【０１２８】
【実施例１４】
次いで、第１４の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第３２図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA（Promega）を、プライマーDNAとして５種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド８７〜９１）を用意した。これらのプライマーDNAは、Homo sapiens BAC clone CTB-135C18 from 7q11.2-q22, complete sequence (ACCESSION AC005164) を参考にして設計した。一方のプライマーDNA（オリゴヌクレオチド８７〜９０）は、３’末端から３番目の塩基配列をそれぞれ異ならせてあり、オリゴヌクレオチド９０が鋳型DNAと１００％相補的である。他方のプライマーDNA（オリゴヌクレオチド９１）は、共通のものであり、鋳型DNAと１００％相補的である。各プライマーDNAは、２２merの塩基配列からなる。
【０１２９】
オリゴヌクレオチド８７：
5'-caaagctactttcacagccgcc-3'
オリゴヌクレオチド８８：
5'-caaagctactttcacagccacc-3'
オリゴヌクレオチド８９：
5'-caaagctactttcacagccccc-3'
オリゴヌクレオチド９０：
5'-caaagctactttcacagcctcc-3'
オリゴヌクレオチド９１：
5'-ggcatattcagccaaggatttc-3'
【０１３０】
次に、ＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。具体的には、５０μlのＰＣＲ反応液中に、各々０．３μM（最終濃度）の２種類のオリゴヌクレオチドと、２００ngのヒトゲノムDNA（Promega）と、１．０unitの TaKaRa Taq-HS（タカラバイオ）と、０．２mMのdNTP混合液と、１．０μgのT.th. RecAタンパク質を、１０mMの Tris-HCl Buffer（pH８．３）、５０mMのKCl、１．５mMのMgCl2 に混合した。そして、ＰＣＲ反応を、１サイクル（９４℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、６０℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）で行った。
次に、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、アガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してゲル中のDNAを染色し、その後、染色されたDNAを写真に記録した。その結果を第３３図に示す。
【０１３１】
レーン１は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド８７とオリゴヌクレオチド９１を加えたものである。
レーン２は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド８８とオリゴヌクレオチド９１を加えたものである。
レーン３は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド８９とオリゴヌクレオチド９１を加えたものである。
レーン４は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド９０とオリゴヌクレオチド９１を加えたものである。
レーン５は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、T.th. RecAタンパク質の代わりに、同量のT.th.のSSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、T.th. RecAタンパク質の代わりに、同量のT.th.のSSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、T.th. RecAタンパク質の代わりに、同量のT.th.のSSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、T.th. RecAタンパク質の代わりに、同量のT.th.のSSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【０１３２】
第３３図の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン４について見ると、鋳型DNAと１００％相補的なプライマーDNAを用いたレーン４では、所望のDNAの増幅が強く検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。一方、３’末端から３番目の塩基が異なるプライマーDNAを用いたレーン１〜レーン３では、所望の核酸の増幅がほとんど検出されなかった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン５〜レーン８については、いずれのレーンにおいても所望のDNAの増幅が検出された。また、レーン５及びレーン６では、副産物も増幅された。
また、T.th. RecAタンパク質の代わりにT.th.のSSBタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン９〜レーン１２についても、いずれのレーンにおいても所望のDNAの増幅が検出された。また、レーン９及びレーン１０では、副産物が増幅された。
【０１３３】
このことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。具体的には、プライマーDNAと鋳型DNAとの塩基のミスマッチがない場合においてのみ、特異的に核酸を増幅させることが可能となる。一般に、プライマーDNAの３’末端近傍の塩基（特に、３’末端から３塩基以内の塩基）が鋳型DNAとミスマッチしている場合には、核酸が増幅されやすい傾向にある。しかし、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸を特異的に増幅させることができる。
一方、RecAタンパク質と同様にDNAに結合するT.th. SSBタンパク質を加えてＰＣＲを行っても、ＰＣＲの特異性は特に向上しない。
【０１３４】
また、本実施例の結果より、一塩基多型を検出することが可能である。即ち、プライマーDNAの１つに、鋳型DNAのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAを用いてＰＣＲを行えば、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全に相補的である場合に、所望の核酸を増幅させるようにすることができる。一方、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全には相補的ではない場合、即ち、一塩基多型をなす塩基がプライマーDNAと相補的でない場合に、所望の核酸が増幅しない、または、抑制されるようにすることができる。このため、ＰＣＲによる所望の核酸の増幅により、一塩基多型を検出することが可能である。
【０１３５】
【実施例１５】
次いで、第１５の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第３４図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA（Promega）を、プライマーDNAとして５種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド９２〜９６）を用意した。これらのプライマーDNAは、Homo sapiens PAC clone RP5-1142J19 from 7q35-q36, complete sequence (ACCESSION AC004975) を参考にして設計した。一方のプライマーDNA（オリゴヌクレオチド９２〜９５）は、３’末端から３番目の塩基配列をそれぞれ異ならせてあり、オリゴヌクレオチド９３が鋳型DNAと１００％相補的である。他方のプライマーDNA（オリゴヌクレオチド９６）は、共通のものであり、鋳型DNAと１００％相補的である。各プライマーDNAは、２０〜２１merの塩基配列からなる。
【０１３６】
オリゴヌクレオチド９２：
5'-gcaggcaccaagaactacggc-3'
オリゴヌクレオチド９３：
5'-gcaggcaccaagaactactgc-3'
オリゴヌクレオチド９４：
5'-gcaggcaccaagaactacagc-3'
オリゴヌクレオチド９５：
5'-gcaggcaccaagaactaccgc-3'
オリゴヌクレオチド９６：
5'-gcctaaggtcacgttgtccc-3'
【０１３７】
次に、上記実施例１４のレーン１等と同様な条件でＰＣＲ反応を行った。そして、その反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１４と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第３５図に示す。
【０１３８】
レーン１は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド９２とオリゴヌクレオチド９６を加えたものである。
レーン２は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド９３とオリゴヌクレオチド９６を加えたものである。
レーン３は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド９４とオリゴヌクレオチド９６を加えたものである。
レーン４は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド９５とオリゴヌクレオチド９６を加えたものである。
レーン５は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、T.th. RecAタンパク質の代わりに、同量のT.th.のSSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、T.th. RecAタンパク質の代わりに、同量のT.th.のSSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、T.th. RecAタンパク質の代わりに、同量のT.th.のSSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、T.th. RecAタンパク質の代わりに、同量のT.th.のSSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【０１３９】
第３５図の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン４について見ると、鋳型DNAと１００％相補的なプライマーDNAを用いたレーン２では、所望のDNAの増幅が強く検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。一方、３’末端から３番目の塩基が異なるプライマーDNAを用いたレーン１，３，４では、所望の核酸の増幅がほとんど検出されなかった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン５〜レーン８については、いずれのレーンにおいても所望のDNAの増幅が検出された。また、レーン７では、副産物も増幅された。
また、T.th. RecAタンパク質の代わりにT.th.のSSBタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン９〜レーン１２についても、いずれのレーンにおいても所望のDNAの増幅が検出された。また、レーン１１では、副産物が増幅された。
【０１４０】
このことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。具体的には、プライマーDNAと鋳型DNAとの塩基のミスマッチがない場合においてのみ、特異的に核酸を増幅させることが可能となる。一般に、プライマーDNAの３’末端近傍の塩基（特に、３’末端から３塩基以内の塩基）が鋳型DNAとミスマッチしている場合には、核酸が増幅されやすい傾向にある。しかし、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸を特異的に増幅させることができる。
一方、RecAタンパク質と同様にDNAに結合するT.th. SSBタンパク質を加えてＰＣＲを行っても、ＰＣＲの特異性は特に向上しない。
【０１４１】
また、本実施例の結果より、一塩基多型を検出することが可能である。即ち、プライマーDNAの１つに、鋳型DNAのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAを用いてＰＣＲを行えば、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全に相補的である場合に、所望の核酸を増幅させるようにすることができる。一方、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全には相補的ではない場合、即ち、一塩基多型をなす塩基がプライマーDNAと相補的でない場合に、所望の核酸が増幅しない、または、抑制されるようにすることができる。このため、ＰＣＲによる所望の核酸の増幅により、一塩基多型を検出することが可能である。
【０１４２】
【実施例１６】
次いで、第１６の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第３６図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA（Promega）を、プライマーDNAとしてオリゴヌクレオチド９７とオリゴヌクレオチド９８を用意した。これらのプライマーDNAは、Human chromosome 14 DNA sequence BAC C-2240H23 of library CalTech-D from chromosome 14 of Homo sapiens (Human), complete sequence (ACCESSION AL356017) を参考にして設計した。各プライマーDNAは、鋳型DNAと１００％相補的な２０merの塩基配列からなる。
【０１４３】
オリゴヌクレオチド９７：
5'-atgaaaagccctgctttgca-3'
オリゴヌクレオチド９８：
5'-agacttcttcaactcaatgg-3'
【０１４４】
次に、ＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。具体的には、５０μlのＰＣＲ反応液中に、各々０．５μM（最終濃度）の２種類のオリゴヌクレオチドと、２００ngのヒトｃDNA（Invitorogen）と、１．０unitの TaKaRa ExTaq-HS polymerase（タカラバイオ）と、０．２mMのdNTP混合液と、１．０μgのT.th. RecAタンパク質を、１×ExTaq-HS 専用 Buffer （タカラバイオ）に混合した。そして、ＰＣＲ反応を、１サイクル（９４℃，３０秒間）、３０サイクル（９４℃，１５秒間、５５℃，３０秒間、７２℃，１分間）、１サイクル（７２℃，７分間、４℃，１分間）で行った。
次に、反応液の１０μlについて１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、アガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してゲル中のDNAを染色し、その後、染色されたDNAを写真に記録した。その結果を第３７図に示す。
【０１４５】
レーン１は、上記のように、T.th. RecAタンパク質を加えたものである。
レーン２は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【０１４６】
第３７図の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。なお、下方に見えるシグナルはバックグラウンドと考えられる。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン２では、所望のDNAの増幅が検出されなかった。これは、鋳型DNAに阻止的または抑制的２次構造の区域があるためと考えられる。
このことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、鋳型DNAに阻止的または抑制的２次構造の区域がある場合であっても、所望の核酸を効率よく特異的に増幅させることができる。その理由は、相同組み換えタンパク質が、鋳型DNAに結合することにより、阻止的または抑制的２次構造が解かれるためであると考えられる。
【０１４７】
【実施例１７】
次いで、第１７の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第３８図及び第３９図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA（Promega）を、プライマーDNAとして１２種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド９９〜１１０）を用意した。オリゴヌクレオチド９９とオリゴヌクレオチド１００は、Human DNA sequence from clone RP11-760M1 on chromosome 13, complete sequence (ACCESSION AL354815) 及び Human hepatocyte nuclear factor 4-alpha gene, exon 1 (ACCESSION U72959 U72960) を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１０１とオリゴヌクレオチド１０２は、Human rhodopsin gene, complete cds (ACCESSION U49742 K02281) を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１０３とオリゴヌクレオチド１０４は、Homo sapiens beta globin region (HBB@) on chromosome 11 (ACCESSION NG_000007) を参考にして設計した。オリゴヌクレオチド１０５とオリゴヌクレオチド１０６は、Homo spaiens HPFH6OR gene for olfactory receptor (ACCESSION X81445 X91835) を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１０７とオリゴヌクレオチド１０８は、Human p53 (TP53) gene, complete cds (ACCESSION U94788) を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１０９とオリゴヌクレオチド１１０は、Human p53 (TP53) gene, complete cds (ACCESSION U94788) を参考にして設計した。各プライマーDNAは、鋳型DNAと１００％相補的な２０〜２７merの塩基配列からなる。
【０１４８】
オリゴヌクレオチド９９：
5'-gcatctggggcctggtatttag-3'
オリゴヌクレオチド１００：
5'-tacaaggcaggcatcatgactcacg-3'
オリゴヌクレオチド１０１：
5'-aggagcttaggagggggaggt-3'
オリゴヌクレオチド１０２：
5'-cattgacaggacaggagaaggga-3'
オリゴヌクレオチド１０３：
5'-ctttttgttcccccagacactc-3'
オリゴヌクレオチド１０４：
5'-gcaatggcttaggagttggact-3'
オリゴヌクレオチド１０５：
5'-gttaatacctaaggctctactgca-3'
オリゴヌクレオチド１０６：
5'-aggcaatggcggcacccatc-3'
オリゴヌクレオチド１０７：
5'-gcagagacctgtgggaagcgaaaa-3'
オリゴヌクレオチド１０８：
5'-gagagctgtggcaagcagggga-3'
オリゴヌクレオチド１０９：
5'-cccctcctggcccctgtcat-3'
オリゴヌクレオチド１１０：
5'-gttagatgactttgcccaactgtaggg-3'
【０１４９】
次に、ＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。具体的には、５０μlのＰＣＲ反応液中に、各々０．８μM（最終濃度）の２種類のオリゴヌクレオチドと、２００ngのヒトゲノムDNA（Promega）と、１．０unitの TaKaRa ExTaq-HS polymerase（タカラバイオ）と、０．２mMのdNTP混合液と、１．０μgのT.th. RecAタンパク質を、１×ExTaq Buffer （タカラバイオ）に混合した。そして、ＰＣＲ反応を、１サイクル（９４℃，３０秒間）、３５サイクル（９４℃，１５秒間、５５℃，３０秒間、７２℃，１分間）、１サイクル（７２℃，７分間、４℃，１分間）で行った。
次に、反応液の１０μlについて１．２％のアガロースゲルで電気泳動を行い、アガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してゲル中のDNAを染色し、その後、染色されたDNAを写真に記録した。その結果を第４０図に示す。
【０１５０】
レーン７は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド９９とオリゴヌクレオチド１００を加えたものである。
レーン８は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド１０１とオリゴヌクレオチド１０２を加えたものである。
レーン９は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド１０３とオリゴヌクレオチド１０４を加えたものである。
レーン１０は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド１０５とオリゴヌクレオチド１０６を加えたものである。
レーン１１は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド１０７とオリゴヌクレオチド１０８を加えたものである。
レーン１２は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド１０９とオリゴヌクレオチド１１０を加えたものである。
レーン１は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン５は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１３は、１５ｍＭ KCl を加えて、レーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１４は、１５ｍＭ KCl を加えて、レーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１５は、１５ｍＭ KCl を加えて、レーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１６は、１５ｍＭ KCl を加えて、レーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１７は、１５ｍＭ KCl を加えて、レーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１８は、１５ｍＭ KCl を加えて、レーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１９は、３０ｍＭ KCl を加えて、レーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２０は、３０ｍＭ KCl を加えて、レーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２１は、３０ｍＭ KCl を加えて、レーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２２は、３０ｍＭ KCl を加えて、レーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２３は、３０ｍＭ KCl を加えて、レーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２４は、３０ｍＭ KCl を加えて、レーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【０１５１】
第４０図の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン７〜レーン１２では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はそれほど検出されなかった。
また、１５ｍＭ KCl を加えたレーン１３〜レーン１８では、レーン７〜レーン１２よりも副産物の増幅が抑制された。
またさらに、３０ｍＭ KCl を加えたレーン１９〜レーン２４では、レーン１３〜レーン１８よりも、効果的に副産物の増幅が抑制された。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン６では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物も多く検出された。
このことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
特に、ＰＣＲ反応液に KCl を加えることにより、ＰＣＲの特異性を向上させることができる。
【０１５２】
【実施例１８】
次いで、第１８の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第４１図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA（Promega）を、プライマーDNAとしてオリゴヌクレオチド１１１とオリゴヌクレオチド１１２を用意した。これらのプライマーDNAは、Homo sapiens beta globin region (HBB@) on chromosome 11 (ACCESSION NG_000007) を参考にして設計した。各プライマーDNAは、鋳型DNAと１００％相補的な２１〜２２merの塩基配列からなる。
【０１５３】
オリゴヌクレオチド１１１：
5'-ctgctgaaagagatgcggtgg-3'
オリゴヌクレオチド１１２：
5'-aggaaaacagcccaagggacag-3'
【０１５４】
次に、ＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。具体的には、５０μlのＰＣＲ反応液中に、各々０．２５μM（最終濃度）の２種類のオリゴヌクレオチドと、１００ngのヒトゲノムDNA（Promega）と、１．２５unitの TaKaRa ExTaq Polymerase（タカラバイオ）と、０．２mMのdNTP混合液と、１．０μgのT.th. RecAタンパク質を、１×ExTaq Buffer（タカラバイオ）に混合した。そして、ＰＣＲ反応を、１サイクル（９４℃，３０秒間）、３５サイクル（９４℃，１５秒間、５５℃，３０秒間、７２℃，１分間）、１サイクル（７２℃，７分間、４℃，１分間）で行った。
次に、反応液の１０μlについて１．２％のアガロースゲルで電気泳動を行い、アガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してゲル中のDNAを染色し、その後、染色されたDNAを写真に記録した。その結果を第４２図に示す。
【０１５５】
レーン１は、上記のように、TaKaRa ExTaq Polymeraseを１．２５unitの加えてＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２は、TaKaRa ExTaq Polymeraseを０．６３unitに減らして、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３は、TaKaRa ExTaq Polymeraseを０．３１unitに減らして、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４は、TaKaRa ExTaq Polymeraseを０．１６unitに減らして、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン５は、TaKaRa ExTaq Polymeraseを０．０８unitに減らして、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、TaKaRa ExTaq Polymeraseを０．０４unitに減らして、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、TaKaRa ExTaq Polymeraseを０．０２unitに減らして、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１３は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１４は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【０１５６】
第４２図の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン７のうち、レーン１〜レーン５において、所望のDNAの増幅が検出された。即ち、ＰＣＲ反応液に TaKaRa ExTaq Polymerase を０．０８unit以上に加えることにより、所望のDNAが増幅された。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行った場合には、レーン８〜レーン１４のうち、レーン８〜レーン１０のみに、所望のDNAの増幅が検出された。即ち、ＰＣＲ反応液に TaKaRa ExTaq Polymerase を０．３１unit以上に加えた場合にのみ、所望のDNAが増幅された。
このことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、DNAポリメラーゼの添加量を少なくしても、所望の核酸を効率よく特異的に増幅させることができる。その理由は、相同組み換えタンパク質がプライマーDNAや鋳型DNAに結合し、プライマーDNAと鋳型DNAとの結合を促進させるため、DNAポリメラーゼの添加量を少なくしても、ＰＣＲ反応が効率よく進行するものと考えられる。
【０１５７】
【実施例１９】
次いで、第１９の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第４３図〜第４６図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA（Promega）を、プライマーDNAとして２０種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド１１３〜１３２）を用意した。オリゴヌクレオチド１１３とオリゴヌクレオチド１１４は、Homo sapiens 16p13.3 sequence section 1 of 8 (ACCESSION AE006462 AE005175) を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１１５とオリゴヌクレオチド１１６は、Homo sapiens SVMT gene for synaptic vesicle monoamine transporter, exon 16 and complete cds (ACCESSION AB044401) を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１１７とオリゴヌクレオチド１１８は、Homo spaiens HPFH6OR gene for olfactory receptor (ACCESSION X81445 X91835) を参考にして設計した。オリゴヌクレオチド１１９とオリゴヌクレオチド１２０は、Human p53 (TP53) gene, complete cds (ACCESSION U94788) を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１２１とオリゴヌクレオチド１２２は、Human hepatocyte nuclear factor 4-alpha gene, exon 1 (ACCESSION U72959 U72960) を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１２３とオリゴヌクレオチド１２４は、Homo sapiens diacylglycerol kinase, zeta 104kDa (DGKZ), mRNA (ACCESSION NM_003646) を参考にして設計した。オリゴヌクレオチド１２５とオリゴヌクレオチド１２６は、Human rhodopsin gene, complete cds (ACCESSION U49742 K02281) を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１２７とオリゴヌクレオチド１２８は、Human DNA for CAAF1 (calcium-binding protein in amniotic fluid 1), complete cds (ACCESSION D83657) を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１２９とオリゴヌクレオチド１３０は、Homo sapiens CYP21 gene, exons 1 through 10; and steroid 21-hydroxylase (CYP21) gene, complete cds (ACCESSION M12792 M23280) を参考にして設計した。オリゴヌクレオチド１３１とオリゴヌクレオチド１３２は、Human S100 protein beta-subunit gene, exon 1 (ACCESSION M59486 J05600) を参考にして設計した。各プライマーDNAは、鋳型DNAと１００％相補的な２０〜２６merの塩基配列からなる。
【０１５８】
オリゴヌクレオチド１１３：
5'-cacagatttccaaggatgcgctg-3'
オリゴヌクレオチド１１４：
5'-cgtgctctgttccagacttg-3'
オリゴヌクレオチド１１５：
5'-cgtctggcgattgctccaaatg-3'
オリゴヌクレオチド１１６：
5'-gggcagttgtgatccatgagaa-3'
オリゴヌクレオチド１１７：
5'-ggcttgcaccagcttaggaaag-3'
オリゴヌクレオチド１１８：
5'-cgttaggcataatcagtgggatagt-3'
オリゴヌクレオチド１１９：
5'-gcctctgattcctcactgattgctct-3'
オリゴヌクレオチド１２０：
5'-tgtcaaccacccttaacccctcc-3'
オリゴヌクレオチド１２１：
5'-ttggaggggtgggtgagtcaag-3'
オリゴヌクレオチド１２２：
5'-ggaggggtgggggttaatggtta-3'
オリゴヌクレオチド１２３：
5'-ggaacaagacacggctggtt-3'
オリゴヌクレオチド１２４：
5'-agcaaggcagggcaggcaagt-3'
オリゴヌクレオチド１２５：
5'-cggtcccattctcagggaatct-3'
オリゴヌクレオチド１２６：
5'-gcccagaggaagaagaaggaaa-3'
オリゴヌクレオチド１２７：
5'-gcccccacccaggttggtttcta-3'
オリゴヌクレオチド１２８：
5'-atgccttcatctggctcagtgaa-3'
オリゴヌクレオチド１２９：
5'-gctcagcatgctggtggcataa-3'
オリゴヌクレオチド１３０：
5'-cctcataccttcccccccattt-3'
オリゴヌクレオチド１３１：
5'-gactactctagcgactgtccatctc-3'
オリゴヌクレオチド１３２：
5'-gacagccaccagatccaatc-3'
【０１５９】
次に、ＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。具体的には、５０μlのＰＣＲ反応液中に、各々０．１μM（最終濃度）の２０種類のオリゴヌクレオチドと、１００ngのヒトゲノムDNA（Promega）と、１．２５unitの TaKaRa ExTaq Polymerase（タカラバイオ）と、０．２mMのdNTP混合液と、１．０μgのT.th. RecAタンパク質を、１×ExTaq Buffer （タカラバイオ）に混合した。そして、ＰＣＲ反応を、１サイクル（９４℃，３０秒間）、３５サイクル（９４℃，１５秒間、５５℃，３０秒間、７２℃，１分間）、１サイクル（７２℃，７分間、４℃，１分間）で行った。
次に、反応液の１０μlについて１．２％のアガロースゲルで電気泳動を行い、アガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してゲル中のDNAを染色し、その後、染色されたDNAを写真に記録した。その結果を第４７図に示す。
【０１６０】
第４７図の結果から明らかなように、各々のプライマーセットに対応した所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。
このことから、複数種類のプライマーDNAを添加して同時にＰＣＲ反応を行っても、即ち、マルチプライマーＰＣＲを行っても、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応をさせれば、副産物の生成を抑制しつつ、所望の核酸を増幅させることができる。前述したように、T.th. RecAタンパク質を加えることにより、プライマーDNAの濃度を下げても所望の核酸が増幅できるため、このようなマルチプライマーＰＣＲを行っても、各々のプライマーセットに対応した所望のDNAを増幅させることのできると考えられる。
【０１６１】
以上において、本発明の実施の形態を実施例に即して説明したが、本発明は上記各実施例１〜１９に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で、適宜変更して適用できることは言うまでもない。
例えば、上記各実施例では、相同組換えタンパク質として T.th. RecAタンパク質を使用したが、前述したように、それ以外のものを使用することも可能である。即ち、T.th. RecAタンパク質を改変したものであってT.th. RecAタンパク質と類似する機能を有するRecA改変タンパク質（T.th. RecA改変タンパク質）や、T.th. RecAタンパク質とT.th. RecA改変タンパク質との混合物を用いてもよい。また、T.th. RecAフラグメントを用いることもできる。
【０１６２】
さらに、上記以外のRecAタンパク質であっても、鋳型DNAに対する塩基のミスマッチが３塩基以内のプライマーDNAについてのみプライマー伸長反応が起こるRecAタンパク質を用いることができる。また、このようなRecAタンパク質またはこのRecAタンパク質を改変したタンパク質であってこのRecAタンパク質と類似する機能を有するRecA改変タンパク質の少なくともいずれかを含む相同的組換えタンパク質を利用することもできる。
【０１６３】
また、鋳型DNAが阻止的または抑制的二次構造の区域を有する場合には、一般的なＰＣＲを行ったとき、このような区域を有する所望の核酸を、効率よく特異的に増幅させることは困難である。
これに対し、本発明を適用すれば、鋳型DNAにこのような阻止的または抑制的２次構造の区域がある場合であっても、所望の核酸を効率よく特異的に増幅させることができる。その理由は、相同組み換えタンパク質が、鋳型DNAに結合することにより、阻止的または抑制的２次構造が解かれるためであると考えられる。
【０１６４】
また、上記各実施例では、別途抽出し精製したT.th. RecAタンパク質を反応液に加えてＰＣＲを行っている。しかしながら、T.th. RecAタンパク質等を発現可能なように形質転換した大腸菌等を用意し、これに熱処理を行ったものをT.th. RecAタンパク質等として利用することもできる。つまり、大腸菌等を熱処理して、耐熱性の高いT.th. RecAタンパク質等を残しつつ、他のタンパク質を失活させ、これをＰＣＲに利用する方法である。
特に、大腸菌のゲノムDNAやプラスミドDNAを鋳型DNAとする場合には、T.th. RecAタンパク質等を発現する大腸菌等に熱処理を行うことで、鋳型DNAとT.th. RecAタンパク質を同時に得ることができるので、ＰＣＲを行うための作業効率を向上させることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１６５】
以上の説明から明らかなように本発明によれば、ＰＣＲ反応において副産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅することができる核酸増幅方法、ＰＣＲ反応において副産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅することができる核酸増幅用試薬キット、ＰＣＲ反応において副産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅することができることを利用して一塩基多型を検出する一塩基多型検出方法、及び、ＰＣＲ反応において副産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅することができることを利用して一塩基多型を検出するための一塩基多型検出用試薬キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】実施例１に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図２】実施例１に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）はプライマーDNAの濃度を０．０６μMにしてＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）はプライマーDNAの濃度を０．２０μMにしてＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
【図３】実施例２に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図４】実施例２に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図５】実施例３に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図６】実施例３に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図７】実施例３に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）はプライマーDNAの濃度を変えてＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）は別のプライマーDNAを用いてプライマーDNAの濃度を変えてＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
【図８】実施例３に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は別のプライマーDNAを用いてプライマーDNAの濃度を変えてＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）は別のプライマーDNAを用いてプライマーDNAの濃度を変えてＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
【図９】実施例４に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図１０】実施例４に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図１１】実施例５に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図１２】実施例５に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図１３】実施例５に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）はアニーリング温度６０℃でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）はアニーリング温度５５℃でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
【図１４】実施例５に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）はアニーリング温度５０℃でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）はアニーリング温度４５℃でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
【図１５】実施例６に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図１６】実施例６に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）はオリゴヌクレオチド３７〜４４のいずれかを用いてＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）はオリゴヌクレオチド５４〜５８のいずれかを用いてＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
【図１７】実施例７に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は最初からプライマーDNAを添加してＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）は１サイクル後にプライマーDNAを添加してＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
【図１８】実施例７に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は３サイクル後にプライマーDNAを添加してＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）は６サイクル後にプライマーDNAを添加してＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
【図１９】実施例７に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は１０サイクル後にプライマーDNAを添加してＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）は１５サイクル後にプライマーDNAを添加してＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
【図２０】実施例８に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は初期温度７０℃の下でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）は初期温度８０℃の下でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
【図２１】実施例９に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図２２】実施例９に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）はATP-γSの非存在下でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）はATP-γSの存在下でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
【図２３】実施例１０に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図２４】実施例１０に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図２５】実施例１０に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）はT.th. RecAタンパク質の非存在下でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）はT.th. RecAタンパク質の存在下でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｃ）はT.th. SSBタンパク質の存在下でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
【図２６】実施例１１に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図２７】実施例１１に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図２８】実施例１２に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図２９】実施例１２に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図３０】実施例１３に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図３１】実施例１３に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図３２】実施例１４に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図３３】実施例１４に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図３４】実施例１５に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図３５】実施例１５に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図３６】実施例１６に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図３７】実施例１６に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図３８】実施例１７に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図３９】実施例１７に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図４０】実施例１７に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図４１】実施例１８に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図４２】実施例１８に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図４３】実施例１９に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図４４】実施例１９に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図４５】実施例１９に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図４６】実施例１９に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図４７】実施例１９に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【０００１】
本発明は、ＰＣＲにより核酸を増幅させる核酸増幅方法、及び、ＰＣＲにより一塩基多型を検出するための一塩基多型検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、ＰＣＲにより核酸を増幅させる核酸増幅方法が知られている。即ち、反応液中に、鋳型DNA、プライマーDNA、DNAポリメラーゼ等を混合して、鋳型DNAのうち、２種類のプライマーDNAによって挟まれた領域を特異的に増幅させ、特定の核酸を得るものである。
このような核酸増幅方法には、大腸菌（E.coli）等のRecAタンパク質を用いる方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
【特許文献１】
特許第３０１０７３８号公報（第１−４頁）
【０００４】
しかしながら、ＰＣＲ反応を行うと、所望の核酸（正しい特異的なＰＣＲ産物）だけでなく、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）も増幅される場合がある。さらに、このような場合において、ＰＣＲの条件を適宜変更しても、上記のような従来の方法では、なお副産物が増幅されることも少なくない。
【０００５】
本発明はかかる現状に鑑みてなされたものであって、ＰＣＲ反応において副産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅することができる核酸増幅方法、及び、ＰＣＲ反応において副産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅することができることを利用して一塩基多型を検出する一塩基多型検出方法を提供することを目的とする。
【発明の開示】
【０００６】
前記目的を達成するための解決手段は、ＰＣＲにより核酸を増幅させる核酸増幅方法であって、ＰＣＲ反応液中に、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）に由来するRecAタンパク質を含む相同的組換えタンパク質を混合すると共に、前記ＰＣＲ反応液中に、複数セットのプライマーDNAを加え、前記ＰＣＲ反応液中に、ATP-γSを加えて、ＰＣＲを行うことを特徴とする核酸増幅方法である。
【０００７】
本発明によれば、ＰＣＲ反応液中に、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）に由来するRecAタンパク質等の相同組み換えタンパク質を混合して、ＰＣＲを行い、所望の核酸を増幅させる。
このようにＰＣＲを行えば、所望の核酸（正しい特異的なＰＣＲ産物）の収量を減少させることなく、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。より具体的には、本発明によれば、ＰＣＲの条件を適宜変更することにより、プライマーDNAと鋳型DNAとの塩基のミスマッチが３塩基以内の場合においてのみ、特異的に核酸を増幅させるようにすることができる。さらには、ＰＣＲの条件を適宜変更することにより、プライマーDNAと鋳型DNAとの塩基のミスマッチが２塩基以内の場合においてのみ、特異的に核酸を増幅させるようにすることができる。またさらには、ＰＣＲの条件を適宜変更することにより、プライマーDNAと鋳型DNAとの塩基のミスマッチが１塩基の場合においてのみ、特異的に核酸を増幅させるようにすることも可能である。
【０００８】
また、本発明の核酸増幅方法によれば、ＰＣＲ反応液中に加えるプライマーDNAの濃度を低く抑えても、十分な量の核酸を増幅させることができ、しかも、プライマーDNAの濃度を低くすることにより、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸だけをより特異的に増幅させることが可能となる。
また、この核酸増幅方法は、上記のように特異性が高いため、アニーリング温度等、プライマー伸長反応の温度条件を変えても、所望の核酸を特異的に増幅させることができる。即ち、従来の核酸増幅方法では、アニーリング温度等、プライマー伸長反応の温度を低く設定すると、目的とする核酸だけでなく、副産物も多量に増幅されることとなるが、本発明によれば、目的とする核酸をより特異的に増幅させることが可能となる。
また、この核酸増幅方法では、ＰＣＲ反応液中に加えるDNAポリメラーゼの添加量を低く抑えても、従来の方法に比して、十分な量の核酸を増幅させることができる。
このように、本発明の核酸増幅方法では、所望の核酸をより特異的に増幅することができる。
【０００９】
さらに、本発明によれば、ＰＣＲ反応液中に複数の標的DNAのプライマーセットを混合し、同時に複数の異なったDNAを増幅するＰＣＲを行う。
従来の核酸増幅方法では、プライマーDNAの濃度をある程度高くしないと所望の核酸を増幅することが難しかったため、複数セットのプライマーDNAを加えることが困難であった。
これに対し、本発明では、上述した相同組み換えタンパク質を加えることにより、各プライマーDNAの濃度を低くしても、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸だけをより特異的に増幅させることができる。従って、複数の標的DNAのプライマーセットを混合することができ、しかも、このようにしてＰＣＲを行っても、副産物の増幅を抑えつつ、各プライマーセットに対応した所望の核酸だけをより特異的に増幅させることができる。
さらに、本発明によれば、ＰＣＲ反応液中に、前述の相同組換えタンパク質を混合した上、さらに、ATP-γSも加えて、ＰＣＲを行う。
このようにＰＣＲを行えば、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができる。なお、ATP-γSを加えた場合と同様に、ATPを加えても、ＰＣＲの特異性が増すと推測される。しかし、ATPは、上記の相同組み換えタンパク質によりADPに分解され、ADPは、上記の相同組み換えタンパク質がプライマーDNA等に結合するのを阻害する。このため、ATPを加えても、ＰＣＲの特異性が上がりにくい。従って、本発明のように、ADPに分解されないATP-γSをＰＣＲ反応液に加えるのが良い。
【００１０】
なお、上記の相同組み換えタンパク質は、プライマーDNA１μgあたり、０．１μg〜１００μgの範囲で混合するのが好ましく、更には１μg〜１０μgの範囲で混合するのが好ましい。このような範囲でＰＣＲを行えば、より効率よく特異的に、所望の核酸の増幅させることができるからである。
【００１１】
以下に、ＰＣＲ反応で用いられる種々の試薬について説明する。
鋳型DNAは、直鎖状で有れば、いかなるものを用いてもよい。即ち、いかなる塩基配列からなるものであってもよく、また、それらの鎖長に上限は存在しない。従って、例えば、３０００Mbpといわれるヒトゲノムの全長を持つような巨大なDNAであっても構わない。勿論、その由来は問われない。従って、ウィルスや微生物、動植物のゲノム由来のDNAやそれらを改変したDNAであっても、微生物等のもつプラスミド等やプラスミド等に異種のDNA断片を挿入したキメラDNA等であっても、あるいは、人工的に合成したオリゴヌクレオチドなどであっても構わない。また、鋳型DNAとしては、２本鎖DNAでも１本鎖DNAでも利用することができる。さらに、RNAを逆転写することで得られるcDNAを鋳型DNAとして利用することもできる。
【００１２】
プライマーDNAは、鋳型DNAのうち増幅すべき配列（領域）の両端に位置する相当数の配列と実質的に相補的であれば、いかなる塩基配列からなるものであってもよく、その由来も問われない。実質的に相補的な程度は、鋳型DNAに対する塩基のミスマッチが３塩基以内であるのが好ましく、さらには、塩基のミスマッチが２塩基以内、またさらには、塩基のミスマッチが１塩基以内、特に、１００％の相補性を有するのが好ましい。前述したように、T.th. RecAタンパク質等の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、プライマーDNAの相補性が低いと、所望の核酸が増幅されにくくなるからである。
【００１３】
なお、プライマーDNAは、各々のプライマーDNAあたり、最終濃度で０．０１μM〜１０μMの範囲で混合するのが好ましく、さらには、０．１μM〜１μMの範囲で混合するのが特に好ましい。このような範囲でＰＣＲを行えば、より効率よく特異的に、所望の核酸の増幅させることができるからである。また、プライマーDNAの濃度を従来よりも低くすることにより、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸だけをより特異的に増幅させることができる。
【００１４】
DNAポリメラーゼは、ＰＣＲにおいてDNA鎖を変性させる際の高温に短時間加熱されても永久的には不活性化されず、しかも、高温における活性を有するものが好適である。例えば、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、メタノサーマス・フェルビドゥス（Methanothermus fervidus）、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）、T.フラブス（T.flavus）、T.ラクテウス（T.lacteus）、T.ルベンス（T.rubens）、T.ルバー（T.ruber）及び T.サーモフィルス（T.thermophilus）などの高熱菌由来のDNAポリメラーゼや、デスルフロコッカス・モビリス（Desulfurococcus mobilis）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィルクム（Methanobacterium thermoautotrophilcum）、スルホロブス・ソルファタリクス（Sulfolobus solfataricus）、S.アシドカルダリウス（S.acidocaldarius）及びサーモプラスマ・アシドフィルム（Thermoplasma acidophilum）などの高熱性古細菌由来のDNAポリメラーゼなどが挙げられる。このうち、入手容易性等の理由から、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）由来のDNAポリメラーゼ（Taq DNAポリメラーゼ）や、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）由来のDNAポリメラーゼ（T.th. DNAポリメラーゼ）、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来のDNAポリメラーゼを利用するのが好ましい。
【００１５】
なお、例えば、Taq DNAポリメラーゼを使用する場合には、１００μl あたり、０．０５unit〜５０unitの範囲で混合するのが好ましく、さらには、０．５unit〜５unitの範囲で混合するのが特に好ましい。このような範囲でＰＣＲを行えば、より効率よく特異的に、所望の核酸の増幅させることができるからである。また、DNAポリメラーゼの添加量を低く抑えても、従来の方法に比して、十分な量の核酸を増幅させることができる。
【００１６】
さらに、上記のDNAポリメラーゼによる核酸増幅工程前の活性を阻害するために、DNAポリメラーゼに特異的な抗体をＰＣＲ反応液に混合するようにしてもよい。この抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え法により製造された抗体、化学的または組換え法により製造された抗体フラグメント（例えば、Fabフラグメント）が挙げられる。このうち、モノクローナル抗体を用いるのが特に好ましい。例えば、Taq DNAポリメラーゼに対する公知のモノクローナル抗体を用いれば、約２０℃〜４０℃の温度においてTaq DNAポリメラーゼの酵素活性を阻害することができると共に、ＰＣＲの熱的サイクルにおける高温によって不活性化される。
【００１７】
また、ＰＣＲは、一般に、４種類のdNTP、即ち、dATP、dCTP、dGTP及びdTTPの存在化において行う。
さらに、ＰＣＲは、一般に、適当な緩衝剤を含むＰＣＲ反応液中で行われる。効率よく核酸を増幅させるためである。緩衝液は、使用する相同組み換えタンパク質やDNAポリメラーゼ等により、反応の最適条件を得るため適宜変更することできる。例えば、ｐＨを適当に調整したトリス系の緩衝液に、塩化カリウムや塩化マグネシウムを加えた緩衝液を利用することができる。
【００１８】
また、ＰＣＲ反応液には、５％〜１０％のDMSOと１％〜２％のベタインを添加してもよい。鋳型DNAの二字構造により目的とする産物が増幅されにくい問題を最小限に留める効果を有するものである。このような変性剤に対し、大腸菌由来のRecAタンパク質等は耐性を有しないが、サーマス・サーモフィルスに由来するRecAタンパク質等は耐性を有するので、本発明において使用することが可能である。
また、ＰＣＲ反応液には、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）に由来するRecAタンパク質等の相同組み換えタンパク質に対する抗体を加えてもよい。
【００２１】
なお、ＰＣＲ反応液を調製する際には、T.th. RecAタンパク質をＰＣＲ反応液に加えた状態で、dNTPを加える前に、ATP-γSを加えるのが好ましい。このようにすることで、より効率よく所望の核酸を特異的に増幅することができる。その理由としては、先にdNTPを加えると、dNTPがT.th. RecAタンパク質が結合し、後から加えたATP-γSがT.th. RecAタンパク質に結合しにくくなるためであると考えられる。
ここで、ATP-γSの濃度は、目的に応じて適宜変更すればよいが、通常、０．０１mM〜１０mM、好ましくは、０．１mM〜１mMとするのが良い。
【００２２】
さらに、上記のいずれかに記載の核酸増幅方法であって、鋳型DNAが阻止的または抑制的２次構造の区域を有することを特徴とする核酸増幅方法とすると良い。
【００２３】
本発明によれば、鋳型DNAが阻止的または抑制的二次構造の区域を有する。即ち、鋳型DNAは、一般的なＰＣＲを行った場合に、核酸の増幅が阻止または抑制される２次構造をなす区域を有する。従って、従来のＰＣＲでは、このような区域を有する所望の核酸を、効率よく特異的に増幅させることは困難であった。
これに対し、本発明では、前述の相同組換えタンパク質を混合してＰＣＲを行うので、鋳型DNAにこのような阻止的または抑制的２次構造の区域がある場合であっても、所望の核酸を効率よく特異的に増幅させることができる。その理由は、相同組み換えタンパク質が、鋳型DNAに結合することにより、阻止的または抑制的２次構造が解かれるためであると考えられる。
【００２４】
さらに、上記のいずれかに記載の核酸増幅方法であって、前記ＰＣＲ反応液中に、KClを加えて、ＰＣＲを行うことを特徴とする核酸増幅方法とすると良い。
【００２５】
本発明によれば、ＰＣＲ反応液中にKClを加えて、ＰＣＲを行う。このようにＰＣＲを行えば、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができる。
ここで、KClの濃度は、目的に応じて適宜変更すればよいが、通常、１mM〜１０００mM、好ましくは、１０mM〜１００mMとするのが良い。
【００２６】
さらに、上記のいずれかに記載の核酸増幅方法であって、前記ＰＣＲ反応液中に、Mg2+ を加えて、ＰＣＲを行うことを特徴とする核酸増幅方法とすると良い。
【００２７】
本発明によれば、ＰＣＲ反応液中にMg2+ を加えて、ＰＣＲを行う。このようにＰＣＲを行えば、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができる。Mg2+ を加えることで、上述した相同組み換えタンパク質のDNAに対する親和性が向上するためであると考えられる。
ここで、Mg2+ の濃度は、目的に応じて適宜変更すればよいが、通常、０．１mM〜１００mM、好ましくは、３mM〜１０mMとするのが良い。
【００２８】
また、他の解決手段は、一塩基多型を検出するための一塩基多型検出方法であって、鋳型DNAのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAを用い、ＰＣＲ反応液に、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）のRecAタンパク質を含む相同的組換えタンパク質を混合すると共に、前記ＰＣＲ反応液中に、ATP-γSを加えて、ＰＣＲを行い、所望の核酸の増幅により一塩基多型を検出することを特徴とする一塩基多型検出方法である。
【００２９】
本発明によれば、プライマーDNAの１つには、鋳型DNAのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAを用いる。そして、ＰＣＲ反応液中に、T.th. RecAタンパク質等の相同組み換えタンパク質を混合して、ＰＣＲを行う。このようにＰＣＲを行えば、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全に相補的である場合に、所望の核酸を増幅させるようにすることができる。一方、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全には相補的ではない場合、即ち、一塩基多型をなす塩基がプライマーDNAと相補的でない場合に、所望の核酸が増幅しない、または、抑制されるようにすることができる。このため、ＰＣＲによる所望の核酸の増幅により、一塩基多型を検出することが可能である。
【００３１】
さらに、本発明によれば、ＰＣＲ反応液中に、前述の相同組換えタンパク質を混合した上、さらに、ATP-γSも加えて、ＰＣＲを行う。このようにＰＣＲを行えば、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができるため、一塩基多型をより確実に検出することが可能となる。
【００３２】
さらに、上記のいずれかに記載の一塩基多型検出方法であって、前記ＰＣＲ反応液中に、KClを加えて、ＰＣＲを行うことを特徴とする一塩基多型検出方法とすると良い。
【００３３】
このようにＰＣＲを行えば、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができるため、一塩基多型をより確実に検出することが可能となる。
【００３４】
さらに、上記のいずれかに記載の一塩基多型検出方法であって、前記ＰＣＲ反応液中に、Mg2+ を加えて、ＰＣＲを行うことを特徴とする一塩基多型検出方法とすると良い。
【００３５】
このようにＰＣＲを行えば、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができるため、一塩基多型をより確実に検出することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下、本発明の実施例を、図を参照しつつ説明する。
【実施例１】
第１図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA（Promega）を用意した。また、プライマーDNAとして１６種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド１〜１６）を用意した。これらのプライマーDNAは、Homo sapiens PAC clone RP5-852P6 from 7p11.2-p21, complete sequence.（ACCESSION AC006454）を参考にして設計した。なお、ACCESSION ナンバーは、Gene Bankのアクセスナンバーを示している（以下同様）。各プライマーDNAは、任意のプライマー設計の可能性を示すため、それぞれ位置をずらして設計してある。また、各プライマーDNAは、鋳型DNAと１００％相補的な２０merの塩基配列からなる。なお、各プライマーDNAは、鋳型DNAの塩基配列に基づいて公知の手法により合成すればよい。
【００３７】
オリゴヌクレオチド１：
5'-ggtgcactcc atcatgctta-3'
オリゴヌクレオチド２：
5'-catcagt cagaggggct cac-3'
オリゴヌクレオチド３：
5'-cccacatccc tggcaggaat-3'
オリゴヌクレオチド４：
5'-tgcaggt gtgggcctag ctg-3'
オリゴヌクレオチド５：
5'-tgtcctgggc cccagcagga-3'
オリゴヌクレオチド６：
5'-ggggtct tgctgtgggc agg-3'
オリゴヌクレオチド７：
5'-gagatgcccc cccatactgc-3'
オリゴヌクレオチド８：
5'-atctgtc ccctctcctc ctg-3'
オリゴヌクレオチド９：
5'-aggtgtgcag agtgcaaagc-3'
オリゴヌクレオチド１０：
5'-gcttcaa ggcagaggcc agg-3'
オリゴヌクレオチド１１：
5'-tccaggtggc ccccaagcag-3'
オリゴヌクレオチド１２：
5'-atctctc ttgccttggg gtg-3'
オリゴヌクレオチド１３：
5'-gtgtgctggg aggaggggcc-3'
オリゴヌクレオチド１４：
5'-gtcacta aacaggggct caa-3'
オリゴヌクレオチド１５：
5'-cgtgtgggag gagcaggcag-3'
オリゴヌクレオチド１６：
5'-gccagaa tgttcccctg gag-3'
【００３８】
また、相同組み換えタンパク質としてサーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）のRecAタンパク質を用意し、DNAポリメラーゼとしてサーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）由来のDNAポリメラーゼ（TaKaRa Taq（タカラバイオ））を用意した。また、４種類のdNTP、即ち、dATP、dCTP、dGTP及びdTTPを用意し、緩衝剤としてｐＨを調整したトリス系の緩衝液に、塩化カリウムや塩化マグネシウムを加えた緩衝液を用意した。
なお、DNAポリメラーゼと、４種類のdNTPと、緩衝液と、T.th. RecAタンパク質等の相同組換えタンパク質とは、核酸増幅用試薬キットとして用意しておくのが便利である。このようなキットを利用すれば、DNAポリメラーゼ、４種類のdNTP、緩衝液、及び、T.th. RecAタンパク質等の相同的組換えタンパク質を反応液に加え、さらに、目的に応じた鋳型DNAとプライマーDNAを用意して反応液に加えるだけで、容易にＰＣＲを行うことができるからである。
【００３９】
次に、ＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。具体的には、１０μlのＰＣＲ反応液中に、０．０６μM（最終濃度）の２種類のオリゴヌクレオチドと、４０ngのヒトゲノムDNAと、１．０unitの TaKaRa Taq と、０．２mMのdNTP混合液と、１．２μgのT.th. RecAタンパク質を、１０mMの Tris-HCl Buffer（pH８．３）、５０mMのKCl、１．５mMのMgCl2 に混合した。そして、ＰＣＲ反応を、１サイクル（７０℃，１０分間、９４℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、６０℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）で行った。
次に、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、アガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してゲル中のDNAを染色し、その後、染色されたDNAを写真に記録した。その結果を第２図に示す。
【００４０】
レーン１は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド１とオリゴヌクレオチド２を加えたものである。
レーン２は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド３とオリゴヌクレオチド４を加えたものである。
レーン３は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド５とオリゴヌクレオチド６を加えたものである。
レーン４は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド７とオリゴヌクレオチド８を加えたものである。
レーン５は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド９とオリゴヌクレオチド１０を加えたものである。
レーン６は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド１１とオリゴヌクレオチド１２を加えたものである。
レーン７は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド１３とオリゴヌクレオチド１４を加えたものである。
レーン８は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド１５とオリゴヌクレオチド１６を加えたものである。
レーン９は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１３は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１４は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１５は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１６は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１７は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１８は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１９は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２０は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２１は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２２は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２３は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２４は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２５は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２６は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２７は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２８は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２９は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン１３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３０は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン１４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３１は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン１５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３２は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．２０μM（最終濃度）に増やして、レーン１６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【００４１】
第２図（Ａ）の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン８では、所望の核酸（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）の増幅はほとんど検出されなかった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン９〜レーン１６では、所望の核酸のみならず副産物も多量に検出された。また、所望の核酸の増幅がほとんど検出されないものもあった（レーン１５，１６等）。この理由としては、鋳型DNAのうち増幅されるべき領域が、阻止的または抑制的２次構造を有するためと考えられる。
また、第２図（Ｂ）の結果から明らかなように、プライマーDNAの濃度を増加させ、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１７〜レーン２４でも、所望のDNAの増幅が検出された。しかし、レーン１〜レーン８の結果に比べると、副産物が若干検出されたものも多い。
一方、プライマーDNAの濃度を増加させ、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン２５〜レーン３２では、対応するレーン９〜レーン１６の結果に比べ、副産物がさらに多量に検出された。
【００４２】
これらのことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、T.th. RecAタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
また、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、鋳型DNAに阻止的または抑制的２次構造を有する場合であっても、所望の核酸を効率よく特異的に増幅させることができる。相同組み換えタンパク質が、鋳型DNAに結合することにより、阻止的または抑制的２次構造が解かれるためと考えられる。
また、反応液中に加えるプライマーDNAの濃度（０．０６μM）を低く抑えても、十分な量の核酸を増幅させることができ、しかも、プライマーDNAの濃度を低くすることにより、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸だけをより特異的に増幅させることが可能となる。
【００４３】
【実施例２】
次いで、第２の実施例について説明する。なお、上記実施例１と同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第３図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNAを、プライマーDNAとして１２種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド１７〜２８）を用意した。これらのプライマーDNAは、Homo sapiens BAC clone RP11-16P10 from 7, complete sequence.（ACCESSION AC093734 AC011786）を参考にして設計した。各プライマーDNAは、任意のプライマー設計の可能性を示すため、それぞれ位置をずらして設計してある。なお、各プライマーDNAは、鋳型DNAと１００％相補的な２０merの塩基配列からなる。
【００４４】
オリゴヌクレオチド１７：
5'-cgggtgc acacaaaggc tgg-3'
オリゴヌクレオチド１８：
5'-tctctggcca ggtgcctggc-3'
オリゴヌクレオチド１９：
5'-cgccccg acaaccctga ccc-3'
オリゴヌクレオチド２０：
5'-cttgggaaga tcctgagact-3'
オリゴヌクレオチド２１：
5'-tcggtaa acgctggctc ccg-3'
オリゴヌクレオチド２２：
5'-caaaacgccc cccaccgccc-3'
オリゴヌクレオチド２３：
5'-ggtttac cagcacctgg gga-3'
オリゴヌクレオチド２４：
5'-cccatcgtgg tctaggggat-3'
オリゴヌクレオチド２５：
5'-gaagtgg cccggaagac ggt-3'
オリゴヌクレオチド２６：
5'-gcagcgccct tcccacccct-3'
オリゴヌクレオチド２７：
5'-gcacacg ccttgtagac agc-3'
オリゴヌクレオチド２８：
5'-ctgattctcc agggtgggct-3'
【００４５】
次に、上記実施例１のレーン１等と同様な条件でＰＣＲ反応を行った。そして、その反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第４図に示す。
【００４６】
レーン１は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド１７とオリゴヌクレオチド１８を加えたものである。
レーン２は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド１９とオリゴヌクレオチド２０を加えたものである。
レーン３は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド２１とオリゴヌクレオチド２２を加えたものである。
レーン４は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド２３とオリゴヌクレオチド２４を加えたものである。
レーン５は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド２５とオリゴヌクレオチド２６を加えたものである。
レーン６は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド２７とオリゴヌクレオチド２８を加えたものである。
レーン７は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【００４７】
第４図の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン６では、所望の核酸（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、多くのレーンでは、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）はほとんど検出されなかった。また、副産物が検出されたレーンでも、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーンに比べれば、副産物の生成が大幅に抑制された。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン７〜レーン１２では、所望の核酸のみならず副産物も多量に検出された。
このことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、T.th. RecAタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
また、反応液中に加えるプライマーDNAの濃度（０．０６μM）を低く抑えても、十分な量の核酸を増幅させることができ、しかも、プライマーDNAの濃度を低くすることにより、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸だけをより特異的に増幅させることが可能となる。
【００４８】
【実施例３】
次いで、第３の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
第５図及び第６図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNAを、プライマーDNAとして８種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド２９〜３６）を用意した。これらのプライマーDNAは、ヒトゲノムDNAの single copy gene について設計した。具体的には、オリゴヌクレオチド２９とオリゴヌクレオチド３０は、Human DNA sequence from clone RP5-1013A22 on chromosome 20 Contains the HNF4A (hepatic nuclear factor 4, alpha) gene, part of a novel gene encoding a protein similar to cellular retinaldehyde-binding protein, a RPL37A (ribosomal protein L37a) pseudogene, parts of 2 novel genes, ESTs, STSs and GSSs, complete sequence.（ACCESSION AL132772）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド３１とオリゴヌクレオチド３２は、Homo sapiens 3q BAC RP11-529F4 (Roswell Park Cancer Institute Human BAC Library) complete sequence.（ACCESSION AC080007）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド３３とオリゴヌクレオチド３４は、Homo sapiens genomic beta globin region (HBB@) on chromosome 11.（ACCESSION NG_000007）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド３５とオリゴヌクレオチド３６は、Homo spaiens HPFH6OR gene for olfactory receptor.（ACCESSION X81445 X91835）を参考にして設計した。各プライマーDNAは、鋳型DNAと１００％相補的な２０mer〜２５merの塩基配列からなる。
【００４９】
オリゴヌクレオチド２９：
5'-gcatctgggg cctgggattt ag-3'
オリゴヌクレオチド３０：
5'-tacaaggcag gcatcatgac tcacg-3'
オリゴヌクレオチド３１：
5'-aggagcttag gagggggagg t-3'
オリゴヌクレオチド３２：
5'-cattgacagg acaggagaag gga-3'
オリゴヌクレオチド３３：
5'-ctttttgttc ccccagacac tc-3'
オリゴヌクレオチド３４：
5'-gcactggctt aggagttgga ct-3'
オリゴヌクレオチド３５：
5'-gttaatacct aaggctctac tgca-3'
オリゴヌクレオチド３６：
5'-aggcaatggc ggcacccatc-3'
【００５０】
次に、プライマーDNAの濃度以外は上記実施例１等と同じ条件で反応液を作成した。そして、ＰＣＲ反応を、１サイクル（９４℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、６０℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）で行った。その後、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１等と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第７図及び第８図に示す。
【００５１】
レーン１は、プライマーDNAとして、０．３μM（最終濃度）のオリゴヌクレオチド２９と０．３μM（最終濃度）のオリゴヌクレオチド３０を加えたものである。
レーン２は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３は、オリゴヌクレオチド２９とオリゴヌクレオチド３０の濃度をそれぞれ０．１μM（最終濃度）に減らして、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン５は、オリゴヌクレオチド２９とオリゴヌクレオチド３０の濃度をそれぞれ０．０３μM（最終濃度）に減らして、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、オリゴヌクレオチド２９とオリゴヌクレオチド３０の濃度をそれぞれ０．０１μM（最終濃度）に減らして、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、オリゴヌクレオチド２９とオリゴヌクレオチド３０の濃度をそれぞれ０．００３μM（最終濃度）に減らして、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、プライマーDNAとして、０．３μM（最終濃度）のオリゴヌクレオチド３１と０．３μM（最終濃度）のオリゴヌクレオチド３２を加えたものである。
レーン１２は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１３は、オリゴヌクレオチド３１とオリゴヌクレオチド３２の濃度をそれぞれ０．１μM（最終濃度）に減らして、レーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１４は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１５は、オリゴヌクレオチド３１とオリゴヌクレオチド３２の濃度をそれぞれ０．０３μM（最終濃度）に減らして、レーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１６は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１７は、オリゴヌクレオチド３１とオリゴヌクレオチド３２の濃度をそれぞれ０．０１μM（最終濃度）に減らして、レーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１８は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１９は、オリゴヌクレオチド３１とオリゴヌクレオチド３２の濃度をそれぞれ０．００３μM（最終濃度）に減らして、レーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２０は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２１は、プライマーDNAとして、０．３μM（最終濃度）のオリゴヌクレオチド３３と０．３μM（最終濃度）のオリゴヌクレオチド３４を加えたものである。
レーン２２は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２３は、オリゴヌクレオチド３３とオリゴヌクレオチド３４の濃度をそれぞれ０．１μM（最終濃度）に減らして、レーン２１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２４は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２５は、オリゴヌクレオチド３３とオリゴヌクレオチド３４の濃度をそれぞれ０．０３μM（最終濃度）に減らして、レーン２１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２６は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２７は、オリゴヌクレオチド３３とオリゴヌクレオチド３４の濃度を０．０１μM（最終濃度）に減らして、レーン２１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２８は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２９は、オリゴヌクレオチド３３とオリゴヌクレオチド３４の濃度を０．００３μM（最終濃度）に減らして、レーン２１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３０は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３１は、プライマーDNAとして、０．３μM（最終濃度）のオリゴヌクレオチド３５と０．３μM（最終濃度）のオリゴヌクレオチド３６を加えたものである。
レーン３２は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３３は、オリゴヌクレオチド３５とオリゴヌクレオチド３６の濃度をそれぞれ０．１μM（最終濃度）に減らして、レーン３１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３４は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３５は、オリゴヌクレオチド３５とオリゴヌクレオチド３６の濃度をそれぞれ０．０３μM（最終濃度）に減らして、レーン３１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３６は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３７は、オリゴヌクレオチド３５とオリゴヌクレオチド３６の濃度をそれぞれ０．０１μM（最終濃度）に減らして、レーン３１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３８は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３９は、オリゴヌクレオチド３５とオリゴヌクレオチド３６の濃度をそれぞれ０．００３μM（最終濃度）に減らして、レーン３１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４０は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【００５２】
第７図（Ａ）の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１，３，５，７，９のうち、レーン９を除くレーンでは、所望の核酸（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）はほとんど検出されなかった。特に、プライマーDNAの濃度が低くなるほど、副産物の生成は抑制される傾向にあった。また、レーン９では、プライマーDNAの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。また、プライマーDNAの濃度が同じであれば、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったものに比べ、所望の核酸の増幅量が多くなった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン２，４，６，８，１０のうち、レーン１０を除くレーンでは、所望の核酸のみならず副産物も検出された。また、レーン１０では、プライマーDNAの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
【００５３】
第７図（Ｂ）の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１１，１３，１５，１７，１９のうち、レーン１９を除くレーンでは、所望の核酸の増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。特に、プライマーDNAの濃度が低くなるほど、副産物の生成は抑制される傾向にあった。また、レーン１９では、プライマーDNAの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。また、プライマーDNAの濃度が同じであれば、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったものに比べ、所望の核酸の増幅量が多くなった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン１２，１４，１６，１８，２０のうち、レーン２０を除くレーンでは、所望の核酸のみならず副産物も検出された。また、レーン２０では、プライマーDNAの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
【００５４】
第８図（Ａ）の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン２１，２３，２５，２７，２９のうち、レーン２９を除くレーンでは、所望の核酸の増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。特に、プライマーDNAの濃度が低くなるほど、副産物の生成は抑制される傾向にあった。また、レーン２９では、プライマーDNAの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。また、プライマーDNAの濃度が同じであれば、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったものに比べ、所望の核酸の増幅量が多くなる傾向にあった。
一方、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン２２，２４，２６，２８，３０のうち、レーン２２，２４，２６では、所望の核酸のみならず副産物も検出された。また、レーン２８，３０では、プライマーDNAの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
【００５５】
第８図（Ｂ）の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン３１，３３，３５，３７，３９のうち、レーン３９を除くレーンでは、所望の核酸の増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。特に、プライマーDNAの濃度が低くなるほど、副産物の生成は抑制される傾向にあった。また、レーン３９では、プライマーDNAの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。また、プライマーDNAの濃度が同じであれば、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったものに比べ、所望の核酸の増幅量が多くなる傾向にあった。
一方、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン３２，３４，３６，３８，４０のうち、レーン４０を除くレーンでは、所望の核酸のみならず副産物も検出された。また、レーン４０では、プライマーDNAの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
【００５６】
これらのことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、T.th. RecAタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
また、反応液中に加えるプライマーDNAの濃度を低く抑えても、十分な量の核酸を増幅させることができ、しかも、プライマーDNAの濃度を低くすることにより、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸だけをより特異的に増幅させることが可能となる。
【００５７】
【実施例４】
次いで、第４の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
第９図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNAを用意し、プライマーDNAとして５種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド３７〜４１）を用意した。これらのプライマーDNAは、Homo sapiens PAC clone RP5-1142J19 from 7q35-q36, complete sequence.（ACCESSION AC004975）を参考にして設計した。
プライマーDNAのうち、オリゴヌクレオチド３７，３８は、鋳型DNAと１００％相補的な２０merまたは２１merの塩基配列からなる。一方、オリゴヌクレオチド３９は、鋳型DNAと１塩基だけ異なる塩基配列からなり、それ以外の部分はオリゴヌクレオチド３７と同様である。また、オリゴヌクレオチド４０は、鋳型DNAに対し３塩基について異なる塩基配列からなり、それ以外の部分はオリゴヌクレオチド３７と同様である。また、オリゴヌクレオチド４１は、鋳型DNAに対し５塩基について異なる塩基配列からなり、それ以外の部分はオリゴヌクレオチド３７と同様である。
【００５８】
オリゴヌクレオチド３７：
5'-gcaggcacca agaactactg c-3'
オリゴヌクレオチド３８：
5'-gcctaaggtc acgttgtccc-3'
オリゴヌクレオチド３９：
5'-gcaggcacca ggaactactg c-3'
オリゴヌクレオチド４０：
5'-gcaggcgcca ggaagtactg c-3'
オリゴヌクレオチド４１：
5'-gcgggcgcca ggaagtacgg c-3'
【００５９】
次に、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．３μM（最終濃度）とし、それ以外は上記実施例３と同様にしてＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。そして、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１等と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第１０図に示す。
【００６０】
レーン１は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド３７とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン２は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド３９とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン３は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド４０とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン４は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド４１とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン５は、１mM（最終濃度）のATP-γS（ロッシュ）をさらに加えて、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【００６１】
第１０図の結果から明らかなように、ATP-γSを加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン４について見ると、レーン１〜レーン３では、所望のDNA（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）はほとんど検出されなかった。一方、レーン４では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
これに対し、ATP-γSを加えてＰＣＲ反応を行ったレーン５〜レーン８について見ると、レーン５とレーン６では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。一方、レーン７とレーン８では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
【００６２】
このことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
具体的には、ATP-γSの非存在下では、プライマーDNAと鋳型DNAとの塩基のミスマッチが３塩基以内の場合においてのみ、特異的に核酸を増幅させるようにすることができる。従って、T.th. RecAタンパク質を反応液に加えることにより、所望の核酸をより特異的に増幅することができる。
一方、ATP-γSの存在下では、プライマーDNAと鋳型DNAとの塩基のミスマッチが１塩基以内の場合においてのみ、特異的に核酸を増幅させるようにすることができる。従って、ATP-γSを反応液に加えることにより、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができる。
なお、DNAポリメラーゼと、４種類のdNTPと、緩衝液と、T.th. RecAタンパク質等の相同組換えタンパク質とを核酸増幅用試薬キットとして用意する場合には、さらに、ATP-γSも、そのキットに加えるのが好ましい。上記の実施例４で明らかなように、ATP-γSを加えてＰＣＲ反応を行えば、さらに特異的に所望の核酸を増幅させることができるからである。
【００６３】
また、上記実施例４の結果より、一塩基多型を検出することが可能である。即ち、プライマーDNAの１つに、鋳型DNAのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAを用いてＰＣＲを行えば、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全に相補的である場合に、所望の核酸を増幅させるようにすることができる。一方、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全には相補的ではない場合、即ち、一塩基多型をなす塩基がプライマーDNAと相補的でない場合に、所望の核酸が増幅しない、または、抑制されるようにすることができる。このため、ＰＣＲによる所望の核酸の増幅により、一塩基多型を検出することが可能である。
【００６４】
さらに、ATP-γSを加えた場合には、より特異的に核酸を増幅することができるため、所望の核酸の増幅により、より確実に一塩基多型を検出することが可能となる。
なお、DNAポリメラーゼと、４種類のdNTPと、緩衝液と、T.th. RecAタンパク質等の相同的組換えタンパク質とは、一塩基多型検出用試薬キットとして用意しておくのが便利である。このようなキットを利用すれば、DNAポリメラーゼ、４種類のdNTP、緩衝液、及び、T.th. RecAタンパク質等の相同的組換えタンパク質を反応液に加え、さらに、目的に応じた鋳型DNAとプライマーDNAを用意して反応液に加えるだけで、容易にＰＣＲにより一塩基多型を検出することができるからである。
そしてさらに、上記キットには、ATP-γSも加えるのが好ましい。上記の実施例４で明らかなように、ATP-γSを加えてＰＣＲ反応を行えば、さらに特異的に所望の核酸を増幅させることができるため、より確実に一塩基多型を検出することが可能となるからである。
【００６５】
【実施例５】
次いで、第５の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
第１１図及び第１２図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNAを、プライマーDNAとして１２種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド４２〜５３）を用意した。具体的には、オリゴヌクレオチド４２とオリゴヌクレオチド４３は、Homo sapiens PAC clone RP5-1142J19 from 7q35-q36, complete sequence.（ACCESSION AC004975）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド４４とオリゴヌクレオチド４５は、Homo sapiens PAC clone RP5-852P6 from 7p11.2-p21, complete sequence.（ACCESSION AC006454）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド４６とオリゴヌクレオチド４７は、Homo sapiens PAC clone RP5-912I13 from 7, complete sequence.（ACCESSION AC008060）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド４８とオリゴヌクレオチド４９は、Homo sapiens BAC clone RP11-16P10 from 7, complete sequence.（ACCESSION AC093734 AC011786）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド５０とオリゴヌクレオチド５１は、Homo sapiens BAC clone CTB-135C18 from 7q11.2-q22, complete sequence.（ACCESSION AC005164）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド５２とオリゴヌクレオチド５３は、Homo sapiens PAC clone RP5-852P6 from 7p11.2-p21, complete sequence.（ACCESSION AC006454）を参考にして設計した。各プライマーDNAは、鋳型DNAと１００％相補的な１８mer〜２２merの塩基配列からなる。
【００６６】
オリゴヌクレオチド４２：
5'-gcaggcacca agaactactg c-3'
オリゴヌクレオチド４３：
5'-gcctaaggtc acgttgtccc-3'
オリゴヌクレオチド４４：
5'-catggcacct gctctgagac-3'
オリゴヌクレオチド４５：
5'-ggcactttgt gcctctctcc-3'
オリゴヌクレオチド４６：
5'-ccgagtcgca tgggtgag-3'
オリゴヌクレオチド４７：
5'-tttgtgcaag gaattgtggg-3'
オリゴヌクレオチド４８：
5'-atctgtgtgg ttcggctctg-3'
オリゴヌクレオチド４９：
5'-ctcccttaac agcagcctcc-3'
オリゴヌクレオチド５０：
5'-caaagctact ttcacagcct cc-3'
オリゴヌクレオチド５１：
5'-ggcatattca gccaaggatt tc-3'
オリゴヌクレオチド５２：
5'-tttctggaag ggactgggtc-3'
オリゴヌクレオチド５３：
5'-tcccaggatc catggagaag-3'
【００６７】
次に、上記実施例４と同様な条件でＰＣＲ反応を行い、核酸を増幅させた。そして、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１等と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第１３図及び第１４図に示す。
なお、このＰＣＲの温度条件、即ち、１サイクル（９４℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、６０℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）を温度条件１とする。アニーリング温度は６０℃である。
【００６８】
レーン１は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド４２とオリゴヌクレオチド４３を加えたものである。
レーン２は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド４４とオリゴヌクレオチド４５を加えたものである。
レーン３は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド４６とオリゴヌクレオチド４７を加えたものである。
レーン４は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド４８とオリゴヌクレオチド４９を加えたものである。
レーン５は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド５０とオリゴヌクレオチド５１を加えたものである。
レーン６は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド５２とオリゴヌクレオチド５３を加えたものである。
レーン７は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１３〜レーン２４は、ＰＣＲの温度条件を、１サイクル（９４℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、５５℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）とした。これを温度条件２とする。アニーリング温度は５５℃である。
レーン１３は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１４は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１５は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１６は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１７は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１８は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１９は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２０は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２１は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２２は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２３は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２４は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２５〜レーン３６は、ＰＣＲの温度条件を、１サイクル（９４℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、５０℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）とした。これを温度条件３とする。アニーリング温度は５０℃である。
レーン２５は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２６は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２７は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２８は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２９は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３０は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３１は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３２は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３３は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３４は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３５は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３６は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３７〜レーン４８は、ＰＣＲの温度条件を、１サイクル（９４℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、４５℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）とした。これを温度条件４とする。アニーリング温度は４５℃である。
レーン３７は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３８は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３９は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４０は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４１は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４２は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４３は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４４は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４５は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４６は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４７は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４８は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【００６９】
第１３図（Ａ）の結果から明らかなように、アニーリング温度が６０℃の場合、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン６では、所望の核酸（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）はほとんど検出されなかった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン７〜レーン１２のうち、一部のレーンでは、所望の核酸のみならず副産物も若干検出された。また、一部のレーンでは、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。これは、鋳型DNAの増幅領域に阻止的または抑制的２次構造を有するためと考えられる。
【００７０】
また、第１３図（Ｂ）の結果から明らかなように、アニーリング温度が５５℃の場合でも、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１３〜レーン１８では、所望の核酸の増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン１９〜レーン２４のうち、一部のレーンでは、所望の核酸のみならず副産物も若干検出された。また、一部のレーンでは、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。これは、鋳型DNAの増幅領域に阻止的または抑制的２次構造を有するためと考えられる。
【００７１】
第１４図（Ａ）の結果から明らかなように、アニーリング温度が５０℃の場合、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン２５〜レーン３０のうち、一部のレーンでは、所望の核酸の増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。また、一部のレーンでは、所望の核酸の増幅のみならず副産物も検出された。但し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったものと比べると、副産物の増幅量は少なかった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン３１〜レーン３６のうち、一部のレーンでは、所望の核酸のみならず副産物も多量に検出された。また、一部のレーンでは、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。これは、鋳型DNAの増幅領域に阻止的または抑制的２次構造を有するためと考えられる。
【００７２】
また、第１４図（Ｂ）の結果から明らかなように、アニーリング温度が４５℃の場合、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン３７〜レーン４２では、所望の核酸の増幅が見られたが、副産物も検出された。但し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったものと比べると、副産物の増幅量は少なかった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン４３〜レーン４８のうち、一部のレーンでは、所望の核酸のみならず副産物も多量に検出された。また、一部のレーンでは、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。これは、鋳型DNAの増幅領域に阻止的または抑制的２次構造を有するためと考えられる。
【００７３】
これらのことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲを行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
また、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、鋳型DNAに阻止的または抑制的２次構造を有する場合であっても、所望の核酸を効率よく特異的に増幅させることができる。相同組み換えタンパク質が、鋳型DNAに結合することにより、阻止的または抑制的２次構造が解かれるためと考えられる。
また、ＰＣＲの特異性が高いため、プライマー伸長反応の温度条件（アニーリング温度）を変えても、所望の核酸を特異的に増幅させることができる。即ち、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行った場合には、プライマー伸長反応の温度（アニーリング温度）を低く設定すると、目的とする核酸だけでなく、副産物も多量に増幅されることとなるが、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、目的とする核酸をより特異的に増幅させることが可能となる。
【００７４】
【実施例６】
次いで、第６の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
鋳型DNAとしてヒトゲノムDNAを用意し、プライマーDNAとして、上記実施例４と同様な５種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド３７〜４１）（第９図参照）と、第１５図に示すように５種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド５４〜５８）を用意した。
第１５図に示すように、後者の５種類のプライマーDNAは、Homo sapiens BAC clone CTB-135C18 from 7q11.2-q22, complete sequence.（ACCESSION AC005164）を参考にして設計した。これらのプライマーDNAのうち、オリゴヌクレオチド５４とオリゴヌクレオチド５５は、鋳型DNAと１００％相補的な２２merの塩基配列からなる。一方、オリゴヌクレオチド５６は、鋳型DNAと１塩基だけ異なる塩基配列からなり、それ以外の部分はオリゴヌクレオチド５４と同様である。また、オリゴヌクレオチド５７は、鋳型DNAに対し３塩基について異なる塩基配列からなり、それ以外の部分はオリゴヌクレオチド５４と同様である。また、オリゴヌクレオチド５８は、鋳型DNAに対し５塩基について異なる塩基配列からなり、それ以外の部分はオリゴヌクレオチド５４と同様である。
【００７５】
オリゴヌクレオチド５４：
5'-caaagctact ttcacagcct cc-3'
オリゴヌクレオチド５５：
5'-ggcatattca gccaaggatt tc-3'
オリゴヌクレオチド５６：
5'-caaagctact tgcacagcct cc-3'
オリゴヌクレオチド５７：
5'-caaagctgct tgcacggcct cc-3'
オリゴヌクレオチド５８：
5'-caaggctgct tgcacggccg cc-3'
【００７６】
次に、上記実施例４等と同様な条件でＰＣＲ反応を行い、核酸を増幅させた。そして、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１等と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第１６図に示す。
【００７７】
レーン５は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド３７とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン６は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド３９とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン７は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド４０とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン８は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド４１とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン９は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、かつ、１mM（最終濃度）のATP-γSを加えて、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、かつ、１mM（最終濃度）のATP-γSを加えて、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、かつ、１mM（最終濃度）のATP-γSを加えて、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、かつ、１mM（最終濃度）のATP-γSを加えて、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１７は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド５４とオリゴヌクレオチド５５を加えたものである。
レーン１８は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド５６とオリゴヌクレオチド５５を加えたものである。
レーン１９は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド５７とオリゴヌクレオチド５５を加えたものである。
レーン２０は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド５８とオリゴヌクレオチド５５を加えたものである。
レーン２１は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン１７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２２は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン１８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２３は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン１９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２４は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン２０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１３は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、かつ、１mM（最終濃度）のATP-γSを加えて、それ以外はレーン１７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１４は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、かつ、１mM（最終濃度）のATP-γSを加えて、それ以外はレーン１８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１５は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、かつ、１mM（最終濃度）のATP-γSを加えて、それ以外はレーン１９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１６は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、かつ、１mM（最終濃度）のATP-γSを加えて、それ以外はレーン２０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【００７８】
第１６図（Ａ）の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加え、かつ、ATP-γSを加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン５〜レーン８について見ると、所望のDNA（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）はほとんど検出されなかった。また、レーン５及びレーン６に比べ、レーン７では所望の核酸の増幅が少なく、さらに、レーン８では所望の核酸の増幅が少なかった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加え、かつ、ATP-γSも加えてＰＣＲ反応を行ったレーン９〜レーン１２について見ると、レーン９〜レーン１１では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。一方、レーン１２では、核酸の増幅が検出できなかった。また、レーン９及びレーン１０に比べ、レーン１１では、所望の核酸の増幅が少なかった。さらに、このレーン１１は、上記レーン７と比べても、所望の核酸の増幅が少なかった。
他方、T.th. RecAタンパク質を加えずに、ATP-γSを加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン４について見ると、所望のDNAの増幅のみならず副産物も多量に増幅された。
【００７９】
また、第１６図（Ｂ）の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加え、かつ、ATP-γSを加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン１７〜レーン２０について見ると、レーン１７〜レーン１９では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。一方、レーン２０では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。また、レーン１７及びレーン１８に比べ、レーン１９では、所望の核酸の増幅が少なかった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加え、かつ、ATP-γSも加えてＰＣＲ反応を行ったレーン２１〜レーン２４について見ると、レーン２１では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。一方、レーン２２〜レーン２４では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
他方、T.th. RecAタンパク質を加えずに、ATP-γSを加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１３〜レーン１６について見ると、所望のDNAの増幅のみならず副産物も多量に増幅された。
【００８０】
これらのことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
具体的には、ATP-γSの非存在下では、プライマーDNAと鋳型DNAとの塩基のミスマッチが３塩基以内の場合においてのみ、特異的に核酸を増幅させるようにすることができる。従って、T.th. RecAタンパク質を反応液に加えることにより、所望の核酸をより特異的に増幅することができる。
一方、ATP-γSの存在下では、プライマーDNAと鋳型DNAとの塩基のミスマッチが１塩基以内の場合においてのみ、特異的に核酸を増幅させるようにすることができる。従って、ATP-γSを反応液に加えることにより、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができる。
また、ATP-γSは、T.th. RecAタンパク質を加えたときには、ＰＣＲの特異性を向上させることができるが、T.th. RecAタンパク質の非存在下、即ち、ATP-γSだけでは、ＰＣＲの特異性を向上させることができないと言える。
【００８１】
また、本実施例の結果より、一塩基多型を検出することが可能である。即ち、プライマーDNAの１つに、鋳型DNAのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAを用いてＰＣＲを行えば、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全に相補的である場合に、所望の核酸を増幅させるようにすることができる。一方、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全には相補的ではない場合、即ち、一塩基多型をなす塩基がプライマーDNAと相補的でない場合に、所望の核酸が増幅しない、または、抑制されるようにすることができる。このため、ＰＣＲによる所望の核酸の増幅により、一塩基多型を検出することが可能である。
さらに、ATP-γSを加えた場合には、より特異的に核酸を増幅することができるため、所望の核酸の増幅により、より確実に一塩基多型を検出することが可能となる。
【００８２】
【実施例７】
次いで、第７の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
鋳型DNAとしてヒトゲノムDNAを、プライマーDNAとして上記実施例４で用いたオリゴヌクレオチドの一部（オリゴヌクレオチド３８〜４０）を用意した（第９図参照）。
次に、上記実施例４等と同様な条件でＰＣＲ反応を行い、核酸を増幅させた。そして、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１等と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第１７図〜第１９図に示す。
【００８３】
レーン１は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド３９とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン２は、T.th. RecAタンパク質の代わりに大腸菌（E.coli）のRecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３は、T.th. RecAタンパク質の代わりに T.th.のSSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン５は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド４０とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン６は、T.th. RecAタンパク質の代わりに E.coli RecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、T.th. RecAタンパク質の代わりに T.th.のSSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、プライマー伸長反応の１サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、プライマー伸長反応の１サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、プライマー伸長反応の１サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、プライマー伸長反応の１サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１３は、プライマー伸長反応の１サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１４は、プライマー伸長反応の１サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１５は、プライマー伸長反応の１サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１６は、プライマー伸長反応の１サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１７は、プライマー伸長反応の３サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１８は、プライマー伸長反応の３サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１９は、プライマー伸長反応の３サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２０は、プライマー伸長反応の３サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２１は、プライマー伸長反応の３サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２２は、プライマー伸長反応の３サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２３は、プライマー伸長反応の３サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２４は、プライマー伸長反応の３サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２５は、プライマー伸長反応の６サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２６は、プライマー伸長反応の６サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２７は、プライマー伸長反応の６サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２８は、プライマー伸長反応の６サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２９は、プライマー伸長反応の６サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３０は、プライマー伸長反応の６サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３１は、プライマー伸長反応の６サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３２は、プライマー伸長反応の６サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３３は、プライマー伸長反応の１０サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３４は、プライマー伸長反応の１０サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３５は、プライマー伸長反応の１０サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３６は、プライマー伸長反応の１０サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３７は、プライマー伸長反応の１０サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３８は、プライマー伸長反応の１０サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３９は、プライマー伸長反応の１０サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４０は、プライマー伸長反応の１０サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４１は、プライマー伸長反応の１５サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４２は、プライマー伸長反応の１５サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４３は、プライマー伸長反応の１５サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４４は、プライマー伸長反応の１５サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４５は、プライマー伸長反応の１５サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４６は、プライマー伸長反応の１５サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４７は、プライマー伸長反応の１５サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４８は、プライマー伸長反応の１５サイクル終了後にはじめてプライマーDNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【００８４】
第１７図（Ａ）の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１では、所望のDNA（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン２では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物の増幅も若干見られた。また、レーン３では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。また、レーン４では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
同様に、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン５では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン６では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物の増幅も見られた。また、レーン７では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。また、レーン８では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
【００８５】
また、第１７図（Ｂ）の結果から明らかなように、プライマー伸長反応の１サイクル終了後にプライマーDNAを加えた場合であっても、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン９では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン１０では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物の増幅も見られた。また、レーン１１では、核酸の増幅が僅かに検出された。また、レーン１２では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
同様に、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１３では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン１４では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物の増幅も見られた。また、レーン１５では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。また、レーン１６では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
【００８６】
また、第１８図（Ａ）の結果から明らかなように、プライマー伸長反応の３サイクル終了後にプライマーDNAを加えた場合であっても、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１７では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン１８では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物の増幅も見られた。また、レーン１９では、所望の核酸の増幅が僅かに検出できた。また、レーン２０では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
一方、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン２１では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン２２では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物の増幅も僅かに見られた。また、レーン２３では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。また、レーン２４では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
【００８７】
また、第１８図（Ｂ）の結果から明らかなように、プライマー伸長反応の６サイクル終了後にプライマーDNAを加えた場合であっても、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン２５では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン２６では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物の増幅も見られた。また、レーン２７では、所望の核酸の増幅が見られたが、副産物はほとんど検出されなかった。また、レーン２８では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
一方、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン２９では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン３０では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物の増幅も見られた。また、レーン３１では、所望の核酸の増幅が見られたが、副産物はほとんど検出されなかった。また、レーン３２では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
【００８８】
また、第１９図（Ａ）の結果から明らかなように、プライマー伸長反応の１０サイクル終了後にプライマーDNAを加えた場合であっても、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン３３では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン３４では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物の増幅も若干見られた。また、レーン３５では、所望の核酸の増幅が見られたが、副産物はほとんど検出されなかった。また、レーン３６では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
一方、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン３７では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン３８では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物の増幅も見られた。また、レーン３９では、所望の核酸の増幅が見られたが、副産物はほとんど検出されなかった。また、レーン４０では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
【００８９】
また、第１９図（Ｂ）の結果から明らかなように、プライマー伸長反応の１５サイクル終了後にプライマーDNAを加えた場合であっても、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン４１では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン４２では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物の増幅も若干見られた。また、レーン４３では、所望の核酸の増幅が見られたが、副産物はほとんど検出されなかった。また、レーン４４では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
一方、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン４５では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン４６では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物の増幅も若干見られた。また、レーン４７では、所望の核酸の増幅が見られたが、副産物はほとんど検出されなかった。また、レーン４８では、所望のDNAの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
【００９０】
まず、第１７図（Ａ）の結果より、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲを行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
一方、E.coli RecAタンパク質を加えてＰＣＲを行った場合には、これを加えない場合よりは、ＰＣＲの特異性が向上するものの、副産物が若干生成されることにより、T.th. RecAタンパク質を加える場合ほどＰＣＲの特異性は向上しない。
なお、E.coli RecAタンパク質はＰＣＲサイクル中にかかる熱によって変性しやすい。このため、E.coli RecAタンパク質の効果が減少しやすいと考えられる。また、E.coli RecAタンパク質が変性した（１本鎖の）鋳型DNAに結合した状態で熱変性を起こすと、E.coli RecAタンパク質が鋳型DNAから離れなくなる。その結果、ＰＣＲ反応を阻害することになる。なお、E.coli のSSBタンパク質を加えた場合も、これと同様な現象でＰＣＲ反応が阻害されると考えられる。
他方、T.th.のSSBタンパク質を加えてＰＣＲを行っても、所望の核酸は増幅されない。
【００９１】
次に、第１７図（Ｂ）、第１８図及び第１９図の結果より、プライマー伸長反応を繰り返した後にプライマーDNAを加えても、即ち、プライマーDNAを加える前に反応液が繰り返し高温状態に置かれても、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲを行ったときに、ＰＣＲの特異性が劣ることがない。従って、T.th. RecAタンパク質は、高温においても不活性化せず安定であると考えられる。
【００９２】
【実施例８】
次いで、第８の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
鋳型DNAとしてヒトゲノムDNAを用意し、プライマーDNAとして上記実施例４と同様に５種類のオリゴヌクレオチド３７〜４１を用意した（第９図参照）。
次に、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．３μMし、それ以外は上記実施例１と同様にしてＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。なお、このＰＣＲの温度条件、即ち、１サイクル（７０℃，１０分間、９４℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、６０℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）を温度条件５とする。１サイクル目の最初の温度（初期温度）は７０℃である。そして、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１等と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第２０図に示す。
【００９３】
レーン５は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド３７とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン６は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド３９とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン７は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド４０とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン８は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド４１とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン１は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、T.th. RecAタンパク質の代わりに E.coli RecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、T.th. RecAタンパク質の代わりに E.coli RecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、T.th. RecAタンパク質の代わりに E.coli RecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、T.th. RecAタンパク質の代わりに E.coli RecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１３〜レーン２４は、ＰＣＲの温度条件を、１サイクル（８０℃，１０分間、９４℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、６０℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）とした。これを温度条件６とする。１サイクル目の最初の温度（初期温度）は８０℃である。
レーン１３は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１４は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１５は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１６は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１７は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１８は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１９は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２０は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２１は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２２は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２３は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２４は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【００９４】
第２０図（Ａ）の結果から明らかなように、初期温度が７０℃の場合、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン５〜レーン８のうち、レーン５〜レーン７では、所望のDNA（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン８では、核酸の増幅がほとんど検出されなかった。
これに対し、E.coli RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン９〜レーン１２のうち、レーン９〜レーン１１では、所望のDNAの増幅が見られたが、副産物も若干検出された。また、レーン１２では、核酸の増幅がほとんど検出されなかった。
他方、RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン４では、所望のDNAの増幅が見られたが、それ以外に副産物も多量に検出された。
なお、初期温度が７０℃の場合、E.coli RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行った場合には、初期温度をかけない場合に比べ、副産物が多く検出された。従って、E.coli RecAタンパク質は、７０℃で不活性化しやすいと考えれる。
一方、初期温度７０℃をかけ、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行っても、初期温度をかけない場合と同様に、副産物はほとんど検出されなかった。従って、T.th. RecAタンパク質は、７０℃でも不活性化しにくいと考えれる。
【００９５】
第２０図（Ｂ）の結果から明らかなように、初期温度が８０℃の場合、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１７〜レーン２０のうち、レーン１７〜レーン１９では、所望のDNAの増幅が見られたが、副産物が若干検出された。また、レーン２０では、核酸の増幅がほとんど検出されなかった。
これに対し、E.coli RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン２１〜レーン２４のうち、レーン２１〜レーン２３では、所望のDNAの増幅が見られたが、副産物も検出された。この副産物の量は、T.th. RecAタンパク質を加えた場合に比べて多かった。また、レーン２４では、核酸の増幅がほとんど検出されなかった。
他方、RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン１３〜レーン１６では、所望のDNAの増幅が見られたが、それ以外に副産物も多量に検出された。
【００９６】
まず、第２０図（Ａ）の結果より、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲを行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
一方、E.coli RecAタンパク質を加えてＰＣＲを行った場合には、これを加えない場合よりは、ＰＣＲの特異性が向上するものの、副産物が若干生成されることにより、T.th. RecAタンパク質を加える場合ほどＰＣＲの特異性は向上しない。
次に、第２０図（Ｂ）の結果より、初期温度を８０℃に上げると、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲを行っても、ＰＣＲの特異性が若干低下する。従って、初期温度を８０℃に上げることにより、T.th. RecAタンパク質の一部が不活性化するものと考えられる。
【００９７】
【実施例９】
次いで、第９の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
第２１図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNAを、プライマーDNAとして５種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド５９〜６３）を用意した。これらのプライマーDNAは、Homo sapiens BAC clone CTB-135C18 from 7q11.2-q22, complete sequence.（ACCESSION AC005164）を参考にして設計した。
プライマーDNAのうち、オリゴヌクレオチド６０とオリゴヌクレオチド６１は、鋳型DNAと１００％相補的な２２merの塩基配列からなる。一方、オリゴヌクレオチド５９は、オリゴヌクレオチド６１のうち一の塩基をＣからＡに変えたものであり、オリゴヌクレオチド６２は、オリゴヌクレオチド６１のうち一の塩基をＣからＧに変えたものであり、オリゴヌクレオチド６３は、オリゴヌクレオチド６１のうち一の塩基をＣからＴに変えたものである。
【００９８】
オリゴヌクレオチド５９：
5'-caaagctact tgcacagcct cc-3'
オリゴヌクレオチド６０：
5'-ggcatattca gccaaggatt tc-3'
オリゴヌクレオチド６１：
5'-caaagctact ttcacagcct cc-3'
オリゴヌクレオチド６２：
5'-caaagctact tacacagcct cc-3'
オリゴヌクレオチド６３：
5'-caaagctact tccacagcct cc-3'
【００９９】
次に、上記実施形態４と同様な条件でＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。そして、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１等と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第２２図に示す。
【０１００】
レーン１は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド５９とオリゴヌクレオチド６０を加えたものである。
レーン２は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド６１とオリゴヌクレオチド６０を加えたものである。
レーン３は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド６２とオリゴヌクレオチド６０を加えたものである。
レーン４は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド６３とオリゴヌクレオチド６０を加えたものである。
レーン５は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、１mM（最終濃度）のATP-γSをさらに加えて、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【０１０１】
第２２図の結果から明らかなように、ATP-γSを加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン４について見ると、すべてのレーンについて、所望のDNA（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）はほとんど検出されなかった。
一方、ATP-γSを加えてＰＣＲ反応を行ったレーン５〜レーン８について見ると、レーン６では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン５とレーン７とレーン８では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
【０１０２】
このことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
そしてさらに、ATP-γSの存在下では、プライマーDNAと鋳型DNAが１００％相補的である場合にのみ、特異的に核酸を増幅させるようにすることができる。従って、ATP-γSを反応液に加えることにより、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができる。
また、上記の結果より、一塩基多型を検出することが可能である。即ち、プライマーDNAの１つに、鋳型DNAのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAを用いてＰＣＲを行えば、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全に相補的である場合に、所望の核酸を増幅させるようにすることができる。一方、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全には相補的ではない場合、即ち、一塩基多型をなす塩基がプライマーDNAと相補的でない場合に、所望の核酸が増幅しない、または、抑制されるようにすることができる。このため、ＰＣＲによる所望の核酸の増幅により、一塩基多型を検出することが可能である。
【０１０３】
【実施例１０】
次いで、第１０の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
第２３図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNAを、プライマーDNAとして５種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド６４〜６８）を用意した。これらのプライマーDNAは、Homo sapiens PAC clone RP5-1142J19 from 7q35-q36,
complete sequence.（ACCESSION AC004975）を参考にして設計した。
プライマーDNAのうち、オリゴヌクレオチド６５とオリゴヌクレオチド６８は、鋳型DNAと１００％相補的な２０merまたは２１merの塩基配列からなる。一方、オリゴヌクレオチド６４は、オリゴヌクレオチド６８のうち３’末端から３塩基目の一の塩基をＴからＡに変えたものであり、オリゴヌクレオチド６６は、オリゴヌクレオチド６８のうち３’末端から３塩基目の一の塩基をＴからＣに変えたものであり、オリゴヌクレオチド６７は、オリゴヌクレオチド６８のうち３’末端から３塩基目の一の塩基をＴからＧに変えたものである。
【０１０４】
オリゴヌクレオチド６４：
5'-gcaggcacca agaactacag c-3'
オリゴヌクレオチド６５：
5'-gcctaaggtc acgttgtccc-3'
オリゴヌクレオチド６６：
5'-gcaggcacca agaactaccg c-3'
オリゴヌクレオチド６７：
5'-gcaggcacca agaactacgg c-3'
オリゴヌクレオチド６８：
5'-gcaggcacca agaactactg c-3'
【０１０５】
またさらに、第２４図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNAを、プライマーDNAとして５種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド６９〜７３）を用意した。これらのプライマーDNAは、Homo sapiens BAC clone CTB-135C18 from 7q11.2-q22, complete sequence.（ACCESSION AC005164）を参考にして設計した。
これらのプライマーDNAのうち、オリゴヌクレオチド７０とオリゴヌクレオチド７１は、鋳型DNAと１００％相補的な２２merの塩基配列からなる。一方、オリゴヌクレオチド６９は、オリゴヌクレオチド７１のうち３’末端から４塩基目の一の塩基をＣからＡに変えたものであり、オリゴヌクレオチド７２は、オリゴヌクレオチド７１のうち３’末端から４塩基目の一の塩基をＣからＧに変えたものであり、オリゴヌクレオチド７３は、オリゴヌクレオチド７１のうち３’末端から４塩基目の一の塩基をＣからＴに変えたものである。
【０１０６】
オリゴヌクレオチド６９：
5'-caaagctact ttcacagcat cc-3'
オリゴヌクレオチド７０：
5'-ggcatattca gccaaggatt tc-3'
オリゴヌクレオチド７１：
5'-caaagctact ttcacagcct cc-3'
オリゴヌクレオチド７２：
5'-caaagctact ttcacagcgt cc-3'
オリゴヌクレオチド７３：
5'-caaagctact ttcacagctt cc-3'
【０１０７】
次に、DNAポリメラーゼとして TaKaRa Taq（タカラバイオ）の代わりに Ex Taq（タカラバイオ）を用い、さらに１mM（最終濃度）のATP-γSを加えて、それ以外は上記実施形態４等と同様な条件でＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。なお、この Ex Taqは、通常（従来）のＰＣＲの条件下では、プライマーDNAの３’末端の塩基配列を認識しないことが知られているものである。そして、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１等と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第２５図に示す。
【０１０８】
レーン９は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド６４とオリゴヌクレオチド６５を加えたものである。
レーン１０は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド６６とオリゴヌクレオチド６５を加えたものである。
レーン１１は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド６７とオリゴヌクレオチド６５を加えたものである。
レーン１２は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド６８とオリゴヌクレオチド６５を加えたものである。
レーン１３は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド６９とオリゴヌクレオチド７０を加えたものである。
レーン１４は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド７１とオリゴヌクレオチド７０を加えたものである。
レーン１５は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド７２とオリゴヌクレオチド７０を加えたものである。
レーン１６は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド７３とオリゴヌクレオチド７０を加えたものである。
レーン１は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン５は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１７は、T.th. RecAタンパク質の代わりにT.th. SSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１８は、T.th. RecAタンパク質の代わりにT.th. SSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１９は、T.th. RecAタンパク質の代わりにT.th. SSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２０は、T.th. RecAタンパク質の代わりにT.th. SSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２１は、T.th. RecAタンパク質の代わりにT.th. SSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン１３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２２は、T.th. RecAタンパク質の代わりにT.th. SSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン１４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２３は、T.th. RecAタンパク質の代わりにT.th. SSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン１５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２４は、T.th. RecAタンパク質の代わりにT.th. SSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン１６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【０１０９】
第２５図（Ｂ）の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質とATP-γSを加えた場合には、まず、レーン９〜レーン１２について見ると、レーン１２では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン９〜レーン１１では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。なお、写真に映っているのは、バックグラウンドであると考えられる。また、レーン１３〜レーン１６について見ると、レーン１４では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン１３とレーン１５とレーン１６では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
これらに対し、第２５図（Ａ）の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えない場合には、レーン１〜レーン４についてもレーン５〜レーン８についても、プライマーDNAに対応するDNAの増幅が検出され、また、副産物も検出された。
また、第２５図（Ｃ）の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質の代わりにT.th. ＳＳＢタンパク質を加えた場合には、レーン１７〜レーン２０についてもレーン２１〜レーン２４についても、プライマーDNAに対応するDNAの増幅が検出され、また、副産物も検出された。
【０１１０】
これらのことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
そしてさらに、ATP-γSの存在下では、プライマーDNAと鋳型DNAが１００％相補的である場合にのみ、特異的に核酸を増幅させるようにすることができる。従って、ATP-γSを反応液に加えることにより、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができる。
また、上記の結果より、一塩基多型を検出することが可能である。即ち、プライマーDNAの１つに、鋳型DNAのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAを用いてＰＣＲを行えば、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全に相補的である場合に、所望の核酸を増幅させるようにすることができる。一方、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全には相補的ではない場合、即ち、一塩基多型をなす塩基がプライマーDNAと相補的でない場合に、所望の核酸が増幅しない、または、抑制されるようにすることができる。このため、ＰＣＲによる所望の核酸の増幅により、一塩基多型を検出することが可能である。
【０１１１】
【実施例１１】
次いで、第１１の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第２６図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA（Promega）を、プライマーDNAとして６種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド７４〜７９）を用意した。オリゴヌクレオチド７４とオリゴヌクレオチド７５は、Human S100 protein beta-subunit gene, exon 1 (ACCESSION M59486 J05600) を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド７６とオリゴヌクレオチド７７は、Homo sapiens blue cone opsin gene, complete cds (ACCESSION L32835) を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド７８とオリゴヌクレオチド７９は、Homo sapiens beta globin region (HBB@) on chromosome 11 (ACCESSION NG_000007) を参考にして設計した。各プライマーDNAは、鋳型DNAと１００％相補的な２０〜２５merの塩基配列からなる。
【０１１２】
オリゴヌクレオチド７４：
5'-gactactctagcgactgtccatctc-3'
オリゴヌクレオチド７５：
5'-gacagccaccagatccaatc-3'
オリゴヌクレオチド７６：
5'-ggcagctttcatgggcactgt-3'
オリゴヌクレオチド７７：
5'-gacagggctggactgacatttg-3'
オリゴヌクレオチド７８：
5'-ctgctgaaagagatgcggtgg-3'
オリゴヌクレオチド７９：
5'-aggaaaacagcccaagggacag-3'
【０１１３】
次に、ＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。具体的には、５０μlのＰＣＲ反応液中に、各々０．５μM（最終濃度）の２種類のオリゴヌクレオチドと、２００ngのヒトゲノムDNA（Promega）と、１．０unitの TaKaRa ExTaq-HS Polymerase（タカラバイオ）と、０．２mMのdNTP混合液と、１．０μgのT.th. RecAタンパク質を、１×Ex-Taq buffer（タカラバイオ）に混合した。そして、ＰＣＲ反応を、１サイクル（９０℃，３０秒間）、３０サイクル（９４℃，１５秒間、５５℃，３０秒間、７２℃，１分間）、１サイクル（７２℃，７分間、４℃，１分間）で行った。
次に、反応液の１μlについて１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、アガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してゲル中のDNAを染色し、その後、染色されたDNAを写真に記録した。その結果を第２７図に示す。
【０１１４】
レーン１は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド７４とオリゴヌクレオチド７５を加えたものである。
レーン２は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド７６とオリゴヌクレオチド７７を加えたものである。
レーン３は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド７８とオリゴヌクレオチド７９を加えたものである。
レーン４は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン５は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、T.th. RecAタンパク質の代わりに同量の大腸菌（E.coli）のRecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、T.th. RecAタンパク質の代わりに同量の大腸菌（E.coli）のRecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、T.th. RecAタンパク質の代わりに同量の大腸菌（E.coli）のRecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【０１１５】
第２７図の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン３では、所望の核酸（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）の増幅はほとんど検出されなかった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン４〜レーン６では、所望の核酸のみならず副産物も多量に検出された。
また、T.th. RecAタンパク質の代わりにE.coli RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン７〜レーン９では、所望の核酸の他、レーン４〜レーン６ほどではないが、副産物も検出された。
【０１１６】
このことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、T.th. RecAタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
一方、E.coli RecAタンパク質を加えてＰＣＲを行った場合には、これを加えない場合よりは、ＰＣＲの特異性が向上するものの、副産物が若干生成されることにより、T.th. RecAタンパク質を加える場合ほどＰＣＲの特異性は向上しない。
【０１１７】
【実施例１２】
次いで、第１２の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第２８図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA（Promega）を、プライマーDNAとして５種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド８０〜８４）を用意した。これらのプライマーDNAは、Homo sapiens BAC clone CTB-135C18 from 7q11.2-q22, complete sequence (ACCESSION AC005164) 及び Homo sapiens chromosome 19 clone CTD-2166J9, complete sequence (ACCESSION AC010412) を参考にして設計した。フォワード側のプライマーDNA（オリゴヌクレオチド８０〜８３）は、任意のプライマー設計の可能性を示すため、それぞれ位置をずらして設計してある。一方、リバース側のプライマーDNA（オリゴヌクレオチド８４）は、共通のものである。各プライマーDNAは、鋳型DNAと１００％相補的な２２merの塩基配列からなる。
【０１１８】
オリゴヌクレオチド８０：
5'-caaagctactttcacagcctcc-3'
オリゴヌクレオチド８１：
5'-caaagctactgtcacagcctcc-3'
オリゴヌクレオチド８２：
5'-caaagcgactgtcagagcctcc-3'
オリゴヌクレオチド８３：
5'-cagagcgactgtcagagcgtcc-3'
オリゴヌクレオチド８４：
5'-ggcatattcagccaaggatttc-3'
【０１１９】
次に、上記実施例１１のレーン１等と同様な条件でＰＣＲ反応を行った。そして、その反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１１と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第２９図に示す。
【０１２０】
レーン１は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド８０とオリゴヌクレオチド８４を加えたものである。
レーン２は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド８１とオリゴヌクレオチド８４を加えたものである。
レーン３は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド８２とオリゴヌクレオチド８４を加えたものである。
レーン４は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド８３とオリゴヌクレオチド８４を加えたものである。
レーン５は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、T.th. RecAタンパク質の代わりに同量の大腸菌（E.coli）のRecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、T.th. RecAタンパク質の代わりに同量の大腸菌（E.coli）のRecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、T.th. RecAタンパク質の代わりに同量の大腸菌（E.coli）のRecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、T.th. RecAタンパク質の代わりに同量の大腸菌（E.coli）のRecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【０１２１】
第２９図の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン４では、所望の核酸（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）の増幅はほとんど検出されなかった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン５〜レーン８では、所望の核酸のみならず副産物も多量に検出された。
また、T.th. RecAタンパク質の代わりにE.coli RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン９〜レーン１２では、所望の核酸の他、レーン５〜レーン８ほどではないが、副産物も検出された。
【０１２２】
このことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、T.th. RecAタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
一方、E.coli RecAタンパク質を加えてＰＣＲを行った場合には、これを加えない場合よりは、ＰＣＲの特異性が向上するものの、副産物が若干生成されることにより、T.th. RecAタンパク質を加える場合ほどＰＣＲの特異性は向上しない。
【０１２３】
【実施例１３】
次いで、第１３の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第３０図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA（Promega）を、プライマーDNAとしてオリゴヌクレオチド８５とオリゴヌクレオチド８６を用意した。これらのプライマーDNAは、ヒトゲノムDNAの single copy gene について設計した。具体的には、Homo sapiens PAC clone RP5-1142J19 from 7q35-q36, complete sequence (ACCESSION AC004975) を参考にして設計した。各プライマーDNAは、鋳型DNAと１００％相補的な２０〜２１merの塩基配列からなる。
【０１２４】
オリゴヌクレオチド８５：
5'-gcaggcaccaagaactactgc-3'
オリゴヌクレオチド８６：
5'-gcctaaggtcacgttgtccc-3'
【０１２５】
次に、ＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。具体的には、５０μlのＰＣＲ反応液中に、各々１．０μM（最終濃度）の２種類のオリゴヌクレオチドと、２００ngのヒトゲノムDNA（Promega）と、１．０unitの TaKaRa Taq-HS（タカラバイオ）と、０．２mMのdNTP混合液と、１．０μgのT.th. RecAタンパク質を、１０mMの Tris-HCl Buffer（pH８．３）、５０mMのKCl、１．５mMのMgCl2 に混合した。そして、ＰＣＲ反応を、１サイクル（９０℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、６０℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）で行った。
次に、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、アガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してゲル中のDNAを染色し、その後、染色されたDNAを写真に記録した。その結果を第３１図に示す。
【０１２６】
レーン１は、上記のように、プライマーDNAの濃度をそれぞれ１．０μM（最終濃度）として、ＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．３μM（最終濃度）に減らして、それ以外はレーン１と同様なＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．１μM（最終濃度）に減らして、それ以外はレーン１と同様なＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．０３μM（最終濃度）に減らして、それ以外はレーン１と同様なＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン５は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．０１μM（最終濃度）に減らして、それ以外はレーン１と同様なＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．００３μM（最終濃度）に減らして、それ以外はレーン１と同様なＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．００１μM（最終濃度）に減らして、それ以外はレーン１と同様なＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、プライマーDNAの濃度をそれぞれ０．０００３μM（最終濃度）に減らして、それ以外はレーン１と同様なＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１３は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１４は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１５は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１６は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【０１２７】
第３１図の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン８のうち、レーン７，８を除くレーンでは、所望の核酸（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）はほとんど検出されなかった。また、レーン７及びレーン８では、プライマーDNAの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン９〜レーン１６のうち、レーン９〜レーン１２では、所望の核酸のみならず副産物も検出された。また、レーン１３及びレーン１４では、所望の核酸の増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。また、レーン１５及びレーン１６では、プライマーDNAの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
このことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、T.th. RecAタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
【０１２８】
【実施例１４】
次いで、第１４の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第３２図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA（Promega）を、プライマーDNAとして５種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド８７〜９１）を用意した。これらのプライマーDNAは、Homo sapiens BAC clone CTB-135C18 from 7q11.2-q22, complete sequence (ACCESSION AC005164) を参考にして設計した。一方のプライマーDNA（オリゴヌクレオチド８７〜９０）は、３’末端から３番目の塩基配列をそれぞれ異ならせてあり、オリゴヌクレオチド９０が鋳型DNAと１００％相補的である。他方のプライマーDNA（オリゴヌクレオチド９１）は、共通のものであり、鋳型DNAと１００％相補的である。各プライマーDNAは、２２merの塩基配列からなる。
【０１２９】
オリゴヌクレオチド８７：
5'-caaagctactttcacagccgcc-3'
オリゴヌクレオチド８８：
5'-caaagctactttcacagccacc-3'
オリゴヌクレオチド８９：
5'-caaagctactttcacagccccc-3'
オリゴヌクレオチド９０：
5'-caaagctactttcacagcctcc-3'
オリゴヌクレオチド９１：
5'-ggcatattcagccaaggatttc-3'
【０１３０】
次に、ＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。具体的には、５０μlのＰＣＲ反応液中に、各々０．３μM（最終濃度）の２種類のオリゴヌクレオチドと、２００ngのヒトゲノムDNA（Promega）と、１．０unitの TaKaRa Taq-HS（タカラバイオ）と、０．２mMのdNTP混合液と、１．０μgのT.th. RecAタンパク質を、１０mMの Tris-HCl Buffer（pH８．３）、５０mMのKCl、１．５mMのMgCl2 に混合した。そして、ＰＣＲ反応を、１サイクル（９４℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、６０℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）で行った。
次に、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、アガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してゲル中のDNAを染色し、その後、染色されたDNAを写真に記録した。その結果を第３３図に示す。
【０１３１】
レーン１は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド８７とオリゴヌクレオチド９１を加えたものである。
レーン２は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド８８とオリゴヌクレオチド９１を加えたものである。
レーン３は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド８９とオリゴヌクレオチド９１を加えたものである。
レーン４は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド９０とオリゴヌクレオチド９１を加えたものである。
レーン５は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、T.th. RecAタンパク質の代わりに、同量のT.th.のSSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、T.th. RecAタンパク質の代わりに、同量のT.th.のSSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、T.th. RecAタンパク質の代わりに、同量のT.th.のSSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、T.th. RecAタンパク質の代わりに、同量のT.th.のSSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【０１３２】
第３３図の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン４について見ると、鋳型DNAと１００％相補的なプライマーDNAを用いたレーン４では、所望のDNAの増幅が強く検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。一方、３’末端から３番目の塩基が異なるプライマーDNAを用いたレーン１〜レーン３では、所望の核酸の増幅がほとんど検出されなかった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン５〜レーン８については、いずれのレーンにおいても所望のDNAの増幅が検出された。また、レーン５及びレーン６では、副産物も増幅された。
また、T.th. RecAタンパク質の代わりにT.th.のSSBタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン９〜レーン１２についても、いずれのレーンにおいても所望のDNAの増幅が検出された。また、レーン９及びレーン１０では、副産物が増幅された。
【０１３３】
このことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。具体的には、プライマーDNAと鋳型DNAとの塩基のミスマッチがない場合においてのみ、特異的に核酸を増幅させることが可能となる。一般に、プライマーDNAの３’末端近傍の塩基（特に、３’末端から３塩基以内の塩基）が鋳型DNAとミスマッチしている場合には、核酸が増幅されやすい傾向にある。しかし、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸を特異的に増幅させることができる。
一方、RecAタンパク質と同様にDNAに結合するT.th. SSBタンパク質を加えてＰＣＲを行っても、ＰＣＲの特異性は特に向上しない。
【０１３４】
また、本実施例の結果より、一塩基多型を検出することが可能である。即ち、プライマーDNAの１つに、鋳型DNAのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAを用いてＰＣＲを行えば、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全に相補的である場合に、所望の核酸を増幅させるようにすることができる。一方、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全には相補的ではない場合、即ち、一塩基多型をなす塩基がプライマーDNAと相補的でない場合に、所望の核酸が増幅しない、または、抑制されるようにすることができる。このため、ＰＣＲによる所望の核酸の増幅により、一塩基多型を検出することが可能である。
【０１３５】
【実施例１５】
次いで、第１５の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第３４図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA（Promega）を、プライマーDNAとして５種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド９２〜９６）を用意した。これらのプライマーDNAは、Homo sapiens PAC clone RP5-1142J19 from 7q35-q36, complete sequence (ACCESSION AC004975) を参考にして設計した。一方のプライマーDNA（オリゴヌクレオチド９２〜９５）は、３’末端から３番目の塩基配列をそれぞれ異ならせてあり、オリゴヌクレオチド９３が鋳型DNAと１００％相補的である。他方のプライマーDNA（オリゴヌクレオチド９６）は、共通のものであり、鋳型DNAと１００％相補的である。各プライマーDNAは、２０〜２１merの塩基配列からなる。
【０１３６】
オリゴヌクレオチド９２：
5'-gcaggcaccaagaactacggc-3'
オリゴヌクレオチド９３：
5'-gcaggcaccaagaactactgc-3'
オリゴヌクレオチド９４：
5'-gcaggcaccaagaactacagc-3'
オリゴヌクレオチド９５：
5'-gcaggcaccaagaactaccgc-3'
オリゴヌクレオチド９６：
5'-gcctaaggtcacgttgtccc-3'
【０１３７】
次に、上記実施例１４のレーン１等と同様な条件でＰＣＲ反応を行った。そして、その反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１４と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第３５図に示す。
【０１３８】
レーン１は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド９２とオリゴヌクレオチド９６を加えたものである。
レーン２は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド９３とオリゴヌクレオチド９６を加えたものである。
レーン３は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド９４とオリゴヌクレオチド９６を加えたものである。
レーン４は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド９５とオリゴヌクレオチド９６を加えたものである。
レーン５は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、T.th. RecAタンパク質の代わりに、同量のT.th.のSSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、T.th. RecAタンパク質の代わりに、同量のT.th.のSSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、T.th. RecAタンパク質の代わりに、同量のT.th.のSSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、T.th. RecAタンパク質の代わりに、同量のT.th.のSSBタンパク質を加えて、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【０１３９】
第３５図の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン４について見ると、鋳型DNAと１００％相補的なプライマーDNAを用いたレーン２では、所望のDNAの増幅が強く検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。一方、３’末端から３番目の塩基が異なるプライマーDNAを用いたレーン１，３，４では、所望の核酸の増幅がほとんど検出されなかった。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン５〜レーン８については、いずれのレーンにおいても所望のDNAの増幅が検出された。また、レーン７では、副産物も増幅された。
また、T.th. RecAタンパク質の代わりにT.th.のSSBタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン９〜レーン１２についても、いずれのレーンにおいても所望のDNAの増幅が検出された。また、レーン１１では、副産物が増幅された。
【０１４０】
このことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。具体的には、プライマーDNAと鋳型DNAとの塩基のミスマッチがない場合においてのみ、特異的に核酸を増幅させることが可能となる。一般に、プライマーDNAの３’末端近傍の塩基（特に、３’末端から３塩基以内の塩基）が鋳型DNAとミスマッチしている場合には、核酸が増幅されやすい傾向にある。しかし、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸を特異的に増幅させることができる。
一方、RecAタンパク質と同様にDNAに結合するT.th. SSBタンパク質を加えてＰＣＲを行っても、ＰＣＲの特異性は特に向上しない。
【０１４１】
また、本実施例の結果より、一塩基多型を検出することが可能である。即ち、プライマーDNAの１つに、鋳型DNAのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAを用いてＰＣＲを行えば、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全に相補的である場合に、所望の核酸を増幅させるようにすることができる。一方、鋳型DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAとが完全には相補的ではない場合、即ち、一塩基多型をなす塩基がプライマーDNAと相補的でない場合に、所望の核酸が増幅しない、または、抑制されるようにすることができる。このため、ＰＣＲによる所望の核酸の増幅により、一塩基多型を検出することが可能である。
【０１４２】
【実施例１６】
次いで、第１６の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第３６図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA（Promega）を、プライマーDNAとしてオリゴヌクレオチド９７とオリゴヌクレオチド９８を用意した。これらのプライマーDNAは、Human chromosome 14 DNA sequence BAC C-2240H23 of library CalTech-D from chromosome 14 of Homo sapiens (Human), complete sequence (ACCESSION AL356017) を参考にして設計した。各プライマーDNAは、鋳型DNAと１００％相補的な２０merの塩基配列からなる。
【０１４３】
オリゴヌクレオチド９７：
5'-atgaaaagccctgctttgca-3'
オリゴヌクレオチド９８：
5'-agacttcttcaactcaatgg-3'
【０１４４】
次に、ＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。具体的には、５０μlのＰＣＲ反応液中に、各々０．５μM（最終濃度）の２種類のオリゴヌクレオチドと、２００ngのヒトｃDNA（Invitorogen）と、１．０unitの TaKaRa ExTaq-HS polymerase（タカラバイオ）と、０．２mMのdNTP混合液と、１．０μgのT.th. RecAタンパク質を、１×ExTaq-HS 専用 Buffer （タカラバイオ）に混合した。そして、ＰＣＲ反応を、１サイクル（９４℃，３０秒間）、３０サイクル（９４℃，１５秒間、５５℃，３０秒間、７２℃，１分間）、１サイクル（７２℃，７分間、４℃，１分間）で行った。
次に、反応液の１０μlについて１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、アガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してゲル中のDNAを染色し、その後、染色されたDNAを写真に記録した。その結果を第３７図に示す。
【０１４５】
レーン１は、上記のように、T.th. RecAタンパク質を加えたものである。
レーン２は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【０１４６】
第３７図の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。なお、下方に見えるシグナルはバックグラウンドと考えられる。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン２では、所望のDNAの増幅が検出されなかった。これは、鋳型DNAに阻止的または抑制的２次構造の区域があるためと考えられる。
このことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、鋳型DNAに阻止的または抑制的２次構造の区域がある場合であっても、所望の核酸を効率よく特異的に増幅させることができる。その理由は、相同組み換えタンパク質が、鋳型DNAに結合することにより、阻止的または抑制的２次構造が解かれるためであると考えられる。
【０１４７】
【実施例１７】
次いで、第１７の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第３８図及び第３９図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA（Promega）を、プライマーDNAとして１２種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド９９〜１１０）を用意した。オリゴヌクレオチド９９とオリゴヌクレオチド１００は、Human DNA sequence from clone RP11-760M1 on chromosome 13, complete sequence (ACCESSION AL354815) 及び Human hepatocyte nuclear factor 4-alpha gene, exon 1 (ACCESSION U72959 U72960) を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１０１とオリゴヌクレオチド１０２は、Human rhodopsin gene, complete cds (ACCESSION U49742 K02281) を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１０３とオリゴヌクレオチド１０４は、Homo sapiens beta globin region (HBB@) on chromosome 11 (ACCESSION NG_000007) を参考にして設計した。オリゴヌクレオチド１０５とオリゴヌクレオチド１０６は、Homo spaiens HPFH6OR gene for olfactory receptor (ACCESSION X81445 X91835) を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１０７とオリゴヌクレオチド１０８は、Human p53 (TP53) gene, complete cds (ACCESSION U94788) を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１０９とオリゴヌクレオチド１１０は、Human p53 (TP53) gene, complete cds (ACCESSION U94788) を参考にして設計した。各プライマーDNAは、鋳型DNAと１００％相補的な２０〜２７merの塩基配列からなる。
【０１４８】
オリゴヌクレオチド９９：
5'-gcatctggggcctggtatttag-3'
オリゴヌクレオチド１００：
5'-tacaaggcaggcatcatgactcacg-3'
オリゴヌクレオチド１０１：
5'-aggagcttaggagggggaggt-3'
オリゴヌクレオチド１０２：
5'-cattgacaggacaggagaaggga-3'
オリゴヌクレオチド１０３：
5'-ctttttgttcccccagacactc-3'
オリゴヌクレオチド１０４：
5'-gcaatggcttaggagttggact-3'
オリゴヌクレオチド１０５：
5'-gttaatacctaaggctctactgca-3'
オリゴヌクレオチド１０６：
5'-aggcaatggcggcacccatc-3'
オリゴヌクレオチド１０７：
5'-gcagagacctgtgggaagcgaaaa-3'
オリゴヌクレオチド１０８：
5'-gagagctgtggcaagcagggga-3'
オリゴヌクレオチド１０９：
5'-cccctcctggcccctgtcat-3'
オリゴヌクレオチド１１０：
5'-gttagatgactttgcccaactgtaggg-3'
【０１４９】
次に、ＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。具体的には、５０μlのＰＣＲ反応液中に、各々０．８μM（最終濃度）の２種類のオリゴヌクレオチドと、２００ngのヒトゲノムDNA（Promega）と、１．０unitの TaKaRa ExTaq-HS polymerase（タカラバイオ）と、０．２mMのdNTP混合液と、１．０μgのT.th. RecAタンパク質を、１×ExTaq Buffer （タカラバイオ）に混合した。そして、ＰＣＲ反応を、１サイクル（９４℃，３０秒間）、３５サイクル（９４℃，１５秒間、５５℃，３０秒間、７２℃，１分間）、１サイクル（７２℃，７分間、４℃，１分間）で行った。
次に、反応液の１０μlについて１．２％のアガロースゲルで電気泳動を行い、アガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してゲル中のDNAを染色し、その後、染色されたDNAを写真に記録した。その結果を第４０図に示す。
【０１５０】
レーン７は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド９９とオリゴヌクレオチド１００を加えたものである。
レーン８は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド１０１とオリゴヌクレオチド１０２を加えたものである。
レーン９は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド１０３とオリゴヌクレオチド１０４を加えたものである。
レーン１０は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド１０５とオリゴヌクレオチド１０６を加えたものである。
レーン１１は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド１０７とオリゴヌクレオチド１０８を加えたものである。
レーン１２は、プライマーDNAとして、オリゴヌクレオチド１０９とオリゴヌクレオチド１１０を加えたものである。
レーン１は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン５は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１３は、１５ｍＭ KCl を加えて、レーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１４は、１５ｍＭ KCl を加えて、レーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１５は、１５ｍＭ KCl を加えて、レーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１６は、１５ｍＭ KCl を加えて、レーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１７は、１５ｍＭ KCl を加えて、レーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１８は、１５ｍＭ KCl を加えて、レーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１９は、３０ｍＭ KCl を加えて、レーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２０は、３０ｍＭ KCl を加えて、レーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２１は、３０ｍＭ KCl を加えて、レーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２２は、３０ｍＭ KCl を加えて、レーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２３は、３０ｍＭ KCl を加えて、レーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２４は、３０ｍＭ KCl を加えて、レーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【０１５１】
第４０図の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン７〜レーン１２では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はそれほど検出されなかった。
また、１５ｍＭ KCl を加えたレーン１３〜レーン１８では、レーン７〜レーン１２よりも副産物の増幅が抑制された。
またさらに、３０ｍＭ KCl を加えたレーン１９〜レーン２４では、レーン１３〜レーン１８よりも、効果的に副産物の増幅が抑制された。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン６では、所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物も多く検出された。
このことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーDNAが鋳型DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
特に、ＰＣＲ反応液に KCl を加えることにより、ＰＣＲの特異性を向上させることができる。
【０１５２】
【実施例１８】
次いで、第１８の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第４１図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA（Promega）を、プライマーDNAとしてオリゴヌクレオチド１１１とオリゴヌクレオチド１１２を用意した。これらのプライマーDNAは、Homo sapiens beta globin region (HBB@) on chromosome 11 (ACCESSION NG_000007) を参考にして設計した。各プライマーDNAは、鋳型DNAと１００％相補的な２１〜２２merの塩基配列からなる。
【０１５３】
オリゴヌクレオチド１１１：
5'-ctgctgaaagagatgcggtgg-3'
オリゴヌクレオチド１１２：
5'-aggaaaacagcccaagggacag-3'
【０１５４】
次に、ＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。具体的には、５０μlのＰＣＲ反応液中に、各々０．２５μM（最終濃度）の２種類のオリゴヌクレオチドと、１００ngのヒトゲノムDNA（Promega）と、１．２５unitの TaKaRa ExTaq Polymerase（タカラバイオ）と、０．２mMのdNTP混合液と、１．０μgのT.th. RecAタンパク質を、１×ExTaq Buffer（タカラバイオ）に混合した。そして、ＰＣＲ反応を、１サイクル（９４℃，３０秒間）、３５サイクル（９４℃，１５秒間、５５℃，３０秒間、７２℃，１分間）、１サイクル（７２℃，７分間、４℃，１分間）で行った。
次に、反応液の１０μlについて１．２％のアガロースゲルで電気泳動を行い、アガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してゲル中のDNAを染色し、その後、染色されたDNAを写真に記録した。その結果を第４２図に示す。
【０１５５】
レーン１は、上記のように、TaKaRa ExTaq Polymeraseを１．２５unitの加えてＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２は、TaKaRa ExTaq Polymeraseを０．６３unitに減らして、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３は、TaKaRa ExTaq Polymeraseを０．３１unitに減らして、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４は、TaKaRa ExTaq Polymeraseを０．１６unitに減らして、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン５は、TaKaRa ExTaq Polymeraseを０．０８unitに減らして、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、TaKaRa ExTaq Polymeraseを０．０４unitに減らして、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、TaKaRa ExTaq Polymeraseを０．０２unitに減らして、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１３は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１４は、T.th. RecAタンパク質を加えないで、レーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
【０１５６】
第４２図の結果から明らかなように、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン７のうち、レーン１〜レーン５において、所望のDNAの増幅が検出された。即ち、ＰＣＲ反応液に TaKaRa ExTaq Polymerase を０．０８unit以上に加えることにより、所望のDNAが増幅された。
これに対し、T.th. RecAタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行った場合には、レーン８〜レーン１４のうち、レーン８〜レーン１０のみに、所望のDNAの増幅が検出された。即ち、ＰＣＲ反応液に TaKaRa ExTaq Polymerase を０．３１unit以上に加えた場合にのみ、所望のDNAが増幅された。
このことから、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、DNAポリメラーゼの添加量を少なくしても、所望の核酸を効率よく特異的に増幅させることができる。その理由は、相同組み換えタンパク質がプライマーDNAや鋳型DNAに結合し、プライマーDNAと鋳型DNAとの結合を促進させるため、DNAポリメラーゼの添加量を少なくしても、ＰＣＲ反応が効率よく進行するものと考えられる。
【０１５７】
【実施例１９】
次いで、第１９の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第４３図〜第４６図に示すように、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA（Promega）を、プライマーDNAとして２０種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド１１３〜１３２）を用意した。オリゴヌクレオチド１１３とオリゴヌクレオチド１１４は、Homo sapiens 16p13.3 sequence section 1 of 8 (ACCESSION AE006462 AE005175) を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１１５とオリゴヌクレオチド１１６は、Homo sapiens SVMT gene for synaptic vesicle monoamine transporter, exon 16 and complete cds (ACCESSION AB044401) を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１１７とオリゴヌクレオチド１１８は、Homo spaiens HPFH6OR gene for olfactory receptor (ACCESSION X81445 X91835) を参考にして設計した。オリゴヌクレオチド１１９とオリゴヌクレオチド１２０は、Human p53 (TP53) gene, complete cds (ACCESSION U94788) を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１２１とオリゴヌクレオチド１２２は、Human hepatocyte nuclear factor 4-alpha gene, exon 1 (ACCESSION U72959 U72960) を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１２３とオリゴヌクレオチド１２４は、Homo sapiens diacylglycerol kinase, zeta 104kDa (DGKZ), mRNA (ACCESSION NM_003646) を参考にして設計した。オリゴヌクレオチド１２５とオリゴヌクレオチド１２６は、Human rhodopsin gene, complete cds (ACCESSION U49742 K02281) を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１２７とオリゴヌクレオチド１２８は、Human DNA for CAAF1 (calcium-binding protein in amniotic fluid 1), complete cds (ACCESSION D83657) を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１２９とオリゴヌクレオチド１３０は、Homo sapiens CYP21 gene, exons 1 through 10; and steroid 21-hydroxylase (CYP21) gene, complete cds (ACCESSION M12792 M23280) を参考にして設計した。オリゴヌクレオチド１３１とオリゴヌクレオチド１３２は、Human S100 protein beta-subunit gene, exon 1 (ACCESSION M59486 J05600) を参考にして設計した。各プライマーDNAは、鋳型DNAと１００％相補的な２０〜２６merの塩基配列からなる。
【０１５８】
オリゴヌクレオチド１１３：
5'-cacagatttccaaggatgcgctg-3'
オリゴヌクレオチド１１４：
5'-cgtgctctgttccagacttg-3'
オリゴヌクレオチド１１５：
5'-cgtctggcgattgctccaaatg-3'
オリゴヌクレオチド１１６：
5'-gggcagttgtgatccatgagaa-3'
オリゴヌクレオチド１１７：
5'-ggcttgcaccagcttaggaaag-3'
オリゴヌクレオチド１１８：
5'-cgttaggcataatcagtgggatagt-3'
オリゴヌクレオチド１１９：
5'-gcctctgattcctcactgattgctct-3'
オリゴヌクレオチド１２０：
5'-tgtcaaccacccttaacccctcc-3'
オリゴヌクレオチド１２１：
5'-ttggaggggtgggtgagtcaag-3'
オリゴヌクレオチド１２２：
5'-ggaggggtgggggttaatggtta-3'
オリゴヌクレオチド１２３：
5'-ggaacaagacacggctggtt-3'
オリゴヌクレオチド１２４：
5'-agcaaggcagggcaggcaagt-3'
オリゴヌクレオチド１２５：
5'-cggtcccattctcagggaatct-3'
オリゴヌクレオチド１２６：
5'-gcccagaggaagaagaaggaaa-3'
オリゴヌクレオチド１２７：
5'-gcccccacccaggttggtttcta-3'
オリゴヌクレオチド１２８：
5'-atgccttcatctggctcagtgaa-3'
オリゴヌクレオチド１２９：
5'-gctcagcatgctggtggcataa-3'
オリゴヌクレオチド１３０：
5'-cctcataccttcccccccattt-3'
オリゴヌクレオチド１３１：
5'-gactactctagcgactgtccatctc-3'
オリゴヌクレオチド１３２：
5'-gacagccaccagatccaatc-3'
【０１５９】
次に、ＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。具体的には、５０μlのＰＣＲ反応液中に、各々０．１μM（最終濃度）の２０種類のオリゴヌクレオチドと、１００ngのヒトゲノムDNA（Promega）と、１．２５unitの TaKaRa ExTaq Polymerase（タカラバイオ）と、０．２mMのdNTP混合液と、１．０μgのT.th. RecAタンパク質を、１×ExTaq Buffer （タカラバイオ）に混合した。そして、ＰＣＲ反応を、１サイクル（９４℃，３０秒間）、３５サイクル（９４℃，１５秒間、５５℃，３０秒間、７２℃，１分間）、１サイクル（７２℃，７分間、４℃，１分間）で行った。
次に、反応液の１０μlについて１．２％のアガロースゲルで電気泳動を行い、アガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してゲル中のDNAを染色し、その後、染色されたDNAを写真に記録した。その結果を第４７図に示す。
【０１６０】
第４７図の結果から明らかなように、各々のプライマーセットに対応した所望のDNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。
このことから、複数種類のプライマーDNAを添加して同時にＰＣＲ反応を行っても、即ち、マルチプライマーＰＣＲを行っても、T.th. RecAタンパク質を加えてＰＣＲ反応をさせれば、副産物の生成を抑制しつつ、所望の核酸を増幅させることができる。前述したように、T.th. RecAタンパク質を加えることにより、プライマーDNAの濃度を下げても所望の核酸が増幅できるため、このようなマルチプライマーＰＣＲを行っても、各々のプライマーセットに対応した所望のDNAを増幅させることのできると考えられる。
【０１６１】
以上において、本発明の実施の形態を実施例に即して説明したが、本発明は上記各実施例１〜１９に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で、適宜変更して適用できることは言うまでもない。
例えば、上記各実施例では、相同組換えタンパク質として T.th. RecAタンパク質を使用したが、前述したように、それ以外のものを使用することも可能である。即ち、T.th. RecAタンパク質を改変したものであってT.th. RecAタンパク質と類似する機能を有するRecA改変タンパク質（T.th. RecA改変タンパク質）や、T.th. RecAタンパク質とT.th. RecA改変タンパク質との混合物を用いてもよい。また、T.th. RecAフラグメントを用いることもできる。
【０１６２】
さらに、上記以外のRecAタンパク質であっても、鋳型DNAに対する塩基のミスマッチが３塩基以内のプライマーDNAについてのみプライマー伸長反応が起こるRecAタンパク質を用いることができる。また、このようなRecAタンパク質またはこのRecAタンパク質を改変したタンパク質であってこのRecAタンパク質と類似する機能を有するRecA改変タンパク質の少なくともいずれかを含む相同的組換えタンパク質を利用することもできる。
【０１６３】
また、鋳型DNAが阻止的または抑制的二次構造の区域を有する場合には、一般的なＰＣＲを行ったとき、このような区域を有する所望の核酸を、効率よく特異的に増幅させることは困難である。
これに対し、本発明を適用すれば、鋳型DNAにこのような阻止的または抑制的２次構造の区域がある場合であっても、所望の核酸を効率よく特異的に増幅させることができる。その理由は、相同組み換えタンパク質が、鋳型DNAに結合することにより、阻止的または抑制的２次構造が解かれるためであると考えられる。
【０１６４】
また、上記各実施例では、別途抽出し精製したT.th. RecAタンパク質を反応液に加えてＰＣＲを行っている。しかしながら、T.th. RecAタンパク質等を発現可能なように形質転換した大腸菌等を用意し、これに熱処理を行ったものをT.th. RecAタンパク質等として利用することもできる。つまり、大腸菌等を熱処理して、耐熱性の高いT.th. RecAタンパク質等を残しつつ、他のタンパク質を失活させ、これをＰＣＲに利用する方法である。
特に、大腸菌のゲノムDNAやプラスミドDNAを鋳型DNAとする場合には、T.th. RecAタンパク質等を発現する大腸菌等に熱処理を行うことで、鋳型DNAとT.th. RecAタンパク質を同時に得ることができるので、ＰＣＲを行うための作業効率を向上させることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１６５】
以上の説明から明らかなように本発明によれば、ＰＣＲ反応において副産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅することができる核酸増幅方法、ＰＣＲ反応において副産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅することができる核酸増幅用試薬キット、ＰＣＲ反応において副産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅することができることを利用して一塩基多型を検出する一塩基多型検出方法、及び、ＰＣＲ反応において副産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅することができることを利用して一塩基多型を検出するための一塩基多型検出用試薬キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】実施例１に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図２】実施例１に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）はプライマーDNAの濃度を０．０６μMにしてＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）はプライマーDNAの濃度を０．２０μMにしてＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
【図３】実施例２に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図４】実施例２に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図５】実施例３に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図６】実施例３に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図７】実施例３に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）はプライマーDNAの濃度を変えてＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）は別のプライマーDNAを用いてプライマーDNAの濃度を変えてＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
【図８】実施例３に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は別のプライマーDNAを用いてプライマーDNAの濃度を変えてＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）は別のプライマーDNAを用いてプライマーDNAの濃度を変えてＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
【図９】実施例４に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図１０】実施例４に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図１１】実施例５に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図１２】実施例５に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図１３】実施例５に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）はアニーリング温度６０℃でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）はアニーリング温度５５℃でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
【図１４】実施例５に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）はアニーリング温度５０℃でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）はアニーリング温度４５℃でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
【図１５】実施例６に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図１６】実施例６に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）はオリゴヌクレオチド３７〜４４のいずれかを用いてＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）はオリゴヌクレオチド５４〜５８のいずれかを用いてＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
【図１７】実施例７に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は最初からプライマーDNAを添加してＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）は１サイクル後にプライマーDNAを添加してＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
【図１８】実施例７に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は３サイクル後にプライマーDNAを添加してＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）は６サイクル後にプライマーDNAを添加してＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
【図１９】実施例７に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は１０サイクル後にプライマーDNAを添加してＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）は１５サイクル後にプライマーDNAを添加してＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
【図２０】実施例８に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は初期温度７０℃の下でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）は初期温度８０℃の下でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
【図２１】実施例９に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図２２】実施例９に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）はATP-γSの非存在下でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）はATP-γSの存在下でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
【図２３】実施例１０に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図２４】実施例１０に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図２５】実施例１０に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）はT.th. RecAタンパク質の非存在下でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）はT.th. RecAタンパク質の存在下でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｃ）はT.th. SSBタンパク質の存在下でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
【図２６】実施例１１に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図２７】実施例１１に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図２８】実施例１２に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図２９】実施例１２に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図３０】実施例１３に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図３１】実施例１３に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図３２】実施例１４に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図３３】実施例１４に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図３４】実施例１５に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図３５】実施例１５に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図３６】実施例１６に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図３７】実施例１６に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図３８】実施例１７に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図３９】実施例１７に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図４０】実施例１７に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図４１】実施例１８に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図４２】実施例１８に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図４３】実施例１９に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図４４】実施例１９に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図４５】実施例１９に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図４６】実施例１９に関し、鋳型DNAと各プライマーDNAとの関係について示す説明図である。
【図４７】実施例１９に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
Claims (7)
- ＰＣＲにより核酸を増幅させる核酸増幅方法であって、
ＰＣＲ反応液中に、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）に由来するRecAタンパク質を含む相同的組換えタンパク質を混合すると共に、
前記ＰＣＲ反応液中に、複数セットのプライマーDNAを加え、
前記ＰＣＲ反応液中に、ATP-γSを加えて、ＰＣＲを行う
ことを特徴とする核酸増幅方法。 - 請求項１に記載の核酸増幅方法であって、
鋳型DNAが阻止的または抑制的２次構造の区域を有する
ことを特徴とする核酸増幅方法。 - 請求項１または請求項２に記載の核酸増幅方法であって、
前記ＰＣＲ反応液中に、KClを加えて、ＰＣＲを行う
ことを特徴とする核酸増幅方法。 - 請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の核酸増幅方法であって、
前記ＰＣＲ反応液中に、Mg2+ を加えて、ＰＣＲを行う
ことを特徴とする核酸増幅方法。 - 一塩基多型を検出するための一塩基多型検出方法であって、
鋳型DNAのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーDNAを用い、
ＰＣＲ反応液に、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）のRecAタンパク質を含む相同的組換えタンパク質を混合すると共に、
前記ＰＣＲ反応液中に、ATP-γSを加えて、ＰＣＲを行い、
所望の核酸の増幅により一塩基多型を検出する
ことを特徴とする一塩基多型検出方法。 - 請求項５に記載の一塩基多型検出方法であって、
前記ＰＣＲ反応液中に、KClを加えて、ＰＣＲを行う
ことを特徴とする一塩基多型検出方法。 - 請求項５または請求項６に記載の一塩基多型検出方法であって、
前記ＰＣＲ反応液中に、Mg2+ を加えて、ＰＣＲを行う
ことを特徴とする一塩基多型検出方法。
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