WO2004027060A1 - 核酸増幅方法、核酸増幅用試薬キット、一塩基多型検出方法、及び、一塩基多型検出用試薬キット - Google Patents

核酸増幅方法、核酸増幅用試薬キット、一塩基多型検出方法、及び、一塩基多型検出用試薬キット Download PDF

Info

Publication number
WO2004027060A1
WO2004027060A1 PCT/JP2003/011752 JP0311752W WO2004027060A1 WO 2004027060 A1 WO2004027060 A1 WO 2004027060A1 JP 0311752 W JP0311752 W JP 0311752W WO 2004027060 A1 WO2004027060 A1 WO 2004027060A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
lane
dna
nucleic acid
pcr
primer
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/011752
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yasushi Shigemori
Takehiko Shibata
Tsutomu Mikawa
Michio Oishi
Osamu Ohara
Original Assignee
Aisin Cosmos R & D Co., Ltd.
Riken
Kazusa Dna Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aisin Cosmos R & D Co., Ltd., Riken, Kazusa Dna Research Institute filed Critical Aisin Cosmos R & D Co., Ltd.
Priority to EP03797599A priority Critical patent/EP1548112B1/en
Priority to JP2004537561A priority patent/JP4455335B2/ja
Priority to DE60324819T priority patent/DE60324819D1/de
Publication of WO2004027060A1 publication Critical patent/WO2004027060A1/ja
Priority to US11/081,949 priority patent/US20050260631A1/en
Priority to US12/062,215 priority patent/US7713700B2/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Definitions

  • nucleic acid amplification method Nucleic acid amplification reagent kit, single nucleotide polymorphism detection method, and single nucleotide polymorphism detection reagent kit
  • the present invention relates to a nucleic acid amplification method for amplifying nucleic acids by PCR, a nucleic acid amplification reagent kit for amplifying nucleic acids from PCIM, and a single nucleotide polymorphism detection for detecting single nucleotide polymorphisms by PCR.
  • the present invention relates to a method for detecting single nucleotide polymorphisms by PCR and a kit for detecting single nucleotide polymorphisms,
  • nucleic acid amplification method for amplifying a nucleic acid by PCR has been known. That is, type II DNA, primer DNA, DNA polymerase, etc. are mixed in the reaction solution to specifically amplify the region sandwiched between two types of primer DNA of type III DM, To obtain nucleic acids. '
  • Patent No. 3107307 Publications 1 to 4.
  • performing a PCR reaction may amplify not only the desired nucleic acid (the correct specific PCR product) but also by-products (the non-specific PCR product). 'Furthermore, in such a case, even if the conditions of the PCR are appropriately changed, the conventional method as described above often causes amplification of by-products.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a nucleic acid amplification method capable of amplifying a desired nucleic acid while suppressing amplification of a by-product in a PCR reaction, and suppressing amplification of a by-product in a PCR reaction.
  • Kit for nucleic acid amplification that can amplify desired nucleic acids while amplifying by-products in PCR reactions
  • a method for detecting a single nucleotide polymorphism by utilizing the ability to amplify a desired nucleic acid while suppressing amplification of a product and: A method for detecting a desired nucleotide while suppressing amplification of a by-product in a PCR reaction.
  • An object of the present invention is to provide a single nucleotide polymorphism detection reagent kit for detecting a single nucleotide polymorphism by utilizing the ability to amplify nucleic acids. Disclosure of the invention
  • a solution for achieving the above object is a nucleic acid amplification method for amplifying a nucleic acid by PCR, wherein a RecA protein derived from Thermus thermophiis and a RecA protein are contained in a reaction solution.
  • a nucleic acid amplification method comprising mixing a homologous recombinant protein containing at least one of the RecA modified proteins having a function similar to that of the RecA protein and having a modified protein, and performing PCR. It is.
  • PCR is carried out by mixing a homologous recombinant protein such as RecA protein derived from Samiris thermophilus (Therimis thermophih) s into a reaction solution, and performing PCR to amplify a desired nucleic acid. .
  • a homologous recombinant protein such as RecA protein derived from Samiris thermophilus (Therimis thermophih) s into a reaction solution, and performing PCR to amplify a desired nucleic acid.
  • the amplification of by-products can be kept low without reducing the yield of the desired nucleic acid (correct specific PCR product). That is, since the presence of the homologous recombinant protein suppresses the primer DNA from binding to the non-specific region of type I DNA and causing the primer extension reaction, the non-specific PCR product Amplification can be suppressed. More specifically, according to the present invention, the nucleic acid is specifically amplified only when the mismatch between the primer DNA and the type I DNA is within 3 bases by appropriately changing the PCR conditions. You can do so.
  • PCR conditions it is possible to specifically amplify a nucleic acid only when the mismatch between the base of the primer DNA and the base DNA is within 2 bases. Furthermore, by appropriately changing the PCR conditions, It is also possible to specifically amplify a nucleic acid only when there is only one base mismatch between the primer DNA and the mirror DNA.
  • nucleic acid amplification method of the present invention a sufficient amount of nucleic acid can be amplified even if the concentration of primer DNA added to the reaction solution is kept low, and the concentration of primer DNA is reduced. This makes it possible to more specifically amplify only the desired nucleic acid while suppressing the amplification of by-products.
  • the nucleic acid amplification method has high specificity as described above, a desired nucleic acid can be specifically amplified even when the temperature conditions of the primer extension reaction such as the annealing temperature are changed. That is, in the conventional nucleic acid amplification method, if the temperature of the primer extension reaction such as the annealing temperature is set low, not only the target nucleic acid but also a large amount of by-products will be amplified, but according to the present invention, Thus, the target nucleic acid can be more specifically amplified. .
  • nucleic acid amplification method a sufficient amount of nucleic acid can be amplified as compared with the conventional method, even if the amount of DNA polymerase added to the reaction solution is kept low.
  • a desired nucleic acid can be more specifically amplified.
  • the above homologous recombinant proteins include Sam's thermophilus (Thermus thermophiis RecA protein (also referred to as T.th. RecA protein in the present specification) and T.th. RecA. Modified protein that contains at least one of the modified RecA modified protein (T.th. RecA modified modified protein) having a function similar to that of the T.th. RecA protein.
  • the modified T.th.RecA protein may be, for example, a product of a gene produced by site-specific mutagenesis from a gene encoding the T.th.RecA protein. One or more of which have an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and which have a function similar to that of T.th. RecA protein. Protein fragment There is, T.th. RecA protein Those having a function similar to the quality (T. th. RecA fragment) may be used.
  • the above homologous recombinant protein is preferably mixed in a range of 0.1 g to 100 g per 1 g of the primer DNA, more preferably in a range of 1 / g to 10 g. preferable. This is because by performing PCR within such a range, the desired nucleic acid can be more efficiently and specifically amplified.
  • Any type III DNA may be used as long as it is linear. That is, it may be composed of any base sequence, and there is no upper limit on their chain length. Therefore, for example, it may be a huge DNA having the full length of a human genome called 300 Mbp. Of course, its origin does not matter. Therefore, DNAs derived from the genomes of viruses, microorganisms, animals and plants, and DNAs modified from them, and chimeric DNAs obtained by inserting a heterologous DNA fragment into a plasmid or the like possessed by a microorganism or the like, Alternatively, an artificially synthesized oligonucleotide or the like may be used. As the type I DNA, either double-stranded DNA or single-stranded DNA can be used. Furthermore, cMA obtained by reverse transcription of MA can be used as type I DNA.
  • the primer DNA may be composed of any base sequence as long as it is substantially complementary to a considerable number of sequences located at both ends of the sequence (region) to be amplified in type I DNA.
  • the origin does not matter.
  • the base mismatch to type I DNA be within 3 bases, more preferably, the base mismatch be within 2 bases, or even 1 base mismatch. It is preferred that they have a complementarity of 100%, especially 100%.
  • the presence of homologous recombination proteins such as the T. th. RecA protein suppresses primer-DNA binding to the non-specific region of type I DM and initiating the primer-elongation reaction.
  • the primer DNA is preferably mixed at a final concentration in the range of 0.01 ⁇ M to 10 ⁇ M per each primer DNA, and more preferably in a range of 0.1 ⁇ M to 1 ⁇ . Mixing is particularly preferred. If PCR is performed in such a range, the desired nucleic acid can be more efficiently and specifically amplified. In addition, by lowering the concentration of the primer DNA than before, it is possible to more specifically amplify only the desired nucleic acid while suppressing the amplification of by-products.
  • the DNA polymerase is preferably one which is not permanently inactivated even if it is heated to a high temperature for denaturing a DNA chain in a PCR for a short time, and has activity at a high temperature.
  • thermoOhilus, etc. Methanobacterinm thennoaiitotrophi1ci] iii, Sulfolops' Solfataricus (Si) lfolob s soTfataricus, S. (S. acidocaldarius ⁇ and Thermoplasma acid film (such as Thermoplasma acidophiTum)
  • DNA polymerases derived from Thermus aquaticns (Taq DNA polymerase) and DNAs derived from Thermus thermophilus are available for reasons such as availability. It is preferable to use a polymerase (T. th. DNA polymerase) or a DNA polymerase derived from Thermococcus litoral is.
  • Taq MA polymerase for example, it is preferable to mix in a range of 0.05 unit to 5 O unit per 100 ⁇ 1. It is particularly preferable to mix in a range of 0.5 unit to 5 units. If PCR is performed in such a range, the desired nucleic acid can be more efficiently and specifically amplified. Even if the amount of DNA polymerase added is kept low, a sufficient amount of nucleic acid can be amplified as compared with the conventional method.
  • an antibody specific to MA polymerase may be mixed into the reaction solution.
  • the antibodies include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, recombinantly produced antibodies, and chemically or recombinantly produced antibody fragments (eg, Fab fragments). Of these, it is particularly preferable to use a monoclonal antibody.
  • a monoclonal antibody For example, using a known monoclonal antibody against Taq DNA polymerase, it is possible to inhibit the enzyme activity of Taq DNA polymerase at a temperature of about 20 ° C to 40 ° C, and to inhibit the thermal cycle of PCR. Inactive by high temperature.
  • PCR is generally performed in the presence of four types of dNTPs, namely, dATP, dCTP, dGTP and dTTP.
  • PCR is generally performed in a reaction solution containing a suitable buffer. This is for efficiently amplifying the nucleic acid.
  • the buffer can be appropriately changed depending on the homologous recombination protein or DNA polymerase to be used in order to obtain optimal conditions for the reaction.
  • a buffer solution obtained by adding potassium chloride / magnesium chloride to a tris-based buffer solution whose pH has been appropriately adjusted can be used.
  • 5% to 10% of MS0 and 1% to 2% of betaine may be added to the PCR reaction solution. It has the effect of minimizing the problem that the target product is difficult to amplify due to the two-letter structure of type I DNA.
  • Escherichia coli-derived HecA protein and the like have no resistance to such an agglutinating agent, but RecA protein and the like derived from common trout and Samophilus have resistance, and thus can be used in the present invention. It is possible.
  • an antibody against a homologous recombinant protein such as RecA protein derived from Thermus thermophilus may be added to the PCR reaction solution.
  • Another solution is a nucleic acid amplification method 5 in which a nucleic acid is amplified by P.
  • a primer extension reaction occurs only for a primer DNA having a base mismatch of less than 3 bases with respect to type I DNA.
  • a homologous recombination protein containing at least one of the protein A or a protein modified from the protein RecA and having at least one function similar to that of the protein RecA and having a similar function to the protein RecA. And performing PCR.
  • a primer extension reaction occurs only for a primer DNA having a mismatch of bases of less than 3 bases with type I DNA in a reaction solution.
  • the homologous recombination protein such as RecA protein is mixed and subjected to PCR to amplify the desired nucleic acid.
  • nucleic acid amplification method a sufficient amount of nucleic acid can be amplified even if the concentration of primer-DNA added to the reaction solution is kept low, and the concentration of primer-MA is lowered. This makes it possible to more specifically amplify only the desired nucleic acid while suppressing the amplification of by-products.
  • the nucleic acid amplification method has high specificity as described above, a desired nucleic acid can be specifically amplified even when the temperature conditions of the primer extension reaction such as the annealing temperature are changed. That is, in the conventional nucleic acid amplification method, when the temperature of the primer extension reaction such as the annealing temperature is set low, not only the target nucleic acid but also by-products are amplified in a large amount, but according to the present invention, It is possible to amplify the target nucleic acid more specifically become.
  • nucleic acid amplification method a sufficient amount of nucleic acid can be amplified as compared with the conventional method, even if the amount of MA polymerase added to the reaction solution is kept low.
  • a desired nucleic acid can be more specifically amplified.
  • ATP-yS is added to the reaction solution to perform PCR.
  • the above-mentioned homologous recombination protein is mixed in the reaction solution, and ATP-S is further added to perform the PCR.
  • ATP-yS that is not decomposed into ADP is preferably added to the reaction solution as in the present invention.
  • ATP-S When preparing a PCR reaction solution, it is preferable to add ATP-S before adding dNTP with T. th. RecA protein added to the reaction solution. By doing so, the desired nucleic acid can be more efficiently and specifically amplified. The reason is that if dNTP is added first, dNTP will bind to T. th. RecA protein, and ATP-S added later will be less likely to bind to T. th. RecA protein. It is thought to be because it becomes.
  • the concentration of ATP-S may be appropriately changed depending on the purpose, but usually,
  • the type III DNA has an area of an inhibitory or inhibitory secondary structure.
  • type I DNA has zones of inhibitory or inhibitory secondary structure. That is, type II DNA has a region having a secondary structure in which amplification of a nucleic acid is inhibited or suppressed when general PCR is performed. Therefore, it has been difficult to efficiently and specifically amplify a desired nucleic acid having such an area by conventional PCR.
  • PCR is performed by mixing the above-mentioned homologous recombination proteins. Therefore, even if the type II DNA has such a region of an inhibitory or inhibitory secondary structure, Nucleic acid can be efficiently and specifically amplified. The reason is considered to be that the binding of the homologous recombinant protein to type I DNA results in the release of the inhibitory or inhibitory secondary structure.
  • KC1 is added to the reaction solution to perform a PCR, and the nucleic acid amplification method be performed.
  • PCR is performed by adding KC1 to the reaction solution.
  • concentration of KC1 may be appropriately changed depending on the purpose, but it is usually 1 mM to 100 OmM, preferably 10 mM to 100 OmM.
  • Mg 2 + be added to the reaction solution and PCR be performed.
  • PCR is performed by adding Mg ′ 2 + to a reaction solution.
  • Mg ′ 2 + improves the affinity of the homologous recombinant protein for DNA described above.
  • the concentration of Mg 2+ may be appropriately changed depending on the purpose, but it is usually from 0. ImM to: L OmM, preferably from 3 mM to 10 mM.
  • a PCR is performed by adding a plurality of sets of primer DNAs to the reaction solution. It is good to use a nucleic acid amplification method.
  • PCR is performed by adding a plurality of sets of primer DNAs to a reaction solution.
  • the present invention by adding the homologous recombinant protein described above, even if the concentration of each primer DNA is reduced, it is possible to more specifically amplify only the desired nucleic acid while suppressing the amplification of by-products. . Therefore, a plurality of sets of primer DNAs can be mixed, and even if PCR is performed in this way, only the desired nucleic acid corresponding to each primer set can be obtained while suppressing amplification of by-products. It can be specifically amplified.
  • nucleic acid amplification reagent kit for amplifying a nucleic acid by PCR, comprising a DNA polymerase, four dNTPs, a buffer, and a sam- Homologous recombination containing at least one of the RecA protein of thermophilus and a modified protein of the RecA protein which has a function similar to that of the RecA protein.
  • a reagent kit for nucleic acid amplification comprising: a protein;
  • the reagent kit for nucleic acid amplification of the present invention comprises an MA polymerase, four types of dNTPs, a buffer, and a homologous recombination protein such as a T. th. RecA protein.
  • a DNA polymerase, four types of dNTPs, a buffer solution, and a homologous recombination protein such as T. th. RecA protein are added to the reaction solution.
  • PCR can be easily performed simply by preparing MA and primer DNA and adding them to the reaction solution.
  • the above-mentioned homologous recombinant protein suppresses the primer DNA from binding to the non-specific region of type I DNA and causing a primer extension reaction, thereby suppressing the amplification of non-specific PCR products. it can. Therefore, this kit Utilization of this method allows the desired nucleic acid to be more specifically amplified.
  • the DNA polymerase, four types of dNTPs, buffers, 'and homologous recombinant proteins such as T. th. RecA protein described in the present invention are the same as those described above.
  • the nucleic acid amplification reagent kit of the present invention may comprise a DNA polymerase, four types of dNTPs, a buffer, and a homologous recombination protein such as T. th. RecA protein. Just fine. Therefore, these may be separated into separate containers or the like, or two or more of these may be mixed in advance. Described below ⁇ - ⁇ S, KC1, Mg 2 + for is the same.
  • the above-mentioned reagent kit for nucleic acid amplification be provided with ATP-S.
  • the desired nucleic acid can be more specifically amplified.
  • the nucleic acid amplification reagent kit according to any one of the above, which is characterized by comprising KC1.
  • the desired nucleic acid can be further specifically amplified.
  • nucleic acid amplification reagent kit according to any one of the above, which is characterized by comprising Mg 2 +, is preferable.
  • the desired nucleic acid can be further specifically amplified.
  • Another solution is a method for detecting a single nucleotide polymorphism for detecting a single nucleotide polymorphism, wherein a primer DNA corresponding to a sequence containing a base forming the single nucleotide polymorphism among the type I DNAs is obtained.
  • the reaction solution used was the RecA protein of Samrium thermophilus (Thermus thermophiis) and a modified version of this ftecA protein, a modified RecA protein having a similar function to this RecA protein.
  • a homologous recombinant protein containing at least one of the proteins is mixed, PCR is performed, and a single nucleotide polymorphism is detected by amplifying a desired nucleic acid.
  • a method for detecting a single nucleotide polymorphism is a method for detecting a single nucleotide polymorphism.
  • a primer DNA corresponding to a sequence containing a base that forms a single nucleotide polymorphism in type I DNA is used as one of the primer DNAs. Then, a homologous recombinant protein such as T. th. RecA protein is mixed in the reaction solution, and PCR is performed. By performing PCR in this way, when the type I DNA and the primer DNA corresponding to the sequence containing a base that forms a single nucleotide polymorphism are completely complementary, the desired nucleic acid can be expanded. .
  • the base forming the single nucleotide polymorphism is not complementary to the primer DNA.
  • the desired nucleic acid can be prevented from being amplified or suppressed. Therefore, single nucleotide polymorphism can be detected by amplification of a desired nucleic acid by PCR.
  • the method for detecting a single nucleotide polymorphism is a method for detecting a single nucleotide polymorphism, wherein ATP-S is added to the reaction solution to perform PCR.
  • the above-mentioned homologous recombination protein is mixed in the reaction solution, and ATP-S is further added to perform the PCR.
  • ATP-S is further added to perform the PCR.
  • KC1 is added to the reaction solution to perform PCR, thereby detecting the single nucleotide polymorphism.
  • the desired nucleic acid can be more specifically amplified, so that the single nucleotide polymorphism can be more reliably detected.
  • a reagent kit for detecting a single nucleotide polymorphism for detecting a single nucleotide polymorphism comprising a DNA polymerase, four dNTPs, a buffer, and a Homologs containing at least one of the RecA protein of Samophilus ⁇ The rums thermoph i lus and a modified protein of the RecA protein which has a function similar to that of the RecA protein.
  • a kit for detecting single nucleotide polymorphisms comprising: a recombinant protein;
  • the kit for detecting single nucleotide polymorphisms of the present invention comprises MA polymerase, four types of dNTPs, a buffer, and a homologous recombination protein such as a T. th. EecA protein.
  • a DNA polymerase a DNA polymerase, four types of dNTPs, a buffer solution, and a homologous recombination protein such as T. th. RecA protein are added to the reaction solution, and furthermore, depending on the purpose.
  • PCR can be easily carried out simply by preparing a type II DM and a primer containing a primer DNA corresponding to a sequence containing a base that forms a single nucleotide polymorphism in the type II DNA, and adding them to the reaction solution.
  • the desired nucleic acid is amplified when the type I DNA is completely complementary to the primer-DNA corresponding to the sequence containing the nucleotides forming the single nucleotide polymorphism.
  • the ⁇ type MA and the primer DNA corresponding to the sequence containing the base forming the single nucleotide polymorphism are not completely complementary, that is, the base forming the single nucleotide polymorphism is complementary to the primer DNA, If not, the desired nucleic acid may not be amplified, or may be suppressed. For this reason, it is possible to detect a monobasic polymorphism depending on the width of a desired nucleic acid by PCIU.
  • the use of the reagent kit for detecting a single nucleotide polymorphism of the present invention makes it possible to easily detect the single nucleotide polymorphism.
  • the MA polymerase, four types of dNTPs, buffers, and homologous recombinant proteins such as T. th. RecA protein described in the present invention are the same as those described above.
  • the reagent kit for detecting a single nucleotide polymorphism of the present invention comprises a DNA polymerase, It suffices to have four types of dNTPs, a buffer, and homologous recombination proteins such as T. th. RecA protein. Therefore, each of these may be divided into separate containers, or two or more of these may be mixed in advance. The same applies to ATP- ⁇ S, KC1, and Mg 2 + described below.
  • the above-mentioned reagent kit for detecting a single nucleotide polymorphism is a reagent kit for detecting a single nucleotide polymorphism, which is provided with ATP-S. If a PCR reaction is performed using such a kit and further adding ATP- ⁇ , a single nucleotide polymorphism can be detected with higher accuracy.
  • the reagent kit for detecting a single nucleotide polymorphism according to any one of the above, which is preferably provided with KC1.
  • a PCR reaction is performed using such a kit, a single nucleotide polymorphism can be detected with higher accuracy.
  • the reagent kit for detecting a single nucleotide polymorphism may be a reagent kit for detecting a single nucleotide polymorphism, comprising Mg 2+ .
  • FIG. 1 is an explanatory diagram relating to Example 1 and showing the relationship between type I DNA and each primer MA.
  • FIG. 2 is a photograph instead of a drawing showing the results of electrophoresis of a PCR reaction product in Example 1.
  • A is a photograph showing the case where the PCR reaction was carried out at a primer DNA concentration of 0.06 M;
  • (B) is a photograph showing the PCR reaction carried out at a primer DNA concentration of 0.20. It is a photograph showing the case.
  • FIG. 3 shows the relationship between type I DNA and each primer DNA in Example 2. , r
  • FIG. 1 A first figure.
  • FIG. 4 is a photograph in place of a drawing showing the results of electrophoresis of the PCR reaction product in Example 2.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram relating to Example 3, showing the relationship between type I DNA and each primer DNA.
  • FIG. 6 is an explanatory diagram showing the relationship between type III MA and each primer MA in Example 3.
  • FIG. 7 is a photograph instead of a drawing showing the results of electrophoresis of the PCR reaction product in Example 3.
  • A is a photograph showing the case where the P reaction was performed while changing the concentration of the primer DNA
  • B is a photograph showing the case where the PCR reaction was performed while changing the concentration of the primer DNA using another primer DNA. It is a photograph shown.
  • FIG. 8 is a photograph instead of a drawing showing the results of electrophoresis of the PCR reaction product in Example 3.
  • A is a photograph showing a case where PCR was performed using another primer DNA and changing the concentration of the primer DNA.
  • B is a concentration of the primer DNA using another primer DNA.
  • 7 is a photograph showing a case where a PCR reaction was performed while changing the above.
  • FIG. 9 is an explanatory diagram relating to Example 4, showing the relationship between type I DNA and each primer DNA.
  • FIG. 10 is a photograph in place of a drawing showing the result of electrophoresis of a PCR reaction product in Example 4.
  • FIG. 11 is an explanatory view showing Example 5 (in this regard, the relationship between type I DNA and each primer DNA).
  • FIG. 12 is an explanatory diagram relating to Example 5, showing the relationship between type I DNA and each primer-DNA.
  • FIG. 13 is a photograph in place of a drawing showing the result of electrophoresis of a PCR reaction product in Example 5.
  • A is a photograph showing a case where a PCR reaction was performed at an annealing temperature of 60 ° C
  • (B) is a photograph showing a case where a PCR reaction was performed at a annealing temperature of 55 ° C.
  • FIG. 14 is a photograph in place of a drawing showing the result of electrophoresis of a PCR reaction product in Example 5.
  • (A) is a photograph showing a case where a PCR reaction was performed at an annealing temperature of 50 ° C
  • (B) is a photograph showing a case where a PCR reaction was performed at an annealing temperature of 45 ° C.
  • FIG. 15 is an explanatory diagram relating to Example 6, showing the relationship between type I DNA and each primer DNA.
  • FIG. 16 is a photograph instead of a drawing showing the results of electrophoresis of the PCR reaction product in Example 6.
  • A is a photograph showing a PCR reaction using one of oligonucleotides 37 to 44
  • B is a PCR reaction using one of oligonucleotides 54 to 58. This is a photograph showing the case where the operation is performed.
  • FIG. 17 is a photograph in place of a drawing showing the result of electrophoresis of a: PCR reaction product in Example 7.
  • A is a photograph showing the case where PCR was performed with primer DNA added from the beginning
  • B is a photograph showing the case where PCR was performed with primer DNA added one cycle later. is there.
  • FIG. 18 is a photograph in place of a drawing showing the result of electrophoresis of the PCR reaction product in Example 7.
  • A) is a photograph showing the case where PCR was performed after adding the primer DNA after 3 cycles
  • (B) is a photograph showing the case where PCR was performed after adding the primer DNA after 6 cycles. It is.
  • FIG. 19 is a photograph in place of a drawing showing the results of electrophoresis of the PCR reaction product in Example 7.
  • (A) is a photograph showing the case where PCR was performed with the addition of primer DNA after 10 cycles
  • (B) is a photograph showing the case where PCR was performed with the addition of primer DNA after 15 cycles. It is.
  • FIG. 20 is a photograph, in place of a drawing, showing the results of electrophoresis of the PCR reaction product in Example 8.
  • (A) is a photograph showing a case where the PCR reaction was performed at an initial temperature of 70 ° C
  • (B) is a photograph showing a case where the PCR reaction was performed at an initial temperature of 80 ° C.
  • FIG. 21 is an explanatory diagram relating to Example 9 and showing the relationship between rust DNA and each primer DNA.
  • FIG. 22 is a photograph in place of a drawing showing the result of electrophoresis of a PCR reaction product in Example 9.
  • A is a photograph showing the case where the PCR reaction was performed in the absence of ATP-
  • B is a photograph showing the case where the PCR reaction was performed in the presence of ATP-yS.
  • FIG. 23 is an explanatory diagram showing the relationship between type I DNA and each primer DNA in Example 10.
  • FIG. 24 is an explanatory diagram showing the relationship between type I DNA and each primer-DNA in Example 10.
  • FIG. 25 is a photograph in place of a drawing showing the result of electrophoresis of a PCR reaction product in Example 10;
  • A is a photograph showing a PCR reaction in the absence of T.th. RecA protein, and
  • B is a photograph showing a PCR reaction in the presence of T.th. RecA protein.
  • C is a photograph showing a case where a PCR reaction was performed in the presence of the T.th. SSB protein.
  • FIG. 26 is an explanatory diagram showing the relationship between mirror DNA and each primer DNA in Example 11;
  • 'FIG. 27 is a photograph replacing a drawing showing the results of electrophoresis of a PCR reaction product in Example 11;
  • FIG. 28 is an explanatory diagram relating to Example 12 and showing the relationship between type I DNA and each primer-DNA.
  • FIG. 29 is a photograph, in place of a drawing, showing the results of electrophoresis of the PCR reaction product in Example 12;
  • FIG. 30 is an explanatory diagram showing the relationship between type I DNA and each primer-DNA in Example 13;
  • FIG. 31 is a photograph in place of a drawing showing the result of electrophoresis of a PCR reaction product in Example 13;
  • FIG. 32 shows the relationship between type I DNA and each primer DNA in Example 14
  • FIG. 32 shows the relationship between type I DNA and each primer DNA in Example 14
  • FIG. 33 is a photograph in place of a drawing showing the result of electrophoresis of the PCR reaction product in Example 14;
  • FIG. 34 is an explanatory diagram showing the relationship between type I DNA and each primer DNA in Example 15;
  • FIG. 35 is a photograph in place of a drawing showing the result of electrophoresis of the PCR reaction product in Example 15;
  • the thirty-sixth is an explanatory view relating to Example 16 and showing the relationship between type I DNA and each primer DNA.
  • FIG. 37 is a photograph in place of a drawing showing the result of electrophoresis of the PCR reaction product in Example 16;
  • FIG. 38 is an explanatory diagram showing the relationship between type I DNA and each primer DNA in Example 17;
  • FIG. 39 is an explanatory diagram showing the relationship between type I DNA and each primer-MA in Example 17;
  • FIG. 40 is a photograph, in place of a drawing, showing the results of electrophoresis of the PCR reaction product in Example 17;
  • FIG. 41 is an explanatory diagram relating to Example 18 showing the relationship between type I DNA and each primer-DNA.
  • FIG. 42 is a photograph, in place of a drawing, showing the results of electrophoresis of the PCR reaction product in Example 18;
  • FIG. 43 is an explanatory diagram showing the relationship between type I DNA and each primer-DNA in Example 19;
  • FIG. 44 is an explanatory diagram showing the relationship between type I DNA and each primer-DNA in Example 19;
  • FIG. 45 is an explanatory view showing the relationship between type I DNA and each primer-DNA in Example 19;
  • FIG. 46 is an explanatory diagram showing the relationship between type I DNA and each primer DNA in Example 19; 03 011752
  • FIG. 47 is a photograph, in place of a drawing, showing the results of electrophoresis of the PCR reaction product in Example 19.
  • oligonucleotides 1 to 16 were prepared as primer DNAs. These primer DNAs were designed with reference to Homo sapiens PAC clone RP5-852P6 from 7pll .2-pZl, complete sequence. (ACCESSION AC006454). The ACCESS ION number indicates the access number of the Gene Bank (the same applies hereinafter). Each primer DNA has been designed at different positions to show the possibility of designing an arbitrary primer. Each primer DNA has a base sequence of 2 O mer which is 100% complementary to type I DNA. In addition, each primer DNA may be synthesized by a known method based on the base sequence of type I DNA.
  • Oligonucleotide 7 5 '-gagatgcccc cccatactgc-3'
  • RecA protein of Thermus thermophi Ins was prepared as a homologous recombinant protein, and DNA polymerase (Thermus aquaticus) -derived DNA polymerase (TaKaRa Taq (Yukara Bio Inc.) was prepared as a DNA polymerase.
  • DNA polymerase Thermus aquaticus
  • TaKaRa Taq Yukara Bio Inc.
  • dNTPs dATP, dCTP, dGTP and dTTP
  • potassium chloride and magnesium chloride were added to a tris-based buffer whose pH was adjusted as a buffer. Buffer solution was prepared.
  • DNA polymerase it is convenient to prepare the DNA polymerase, the four dNTPs, the buffer, and the homologous recombination protein such as the T. th. RecA protein as a reagent kit for nucleic acid amplification. .
  • DNA Poemase, 4 types of dNTPs, buffer, and homologous recombination protein such as T.th.RecA protein are added to the reaction mixture, and type II DNA and primer DNA are prepared according to the purpose. This is because PCR can be easily performed simply by adding the reaction solution to the reaction solution.
  • the nucleic acid was amplified by a PCR reaction. Specifically, two kinds of oligonucleotides at 0.06 ⁇ M (final concentration), 40 ng of human genome MA, and 1.0 unit of TaKaRa Taq And 0.2 mM dNTP mixture, 1.2 ⁇ g T.th.RecA protein, 10 mM Tris-HCl Buffer (pH 8.3), 50 mM KC1 ⁇ 1.5 mM It was mixed in MgCl 2. Then, the PCR reaction was performed for 1 cycle (70 ° C, 10 minutes, 94 ° C, 1 minute), 30 cycles (94 ° C, 30 seconds, 60 ° C, 3 ⁇ ⁇ seconds, 68 ° C). (° C, 1 minute) and 1 cycle (68 ° C, 7 minutes, 4 ° C, 1 minute).
  • Fig. 2 shows the results.
  • Lane 1 shows the results when Oligonucleotide 1 and Oligonucleotide 2 were added as the primer DNAs.
  • Lane 2 shows the results when Oligonucleotide 3 and Oligonucleotide 4 were added as primer DNAs.
  • Lane 3 shows the results when Oligonucleotide 5 and Oligonucleotide 6 were added as the primer DNA.
  • Lane 4 shows the results when primer 7 and oligonucleotide 8 were added as primer DNAs.
  • Lane 5 shows the results obtained by adding oligonucleotide 9 and oligonucleotide 10 as primer DNA.
  • Lane 6 shows the results when Oligonucleotide 11 and Oligonucleotide 12 were added as the primer-MA.
  • Lane 7 shows the addition of oligonucleotides 13 and 14 as primers.
  • Lane 8 shows the results when Oligonucleotide 15 and Oligonucleotide 16 were added as the primer DNA.
  • Lane 9 shows the same PCR response as lane 1 without addition of T.th. RecA protein.
  • Lane 10 is the result of the same PCII reaction as in Lane 2 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 12 is the result of the same P Ci reaction as in Lane 4 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 13 shows the result of the same PC reaction as in lane 5 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 14 shows the same PCR reaction as in lane 6 without the addition of T.th. RecA protein.
  • Lane 15 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 7 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 16 shows the result of a PCR reaction performed in the same manner as in Lane 8 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 17 shows the same PCR reaction as lane 1 with the primer DNA concentration increased to 0.20 M (final concentration).
  • Lane 18 shows the same PCR reaction as in lane 2 with the primer DNA concentration increased to 0.20 M (final concentration).
  • Lane 19 shows the same PCR reaction as lane 3 with the primer DNA concentration increased to 0.20 2M (final concentration).
  • Lane 20 shows the same PCR reaction as in lane 4, except that the concentration of the primer DNA was increased to 0.20 ⁇ M (final concentration).
  • Lane 21 shows the same PCR reaction as lane 5 with the primer DNA concentration increased to 0.20 M (final concentration).
  • Lane 22 shows the concentration of primer MA at 0.20 ⁇ ⁇ M (final concentration).
  • Lane 23 shows the same PCR reaction as in lane 7, with the concentration of each primer DNA increased to 0.20 ⁇ M (final concentration).
  • Lane 24 shows the same PCR reaction as in lane 8, with the primer-DNA concentration increased to 0.20 M (final concentration).
  • Lane 25 shows the same PCR reaction as lane 9 with the primer DNA concentration increased to 0.20 // M (final concentration).
  • Lane 26 shows the same PCR reaction as lane 10 with the primer DNA concentration increased to 0.20 ⁇ M (final concentration).
  • Lane 27 shows the same PCR reaction as lane 11 with the primer DNA concentration increased to 0.2 (final concentration).
  • Lane 28 shows the same PCR reaction as lane 12 with the primer DNA concentration increased to 0.20 M (final concentration).
  • Lane 29 shows the same PCR reaction as lane 13 with the concentration of primer-DNA increased to 0.20 / M (final concentration).
  • Lane 30 shows the same PCR reaction as in lane 14, except that the concentration of the primer DNA was increased to 0.20 ⁇ M (final concentration).
  • Lane 31 shows the same PCR reaction as lane 15 with the primer DNA concentration increased to 0.20 M (final concentration).
  • Lane 32 shows the same PCR reaction as lane 16 with the primer MA concentration increased to 0.20 / M (final concentration).
  • Fig. 2 (A) in lanes 1 to 8 where PCR reaction was performed with the addition of T.th. RecA protein, amplification of the desired nucleic acid (correct specific PCR product) was performed. While amplification of by-products (non-specific PCR products) was hardly detected.
  • Lanes 9 to 16 in which PCR was performed without adding the T.th. RecA protein not only the desired nucleic acid but also a large amount of by-products were detected. In some cases, amplification of the desired nucleic acid was hardly detected (lanes 15 and 16, etc.). The reason for this is that type DNA DNA should be amplified This is probably because the region has an inhibitory or inhibitory secondary structure.
  • the desired DNA was also increased in lanes 17 to 24 in which the concentration of the primer-DNA was increased and the PCR was performed by adding the T. th. RecA protein. DNA amplification was detected. However, compared with the results in lanes 1 to 8, some by-products were slightly detected. On the other hand, in Lanes 25 to 32 where PCR was performed without increasing T. th. RecA protein by increasing the concentration of primer DNA, lane 25 to lane 32 showed lower results than the corresponding lane 9 to lane 16 Was detected in a larger amount.
  • the amplification of by-products can be suppressed to a low level without reducing the yield of the desired nucleic acid. That is, the presence of the T. th. RecA protein inhibits the primer DNA from binding to the non-specific region of type I DNA and causing a primer-elongation reaction. Product amplification can be suppressed.
  • Rec.A protein can be used to efficiently and specifically amplify a desired nucleic acid even if the type I DNA has an inhibitory or inhibitory secondary structure. it can. This is probably because the binding of the homologous recombinant protein to type I DNA causes the inhibitory or inhibitory secondary structure to be released.
  • human genomic DNA was prepared as type I DNA, and 12 types of oligonucleotides (oligonucleotides 17 to 28) were prepared as primer DNA.
  • These primer DNAs are from Homo sapiens BAG clone RP11-16P10 from 7, complete sequence. (ACCESSI ON AC093734 ACO 11786).
  • Each primer-DNA is designed with its position shifted to show the possibility of arbitrary primer-design.
  • Each primer DNA has a base sequence of 2 O mer which is 100% complementary to type I DNA.
  • Lane 1 shows the results when Oligonucleotide 17 and Oligonucleotide 18 were added as the primer DNAs.
  • Lane 2 shows the results when Oligonucleotide 19 and Oligonucleotide 20 were added as the primer DNAs.
  • Lane 3 shows the results when Oligonucleotide 21 and Oligonucleotide 22 were added as the primer DNAs.
  • Lane 4 shows the results when Oligonucleotide 23 and Oligonucleotide 24 were added as the primer DNAs.
  • Lane 5 shows the results when Oligonucleotide 25 and Oligonucleotide 26 were added as the primer DNAs.
  • Lane 6 shows the results when Oligonucleotide 27 and Oligonucleotide 28 were added as the primer DNA.
  • Lane 7 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 1 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 8 shows the result of the same P reaction as in lane 2 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 9 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 3 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 10 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 4 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 11 shows the same PCR reaction as lane 5 without addition of T.th. RecA protein.
  • Lane 12 shows the result of the same PCR reaction as in lane 6 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lanes 7 to 12 in which the PCR reaction was performed without adding the T.th. RecA protein, not only the desired nucleic acid but also a large amount of by-products were detected.
  • a PCR reaction is performed with the addition of the T.th. RecA protein, amplification of by-products can be kept low without reducing the yield of the desired nucleic acid.
  • the presence of the T.th.RecA protein inhibits the primer DNA from binding to the non-specific region of type I DNA and initiating the primer extension reaction. Product amplification can be suppressed.
  • human genome MA was prepared as type I DNA, and eight kinds of oligonucleotides (oligonucleotides 29 to 36) were prepared as primer thighs. These primer DNAs were designed for a single copy gene of human genomic DNA.
  • Oligonucleotide 29 and Oligonucleotide 30 are human DNA sequence from clone EP5-1013A22 on chromosome 20 Contains the HNF4A (hepatic nuclear factor 4, alpha) gene, part of a novel gene encoding a protein similar to cellular retinaldehyde-binding protein, a RPL37A (ribosomal protein L37a) Designed with reference to pseudogene, parts of 2 novel genes, ESTs, STSs and GSSs, complete sequence. (ACCESSION AL132772).
  • HNF4A hepatic nuclear factor 4, alpha
  • RPL37A ribosomal protein L37a
  • Oligonucleotide 31 and oligonucleotide 32 were designed with reference to Homo sapiens 3q BAG RP11-529F4 (Roswell Park Cancer Institute Human BAC Library) complete sequence. (ACCESSION AC080007). Oligonucleotides 33 and 34 were designed with reference to Homo sapiens genomic beta globin region (HBB @) on chromosome 11. ACCESSION NG_000007). Oligonucleotides 35 and oligonucleotides 36 were designed with reference to Homo spaiens HPFH60R gene for olfactory receptor. (ACCESSION X81445 X91835). Each primer DNA has a base sequence of 20 mer to 25 mer which is 100% complementary to type I DNA.
  • the reaction mixture was prepared under the same conditions as in Example 1 above, except for the concentration of the primer DNA. It was created. Then, the PCR reaction was performed for 1 cycle (94 ° C, 1 minute), 30 cycles (94 ° C, 30 seconds, 60 ° C, 30 seconds, 68 ° C, 1 minute), One cycle (68, 7 minutes, 4 ° C, 1 minute) was performed. Thereafter, the reaction solution was subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel, and the results were recorded in photographs in the same manner as in Example 1 above. This is shown in Figures 7 and 8.
  • Lane 1 contains 0.3 M (final concentration) of oligonucleotide 29 and 0.3 M (final concentration) of oligonucleotide 30 as primer MA.
  • Lane 2 is the same as lane 1 without adding T.th. RecA protein; P
  • Lane 3 shows the same PCR reaction as in lane 1, with the concentrations of oligonucleotide 29 and oligonucleotide 30 reduced to 0.1 ⁇ M (final concentration).
  • Lane 4 is the same as lane 3 without adding T.th. RecA protein.
  • Lane 5 shows the same PC as lane 1 with the concentration of oligonucleotides 29 and oligonucleotides 30 reduced to 0.03 ⁇ M (final concentration) respectively.
  • Lane 6 is the same as lane 5 without adding T.th.RecA protein.
  • Lane 7 shows the same PC as lane 1 with the concentration of oligonucleotides 29 and 30 reduced to 0.01 M (final concentration), respectively.
  • Lane 8 is the same as lane 7 without adding T.th. RecA protein.
  • Lane 9 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 1 by reducing the concentrations of oligonucleotides 29 and 30 to 0.003 M (final concentration), respectively.
  • the same PCR reaction as in lane 9 was performed without adding T.th. RecA protein.
  • Lane 11 shows the addition of 0.3 ⁇ M (final concentration) of oligonucleotide 31 and 0.3 (final concentration) of oligonucleotide 32 as primer DNA.
  • Lane 12 shows the same PCII reaction as lane 11 without addition of T.th. RecA protein.
  • Lane 13 shows the same PCR reaction as in lane 11, with the concentrations of Oligonucleotide 31 and Oligonucleotide 32 reduced to 0.1 ⁇ M (final concentration).
  • Lane 14 shows the result of PCR in the same manner as in Lane; 13 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 15 shows the same PCR reaction as in lane 11, except that the concentrations of Oligonucleotide 31 and Oligonucleotide 32 were each reduced to 0.03 ⁇ M (final concentration).
  • Lane 16 shows the result of the same P reaction as in lane 15 without adding T.th. RecA protein.
  • Lane 17 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 11 by reducing the concentrations of oligonucleotide 31 and oligonucleotide 32 to 0.01 M (final concentration).
  • Lane 18 shows the same PCR reaction as lane 17 without addition of T.th. RecA protein.
  • Lane 19 shows the same PCR reaction as lane 11 except that the concentrations of oligonucleotides 31 and 32 were reduced to 0.003 M (final concentration).
  • Lane 20 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in lane 19, without adding T.th. RecA protein.
  • Lane 21 contains 0.3 ⁇ M (final concentration) of oligonucleotide 33 and 0.3 / M (final concentration) of oligonucleotide 34 as primer DNA. ⁇ Is added.
  • Lane 22 shows the same PCR reaction as lane 21 without addition of T.th. RecA protein.
  • Lane 23 shows the same PCR reaction as in lane 21 with the concentrations of oligonucleotide 33 and oligonucleotide 34 reduced to 0.1 M (final concentration), respectively.
  • Lane 24 shows the same PCR reaction as lane 23 without addition of T.th. RecA protein.
  • Lane 25 shows the same PCR reaction as in lane 21 except that the concentrations of oligonucleotide 33 and oligonucleotide 34 were reduced to 0.03 ⁇ M (final concentration).
  • Lane 26 shows the same PCR reaction as lane 25 without addition of T.th. RecA protein.
  • Lane 27 shows the same PCR reaction as in lane 21 except that the concentrations of oligonucleotide 33 and oligonucleotide 34 were reduced to 0.01 M (final concentration).
  • Lane 28 shows the same PCR reaction as lane 27 without addition of T.th. EecA protein.
  • Lane 29 shows the same PCR reaction as in lane 21 except that the concentrations of oligonucleotide 33 and oligonucleotide 34 were reduced to 0.003 M (final concentration).
  • Lane 30 shows the result of a PCR reaction performed in the same manner as in Lane 29 without adding T.th. RecA protein.
  • Lane 31 shows the addition of 0.3 M (final concentration) of oligonucleotide 35 and 0.3 M (final concentration) of oligonucleotide 36 as primer DNA.
  • Lane 32 shows the same PCR reaction as lane 31 without addition of T.th. RecA protein.
  • Lanes 33 contain oligonucleotides 35 and oligonucleotides 36 ⁇
  • the same PCR reaction as in lane 31 was performed with the concentration reduced to 1 ⁇ M (final concentration).
  • Lane 34 shows the result of a PCR reaction performed in the same manner as in Lane 33 without the addition of T.th. RecA protein.
  • Lane 35 shows the same PCR reaction as lane 31 except that the concentrations of oligonucleotides 35 and 36 were reduced to 0.03 ⁇ M (final concentration).
  • Lane 36 shows the same PCR reaction as lane 35 without addition of T.th. RecA protein.
  • Lane 37 shows the same PCR reaction as in lane 31 except that the concentrations of oligonucleotides 35 and 36 were each reduced to 0.01 M (final concentration).
  • Lane 38 shows the same PCR reaction as lane 37 without addition of T.th. RecA protein.
  • Lane 39 shows the same PCR reaction as in lane 31 with the concentrations of oligonucleotides 35 and 36 reduced to 0.003 0M (final concentration).
  • Lane 40 is the result of the same PCR reaction as in lane 39 without adding T.th. RecA protein.
  • the PCR reaction was performed without adding the T.th.RecA protein.
  • lanes 2, 4, 6, 8, and 10 excluding lane 10, not only the desired nucleic acid but also by-products were detected.
  • lane 10 almost no nucleic acid amplification was detected, probably because the concentration of the primer DNA was too low.
  • amplification of the desired nucleic acid was detected, but almost no by-products were detected.
  • the concentration of primer DNA the lower the tendency for by-product formation to be suppressed.
  • lane 19 almost no nucleic acid amplification was detected, probably because the concentration of primer-DNA was too low.
  • the concentration of the primer-DNA was the same, the amplification amount of the desired nucleic acid was larger than that obtained by performing the PCR reaction without adding the T.th. RecA protein.
  • lanes 22, 24, 26, 28, and 30 in which PCR was performed without adding T.th. RecA protein, lanes 22, 24, and 26 showed Not only the desired nucleic acid but also by-products were detected. In lanes 28 and 30, almost no nucleic acid amplification was detected, probably because the concentration of primer-DNA was too low.
  • lanes 39 were used for PCR reaction with the addition of T.th. RecA protein.
  • amplification of the desired nucleic acid was detected, but almost no by-products were detected.
  • the concentration of primer DNA the lower the tendency for by-product formation to be suppressed.
  • lane 39 almost no nucleic acid amplification was detected, probably because the concentration of primer-DNA was too low.
  • the concentration of the primer-DM was the same, the amplification amount of the desired nucleic acid tended to be larger than that obtained by performing the PCR reaction without adding the T.th.RecA protein.
  • the lanes excluding lane 40 included not only the desired nucleic acid but also the desired nucleic acid. By-products were also detected. In lane 40, amplification of nucleic acid was hardly detected, probably because the concentration of the Bramer DNA was too low.
  • the amplification of by-products can be suppressed to a low level without reducing the yield of the desired nucleic acid. That is, the presence of the T.th.RecA protein inhibits the primer DNA from binding to the non-specific region of type III DNA and causing a primer-elongation reaction. Amplification can be suppressed.
  • nucleic acid can be amplified even if the concentration of the primer DNA added to the reaction solution is kept low. Furthermore, by reducing the concentration of the primer DNA, the amplification of by-products can be suppressed while maintaining the desired It is possible to more specifically amplify only those nucleic acids.
  • human genomic DNA was prepared as type AA, and five types of oligonucleotides (oligonucleotides 37-
  • oligonucleotides 37 and 38 consist of a base sequence of 2 Omer or 21 mer which is 100% complementary to type I DNA.
  • the oligonucleotide 39 has a base sequence that differs from type I DNA by one base, and the other parts are the same as the oligonucleotide 37.
  • Oligonucleotide 40 has a base sequence that differs from type III MA by three bases, and the other parts are the same as oligonucleotide 37.
  • Oligonucleotide 41 is composed of base sequences different from each other for 5 bases with respect to type I DNA, and the other portions are the same as oligonucleotide 37.
  • Oligonucleotide 37 :
  • the nucleic acid was amplified by a PCR reaction in the same manner as in Example 3 except that the concentration of the primer DNA was set to 0.3 M (final concentration). Then, the reaction solution was subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel, and the results were recorded in a photograph in the same manner as in Example 1 above. This is the first
  • Ob-1 is obtained by adding oligonucleotide 37 and oligonucleotide 38 as primer DNA.
  • Lien 2 is obtained by adding oligonucleotide 39 and oligonucleotide 38 as primer A.
  • Lane 3 shows the results when Oligonucleotide 40 and Oligonucleotide 38 were added as the primer DNAs.
  • Lane 4 is obtained by adding oligonucleotide 41 and oligonucleotide 38 as primer DNA.
  • Lane 6 shows the same PCR reaction as lane 2 with the addition of further ImM (final concentration) of ATP-A! ).
  • Lane 7 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 3 by further adding ATP- ⁇ S (ImM (final concentration)).
  • Lane 8 shows the result when the same PCR reaction as in lane 4 was carried out with the addition of further ImM (final concentration) of ATP-S.
  • Lanes 5 to 8 where PCR was performed with the addition of P- ⁇ S
  • Lanes 5 and 6 amplification of the desired DNA was detected, but almost no by-products were detected.
  • Lanes 7 and 8 almost no nucleic acid amplification was detected.
  • amplification of by-products can be suppressed to a low level without reducing the yield of the desired nucleic acid. That is, the presence of the homologous recombinant protein described above allows the primer DNA to bind to the non-specific region of type I DNA and to extend the primer. Since a long reaction is suppressed, amplification of non-specific PCR products can be suppressed.
  • the nucleic acid in the absence of ATP-S, can be specifically amplified only when the mismatch between the primer DNA and the type I DNA is within 3 bases. . Therefore, the desired nucleic acid can be more specifically amplified by adding the T. th. RecA protein to the reaction solution.
  • the nucleic acid in the presence of ATP-S, can be specifically amplified only when the mismatch between the bases of the primer DNA and the type I DNA is within 1 base. Therefore, the desired nucleic acid can be more specifically amplified by adding ATP-yS to the reaction solution.
  • ATP -S is also a good addition to the kit. This is because, as is clear from the above Example 4, the desired nucleic acid can be more specifically amplified by adding ATP-S and performing the PCR reaction. Also, from the results of Example 4 above, it is possible to detect single nucleotide polymorphisms.
  • the base that forms a single nucleotide polymorphism with the type III DNA is obtained.
  • the desired nucleic acid can be amplified when it is completely complementary to the primer DNA corresponding to the sequence contained.
  • the ⁇ type DNA is not completely complementary to the primer DNA corresponding to the sequence containing the base forming the single nucleotide polymorphism, that is, the base forming the single nucleotide polymorphism is not complementary to the primer MA.
  • the desired nucleic acid can be prevented from being amplified or suppressed. Therefore, single nucleotide polymorphism can be detected by amplifying the desired nucleic acid by PCII.
  • the nucleic acid when ATP-yS is added, the nucleic acid can be more specifically amplified, so that amplification of a desired nucleic acid makes it possible to more reliably detect a single nucleotide polymorphism.
  • oo DNA polymerase, four types of dNTPs, a buffer, and a homologous recombinant protein such as T.th.RecA protein were prepared as a kit for detecting single nucleotide polymorphisms. It is convenient to keep.
  • a DNA polymerase a DNA polymerase, four dNTPs, a buffer, and a homologous recombination protein such as T.th.RecA protein are added to the reaction solution, and This is because a single nucleotide polymorphism can be easily detected by PCR simply by preparing the corresponding type I DNA and primer-DNA and adding them to the reaction solution.
  • ATP-S it is preferable to add ATP-S to the kit.
  • the desired nucleic acid can be further specifically amplified, so that the single nucleotide polymorphism can be more reliably detected. This is because detection can be performed.
  • oligonucleotides 42 to 53 human genomic DNA was prepared as type I DNA, and 12 types of oligonucleotides (oligonucleotides 42 to 53) were prepared as primers. Specifically, Oligonucleotide 42 and Oligonucleotide 43 were designed with reference to Homo sapiens PAC clone RP5-1142J19 from 7q35-q36, complete sequence. (ACCESSION AC004975). Oligonucleotide 44 and Oligonucleotide 45 were designed with reference to Homo sapiens PAC clone RP5-85EP6 from 7pll .2-p21, complete sequence. (ACCESSION AC006454).
  • Oligonucleotides 46 and oligonucleotides 47 were designed with reference to Homo sapiens PAC clone RP5-912I13 from 7, complete sequence. (ACCESSION AC008060). Oligonucleotides 48 and 49 are Homo sapiens BAC clone RP11-16P10 from 7, complete sequence. (ACCESSION AC093734
  • Oligonucleotide 50 and oligonucleotide 51 are also derived from Homo sapiens BAC clone CTB-135C18. 75 qoo 5qll .2-q22 5 Complete sequence. (ACCESSION AC005164). Oligonucleotide 52 and oligonucleotide 53 were designed with reference to Homo sapiens PAC clone RP5-852P6 from 7pll .2-p21, complete sequence. (ACCESS ION AC006454). Each primer DNA has a base sequence of 18 mer to 22 mer which is 100% complementary to the ⁇ -type DNA.
  • Example 4 a PCR reaction was performed under the same conditions as in Example 4 above to amplify the nucleic acid. Then, the reaction solution was subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel, and the results were recorded in a photograph in the same manner as in Example 1 above. This is shown in FIGS. 13 and 14.
  • the temperature conditions of this PCR namely, 1 cycle (94 ° C, 1 minute), 30 cycles (94 ° C, 30 seconds, 60 ° C, 30 seconds, 68 ° C, 1 cycle) 1 minute) (68 ° C, 7 minutes, 4 ° C, 1 minute).
  • the initial ring temperature is 60 ° C.
  • Lane 1 shows the results when Oligonucleotide 42 and Oligonucleotide 43 were added as the primer DNAs.
  • Lane 2 shows the results obtained by adding oligonucleotide 44 and oligonucleotide 45 as the Bramer MA.
  • Lane 3 shows the results when Oligonucleotide 46 and Oligonucleotide 47 were added as the primer DNA.
  • Lane 4 shows the results when Oligonucleotide 48 and Oligonucleotide 49 were added as the primer DNAs.
  • Lane 5 shows the results when Oligonucleotide 50 and Oligonucleotide 51 were added as the Bramer DNA.
  • Lane 6 shows the results when Oligonucleotide 52 and Oligonucleotide 53 were added as the primer DNA.
  • Lane 7 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 1 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 8 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 2 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 9 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 3 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 10 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 4 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 1 1 is the same as Lane 5 without adding T.th. RecA protein This is a PCR reaction.
  • Lane 12 shows the result of the same PCR reaction as in lane 6, without adding the T.th. RecA protein.
  • Lanes 13 to 24 are for PCR temperature conditions of 1 cycle (94 ° C, 1 minute), 30 cycles (94 ° C, 30 seconds, 55 ° C, 30 seconds, 6 cycles). 8 ° C, 1 minute) and 1 cycle (68 ° C; 7 minutes, 4 ° C, 1 minute). This is temperature condition 2. Annealing temperature is 55 ° C.
  • Lane 13 shows the same PCR reaction as in lane 1 under the above-mentioned temperature condition 2.
  • Lane 14 shows the result of the same PCR reaction as in lane 2 under the above temperature condition 2 except for the above.
  • Lane 15 shows the same PCR reaction as in Lane 3 except for the above temperature condition 2.
  • Lane 16 shows the same PCR reaction as in lane 4 under the above temperature condition 2 except for the above.
  • Lane 17 shows the same PCR reaction as lane 5 under the above-mentioned temperature condition 2.
  • Lane 18 shows the result of the same PCR reaction as in lane 6 under the above-mentioned temperature condition 2 except for the above.
  • Lane 19 shows the same PCR reaction as in Lane 7, except for the above temperature condition 2.
  • Lane 20 is the result of the same PCR reaction as in lane 8 except under the above-mentioned temperature condition 2.
  • Lane 21 shows the result of the same PCR reaction as in lane 9 under the above-mentioned temperature condition 2.
  • Lane 22 shows the result of the same PCR reaction as in lane 10 under the above-mentioned temperature condition 2.
  • Lane 23 shows the same PCR reaction as lane 11 under the above-mentioned temperature condition 2. 42 Lane 24 shows the same PCR reaction as in lane 12 under the above-mentioned temperature condition 2.
  • Lanes 25 to 36 show the PCR temperature conditions for 1 cycle (94 ° C, 1 minute), 30 cycles (94 ° C, 30 seconds, 50 ° C, 30 seconds, 6 cycles). 8 ° C, 1 minute) and 1 cycle (68 ° C, 7 minutes, 4 ° C, 1 minute). This is temperature condition 3.
  • the annealing temperature is 50 ° C.
  • Lane 25 shows the same PCR reaction as lane 1 under the above-mentioned temperature condition 3.
  • Lane 26 shows the same PCR reaction as in lane 2 under the above temperature condition 3 except for the above.
  • Lane 27 shows the same PCR reaction as in lane 3 under the above-mentioned temperature condition 3.
  • Lane 28 shows the same PCR reaction as that of lane 4 under the above-mentioned temperature condition 3 except for the above.
  • Lane 29 shows the same PCR reaction as that of lane 5 under the above temperature condition 3 except for the above.
  • Lane 30 is the result of the same PCR reaction as in lane 6 under the above-mentioned temperature condition 3 and otherwise.
  • Lane 31 shows the same PCR reaction as in lane 7, except under the above-mentioned temperature condition 3.
  • Lane 32 shows the same PCR reaction as that of lane 8 under the above temperature condition 3 except for the above.
  • Lane 33 shows the same PCR reaction as in lane 9 under the above-mentioned temperature condition 3 except for the above.
  • Lane 34 shows the result of the same PCR reaction as lane 10 under the above-mentioned temperature condition 3.
  • Lane 35 shows the same PCR reaction as that of lane 11 under the above temperature condition 3 except for the above.
  • Lanes 3 and 6 are the same as those of Lanes 1 and 2 under the above temperature conditions 3 Original 11752
  • Lanes 37 to 48 show the PCR temperature conditions for one cycle (94 ° C, 1 minute), 30 cycles (94 ° C, 30 seconds, 45 ° C, 30 seconds, 6 cycles). 1 cycle (68 ° C, 7 minutes, 4 ° C, 1 minute). This is temperature condition 4. The annealing temperature is 45 ° C.
  • Lane 37 shows the same PCR reaction as lane 1 under temperature condition 4 described above.
  • Lane 38 shows the same PCR reaction as that of lane 2 under the above-mentioned temperature condition 4 except for the above.
  • Lane 39 shows the same PCR reaction as lane 3 under the above-mentioned temperature condition 4.
  • Lane 40 shows the result of the same PCR reaction as in lane 4 under the above-mentioned temperature condition 4 except for the above.
  • Lane 41 shows the result of the same PCR reaction as in lane 5 under the above-mentioned temperature condition 4.
  • Lane 42 shows the same PCR reaction as that of lane 6 under the above-mentioned temperature condition 4 except for the above.
  • Lane 43 shows the same PCR reaction as in lane 7, except under the above temperature condition 4.
  • Lane 44 shows the same PCR reaction as that of lane 8 under the above-mentioned temperature condition 4.
  • Lanes 45 and 45 were obtained by performing the same PCR reaction as lane 9 under the above-mentioned temperature condition 4.
  • Lane 46 is the result of the same PCR reaction as lane 10 under the above-mentioned temperature condition 4.
  • Lane 47 shows the same PCR reaction as that of lane 11 under the above-mentioned temperature condition 4 except for the above.
  • Lane 48 shows the result of the same PCR reaction as in lane 12 under the above-mentioned temperature condition 4.
  • the annealing temperature was 60 ° C.
  • Amplification of nucleic acids was detected, while few by-products (nonspecific PCR products) were detected.
  • Lanes 7 to 12 in which PCR was performed without adding the T.th. RecA protein, not only the desired nucleic acid but also some by-products were detected in some of the lanes. Also, in some lanes, almost no nucleic acid amplification was detectable. This is probably because the amplified region of type I DNA has an inhibitory or inhibitory secondary structure.
  • the desired nucleic acid can be efficiently and specifically amplified even if the type I DNA has an inhibitory or inhibitory secondary structure. it can. This is probably because the binding of the homologous recombinant protein to type I DNA causes the inhibitory or inhibitory secondary structure to be released.
  • a desired nucleic acid can be specifically amplified even if the temperature conditions (annealing temperature) of the primer extension reaction are changed.
  • the temperature conditions (annealing temperature) of the primer extension reaction are changed.
  • setting the primer extension reaction temperature (annealing temperature) to a low value would result in a large amount of by-products as well as the target nucleic acid. Amplification will be achieved, but if the PCR reaction is performed with the addition of T.th. 4b It is possible to amplify the nucleus ⁇ more specifically.
  • Human genome MA was prepared as type I DNA, and five kinds of oligonucleotides (oligonucleotides 37 to 4 : 1) (see FIG. 9) similar to those in Example 4 were used as primer DNAs. As shown in Fig. 5, five types of oligonucleotides (oligonucleotides 54 to 58) were prepared.
  • oligonucleotide 54 and oligonucleotide 55 consist of a 22-mer nucleotide sequence that is 100% complementary to type I DNA.
  • Oligonucleotide 56 on the other hand, consists of a base sequence that differs from the mirror DNA by one base, and the rest is the same as oligonucleotide 54.
  • Oligonucleotide 57 has a base sequence different from that of the gun-shaped DNA by three bases, and the other portions are the same as oligonucleotide 54.
  • Oligonucleotide '58 has a base sequence different from that of type II DM by 5 bases, and the other portions are the same as oligo nucleotide 54.
  • Lane 5 shows the results when Oligonucleotide 37 and Oligonucleotide 38 were added as the primer DNA.
  • Lane 6 shows the results when Oligonucleotide 39 and Oligonucleotide 38 were added as the primer DNAs.
  • Lane 7 shows the results when Oligonucleotide 40 and Oligonucleotide 38 were added as the primer DNAs.
  • Lane 8 shows the results when Oligonucleotide 41 and Oligonucleotide 38 were added as primers MA.
  • Lane 9 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 5 by further adding 1 mM (final concentration) of ATP-S.
  • Lane 10 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 6 by further adding ATP-S of IfflM (final concentration).
  • Lane 11 is the same as lane 7, with the addition of ImM (final concentration) of ATP-S: a PCR reaction was performed.
  • Lane 12 shows the same PCR reaction as in Lane 8, with the addition of ImM (final concentration) of ATP-S.
  • Lane 1 shows the result of the same PCI reaction as in lane 5, except that T.th. RecA protein was not added, and ImM (final concentration) of ATP-S was added.
  • Lane 2 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 6 without adding the T.th. RecA protein and adding ATP-yS of ImM (final concentration).
  • Lane 3 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in lane 7, except that T.th. RecA protein was not added, and ATP-S at ImM (final concentration) was added. ⁇
  • Lane 4 shows the result of the same P reaction as in lane 8, except that T.th. RecA protein was not added, and ATPase of ImM (final concentration) was added.
  • Lane 17 shows the results when Oligonucleotide 54 and Oligonucleotide 55 were added as the primer DNA.
  • Lane 18 shows the results when Oligonucleotide 56 and Oligonucleotide 55 were added as the primer DNAs.
  • Lane 19 shows the addition of oligonucleotide 57 and oligonucleotide 55 as primer DNA.
  • Lane 20 shows the results when Oligonucleotide 58 and Oligonucleotide 55 were added as the primer DNA.
  • Lane 21 shows the same PCR reaction as in lane 17 with the addition of ImM (final concentration) of ATP-yS.
  • Lane 22 is the same as lane 18 with the addition of 1 mM (final concentration) ATP-AS; PCR reaction was performed.
  • Lane 23 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in lane 19, further adding ImM (final concentration) of ATP-S.
  • Lane 24 shows the result of the same PCI reaction as in lane 20, to which ImM (final concentration) of ATP- ⁇ S was further added.
  • Lane 13 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in lane 17 except that T.th. RecA protein was not added, and ATP-S of ImM (final concentration) was added.
  • Lane 14 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 18 without adding the T.th. RecA protein, and adding ATP-S of ImM (final concentration).
  • Lane 15 shows the same PCR reaction as lane 19, except that T.th. RecA protein was not added, and ATP-S of ImM (final concentration) was added. .
  • Lane 16 shows the results without adding the T.th. (Final concentration), and the same PCR reaction as in lane 20 was performed for the rest.
  • lanes 9 to 12 in which the PCR reaction was performed with the addition of the T.th. RecA protein and with the addition of ATP-S, lanes 9 to lane 11 showed the desired While amplification of DNA was detected, few by-products were detected. On the other hand, in Lanes 12 and 17, nucleic acid amplification could not be detected. In addition, in lane 11, the desired nucleic acid was less amplified than in lane 9 and lane 10. Furthermore, lane 11 showed less amplification of the desired nucleic acid than lane 7 described above.
  • the amplification of by-products can be suppressed to a low level without reducing the yield of the desired nucleic acid. That is, the presence of the homologous recombinant protein suppresses the primer DNA from binding to the non-specific region of the type I DNA and initiating the primer extension reaction. The amplification can be suppressed.
  • the desired nucleic acid can be more specifically amplified by adding the T.th. RecA protein to the reaction solution.
  • the nucleic acid in the presence of ATP-yS, the nucleic acid can be specifically amplified only when the mismatch between the base DNA and the base DNA is less than 1 base. Therefore, the desired nucleic acid can be more specifically amplified by adding ATP-S to the reaction solution.
  • ATP-yS can improve the specificity of PCR when T.th.RecA protein is added, but in the absence of T.th.RecA protein, that is, only ATP- ⁇ S Then, it cannot be said that the specificity of PCR can be improved.
  • the desired nucleic acid can be prevented from being amplified or suppressed. . Therefore, single nucleotide polymorphism can be detected by amplification of a desired nucleic acid by PCR.
  • the nucleic acid when ATP-S is added, the nucleic acid can be more specifically amplified, so that the amplification of the desired nucleic acid makes it possible to more reliably detect the single nucleotide polymorphism.
  • Human genomic DNA was prepared as type IV MA, and part of the oligonucleotides (oligonucleotides 38 to 40) used in Example 4 above were prepared as blood DNA (see FIG. 9).
  • Example 4 a PCR reaction was performed under the same conditions as in Example 4 and the like to amplify nucleic acids. Then, the reaction solution was subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel, and the result was recorded in a photograph in the same manner as in Example 1 above. This is shown in Figs.
  • Lane 1 shows the results when Oligonucleotide 39 and Oligonucleotide 38 were added as the primer DNA.
  • Lane 2 shows the results of adding the E. coli RecA protein in place of the T.th. RecA protein and performing the same PCR reaction as in lane 1 except for that.
  • Lane 3 shows the same PCR reaction as lane 1 except that T.th. SSB protein was added instead of T.th. RecA protein.
  • Lane 4 shows the result of the same PCR reaction as in lane 1 except that T.th. RecA protein was not added.
  • Lane 5 shows the addition of oligonucleotide 40 and oligonucleotide 38 as primer DNA.
  • Lane 6 shows E. coli RecA protein instead of T.th. RecA protein.
  • the same PCR reaction as in lane 5 was performed except for the quality.
  • Lane 7 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 5 except that T. th. SSB protein was added instead of T. th. HecA protein.
  • Lane 8 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in lane 5 except that the T. th. RecA protein was not added.
  • Lane 9 shows the results when primer DNA was added for the first time after one cycle of the primer extension reaction and then the primer extension reaction was further performed for 30 cycles, and otherwise the same PCR reaction as in lane 1 was performed. It is a thing.
  • Lane 10 shows the results when primer DNA was added for the first time after the completion of one cycle of the primer extension reaction, followed by another 3 ° cycle of the primer extension reaction, and otherwise the same PCR reaction as in Lane 2 was performed. It is.
  • Lane 11 shows the results obtained by adding primer DNA for the first time after the completion of one cycle of the primer extension reaction, and then performing the primer extension reaction for 30 cycles, and otherwise performing the same PCR reaction as lane 3. It is.
  • Lanes 12 and 13 show the results obtained by adding primer DNA for the first time after the completion of one cycle of the primer extension reaction, and then performing the primer-extension reaction for 30 cycles, and otherwise performing the same PCR reaction as lane 4. It is.
  • Lane 13 shows the results of the same PCR reaction as in Lane 5 except that the primer DNA was added for the first time after one cycle of the primer extension reaction, followed by another 30 cycles of the primer extension reaction. It is.
  • Lane 14 shows the results when primer DNA was added for the first time after the completion of one cycle of the primer extension reaction, and then the primer extension reaction was further performed for 30 cycles.Otherwise, the same PCR reaction as in lane 6 was performed. is there.
  • Lane 15 shows the results obtained by adding the primer DNA for the first time after one cycle of the primer extension reaction and then performing the 30 cycles of the primer extension reaction, and otherwise, the same PCR reaction as in lane 7 was performed. Things.
  • Lane 16 shows the results obtained by adding the primer MA for the first time after one cycle of the primer-elongation reaction, followed by 30 cycles of the primer extension reaction, and otherwise, the same PCR reaction as in lane 8 was performed. It is.
  • Lane 17 shows the results obtained by adding primer DNA for the first time after 3 cycles of the primer extension reaction and then performing another 30 cycles of the primer extension reaction.Otherwise, the same PCR reaction as in lane 1 was performed. is there.
  • Lane 18 shows the results obtained by adding the primer DNA for the first time after the completion of the three cycles of the primer extension reaction and then performing the primer extension reaction for another 30 cycles, and otherwise performing the same PCR reaction as in lane 2. It is a thing.
  • Lane 19 shows the results obtained by adding the primer MA for the first time after the completion of the three cycles of the primer extension reaction, and then performing the cycle of the primer extension for 30 cycles, and otherwise performing the same PCR reaction as in the lane 3. It is a thing.
  • Lane 20 shows the results when primer DNA was added for the first time after 3 cycles of the primer extension reaction and then 30 cycles of the primer extension reaction were performed, and otherwise the same PCR reaction as in lane 4 was performed. Things. .
  • Lane 21 is the same as lane 5 except that primer DNA was added for the first time after 3 cycles of the primer extension reaction and then the primer extension reaction was further performed for 30 cycles. It was done.
  • Lane 22 is the first time after 3 cycles of the primer extension reaction. This was the result of adding the primer DNA and then performing the primer extension reaction for another 30 cycles, and otherwise performing the same PCR reaction as in lane 6.
  • Lane 23 shows the results obtained by adding primer DNA for the first time after 3 cycles of the primer extension reaction and then performing another 30 cycles of the primer extension reaction. is there.
  • Lane 24 shows the results when primer DNA was added for the first time after 3 cycles of the primer extension reaction, and then the primer extension reaction was further performed for 30 cycles. Things.
  • Lane 25 shows the results obtained by adding primer DNA for the first time after 6 cycles of the primer extension reaction, followed by another 30 cycles of the primer extension reaction, and otherwise, the same PCR reaction as in lane 1 was performed. It is.
  • Lane 26 shows the results obtained by adding primer DNA for the first time after 6 cycles of the primer extension reaction and then performing another 30 cycles of the primer extension reaction. Things.
  • Lane 27 shows the results obtained by adding primer DNA for the first time after 6 cycles of the primer extension reaction and then performing another 30 cycles of the primer extension reaction; otherwise, the same PCR reaction as in lane 3 was performed. It is.
  • Lane 28 shows the results when primer DNA was added for the first time after 6 cycles of the primer extension reaction and then 30 cycles of the primer extension reaction were performed, and otherwise the same PCR reaction as in Lane 4 was performed. It is.
  • Lane 30 shows the results when primer DNA was added for the first time after 6 cycles of the primer extension reaction, followed by another 30 cycles of the primer extension reaction, and otherwise the same PCR reaction as in Lane 6 was performed. It is.
  • Lane 31 shows the results obtained by adding the primer DNA for the first time after 6 cycles of the primer extension reaction and then performing the 30 cycles of the primer extension reaction, otherwise performing the same PCR reaction as in lane 7. It is a thing.
  • Lane 32 shows the results of the addition of the primer-MA for the first time after the completion of the 6 cycles of the primer extension reaction, followed by another 30 cycles of the primer extension reaction, and otherwise the same PCR reaction as in lane 8 was performed. Things.
  • Lane 33 shows the results obtained by adding the primer DNA for the first time after the completion of the 10th cycle of the primer extension reaction and then performing the primer extension reaction for another 30 cycles. It is.
  • Lane 34 shows the results when the primer DNA was added for the first time after the completion of the 10 cycles of the primer extension reaction, and then the primer extension reaction was further performed for 30 cycles.Otherwise, the same PCR reaction as in the lane 2 was performed. is there.
  • Lane 35 shows the result of adding the primer DNA for the first time after the completion of the 10 cycles of the primer extension reaction and then performing 30 cycles of the primer extension reaction. It is a thing.
  • Lane 36 shows the results obtained by adding the primer DNA for the first time after the completion of the 10 cycles of the primer extension reaction, and then performing another 30 cycles of the primer extension reaction.
  • Lane 37 shows the results of adding the primer MA for the first time after the completion of the 10 cycles of the primer extension reaction and then performing the 30 cycles of the primer extension reaction.Otherwise, the same PCR reaction as in the lane 5 was performed. It is.
  • Lane 38 shows the results obtained by adding primer DNA for the first time after the completion of the 10th cycle of the primer extension reaction, and then performing another 30 cycles of the primer extension reaction, and otherwise performed the same PCR reaction as in lane 6. It is a thing.
  • Lane 39 shows the results obtained by adding the primer DNA for the first time after the completion of the 10 cycles of the primer extension reaction, and then performing another 30 cycles of the primer extension reaction. It is.
  • Lane 40 shows the results of the addition of primer DNA for the first time after the completion of the 10 cycles of the primer extension reaction, followed by another 30 cycles of the primer extension reaction, and otherwise the same PCR reaction as in lane 8 was performed. It is a thing.
  • Lane 41 shows the results when primer DNA was added for the first time after 15 cycles of the primer extension reaction, and then the primer extension reaction was further performed for 30 cycles. It is.
  • Lane 42 shows the results when primer DNA was added for the first time after the completion of 15 cycles of the primer extension reaction, and then the primer extension reaction was further performed for 30 cycles. It is.
  • Lane 43 shows the results obtained by adding the primer DNA for the first time after the completion of 15 cycles of the primer-extension reaction and then performing another 30 cycles of the primer extension reaction. It is. 1752
  • Lanes 4 and 4 show the results of adding primer DNA for the first time after the completion of 15 cycles of the primer extension reaction and then performing another 30 cycles of the primer extension reaction. It is a thing.
  • Lane 45 shows the results obtained by adding primer DNA for the first time after the completion of the 15th cycle of the primer extension reaction and then performing the primer-extension reaction for another 30 cycles. It is.
  • Lane 46 shows the results when primer DNA was added for the first time after 15 cycles of the primer extension reaction and then 30 cycles of the primer extension reaction were performed. It is a thing.
  • Lane 47 shows the result of adding the primer DNA for the first time after the completion of the 15 cycles of the primer extension reaction, and then performing another 30 cycles of the primer extension reaction, and otherwise performed the same PCR reaction as in lane 7. It is a thing.
  • Lane 48 shows the results obtained by adding primer DNA for the first time after 15 cycles of the primer extension reaction and then performing another 30 cycles of the primer extension reaction, otherwise performing the same PCR reaction as in lane 8. It is a thing.
  • Lane 5 where PCR was performed with the addition of the T. th. RecA protein, amplification of the desired DNA was detected, but almost no by-products were detected. won.
  • Lane 6 although the desired DNA width was observed, amplification of by-products was also observed.
  • Lane 7 almost no nucleic acid amplification was detected.
  • Lane 8 the desired DNA was amplified, but a large amount of by-products was also amplified.
  • Lane 13 where the PCR reaction was performed with the addition of the T. th. RecA protein, amplification of the desired DNA was detected, but almost no by-products were detected.
  • Lane 14 amplification of the desired DNA was observed, but amplification of by-products was also observed.
  • Lane 15 almost no nucleic acid amplification was detected.
  • Lane 16 the desired DNA was amplified, but a large amount of by-products were also amplified.
  • Lane 21 where PCR was performed with the addition of the T. th. RecA protein, amplification of the desired MA was detected, but almost no by-products were detected.
  • Lane 22 the desired DNA was amplified, A slight amplification of the OJ by-product was also seen. In lane 23, almost no nucleic acid amplification was detected.
  • Lane 24 the desired DM was amplified, but a large amount of by-products were also amplified.
  • PCR was performed by adding T. th. RecA protein.
  • lane 25 where the reaction was performed, amplification of the desired DNA was detected, but almost no by-product was detected.
  • Lane 26 amplification of the desired DNA was observed, but amplification of by-products was also observed.
  • Lane 27 amplification of the desired nucleic acid was observed, but almost no by-product was detected.
  • Lane 28 the desired DNA was amplified, but a large amount of by-products were also amplified.
  • Lane 37 where PCR was performed with the addition of T. th. RecA protein, amplification of the desired DNA was detected, but almost no by-products were detected.
  • Lane 38 the desired DNA was amplified, but the by-product was also amplified.
  • lane 39 amplification of the desired nucleic acid is Although it could be seen, little by-product was detected.
  • lane 40 the desired DNA was amplified, but a large amount of by-products were also amplified.
  • the E. coli RecA protein is easily denatured by the heat applied during the PCR cycle. Therefore, it is considered that the effect of the E. coli RecA protein tends to decrease. In addition, E.coli RecA protein was denatured (single-stranded). When heat denaturation occurs while bound to type I DNA, the E. coli RecA protein will not separate from type I DNA. As a result, the PCR reaction will be inhibited. When the E. coli SSB protein is added, the PCR reaction is considered to be inhibited by the same phenomenon.
  • the desired nucleic acid is not amplified when PCR is performed with the addition of the T.th. SSB protein.
  • Human genome MA was prepared as type I DNA, and five kinds of oligonucleotides 37 to 41 were prepared as primer DNAs in the same manner as in Example 4 (see FIG. 9).
  • the nucleic acid was amplified by the PCR reaction in the same manner as in Example 1 except that the concentration of the primer DNA was 0.3 M, respectively.
  • this PCR temperature condition 1 cycle (70 ° C ;, 10 minutes, 94 ° C, 1 minute), 30 cycles (94 ° C, 30 seconds, 60 ° C , 30 seconds, 68 ° C, 1 minute) and one cycle (68 ° C; 7 minutes, 4 ° C, 1 minute) are temperature conditions 5.
  • the initial temperature in the first cycle (initial temperature) is 70 ° C.
  • the reaction solution was subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel, and the results were recorded in a photograph in the same manner as in Example 1 above. This is shown in FIG.
  • Lane 5 shows the results when Oligonucleotide 37 and Oligonucleotide 38 were added as the primer DNAs.
  • Lane 6 shows oligo nucleotide 39 and oligo as primer DNA. n Nucleotides 38 added.
  • Lane 7 shows the results when Primer DM and Oligonucleotide 40 and Oligonucleotide 38 were added.
  • Lane 8 shows the results when Oligonucleotide 41 and Oligonucleotide 38 were added as the primer DNA.
  • Lane 1 shows the result of the same PCR reaction as in lane 5 except that T.th. RecA protein was not added.
  • Lane 2 shows the result of PCR in the same manner as in lane 6, except that T.th. RecA protein was not added.
  • Lane 3 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 7 except that the T.th. RecA protein was not added.
  • Lane 4 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 8 except that the T.th. RecA protein was not added.
  • Lane 9 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 5 except that E. coli RecA protein was added instead of the T.th. RecA protein.
  • Lane 10 shows the results when PCR was performed in the same manner as in Lane 6 except that E. coli RecA protein was added instead of T.th. RecA protein.
  • Lane 11 E.coli RecA protein was added in place of T.th.RecA protein, and the same PCR reaction was performed as in Lane 7 except for o.
  • Lane 12 shows the same PCR reaction as lane 8, except that E. coli RecA protein was added instead of T.th. RecA protein.
  • Lanes 13 to 24 show the PCR temperature conditions for one cycle (80 ° C, 1 ° minute, 94 ° C, 1 minute), 30 cycles (94 ° C, 30 seconds, 60 ° C, 30 seconds, 68 ° C; 1 minute) and 1 cycle (68 ° C, 7 minutes, 4 ° C, 1 minute).
  • the initial temperature in the first cycle (initial temperature) is 80 ° C.
  • Lane 13 shows the result of the same PCR reaction as in lane 1 under the above-mentioned temperature condition 6.
  • Lane 14 shows the result of the same PCR reaction as in lane 2 under the above-mentioned temperature condition 6.
  • Lane 15 shows the result of the same PCR reaction as in lane 3 under the above-mentioned temperature condition 6.
  • Lane 16 shows the result of the same PCR reaction as in lane 4 under the above-mentioned temperature condition 6.
  • Lane 17 shows the same PCR reaction as that of lane 5 under the above temperature condition 6 except for the above.
  • Lane 18 shows the result of the same PCR reaction as in lane 6 under the above-mentioned temperature condition 6.
  • Lane 19 was obtained by performing the same PCR reaction as in Lane 7 under the above-mentioned temperature condition 6 and otherwise.
  • Lane 20 is the result of the same PCR reaction as in lane 8 under the above-mentioned temperature condition 6.
  • Lane 21 is the result of the same PCR reaction as in lane 9 under the above-mentioned temperature condition 6.
  • Lane 22 shows the result of the same PCR reaction as in lane 10 under the above-mentioned temperature condition 6.
  • Lane 23 shows the same PCR reaction as that of lane 11 under the above-mentioned temperature condition 6.
  • Lane 24 shows the result of the same PCR reaction as in lane 12 under the above-mentioned temperature condition 6.
  • Lanes 9 to 12 in which PCR was performed with the addition of E. coli RecA protein desired DNA was amplified in Lanes 9 to 11, but there were some by-products. was detected. In lane 12, almost no nucleic acid amplification was detected.
  • Lanes 21 to 24 in which PCR was performed with the addition of E. coli RecA protein desired DNA was amplified in Lanes 21 to 23. By-products were also detected. The amount of this by-product was higher than when T.th. RecA protein was added. In lane 24, almost no nucleic acid amplification was detected.
  • human genome MA was prepared as type I DNA, and five types of oligonucleotides (oligonucleotides 59 to 63) were prepared as primer DNA. These primer DNAs were designed with reference to Homo sapiens BAG clone CTB-135C18 from 7qll.2-q22, complete sequence. (ACCESSION AC005164).
  • Oligonucleotide 60 and oligonucleotide 61 among the primer DNAs consist of a 22-mer nucleotide sequence that is 100% complementary to type III DNA.
  • Oligonucleotide 59 has one base of oligonucleotide 61 changed from C to A, and oligonucleotide 62 has one base of oligonucleotide 61 changed from C to G.
  • Oligonucleotide 63 is one in which one base of oligonucleotide 61 is changed from C to T.
  • Oligonucleotide 62
  • the nucleic acid was amplified by a PCR reaction under the same conditions as in Embodiment 4 above. Then, the reaction solution was subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel, and the results were recorded in a photograph in the same manner as in Example 1 above. This is shown in FIG.
  • Lane 1 shows the addition of oligonucleotide 59 and oligonucleotide 60 as primers.
  • Lane 2 shows the results when Oligonucleotide 61 and Oligonucleotide 60 were added as the primer DNA.
  • Lane 3 shows the results when Oligonucleotide 62 and Oligonucleotide 60 were added as the primer DNA.
  • Lane 4 shows the results when Oligonucleotide 63 and Oligonucleotide 60 were added as the primer DNA.
  • Lane 5 shows the result of the same PCR reaction as in lane 1, with the addition of 1 mM (final concentration) of ATP-S.
  • Lane 6 shows the result when the same PCR reaction as in lane 2 was carried out with the addition of further ImM (final concentration) of ATP-S.
  • Lane 7 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 3 by further adding ATP- ⁇ S (ImM (final concentration)).
  • Lane 8 shows lane 4 with the addition of additional ImM (final concentration) ATP-S. JP2003 / 011752
  • the lane 1 to lane 4 in which the PCR was performed without adding ATP- ⁇ S showed the desired DNA (correct specific PCR product) for all lanes. While amplification was detected, by-products (non-specific PCR products) were hardly detected.
  • Lanes 5 to 8 in which the PCR reaction was performed with the addition of ATP-S, in Lane 6, amplification of the desired DNA was detected, but almost no by-products were detected. On the other hand, in Lanes 5, 7, and 8, almost no nucleic acid amplification was detected.
  • the nucleic acid in the presence of ATP-S, can be specifically amplified only when the primer DNA and the type I DNA are 100% complementary. Therefore, the desired nucleic acid can be further specifically amplified by adding ATP-yS to the reaction solution.
  • the primer MA DNA and the primer MA corresponding to the sequence containing the base forming the single nucleotide polymorphism are not completely complementary, that is, when the base forming the single nucleotide polymorphism is not complementary to the primer DNA
  • the desired nucleic acid can be prevented from being amplified or suppressed. Therefore, it is possible to detect a single nucleotide polymorphism by amplifying a desired nucleic acid by PCR.
  • oligonucleotides 64 to 6 were used as primer DNA.
  • oligonucleotide 65 and oligonucleotide 68 consist of a base sequence of 2 O mer or 2 l mer which is 100% complementary to type III DM.
  • Origonukureochi de 6 4 which has changed to A to one base 3 base from T 3 to 5 end of O oligo nucleotides 6-8, oligonucleotide 6 6, of the oligonucleotide 6 8 3 'The first base at the third base from the end is changed from T to C.
  • Oligonucleotide 67 is the third base of oligonucleotide 68 at the third base from the end. It is changed to G.
  • Oligonucleotide 66
  • Oligonucleotide 68
  • oligonucleotides were used as primer DNA.
  • oligonucleotide 70 and oligonucleotide 71 consist of a 22-mer nucleotide sequence that is 100% complementary to type I DNA.
  • oligonucleotide 69 is an oligonucleotide 71
  • Oligonucleotide 72 is the first base at the 4th base from the 3 'end of oligonucleotide 71. Oligonucleotide
  • Reference numeral 73 denotes a case where the first base at the third and fourth bases of the oligonucleotide 71 is changed from C to T.
  • Ex Taq (Yukara Bio) was used, and 1 mM (final concentration) of ATP- ⁇ S was further added.
  • the nucleic acid was amplified by PCR under the same conditions as described above. It is known that this Ex Taq does not recognize the base sequence at the 3 'end of the primer DNA under normal (conventional) PCR conditions.
  • the reaction solution was subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel, and the results were recorded in a photograph in the same manner as in Example 1 above. This is shown in Figure 25.
  • Lane 9 shows oligonucleotides 64 and oligos as primer DNA. Nucleotides 65 added.
  • Lane 10 shows the results when Oligonucleotide 66 and Oligonucleotide 65 were added as the primer DNA.
  • Lane 11 shows the results when Oligonucleotide 67 and Oligonucleotide 65 were added as the primer DNAs.
  • Lane 12 shows the results obtained by adding oligonucleotide 68 and oligonucleotide 65 to primer DNA.
  • Lane 13 shows the results when Oligonucleotide 69 and Oligonucleotide 70 were added as primer MA.
  • Lane 14 shows the results obtained by adding oligonucleotide 71 and oligonucleotide 70 as the primer MA.
  • Lane 15 contains primer DNA 72 and oligonucleotide 70 as primer DNA.
  • Lane 16 shows the results when Oligonucleotide 73 and Oligonucleotide 70 were added as the primer DNA.
  • Lane 1 shows the result of the same PCR reaction as in lane 9 except that T.th. RecA protein was not added.
  • Lane 2 shows the result of the same PCR reaction as in lane 10 except that T.th. RecA protein was not added.
  • Lane 3 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in lane 11 except that T.th. RecA protein was not added.
  • Lane 4 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 12 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 5 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 13 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 6 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 14 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 7 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in lane 15 except that T.th. RecA protein was not added.
  • Lane 8 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in lane 16 except that T.th. RecA protein was not added.
  • Lane 17 shows the same PCR reaction as lane 9 except that T.th. SSB protein was added instead of T.th. RecA protein.
  • Lane 18 shows the results when PCR was performed in the same manner as in Lane 10 except that T.th.SSB protein was added instead of T.th.RecA protein.
  • Lane 19 shows the same PCR reaction as lane 11 except that T.th. SSB protein was added in place of T.th. RecA protein.
  • Lane 20 shows the results when PCR was performed in the same manner as in Lane 12 except that T.th. SSB protein was added instead of T.th. RecA protein.
  • Lane 21 shows the same PCR reaction as lane 13 except that T.th. SSB protein was added instead of T.th. RecA protein.
  • Lane 22 shows the same PCR reaction as lane 14 except that T.th. SSB protein was added in place of T.th. RecA protein.
  • Lane 23 shows the same PCR reaction as in lane 15 except that T.th.SSB protein was added instead of T.th.RecA protein.
  • Lane 24 shows the same PCR reaction as lane 16 except that T.th. SSB protein was added instead of T.th. RecA protein.
  • the PCR reaction is performed by adding the T. th. RecA protein, the amplification of by-products can be suppressed to a low level without reducing the yield of the desired nucleic acid.
  • the presence of the above-mentioned homologous recombinant protein suppresses the primer DNA from binding to the non-specific region of type I DNA and causing a primer extension reaction, thereby increasing the non-specific PCR product.
  • the width can be suppressed.
  • the nucleic acid in the presence of ATP-S, can be specifically amplified only when the Bramer DNA and the type I DNA are 100% complementary. Therefore, the desired nucleic acid can be further specifically amplified by adding ATP-S to the reaction solution.
  • the primer MA DNA and the primer MA corresponding to the sequence containing the base forming the single nucleotide polymorphism are not completely complementary, that is, when the base forming the single nucleotide polymorphism is not complementary to the primer DNA
  • the desired nucleic acid can be prevented from being amplified or suppressed. Therefore, single nucleotide polymorphism can be detected by amplification of a desired nucleic acid by PCR.
  • oligonucleotides 74 to 79 human genomic DNA (Promega) was prepared as type I DNA, and six types of oligonucleotides (oligonucleotides 74 to 79) were prepared as primer MA. Oligonucleotides 74 and oligonucleotides 75 were designed with reference to Human S100 protein beta-subunit gene, exon 1 (ACCESSION M59486 J05600). The oligonucleotides 76 and oligonucleotides 77 were designed with reference to Homo sapiens blue cone opsin gene, complete cds (ACCESSION L32835).
  • Oligonucleotides 78 and oligonucleotides 79 were designed with reference to Homo sapiens beta globin region (HBB @) on chromosome 11 (ACCESSION NG_000007).
  • Each primer DNA consists of ⁇ type DNA and 10
  • the nucleic acid was amplified by a PCR reaction. Specifically, 0.5 PCR (final concentration) of each of two types of oligonucleotides, 20 ng of human genomic DNA (Promega), and 1.0 unit TaKaRa
  • Lane 1 shows the results when Oligonucleotide 74 and Oligonucleotide 75 were added as the primer DNAs.
  • Lane 2 shows the results when Oligonucleotide 76 and Oligonucleotide 77 were added as the primer DNA.
  • Lane 3 shows the results when Oligonucleotide 78 and Oligonucleotide 79 were added as the primer DNA.
  • Lane 4 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 1 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 5 shows the result of the same PCR reaction as in lane 2 without adding T.th. RecA protein.
  • Lane 6 shows the result of the same PCR reaction as in lane 3 without adding T.th. RecA protein.
  • Lane 7 shows the same PCR reaction as in lane 1, except that the same amount of E. coli HecA protein was added instead of the T.th. RecA protein.
  • Lane 8 shows the same PCR reaction as in lane 2, except that the same amount of E. coli RecA protein was added instead of the T.th. RecA protein.
  • Lane 9 shows the result when the same amount of E. coli RecA protein was added in place of the T.th.
  • lanes 7 to 9 in which PCR was performed by adding E. coli RecA protein instead of T. th. RecA protein lanes 4 to 6 were used in addition to the desired nucleic acid. To a lesser extent, by-products were detected.
  • amplification of by-products can be kept low without reducing the yield of the desired nucleic acid. That is, the presence of the T.th. RecA protein suppresses the binding of the primer DNA to the non-specific region of the type I DNA to cause the primer extension reaction. CR product amplification can be suppressed.
  • human genomic DNA (Promega) was prepared as type I DNA, and five kinds of oligonucleotides (oligonucleotides 80 to 84) were prepared as primer DNA.
  • These primer DNAs were designed with reference to Homo sapiens BAC clone CTB-135C18 from 7qll.2-q22, complete sequence (ACCESSION AC005164) and Homo sapiens chromosome 19 clone CTD-2166J9, complete sequence (ACCESSION AC010412). .
  • the primer DNA on the feed side (oligonucleotides 80 to 83) is shifted in position to show the possibility of arbitrary primer design. It is designed.
  • the reverse primer DNA (oligonucleotide 84) is common.
  • Each primer DNA consists of a 22-mer nucleotide sequence that is 100% complementary to type I MA.
  • Oligonucleotide 84
  • Lane 1 shows the results when Oligonucleotide 80 and Oligonucleotide 84 were added as the primer DNA.
  • Lane 2 shows the addition of oligonucleotide 81 and oligonucleotide 84 as primer DNA.
  • Lane 3 shows the results when Oligonucleotide 82 and Oligonucleotide 84 were added as the primer DNAs.
  • Lane 4 shows the results when Primer MA was supplemented with Oligonucleotide 83 and Oligonucleotide 84.
  • Lane 5 shows the result of the same PCR reaction as in lane 1 without adding T. th. RecA protein.
  • Lane 6 shows the result when PCR was carried out in the same manner as in Lane 2 without adding the T. th. RecA protein.
  • Lane 7 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 3 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 8 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 4 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 9 shows the same PCR reaction as in lane 1, except that the same amount of E. coli HecA protein was added instead of T.th. RecA protein.
  • Lane 10 shows the results when the same amount of E. coli RecA protein was added in place of the T.th. RecA protein and the same PCR reaction was performed as in lane 2 except for that.
  • Lane 11 shows the same PCR reaction as in lane 3, except that the same amount of E. coli RecA protein was added instead of T.th. RecA protein.
  • Lane 12 shows the same PC reaction as in lane 4, except that the same amount of E. coli HecA protein was added instead of T.th. RecA protein.
  • lanes 9 to 12 in which PCR was performed by adding E. coli RecA protein instead of T.th. RecA protein lanes 5 to 8 were added in addition to the desired nucleic acid. However, by-products were also detected.
  • human genomic DNA (Promega) was prepared as type I DNA, and oligonucleotide 85 and oligonucleotide 86 were prepared as primer DNA. These primer DNAs were designed using the single copy gene of the human genome MA. Each primer DNA consists of a 20 to 2 lmer base sequence that is 100% complementary to type I DNA.
  • each of the two oligonucleotides at 1.0 ⁇ M (final concentration) and 200 ng of human genome MA (Promega) were prepared as follows: 1. 0 unit of TaKaRa Taq-HS (Evening Color Bio), 0.2 mM dNTP mixture, and 1.0 g of T.th. RecA protein were mixed with 1 OmM Tris-HC1 Buffer (pH 8.3), It was mixed with 5 OmM KC1 and 1.5 mM MgCl2.
  • the PCR reaction was performed for 1 cycle (90 ° C for 31 minutes), 30 cycles (94 ° C, 30 seconds, 60 ° C, 30 seconds, 68 ° C for 31 minutes), 1 cycle Cycle (68 ° C, 7 minutes, 4 ° C, 1 minute)
  • the reaction solution was subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel, and the agarose gel was immersed in a solution of ethidium bromide to stain the DNA in the gel.
  • Fig. 31 shows the results.
  • Lane 1 shows the results obtained by performing a PCR reaction using the primer-DNA concentration of 1.0 ⁇ M (final concentration) as described above.
  • Lane 2 shows the same PCR reaction as in lane 1 except that the concentration of primer DNA was reduced to 0.3 0M (final concentration).
  • Lane 3 shows the results when the PCR reaction was performed in the same manner as in lane 1 except that the concentration of the primer DNA was reduced to 0.1 zM (final concentration).
  • Lane 4 shows the results of a PCR reaction similar to that of lane 1 except that the concentration of the primer DNA was reduced to 0.03 ⁇ M (final concentration).
  • Lane 5 shows the results obtained by performing the same PCR reaction as in lane 1 except that the concentration of the primer DNA was reduced to 0.01 M (final concentration).
  • Lane 6 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 1 except that the concentration of the primer DNA was reduced to 0.003 0M (final concentration).
  • Lane 7 shows the results obtained by performing the same PCR reaction as in lane 1 except that the concentration of the primer-DNA was reduced to 0 ⁇ 001 ⁇ M (final concentration).
  • Lane 8 shows the same PCR reaction as in lane 1 except that the concentration of the primer DNA was reduced to 0.003 ⁇ M (final concentration).
  • Lane 9 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 1 without adding the T. th. RecA protein.
  • Lane 10 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 2 without adding T.th. RecA protein.
  • Lane 11 shows the result of the same PCR reaction as in lane 3 without adding T.th. RecA protein.
  • Lane 12 shows the result of the same PCR reaction as in lane 4 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 13 shows the same PCR reaction as lane 5 without addition of T.th. RecA protein.
  • Lane 14 shows the same PCR reaction as in lane 6 without addition of T.th. RecA protein.
  • Lane 15 shows the same PCR reaction as lane 7 without addition of T.th. RecA protein.
  • Lane 16 shows the same PCR reaction as in Lane 8 without addition of T.th. RecA protein.
  • Lanes 9 to 16 in which the PCR reaction was performed without adding the T.th.RecA protein in Lanes 9 to 12, not only the desired nucleic acid but also by-products were observed. was detected. In lanes 13 and 14, amplification of the desired nucleic acid was detected, but by-products were hardly detected. In Lanes 15 and 16, almost no nucleic acid amplification was detected, probably because the concentration of the primer DNA was too low.
  • amplification of by-products can be kept low without reducing the yield of the desired nucleic acid. That is, the presence of the T.th. RecA protein Since the oligomer DNA is prevented from binding to the non-specific region of type I DNA to cause a primer extension reaction, amplification of the non-specific PCR product can be suppressed.
  • human genomic DNA Promega
  • type I DNA human genomic DNA
  • oligonucleotides 87 to 91 oligonucleotides 87 to 91
  • primer DNAs are Homo sapiens BAG clone CTB-135C18 from 7ql l.2-q22, complete sequence
  • the primer MA (oligonucleotides 87 to 90) differs in the third nucleotide sequence from the 3 ′ end, and the oligonucleotide 90 has 100% complementarity with the type I MA. It is a target.
  • the other primer DNA (oligonucleotide 91) is common and 100% complementary to type I DNA. Each primer DNA is
  • the nucleic acid was amplified by a PCR reaction. Specifically, 50 ⁇ 1 P
  • Lane 1 shows the results obtained by adding oligonucleotide 87 and oligonucleotide 91 as the primer MA.
  • Lane 2 shows the results when Oligonucleotide 88 and Oligonucleotide 91 were added as the primer DNA.
  • Lane 3 shows the addition of oligonucleotide 89 and oligonucleotide 91 as primer DNA.
  • Lane 4 shows the results obtained by adding oligonucleotide 90 and oligonucleotide 91 to the primer DNA.
  • Lane 5 shows the result of the same PCR reaction as in lane 1 without adding T.th. RecA protein.
  • Lane 6 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 2 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 7 shows the result of the same P reaction as in lane 3 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 8 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 4 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 9 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in lane 1 except that the same amount of T.th. SSB protein was added instead of the T.th. RecA protein.
  • Lane 10 shows the same amount of T.th.SSB instead of T.th.RecA protein. .
  • Lane 11 shows the same PCR reaction as lane 3 except that the same amount of T.th. SSB protein was added instead of T.th. RecA protein.
  • Lane 12 shows the same PCR reaction as lane 4 except that the same amount of T.th. SSB protein was added instead of T.th. RecA protein.
  • the desired DNA amplification was detected in any of lanes 5 to 8 in which the PCR reaction was performed without adding the T.th. RecA protein. In lanes 5 and 6, by-products were also amplified.
  • amplification of by-products can be kept low without reducing the yield of the desired nucleic acid. That is, the presence of the homologous recombinant protein suppresses the occurrence of the primer-elongation reaction due to the binding of the primer-DNA to the non-specific region of the type I DNA. CR product amplification can be suppressed. Specifically, specifically amplify nucleic acids only when there is no base mismatch between primer DNA and type I DNA. Becomes possible.
  • nucleic acid tends to be easily amplified.
  • a desired nucleic acid can be specifically amplified by performing a PCR reaction with the addition of the T. th. RecA protein.
  • the type I DNA and the primer corresponding to the sequence containing the base forming the single nucleotide polymorphism are not completely complementary, that is, when the base forming the single nucleotide polymorphism is not complementary to the primer-DNA
  • the desired nucleic acid can be prevented from being amplified or suppressed. Therefore, single nucleotide polymorphism can be detected by amplification of a desired nucleic acid by PCR.
  • human genomic DNA (Promega) was prepared as type I DNA, and five kinds of oligonucleotides (oligonucleotides 92 to 96) were prepared as primer DNA.
  • These primer DNAs were designed with reference to Homo sapiens PAC clone RP5-1142J19 from 7q3o-q36, complete sequence (ACCESSION ON AC004975).
  • One of the primer DNAs (oligonucleotides 92 to 95) has a different base sequence from the third end to the third end, and oligonucleotide 93 is 100% complementary to type I DNA. It is.
  • the other primer DNA (oligonucleotide 96) is common and 100% complementary to type I MA.
  • Each primer MA It consists of a base sequence of 20 to 2 mer.
  • Lane 1 shows the results when Oligonucleotide 92 and Oligonucleotide 96 were added as the primer DNA.
  • Lane 2 shows the results when Oligonucleotide 93 and Oligonucleotide 96 were added as the primer DNA.
  • Lane 3 shows the results when Oligonucleotide 94 and Oligonucleotide 96 were added as the primer DNAs.
  • Lane 4 shows the results when Oligonucleotide 95 and Oligonucleotide 96 were added as the primer DNAs.
  • Lane 5 shows the result of the same PCR reaction as in lane 1 without adding T. th. RecA protein.
  • Lane 6 shows the result of the same PCR reaction as in lane 2 without adding T. th. RecA protein.
  • Lane 7 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 3 without adding the T. th. RecA protein. .
  • Lane 8 is the result of the same PCR reaction as in lane 4 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 9 shows the results when the same amount of T.th. SSB protein was added instead of the T.th. RecA protein, and the same P reaction was performed as in lane 1 except for that.
  • Lane 10 shows the results when the same amount of T.th. SSB protein was added instead of the T.th. RecA protein, and the same PCR reaction was performed as in lane 2 except for that.
  • Lane 11 shows the result of adding the same amount of T.th. SSB protein in place of T.th. RecA protein and performing the same PCR reaction as Lane 3 except for the same amount.
  • Lane 12 shows the same PCR reaction as in Lane 4, except that the same amount of T.th. SSB protein was added instead of T.th. RecA protein.
  • the base that forms a single nucleotide polymorphism with the type III DNA is obtained.
  • the desired nucleic acid can be amplified when the primer DNA corresponding to the contained sequence is completely complementary.
  • the ⁇ MA and the primer DNA corresponding to the sequence containing the base forming the single nucleotide polymorphism are not completely complementary, that is, the base forming the single nucleotide polymorphism is complementary to the primer DNA. If not, the desired nucleic acid may not be amplified or suppressed. Therefore, single nucleotide polymorphism can be detected by amplification of a desired nucleic acid by PCR.
  • human genomic DNA (Promega) was prepared as type I DNA, and oligonucleotide 97 and oligonucleotide 98 were prepared as primer DNA.
  • primer DNAs are human chromosome 14 DNA sequence BAC C-2240H23 of l ibrary CalTech-D from 00
  • Each primer DNA consisted of ⁇ type MA and 10
  • the nucleic acid was amplified by a PCR reaction. Specifically, 50 zl P
  • Lane 1 contains T.th. RecA protein as described above.
  • Lane 2 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 1 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 2 in which the PCR was performed without adding the T.th. RecA protein, amplification of the desired DNA was not detected. This is the type I DNA Probably due to the presence of areas of secondary structure that are either inhibitory or inhibitory.
  • the PCR reaction with the T. th. RecA protein can efficiently and specifically target the desired nucleic acid even if the type II DNA has an area of inhibitory or inhibitory secondary structure. Can be amplified. The reason may be that the homologous recombinant protein binds to type I DNA, and the inhibitory or inhibitory secondary structure is released.
  • oligonucleotide 99 and oligonucleotide 1 ⁇ 0 refer to Human DNA sequence from clone RP11-760M1 on chromosome 13, complete sequence (ACCESSION AL354815) and Human hepatocyte nuc lear factor 4-alpha gene, exon 1 (ACCESSION U72959 U72960) was designed.
  • Oligonucleotide 101 and Oligonucleotide 102 were designed with reference to Human rhodopsin gene, complete cds (ACCESSION U49742 K02Z81).
  • Oligonucleotide 103 and Oligonucleotide 104 were designed with reference to Homo sapiens beta globin region (HBB @) on chromosome 11 (ACCESS ION NG_000007).
  • Oligonucleotide 1 5 and oligonucleotide 106 were designed with reference to Homo spaiens HPFH60R gene for olfactory receptor (ACCESSION X81445 X91835).
  • Oligonucleotide 107 and oligonucleotide 108 were designed with reference to Human p53 (TP53) gene, complete cds (ACCESSION U94788). Oligonucleotide 109 and oligonucleotide 110 were designed with reference to Human p53 (TP53) gene, complete cds (ACCESSION U94788). Each primer DNA has a base sequence of 20 to 27 mer that is 100% complementary to type I DNA. nn oligonucleotide 9 9:
  • Oligonucleotide 102
  • Oligonucleotide 103
  • Oligonucleotide 104
  • Oligonucleotide 105
  • Oligonucleotide 106
  • Oligonucleotide 108
  • Oligonucleotide 1 1 0 0:
  • the nucleic acid was amplified by the: P reaction. Specifically, 50 ⁇ 1?
  • oligonucleotides each at 0.8 ⁇ M (final concentration), 20 ng of human genomic DNA (Promega), and 1.0 unit of TaKaRa
  • Lane 7 shows the results when Oligonucleotide 99 and Oligonucleotide 100 were added as the primer DNA.
  • Lane 8 shows the results when Oligonucleotide 101 and Oligonucleotide 102 were added as the primer DNA.
  • Lane 9 shows the results when Oligonucleotide 103 and Oligonucleotide 104 were added as the primer DNA.
  • Lane 10 shows the results when Oligonucleotide 105 and Oligonucleotide 106 were added as the primer DNAs.
  • Lane 11 shows the results when Oligonucleotide 107 and Oligonucleotide 108 were added as the primer DNAs.
  • Lane 12 shows the results when Oligonucleotide 109 and Oligonucleotide 110 were added as the primer DNA.
  • Lane 1 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 7 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 2 shows the result of the same PCR reaction as in lane 8 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 3 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 9 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 4 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 10 without adding T.th. RecA protein.
  • Lane 5 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 11 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 6 shows the same PCR reaction as lane 12 without addition of T.th. RecA protein.
  • Lane 13 shows the same PCR reaction as lane 7, with the addition of 15 mM KCl.
  • Lane 14 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 8 by adding 15 mM KC1.
  • Lane 15 shows the result of the same PCR reaction as in lane 9 except that 15 mM KCl was added.
  • Lane 16 shows the result of the same P reaction as in lane 10 except that 15 mM KC1 was added.
  • Lane 17 shows the same PCR reaction as in lane 11, with the addition of 15 mM KCl.
  • Lane 18 shows the result of the same PCR reaction as in lane 12 except that 15 mM KCl was added.
  • Lane 19 is the same PCR reaction as lane 7, with the addition of 30 mM KC1.
  • Lane 20 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 8 by adding 30 mM KCl.
  • Lane 21 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 9 by adding 30 mM KC1.
  • Lane 22 shows the same PCR reaction as lane 10, with the addition of 30 mM KCl.
  • Lane 23 shows the same PCR reaction as lane 11 with the addition of 30 mM KC1.
  • Lane 24 shows the same PCR reaction as lane 12 except that 30 mM KC1 was added.
  • amplification of by-products can be kept low without reducing the yield of the desired nucleic acid. That is, the presence of the above homologous recombinant protein suppresses the primer DNA from binding to the non-specific region of type I DNA and initiating the primer extension reaction. Amplification can be suppressed.
  • the specificity of the PCR can be improved.
  • human genomic DNA (Promega) was prepared as type I DNA, and oligonucleotides 111 and 112 were prepared as primer DNA. These primer DNA was designed to Homo sapiens beta globin region (HBB @ ) on chromosome 1 11 a (ACCESSION NGJ) 00007) to the reference. Each primer DNA has a base sequence of 21 to 22 mer which is 100% complementary to type I DNA.
  • the nucleic acid was amplified by a PCR reaction. Specifically, P of 50 ⁇ 1sky
  • Lane 1 shows the results obtained by performing a PCR reaction in addition to TaKaRa ExTaq Polymerase3 ⁇ 41.25 units as described above.
  • Lane 2 shows the results obtained by reducing TaKaRa ExTaq Polymerase to 0.63 units and performing the same PCR reaction as in lane 1 except for the above.
  • Lane 3 shows the results obtained by reducing TaKaRa ExTaq Polymerase to 0.3 limit and performing the same PCR reaction as in lane 1 except for that.
  • Lane 4 shows the results when PCR was performed in the same manner as in Lane 1 except that TaKaRa ExTaq Polymerase was reduced to 0.16 units.
  • Lane 5 shows the results when PCR was performed in the same manner as in lane 1 except that TaKaRa ExTaq Polymerase was reduced to 0.08 units.
  • Lane 6 shows the results of reducing the TaKaRa ExTaq Polymerase to 0.04 units and performing the same PCR reaction as in Lane 1 except for that.
  • Lane 7 shows the results when PCR was performed in the same manner as in Lane 1 except that TaKaRa ExTaq Polymerase was reduced to 0.02 units.
  • Lane 8 shows the result of the same PCR reaction as in lane 1 without adding T.th. RecA protein.
  • Lane 9 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 2 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 10 shows the results when PCR was carried out in the same manner as in Lane 3 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 11 shows the same PCR reaction as lane 4 without addition of T.th. RecA protein.
  • Lane 12 shows the result of the same PCR reaction as in lane 5 without adding the T.th. RecA protein.
  • Lane 13 shows the same PCR reaction as in lane 6, without the addition of the T.th.ecA protein.
  • Lane 14 shows the result of a PCR reaction carried out in the same manner as in Lane 7 without adding the T.th. RecA protein.
  • the amplification of the desired DNA was observed in lanes 1 to 5 of lanes 1 to 7 in which PCR was performed with the addition of T.th.RecA protein. was detected. That is, the desired MA was amplified by adding TaKaRa ExTaq Polymerase to the PCR reaction solution to 0.08 units or more.
  • the PCR reaction is performed with the addition of the T.th. RecA protein
  • the desired nucleic acid can be efficiently and specifically amplified even with a small amount of MA polymerase added.
  • the homologous recombination protein binds to the primer-DNA type DNA DNA and promotes the binding between the primer DNA and type DNA DNA. It is thought that the process proceeds efficiently.
  • Oligonucleotide 115 and oligonucleotide 116 were designed with reference to Homo sapiens SVMT gene for synaptic vesicle monoamine transporter, exon 16 and complete cds (ACCESSION AB044401). Oligonucleotide 117 and oligonucleotide 118 were designed with reference to Homo spaiens HPFH60R gene for olfactory receptor (ACCESSION X81445 X91835). Oligonucleotide 119 and oligonucleotide 120 were designed with reference to Human p53 (TP53) gene, complete cds (ACCESSION U94788).
  • Oligonucleotide 122 and Oligonucleotide 122 were designed with reference to Human hepatocyte nuclear factor 4-alpha gene, exon 1 (ACCESSION U72959 U72960).
  • Oligonucleotides 123 and oligonucleotides 124 were designed with reference to Homo sapiens diacylglycerol kinase, zeta 104 kDa (DGKZ), and mRNA (ACCESSION NM-003646).
  • Oligonucleotide 125 and Oligonucleotide 126 were designed with reference to Human rhodopsin gene, complete cds (ACCESSION U49742 02281).
  • Oligonucleotide 127 and oligonucleotide 128 were designed with reference to Human DNA for CAAFl (calcium-binding protein in amniotic fluid 1) and complete cds (ACCESSION D83657).
  • Oligonucleotides 129 and oligonucleotides 130 were designed with reference to Homo sapiens CYP21 gene, exons 1 through 10; and steroid 21-hydroxylase (CYP21) gene, complete cds (ACCESSION M12792 M23280).
  • Oligonucleotides 13 1 and 13 2 were designed with reference to Human S100 protein beta-subunit gene, exon 1 (ACCESSION M59486 J05600). Each Bramer DNA is 100% with Type I DNA It consists of a complementary 20-26 mer nucleotide sequence.
  • Oligonucleotides 1 1 3 :
  • Oligonucleotides 125 are identical to Oligonucleotides 125:
  • the nucleic acid was amplified by a PCR reaction. Specifically, P of 5 0 1
  • the T.th when a PCR reaction is performed with the addition of protein, the desired nucleic acid can be amplified while suppressing the generation of by-products. As described above, the addition of T.th. RecA protein can amplify the desired nucleic acid even if the concentration of primer-DNA is reduced. It is considered that the desired MA corresponding to one set can be amplified.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

PCR反応において副産物の増幅を抑制することができる核酸増幅方法、それに用いる核酸増幅用試薬キット、PCR反応において副産物の増幅を抑制することを利用して一塩基多型を検出する一塩基多型検出方法、及び、それに用いる一塩基多型検出用試薬キットを提供することを目的とする。　PCRにより核酸を増幅させる核酸増幅方法は、反応液中に、サーマス・サーモフィルス(Thermus thermophilus)に由来するRecAタンパク質及びこのRecAタンパク質を改変したタンパク質であってこのRecAタンパク質と類似する機能を有するRecA改変タンパク質の少なくともいずれかを含む相同的組換えタンパク質を混合して、PCRを行うことを特徴とする。

Description

明 細 書 核酸増幅方法、 核酸増幅用試薬キッ ト、 一塩基多型検出方法、 及び、 一 塩基多型検出用試薬キッ ト 技術分野
本発明は、 'P CRにより核酸を増幅させる核酸増幅方法、 P CIMこよ り核酸を増幅させるための核酸増幅用試薬キッ ト、 P CRにより一塩基 多型を検出するための一塩基多型検出方法、 及び、 P CRにより一塩基 多型を検出するための一塩基多型検出用試薬キッ トに関するものである, 背景技術
従来より、 P CRにより核酸を増幅させる核酸増幅方法が知られてい る。 即ち、 反応液中に、 錡型 DNA、 プライマ一 DNA、 DNAポリメラーゼ等を 混合して、 錶型 DMのうち、 2種類のプライマ一 DNAによって挟まれた領 域を特異的に増幅させ、 特定の核酸を得るものである。 '
このような核酸増幅方法には、 大腸菌 (Ε.ποΐη 等の RecAタンパク質 を用いる方法が知られている （例えば、 特許文献 1参照。）。
【特許文献 1】
特許第 3 0 1 0 73 8号公報 （第 1 _ 4頁）
しかしながら、 P CR反応を行うと、 所望の核酸 （正しい特異的な P CR産物） だけでなく、 副産物 （非特異的な P CR産物） も増幅される 場合がある。'さらに、 このような場合において、 P CRの条件を適宜変 更しても、 上記のような従来の方法では、 なお副産物が増幅ざれること も少なくない。
本発明はかかる現状に鑑みてなされたものであって、 P CR反応にお いて副産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅することができる核酸 増幅方法、 P C R反応において副産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を 増幅することができる核酸増幅用試薬キッ ト、 P CR反応において副産 物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅することができることを利用し て一塩基多型を検出する一塩基多型検出方法、 及び、 ： P C R反応におい て副産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅することができることを 利用して一塩基多型を検出するための一塩基多型検出用試薬キッ トを提 供することを目的とする。 発明の開示
前記目的を達成するための解決手段は、 P C Rにより核酸を増幅させ る核酸増幅方法であって、 反応液中に、 サ一マス · サーモフ ィルス ( Thermus thermophi is に由来する RecAタンパク質及びこの RecA夕 ンパク質を改変したタンパク質であってこの RecA タンパク質と類似す る機能を有する RecA 改変タンパク質の少なく ともいずれかを含む相同 的組換えタンパク質を混合して、 P C Rを行うことを特徴とする核酸増 幅方法である。
本発明によれば、 反応液中に、 サ一マス ' サーモフィルス ( Therimis thermophi h]s に由来する RecA夕ンパク質等の相同組み換えタンパク質 を混合して、 P C Rを行い、 所望の核酸を増幅させる。
このように P C Rを行えば、 所望の核酸（正しい特異的な P C R産物） の収量を減少させることなく、 副産物 （非特異的な P C R産物） の増幅 を低く抑えることができる。 即ち、 上記の相同組み換えタンパク質が存 在することにより、 プライマー DNAが錶型 DNAの非特異的な領域に結合し てプライマ一伸長反応を起こすことが抑制されるため、 非特異的な P C R産物の増幅を抑制することができる。 より具体的には、 本発明によれ ば、 P C Rの条件を適宜変更することにより、 プライマ一 DNAと錶型 DNA との塩基のミスマッチが 3塩基以内の場合においてのみ、 特異的に核酸 を増幅させるようにすることができる。 さらには、 P C Rの条件を適宜 変更することにより、 プライマ一 DNAと錶型 DNAとの塩基のミスマッチが 2塩基以内の場合においてのみ、 特異的に核酸を増幅させるようにする ことができる。またさらには、 P C Rの条件を適宜変更することにより、 プライマ一 DNAと鏡型 DNAとの塩基のミスマッチが 1塩基の場合において のみ、 特異的に核酸を増幅させるようにすることも可能である。
また、 本発明の核酸増幅方法によれば、 反応液中に加えるプライマー DNAの濃度を低く抑えても、 十分な量の核酸を増幅させることができ、 し かも、 プライマ一 DNAの濃度を低くすることにより、 副産物の増幅を抑え つつ、 所望の核酸だけをより特異的に増幅させることが可能となる。
また、 この核酸増幅方法は、 上記のように特異性が高いため、 ァニ一 リング温度等、 プライマー伸長反応の温度条件を変えても、 所望の核酸 を特異的に増幅させることができる。 即ち、 従来の核酸増幅方法では、 アニーリ ング温度等、 プライマー伸長反応の温度を低く設定すると、 目 的とする核酸だけでなく、 副産物も多量に増幅されることとなるが、 本 発明によれば、 目的とする核酸をより特異的に増幅させることが可能と なる。 .
また、 この核酸増幅方法では、 反応液中に加える DNAポリメラ一ゼの添 加量を低く抑えても、 従来の方法に比して、 十分な量の核酸を増幅させ ることができる。
このように、 本発明の核酸増幅方法では、 所望の核酸をより特異的に 増幅することができる。
ここで、 上記の相同組み換えタンパク質は、 サ一マス ' サーモフィル ス (Thermus thermophi is の RecA夕ンパク質（本明細書では、 T.th. RecA タンパク質とも言う。）、 及び、 T.th. RecAタンパク質を改変したもので あって T.th. RecA夕ンパク質と類似する機能を有する RecA改変夕ンパク 質 （T.th. RecA改変夕ンパク質）、 の少なく ともいずれかを含むものであ れば、 いかなるものを用いてもよい。 T.th. RecA改変タンパク質として は、 例えば、 T.th. RecAタンパク質をコードする遺伝子から、 部位特異 的変位誘発等により作出された遺伝子の産物であって、 1 または数個の アミノ酸が欠損、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、 T.th. RecA夕ンパク質と類似する機能を有するものが挙げられる。 また、 T.th. RecAタンパク質のタンパク質断片であって、 T.th. RecAタンパク 質と類似する機能を有するもの （T . th . RecAフラグメント） などであつ てよい。
なお、上記の相同組み換えタンパク質は、プライマー DNA 1 z gあたり、 0 . 1 g〜 1 0 0〃gの範囲で混合するのが好ましく、 更には 1 / g〜 1 0 gの範囲で混合するのが好ましい。このような範囲で P C Rを行えば、 より効率よく特異的に、 所望の核酸の増幅させることができるからであ る。
以下に、 P C R反応で用いられる種々の試薬について説明する。
鎵型 DNAは、 直鎖状で有れば、 いかなるものを用いてもよい。 即ち、 い かなる塩基配列からなるものであってもよく、 また、 それらの鎖長に上 限は存在しない。 従って、 例えば、 3 0 0 0 Mbpといわれるヒ トゲノムの 全長を持つような巨大な DNAであっても構わない。勿論、 その由来は問わ れない。 従って、 ウイルスや微生物、 動植物のゲノム由来の DNAやそれら を改変した DNAであっても、微生物等のもつプラスミ ド等ゃプラスミ ド等 に異種の DNA断片を挿入したキメラ DNA等であっても、 あるいは、 人工的 に合成したオリゴヌクレオチドなどであっても構わない。 また、 鎵型 DNA としては、 2本鎖 DNAでも 1本鎖 DNAでも利用することができる。さらに、 MAを逆転写することで得られる cMAを錶型 DNAとして利用することもで ぎる。
プライマ一 DNAは、 錡型 DNAのうち増幅すべき配列 （領域） の両端に位 置する相当数の配列と実質的に相補的であれば、 いかなる塩基配列から なるものであってもよく、 その由来も問われない。 実質的に相補的な程 度は、鎢型 DNAに対する塩基のミスマッチが 3塩基以内であるのが好まし く、 さらには、 塩基のミスマッチが 2塩基以内、 またさらには、 塩基の ミスマヅチが 1塩基以内、 特に、 1 0 0 %の相補性を有するのが好まし い。 前述したように、 T . th . RecAタンパク質等の相同組み換えタンパク 質が存在することにより、 プライマ一 DNAが錶型 DMの非特異的な領域に 結合してプライマ一伸長反応を起こすことが抑制されるため、 プライマ 一 DNAの相補性が低いと、 所望の核酸が増幅されにく くなるからである。 なお、 プライマ一 DNAは、各々のプライマ一 DNAあたり、最終濃度で 0 . 0 1〃M〜 1 0〃Mの範囲で混合するのが好ましく、 さらには、 0 . 1〃M 〜 1 の範囲で混合するのが特に好ましい。このような範囲で P C Rを 行えば、 より効率よく特異的に、 所望の核酸の増幅させることができる からである。 また、 プライマ一 DNAの濃度を従来よりも低くすることによ り、 副産物の増幅を抑えつつ、 所望の核酸だけをより特異的に増幅させ ることができる。
DNAポリメラ一ゼは、 P C Rにおいて DNA鎖を変性させる際の高温に短 時間加熱されても永久的には不活性化されず、 しかも、 高温における活 性を有するものが好適である。 例えば、 サ一モコ ヅカス · リ トラ リス ( Thermoconcns 1 itoralis )、 ノ チルス ' ステア口サーモフ ィ ルス ( Bacillus stearothermophil us 、 メタノサ一マス ' フエルビ ド ウス ( Methanotherm s fervidus 、 サーマス - アクアテイ クス ( Thermus aq ticiisk T.フラブス (T.flavus)ゝ T.ラクテウス ( T.1 anteiis T. ルペンス (T.rubens), Τ·ルバ一 (T. ruber 及び T.サーモフ ィルス (T.thermoOhilus などの高熱菌由来の DNAポリメラ一ゼや、 デスルフロ コッカス 'モビリス rnesiilfurocoocTis mobilise メタノバクテリウム · サ 一 モ オ ー ト ト ロ フ ィ レ ク ム ( Methanobacterinm thennoaiitotrophi1ci]iii , スルホロプス 'ソルフアタリクス ( Si】 lfolob s soTfataricus), S.ァシドカルダリウス (S.acidocaldarius^ 及びサ一モ プラスマ · ァシ ドフィルム (Thermoplasma acidophiTum などの高熱性 古細菌由来の DNAポリメラ一ゼなどが挙げられる。 このうち、 入手容易性 等の理由から、 サーマス ' アクアテイクス (Thermus aquaticns) 由来の DNAポリメラ一ゼ （Taq DNAポリメラ一ゼ） や、 サーマス · サ一モフィル ス ( Thermus thermophilus 由来の DNAポリメラ一ゼ （T.th. DNAポリメ ラーゼ）、 サ一モコ ヅカス · リ トラ リス （ Thermococcus litoral is) 由来 の DNAポリメラ一ゼを利用するのが好ましい。
なお、 例えば、 Taq MAポリメラ一ゼを使用する場合には、 1 0 0〃1 あたり、 0 . 0 5 unit〜 5 O unitの範囲で混合するのが好ましく、 さら には、 0 . 5 unit~ 5 unitの範囲で混合するのが特に好ましい。 このよ うな範囲で P C Rを行えば、 より効率よく特異的に、 所望の核酸の増幅 させることができるからである。 また、 DNAポリメラ一ゼの添加量を低く 抑えても、 従来の方法に比して、 十分な量の核酸を増幅させることがで ぎる。
さらに、上記の DNAポリメラーゼによる核酸増幅工程前の活性を阻害す るために、 MAポリメラーゼに特異的な抗体を反応液に混合するようにし てもよい。 この抗体には、 モノクローナル抗体、 ポリクローナル抗体、 組換え法により製造された抗体、 化学的または組換え法により製造され た抗体フラグメン ト （例えば、 Fabフラグメント） が挙げられる。 このう ち、 モノクローナル抗体を用いるのが特に好ましい。 例えば、 Taq DNA ポリメラーゼに対する公知のモノクロ一ナル抗体を用いれば、 約 2 0 °C 〜 4 0 °Cの温度において Taq DNAポリメラーゼの酵素活性を阻害するこ とができると共に、 P C Rの熱的サイクルにおける高温によって不活性 ィ匕される。
また、 P C Rは、 一般に、 4種類の dNTP、 即ち、 dATP、 dCTP、 dGTP及 び dTTPの存在化において行う。
さらに、 P C Rは、一般に、適当な緩衝剤を含む反応液中で行われる。 効率よく核酸を増幅させるためである。 緩衝液は、 使用する相同組み換 えタンパク質や DNAポリメラーゼ等により、反応の最適条件を得るため適 宜変更することできる。 例えば、 p Hを適当に調整したト リス系の緩衝 液に、 塩化力リウムゃ塩化マグネシウムを加えた緩衝液を利用すること ができる。
また、 P C R反応液には、 5 %〜 1 0 %の MS0と 1 %〜 2 %のべタイ ンを添加してもよい。錄型 DNAの二字構造により 目的とする産物が増幅さ れにくい問題を最小限に留める効果を有するものである。 このような変 性剤に対し、 大腸菌由来の HecAタンパク質等は耐性を有しないが、 サ一 マス.サ一モフィルスに由来する RecA夕ンパク質等は耐性を有するので、 本発明において使用することが可能である。 また、 P C R反応液には、 サ一マス ' サ一モフ ィ ルス （ Thermus thermoph i l us に由来する RecA夕ンパク質等の相同組み換えタンパク質 に対する抗体を加えてもよい。
また、 他の解決手段は、 P により核酸を増幅させる核酸増幅方法 5 であって、 反応液中に、 鎢型 DNAに対する塩基のミスマッチが 3塩基以内 のプライマ一 DNAについてのみプライマー伸長反応が起こる RecA夕ンパ ク質またはこの RecA夕ンパク質を改変した夕ンパク質であってこの RecA 夕ンパク質と類似する機能を有する RecA改変夕ンパク質の少なく ともい ずれかを含む相同的組換えタンパク質を混合して、 P C Rを行うことを0 特徴とする核酸増幅方法である。
本発明によれば、 反応液中に、鎵型 DNAに対する塩基のミスマッチが 3 一 塩基以内のブライマ一 DNAについてのみプライマー伸長反応が起こる
一 -一 -
RecA夕ンパク質等の相同組み換え夕ンパク質を混合して、： P C Rを行い、 所望の核酸を増幅させる。
5 このように P C Rを行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、 副産物の増幅を低く抑えることができる。 即ち、 上記の相同組み換え夕 ンパク質が存在することにより、 プライマー DNAが錶型 DNAの非特異的な 領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、 非 特異的な P C R産物の増幅を抑制することができる。
0 また、 この核酸増幅方法によれば、 反応液中に加えるプライマ一 DNA の濃度を低く抑えても、 十分な量の核酸を増幅させることができ、 しか も、 プライマ一 MAの濃度を低くすることにより、 副産物の増幅を抑えつ つ、 所望の核酸だけをより特異的に増幅させることが可能となる。
また、 この核酸増幅方法は、 上記のように特異性が高いため、 ァニー 5 リング温度等、 プライマー伸長反応の温度条件を変えても、 所望の核酸 を特異的に増幅させることができる。 即ち、 従来の核酸増幅方法では、 アニーリング温度等、 プライマー伸長反応の温度を低く設定すると、 目 的とする核酸だけでなく、 副産物も多量に増幅されることとなるが、 本 発明によれば、 目的とする核酸をより特異的に増幅させることが可能と なる。
また、 この核酸増幅方法では、 反応液中に加える MAポリメラーゼの添 加量を低く抑えても、 従来の方法に比して、 十分な量の核酸を増幅させ ることができる。
このように、 本発明の核酸増幅方法では、 所望の核酸をより特異的に 増幅することができる。
さらに、 上記のいずれかに記載の核酸増幅方法であって、 前記反応液 中に、 ATP- y Sを加えて、 P C Rを行うことを特徴とする核酸増幅方法と すると良い。
本発明によれば、 反応液中に、 前述の相同組換えタンパク質を混合し た上、 さらに、 ATP-ァ Sも加えて、 P C Rを行う。
このように P C Rを行えば、 所望の核酸をさらに特異的に増幅するこ とができる。 なお、 ATP-ァ Sを加えた場合と同様に、 ATPを加えても、 P
C Rの特異性が増すと推測される。 しかし、 ATPは、 上記の相同組み換え タンパク質により ADPに分解され、 ADPは、 上記の相同組み換えタンパク 質がプライマー DNA等に結合するのを阻害する。 このため、 ATPを加えて も、 P C Rの特異性が上がりにくい。 従って、 本発明のように、 ADPに分 解されない ATP- y Sを反応液に加えるのが良い。
なお、 P C R反応液を調製する際には、 T . th. RecAタンパク質を反応 液に加えた状態で、 dNTPを加える前に、 ATP-ァ Sを加えるのが好ましい。 このようにすることで、 より効率よく所望の核酸を特異的に増幅するこ とができる。 その理由としては、 先に dNTPを加えると、 dNTPが T . th . RecA 夕ンパク質が結合し、 後から加えた ATP-ァ Sが T . th . RecA夕ンパク質に結 合しにく くなるためであると考えられる。
ここで、 ATP-ァ Sの濃度は、目的に応じて適宜変更すればよいが、通常、
0 . 0 I mM〜： L O mM、 好ましくは、 0 . 1 mM〜 1 mMとするのが良い。 さらに、上記のいずれかに記載の核酸増幅方法であって、鎢型 DNAが阻 止的または抑制的 2次構造の区域を有することを特徴とする核酸増幅方 法とすると良い。 本発明によれば、錡型 DNAが阻止的または抑制的二次構造の区域を有す る。 即ち、 錶型 DNAは、 一般的な P CRを行った場合に、 核酸の増幅が阻 止または抑制される 2次構造をなす区域を有する。 従って、 従来の: P C Rでは、 このような区域を有する所望の核酸を、 効率よく特異的に増幅 させることは困難であった。
これに対し、 本発明では、 前述の相同組換えタンパク質を混合して P C Rを行うので、錶型 DNAにこのような阻止的または抑制的 2次構造の区 域がある場合であっても、 所望の核酸を効率よく特異的に増幅させるこ とができる。 その理由は、 相同組み換えタンパク質が、 錶型 DNAに結合す ることにより、 阻止的または抑制的 2次構造が解かれるためであると考 えられる。
さらに、 上記のいずれかに記載の核酸増幅方法であって、 前記反応液 中に、 KC1を加えて、 P C Rを行うことを特徴とする核酸増幅方法とする と良い。
本発明によれば、 反応液中に KC1を加えて、 P CRを行う。 このように P CRを行えば、 所望の核酸をさらに特異的に増幅することができる。 ここで、 KC1の濃度は、 目的に応じて適宜変更すればよいが、 通常、 1 mM〜 1 0 0 OmM、 好ましくは、 1 0 mM〜 1 0 OmMとするのが良い。
さらに、 上記のいずれかに記載の核酸増幅方法であって、 前記反応液 中に、 Mg2 + を加えて、 P C Rを行うことを特徴とする核酸増幅方法と すると良い。
本発明によれば、 反応液中に Mg'2 + を加えて、 P C Rを行う。 このよ うに P C Rを行えば、 所望の核酸をさらに特異的に増幅することができ る。 Mg2 + を加えることで、 上述した相同組み換えタンパク質の DNAに対 する親和性が向上するためであると考えられる。
ここで、 Mg2 + の濃度は、 目的に応じて適宜変更すればよいが、 通常、 0. ImM〜： L 0 OmM、 好ましくは、 3 mM~ 1 0 mMとするのが良い。
さらに、 上記のいずれかに記載の核酸増幅方法であって、 前記反応液 中に、 複数セッ トのプライマー DNAを加えて、 P CRを行うことを特徴と ^ する核酸増幅方法とすると良い。
本発明によれば、 反応液中に複数セッ トのプライマー DNAを加えて、 P C Rを行う。
従来の核酸増幅方法では、プライマ一 DNAの濃度をある程度高く しない と所望の核酸を増幅することが難しかったため、 複数セヅ 卜のプライマ 一 MAを加えることが困難であった。
これに対し、 本発明では、 上述した相同組み換えタンパク質を加える ことにより、 各プライマー DNAの濃度を低く しても、 副産物の増幅を抑え つつ、所望の核酸だけをより特異的に増幅させることができる。従って、 複数セヅ トのプライマー DNAを混合することができ、 しかも、 このように して P C Rを行っても、 副産物の増幅を抑えつつ、 各プライマ一セッ ト に対応した所望の核酸だけをより特異的に増幅させることができる。 また、 他の解決手段は、 P C Rにより核酸を増幅させるための核酸増 幅用試薬キッ 卜であって、 DNAポリメラーゼと、 4種類の dNTPと、 緩衝液 と、 サ一マス ' サ一モフィルス ( Thermus thermoph i lus の RecA夕ンパ ク質及びこの RecA夕ンパク質を改変した夕ンパク質であってこの RecA夕 ンパク質と類似する機能を有する RecA改変タンパク質の少なく ともいず れかを含む相同的組換えタンパク質と、 を備えることを特徴とする核酸 増幅用試薬キッ トである。
本発明の核酸増幅用試薬キッ トは、 MAポリメラ一ゼと、 4種類の dNTP と、 緩衝液と、 T . th. RecAタンパク質等の相同的組換えタンパク質とを 備える。
このようなキヅ トを利用すれば、 DNAポリメラーゼ、 4種類の dNTP、 緩 衝液、 及び、 T . th . RecAタンパク質等の相同的組換えタンパク質を反応 液に加え、 さらに、 目的に応じた錄型 MAとプライマ一 DNAを用意して反 応液に加えるだけで、 容易に P C Rを行うことができる。 しかも、 上記 の相同組み換えタンパク質により、 プライマー DNAが錶型 DNAの非特異的 な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、 非特異的な P C R産物の増幅を抑制することができる。 従って、 本キッ 卜 利用すれば、 所望の核酸をより特異的に増幅させることができる。 お、 本発明に記載されている DNAポリメラ一ゼ、 4種類の dNTP、 緩衝 液、'及び、 T . th . RecAタンパク質等の相同的組換えタンパク質は、 前述 し こものと同様である。
ここで、 本発明の核酸増幅用試薬キッ トは、 DNAポリメラ一ゼと、 4種 類の dNTPと、 緩衝液と、 T . th . RecAタンパク質等の相同的組換えタンパ ク とを備えていればよい。 従って、 これらのものが各々別個の容器等 に分けられていても、 あるいは、 これらのうち 2以上のものが予め混合 されていてもよい。 以下に述べる ΑΤΡ-ァ S、 KC1、 Mg 2 + についても同様 である。
さらに、 上記の核酸増幅用試薬キッ 卜であって、 ATP-ァ Sを備えること を特徴とする核酸増幅用試薬キッ トとするのが好ましい。
このようなキッ トを利用して、 さらに ATP-ァを加えて P C R反応を行 えば、 所望の核酸をさらに特異的に増幅することができる。
きらに、 上記のいずれかに記載の核酸増幅用試薬キッ トであって、 KC1 を備えることを特徴とする核酸増幅用試薬キッ トとすると良い。
このようなキッ トを利用して、 P C R反応を行えば、 所望の核酸をさ らに特異的に増幅することができる。
さらに、 上記のいずれかに記載の核酸増幅用試薬キッ トであって、 Mg 2 + を備えることを特徴とする核酸増幅用試薬キッ 卜とすると良い。
このようなキッ トを利用して、 P C R反応を行えば、 所望の核酸をさ らに特異的に増幅することができる。
また、 他の解決手段は、 一塩基多型を検出するための一塩基多型検出 方法であって、鎵型 DNAのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応し たプライマ一 DNAを用い、 反応液に、 サ一マス ·サ一モフィルス ( Thermus thermophi is の RecA夕ンパク質及びこの ftecA夕ンパク質を改変した夕 ンパク質であってこの RecA夕ンパク質と類似する機能を有する RecA改変 タンパク質の少なく ともいずれかを含む相同的組換えタンパク質を混合 して、 P C Rを行い、 所望の核酸の増幅により一塩基多型を検出するこ とを特徴とする一塩基多型検出方法である。
本発明によれば、 プライマ一 DNAの 1つには、 鎵型 DNAのうち一塩基多 型をなす塩基を含む配列に対応したプライマー DNAを用いる。そして、反 応液中に、 T . th . RecAタンパク質等の相同組み換えタンパク質を混合し て、 P C Rを行う。 このように P C Rを行えば、 錶型 DNAと一塩基多型を なす塩基を含む配列に対応したプライマー DNAとが完全に相補的である 場合に、 所望の核酸を增幅させるようにすることができる。 一方、 銹型 MAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマ一 Aとが完 全には相補的ではない場合、 即ち、 一塩基多型をなす塩基がプライマー DNAと相補的でない場合に、 所望の核酸が増幅しない、 または、 抑制され るようにすることができる。 このため、 P C Rによる所望の核酸の増幅 により、 一塩基多型を検出することが可能である。
さらに、 上記の一塩基多型検出方法であって、 前記反応液中に、 ATP - ァ Sを加えて、 P C Rを行うことを特徴とする一塩基多型検出方法とする のが好ましい。
本発明によれば、 反応液中に、 前述の相同組換えタンパク質を混合し た上、 さらに、 ATP-ァ Sも加えて、 P C Rを行う。 このように P C Rを行 えば、 所望の核酸をさらに特異的に増幅することができるため、 一塩基 多型をより確実に検出することが可能となる。
さらに、 上記のいずれかに記載の一塩基多型検出方法であって、 前記 反応液中に、 KC 1を加えて、 P C Rを行うことを特徴とする一塩基多型検 出方法とすると良い。
このように P C Rを行えば、 所望の核酸をさらに特異的に増幅するこ とができるため、 一塩基多型をより確実に検出することが可能となる。 さらに、 上記のいずれかに記載の一塩基多型検出方法であって、 前記 反応液中に、 Mg 2 + を加えて、 P C Rを行うことを特徴とする一塩基多 型検出方法とすると良い。
このように P C Rを行えば、 所望の核酸をさらに特異的に増幅するこ とができるため、 一塩基多型をより確実に検出することが可能となる。 また、 他の解決手段は、 一塩基多型を検出するための一塩基多型検出 用試薬キッ トであって、 DNAポリメラ一ゼと、 4種類の dNTPと、緩衝液と、 サ一マス · サ一モフィルス Γ The rums thermoph i lus の RecA夕ンパク質 及びこの RecA夕ンパク質を改変したタンパク質であってこの RecA夕ンパ ク質と類似する機能を有する RecA改変タンパク質の少なく ともいずれか を含む相同的組換えタンパク質と、 を備えることを特徴とする一塩基多 型検出用試葉キッ トである。
本発明の一塩基多型検出用試薬キツ トは、 MAポリメラ一ゼと、 4種類 の dNTPと、 緩衝液と、 T. th . EecAタンパク質等の相同的組換えタンパク 質とを備える。
このようなキヅ トを利用すれば、 DNAポリメラ一ゼ、 4種類の dNTP、 緩 衝液、 及び、 T . th . RecAタンパク質等の相同的組換えタンパク質を反応 液に加え、 さらに、 目的に応じた錶型 DMと、 この鎵型 DNAのうち一塩基 多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマー DNA含むプライマ を用意して反応液に加えるだけで、 容易に P C Rを行うことができる。 そして、 このように P C Rを行えば、 鎵型 DNAと一塩基多型をなす塩基を 含む配列に対応したプライマ一 DNAとが完全に相補的である場合に、所望 の核酸を増幅させるようにすることができる。一方、 鐯型 MAと一塩基多 型をなす塩基を含む配列に対応したプライマ一 DNAとが完全には相補的 ではない場合、 即ち、 一塩基多型をなす塩基がプライマ一 DNAと相補的で ない場合に、 所望の核酸が増幅しない、 まだは、 抑制されるようにする ことができる。 このため、 P C IUこよる所望の核酸の增幅により、 一塩 基多型を検出することが可能となる。
よって、 本発明の一塩基多型検出用試薬キッ トを用いれば、 容易に一 塩基多型を検出することができる。
なお、 本発明に記載されている MAポリメラ一ゼ、 4種類の dNTP、 緩衝 液、 及び、 T . th . RecAタンパク質等の相同的組換えタンパク質は、 前述 したものと同様である。
ここで、本発明の一塩基多型検出用試薬キッ トは、 DNAポリメラ一ゼと、 4種類の dNTPと、 緩衝液と、 T . th. RecAタンパク質等の相同的組換え夕 ンパク質とを備えていればよい。 従って、 これらのものが各々別個の容 器 に分けられていても、 あるいは、 これらのうち 2以上のものが予め 混合されていてもよい。 以下に述べる ATP-ァ S、 KC1、 Mg 2 + についても 同様である。
さらに、 上記の一塩基多型検出用試薬キッ トであって、 ATP-ァ Sを備え ることを特徴とする一塩基多型検出用試薬キッ トとするのが好ましい。 このようなキッ トを利用して、 さらに ATP-ァを加えて P C R反応を行 えば、 さらに精度良く一塩基多型を検出することができる。
さらに、 上記のいずれかに記載の一塩基多型検出用試薬キッ トであつ て、 KC 1を備えることを特徴とする一塩基多型検出用試薬キッ 卜とすると 良い。
このようなキッ トを利用して P C R反応を行えば、 さらに精度良く一 塩基多型を検出することができる。
さらに、 上記のいずれかに記載の一塩基多型検出用試薬キッ トであつ て、 Mg 2 + を備えることを特徴とする一塩基多型検出用試薬キヅ トとす ると良い。
このようなキッ トを利用して P C R反応を行えば、 さらに精度良く一 塩基多型を検出することができる。 図面の簡単な説明
第 1図は、 実施例 1 に関し、 鎵型 DNAと各プライマー MAとの関係につ いて示す説明図である。
第 2図は、 実施例 1 に関し、 P C R反応物についての電気泳動の結果 を示す図面に代わる写真である。 （A ) はプライマー DNAの濃度を 0 . 0 6 Mにして ; P C R反応を行った場合を示す写真であり、 （B ) はプライ マー DNAの濃度を 0 . 2 0 にして P C R反応を行った場合を示す写真 である。
第 3図は、 実施例 2に関し、 鎵型 DNAと各プライマ一 DNAとの関係につ , r
15 いて示す説明図である。
第 4図は、 実施例 2に関し、 P CR反応物についての電気泳動の結果 を示す図面に代わる写真である。
第 5図は、 実施例 3に関し、 錶型 DNAと各プライマ一 DNAとの関係につ いて示す説明図である。
第 6図は、 実施例 3に関し、 铸型 MAと各プライマー MAとの関係につ いて示す説明図である。
第 7図は、 実施例 3に関し、 P CR反応物についての電気泳動の結果 を示す図面に代わる写真である。 （A) はプライマ一 DNAの濃度を変えて P 反応を行った場合を示す写真であり、 （B) は別のプライマー DNA を用いてプライマー DNAの濃度を変えて P CR反応を行った場合を示す 写真である。
第 8図は、 実施例 3に関し、 P C R反応物についての電気泳動の結果 を示す図面に代わる写真である。 （A) は別のプライマ一 DNAを用いてプ ライマー DNAの濃度を変えて： P C R反応を行った場合を示す写真であり、 (B ) は別のプライマ一 DNAを用いてプライマ一 DNAの濃度を変えて P C R反応を行った場合を示す写真である。
第 9図は、 実施例 4に関し、 錄型 DNAと各プライマ一 DNAとの関係につ いて示す説明図である。
第 1 0図は、 実施例 4に関し、 P CR反応物についての電気泳動の結 果を示す図面に代わる写真である。
第 1 1図は、 実施例 5 (こ関し、 錶型 DNAと各プライマー DNAとの関係に ついて示す説明図である。
第 1 2図は、 実施例 5に関し、 鎵型 DNAと各プライマ一 DNAとの関係に ついて示す説明図である。
第 1 3図は、 実施例 5に関し、 P C R反応物についての電気泳動の結 果を示す図面に代わる写真である。 （A)はァニーリング温度 6 0 °Cで P C R反応を行った場合を示す写真であり、 （B ) はタニーリング温度 5 5 °Cで P CR反応を行った場合を示す写真である。 第 1 4図は、 実施例 5に関し、 P C R反応物についての電気泳動の結 果を示す図面に代わる写真である。 （A)はァ二一リング温度 5 0°Cで P C R反応を行った場合を示す写真であり、 （B) はアニーリング温度 4 5 °Cで P CR反応を行った場合を示す写真である。
第 1 5図は、 実施例 6に関し、 錡型 DNAと各プライマ一 DNAとの関係に ついて示す説明図である。
第 1 6図は、 実施例 6に関し、 P CR反応物についての電気泳動の結 果を示す図面に代わる写真である。 （A)はオリゴヌクレオチド 3 7 ~4 4のいずれかを用いて P CR反応を行った場合を示す写真であり、 （B) はォリゴヌクレオチド 5 4〜 5 8のいずれかを用いて P C R反応を行つ た場合を示す写真である。
第 1 7図は、 実施例 7に関し、 ： P C R反応物についての電気泳動の結 果を示す図面に代わる写真である。 （A) は最初からプライマー DNAを添 加して P C R反応を行った場合を示す写真であり、 （B )は 1サイクル後 にプライマ一 DNAを添加して P C R反応を行った場合を示す写真である。 第.1 8図は、 実施例 7に関し、 P C R反応物についての電気泳動の結 果を示す図面に代わる写真である。 （A) は 3サイクル後にプライマー DNAを添加して P CR反応を行った場合を示す写真であり、 （B) は 6サ ィクル後にプライマー DNAを添加して P C R反応を行った場合を示す写 真である。
第 1 9図は、 実施例 7に関し、 P C R反応物についての電気泳動の結 果を示す図面に代わる写真である。 （A)は 1 0サイクル後にプライマー DNAを添加して P CR反応を行った場合を示す写真であり、 （B) は 1 5 サイクル後にプライマー DNAを添加して P C R反応を行った場合を示す 写真である。
第 2 0図は、 実施例 8に関し、 P C R反応物についての電気泳動の結 果を示す図面に代わる写真である。 （A)は初期温度 7 0°Cの下で P CR 反応を行った場合を示す写真であり、 （B)は初期温度 8 0°Cの下で P C R反応を行った場合を示す写真である。 第 2 1図は、 実施例 9に関し、 銹型 DNAと各プライマ一 DNAとの関係に ついて示す説明図である。
第 2 2図は、 実施例 9に関し、 P C R反応物についての電気泳動の結 果を示す図面に代わる写真である。 （A) は ATP- の非存在下で P CR 反応を行った場合を示す写真であり、 （B ) は ATP-y Sの存在下で P C R 反応を行った場合を示す写真である。
第 2 3図は、 実施例 1 0に関し、 鎵型 DNAと各プライマー DNAとの関係 について示す説明図である。
第 2 4図は、 実施例 1 0に関し、 鎵型 DNAと各プライマ一 DNAとの関係 について示す説明図である。
第 2 5図は、 実施例 1 0に関し、 P CR反応物についての電気泳動の 結果を示す図面に代わる写真である。 （ A) は T.th. RecA夕ンパク質の非 存在下で P CR反応を行った場合を示す写真であり、 （B) は T.th. RecA タンパク質の存在下で P C R反応を行った場合を示す写真であり、 （ C) は T.th. SSBタンパク質の存在下で P C R反応を行った場合を示す写真 である。
第 2 6図は、 実施例 1 1に関し、 鏡型 DNAと各プライマー DNAとの関係 について示す説明図である。 ' 第 2 7図は、 実施例 1 1に関し、 P C R反応物についての電気泳動の 結果を示す図面に代わる写真である。
第 2 8図は、 実施例 1 2に関し、 錶型 DNAと各プライマ一 DNAとの関係 について示す説明図である。
第 2 9図は、 実施例 1 2に関し、 P CR反応物についての電気泳動の 結果を示す図面に代わる写真である。
第 3 0図は、 実施例 1 3に関し、 鎵型 DNAと各プライマ一 DNAとの関係 について示す説明図である。
第 3 1図は、 実施例 1 3に関し、 P CR反応物についての電気泳動の 結果を示す図面に代わる写真である。
第 3 2図は、 実施例 1 4に関し、 錶型 DNAと各プライマ一 DNAとの関係 について示す説明図である。
第 3 3図は、 実施例 1 4に関し、 P CR反応物についての電気泳動の 結果を示す図面に代わる写真である。
第 3 4図は、 実施例 1 5に関し、 鎵型 DNAと各プライマー DNAとの関係 について示す説明図である。
第 3 5図は、 実施例 1 5に関し、 P CR反応物についての電気泳動の 結果を示す図面に代わる写真である。
第 3 6 ¾は、 実施例 1 6に関し、 錶型 DNAと各プライマー DNAとの関係 について示す説明図である。
第 3 7図は、 実施例 1 6に関し、 P C R反応物についての電気泳動の 結果を示す図面に代わる写真である。
第 3 8図は、 実施例 1 7に関し、 錡型 DNAと各プライマー DNAとの関係 について示す説明図である。
第 3 9図は、 実施例 1 7に関し、 錡型 DNAと各プライマ一 MAとの関係 について示す説明図である。
第 4 0図は、 実施例 1 7に関し、 P C R反応物についての電気泳動の 結果を示す図面に代わる写真である。
第 4 1図は、 実施例 1 8に関し、 錶型 DNAと各プライマ一 DNAとの関係 について示す説明図である。
第 4 2図は、 実施例 1 8に関し、 P CR反応物についての電気泳動の 結果を示す図面に代わる写真である。
第 4 3図は、 実施例 1 9に関し、 鍀型 DNAと各プライマ一 DNAとの関係 について示す説明図である。
第 4 4図は、 実施例 1 9に関し、 鐯型 DNAと各プライマ一 DNAとの関係 について示す説明図である。
^ 4 5図は、 実施例 1 9に関し、 錶型 DNAと各プライマ一 DNAとの関係 について示す説明図である。
第 4 6図は、 実施例 1 9に関し、 铸型 DNAと各プライマー DNAとの関係 について示す説明図である。 03 011752
19 第 4 7図は、 実施例 1 9に関し、 P C R反応物についての電気泳動の 結果を示す図面に代わる写真である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施例を、 図を参照しつつ説明する。
(実施例 1 )
第 1図に示すように、 錶型 DNAとしてヒ トゲノム DNA ( Promega) を用意 した。 また、 プライマー DNAとして 1 6種類のォリゴヌクレオチ ド （ォリ ゴヌクレオチ ド 1〜 1 6 ) を用意した。 これらのプライマ一 DNAは、 Homo sapiens PAC c lone RP5-852P6 from 7pll .2-pZl , complete sequence . ( ACCESSION AC006454) を参考にして設計した。 なお、 ACCESS ION ナン バ一は、 Gene Bankのアクセスナンバーを示している （以下同様）。 各プ ラィマー DNAは、 任意のプライマ一設計の可能性を示すため、 それそれ位 置をずらして設計してある。 また、 各プライマ一 DNAは、 錶型 DNAと 1 0 0 %相補的な 2 O merの塩基配列からなる。 なお、 各プライマー DNAは、 鍀型 DNAの塩基配列に基づいて公知の手法により合成すればよい。
オリゴヌクレオチド 1 ：
5' -ggtgcactcc atcatgctta-3'
ォリゴヌクレオチド 2 ：
5' -catcagt cagaggggct cac-3'
ォリゴヌクレオチド 3 ：
5 -cccacatccc tggcaggaat-3'
ォリゴヌクレオチド 4 ：
5' -tgcaggt gtgggcctag ctg-3'
才リゴヌクレ才チド 5 ：
5 -tgtcctgggc cccagcagga-3'
ォリゴヌクレ才チド 6 ：
5' -ggggtct tgctgtgggc agg-3'
オリゴヌクレオチド 7 ： 5' -gagatgcccc cccatactgc-3'
オリゴヌクレオチド 8 ：
5' -atctgtc ccctctcctc ctg-3'
ォリゴヌクレオチド 9 ：
5， -aggtgtgcag agtgcaaagc-3'
オリゴヌクレオチド 1 0 ：
5 -gcttcaa ggcagaggcc agg-3
ォリゴヌクレオチド 1 1 ：
5" -tccaggtggc ccccaagcag-3'
オリゴヌクレオチド 1 2 ：
5' -atctctc ttgccttggg gtg-3'
オリゴヌクレオチド 1 3 ：
5， -gtgtgctggg aggaggggcc-3'
ォリゴヌクレオチ ド 1 4 ：
5" -gtcacta aacaggggct caa-3'
オリゴヌクレオチド 1 5 ：
5， -cgtgtgggag gagcaggcag-3'
オリゴヌクレオチド 1 6 ：
5 -gccagaa tgttcccctg gag-3
また、 相同組み換えタンパク質と してサーマス · サーモフィルス ( Thermus thermophi I ns の RecAタンパク質を用意し、 DNAポリメラ一ゼ としてサ一マス ' アクアテイクス （Thermus aquaticus) 由来の DNAポリ メラーゼ（ TaKaRa Taq (夕カラバイオ））を用意した。また、 4種類の dNTP、 即ち、 dATP、 dCTP、 dGTP及び dTTPを用意し、 緩衝剤として p Hを調整し た ト リス系の緩衝液に、 塩化カリウムや塩化マグネシウムを加えた緩衝 液を用意した。
なお、 DNAポリメラ一ゼと、 4種類の dNTPと、 緩衝液と、 T . th. RecA タンパク質等の相同組換えタンパク質とは、 核酸増幅用試薬キッ トとし て用意しておくのが便利である。 このようなキヅ トを利用すれば、 DNA ポ ύメラ一ゼ、 4種類の dNTP、 緩衝液、 及び、 T.th. RecAタンパク質等 の相同的組換えタンパク質を反応液に加え、 さらに、 目的に応じた铸型 DNAとプライマ一 DNAを用意して反応液に加えるだけで、 容易に P CRを 行うことができるからである。
次に、 P CR反応により核酸を増幅させた。 具体的には、 1 0 zlの P CR反応液中に、 0. 0 6〃M (最終濃度） の 2種類のオリゴヌクレオチ ドと、 40 ngのヒ トゲノム MAと、 1. 0 unitの TaKaRa Taqと、 0. 2 mMの dNTP混合液と、 1 . 2〃gの T.th. RecAタンパク質を、 1 0 mMの Tris-HCl Buffer (pH8. 3 )、 5 0mMの KC1ヽ 1. 5 mMの MgCl2 に混合し た。 そして、 P C R反応を、 1サイクル （ 7 0 °C， 1 0分間、 9 4 °C , 1分間）、 3 0サイクル（ 9 4 C， 3 0秒間、 6 0°C, 3 ◦秒間、 6 8 °C , 1分間）、 1サイクル （ 6 8°C, 7分間、 4°C， 1分間） で行った。
次に、 反応液について 1 %のァガロースゲルで電気泳動を行い、 ァガ ロースゲルをェチジゥムプロミ ドの溶液に浸してゲル中の DNAを染色し、 その後、 染色された DNAを写真に記録した。 その結果を第 2図に示す。 レーン 1は、 プライマー DNAとして、 ォリゴヌクレオチド 1とオリゴヌ クレオチド 2を加えたものである。
レーン 2は、 プライマー DNAとして、 オリゴヌクレオチド 3とオリゴヌ クレオチド 4を加えたものである。
レーン 3は、 プライマ一 DNAとして、 オリゴヌクレオチ ド 5 とオリゴヌ クレオチド 6を加えたものである。
レーン 4は、 プライマー DNAとして、 才リゴヌクレオチド 7とオリゴヌ クレオチド 8を加えたものである。
レーン 5は、 プライマ一 DNAとして、 才リゴヌクレオチド 9 とオリゴヌ クレオチド 1 0を加えたものである。
レーン 6は、 プライマ一 MAとして、 ォリゴヌクレオチド 1 1とオリゴ ヌクレオチド 1 2を加えたものである。
レーン 7は、 プライマ—匪として、 オリゴヌクレオチド 1 3とオリゴ ヌクレオチド 1 4を加えたものである。 レーン 8は、 プライマ一 DNAとして、 オリゴヌクレオチド 1 5とオリゴ ヌクレオチド 1 6を加えたものである。
レーン 9は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 1 と同じ P CR 応を行ったものである。
レ ン 1 0は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 2と同じ P C II反応を行ったものである。
レ1 "ン 1 1は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えないで、 レーン 3と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1 2は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 4と同じ P Ci 反応を行ったものである。
レーン 1 3は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 5と同じ P C 反応を行ったものである。
レーン 1 4は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 6と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1 5は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 7と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 1 6は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 8と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 1 7は、 プライマ一 DNAの濃度をそれそれ 0. 2 0 M (最終濃 度） に増やして、 レーン 1と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1 8は、 プライマ一 DNAの濃度をそれそれ 0. 2 0〃M (最終濃 度） に増やして、 レーン 2と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1 9は、 プライマー DNAの濃度をそれそれ 0. 2 0〃M (最終濃 度） に増やして、 レーン 3と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 2 0は、 プライマー DNAの濃度をそれそれ 0. 2 0〃M (最終濃 度） に増やして、 レーン 4と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 2 1は、 プライマ一 DNAの濃度をそれそれ 0. 2 0〃M (最終濃 度） に増やして、 レーン 5と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 2 2は、 プライマー MAの濃度をそれそれ 0. 2 0〃M (最終濃 _
23 度） に増やして、 レーン 6と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 2 3は、 プライマ一 DNAの濃度をそれぞれ 0. 2 0〃M (最終濃 度） に増やして、 レーン 7 と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 2 4は、 プライマ一 DNAの濃度をそれぞれ 0. 2 0〃M (最終濃 度） に増やして、 レーン 8と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 2 5は、 プライマ一 DNAの濃度をそれそれ 0. 2 0 //M (最終濃 度） に増やして、 レーン 9と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 2 6は、 プライマ一 DNAの濃度をそれそれ 0. 2 0〃M (最終濃 度） に増やして、 レーン 1 0と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 2 7は、 プライマー DNAの濃度をそれそれ 0. 2 (最終濃 度） に増やして、 レーン 1 1と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 2 8は、 プライマ一 DNAの濃度をそれそれ 0. 2 0〃M (最終濃 度） に増やして、 レーン 1 2と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 2 9は、 プライマ一 DNAの濃度をそれぞれ 0. 2 0 / M (最終濃 度） に増やして、 レーン 1 3と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 3 0は、 プライマ一 DNAの濃度をそれそれ 0. 2 0〃M (最終濃 度） に増やして、 レーン 1 4と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 3 1は、 プライマー DNAの濃度をそれそれ 0. 2 0 M (最終濃 度） に増やして、 レーン 1 5と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 3 2は、 プライマー MAの濃度をそれぞれ 0. 2 0 / M (最終濃 度） に増やして、 レーン 1 6と同じ P CR反応を行ったものである。 第 2図 （A) の結果から明らかなように、 T.th. RecAタンパク質を加 えて P CR反応を行ったレーン 1〜レーン 8では、 所望の核酸 （正しい 特異的な P CR産物） の増幅が検出された一方、 副産物 （非特異的な P CR産物) の増幅はほとんど検出されなかった。
これに対し、 T.th. RecAタンパク質を加えずに P C R反応を行ったレ —ン 9〜レーン 1 6では、 所望の核酸のみならず副産物も多量に検出さ れた。また、所望の核酸の増幅がほとんど検出されないものもあった（レ ーン 1 5， 1 6等）。 この理由としては、 鎵型 DNAのうち増幅されるべき 領域が、 阻止的または抑制的 2次構造を有するためと考えられる。
また、 第 2図 （B ) の結果から明らかなように、 プライマ一 DNAの濃度 を増加させ、 T . th . RecAタンパク質を加えて P C R反応を行ったレーン 1 7〜レーン 2 4でも、 所望の DNAの増幅が検出された。 しかし、 レーン 1〜レーン 8の結果に比べると、 副産物が若干検出されたものも多い。 一方、 プライマ一 DNAの濃度を増加させ、 T . th. RecAタンパク質を加え ずに P C R反応を行ったレーン 2 5〜レーン 3 2では、 対応するレーン 9〜レーン 1 6の結果に比ぺ、 副産物がさらに多量に検出された。
これらのことから、 T . th . RecAタンパク質を加えて P C R反応を行え ば、 所望の核酸の収量を減少させることなく、 副産物の増幅を低く抑え ることができる。 即ち、 T . th. RecAタンパク質が存在することにより、 プライマ一 DNAが錶型 DNAの非特異的な領域に結合してプライマ一伸長反 応を起こすことが抑制されるため、 非特異的な P 産物の増幅を抑制 することができる。
また、 T . th . RecAタンパク質を加えて P C R反応を行えば、 錶型 DNA に阻止的または抑制的 2次構造を有する場合であっても、 所望の核酸を 効率よく特異的に増幅させることができる。相同組み換えタンパク質が、 錶型 DNAに結合することにより、阻止的または抑制的 2次構造が解かれる ためと考えられる。
また、 反応液中に加えるプライマー DNAの濃度 （ 0 . 0 6〃M) を低く 抑えても、 十分な量の核酸を増幅させることができ、 しかも、 プライマ — DNAの濃度を低くすることにより、 副産物の増幅を抑えつつ、 所望の核 酸だけをより特異的に増幅させることが可能となる。
(実施例 2 )
次いで、 第 2の実施例について説明する。 なお、 上記実施例 1 と同様 な部分の説明は、 省略または簡略化する。
本実施例では、第 3図に示すように、錶型 DNAとしてヒ トゲノム DNAを、 プライマー DNAとして 1 2種類のォリゴヌクレオチド（ォリゴヌクレオチ ド 1 7〜 2 8 )を用意した。これらのプライマー DNAは、 Homo sapiens BAG clone RP11-16P10 from 7， complete sequence . ( ACCESSI ON AC093734 ACO 11786 ) を参考にして設計した。 各プライマ一 DNAは、 任意のプライマ —設計の可能性を示すため、 それそれ位置をずらして設計してある。 な お、各プライマ一 DNAは、錶型 DNAと 1 0 0 %相補的な 2 O merの塩基配列 からなる。
ォリゴヌクレオチド 1 7
5' -cgggtgc acacaaaggc tgg-3
ォリゴヌクレオチド 1 8
55 -tctctggcca ggtgcctggc-3'
ォ 'Jゴヌクレオチド 1 9
5' -cgccccg acaacccxga ccc - 3，
ォリゴヌクレオチド 2 0
5， -cttgggaaga tcctgagact-35
ォリゴヌクレオチド 2 1
5' -tcggtaa acgctggctc ccg - 3，
ォ ΰゴヌクレオチド 2 2
5， -caaaacgccc cccaccgccc-3'
ォリゴヌクレオチド 2 3
5， -ggtttac cagcacctgg gga-3'
ォリゴヌクレオチド 2 4
5' - cccatcgtgg tctaggggat-3'
ォリゴヌクレオチド 2 5
5' -gaagtgg cccggaagac ggt-3
ォリゴヌクレオチ 2 6
5' -gcagcgccct tcccacccct-3'
ォリゴヌクレオチド 2 7
5' -gcacacg ccttgtagac agc-3"
ォリゴヌクレオチド 2 8
5， -ctgattctcc agggtgggct-3' 次に、上記実施例 1のレーン 1等と同様な条件で P CR反応を行った。 そして、 その反応液について 1 %のァガロースゲルで電気泳動を行い、 上記実施例 1 と同様にして、 その結果を写真に記録した。 これを第 4図 に示す。
レーン 1は、 プライマー DNAとして、 オリゴヌクレオチ ド 1 7とオリゴ ヌクレオチド 1 8を加えたものである。
レーン 2は、 プライマー DNAとして、 オリゴヌクレオチド 1 9 とオリゴ ヌクレオチド 2 0を加えたものである。
レーン 3は、 プライマー DNAとして、 ォリゴヌクレオチド 2 1 とオリゴ ヌクレオチド 2 2を加えたものである。
レーン 4は、 プライマー DNAとして、 オリゴヌクレオチド 2 3 とオリゴ ヌクレオチド 2 4を加えたものである。
レーン 5は、 プライマー DNAとして、 オリゴヌクレオチド 2 5 とオリゴ ヌクレオチド 2 6を加えたものである。
レーン 6は、 プライマ一 DNAとして、 オリゴヌクレオチド 2 7とオリゴ ヌクレオチド 2 8を加えたものである。
レーン 7は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 1 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 8は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 2 と同じ P 反応を行ったものである。
レーン 9は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 3 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 1 0は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 4と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1 1は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えないで、 レーン 5 と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1 2は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 6 と同じ P CR反応を行ったものである。
第 4図の結果から明らかなように、 T.th. RecAタンパク質を加えて P CRfe応を行ったレーン 1〜レーン 6では、 所望の核酸 （正しい特異的 な P CR産物） の増幅が検出された一方、 多くのレーンでは、 副産物（非 特異的な P CR産物） はほとんど検出されなかった。 また、 副産物が検 出されたレーンでも、 T.th. RecAタンパク質を加えずに P CR反応を行 つたレーンに比べれば、 副産物の生成が大幅に抑制された。
これに対し、 T.th. RecAタンパク質を加えずに P C R反応を行ったレ ーン 7〜レーン 1 2では、 所望の核酸のみならず副産物も多量に検出さ れた。
このことから、 T.th. RecAタンパク質を加えて P C R反応を行えば、 所望の核酸の収量を減少させることなく、 副産物の増幅を低く抑えるこ とができる。 即ち、 T.th. RecAタンパク質が存在することにより、 プラ ィマ一 DNAが錶型 DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を 起こすことが抑制されるため、 非特異的な P C R産物の増幅を抑制する ことができる。
また、 反応液中に加えるプライマ一 DNAの濃度 （ 0. 0 6〃M) を低く 抑えても、 十分な量の核酸を増幅させることができ、 しかも、 プライマ 一 DNAの濃度を低くすることにより、 副産物の増幅を抑えつつ、 所望の核 酸だけをより特異的に増幅させることが可能となる。
(実施例 3 )
次いで、 第 3の実施例について説明する。 なお、 上記各実施例のいず れかと同様な部分の説明は、 省略または簡略化する。
第 5図及び第 6図に示すように、 錶型 DNAとしてヒ トゲノム MAを、 プ ラィマー腿として 8種類のォリゴヌクレオチ ド（オリゴヌクレ才チ ド 2 9〜 3 6 ) を用意した。 これらのプライマー DNAは、 ヒ トゲノム DNAの single copy gene について設計した。 具体的には、 オリゴヌクレオチ ド 2 9 とオ リ ゴヌ ク レオチ ド 3 0は、 Human DNA sequence from clone EP5-1013A22 on chromosome 20 Contains the HNF4A (hepatic nuclear factor 4， alpha) gene, part of a novel gene encoding a protein similar to cellular retinaldehyde - binding protein, a RPL37A (ribosomal protein L37a) pseudogene, parts of 2 novel genes, ESTs , STSs and GSSs, complete sequence . ( ACCESSION AL132772) を参考にして設計した。 ま た、オリゴヌクレオチ ド 3 1 とオリゴヌクレオチド 3 2は、 Homo sapiens 3q BAG RP11-529F4 ( Roswel l Park Cancer Institute Human BAC Library) complete sequence . ( ACCESSION AC080007) を参考にして設計した。 ま た、オリゴヌクレオチド 3 3 とオリゴヌクレオチド 3 4は、 Homo sapiens genomic beta globin region (HBB@ ) on chromosome 11. ACCESSION NG_000007) を参考にして設計した。 また、 オリゴヌクレオチド 3 5 とォ リゴヌクレオチ ド 3 6は、 Homo spaiens HPFH60R gene for olfactory receptor . ( ACCESSION X81445 X91835 ) を参考にして設計した。 各ブラ ィマ一 DNAは、 錶型 DNAと 1 0 0 %相補的な 2 0 mer〜 2 5 merの塩基配列 からなる。
オリゴヌクレオチド 2 9 ：
5， -gcatctgggg cctgggattt ag-3"
オリゴヌクレオチド 3 0 ：
5' -tacaaggcag gcatcatgac tcacg-3'
ォリゴヌクレ才チド 3 1 ：
5' -aggagcttag gagggggagg t - 3，
才リゴヌクレオチド 3 2 ：
5， -cattgacagg acaggagaag gga-3"
ォリゴヌクレオチド 3 3 ：
5' -ctttttgttc ccccagacac tc - 3，
ォリゴヌクレオチ ド 3 4 ：
5' -gcactggctt aggagttgga ct - 3，
才リゴヌクレオチド 3 5 ：
5' -gttaatacct aaggcxcxac tgca-35
オリゴヌクレオチド 3 6 ：
5' -aggcaatggc ggcacccatc-3'
次に、プライマー DNAの濃度以外は上記実施例 1等と同じ条件で反応液 を作成した。 そして、 P CR反応を、 1サイクル （ 9 4°C, 1分間）、 3 0サイクル （ 9 4°C, 3 0秒間、 6 0 °C, 3 0秒間、 6 8 °C , 1分間）、 1サイクル （ 6 8 ， 7分間、 4 °C, 1分間） で行った。 その後、 反応 液について 1 %のァガロースゲルで電気泳動を行い、 上記実施例 1等と 同様にして、 その結果を写真に記録した。 これを第 7図及び第 8図に示 す。
レーン 1は、 プライマー MAとして、 0. 3〃M (最終濃度） のオリゴ ヌクレオチド 2 9と 0. 3 M (最終濃度） のォリゴヌクレオチ ド 3 0を 加えたものである。
レーン 2は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 1 と同じ； P
CR反応を行ったものである。
レーン 3は、 ォリゴヌクレオチド 2 9とオリゴヌクレオチド 3 0の濃 度をそれそれ 0. 1〃M (最終濃度） に減らして、 レーン 1 と同じ P CR 反応を行ったものである。
レーン 4は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 3と同じ P
CR反応を行ったものである。
レーン 5は、 オリゴヌクレオチド 2 9とオリゴヌクレオチ ド 3 0の濃 度をそれそれ 0. 0 3〃M (最終濃度） に減らして、 レーン 1 と同じ P C
R反応を行ったものである。
レーン 6は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 5 と同じ P
C R反応を行ったものである。
レーン 7は、 オリゴヌクレオチド 2 9 とオリゴヌクレオチド 3 0の濃 度をそれそれ 0. 0 1〃M (最終濃度） に減らして、 レーン 1 と同じ P C
R反応を行ったものである。
レーン 8は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 7と同じ P
C R反応を行ったものである。
レーン 9は、 オリゴヌクレオチド 2 9とオリゴヌクレオチド 3 0の濃 度をそれぞれ 0. 0 0 3 M (最終濃度） に減らして、 レーン 1 と同じ P C R反応を行ったものである。 gQ レーン 10は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えないで、 レーン 9と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1 1は、 プライマー DNAとして、 0. 3〃M (最終濃度） のオリ ゴヌクレオチド 3 1と 0. (最終濃度） のオリゴヌクレオチ ド 32 を加えたものである。
レーン 1 2は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えないで、 レーン 1 1と同 じ P C II反応を行ったものである。
レーン 1 3は、 オリゴヌクレオチド 3 1とオリゴヌクレオチド 32の 濃度をそれそれ 0. 1〃M (最終濃度） に減らして、 レーン 1 1と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 14は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン ； 1 3と同 じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1 5は、 オリゴヌクレオチド 3 1とオリゴヌクレオチド 32の 濃度をそれぞれ 0. 03〃M (最終濃度） に減らして、 レーン 1 1と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1 6は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えないで、 レーン 1 5と同 じ P 反応を行ったものである。
レーン 17は、 オリゴヌクレオチド 3 1とオリゴヌクレオチド 32の 濃度をそれそれ 0. 0 1〃M (最終濃度） に減らして、 レーン 1 1と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1 8は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えないで、 レーン 1 7と同 じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1 9は、 オリゴヌクレオチ ド 3 1とオリゴヌクレオチ ド 32の 濃度をそれそれ 0. 003 M (最終濃度） に減らして、 レーン 1 1と同 じ; P CR反応を行ったものである。
レーン 20は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えないで、 レーン 1 9と同 じ P CR反応を行ったものである。
レーン 2 1は、 プライマ一 DNAとして、 0. 3〃M (最終濃度） のオリ ゴヌクレオチド 33と 0. 3 /M (最終濃度） のォリゴヌクレオチ ド 34 ^ を加えたものである。
レーン 2 2は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えないで、 レーン 2 1 と同 じ P CR反応を行ったものである。
レーン 2 3は、 ォリゴヌクレオチド 3 3とオリゴヌクレオチド 3 4の 濃度をそれそれ 0. 1 M (最終濃度） に減らして、 レーン 2 1 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 2 4は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えないで、 レーン 2 3と同 じ P CR反応を行ったものである。
レーン 2 5は、 オリゴヌクレオチ ド 3 3とオリゴヌクレオチド 34の 濃度をそれそれ 0. 0 3〃M (最終濃度） に減らして、 レーン 2 1 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 2 6は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えないで、 レーン 2 5と同 じ: P CR反応を行ったものである。
レーン 2 7は、 オリゴヌクレオチ ド 3 3とオリゴヌクレオチド 34の 濃度を 0. 0 1〃M (最終濃度） に減らして、 レーン 2 1と同じ P CR反 応を行ったものである。
レーン 2 8は、 T.th. EecAタンパク質を加えないで、 レーン 2 7と同 じ P CR反応を行ったものである。
レーン 2 9は、 オリゴヌクレオチ ド 3 3とオリゴヌクレオチド 3 4の 濃度を 0. 0 0 3 M (最終濃度） に減らして、 レーン 2 1と同じ P CR 反応を行ったものである。
レーン 3 0は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えないで、 レーン 2 9と同 じ P CR反応を行ったものである。
レーン 3 1は、 プライマ一 DNAとして、 0. 3 M (最終濃度） のオリ ゴヌクレオチド 3 5と 0. 3〃M (最終濃度） のオリゴヌクレオチド 3 6 を加えたものである。
レーン 3 2は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えないで、 レーン 3 1 と同 じ P CR反応を行ったものである。
レーン 3 3は、 オリゴヌクレオチド 3 5 とオリゴヌクレオチ ド 3 6の ^ 濃度をそれそれ◦ . 1〃M (最終濃度） に減らして、 レーン 3 1 と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 34は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えないで、 レーン 3 3と同 じ P CR反応を行ったものである。
レーン 3 5は、 オリゴヌクレオチド 3 5とオリゴヌクレオチド 3 6の 濃度をそれそれ 0. 0 3〃M (最終濃度） に減らして、 レーン 3 1 と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 3 6は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えないで、 レーン 3 5 と同 じ P CR反応を行ったものである。
レーン 3 7は、 オリゴヌクレオチド 3 5とオリゴヌクレオチド 3 6の 濃度をそれぞれ 0. 0 1 M (最終濃度） に減ら して、 レーン 3 1 と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 3 8は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えないで、 レーン 3 7と同 じ P CR反応を行ったものである。
レーン 3 9は、 オリゴヌクレオチド 3 5とオリゴヌクレオチド 3 6の 濃度をそれそれ 0. 0 0 3〃M (最終濃度） に減らして、 レーン 3 1 と同 じ P CR反応を行ったものである。
レーン 40は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えないで、 レーン 3 9 と同 じ P C R反応を行ったものである。
第 7図 （A) の結果から明らかなように、 T.th. RecAタンパク質を加 えて P C R反応を行ったレーン 1 , 3， 5 , 7 , 9のうち、 レーン 9を 除く レーンでは、 所望の核酸 （正しい特異的な P CR産物） の増幅が検 出された一方、 副産物 （非特異的な P CR産物） はほとんど検出されな かった。 特に、 プライマ一 DNAの濃度が低くなるほど、 副産物の生成は抑 制される傾向にあった。 また、 レーン 9では、 プライマ一 DNAの濃度が低 すぎるためか、 核酸の増幅がほとんど検出できなかった。 また、 プライ マ一 DNAの濃度が同じであれば、 T.th. RecA夕ンパク質を加えずに P CR 反応を行ったものに比べ、 所望の核酸の増幅量が多くなつた。
これに対し、 T.th. RecAタンパク質を加えずに P C R反応を行ったレ —ン 2 , 4 , 6 , 8 , 1 0のうち、 レーン 1 0を除く レーンでは、 所望 の核酸のみならず副産物も検出された。 また、 レーン 1 0では、 プライ マー DNAの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかつ た。
第 7図 （B) の結果から明らかなように、 T.th. RecAタンパク質を加 えて P C R反応を行ったレーン 1 1 , 1 3 , 1 5 , 1 7 , 1 9のうち、 レーン 1 9を除く レーンでは、 所望の核酸の増幅が検出された一方、 副 産物はほとんど検出されなかった。特に、 プライマ一 DNAの濃度が低くな るほど、 副産物の生成は抑制される傾向にあった。 また、 レーン 1 9で は、 プライマ一 DNAの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出 できなかった。 また、 プライマ一 DNAの濃度が同じであれば、 T.th. RecA タンパク質を加えずに P C R反応を行ったものに比べ、 所望の核酸の増 幅量が多くなった。
これに対し、 T.th. HecAタンパク質を加えずに P C R反応を行ったレ ーン 1 2 , 1 4 , 1 6， 1 8， 2 0のうち、 レーン 2 0を除く レーンで は、所望の核酸のみならず副産物も検出された。また、 レーン 2 0では、 プライマ一 D N Aの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出でき なかった。
第 8図 （A) の結果から明らかなように、 T.th. RecAタンパク質を加 えて P CR反応を行ったレーン 2 1 , 2 3 , 2 5， 2 7， 2 9のうち、 レーン 2 9を除く レーンでは、 所望の核酸の増幅が検出された一方、 副 産物はほとんど検出されなかった。特に、 プライマ一 D N Aの濃度が低くな るほど、 副産物の生成は抑制される傾向にあった。 また、 レーン 2 9で は、 プライマー DNAの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出 できなかった。 また、 プライマー DNAの濃度が同じであれば、 T.th. RecA タンパク質を加えずに P C R反応を行ったものに比べ、 所望の核酸の増 幅量が多くなる傾向にあった。
一方、 T.th. RecAタンパク質を加えずに P C R反応を行ったレーン 2 2 , 2 4 , 2 6， 2 8 , 3 0のうち、 レーン 2 2， 2 4 , 2 6では、 所 望の核酸のみならず副産物も検出された。また、 レーン 2 8 , 3 0では、 プライマ一 DNAの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出でき なかった。
第 8図 （B) の結果から明らかなように、 T.th. RecAタンパク質を加 えて P C R反応を行ったレーン 3 1 , 3 3 , 3 5 , 3 7 , 3 9のうち、 レーン 3 9を除く レーンでは、 所望の核酸の増幅が検出された一方、 副 産物はほとんど検出されなかった。特に、 プライマ一 DNAの濃度が低くな るほど、 副産物の生成は抑制される傾向にあった。 また、 レーン 3 9で は、 プライマ一 DNAの濃度 低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出 できなかった。 また、 プライマ一 DMの濃度が同じであれば、 T.th. RecA タンパク質を加えずに P C R反応を行ったものに比べ、 所望の核酸の増 幅量が多くなる傾向にあった。
一方、 T.th. RecAタンパク質を加えずに P C R反応を行ったレーン 3 2 , 3 4 , 3 6 , 3 8 , 4 0のうち、 レーン 4 0を除く レーンでは、 所 望の核酸のみならず副産物も検出された。 また、 レーン 4 0では、 ブラ ィマー DNAの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなか つた。
これらのことから、 T.th. RecAタンパク質を加えて P C R反応を行え ば、 所望の核酸の収量を減少させることなく、 副産物の増幅を低く抑え ることができる。 即ち、 T.th. RecAタンパク質が存在することにより、 プライマー DNAが銪型 DNAの非特異的な領域に結合してプライマ一伸長反 応を起こすことが抑制されるため、 非特異的な P C R産物の増幅を抑制 することができる。
また、 反応液中に加えるプライマー DNAの濃度を低く抑えても、 十分な 量の核酸を増幅させることができ、 しかも、 プライマ一 DNAの濃度を低く することにより、 副産物の増幅を抑えつつ、 所望の核酸だけをより特異 的に増幅させることが可能となる。
(実施例 4 )
次いで、 第 4の実施例について説明する。 なお、 上記各実施例のいず れかと同様な部分の説明は、 省略または簡略化する。
第 9図に示すように、 鐯型 Aとしてヒ トゲノム DNAを用意し、 プライ マ一 DNAとして 5種類のォリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド 3 7〜
4 1 ) を用意した。 これらのプライマー DNAは、 Homo sapiens PAC clone RP5-1142J19 from 7q35-q365 complete sequence. (ACCESSION AC004975) を参考にして設計した。
プライマ一 DNAのうち、 オリゴヌクレオチド 3 7， 3 8は、 錶型 DNAと 1 0 0 %相補的な 2 Omerまたは 2 1 merの塩基配列からなる。 一方、 ォ リゴヌクレオチ ド 3 9は、錄型 DNAと 1塩基だけ異なる塩基配列からなり、 それ以外の部分はオリゴヌクレオチド 3 7 と同様である。 また、 オリゴ ヌクレオチド 4 0は、錶型 MAに対し 3塩基について異なる塩基配列から なり、 それ以外の部分はオリゴヌクレオチド 3 7 と同様である。 また、 オリゴヌクレオチド 4 1は、鎵型 DNAに対し 5塩基について異なる塩基配 列からなり、 それ以外の部分はォリゴヌクレオチド 3 7と同様である。 オリゴヌクレオチド 3 7 ：
5， -gcaggcacca agaactactg c - 3，
オリゴヌクレオチド 3 8 ：
5， -gcctaaggtc acgttgtccc-3'
ォリゴヌクレオチド 3 9 ：
5' -gcaggcacca ggaactactg c - 3，
ォリゴヌクレオチド 4 0 ：
5' -gcaggcgcca ggaagtactg c - 3，
オリゴヌクレオチド 4 1 ：
5' -gcgggcgcca ggaagtacgg c-3
次に、 プライマ一 DNAの濃度をそれそれ 0 . 3〃M (最終濃度） とし、 それ以外は上記実施例 3 と同様にして P C R反応により核酸を増幅させ た。 そして、 反応液について 1 %のァガロースゲルで電気泳動を行い、 上記実施例 1等と同様にして、 その結果を写真に記録した。 これを第 1
0図に示す。 n
ob —ン 1は、 プライマー DNAとして、 オリゴヌクレオチド 3 7 とオリゴ ヌクレオチド 3 8を加えたものである。
liーン 2は、 プライマー Aとして、 オリゴヌクレオチド 3 9 とオリゴ ヌ レオチド 3 8を加えたものである。
レーン 3は、 プライマー DNAとして、 オリゴヌクレオチド 4 0 とオリゴ ヌクレオチド 3 8を加えたものである。
ーン 4は、 プライマ一 DNAとして、 オリゴヌクレオチ ド 4 1 とオリゴ ヌクレオチド 3 8を加えたものである。
1/ーン 5は、 I mM (最終濃度）の ATP-ァ S (ロヅシュ）をさらに加えて、 レーン 1 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 6は、 I mM (最終濃度） の ATP-ァ Sをさらに加えて、 レーン 2 と 同じ P C R反応を行ったものであ！)。
レーン 7は、 I mM (最終濃度） の ATP-ァ Sをさらに加えて、 レーン 3 と 同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 8は、 I mM (最終濃度） の ATP-ァ Sをさらに加えて、 レーン 4と 同じ P C R反応を行ったものである。
第 1 0図の結果から明らかなように、 ATP- y Sを加えずに P C R反応を 行ったレーン 1〜レ一ン 4について見ると、 レーン 1〜レーン 3では、 所望の DNA (正しい特異的な P C R産物） の増幅が検出された一方、 副産 物 （非特異的な P C R産物） はほとんど検出されなかった。 一方、 レー ン 4では、 核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
これに対し、 ΑΊ -ァ Sを加えて P C R反応を行ったレーン 5〜レーン 8 について見ると、 レーン 5 とレーン 6では、所望の DNAの増幅が検出され た一方、 副産物はほとんど検出されなかった。 一方、 レーン 7 とレーン 8では、 核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
このことから、 T . th. RecAタンパク質を加えて P C R反応を行えば、 所望の核酸の収量を減少させることなく、 副産物の増幅を低く抑えるこ とができる。 即ち、 上記の相同組み換えタンパク質が存在することによ り、 プライマー DNAが錶型 DNAの非特異的な領域に結合してプライマ一伸 長反応を起こすことが抑制されるため、 非特異的な P C R産物の増幅を 抑制することができる。
具体的には、 ATP-ァ Sの非存在下では、 プライマ一 DNAと錶型 DNAとの塩 基のミスマッチが 3塩基以内の場合においてのみ、 特異的に核酸を増幅 させるようにすることができる。 従って、 T. th. RecAタンパク質を反応 液に加えることにより、 所望の核酸をより特異的に増幅することができ る。
一方、 ATP-ァ Sの存在下では、 プライマー DNAと錶型 DNAとの塩基のミス マツチが 1塩基以内の場合においてのみ、 特異的に核酸を増幅させるよ うにすることができる。 従って、 ATP- y Sを反応液に加えることにより、 所望の核酸をさらに特異的に増幅することができる。
なお、 MAポリメラ一ゼと、 4種類の dNTPと、 緩衝液と、 T . th. RecA 夕ンパク質等の相同組換えタンパク質とを核酸増幅用試薬キッ トとして 用意する場合には、 さらに、 ATP-ァ Sも、 そのキッ トに加えるのが好まし い。上記の実施例 4で明らかなように、 ATP-ァ Sを加えて P C R反応を行 えば、さらに特異的に所望の核酸を増幅させることができるからである。 また、 上記実施例 4の結果より、 一塩基多型を検出することが可能で ある。 即ち、 プライマ一 DNAの 1つに、 鎵型 DNAのうち一塩基多型をなす 塩基を含む配列に対応したプライマー DNAを用いて P C Rを行えば、鍀型 DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマ一 DNAとが完 全に相補的である場合に、 所望の核酸を増幅させるようにすることがで きる。一方、 鎵型 DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したブラ ィマー DNAとが完全には相補的ではない場合、 即ち、 一塩基多型をなす塩 基がプライマー MAと相補的でない場合に、所望の核酸が増幅しない、 ま たは、 抑制されるようにすることができる。 このため、 P C IIによる所 望の核酸の増幅により、 一塩基多型を検出することが可能である。
さらに、 ATP- y Sを加えた場合には、 より特異的に核酸を増幅すること ができるため、 所望の核酸の増幅により、 より確実に一塩基多型を検出 することが可能となる。 oo なお、 DNAポリメラ一ゼと、 4種類の dNTPと、 緩衝液と、 T.th. RecA 夕ンパク質等の相同的組換えタンパク質とは、 一塩基多型検出用試薬キ ッ トとして用意しておくのが便利である。 このようなキッ トを利用すれ ば、 DNAポリメラ一ゼ、 4種類の dNTP、 緩衝液、 及び、 T.th. RecAタンパ ク質等の相同的組換えタンパク質を反応液に加え、 さらに、 目的に応じ た錶型 DNAとプライマ一 DNAを用意して反応液に加えるだけで、 容易に P C Rにより一塩基多型を検出することができるからである。
そしてさらに、 上記キッ トには、 ATP-ァ Sも加えるのが好ましい。 上記 の実施例 4で明らかなように、 ATP-ァ Sを加えて P CR反応を行えば、 さ らに特異的に所望の核酸を増幅させることができるため、 より確実に一 塩基多型を検出することが可能となるからである。
(実施例 5 )
次いで、 第 5の実施例について説明する。 なお、 上記各実施例のいず れかと同様な部分の説明は、 省略または簡略化する。
第 1 1図及び第 1 2図に示すように、錶型 DNAとしてヒ トゲノム DNAを、 プライマー諷として 1 2種類のォリゴヌクレオチド（ォリゴヌクレオチ ド 4 2〜 5 3 ) を用意した。 具体的には、 ォリゴヌクレオチ ド 4 2 とォ' リゴヌクレオチ ド 4 3は、 Homo sapiens PAC clone RP5-1142J19 from 7q35-q36, complete sequence. (ACCESSION AC004975) を参考にして設 計した。 また、 オリゴヌクレオチ ド 44とオリゴヌクレオチ ド 4 5は、 Homo sapiens PAC clone RP5-85EP6 from 7pll .2-p21, complete sequence. (ACCESSION AC006454) を参考にして設計した。 また、 オリゴヌクレオ チ ド 4 6 とオ リ ゴヌ ク レオチ ド 4 7 は、 Homo sapiens PAC clone RP5-912I13 from 7, complete sequence. (ACCESSION AC008060) を参考 にして設計した。 また、 オリゴヌクレオチド 4 8 とオリゴヌクレオチド 4 9は、 Homo sapiens BAC clone RP11-16P10 from 7, complete sequence. (ACCESSION AC093734
AC011786) を参考にして設計した。 また、 ォリゴヌクレオチド 5 0 とォ リゴヌク レオチ ド 5 1は、 Homo sapiens BAC clone CTB-135C18 from 75ォォォォ 5qll .2-q225 complete sequence . ( ACCESSION AC005164) を参考にして 設計した。また、オリゴヌクレオチ ド 5 2 とオリゴヌクレオチド 5 3は、 Homo sapi ens PAC c lone RP5-852P6 from 7pll .2-p21 , complete sequence . ( ACCESS ION AC006454) を参考にして設計した。 各プライマ一 DNAは、 錶 型 DNAと 1 0 0 %相補的な 1 8 mer〜 2 2 merの塩基配列からなる。
ォリゴヌクレオチド 4 2
5， -gcaggcacca agaactactg c-3
才リゴヌクレオチド 4 3
5' -gcctaaggtc acgttgtccc-3'
ォリゴヌクレオチド 4 4
5' -catggcacct gctctgagac-3'
ォリゴヌクレオチド 4 5
5' -ggcactttgt gcctctctcc-3
ォリゴヌクレオチド 4 6 ：
5' -ccgagtcgca tgggtgag-3'
リゴヌクレオチド 4 7 ：
tttgtgcaag gaattgtggg-33
リゴヌクレオチド 4 8 ：
5' -atctstgtgg ttcggctctg-3'
ォリゴヌクレオチド 4 9
5' -ctcccttaac agcagccxcc-3
ォリゴヌクレオチド 5 0
5 -caaagctacx txcacagccx cc一 3
ォ 'Jゴヌクレオチド 5 1
5' -ggcatattca gccaaggatt tc-3'
リゴヌクレオチド 5 2 ：
tttctggaag ggactgggtc-33
リゴヌクレオチド 5 3 ：
5' -tcccaggatc catggagaag-35 Λη
40 次に、 上記実施例 4と同様な条件で P CR反応を行い、 核酸を増幅さ せた。そして、反応液について 1 %のァガロースゲルで電気泳動を行い、 上記実施例 1等と同様にして、 その結果を写真に記録した。 これを第 1 3図及び第 1 4図に示す。
なお、 この P CRの温度条件、 即ち、 1サイクル （ 94°C, 1分間）、 3 0サイクル（ 9 4 °C， 3 0秒間、 6 0 °C， 3 0秒間、 6 8 °C， 1分間）、 1サイクル （ 6 8 °C, 7分間、 4°C， 1分間） を温度条件 1とする。 ァ 二一リング温度は 6 0 °Cである。
レーン 1は、 プライマー DNAとして、 オリゴヌクレオチ ド 42とオリゴ ヌクレオチド 43を加えたものである。
レーン 2は、 ブラィマー MAとして、 オリゴヌクレオチ ド 44とオリゴ ヌクレオチド 45を加えたものである。
レーン 3は、 プライマ一 DNAとして、 オリゴヌクレオチド 46 とオリゴ ヌクレオチ ド 4 7を加えたものである。
レーン 4は、 プライマー DNAとして、 オリゴヌクレオチ ド 48とオリゴ ヌクレオチド 4 9を加えたものである。
レーン 5は、 ブラィマー DNAとして、ォリゴヌクレオチ ド 5 0とオリゴ ヌクレオチド 5 1を加えたものである。
レーン 6は、 プライマ一 DNAとして、 オリゴヌクレオチド 5 2とオリゴ ヌクレオチド 5 3を加えたものである。
レーン 7は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 1 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 8は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 2 と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 9は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 3 と同じ P CR反応を行ったものである。
レ一ン 1 0は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 4と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 1 1は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えないで、 レーン 5と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1 2は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 6と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 1 3〜レーン 2 4は、 P C Rの温度条件を、 1サイクル（ 9 4 °C， 1分間）、 3 0サイクル（ 9 4 °C, 3 0秒間、 5 5 °C， 3 0秒間、 6 8 °C , 1分間）、 1サイクル （ 6 8 °C；， 7分間、 4°C, 1分間） とした。 これを 温度条件 2とする。 アニーリング温度は 5 5 °Cである。
レーン 1 3は、 上記温度条件 2の下で、 それ以外はレーン 1 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 1 4は、 上記温度条件 2の下で、 それ以外はレーン 2 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 1 5は、 上記温度条件 2の下で、 それ以外はレ一ン 3 と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1 6は、 上記温度条件 2の下で、 それ以外はレーン 4と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1 7は、 上記温度条件 2の下で、 それ以外はレーン 5 と同じ P C R反応を行つたものである。
レーン 1 8は、 上記温度条件 2の下で、 それ以外はレーン 6と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1 9は、 上記温度条件 2の下で、 それ以外はレ一ン 7と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 2 0は、 上記温度条件 2の下で、 それ以外はレーン 8 と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 2 1は、 上記温度条件 2の下で、 それ以外はレーン 9 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 2 2は、 上記温度条件 2の下で、 それ以外はレーン 1 0 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 2 3は、 上記温度条件 2の下で、 それ以外はレーン 1 1 と同じ P CR反応を行ったものである。 42 レーン 2 4は、 上記温度条件 2の下で、 それ以外はレーン 1 2 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 2 5〜レーン 3 6は、 P C Rの温度条件を、 1サイクル（ 9 4 °C , 1分間）、 3 0サイクル（ 9 4 °C , 3 0秒間、 5 0 °C， 3 0秒間、 6 8 °C , 1分間）、 1サイクル （ 6 8 °C , 7分間、 4 °C , 1分間） とした。 これを 温度条件 3とする。 ァニーリング温度は 5 0 °Cである。
レーン 2 5は、 上記温度条件 3の下で、 それ以外はレーン 1 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 2 6は、 上記温度条件 3の下で、 それ以外はレーン 2 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 2 7は、 上記温度条件 3の下で、 それ以外はレーン 3 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 2 8は、 上記温度条件 3の下で、 それ以外はレーン 4と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 2 9は、 上記温度条件 3の下で、 それ以外はレーン 5 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 3 0は、 上記温度条件 3の下で、 それ以外はレーン 6 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 3 1は、 上記温度条件 3の下で、 それ以外はレーン 7 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 3 2は、 上記温度条件 3の下で、 それ以外はレーン 8 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 3 3は、 上記温度条件 3の下で、 それ以外はレーン 9 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 3 4は、 上記温度条件 3の下で、 それ以外はレーン 1 0 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 3 5は、 上記温度条件 3の下で、 それ以外はレーン 1 1 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 3 6は、 上記温度条件 3の下で、 それ以外はレーン 1 2 と同じ 賺 11752
43
P G 反応を行つたものである。
レーン 3 7〜レーン 4 8は、 P C Rの温度条件を、 1サイクル（ 9 4 °C , 1分間）、 3 0サイクル（ 9 4 °C , 3 0秒間、 4 5 °C , 3 0秒間、 6 8 °C， 1分間）、 1サイクル （ 6 8 °C , 7分間、 4 °C , 1分間） とした。 これを 温度条件 4とする。 アニーリング温度は 4 5 °Cである。
レーン 3 7は、 上記温度条件 4の下で、 それ以外はレーン 1 と同じ P C R反応を行つたものである。
レーン 3 8は、 上記温度条件 4の下で、 それ以外はレーン 2 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 3 9は、 上記温度条件 4の下で、 それ以外はレーン 3 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 4 0は、 上記温度条件 4の下で、 それ以外はレーン 4 と同じ P C R反応を行つたものである。
レーン 4 1は、 上記温度条件 4の下で、 それ以外はレーン 5 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 4 2は、 上記温度条件 4の下で、 それ以外はレーン 6 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 4 3は、 上記温度条件 4の下で、 それ以外はレーン 7 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 4 4は、 上記温度条件 4の下で、 それ以外はレーン 8 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 4 5は、 上記温度条件 4の下で、 それ以外はレーン 9 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 4 6は、 上記温度条件 4の下で、 それ以外はレーン 1 0 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 4 7は、 上記温度条件 4の下で、 それ以外はレーン 1 1 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 4 8は、 上記温度条件 4の下で、 それ以外はレーン 1 2 と同じ P C R反応を行ったものである。 第 1 3図（A)の結果から明らかなように、アニーリング温度が 6 0°C の場合、 T.th. RecAタンパク質を加えて P C R反応を行ったレーン 1〜 レ一ン 6では、 所望の核酸 （正しい特異的な P CR産物） の増幅が検出 された一方、 副産物 （非特異的な P C R産物） はほとんど検出されなか つた。
これに対し、 T.th. RecAタンパク質を加えずに P CR反応を行ったレ —ン 7〜レーン 1 2のうち、 一部のレーンでは、 所望の核酸のみならず 副産物も若干検出された。 また、 一部のレーンでは、 核酸の増幅がほと んど検出できなかった。 これは、鎵型 DNAの増幅領域に阻止的または抑制 的 2次構造を有するためと考えられる。
また、 第 1 3図 （B) の結果から明らかなように、 アニーリング温度 が 5 5 °Cの場合でも、 T.th. RecAタンパク質を加えて P C R反応を行つ たレーン 1 3〜レーン 1 8では、 所望の核酸の増幅が検出された一方、 副産物はほとんど検出されなかつた。
これに対し、 T.th. RecAタンパク質を加えずに P C R反応を行ったレ ーン 1 9〜レーン 24のうち、 一部のレーンでは、 所望の核酸のみなら ず副産物も若干検出された。 また、 一部のレーンでは、 核酸の増幅がほ とんど検出できなかった。 これは、鎵型 D N Aの増幅領域に阻止的または抑 制的 2次構造を有するためと考えられる。
第 1 4図（A)の結果から明らかなように、ァニ一リング温度が 5 0 °C の場合、 T.th. RecAタンパク質を加えて P C R反応を行ったレ一ン 2 5 〜レーン 3 0のうち、 一部のレーンでは、 所望の核酸の増幅が検出され た一方、副産物はほとんど検出されなかった。また、一部のレーンでは、 所望の核酸の増幅のみならず副産物も検出された。 但し、 T.th. RecA夕 ンパク質を加えずに P CR反応を行ったものと比べると、 副産物の増幅 量は少なかった。
これに対し、 T.th. RecAタンパク質を加えずに P C R反応を行ったレ —ン 3 1〜レーン 3 6のうち、 一部のレーンでは、 所望の核酸のみなら ず副産物も多量に検出された。 また、 一部のレーンでは、 核酸の増幅が ほ^んど検出できなかった。 これは、 錶型 DNAの増幅領域に阻止的または 抑制的 2次構造を有するためと考えられる。
また、 第 1 4図 （B) の結果から明らかなように、 ァニ一リ ング温度 が 4 5 °Cの場合、 T.th. RecA夕ンパク質を加えて P C R反応を行ったレ —ン 3 7〜レーン 4 2では、 所望の核酸の増幅が見られたが、 副産物も 検出された。 但し、 T.th. RecAタンパク質を加えずに P CR反応を行つ た^)のと比べると、 副産物の増幅量は少なかった。
れに対し、 T.th. RecAタンパク質を加えずに P C R反応を行ったレ — 4 3〜レーン 4 8のうち、 一部のレーンでは、 所望の核酸のみなら ず副産物も多量に検出された。 また、 一部のレーンでは、 核酸の増幅が ほ んど検出できなかった。 これは、 銪型 DNAの増幅領域に阻止的または 抑 的 2次構造を有するためと考えられる。
これらのことから、 T.th. RecAタンパク質を加えて P CRを行えば、 所望の核酸の収量を減少させることなく、 副産物の増幅を低く抑えるこ とができる。 即ち、 上記の相同組み換えタンパク質が存在することによ り、 プライマー DNAが錡型 DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸 長反応を起こすことが抑制されるため、 非特異的な P C R産物の増幅を 抑制することができる。
また、 T.th. RecAタンパク質を加えて P C R反応を行えば、 錶型 DNA に阻止的または抑制的 2次構造を有する場合であっても、 所望の核酸を 効率よく特異的に増幅させることができる。相同組み換えタンパク質が、 錶型 DNAに結合することにより、阻止的または抑制的 2次構造が解かれる ためと考えられる。
また、 P CRの特異性が高いため、 プライマ一伸長反応の温度条件（ァ ニーリング温度） を変えても、 所望の核酸を特異的に増幅させることが できる。 即ち、 T.th. RecAタンパク質を加えずに P C R反応を行った場 合には、 プライマー伸長反応の温度 （アニーリング温度） を低く設定す ると、 目的とする核酸だけでなく、 副産物も多量に増幅されることとな るが、 T.th. RecAタンパク質を加えて P C R反応を行えば、 目的とする 4b 核^をより特異的に増幅させることが可能となる。
( ^施例 6 )
次 ;いで、 第 6の実施例について説明する。 なお、 上記各実施例のいず れかと同様な部分の説明は、 省略または簡略化する。
錶型 DNAとしてヒ トゲノム MAを用意し、 プライマ一 DNAとして、 上記実 施例4と同様な 5種類のォリゴヌクレオチド （オリゴヌクレオチド 3 7 〜4: 1 ) (第 9図参照） と、第 1 5図に示すように 5種類のォリゴヌクレ ォチド （ォリゴヌクレオチド 5 4〜 5 8 ) を用意した。
第 1 5 図に示すよう に、 後者の 5種類のプライマー DNAは、 Homo sapiens BAC c lone CTB-135C18 from 7ql l .2-q22, complete sequence . (ACCESSION AC005164) を参考にして設計した。 これらのプライマ一 DNA のうち、 オリゴヌクレオチド 5 4とオリゴヌクレオチド 5 5は、 鍊型 DNA と 1 0 0 %相補的な 2 2 merの塩基配列からなる。一方、 オリゴヌクレオ チド 5 6は、 鏡型 DNAと 1塩基だけ異なる塩基配列からなり、 それ以外の 部分はオリゴヌクレオチド 5 4と同様である。 また、 オリゴヌクレオチ ド 5 7は、 銃型 DNAに対し 3塩基について異なる塩基配列からなり、 それ 以外の部分はオリゴヌクレオチ ド 5 4 と同様である。 また、 オリゴヌク レオチド' 5 8は、鎵型 DMに対し 5塩基について異なる塩基配列からなり、 それ以外の部分はォリゴヌクレオチド 5 4と同様である。
才リゴヌクレオチド 5 4 ：
5' -caaagctact ttcacagcct cc-3'
オリゴヌクレオチド 5 5 ：
5' -ggcatattca gccaaggatt tc-35
オリゴヌクレオチド 5 6 ：
5' -caaagctact tgcacagcct cc-3'
オリゴヌクレオチド 5 7 ：
b' -caaagctgct tgcacggcct cc-3'
ォリゴヌクレオチド 5 8 ：
5' -caaggctgct tgcacggccg cc-3' 次に、 上記実施例 4等と同様な条件で P CR反応を行い、 核酸を増幅 させた。 そして、 反応液について 1 %のァガロースゲルで電気泳動を行 い、 上記実施例 1等と同様にして、 その結果を写真に記録した。 これを 第 16図に示す。
レーン 5は、 プライマ一 DNAとして、 オリゴヌクレオチ ド 37とオリゴ ヌクレオチド 38を加えたものである。
レーン 6は、 プライマー DNAとして、 オリゴヌクレオチド 39とオリゴ ヌクレオチド 38を加えたものである。
レーン 7は、 プライマー DNAとして、 オリゴヌクレオチド 40とオリゴ ヌクレオチド 3 8を加えたものである。
レーン 8は、 プライマー MAとして、 ォリゴヌクレオチ ド 4 1とオリゴ ヌクレオチド 38を加えたものである。
レーン 9は、 1 mM (最終濃度） の ATP-ァ Sをさらに加えて、 レーン 5と 同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1 0は、 IfflM (最終濃度） の ATP-ァ Sをさらに加えて、 レーン 6 と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1 1は、 ImM (最終濃度） の ATP-ァ Sをさらに加えて、 レーン 7 と同じ： P C R反応を行つたものである。
レーン 1 2は、 ImM (最終濃度） の ATP-ァ Sをさらに加えて、 レ一ン 8 と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 かつ、 ImM (最終 濃度）の ATP-ァ Sを加えて、 それ以外はレーン 5と同じ P C I 反応を行つ たものである。
レーン 2は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 かつ、 ImM (最終 濃度）の ATP- y Sを加えて、 それ以外はレーン 6と同じ P CR反応を行つ たものである。
レーン 3は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 かつ、 ImM (最終 濃度）の ATP-ァ Sを加えて、 それ以外はレーン 7と同じ P CR反応を行つ たものである。 Λα
48 レーン 4は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 かつ、 ImM (最終 濃度）の ATP-ァ Sを加えて、 それ以外はレーン 8と同じ P 反応を行つ たものである。
レーン 17は、 プライマ一 DNAとして、 オリゴヌクレオチド 54とオリ ゴヌクレオチド 5 5を加えたものである。
レーン 18は、 プライマー DNAとして、 ォリゴヌクレオチド 5 6とオリ ゴヌクレオチド 5 5を加えたものである。
レーン 1 9は、 プライマ一 DNAとして、ォリゴヌクレオチ ド 5 7とオリ ゴヌクレオチド 5 5を加えたものである。
レーン 20は、 プライマ一 DNAとして、 オリゴヌクレオチド 5 8 とオリ ゴヌクレオチド 55を加えたものである。
レーン 2 1は、 ImM (最終濃度） の ATP-y Sをさらに加えて、 レーン 1 7と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 22は、 1 mM (最終濃度） の ATP-ァ Sをさらに加えて、 レーン 1 8と同じ； P CR反応を行ったものである。
レーン 23は、 ImM (最終濃度） の ATP-ァ Sをさらに加えて、 レーン 1 9と同じ PCR反応を行ったものである。
レーン 24は、 ImM (最終濃度） の ATP -ァ Sをさらに加えて、 レーン 2 0と同じ P C I反応を行ったものである。
レーン 1 3は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 かつ、 ImM (最 終濃度）の ATP-ァ Sを加えて、 それ以外はレーン 17と同じ P CR反応を 行ったものである。
レーン 14は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 かつ、 ImM (最 終濃度）の ATP-ァ Sを加えて、 それ以外はレーン 1 8と同じ P CR反応を 行ったものである。
レーン 1 5は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 かつ、 ImM (最 終濃度）の ATP-ァ Sを加えて、 それ以外はレーン 1 9と同じ P CR反応を 行ったものである。
レーン 1 6は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 かつ、 ImM (最 終濃度） の ATP-ァ Sを加えて、 それ以外はレーン 2 0 と同じ P CR反応を 行ったものである。
第 1 6図 （A) の結果から明らかなように、 T.th. RecAタンパク質を 加:え、 かつ、 ATP-ァ Sを加えずに P C R反応を行ったレーン 5〜レーン 8 について見ると、 所望の DNA (正しい特異的な P CR産物） の増幅が検出 された一方、 副産物 （非特異的な P C R産物） はほとんど検出されなか つた。 また、 レーン 5及びレーン 6に比べ、 レーン 7では所望の核酸の 増幅が少なく、 さらに、 レーン 8では所望の核酸の増幅が少なかった。
これに対し、 T.th. RecAタンパク質を加え、 かつ、 ATP-ァ Sも加えて P CR反応を行ったレーン 9〜レーン 1 2について見ると、 レーン 9〜レ —ン 1 1では、 所望の DNAの増幅が検出された一方、 副産物はほとんど検 出されなかった。 一方、 レーン 1 2では、 核酸の増幅が検出できなかつ た。 また、 レーン 9及びレーン 1 0に比べ、 レーン 1 1では、 所望の核 酸の増幅が少なかった。 さらに、 このレーン 1 1は、 上記レーン 7 と比 ベても、 所望の核酸の増幅が少なかった。
他方、 T.th. RecAタンパク質を加えずに、 ATP-ァ Sを加えて P 反応 を行ったレーン 1〜レーン 4について見ると、所望の DNAの增幅のみなら ず副産物も多量に増幅された。
また、 第 1 6図 （B ) の結果から明らかなように、 T.th. RecA夕ンパ ク質を加え、 かつ、 ATP-ySを加えずに P CR反応を行ったレーン 1 Ί〜 レーン 2 0について見ると、 レーン 1 7〜レーン 1 9では、 所望の DNA の増幅が検出された一方、 副産物はほとんど検出されなかった。 一方、 レーン 2 0では、 核酸の増幅がほとんど検出できなかった。 また、 レー ン 1 7及びレーン 1 8に比べ、 レーン 1 9では、 所望の核酸の増幅が少 なかった。
これに対し、 T.th. RecAタンパク質を加え、 かつ、 ATP-ァ Sも加えて P 反応を行ったレーン 2 1〜レーン 2 4について見ると、 レーン 2 1 では、 所望の DNAの増幅が検出された一方、 副産物はほとんど検出されな かった。 一方、 レーン 2 2〜レーン 2 4では、 核酸の増幅がほとんど検 n 出できなかった。
他方、 T.th. RecAタンパク質を加えずに、 ATP-ァ Sを加えて P CR反応 を行ったレーン 1 3〜レーン 1 6について見ると、所望の DNAの増幅のみ ならず副産物も多量に増幅された。
これらのことから、 T.th. RecAタンパク質を加えて P C R反応を行え ば、 所望の核酸の収量を減少させることなく、 副産物の増幅を低く抑え ることができる。 即ち、 上記の相同組み換えタンパク質が存在すること により、 プライマー DNAが錶型 DNAの非特異的な領域に結合してプライマ 一伸長反応を起こすことが抑制されるため、 非特異的な P CR産物の増 幅を抑制することができる。
具体的には、 ATP-ァ Sの非存在下では、 プライマ一 MAと錶型 DNAとの塩 基のミスマッチが 3塩棊以内の場合においてのみ、 特異的に核酸を増幅 させるようにすることができる。 従って、 T.th. RecAタンパク質を反応 液に加えることにより、 所望の核酸をより特異的に増幅することができ る。
一方、 ATP- y Sの存在下では、 プライマ一 DNAと鎢型 DNAとの塩基のミス マツチが 1塩基以内の場合においてのみ、 特異的に核酸を増幅させるよ うにすることができる。 従って、 ATP-ァ Sを反応液に加えることにより、 所望の核酸をさらに特異的に増幅することがでぎる。
また、 ATP-ySは、 T.th. RecAタンパク質を加えたときには、 P C Rの 特異性を向上させることができるが、 T.th. RecA夕ンパク質の非存在下、 即ち、 ATP-ァ Sだけでは、 P CRの特異性を向上させることができないと 曰える。
また、本実施例の結果より、一塩基多型を検出することが可能である。 即ち、 プライマ一 DNAの 1つに、 铸型 DNAのうち一塩基多型をなす塩基を 含む配列に対応したプライマー DNAを用いて P CRを行えば、 錡型 DNAと 一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマ一 DNAとが完全に 相補的である場合に、所望の核酸を増幅させるようにすることができる。 一方、錶型 DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマー C1
ol
DNAとが完全には相補的ではない場合、 即ち、 一塩基多型をなす塩基がプ ライマー DMと相補的でない場合に、 所望の核酸が増幅しない、 または、 抑制されるようにすることができる。 このため、 P CRによる所望の核 酸の増幅により、 一塩基多型を検出することが可能である。
さらに、 ATP-ァ Sを加えた場合には、 より特異的に核酸を増幅すること ができるため、 所望の核酸の増幅により、 より確実に一塩基多型を検出 することが可能となる。
(実施例 7)
次いで、 第 7の実施例について説明する。 なお、 上記各実施例のいず れかと同様な部分の説明は、 省略または簡略化する。
鐽型 MAとしてヒ トゲノム DNAを、ブラィマ一 DNAとして上記実施例 4で 用いたオリゴヌクレオチドの一部 （オリゴヌクレオチド 3 8〜4 0 ) を 用意した （第 9図参照）。
次に、 上記実施例 4等と同様な条件で P CR反応を行い、 核酸を増幅 させた。 そして、 反応液について 1 %のァガロースゲルで電気泳動を行 い、 上記実施例 1等と同様にして、 その結果を写真に記録した。 これを 第 1 7図〜第 1 9図に示す。
レーン 1は、 プライマー DNAとして、 オリゴヌクレオチ ド 3 9 とオリゴ ヌクレオチド 3 8を加えたものである。
レーン 2は、 T.th. RecA夕ンパク質の代わりに大腸菌（E.coli)の RecA タンパク質を加えて、 それ以外はレーン 1と同じ P CR反応を行ったも のである。
レーン 3は、 T.th. RecA夕ンパク質の代わりに T.th.の SSB夕ンパク質 を加えて、 それ以外はレーン 1と同じ P CR反応を行ったものである。 レーン 4は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 それ以外はレーン 1と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 5は、 プライマ一 DNAとして、 ォリゴヌクレオチド 4 0 とオリゴ ヌクレオチド 3 8を加えたものである。
レーン 6は、 T.th. RecAタンパク質の代わりに E.coli RecAタンパク 質を加えて、それ以外はレーン 5 と同じ P C R反応を行ったものである。 レーン 7は、 T. th. HecA夕ンパク質の代わりに T. th.の SSB夕ンパク質 を加えて、 それ以外はレーン 5と同じ P C R反応を行ったものである。 レーン 8は、 T . th. RecAタンパク質を加えないで、 それ以外はレーン 5 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 9は、 プライマ一伸長反応の 1サイクル終了後にはじめてプラ ィマ一 DNAを加え、その後さらにプライマ一伸長反応を 3 0サイクルを行 つたものであり、 それ以外はレーン 1 と同じ P C R反応を行ったもので ある。
レーン 1 0は、 プライマー伸長反応の 1サイクル終了後にはじめてプ ライマー DNAを加え、その後さらにブラィマ一伸長反応を 3 ◦サイクルを 行ったものであり、 それ以外はレーン 2 と同じ P C R反応を行ったもの である。
レーン 1 1は、 プライマ一伸長反応の 1サイクル終了後にはじめてプ ライマー DNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を 3 0サイクルを 行ったものであり、 それ以外はレーン 3 と同じ P C R反応を行ったもの である。
レーン 1 2は、 プライマー伸長反応の 1サイクル終了後にはじめてプ ライマー DNAを加え、その後さらにプライマ一伸長反応を 3 0サイクルを 行ったものであり、 それ以外はレーン 4と同じ P C R反応を行ったもの である。
レーン 1 3は、 プライマー伸長反応の 1サイクル終了後にはじめてプ ライマー DNAを加え、その後さらにブラィマ一伸長反応を 3 0サイクルを 行ったものであり、 それ以外はレーン 5 と同じ P C R反応を行ったもの である。
レーン 1 4は、 プライマー伸長反応の 1サイクル終了後にはじめてプ ライマー DNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を 3 0サイクルを 行ったものであり、 それ以外はレーン 6 と同じ P C R反応を行ったもの である。 レーン 1 5は、 プライマー伸長反応の 1サイクル終了後にはじめてプ ライマ一 DNAを加え、その後さらにブライマ一伸長反応を 3 0サイクルを 行ったものであり、 それ以外はレーン 7 と同じ P C R反応を行ったもの である。
レーン 1 6は、 プライマ一伸長反応の 1サイクル終了後にはじめてプ ライマー MAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を 3 0サイクルを 行ったものであり、 それ以外はレーン 8と同じ P C R反応を行ったもの である。
レーン 1 7は、 プライマー伸長反応の 3サイクル終了後にはじめてプ ライマー DNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を 3 0サイクルを 行ったものであり、 それ以外はレーン 1 と同じ P C R反応を行ったもの である。
レーン 1 8は、 プラィマ一伸長反応の 3サイクル終了後にはじめてプ ライマ一 DNAを加え、その後さらにプライマ一伸長反応を 3 0サイクルを 行ったものであり、 それ以外はレーン 2 と同じ P C R反応を行ったもの である。
レーン 1 9は、 プライマ一伸長反応の 3サイクル終了後にはじめてプ ライマ一 MAを加え、その後さらにブラィマ一伸長反応を 3 0サイクルを 行ったものであり、 それ以外はレーン 3 と同じ P C R反応を行ったもの である。
レーン 2 0は、 プライマー伸長反応の 3サイクル終了後にはじめてプ ライマ一 DNAを加え、その後さらにプライマ一伸長反応を 3 0サイクルを 行ったものであり、 それ以外はレーン 4と同じ P C R反応を行ったもの である。 .
レーン 2 1は、 プライマ一伸長反応の 3サイクル終了後にはじめてプ ラィマ一 DNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を 3 0サイクルを 行ったものであ り、 それ以外はレーン 5 と同じ； P C R反応を行ったもの である。
レーン 2 2は、 プライマ一伸長反応の 3サイクル終了後にはじめてプ ライマ一 DNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を 3 0サイクルを 行ったものであり、 それ以外はレーン 6 と同じ P C R反応を行ったもの である。
レーン 2 3は、 プライマー伸長反応の 3サイクル終了後にはじめてプ ライマー DNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を 3 0サイクルを 行ったものであり、 それ以外はレーン 7 と同じ P C R反応を行ったもの である。
レーン 2 4は、 プラィマー伸長反応の 3サイクル終了後にはじめてプ ライマ一 DNAを加え、その後さらにプライマ一伸長反応を 3 0サイクルを 行ったものであり、 それ以外はレーン 8 と同じ P C R反応を行ったもの である。
レーン 2 5は、 プライマー伸長反応の 6サイクル終了後にはじめてプ ラィマ一 DNAを加え、その後さらにブラィマー伸長反応を 3 0サイクルを 行ったものであり、 それ以外はレーン 1 と同じ P C R反応を行ったもの である。
レーン 2 6は、 プライマ一伸長反応の 6サイクル終了後にはじめてプ ライマ一 DNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を 3 0サイクルを 行ったものであり、 それ以外はレーン 2 と同じ P C R反応を行ったもの である。
レーン 2 7は、 プライマー伸長反応の 6サイクル終了後にはじめてプ ライマ一 DNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を 3 0サイクルを 行ったものであり、 それ以外はレーン 3 と同じ P C R反応を行ったもの である。
レーン 2 8は、 プライマー伸長反応の 6サイクル終了後にはじめてプ ライマ一 DNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を 3 0サイクルを 行ったものであり、 それ以外はレーン 4と同じ P C R反応を行ったもの である。
レーン 2 9は、 プライマー伸長反応の 6サイクル終了後にはじめてプ ラィマ一 DNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を 3 0サイクルを 行ったものであり、 それ以外はレーン 5 と同じ P 反応を行ったもの である。
レーン 3 0は、 プライマ一伸長反応の 6サイクル終了後にはじめてプ ライマー DNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を 3 0サイクルを 行ったものであり、 それ以外はレーン 6 と同じ P C R反応を行ったもの である。
レーン 3 1は、 プライマ一伸長反応の 6サイクル終了後にはじめてプ ライマ一 DNAを加え、その後さらにブライマ一伸長反応を 3 0サイクルを 行ったものであり、 それ以外はレーン 7と同じ P C R反応を行ったもの である。
レーン 3 2は、 ブライマ一伸長反応の 6サイクル終了後にはじめてプ ライマ一 MAを加え、その後さらにブラィマー伸長反応を 3 0サイクルを 行ったものであり、 それ以外はレーン 8 と同じ P C R反応を行ったもの である。
レーン 3 3は、 プライマー伸長反応の 1 0サイクル終了後にはじめて プライマー DNAを加え、その後さらにプライマ一伸長反応を 3 0サイクル を行ったものであり、 それ以外はレーン 1 と同じ P C R反応を行ったも のである。
レーン 3 4は、 プライマー伸長反応の 1 0サイクル終了後にはじめて プライマー DNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を 3 0サイクル を行ったものであり、 それ以外はレーン 2 と同じ P C R反応を行ったも のである。
レーン 3 5は、 プライマ一伸長反応の 1 0サイクル終了後にはじめて プライマ一 DNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を 3 0サイクル を行ったものであり、 それ以外はレーン 3 と同じ P C R反応を行ったも のである。
レーン 3 6は、 プライマー伸長反応の 1 0サイクル終了後にはじめて プライマ一 DNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を 3 0サイクル を行ったものであり、 それ以外はレーン 4と同じ P C R反応を行ったも rr
56 のである。
レーン 3 7は、 プライマ一伸長反応の 1 0サイクル終了後にはじめて プライマー MAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を 3 0サイクル を行ったものであり、 それ以外はレーン 5 と同じ P C R反応を行ったも のである。
レーン 3 8は、 プライマー伸長反応の 1 0サイクル終了後にはじめて プライマ一 DNAを加え、その後さらにプライマ一伸長反応を 3 0サイクル を行ったものであり、 それ以外はレーン 6 と同じ P C R反応を行ったも のである。
レーン 3 9は、 プライマー伸長反応の 1 0サイクル終了後にはじめて プライマ一 DNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を 3 0サイクル を行ったものであり、 それ以外はレーン 7 と同じ P C R反応を行ったも のである。
レーン 4 0は、 プライマ一伸長反応の 1 0サイクル終了後にはじめて プライマ一 DNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を 3 0サイクル を行ったものであり、 それ以外はレーン 8 と同じ P C R反応を行ったも のである。
レーン 4 1は、 プライマー伸長反応の 1 5サイクル終了後にはじめて プライマー DNAを加え、その後さらにプライマ一伸長反応を 3 0サイクル を行ったものであり、 それ以外はレーン 1 と同じ P C R反応を行ったも のである。
レーン 4 2は、 プライマー伸長反応の 1 5サイクル終了後にはじめて プライマー DNAを加え、その後さらにプライマ一伸長反応を 3 0サイクル を行ったものであり、 それ以外はレーン 2 と同じ P C R反応を行ったも のである。
レーン 4 3は、 プライマ一伸長反応の 1 5サイクル終了後にはじめて ブラィマー DNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を 3 0サイクル を行ったものであり、 それ以外はレーン 3 と同じ P C R反応を行ったも のである。 1752
57 レーン 4 4は、 プライマー伸長反応の 1 5サイクル終了後にはじめて プライマ一 DNAを加え、その後さらにプライマ一伸長反応を 3 0サイクル を行ったものであり、 それ以外はレーン 4と同じ P C R反応を行ったも のである。
レーン 4 5は、 プライマー伸長反応の 1 5サイクル終了後にはじめて プライマー DNAを加え、その後さらにプライマ一伸長反応を 3 0サイクル を行ったものであり、 それ以外はレーン 5 と同じ P C R反応を行ったも のである。
レ一ン 4 6は、 プライマー伸長反応の 1 5サイクル終了後にはじめて プライマ一 DNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を 3 0サイクル を行ったものであり、 それ以外はレーン 6 と同じ P C R反応を行ったも のである。
レーン 4 7は、 プライマ一伸長反応の 1 5サイクル終了後にはじめて プライマ一 DNAを加え、その後さらにプライマー伸長反応を 3 0サイクル を行ったものであり、 それ以外はレーン 7 と同じ P C R反応を行ったも のである。
レーン 4 8は、 プライマ一伸長反応の 1 5サイクル終了後にはじめて プライマ一 DNAを加え、その後さらにプライマ一伸長反応を 3 0サイクル を行ったものであり、 それ以外はレーン 8 と同じ P C R反応を行ったも のである。
第 1 7図 （A ) の結果から明らかなように、 T . th. RecAタンパク質を 加えて P C R反応を行ったレーン 1では、 所望の DNA (正しい特異的な; P C R産物） の増幅が検出された一方、 副産物 （非特異的な P C R産物） はほとんど検出されなかった。 これに対し、 レ一ン 2では、 所望の DNA の増幅は見られたが、 副産物の増幅も若干見られた。 また、 レーン 3で は、 核酸の増幅がほとんど検出できなかった。 また、 レーン 4では、 所 望の DNAの増幅は見られたが、 副産物も多量に増幅された。
同様に、 T . th . RecAタンパク質を加えて P C R反応を行ったレーン 5 では、 所望の DNAの増幅が検出された一方、 副産物はほとんど検出されな かった。 これに対し、 レーン 6では、 所望の DNAの增幅は見られたが、 副 産物の増幅も見られた。 また、 レーン 7では、 核酸の増幅がほとんど検 出できなかった。 また、 レ一ン 8では、 所望の DNAの増幅は見られたが、 副産物も多量に増幅された。
また、 第 1 7図 （B ) の結果から明らかなように、 プライマ一伸長反 応の 1サイクル終了後にプライマー DNAを加えた場合であっても、 T . th. RecA夕ンパク質を加えて： P C R反応を行ったレーン 9では、 所望の DNA の増幅が検出された一方、 副産物はほとんど検出されなかった。 これに 対し、 レーン 1 0では、 所望の DNAの増幅は見られたが、 副産物の増幅も 見られた。 また、 レーン 1 1では、 核酸の増幅が僅かに検出された。 ま た、 レーン 1 2では、 所望の DNAの増幅は見られたが、 副産物も多量に增 幅された。
同様に、 T . th . RecAタンパク質を加えて P C R反応を行ったレーン 1 3では、所望の DNAの増幅が検出された一方、 副産物はほとんど検出され なかった。これに対し、レーン 1 4では、所望の DNAの増幅は見られたが、 副産物の増幅も見られた。 また、 レーン 1 5では、 核酸の増幅がほとん ど検出できなかった。 また、 レーン 1 6では、 所望の DNAの増幅は見られ たが、 副産物も多量に増幅された。
また、 第 1 8図 （A ) の結果から明らかなように、 プライマー伸長反 応の 3サイクル終了後にプライマ一 DNAを加えた場合であっても、 T . th. RecAタンパク質を加えて P C R反応を行ったレーン 1 7では、所望の DNA の増幅が検出された一方、 副産物はほとんど検出されなかった。 これに 対し、 レーン 1 8では、 所望の DNAの増幅は見られたが、 副産物の増幅も 見られた。 また、 レーン 1 9では、 所望の核酸の増幅が僅かに検出でき た。 また、 レーン 2 0では、 所望の DNAの増幅は見られたが、 副産物も多 量に増幅された。
一方、 T . th . RecAタンパク質を加えて P C R反応を行ったレーン 2 1 では、所望の MAの増幅が検出された一方、 副産物はほとんど検出されな かった。 これに対し、 レーン 2 2では、 所望の DNAの増幅は見られたが、 O J 副産物の増幅も僅かに見られた。 また、 レーン 2 3では、 核酸の増幅が ほとんど検出できなかった。 また、 レーン 2 4では、 所望の DMの増幅は 見られたが、 副産物も多量に増幅された。
また、 第 1 8図 （B ) の結果から明らかなように、 プライマ一伸長反 応の 6サイクル終了後にプライマー DMを加えた場合であっても、 T . th. RecA夕ンパク質を加えて P C R反応を行ったレーン 2 5では、所望の DNA の増幅が検出された一方、 副産物はほとんど検出されなかった。 これに 対し、 レーン 2 6では、 所望の DNAの増幅は見られたが、 副産物の増幅も 見られた。 また、 レーン 2 7では、 所望の核酸の増幅が見られたが、 副 産物はほとんど検出されなかった。 また、 レ一ン 2 8では、 所望の DNA の増幅は見られたが、 副産物も多量に増幅された。
一方、 T . th . RecA夕ンパク質を加えて P C R反応を行ったレーン 2 9 では、所望の DNAの増幅が検出された一方、 副産物はほとんど検出されな かった。 これに対し、 レーン 3 0では、 所望の DMの増幅は見られたが、 副産物の増幅も見られた。 また、 レーン 3 1では、 所望の核酸の増幅が 見られたが、 副産物はほとんど検出されなかった。 また、 レーン 3 2で は、 所望の DNAの増幅は見られたが、 副産物も多量に増幅された。
また、 第 1 9図 （A ) の結果から明らかなように、 プライマー伸長反 応の 1 0サイクル終了後にプライマ一 DNAを加えた場合であっても、 T . th . RecA夕ンパク質を加えて P C R反応を行ったレーン 3 3では、所望の DNA の増幅が検出された一方、 副産物はほとんど検出されなかった。 これに 対し、 レーン 3 4では、 所望の DNAの増幅は見られたが、 副産物の増幅も 若干見られた。また、 レーン 3 5では、所望の核酸の増幅が見られたが、 副産物はほとんど検出されなかった。 また、 レーン 3 6では、 所望の MA の増幅は見られたが、 副産物も多量に増幅された。
一方、 T . th. RecAタンパク質を加えて P C R反応を行ったレーン 3 7 では、所望の DNAの増幅が検出された一方、 副産物はほとんど検出されな かった。 これに対し、 レーン 3 8では、 所望の DNAの増幅は見られたが、 副産物の増幅も見られた。 また、 レーン 3 9では、 所望の核酸の増幅が 見 ^れたが、 副産物はほとんど検出されなかった。 また、 レーン 4 0で は、 所望の DNAの増幅は見られたが、 副産物も多量に増幅された。
また、 第 1 9図 （B) の結果から明らかなように、 プライマー伸長反 i
応の 1 5サイクル終了後にプライマ一 DNAを加えた場合であっても、 T.th. Rec タンパク質を加えて P CR反応を行ったレーン 4 1では、所望の DNA の増幅が検出された一方、 副産物はほとんど検出されなかった。 これに 対 ύ
！ 、 レーン 42では、 所望の DNAの増幅は見られたが、 副産物の増幅も 若干見られた。また、 レーン 4 3では、所望の核酸の増幅が見られたが、 副産物はほとんど検出されなかった。 また、 レーン 44では、 所望の DNA の増幅は見られたが、 副産物も多量に増幅された。
一方、 T.th. RecA夕ンパク質を加えて P C R反応を行ったレーン 4 5 で {ά、所望の DNAの増幅が検出された一方、 副産物はほとんど検出されな かった。 これに対し、 レーン 4 6では、 所望の DNAの増幅は見られたが、 副産物の増幅も若干見られた。 また、 レーン 47では、 所望の核酸の増 幅が見られたが、 副産物はほとんど検出されなかった。 また、 レーン 4 8では、 所望の DNAの増幅は見られたが、 副産物も多量に増幅された。
まず、 第 1 7図 （ A) の結果より、 T.th. RecA夕ンパク質を加えて P CRを行えば、 所望の核酸の収量を減少させることなく、 副産物の増幅 を低く抑えることができる。 即ち、 上記の相同組み換えタンパク質が存 在することにより、 プライマー DNAが錶型 DNAの非特異的な領域に結合し てプライマ一伸長反応を起こすことが抑制されるため、 非特異的な： P C R産物の増幅を抑制することができる。
一方、 E.coliRecAタンパク質を加えて P CRを行った場合には、 これ を加えない場合よりは、 P CRの特異性が向上するものの、 副産物が若 干生成されることにより、 T.th. RecAタンパク質を加える場合ほど P C Rの特異性は向上しない。
なお、 E.coli RecAタンパク質は P CRサイクル中にかかる熱によって 変性しやすい。 このため、 E.coli RecAタンパク質の効果が減少しやすい と考えられる。 また、 E.coli RecA夕ンパク質が変性した （ 1本鎖の） 錶 型 DNAに結合した状態で熱変性を起こすと、 E.coli RecAタンパク質が鎵 型 DNAから離れなくなる。 その結果、 P CR反応を阻害することになる。 なお、 E.coli の SSBタンパク質を加えた場合も、 これと同様な現象で P CR反応が阻害されると考えられる。
他方、 T.th.の SSBタンパク質を加えて P CRを行っても、 所望の核酸 は増幅されない。
次に、 第 1 7図 （B)、 第 1 8図及び第 1 9図の結果より、 プライマ一 伸長反応を繰り返した後にプライマ一 DNAを加えても、 即ち、 プライマ一 DNAを加える前に反応液が繰り返し高温状態に置かれても、 T.th. RecA タンパク質を加えて P CRを行ったときに、 P C Rの特異性が劣ること がない。 従って、 T.th. RecAタンパク質は、 高温においても不活性化せ ず安定であると考えられる。
(実施例 8 )
次いで、 第 8の実施例について説明する。 なお、 上記各実施例のいず れかと同様な部分の説明は、 省略または簡略化する。
錶型 DNAとしてヒ トゲノム MAを用意し、プライマー DNAとして上記実施 例 4と同様に 5種類のォリゴヌクレオチ ド 3 7〜 4 1を用意した （第 9 図参照）。
次に、 プライマー DNAの濃度をそれそれ 0. 3 Mし、 それ以外は上記 実施例 1 と同様にして P C R反応によ り核酸を増幅させた。 なお、 この P CRの温度条件、 即ち、 1サイクル （ 7 0 °C；， 1 0分間、 9 4°C, 1 分間）、 3 0サイクル （ 9 4 °C, 3 0秒間、 6 0 °C， 3 0秒間、 6 8 °C , 1分間）、 1サイクル （ 6 8°C；， 7分間、 4°C, 1分間） を温度条件 5 と する。 1サイクル目の最初の温度（初期温度） は 7 0 °Cである。 そして、 反応液について 1 %のァガロースゲルで電気泳動を行い、 上記実施例 1 等と同様にして、 その結果を写真に記録した。 これを第 2 0図に示す。
レーン 5は、 プライマー DNAとして、 ォリゴヌクレオチド 3 7とオリゴ ヌクレオチド 3 8を加えたものである。
レーン 6は、 プライマ一 DNAとして、 ォリゴヌクレオチド 3 9 とオリゴ n ヌクレオチド 38を加えたものである。
レーン 7は、 プライマ一 DMとして、 オリゴヌクレオチ ド 40とオリゴ ヌクレオチド 38を加えたものである。
レーン 8は、 プライマ一 DNAとして、 ォリゴヌクレオチド 41とオリゴ ヌクレオチド 38を加えたものである。
レーン 1は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 それ以外はレーン 5と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 2は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 それ以外はレーン 6と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 3は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 それ以外はレーン 7と同じ PCR反応を行ったものである。
レーン 4は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 それ以外はレーン 8と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 9は、 T.th. RecAタンパク質の代わりに E.coli RecAタンパク 質を加えて、それ以外はレーン 5と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 1 0は、 T.th. RecA夕ンパク質の代わりに E.coli RecA夕ンパ ク質を加えて、 それ以外はレーン 6と同じ P CR反応を行ったものであ る。
レーン 1 1は、 T.th. RecA夕ンパク質の代わりに E.coli RecA夕ンパ ク質を加えて、 それ以外はレーン 7と同じ P CR反応を行ったものであ る o
レーン 1 2は、 T.th. RecA夕ンパク質の代わりに E.coli RecA夕ンパ ク質を加えて、 それ以外はレーン 8と同じ P CR反応を行ったものであ る。
レーン 1 3〜レーン 24は、 P C Rの温度条件を、 1サイクル（ 80 °C , 1◦分間、 94 °C， 1分間）、 30サイクル（ 94 °C, 30秒間、 60 °C , 30秒間、 68°C；， 1分間）、 1サイクル （ 6 8°C, 7分間、 4 °C , 1分 間） とした。 これを温度条件 6とする。 1サイクル目の最初の温度 （初 期温度） は 80°Cである。 レーン 1 3は、 上記温度条件 6の下で、 それ以外はレーン 1 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 1 4は、 上記温度条件 6の下で、 それ以外はレーン 2 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 1 5は、 上記温度条件 6の下で、 それ以外はレーン 3 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 1 6は、 上記温度条件 6の下で、 それ以外はレーン 4と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 1 7は、 上記温度条件 6の下で、 それ以外はレーン 5 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 1 8は、 上記温度条件 6の下で、 それ以外はレーン 6 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 1 9は、 上記温度条件 6の下で、 それ以外はレーン 7 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 2 0は、 上記温度条件 6の下で、 それ以外はレーン 8 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 2 1は、 上記温度条件 6の下で、 それ以外はレーン 9 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 2 2は、 上記温度条件 6の下で、 それ以外はレーン 1 0 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 2 3は、 上記温度条件 6の下で、 それ以外はレーン 1 1 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 2 4は、 上記温度条件 6の下で、 それ以外はレーン 1 2 と同じ P C R反応を行ったものである。
第 2 0図（A )の結果から明らかなように、初期温度が 7 0 °Cの場合、 T. th. RecAタンパク質を加えて P C R反応を行ったレーン 5〜レーン 8 のうち、 レーン 5〜レーン 7では、 所望の DNA (正しい特異的な P C R産 物） の増幅が検出された一方、 副産物 （非特異的な P C R産物） はほと んど検出されなかった。 これに対し、 レーン 8では、 核酸の増幅がほと んど検出されなかった。
これに対し、 E.coli RecAタンパク質を加えて P CR反応を行ったレー ン 9〜レーン 1 2のうち、 レーン 9〜レーン 1 1では、 所望の DNAの増幅 が見られたが、 副産物も若干検出された。 また、 レーン 1 2では、 核酸 の増幅がほとんど検出されなかった。
他方、 RecA夕ンパク質を加えずに P CR反応を行ったレーン 1〜レ一 ン 4では、 所望の DNAの増幅が見られたが、 それ以外に副産物も多量に検 出された。
なお、 初期温度が 70 °Cの場合、 E.coli RecA夕ンパク質を加えて P C R反応を行った場合には、 初期温度をかけない場合に比べ、 副産物が多 く検出された。 従って、 E.coli RecAタンパク質は、 70°Cで不活性化し やすいと考えれる。
一方、 初期温度 70 °Cをかけ、 T.th. RecA夕ンパク質を加えて P CR 反応を行っても、 初期温度をかけない場合と同様に、 副産物はほとんど 検出されなかった。 従って、 T.th. RecAタンパク質は、 70°Cでも不活 性化しにくいと考えれる。
第 20図（B)の結果から明らかなように、初期温度が 80°Cの場合、 T.th. RecA夕ンパク質を加えて P C R反応を行ったレーン 17〜レーン 20のうち、 レーン 1 7〜レーン 1 9では、所望の DNAの増幅が見られた が、 副産物が若干検出された。 また、 レーン 20では、 核酸の増幅がほ とんど検出されなかった。
これに対し、 E.coli RecA夕ンパク質を加えて P C R反応を行ったレ一 ン 2 1〜レーン 24のうち、 レーン 2 1〜レーン 2 3では、 所望の DNA の増幅が見られたが、 副産物も検出された。 この副産物の量は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えた場合に比べて多かった。また、レーン 24では、 核酸の増幅がほとんど検出されなかった。
他方、 RecA夕ンパク質を加えずに P C R反応を行ったレーン 1 3〜レ —ン 16では、 所望の DNAの増幅が見られたが、 それ以外に副産物も多量 に検出された。 i
まず、 第 2 0図 （A) の結果より、 T.th. RecA夕ンパク質を加えて P CRを行えば、 所望の核酸の収量を減少させることなく、 副産物の増幅 を ¾く抑えることができる。 即ち、 上記の相同組み換えタンパク質が存 在することにより、 プライマー DNAが鎵型 DNAの非特異的な領域に結合し てプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、 非特異的な P C R産物の増幅を抑制することができる。
—方、 E.coli RecAタンパク質を加えて P C Rを行った場合には、 これ を加えない場合よりは、 P CRの特異性が向上するものの、 副産物が若 干生成されることにより、 T.th. RecA夕ンパク質を加える場合ほど P C Rの特異性は向上しない。
次に、第 2 0図（B)の結果より、初期温度を 8 0°Cに上げると、 T.th. RecAタンパク質を加えて P CRを行っても、 P CRの特異性が若干低下 する。 従って、 初期温度を 8 0 °Cに上げることにより、 T.th. RecA夕ン パク質の一部が不活性化するものと考えられる。
(実施例 9)
次いで、 第 9の実施例について説明する。 なお、 上記各実施例のいず れかと同様な部分の説明は、 省略または簡略化する。
第 2 1図に示すように、 錶型 DNAとしてヒ トゲノム MAを、 プライマー DNAとして 5種類のォリゴヌクレオチ ド （ォリゴヌクレオチ ド 5 9〜 6 3 ) を用意した。 これらのプライマ一 DNAは、 Homo sapiens BAG clone CTB-135C18 from 7qll.2-q22, complete sequence. (ACCESSION AC005164) を参考にして設計した。
プライマ—DNAのうち、オリゴヌクレオチド 6 0とオリゴヌクレオチド 6 1は、錶型 DNAと 1 0 0 %相補的な 2 2 merの塩基配列からなる。一方、 オリゴヌクレオチド 5 9は、 オリゴヌクレオチド 6 1のうち一の塩基を Cから Aに変えたものであ り、 オリゴヌクレオチド 6 2は、 オリゴヌク レオチド 6 1のうち一の塩基を Cから Gに変えたものであり、 オリゴヌ クレオチ ド 6 3は、 オリゴヌクレオチ ド 6 1のうち一の塩基を Cから T に変えたものである。 ォリゴヌクレオチド 5 9 ：
55 -caaagctact tgcacagcct cc-35
オリゴヌクレオチド 6 0 ：
5" -ggcatattca gccaaggatt tc - 3，
オリゴヌクレオチド 6 1 ：
5' -caaagctact ttcacagcct cc-33
オリゴヌクレオチド 6 2 ：
5， - caaagctact tacacagcct cc-35
オリゴヌクレオチド 6 3 ：
5' -caaagctact tccacagcct cc-3'
次に、 上記実施形態 4 と同様な条件で P C R反応により核酸を増幅さ せた。そして、反応液について 1 %のァガロースゲルで電気泳動を行い、 上記実施例 1等と同様にして、 その結果を写真に記録した。 これを第 2 2図に示す。
レーン 1は、 プライマ—醒として、 オリゴヌクレオチ ド 5 9 とオリゴ ヌクレオチド 6 0を加えたものである。
レーン 2は、 プライマ— DNAとして、 オリゴヌクレオチ ド 6 1 とオリゴ ヌクレオチド 6 0を加えたものである。
レーン 3は、 プライマ一 DNAとして、 オリゴヌクレオチ ド 6 2 とオリゴ ヌクレオチド 6 0を加えたものである。
レーン 4は、 プライマ一 DNAとして、 オリゴヌクレオチド 6 3 とオリゴ ヌクレオチド 6 0を加えたものである。
レーン 5は、 1 mM (最終濃度） の ATP-ァ Sをさらに加えて、 レーン 1 と 同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 6は、 I mM (最終濃度） の ATP-ァ Sをさらに加えて、 レーン 2 と 同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 7は、 I mM (最終濃度） の ATP-ァ Sをさらに加えて、 レーン 3 と 同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 8は、 I mM (最終濃度） の ATP-ァ Sをさらに加えて、 レーン 4と JP2003/011752
67 同じ P C R反応を行ったものである。
第 2 2図の結果から明らかなように、 ATP -ァ Sを加えずに P C R反応を 行ったレーン 1〜レーン 4について見ると、 すべてのレーンについて、 所望の DNA (正しい特異的な P C R産物） の増幅が検出された一方、 副産 物 （非特異的な P C R産物） はほとんど検出されなかった。
一方、 ATP-ァ Sを加えて P C R反応を行ったレーン 5〜レーン 8につい て見ると、 レーン 6では、 所望の DNAの増幅が検出された一方、 副産物は ほとんど検出されなかった。 これに対し、 レーン 5 とレーン 7 とレーン 8では、 核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
このことから、 T . th. RecAタンパク質を加えて P C R反応を行えば、 所望の核酸の収量を減少させることなく、 副産物の増幅を低く抑えるこ とができる。 即ち、 上記の相同組み換えタンパク質が存在することによ り、 プライマ一 MAが錄型 DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸 長反応を起こすことが抑制されるため、 非特異的な P C R産物の増幅を 抑制することができる。
そしてさらに、 ATP-ァ Sの存在下では、 プライマー DNAと鎵型 DNAが 1 0 0 %相補的である場合にのみ、 特異的に核酸を増幅させるようにするこ とができる。 従って、 ATP- y Sを反応液に加えることにより、 所望の核酸 をさらに.特異的に増幅することができる。
また、 上記の結果より、 一塩基多型を検出することが可能である。 即 ち、 プライマ一 DNAの 1つに、 錶型 DNAのうち一塩基多型をなす塩基を含 む配列に対応したプライマー DNAを用いて P C Rを行えば、 錶型 DNAと一 塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマ一 DNAとが完全に相 補的である場合に、 所望の核酸を增幅させるようにすることができる。 一方、鎵型 DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマー MAとが完全には相補的ではない場合、 即ち、 一塩基多型をなす塩基がプ ライマー DNAと相補的でない場合に、 所望の核酸が増幅しない、 または、 抑制されるようにすることができる。 このため、 P C Rによる所望の核 酸の増幅により、 一塩基多型を検出することが可能である。 bo
(実施例 1 0 )
次いで、 第 1 0の実施例について説明する。 なお、 上記各実施例のい ずれかと同様な部分の説明は、 省略または簡略化する。
第 2 3図に示すように、 鎵型 DNAとしてヒ トゲノム DNAを、 プライマ一 DNAとして 5種類のオリゴヌクレオチ ド （オリゴヌクレオチ ド 6 4 ~ 6
8 ) を用意した。 これらのプライマ一 DNAは、 Homo sap iens PAC c lone
RP5-1142J19 from 7q35-q36 ,
complete sequence . ( ACCESS ION AC004975 ) を参考にして設計した。 プライマー DNAのうち、オリゴヌクレオチド 6 5 とオリゴヌクレオチド 6 8は、铸型 DMと 1 0 0 %相補的な 2 O merまたは 2 l merの塩基配列か らなる。 一方、 ォリゴヌクレオチ ド 6 4は、 ォリゴヌクレオチド 6 8の うち 3 5 末端から 3塩基目の一の塩基を Tから Aに変えたものであり、 オリゴヌクレオチド 6 6は、 オリゴヌクレオチド 6 8のうち 3 ' 末端か ら 3塩基目の一の塩基を Tから Cに変えたものであり、 オリゴヌクレオ チ ド 6 7は、 オリゴヌクレオチド 6 8のうち 3， 末端から 3塩基目の一 の塩基を Tから Gに変えたものである。
オリゴヌクレオチド 6 4 ：
5' -gcaggcacca agaactacag c-3
オリゴヌクレオチド 6 5 ：
53 -gcctaaggtc acgttgtccc-3'
オリゴヌクレオチド 6 6 ：
5' -gcaggcacca agaactaccg c-3
オリゴヌクレオチド 6 7 ：
5' -gcaggcacca agaactacgg c-3
オリゴヌクレオチド 6 8 ：
5， -gcaggcacca agaactacxg c-35
またさらに、第 2 4図に示すように、鍊型 DNAとしてヒ トゲノム DNAを、 プライマー DNAとして 5種類のォリゴヌクレオチド（ォリゴヌクレオチド
6 9〜 7 3 ) を用意した。 これらのプライマー DNAは、 Homo sap iens BAC ^
69 clone CTB-135C 18 from 7ql l . 2-q225 complete sequence . ( ACCESSION
AC005164) を参考にして設計した。
これらのプライマ一 DNAのうち、オリゴヌクレオチド 7 0 とオリゴヌク レオチド 7 1は、 錶型 DNAと 1 0 0 %相補的な 2 2 merの塩基配列からな る。 一方、 ォリゴヌクレオチド 6 9は、 ォリゴヌクレオチ ド 7 1のうち
3 5 末端から 4塩基目の一の塩基を Cから Aに変えたものであり、 オリ ゴヌクレオチド 7 2は、 オリゴヌクレオチド 7 1のうち 3 ' 末端から 4 塩基目の一の塩基を Cから Gに変えたものであり、 オリゴヌクレオチド
7 3は、 オリゴヌクレオチド 7 1のうち 3， 末端から 4塩基目の一の塩 基を Cから Tに変えたものである。
オリゴヌクレオチド 6 9 ：
5' -caaagctact ttcacagcat cc-3'
オリゴヌクレオチド 7 0 ：
5， -ggcatattca gccaaggatt tc - 3，
オリゴヌクレオチド 7 1 ：
5' - caaagctact ttcacagcct cc-3'
オリゴヌクレオチド 7 2 ：
5' -caaagctact ttcacagcgt cc-3'
オリゴヌクレオチド 7 3 ：
5' -caaagctacx ttcacagctt cc-3'
次に、 DNAポリメラ一ゼとして TaKaRa Taq (夕カラバイオ） の代わり に Ex Taq (夕カラバイオ） を用い、 さらに 1 mM (最終濃度） の ATP-ァ S を加えて、 それ以外は上記実施形態 4等と同様な条件で P C R反応によ り核酸を増幅させた。 なお、 この Ex Taqは、 通常 （従来） の P C Rの条 件下では、 プライマ一 DNAの 3 ' 末端の塩基配列を認識しないことが知ら れているものである。 そして、 反応液について 1 %のァガロースゲルで 電気泳動を行い、 上記実施例 1等と同様にして、 その結果を写真に記録 した。 これを第 2 5図に示す。
レーン 9は、 プライマー DNAとして、 オリゴヌクレオチド 6 4 とオリゴ ヌクレオチド 6 5を加えたものである。
レーン 1 0は、 プライマ一 DNAとして、 オリゴヌクレオチド 6 6とオリ ゴヌクレオチド 6 5を加えたものである。
レーン 1 1は、 プライマー DNAとして、 オリゴヌクレオチド 6 7とオリ ゴヌクレオチド 6 5を加えたものである。
レーン 1 2は、 プライマ一 DNAとレて、 オリゴヌクレオチド 6 8とオリ ゴヌクレオチド 6 5を加えたものである。
レーン 1 3は、 プライマー MAとして、 オリゴヌクレオチド 6 9とオリ ゴヌクレオチド 7 0を加えたものである。
レーン 1 4は、 プライマ一 MAとして、 オリゴヌクレオチド 7 1 とオリ ゴヌクレオチド 70を加えたものである。
レーン 1 5は、 プライマー DNAとして、 才リゴヌクレ才チド 7 2とオリ ゴヌクレオチド 7 0を加えたものである。
レーン 1 6は、 プライマ一 DNAとして、 オリゴヌクレオチド 7 3とオリ ゴヌクレオチド 7 0を加えたものである。
レーン 1は、 T.th. RecAタンパク質を加えずに、 それ以外はレーン 9 と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 2は、 T.th. RecAタンパク質を加えずに、 それ以外はレーン 1 0と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 3は、 T.th. RecAタンパク質を加えずに、 それ以外はレーン 1 1と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 4は、 T.th. RecAタンパク質を加えずに、 それ以外はレーン 1 2と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 5は、 T.th. RecAタンパク質を加えずに、 それ以外はレーン 1 3と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 6は、 T.th. RecAタンパク質を加えずに、 それ以外はレーン 1 4と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 7は、 T.th. RecAタンパク質を加えずに、 それ以外はレーン 1 5と同じ P CR反応を行ったものである。 レーン 8は、 T.th. RecAタンパク質を加えずに、 それ以外はレーン 1 6と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1 7は、 T.th. RecA夕ンパク質の代わりに T.th. SSB夕ンパク質 を加えて、 それ以外はレーン 9と同じ P CR反応を行ったものである。 レーン 1 8は、 T.th. RecAタンパク質の代わりに T.th. SSBタンパク質 を加えて、それ以外はレーン 1 0と同じ P CR反応を行ったものである。 レーン 1 9は、 T.th. RecA夕ンパク質の代わりに T.th. SSB夕ンパク質 を加えて、それ以外はレーン 1 1と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 2 0は、 T.th. RecA夕ンパク質の代わりに T.th. SSB夕ンパク質 を加えて、それ以外はレーン 1 2と同じ P CR反応を行ったものである。 レーン 2 1は、 T.th. RecA夕ンパク質の代わりに T.th. SSB夕ンパク質 を加えて、それ以外はレーン 1 3と同じ P CR反応を行ったものである。 レーン 2 2は、 T.th. RecA夕ンパク質の代わりに T.th. SSB夕ンパク質 を加えて、それ以外はレーン 1 4と同じ P CR反応を行ったものである。 レーン 2 3は、 T.th. RecAタンパク質の代わりに T.th. SSBタンパク質 を加えて、それ以外はレーン 1 5と同じ P CR反応を行ったものである。 レーン 2 4は、 T.th. RecA夕ンパク質の代わりに T.th. SSB夕ンパク質 を加えて、それ以外はレーン 1 6と同じ P CR反応を行ったものである。 第 2 5図 （B ) の結果から明らかなように、 T.th. RecAタンパク質と ATP-ァ Sを加えた場合には、まず、レーン 9〜レーン 1 2について見ると、 レーン 1 2では、 所望の DNAの増幅が検出された一方、 副産物はほとんど 検出されなかった。 これに対し、 レーン 9〜レーン 1 1では、 核酸の増 幅がほとんど検出できなかった。 なお、 写真に映っているのは、 バック グラウン ドであると考えられる。 また、 レーン 1 3〜レーン 1 6につい て見ると、 レーン 1 4では、 所望の DNAの増幅が検出された一方、 副産物 はほとんど検出されなかった。 これに対し、 レーン 1 3とレーン 1 5 と レーン 1 6では、 核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
これらに対し、 第 2 5図 （A) の結果から明らかなように、 T.th. RecA 夕ンパク質を加えない場合には、 レーン 1〜レーン 4についてもレーン ^
5〜レ一ン 8についても、 プライマー DNAに対応する DNAの増幅が検出さ れ、 また、 副産物も検出された。
また、 第 2 5図 （ C ) の結果から明らかなように、 T . th. RecA夕ンパ ク質の代わりに T . th. S S Bタンパク質を加えた場合には、 レーン 1 7 〜レーン 2 0についてもレーン 2 1〜レーン 2 4についても、 プライマ — DNAに対応する MAの増幅が検出され、 また、 副産物も検出された。
これらのことから、 T . th . RecAタンパク質を加えて P C R反応を行え ば、 所望の核酸の収量を減少させることなく、 副産物の増幅を低く抑え ることができる。 即ち、 上記の相同組み換えタンパク質が存在すること により、 プライマー DNAが錶型 DNAの非特異的な領域に結合してプライマ 一伸長反応を起こすことが抑制されるため、 非特異的な P C R産物の増 幅を抑制することができる。
そしてさらに、 ATP-ァ Sの存在下では、 ブラィマ一 DNAと錶型 DNAが 1 0 0 %相補的である場合にのみ、 特異的に核酸を増幅させるようにするこ とができる。 従って、 ATP-ァ Sを反応液に加えることにより、 所望の核酸 をさらに特異的に増幅することができる。
また、 上記の結果より、 一塩基多型を検出することが可能である。 即 ち、 プライマー DNAの 1つに、 鎵型 DNAのうち一塩基多型をなす塩基を含 む配列に対応したプライマ一 DNAを用いて P C Rを行えば、 鍀型 DNAと一 塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマ一 DNAとが完全に相 補的である場合に、 所望の核酸を増幅させるようにすることができる。 一方、鐯型 DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマー MAとが完全には相補的ではない場合、 即ち、 一塩基多型をなす塩基がプ ライマー DNAと相補的でない場合に、 所望の核酸が増幅しない、 または、 抑制されるようにすることができる。 このため、 P C Rによる所望の核 酸の増幅により、 一塩基多型を検出することが可能である。
(実施例 1 1 )
次いで、 第 1 1の実施例について説明する。 なお、 上記各実施例のい ずれかと同様な部分の説明は、 省略または簡略化する。 „
73 本実施例では、 第 2 6図に示すように、 錶型 DNAとしてヒ トゲノム DNA (Promega) を、 プライマ一 MAとして 6種類のオリゴヌクレオチ ド （ォ リゴヌクレオチド 74~ 7 9 ) を用意した。 オリゴヌクレオチド 7 4と オリゴヌクレオチ ド 7 5は、 Human S100 protein beta-subunit gene, exon 1 (ACCESSION M59486 J05600) を参考にして設計した。 また、 オリ ゴヌクレオチ ド 7 6 とオリゴヌクレオチ ド 7 7は、 Homo sapiens blue cone opsin gene, complete cds (ACCESSION L32835) を参考にして設計 した。また、ォリゴヌクレオチ ド 7 8 とオリゴヌクレオチ ド 7 9は、 Homo sapiens beta globin region (HBB@) on chromosome 11 (ACCESSION NG_000007) を参考にして設計した。 各プライマー DNAは、 鎵型 DNAと 1 0
0 %相補的な 20〜2 5 merの塩基配列からなる。
オリゴヌクレオチド 74 ：
5' -gacxactctagcgactgtccatctc-3'
才リゴヌクレオチド 7 5 ：
5' -gacagccaccagatccaatc-3'
才リゴヌクレオチド 7 6 ：
5， -ggcagctttcatgggcactgt-3'
オリゴヌクレオチド 7 7 ：
5' -gacagggctggactgacatttg-3'
才リゴヌクレオチド 7 8 ：
5， -ctgctgaaagagatgcggtgg-3'
オリゴヌクレオチド 7 9 ：
53 -aggaaaacagcccaagggacag-35
次に、 P CR反応により核酸を増幅させた。 具体的には、 5 0 1の P CR反応液中に、 各々 0. 5 (最終濃度） の 2種類のオリゴヌクレオ チ ドと、 2 0 Ongのヒ トゲノム DNA (Promega) と、 1. 0 unitの TaKaRa
ExTaq-HSPolymerase (夕カラバイオ） と、 0. 2 mMの dNTP混合液と、 1.
0 zgの T.th. RecAタンパク質を、 1 X Ex- Taq buf f er (夕カラバイオ） に混合した。 そして、 P CR反応を、 1サイクル （ 9 0 °C, 3 0秒間）、 3 0サイクル（ 94°C， 1 5秒間、 5 5 °C, 3 0秒間、 7 2 °C, 1分間）、 1サイクル （ 7 2°C， 7分間、 4°C, 1分間） で行った。
次に、反応液の 1 1について 1 %のァガロースゲルで電気泳動を行い、 ァガロースゲルをェチジゥムブ口 ミ ドの溶液に浸してゲル中の DNAを染 色し、 その後、 染色された DNAを写真に記録した。 その結果を第 2 7図に 示す。
レーン 1は、 プライマー DNAとして、 オリゴヌクレオチド 74とオリゴ ヌクレオチド 7 5を加えたものである。
レーン 2は、 プライマ一 DNAとして、 オリゴヌクレオチド 7 6とオリゴ ヌクレオチド 7 7を加えたものである。
レーン 3は、 プライマ一 DNAとして、 オリゴヌクレオチ ド 7 8とオリゴ ヌクレオチド 7 9を加えたものである。
レーン 4は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 1 と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 5は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 2 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 6は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 3 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 7は、 T.th. RecAタンパク質の代わりに同量の大腸菌 （E.coli) の HecAタンパク質を加えて、 それ以外はレーン 1と同じ P C R反応を行 つたものである。
レーン 8は、 T.th. RecAタンパク質の代わりに同量の大腸菌 （E.coli) の RecAタンパク質を加えて、 それ以外はレーン 2と同じ P CR反応を行 つたものである。
レーン 9は、 T.th. RecAタンパク質の代わりに同量の大腸菌 （E.coli) の RecAタンパク質を加えて、 それ以外はレーン 3と同じ P CR反応を行 つたものである。
第 2 7図の結果から明らかなように、 T.th. RecAタンパク質を加えて P C R反応を行ったレーン 1〜レ一ン 3では、 所望の核酸 （正しい特異 的な P CR産物） の増幅が検出された一方、 副産物 （非特異的な P CR 産物） の増幅はほとんど検出されなかった。
これに対し、 T.th. RecAタンパク質を加えずに P C R反応を行ったレ —ン 4〜レーン 6では、 所望の核酸のみならず副産物も多量に検出され た。
また、 T.th. RecA夕ンパク質の代わりに E. col i RecA夕ンパク質を加え て P CR反応を行ったレーン 7〜レーン 9では、 所望の核酸の他、 レ一 ン 4〜レーン 6ほどではないが、 副産物も検出された。
このことから、 T.th. RecAタンパク質を加えて P C R反応を行えば、 所望の核酸の収量を減少させることなく、 副産物の増幅を低く抑えるこ とができる。 即ち、 T.th. RecAタンパク質が存在することにより、 ブラ イマ一 DNAが錶型 DNAの非特異的な領域に結合してブライマ一伸長反応を 起こすことが抑制されるため、 非特異的な P CR産物の増幅を抑制する ことができる。
一方、 E.coli RecAタンパク質を加えて P C Rを行った場合には、 これ を加えない場合よりは、 P CRの特異性が向上するものの、 副産物が若 干生成されることにより、 T.th. RecAタンパク質を加える場合ほど P C Rの特異性は向上しない。
(実施例 1 2 )
次いで、 第 1 2の実施例について説明する。 なお、 上記各実施例のい ずれかと同様な部分の説明は、 省略または簡略化する。
本実施例では、 第 2 8図に示すように、 錡型 DNAとしてヒ トゲノム DNA (Promega) を、 プライマー DNAとして 5種類のオリゴヌクレオチ ド （ォ リゴヌクレオチ ド 8 0〜 8 4 ) を用意した。 これらのプライマー DNAは、 Homo sapiens BAC clone CTB-135C18 from 7qll.2-q22, complete sequence (ACCESSION AC005164) 及 び Homo sapiens chromosome 19 clone CTD-2166J9, complete sequence (ACCESSION AC010412) を参考にして設 計した。フォヮ一ド側のプライマー DNA (ォリゴヌクレオチド 8 0〜 8 3 ) は、 任意のプライマー設計の可能性を示すため、 それそれ位置をずらし て設計してある。 一方、 リバース側のプライマー DNA (オリゴヌクレオチ ド 8 4 )は、 共通のものである。各プライマー DNAは、 铸型 MAと 1 0 0 % 相補的な 2 2 merの塩基配列からなる。
オリゴヌクレオチド 8 0 ：
5' -caaagctactticacagcctcc-35
オリゴヌクレオチド 8 1 ：
55 -caaagctactgtcacagcctcc-3'
才リゴヌクレオチド 8 2 ：
5， -caaagcgactgxcagagcctcc-3'
オリゴヌクレオチド 8 3 ：
5， -cagagcgactgtcagagcgtcc-3'
ォリゴヌクレオチド 8 4 ：
5' -ggcatattcagccaaggatttc-3'
次に、 上記実施例 1 1のレーン 1等と同様な条件で P C R反応を行つ た。 そして、 その反応液について 1 %のァガロースゲルで電気泳動を行 い、 上記実施例 1 1 と同様にして、 その結果を写真に記録した。 これを 第 2 9図に示す。
レーン 1は、 プライマ一 DNAとして、 オリゴヌクレオチ ド 8 0 とオリゴ ヌクレオチド 8 4を加えたものである。
レーン 2は、 プラィマー DNAとして、 ォリゴヌクレ才チ ド 8 1 とオリゴ ヌクレオチド 8 4を加えたものである。
レーン 3は、 プライマー DNAとして、 オリゴヌクレオチド 8 2 とオリゴ ヌクレオチ ド 8 4を加えたものである。
レーン 4は、 プライマ一 MAとして、 オリゴヌクレオチ ド 8 3 とオリゴ ヌクレオチド 8 4を加えたものである。
レーン 5は、 T . th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 1 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 6は、 T . th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 2 と同じ P C R反応を行ったものである。 レーン 7は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 3 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 8は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 4 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 9は、 T.th. RecA夕ンパク質の代わりに同量の大腸菌 （E.coli) の HecAタンパク質を加えて、 それ以外はレーン 1 と同じ P C R反応を行 つたものである。
レーン 1 0 は、 T.th. RecA夕 ンパク質の代わ り に同量の大腸菌 (E.coli) の RecAタンパク質を加えて、 それ以外はレーン 2 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 1 1 は、 T.th. RecA夕 ンパク質の代わ り に同量の大腸菌 (E.coli) の RecAタンパク質を加えて、 それ以外はレーン 3 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 1 2 は、 T.th. RecA夕 ンパク質の代わ り に同量の大腸菌 (E.coli) の HecAタンパク質を加えて、 それ以外はレーン 4と同じ P C 反応を行つたものである。
第 2 9図の結果から明らかなように、 T.th. RecAタンパク質を加えて P C R反応を行ったレ一ン 1〜レーン 4では、 所望の核酸 （正しい特異 的な P C R産物） の増幅が検出された一方、 副産物 （非特異的な P C R 産物） の増幅はほとんど検出されなかった。
これに対し、 T.th. RecAタンパク質を加えずに P C R反応を行ったレ ーン 5〜レーン 8では、 所望の核酸のみならず副産物も多量に検出され ノ o
また、 T.th. RecA夕ンパク質の代わりに E.coli RecA夕ンパク質を加え て P C R反応を行ったレーン 9〜レーン 1 2では、 所望の核酸の他、 レ ーン 5〜レーン 8ほどではないが、 副産物も検出された。
このことから、 T.th. RecAタンパク質を加えて P C R反応を行えば、 所望の核酸の収量を減少させることなく、 副産物の増幅を低く抑えるこ とができる。 即ち、 T.th. RecAタンパク質が存在することにより、 ブラ ィマ一 DNAが鎵型 DNAの非特異的な領域に結合してブラィマ一伸長反応を 起こすことが抑制されるため、 非特異的な P CR産物の増幅を抑制する ことができる。
一方、 E.coliRecAタンパク質を加えて P CRを行った場合には、 これ を加えない場合よりは、 P CRの特異性が向上するものの、 副産物が若 干生成されることにより、 T.th. RecAタンパク質を加える場合ほど P C Rの特異性は向上しない。
(実施例 1 3)
次いで、 第 1 3の実施例について説明する。 なお、 上記各実施例のい ずれかと同様な部分の説明は、 省略または簡略化する。
本実施例では、 第 3 0図に示すように、 鎵型 DNAとしてヒ トゲノム DNA (Promega) を、 プライマー DNAとしてオリゴヌクレオチド 8 5 とオリゴ ヌクレオチド 8 6を用意した。これらのプライマ一 DNAは、ヒ トゲノム MA の single copy gene (こつレヽて設計した。 具体的 ίこ（ま、 Homo sapiens PAC clone RP5-1142J19 from 7q35-q36, complete sequence (ACCESSION AC004975) を参考にして設計した。 各プライマー DNAは、 錶型 DNAと 1 0 0 %相補的な 2 0〜 2 lmerの塩基配列からなる。
オリゴヌクレオチド 8 5 ：
5， -gcaggcaccaagaacxactgc-3'
オリゴヌクレオチド 8 6 ：
5， -gcctaaggtcacgttgtccc-33
次に、 P 反応により核酸を増幅させた。 具体的には、 5 0 1の P CR反応液中に、 各々 1 · 0〃M (最終濃度） の 2種類のオリゴヌクレオ チドと、 2 0 0 ngのヒ トゲノム MA (Promega) と、 1. 0 unitの TaKaRa Taq- HS (夕カラバイオ） と、 0. 2mMの dNTP混合液と、 1. 0 gの T.th. RecA夕ンパク質を、 1 OmMの Tris- HC1 Buffer(pH8. 3 )、 5 OmMの KC1、 1. 5 mMの MgCl2 に混合した。 そして、 P C R反応を、 1サイクル （ 9 0 °C3 1分間）、 3 0サイクル （ 9 4°C, 3 0秒間、 6 0 °C, 3 0秒間、 6 8 °C3 1分間）、 1サイクル （ 6 8 °C, 7分間、 4 °C , 1分間） で行つ 次に、 反応液について 1 %のァガロースゲルで電気泳動を行い、 ァガ ロースゲルをェチジゥムプロミ ドの溶液に浸してゲル中の DNAを染色し、 その後、 染色された DNAを写真に記録した。 そ ø結果を第 3 1図に示す。
レーン 1は、 上記のように、 プライマ一 DNAの濃度をそれそれ 1 . 0〃 M (最終濃度） として、 P C R反応を行ったものである。
レーン 2は、 プライマ一 DNAの濃度をそれそれ 0 . 3〃M (最終濃度） に減らして、 それ以外はレーン 1 と同様な P C R反応を行ったものであ る ο
レーン 3は、 プライマー DNAの濃度をそれそれ 0 . 1 z M (最終濃度） に減らして、 それ以外はレーン 1 と同様な P C R反応を行ったものであ る。
レーン 4は、 プライマ一 DNAの濃度をそれそれ 0 . 0 3〃M (最終濃度） に減らして、 それ以外はレーン 1 と同様な P C R反応を行ったものであ る。
レーン 5は、 プライマ一 DNAの濃度をそれぞれ 0 . 0 1〃M (最終濃度） に減らして、 それ以外はレーン 1 と同様な P C R反応を行ったものであ る。
レーン 6は、 プライマー DNAの濃度をそれそれ 0 . 0 0 3〃M (最終濃 度） に減らして、 それ以外はレーン 1 と同様な P C R反応を行ったもの である。
レーン 7は、 プライマ一 DNAの濃度をそれそれ 0 · 0 0 1〃M (最終濃 度） に減らして、 それ以外はレーン 1 と同様な P C R反応を行ったもの である。
レーン 8は、 プライマ一 DNAの濃度をそれそれ 0 · 0 0 0 3〃M (最終 濃度） に減らして、 それ以外はレーン 1 と同様な P C R反応を行ったも のである。
レーン 9は、 T . th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 1 と同じ P C R反応を行ったものである。 レーン 1 0は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えないで、 レーン 2と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1 1は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 3と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 1 2は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 4と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1 3は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えないで、 レーン 5 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 1 4は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えないで、 レーン 6 と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1 5は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えないで、 レーン 7と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1 6は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えないで、 レーン 8と同じ P CR反応を行ったものである。
第 3 1図の結果から明らかなように、 T.th. RecAタンパク質を加えて P CR反応を行ったレーン 1〜レーン 8のうち、 レーン 7 , 8を除く レ —ンでは、 所望の核酸 （正しい特異的な P CR産物） の増幅が検出され た一方、副産物（非特異的な P C R産物）はほとんど検出されなかった。 また、 レーン 7及びレーン 8では、 プライマー DNAの濃度が低すぎるため か、 核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
これに対し、 T.th. RecAタンパク質を加えずに P CR反応を行ったレ ーン 9〜レーン 1 6のうち、 レ一ン 9〜レーン 1 2では、 所望の核酸の みならず副産物も検出された。 また、 レーン 1 3及びレーン 1 4では、 所望の核酸の増幅が検出された一方、 副産物はほとんど検出されなかつ た。 また、 レーン 1 5及びレーン 1 6では、 プライマー DNAの濃度が低す ぎるためか、 核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
このことから、 T.th. RecAタンパク質を加えて P C R反応を行えば、 所望の核酸の収量を減少させることなく、 副産物の増幅を低く抑えるこ とができる。 即ち、 T.th. RecAタンパク質が存在することにより、 ブラ ol ィマー DNAが鎵型 DNAの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を 起こすことが抑制されるため、 非特異的な P C R産物の増幅を抑制する ことができる。
(実施例 1 4 )
次いで、 第 1 4の実施例について説明する。 なお、 上記各実施例のい ずれかと同様な部分の説明は、 省略または簡略化する。
本実施例では、 第 3 2図に示すように、 铸型 DNAとしてヒ トゲノム DNA ( Promega) を、 プライマ一 DNAとして 5種類のオリゴヌクレオチド （ォ リゴヌクレオチ ド 8 7〜 9 1 ) を用意した。 これらのプライマ一 DNAは、 Homo sapiens BAG c lone CTB-135C18 from 7ql l . 2-q22, complete sequence
(ACCESSION AC005164 ) を参考にして設計した。一方のプライマ一 MA (ォ リゴヌクレオチ ド 8 7 ~ 9 0 ) は、 3 ' 末端から 3番目の塩基配列をそ れそれ異ならせてあり、オリゴヌクレオチド 9 0が鎵型 MAと 1 0 0 %相 補的である。 他方のプライマ一 DNA (オリゴヌクレオチド 9 1 ) は、 共通 のものであり、 錡型 DNAと 1 0 0 %相補的である。 各プライマ一 DNAは、
2 2 merの塩基配列からなる。
オリゴヌクレオチド 8 7 ：
5' -caaagctactttcacagccgcc-3
才リゴヌクレオチド 8 8 ：
5' -caaagctactttcacagccacc-3
オリゴヌクレオチド 8 9 ：
5 -caaagctactttcacagccccc-3'
オリゴヌクレオチド 9 0 ：
5' -caaagctactttcacagcctcc-3
オリゴヌクレオチド 9 1 ：
5 -ggcatattcagccaaggatttc-3'
次に、 P C R反応により核酸を増幅させた。 具体的には、 5 0 ^ 1の P
C R反応液中に、 各々 0 · 3〃M (最終濃度） の 2種類のォリゴヌクレオ チドと、 2 0 0 ngのヒ トゲノム DNA ( Promega) と、 1 . 0 unitの TaKaRa Q
Taq- HS (夕カラバイオ） と、 0. 2mMの dNTP混合液と、 1. 。〃 の!1."^. RecA夕ンパク質を、 1 OmMの Tris- HC1 Buffer(pH8. 3 )、 5 OmMの KC1、 1. 5mMの MgCl2 に混合した。 そして、 P CR反応を、 1サイクル （ 9 4°C, 1分間）、 3 0サィクル （ 94 ， 3 0秒間、 6 0°C， 3 0秒間、 6 8 °C, 1分間）、 1サイクル （ 6 8°C, 7分間、 4 °C , 1分間） で行つ た。
次に、 反応液について 1 %のァガロースゲルで電気泳動を行い、 ァガ ロースゲルをェチジゥムブロミ ドの溶液に浸してゲル中の DNAを染色し、 その後、 染色された DNAを写真に記録した。 その結果を第 33図に示す。 レーン 1は、 プライマ一 MAとして、 オリゴヌクレオチド 8 7とオリゴ ヌクレオチド 9 1を加えたものである。
レーン 2は、 プライマ一 DNAとして、 ォリゴヌクレオチド 8 8とオリゴ ヌクレオチド 9 1を加えたものである。
レーン 3は、 プラィマー DNAとして、 ォリゴヌクレオチ ド 8 9 とオリゴ ヌクレオチド 9 1を加えたものである。
レーン 4は、 プライマ一 DNAとして、 オリゴヌクレオチド 9 0と才リゴ ヌクレオチド 9 1を加えたものである。
レーン 5は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 1 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 6は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 2 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 7は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 3と同じ P 反応を行ったものである。
レーン 8は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 4と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 9は、 T.th. RecAタンパク質の代わりに、 同量の T.th.の SSB夕 ンパク質を加えて、 それ以外はレーン 1 と同じ P CR反応を行ったもの である。
レーン 1 0は、 T.th. RecAタンパク質の代わりに、 同量の T.th.の SSB .
83 タンパク質を加えて、 それ以外はレーン 2 と同じ P C R反応を行ったも のである。
レーン 1 1は、 T.th. RecAタンパク質の代わりに、 同量の T.th.の SSB タンパク質を加えて、 それ以外はレーン 3と同じ P C R反応を行ったも のである。
レーン 1 2は、 T.th. RecAタンパク質の代わりに、 同量の T.th.の SSB タンパク質を加えて、 それ以外はレーン 4と同じ P C R反応を行ったも のである。
第 3 3図の結果から明らかなように、 T.th. RecAタンパク質を加えて P CR反応を行ったレーン 1〜レーン 4について見ると、錶型 DNAと 1 0 0 %相補的なプライマ一 DNAを用いたレーン 4では、 所望の DNAの増幅が 強く検出された一方、 副産物はほとんど検出されなかった。 一方、 3 ' 末端から 3番目の塩基が異なるプライマ一 DNAを用いたレーン 1〜レー ン 3では、 所望の核酸の増幅がほとんど検出されなかった。
これに対し、 T.th. RecAタンパク質を加えずに： P C R反応を行ったレ —ン 5〜レーン 8については、いずれのレーンにおいても所望の DNAの増 幅が検出された。 また、 レーン 5及びレーン 6では、 副産物も増幅され た。
また、 T.th. RecAタンパク質の代わりに T.th.の SSBタンパク質を加え て P C R反応を行ったレーン 9〜レーン 1 2についても、 いずれのレ一 ンにおいても所望の DNAの増幅が検出された。 また、 レーン 9及びレーン 1 0では、 副産物が増幅された。
このことから、 T.th. RecAタンパク質を加えて P C R反応を行えば、 所望の核酸の収量を減少させることなく、 副産物の増幅を低く抑えるこ とができる。 即ち、 上記の相同組み換えタンパク質が存在することによ り、 プライマ一 DNAが錶型 DNAの非特異的な領域に結合してプライマ一伸 長反応を起こすことが抑制されるため、 非特異的な P CR産物の増幅を 抑制することができる。 具体的には、 プライマ一 DNAと鎊型 DNAとの塩基 のミスマッチがない場合においてのみ、 特異的に核酸を増幅させること が可能となる。 一般に、 プライマ一 DNAの 3 ' 末端近傍の塩基 （特に、 3 ' 末端から 3塩基以内の塩基） が錶型 DNAとミスマッチしている場合には、 核酸が増幅されやすい傾向にある。 しかし、 T . th . RecAタンパク質を加 えて P C R反応を行えば、 所望の核酸を特異的に増幅させることができ る。
一方、 RecAタンパク質と同様に DNAに結合する T . th . SSBタンパク質を 加えて P C Rを行っても、 P C Rの特異性は特に向上しない。
また、本実施例の結果より、一塩基多型を検出することが可能である。 即ち、 プライマー DNAの 1つに、 錡型 DNAのうち一塩基多型をなす塩基を 含む配列に対応したプライマ一 DNAを用いて P C Rを行えば、 銃型 DNAと 一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマー DNAとが完全に 相補的である場合に、所望の核酸を増幅させるようにすることができる。 一方、鎵型 DNAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマー とが完全には相補的ではない場合、 即ち、 一塩基多型をなす塩基がプ ライマ一 DNAと相補的でない場合に、 所望の核酸が増幅しない、 または、 抑制されるようにすることができる。 このため、 P C Rによる所望の核 酸の増幅により、 一塩基多型を検出することが可能である。
(実施例 1 5 )
次いで、 第 1 5の実施例について説明する。 なお、 上記各実施例のい ずれかと同様な部分の説明は、 省略または簡略化する。
本実施例では、 第 3 4図に示すように、 錶型 DNAとしてヒ トゲノム DNA ( Promega) を、 プライマー DNAとして 5種類のオリゴヌクレオチド （ォ リゴヌクレオチ ド 9 2〜 9 6 ) を用意した。 これらのプライマ一 DNAは、 Homo sapiens PAC c lone RP5-1142J19 from 7q3o-q36 , compl ete sequence (ACCESSI ON AC004975 ) を参考にして設計した。一方のプライマー DNA (ォ リゴヌクレオチド 9 2〜 9 5 ) は、 3， 末端から 3番目の塩基配列をそ れそれ異ならせてあり、オリゴヌクレオチド 9 3が錡型 DNAと 1 0 0 %相 補的である。 他方のプライマー DNA (ォリゴヌクレオチド 9 6 ) は、 共通 のものであり、 錡型 MAと 1 0 0 %相補的である。 各プライマ一 MAは、 2 0〜 2 l merの塩基配列からなる。
ォリゴヌクレオチド 9 2 ：
5' -gcaggcaccaagaactacggc-3'
オリゴヌクレオチド 9 3 ：
5' ~gcaggcaccaagaactactgc-35
オリゴヌクレオチド 9 4 ：
5' -gcaggcaccaagaactacagc-3'
オリゴヌクレオチド 9 5 ：
5' -gcaggcaccaagaactaccgc-35
オリゴヌクレオチド 9 6 ：
53 -gcctaaggtcacgttgtccc-3'
次に、 上記実施例 1 4のレーン 1等と同様な条件で P C R反応を行つ た。 そして、 その反応液について 1 %のァガロースゲルで電気泳動を行 い、 上記実施例 1 4と同様にして、 その結果を写真に記録した。 これを 第 3 5図に示す。
レーン 1は、 プライマ一 DNAとして、 オリゴヌクレオチド 9 2 とオリゴ ヌクレオチド 9 6を加えたものである。
レーン 2は、 プライマ一 DNAとして、 オリゴヌクレオチド 9 3とオリゴ ヌクレオチド 9 6を加えたものである。
レーン 3は、 プライマー DNAとして、 オリゴヌクレオチ ド 9 4とオリゴ ヌクレオチド 9 6を加えたものである。
レーン 4は、 プライマー DNAとして、 オリゴヌクレオチ ド 9 5 とオリゴ ヌクレオチド 9 6を加えたものである。
レーン 5は、 T . th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 1 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 6は、 T . th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 2 と同じ P C R反応を行つたものである。
レーン 7は、 T . th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 3 と同じ P C R反応を行ったものである。 。
ob レーン 8は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 4と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 9は、 T.th. RecAタンパク質の代わりに、 同量の T.th.の SSB夕 ンパク質を加えて、 それ以外はレーン 1と同じ P 反応を行ったもの である。
レーン 1 0は、 T.th. RecAタンパク質の代わりに、 同量の T.th.の SSB タンパク質を加えて、 それ以外はレーン 2と同じ P C R反応を行ったも のである。
レーン 1 1は、 T.th. RecAタンパク質の代わりに、 同量の T.th.の SSB タンパク質を加えて、 それ以外はレ一ン 3 と同じ P CR反応を行ったも のである。
レーン 1 2は、 T.th. RecAタンパク質の代わりに、 同量の T.th.の SSB タンパク質を加えて、 それ以外はレ一ン 4と同じ P CR反応を行ったも のである。
第 3 5図の結果から明らかなように、 T.th. RecA夕ンパク質を加えて P C R反応を行ったレーン 1〜レーン 4について見ると、錶型 MAと 1 0 0 %相補的なプライマー DNAを用いたレーン 2では、 所望の DNAの増幅が 強く検出された一方、 副産物はほとんど検出されなかった。 一方、 3 ' 末端から 3番目の塩基が異なるプライマー DNAを用いたレーン 1 , 3 , 4 では、 所望の核酸の増幅がほとんど検出されなかった。
これに対し、 T.th. RecAタンパク質を加えずに P CR反応を行ったレ —ン 5〜レーン 8については、いずれのレーンにおいても所望の DNAの增 幅が検出された。 また、 レーン 7では、 副産物も増幅された。
また、 T.th. RecAタンパク質の代わりに T.th.の SSBタンパク質を加え て P CR反応を行ったレーン 9〜レーン 1 2についても、 いずれのレー ンにおいても所望の MAの増幅が検出された。 また、 レーン 1 1では、 副 産物が増幅された。
このことから、. T . th. RecAタンパク質を加えて P C R反応を行えば、 所望の核酸の収量を減少させることなく、 副産物の増幅を低く抑えるこ とができる。 即ち、 上記の相同組み換えタンパク質が存在することによ り、'プライマ一 DNAが鎵型 DNAの非特異的な領域に結合してプライマ一伸 長反応を起こすことが抑制されるため、 非特異的な P C R産物の増幅を 抑制することができる。 具体的には、 プライマー DNAと錡型 MAとの塩基 のミスマッチがない場合においてのみ、 特異的に核酸を增幅させること が可能となる。一般に、 プライマ一 DNAの 3， 末端近傍の塩基（特に、 3 5 末端から 3塩基以内の塩基） が錡型 DNAとミスマッチしている場合には、 核酸が増幅されやすい傾向にある。 しかし、 T . th. RecAタンパク質を加 えて P C R反応を行えば、 所望の核酸を特異的に増幅させることができ る。
一方、 RecAタンパク質と同様に DNAに結合する T . th . SSBタンパク質を 加えて P C Rを行っても、 P C Rの特異性は特に向上しない。
また、本実施例の結果より、一塩基多型を検出することが可能である。 即ち、 プライマ一 DNAの 1つに、 錶型 DNAのうち一塩基多型をなす塩基を 含む配列に対応したプライマー DNAを用いて P C Rを行えば、 錄型 DNAと 一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマー DNAとが完全に 相補的である場合に、所望の核酸を増幅させるようにすることができる。 一方、錶型 MAと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマ一 DNAとが完全には相補的ではない場合、 即ち、 一塩基多型をなす塩基がプ ライマ一 DNAと相補的でない場合に、 所望の核酸が増幅しない、 または、 抑制されるようにすることができる。 このため、 P C Rによる所望の核 酸の増幅により、 一塩基多型を検出することが可能である。
(実施例 1 6 )
次いで、 第 1 6の実施例について説明する。 なお、 上記各実施例のい ずれかと同様な部分の説明は、 省略または簡略化する。
本実施例では、 第 3 6図に示すように、 錡型 DNAとしてヒ トゲノム DNA ( Promega) を、 プライマ一 DNAとしてオリゴヌクレオチド 9 7 とオリゴ ヌ ク レオチ ド 9 8 を用意した。 これらのプライマー DNAは、 Human chromosome 14 DNA sequence BAC C-2240H23 of l ibrary CalTech-D from 00
oo chromosome 14 of Homo sapiens (Human) , complete sequence (ACCESSION
AL356017) を参考にして設計した。 各プライマー DNAは、 錶型 MAと 1 0
0 %相補的な 2 Omerの塩基配列からなる。
オリゴヌクレオチド 9 7 ：
5' -atgaaaagccctgctttgca-3'
オリゴヌクレオチド 9 8 ：
5' -agacttcttcaactcaatgg-3'
次に、 P CR反応により核酸を増幅させた。 具体的には、 5 0 zlの P
CR反応液中に、 各々 0. 5 M (最終濃度） の 2種類のオリゴヌクレオ チドと、 2 0 0 ngのヒ 卜 c DNA (Invitorogen) と、 1. 0 unitの TaKaRa
ExTaq - HS polymerase (夕カラノ イォ） と、 0. 2 mMの dNTP混合液と、 1.
0〃gの T.th. RecAタンパク質を、 l xExTaq-HS 専用 Buffer (夕カラ バイオ） に混合した。 そして、 P C R反応を、 1サイクル （ 9 4 °C， 3
0秒間）、 3 0サイクル（ 94 °C, 1 5秒間、 5 5 C， 3 0秒間、 7 2 °C , 1分間）、 1サイクル （ 72°C, 7分間、 4°C, 1分間） で行った。
次に、反応液の 1 0 /1について 1 %のァガロースゲルで電気泳動を行 い、 ァガロースゲルをェチジゥムブロミ ドの溶液に浸してゲル中の DNA を染色し、 その後、 染色された DNAを写真に記録した。 その結果を第 3 7 図に示す。
レーン 1は、 上記のように、 T.th. RecAタンパク質を加えたものであ る。
レーン 2は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 1 と同じ P CR反応を行ったものである。
第 3 7図の結果から明らかなように、 T.th. RecAタンパク質を加えて P CR反応を行ったレーン 1では、 所望の DNAの増幅が検出された一方、 副産物はほとんど検出されなかった。 なお、 下方に見えるシグナルはバ ックグラウンドと考えられる。
これに対し、 T.th. RecAタンパク質を加えずに P C R反応を行ったレ —ン 2では、 所望の DNAの増幅が検出されなかった。 これは、 錡型 DNAに 阻止的または抑制的 2次構造の区域があるためと考えられる。
このことから、 T. th. RecAタンパク質を加えて P C R反応を行えば、 錶型 DNAに阻止的または抑制的 2次構造の区域がある場合であっても、所 望の核酸を効率よく特異的に増幅させることができる。 その理由は、 相 同組み換え夕ンパク質が、 錶型 DNAに結合することにより、 阻止的または 抑制的 2次構造が解かれるためであると考えられる。
(実施例 1 7 )
次いで、 第 1 7の実施例について説明する。 なお、 上記各実施例のい ずれかと同様な部分の説明は、 省略または簡略化する。
本実施例では、 第 3 8図及び第 3 9図に示すように、 錶型 DNAとしてヒ トゲノム DNA (Promega) を、 プライマ一 DNAとして 1 2種類のォリゴヌク レオチド （オリゴヌクレオチド 9 9〜： L 1 0 ) を用意した。 オリゴヌク レオチド 9 9 とオリゴヌクレオチド 1 ◦ 0は、 Human DNA sequence from clone RP11-760M1 on chromosome 13 , complete sequence (ACCESSION AL354815 ) 及び Human hepatocyte nuc lear factor 4 - alpha gene, exon 1 (ACCESSION U72959 U72960 ) を参考にして設計した。 また、 オリゴヌ クレオチド 1 0 1 とオリゴヌクレオチ ド 1 0 2は、 Human rhodopsin gene , complete cds (ACCESS ION U49742 K02Z81 ) を参考にして設計した。 また、 オ リ ゴヌ ク レオチ ド 1 0 3 とオリ ゴヌ ク レオチ ド 1 0 4 は、 Homo sapiens beta globin region (HBB@ ) on chromosome 11 (ACCESS ION NG_000007) を参考にして設計した。 オリゴヌクレオチド 1 ◦ 5 とオリゴ ヌ ク レオチ ド 1 0 6 は、 Homo spaiens HPFH60R gene for olfactory receptor (ACCESS ION X81445 X91835 ) を参考にして設計した。 また、 ォ リゴヌク レオチ ド 1 0 7 とオリゴヌク レオチ ド 1 0 8 は、 Human p53 (TP53 ) gene , complete cds (ACCESSION U94788 ) を参考にして設計した。 また、 オリゴヌクレオチ ド 1 0 9 とオリゴヌクレオチド 1 1 0は、 Human p53 ( TP53 ) gene, complete cds (ACCESSION U94788 ) を参考にして設計 した。 各プライマー DNAは、 鎵型 DNAと 1 0 0 %相補的な 2 0〜 2 7 mer の塩基配列からなる。 nn オリゴヌクレオチド 9 9 ：
5， -gcatctggggcctggtatttag-3'
ォリゴヌクレオチド 1 0 0 ：
D -tacaaggcaggcatcatgactcacg-3'
オリゴヌクレオチド 1 0 1 ：
a -aggagcttaggagggggaggt-3'
オリゴヌクレオチド 1 0 2 ：
0 -catigacaggacaggagaaggga-ό'
オリゴヌクレオチ ド 1 0 3 ：
0 -cttLttgticccccagacactc-35
ォリゴヌクレオチ ド 1 0 4 ：
5' -gcaatggcttaggagttggact-3'
オリゴヌクレオチド 1 0 5 ：
0 -gttaatacctaaggctctactgca-3'
オリゴヌクレオチド 1 0 6 ：
0 -aggcaatggcggcacccatc-3'
ォリゴヌクレオチ ド 1 0 7 ：
5， -gcagagacctgtgggaagcgaaaa-3'
オリゴヌクレオチド 1 0 8 ：
5' -gagagctgtggcaagcagggga-3'
オリゴヌクレオチド 1 0 9 ：
5' -cccctcctggcccctgtcat-3'
ォリゴヌクレオチ ド 1 1 0 ：
5- -gttagatgactttgcccaactgtaggg-3'
次に、 ： P 反応により核酸を増幅させた。 具体的には、 5 0〃1の？
C R反応液中に、 各々 0 . 8〃M (最終濃度） の 2種類のォリゴヌクレオ チドと、 2 0 O ngのヒ トゲノム DNA ( Promega) と、 1 . 0 unitの TaKaRa
ExTaq - HS polymerase (夕カラノ、、ィォ） と、 0 . 2 mMの dNTP混合液とヽ 1 .
0 gの T . th . RecAタンパク質を、 1 x ExTaq Buffer (夕カラバイオ） に混合した。 そして、 ； P C R反応を、 1サイクル （ 9 4°C， 3 0秒間）、
3 5サイクル（ 9 4°C, 1 5秒間、 5 5 °C， 3 0秒間、 7 2 °C , 1分間）、 1サイクル （ 72°C， 7分間、 4°C, 1分間） で行った。
次に、 反応液の 1 0〃1について 1. 2 %のァガ口一スゲルで電気泳動 を行い、 ァガロースゲルをェチジゥムプロミ ドの溶液に浸してゲル中の DNAを染色し、 その後、 染色された DNAを写真に記録した。 その結果を第
40図に示す。
レーン 7は、 プライマ一 DNAとして、 ォリゴヌクレオチ ド 9 9とオリゴ ヌクレオチド 1 00を加えたものである。
レーン 8は、 プライマ一 DNAとして、 オリゴヌクレオチド 1 0 1とオリ ゴヌクレオチド 1 02を加えたものである。
レーン 9は、 プライマ一 DNAとして、 オリゴヌクレオチド 1 0 3とオリ ゴヌクレオチド 1 04を加えたもの,である。
レーン 1 0は、 プライマー DNAとして、 オリゴヌクレオチド 1 0 5とォ リゴヌクレオチド 1 0 6を加えたものである。
レーン 1 1は、 プライマー DNAとして、 オリゴヌクレオチド 1 0 7とォ リゴヌクレオチド 1 0 8を加えたものである。
レーン 1 2は、 プライマー DNAとして、 オリゴヌクレオチ ド 1 0 9とォ リゴヌクレオチド 1 1 0を加えたものである。
レーン 1は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 7と同じ P C R反応を行ったものである。
レ一ン 2は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 8と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 3は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 9と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 4は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えないで、 レーン 1 0と同じ P CR反応を行ったものである。
レ一ン 5は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えないで、 レーン 1 1と同じ P C R反応を行ったものである。 9 レーン 6は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えないで、 レーン 1 2 と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1 3は、 1 5 mM KCl を加えて、 レーン 7 と同じ P CR反応を 行ったものである。
レーン 1 4は、 1 5 mM KC1 を加えて、 レ一ン 8 と同じ P CR反応を 行ったものである。
レーン 1 5は、 1 5 mM KCl を加えて、 レーン 9 と同じ P C R反応を 行ったものである。
レーン 1 6は、 1 5 mM KC1を加えて、 レーン 1 0 と同じ P 反応 を行ったものである。
レーン 1 7は、 1 5 mM KClを加えて、 レーン 1 1 と同じ P CR反応 を行ったものである。
レーン 1 8は、 1 5 mM KClを加えて、 レーン 1 2 と同じ P C R反応 を行ったものである。
レーン 1 9は、 3 0 mM KC1を加えて、 レーン 7 と同じ P CR反応を 行ったものである。
レーン 2 0は、 3 0 mM KClを加えて、 レーン 8 と同じ P C R反応を 行ったものである。
レーン 2 1は、 3 0 mM KC1 を加えて、 レーン 9 と同じ P C R反応を 行ったものである。
レーン 2 2は、 3 0 mM KCl を加えて、 レーン 1 0と同じ P CR反応 を行ったものである。
レーン 2 3は、 3 0 mM KC1を加えて、 レーン 1 1 と同じ P C R反応 を行ったものである。
レーン 2 4は、 3 0 mM KC1を加えて、 レーン 1 2 と同じ P C R反応 を行ったものである。
第 4 0図の結果から明らかなように、 T.th. RecAタンパク質を加えて P C R反応を行ったレーン 7〜レーン 1 2では、所望の DMの増幅が検出 された一方、 副産物はそれほど検出されなかった。 yd また、 1 5 mM KC1を加えたレーン 1 3〜レーン 1 8では、 レーン 7 〜レーン 1 2よりも副産物の増幅が抑制された。
またさらに、 3 0 mM KC1を加えたレーン 1 9〜レーン 2 4では、 レ ーン 1 3〜レーン 1 8よりも、 効果的に副産物の増幅が抑制された。
これに対し、 T.th. RecAタンパク質を加えずに P C R反応を行ったレ —ン 1〜レーン 6では、 所望の DNAの増幅が検出された一方、 副産物も多 く検出された。
このことから、 T.th. RecAタンパク質を加えて P C R反応を行えば、 所望の核酸の収量を減少させることなく、 副産物の増幅を低く抑えるこ とができる。 即ち、 上記の相同組み換えタンパク質が存在することによ り、 プライマー DNAが錡型 DNAの非特異的な領域に結合してプライマ一伸 長反応を起こすことが抑制されるため、 非特異的な P C R産物の増幅を 抑制することができる。
特に、 P CR反応液に KCI を加えることにより、 P C Rの特異性を向 上させることができる。
(実施例 1 8 )
次いで、 第 1 8の実施例について説明する。 なお、 上記各実施例のい ずれかと同様な部分の説明は、 省略または簡略化する。
本実施例では、 第 4 1図に示すように、 錶型 DNAとしてヒ トゲノム DNA (Promega) を、 プライマ一 DNAとしてオリゴヌクレオチ ド 1 1 1 とオリ ゴヌクレオチ ド 1 1 2 を用意した。 これらのプライマー DNAは、 Homo sapiens beta globin region (HBB@) on chromosome1 11 (ACCESSION NGJ)00007) を参考にして設計した。 各プライマ一 DNAは、 錶型 DNAと 1 0 0 %相補的な 2 1〜 2 2merの塩基配列からなる。
オリゴヌクレオチド 1 1 1 ：
5" -ctgctgaaagagatgcggtgg-3
オリゴヌクレオチド 1 1 2 ：
5, -aggaaaacagcccaagggacag-3'
次に、 P CR反応によ り核酸を増幅させた。 具体的には、 5 0〃1の P „
9
CR反応液中に、 各々 0. 2 5〃M (最終濃度） の 2種類のオリゴヌクレ ォチドと、 1 0 Ongのヒ トゲノム MA(Promega)と、 1.2 5 unitの TaKaRa ExTaq Polymerase (夕カラバイオ） と、 0. 2 mMの dNTP混合液と、 1. 0〃gの T.th. RecAタンパク質を、 1 x ExTaq Buf f er (夕カラバイオ） に 混合した。 そして、 P CR反応を、 1サイクル （ 94°C；， 3 0秒間）、 3 5サイクル （ 9 4°C， 1 5秒間、 5 5 °C， 3 0秒間、 7 2 °C, 1分間）、 1サイクル （ 7 2°C, 7分間、 4°C， 1分間） で行った。
次に、 反応液の 1 0 lについて 1. 2 %のァガロースゲルで電気泳動 を行い、 ァガロースゲルをェチジゥムプロミ ドの溶液に浸してゲル中の DNAを染色し、 その後、 染色された DNAを写真に記録した。 その結果を第 42図に示す。
レーン 1は、 上記のように、 TaKaRa ExTaq Polymerase ¾ 1. 2 5 unit の加えて P C R反応を行つたものである。
レーン 2は、 TaKaRa ExTaq Polymeraseを 0. 6 3 unitに減ら して、 そ れ以外はレーン 1と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 3は、 TaKaRa ExTaq Polymeraseを 0. 3 limitに減らして、 そ れ以外はレーン 1と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 4は、 TaKaRa ExTaq Polymeraseを 0. 1 6 unitに減らして、 そ れ以外はレーン 1と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 5は、 TaKaRa ExTaq Polymeraseを 0. 0 8 unitに減ら して、 そ れ以外はレーン 1と同じ P CR反応を行ったものである。
レ一ン 6は、 TaKaRa ExTaq Polymeraseを 0. 04 unitに減らして、 そ れ以外はレーン 1と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 7は、 TaKaRa ExTaq Polymeraseを 0. 0 2unitに減らして、 そ れ以外はレーン 1と同じ P CR反応を行ったものである。
レ一ン 8は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えないで、 レーン 1 と同じ P C R反応を行ったものである。
レーン 9は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 2 と同じ P CR反応を行ったものである。 レーン 1 0は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 3と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1 1は、 T.th. RecA夕ンパク質を加えないで、 レーン 4と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1 2は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 5 と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1 3は、 T.th. ecAタンパク質を加えないで、 レーン 6 と同じ P CR反応を行ったものである。
レーン 1 4は、 T.th. RecAタンパク質を加えないで、 レーン 7と同じ P C R反応を行ったものである。
第 4 2図の結果から明らかなように、 T.th. RecAタンパク質を加えて P CR反応を行ったレーン 1〜レーン 7のうち、 レーン 1〜レーン 5に おいて、 所望の DNAの増幅が検出された。 即ち、 P CR反応液に TaKaRa ExTaq Polymerase を 0. 08 unit以上に加えることにより、 所望の MA が増幅された。
これに対し、 T.th. RecAタンパク質を加えずに P 反応を行った場 合には、 レーン 8〜レーン 1 4のうち、 レーン 8〜レーン 1 0のみに、 所望の DNAの増幅が検出された。 即ち、 P C R反応液に TaKaRa ExTaq Polymerase を 0. 3 1 unit以上に加えた場合にのみ、 所望の DNAが増幅 された。
このことから、 T.th. RecAタンパク質を加えて P C R反応を行えば、 MAポリメラーゼの添加量を少なく しても、所望の核酸を効率よく特異的 に増幅きせることができる。 その理由は、 相同組み換えタンパク質がプ ライマ一 DNAゃ錶型 DNAに結合し、 プライマー DNAと錶型 DNAとの結合を促 進させるため、 DNAポリメラ一ゼの添加量を少なく しても、 P C R反応が 効率よく進行するものと考えられる。
(実施例 1 9 )
次いで、 第 1 9の実施例について説明する。 なお、 上記各実施例のい ずれかと同様な部分の説明は、 省略または簡略化する。 本実施例では、 第 4 3図〜第 4 6図に示すように、 鎵型 MAとしてヒ ト ゲノム DNA (Promega) を、 プライマ一 DNAとして 2 0種類のォリゴヌクレ ォチド （オリゴヌクレオチド 1 1 3〜 1 3 2 ) を用意した。 オリゴヌク レオチド 1 1 3とオリゴヌクレオチド 1 1 4は、 Homo sapiens 16pl3.3 sequence section 1 of 8 (ACCESSION AE006462 AE005175) を参考にし て設計した。 また、 オリゴヌクレオチド 1 1 5とオリゴヌクレオチド 1 1 6 は、 Homo sapiens SVMT gene for synaptic vesicle monoamine transporter, exon 16 and complete cds (ACCESSION AB044401) を参考 にして設計した。 また、 オリゴヌクレオチド 1 1 7とオリゴヌクレオチ ド 1 1 8 は、 Homo spaiens HPFH60R gene for olfactory receptor (ACCESSION X81445 X91835) を参考にして設計した。 オリゴヌクレオチ ド 1 1 9 とオ リ ゴヌ ク レオチ ド 1 2 0は、 Human p53 (TP53) gene, complete cds (ACCESSION U94788) を参考にして設計した。 また、 オリ ゴヌ ク レ オチ ド 1 2 1 とオ リ ゴヌ ク レ オチ ド 1 2 2 は、 Human hepatocyte nuclear factor 4 - alpha gene, exon 1 (ACCESSION U72959 U72960 ) を参考にして設計した。 また、 オリゴヌクレオチド 1 2 3とォ リコヌクレオテ ド 1 24は、 Homo sapiens diacylglycerol kinase, zeta 104kDa (DGKZ), mRNA (ACCESSION NM— 003646) を参考にして設計した。 オリ ゴヌ ク レオチ ド 1 2 5 とオ リ ゴヌ ク レオチ ド 1 2 6は、 Human rhodopsin gene, complete cds (ACCESSION U49742 02281) を参考にし て設計した。 また、 オリゴヌクレオチ ド 1 2 7とオリゴヌクレオチド 1 2 8は、 Human DNA for CAAFl (calcium-binding protein in amniotic fluid 1), complete cds (ACCESSION D83657) を参考にして設計した。 また、 オリゴヌクレオチド 1 2 9とオリゴヌクレオチ ド 1 3 0は、 Homo sapiens CYP21 gene, exons 1 through 10; and steroid 21 - hydroxylase (CYP21) gene, complete cds (ACCESSION M12792 M23280) を参考にして 設計した。 オリゴヌクレオチド 1 3 1 とオリゴヌクレオチド 1 3 2は、 Human S100 protein beta - subunit gene, exon 1 (ACCESSION M59486 J05600)を参考にして設計した。各ブラィマ一 DNAは、錶型 DNAと 1 0 0 % 相補的な 2 0〜 2 6 merの塩基配列からなる。 ォリゴヌクレオチド 1 1 3 ：
5， -cacagatttccaaggatgcgctg-3'
オリゴヌクレオチド 1 1 4 ：
5' -cgtgctctgttccagacttg-3'
オリゴヌクレオチド 1 1 5 ：
5， -cgtctggcgattgctccaaatg-35
オリゴヌクレオチド 1 1 6 ：
5， -gggcagttgtgatccatgagaa-3'
オリゴヌクレオチド 1 1 7 ：
5 -ggcttgcaccagcttaggaaag-3'
オリゴヌクレオチド 1 1 8 ：
0 -cgttaggcataatcagtgggatagt-35
ォリゴヌクレオチド 1 1 9 ：
5' -gcctctgattcctcactgattgctct-3' 才リゴヌクレオチド 1 2 0 ：
0 -ig ;caaccacccttaac ccctcc-35
ォリゴヌクレオチド 1 2 1 ：
5' -ttggaggggtgggtgagtcaag-35
ォリゴヌクレオチド 1 2 2 ：
5' -ggaggggtgggggttaatggtta-3'
ォリゴヌクレオチド 1 2 3 ：
5' -ggaacaagacacggctggtt-3'
オリゴヌクレオチド 1 2 4 ：
5' -agcaaggcagggcaggcaagt-35
オリゴヌクレオチド 1 2 5 ：
5， -cggtcccattctcagggaatct-35
ォリゴヌクレオチド 1 2 6 ：
5 -gcccagaggaagaagaaggaaa-3" no オリゴヌクレオチド 1 2 7 ：
5， -gcccccacccaggttggtttcta-3'
オリゴヌクレオチド 1 2 8 ：
5' -atgccttcatctggctcagtgaa-35
オリゴヌクレオチド 1 2 9 ：
5， -gctcagcatgctggtggcataa-3'
オリゴヌクレオチド 1 3 0 ：
5' -ccicataccttcccccccattt-35
オリゴヌクレオチド 1 3 1 ：
5' -gactactctagcgactgtccatctc-3'
才リゴヌクレ才チ ド 1 3 2 ：
55 -gacagccaccagatccaatc-3'
次に、 P CR反応により核酸を増幅させた。 具体的には、 5 0 1の P
CR反応液中に、 各々 0. 1 zM (最終濃度） の 2 0種類のォリゴヌクレ ォチドと、 1 0 0 ngのヒ トゲノム DNA(Promega)と、 1.2 5 unitの TaKaRa
ExTaq Polymerase (夕カラバイオ） と、 0. 2 mMの dNTP混合液と、 1.
0〃gの T.th. RecAタンパク質を、 1 x ExTaq Buffer (夕カラバイオ） に混合した。 そして、 P C R反応を、 1サイクル （ 9 4°C, 3 0秒間）、
3 5サイクル（ 9 4 °C, 1 5秒間、 5 5 °C, 3 0秒間、 7 2 °C， 1分間）、 1サイクル （ 72 °C， 7分間、 4°C， 1分間） で行った。
次に、 反応液の 1 0 1について 1. 2 %のァガロースゲルで電気泳動 を行い、 ァガロースゲルをェチジゥムプロミ ドの溶液に浸してゲル中の DNAを染色し、 その後、 染色された DNAを写真に記録した。 その結果を第
47図に示す。
第 47図の結果から明らかなように、 各々のプライマ一セッ トに対応 した所望の DNAの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなか つ 7こ。
このことから、複数種類のプライマー DNAを添加して同時に P CR反応 を行っても、 即ち、 マルチプライマー P CRを行っても、 T.th. RecA夕 ンパク質を加えて P C R反応をさせれば、 副産物の生成を抑制しつつ、 所望の核酸を増幅させることができる。 前述したように、 T.th. RecA夕 ンパク質を加えることにより、プライマ一 DNAの濃度を下げても所望の核 酸が増幅できるため、 このようなマルチプライマー P C Rを行っても、 各々のプライマ一セヅ 卜に対応した所望の MAを増幅させることのでき ると考えられる。
以上において、 本発明の実施の形態を実施例に即して説明したが、 本 発明は上記各実施例 1〜 1 9に限定されるものではなく、 その要旨を逸 脱しない範囲で、 適宜変更して適用できることは言うまでもない。
例えば、 上記各実施例では、 相同組換えタンパク質として T.th. RecA タンパク質を使用したが、 前述したように、 それ以外のものを使用する ことも可能である。 即ち、 T.th. RecAタンパク質を改変したものであつ て T.th. RecA夕ンパク質と類似する機能を有する RecA改変夕ンパク質 (T.th. RecA改変タンパク質） や、 T.th. RecAタンパク質と T.th. RecA 改変タンパク質との混合物を用いてもよい。 また、 T.th. RecAフラグメ ントを用いることもできる。
さらに、 上記以外の RecA夕ンパク質であっても、 鎵型 DNAに対する塩基 のミスマツチが 3塩基以内のプライマ一 DNAについてのみプラィマ一伸 長反応が起こる RecAタンパク質を用いることができる。 また、 このよう な RecA夕ンパク質またはこの RecA夕ンパク質を改変した夕ンパク質であ つてこの RecA夕ンパク質と類似する機能を有する RecA改変夕ンパク質の 少なく ともいずれかを含む相同的組換えタンパク質を利用することもで ぎる。
また、錶型 DNAが阻止的または抑制的二次構造の区域を有する場合には、 一般的な P C Rを行ったとき、 このような区域を有する所望の核酸を、 効率よく特異的に増幅させることは困難である。
これに対し、 本発明を適用すれば、 錶型 DNAにこのような阻止的または 抑制的 2次構造の区域がある場合であっても、 所望の核酸を効率よく特 異的に増幅させることができる。 その理由は、 相同組み換えタンパク質 が、 錶型 DNAに結合することにより、 阻止的または抑制的 2次構造が解か れるためであると考えられる。
また、 上記各実施例では、 別途抽出し精製した T.th. RecAタンパク質 を反応液に加えて P CRを行っている。 しかしながら、 T.th. RecAタン パク質等を発現可能なように形質転換した大腸菌等を用意し、 これに熱 処理を行ったものを T.th. RecA夕ンパク質等として利用することもでき る。 つまり、 大腸菌等を熱処理して、 耐熱性の高い T.th. RecAタンパク 質等を残しつつ、 他のタンパク質を失活させ、 これを P CRに利用する 方法である。
特に、 大腸菌のゲノム DNAやプラスミ ド DNAを錶型 DNAとする場合には、 T.th. RecAタンパク質等を発現する大腸菌等に熱処理を行うことで、 銪 型 DNAと T.th. RecA夕ンパク質を同時に得ることができるので、 P C Rを 行うための作業効率を向上させることができる。 産業上の利用可能性
以上の説明から明らかなように本発明によれば、 P C R反応において 副産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅することができる核酸増幅 方法、 P C R反応において副産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅 することができる核酸増幅用試薬キッ ト、 P CR反応において副産物の 増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅することができることを利用して一 塩基多型を検出する一塩基多型検出方法、 及び、 P C R反応において副 産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅することができることを利用 して一塩基多型を検出するための一塩基多型検出用試薬キッ トを提供す ることができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. P CRにより核酸を増幅させる核酸増幅方法であって、
反応液中に、 サーマス ' サ一モフィルス (Thermus thermophi is に 由来する RecA夕ンパク質及びこの RecA夕ンパク質を改変したタンパク質 であってこの RecA夕ンパク質と類似する機能を有する RecA改変夕ンパク 質の少なく ともいずれかを含む相同的組換えタンパク質を混合して、 P CRを行う
ことを特徴とする核酸増幅方法。
2. P CRにより核酸を増幅させる核酸増幅方法であって、
反応液中に、鎢型 DNAに対する塩基のミスマッチが 3塩基以内のプライ マ一 DNAについてのみプライマ一伸長反応が起こる RecA夕ンパク質また はこの HecA夕ンパク質を改変した夕ンパク質であってこの RecA夕ンパク 質と類似する機能を有する RecA改変夕ンパク質の少なく ともいずれかを 含む相同的組換えタンパク質を混合して、 P CRを行う
ことを特徴とする核酸増幅方法。
3. 請求項 1または請求項 2に記載の核酸増幅方法であって、
前記反応液中に、 ATP-ァ Sを加えて、 P CRを行う
ことを特徴とする核酸増幅方法。
4.請求項 1〜請求項 3のいずれか一項に記載の核酸増幅方法であって、 銪型 DNAが阻止的または抑制的 2次 造の区域を有する
ことを特徴とする核酸増幅方法。
5.請求項 1〜請求項 4のいずれか一項に記載の核酸増幅方法であって、 前記反応液中に、 KC1を加えて、 P CRを行う
ことを特徴とする核酸増幅方法。
6.請求項 1〜請求項 5のいずれか一項に記載の核酸増幅方法であって、 前記反応液中に、 Mg2 + を加えて、 P CRを行う
■ ことを特徴とする核酸増幅方法。
7.請求項 1〜請求項 6のいずれか一項に記載の核酸増幅方法であって、 前記反応液中に、 複数セッ トのプライマー DNAを加えて、 P C Rを行う ことを特徴とする核酸増幅方法。
8 . P C Rにより核酸を増幅させるための核酸増幅用試薬キッ トであつ て、
MAポリメラ一ゼと、
4種類の dNTPと、
緩衝液と、
サーマス · サ一モフィルス ( Thermus thermophi lus の RecA夕ンパク 質及びこの RecA夕ンパク質を改変した夕ンパク質であってこの RecA夕ン パク質と類似する機能を有する RecA改変夕ンパク質の少なく ともいずれ かを含む相同的組換えタンパク質と、
を備えることを特徴とする核酸増幅用試薬キッ ト。
9 . 請求項 8に記載の核酸増幅用試薬キッ トであって、
ATP-ァ Sを備える
ことを特徴とする核酸増幅用試薬キッ 卜。
1 0 .請求項 8または請求項 9に記載の核酸増幅用試薬キッ トであって、
KC 1を備える
ことを特徴とする核酸増幅用試薬キッ ト。
1 1 . 請求項 8〜請求項 1 0のいずれか一項に記載の核酸増幅用試薬キ ヅ トであって、
Mg 2 + を備える
ことを特徴とする核酸増幅用試薬キッ ト。
1 2 . 一塩基多型を検出するための一塩基多型検出方法であって、
錡型 DNAのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマ — DNAを用い、
反応液に、 サ一マス 'サ一モフィルス ( Thermus thermophi lus ) の RecA タンパク質及びこの RecA夕ンパク質を改変したタンパク質であってこの RecA夕ンパク質と類似する機能を有する RecA改変夕ンパク質の少なく と もいずれかを含む相同的組換えタンパク質を混合して、 P C Rを行い、 所望の核酸の増幅により一塩基多型を検出する
ことを特徴とする一塩基多型検出方法。
1 3 . 請求項 1 2に記載の一塩基多型検出方法であって、
前記反応液中に、 ATP-ァ Sを加えて、 P C Rを行う
ことを特徴とする一塩基多型検出方法。
1 4 . 請求項 1 2または請求項 1 3に記載の一塩基多型検出方法であつ て、
前記反応液中に、 KC1を加えて、 P C Rを行う
ことを特徴とする一塩基多型検出方法。
1 5 . 請求項 1 2〜請求項 1 4のいずれか一項に記載の一塩基多型検出 方法であって、
前記反応液中に、 Mg2 + を加えて、 P C Rを行う
ことを特徴とする一塩基多型検出方法。
1 6 . 一塩基多型を検出するための一塩基多型検出用試薬キッ トであつ て、
DNAポリメラ一ゼと、
4種類の dNTPと、
緩衝液と、
サーマス · サーモフィルス ( The rums thermophi lus の RecA夕ンパク 質及びこの RecA夕ンパク質を改変した夕ンパク質であってこの RecA夕ン パク質と類似する機能を有する RecA改変夕ンパク質の少なく ともいずれ かを含む相同的組換えタンパク質と、
を備えることを特徴とする一塩基多型検出用試薬キッ ト。
1 7 . 請求項 1 6に記載の一塩基多型検出用試薬キッ トであって、
ATP-ァ Sを備える
ことを特徴とする一塩基多型検出用試薬キッ ト。
1 8 . 請求項 1 6 または請求項 1 7に記載の一塩基多型検出用試薬キッ トであって、
KC1を備える ことを特徴とする一塩基多型検出用試薬キッ ト。
1 9 . 請求項 1 6〜請求項 1 8のいずれか一項に記載の一塩基多型検出 用試薬キッ トであって、
Mg2 + を備える
ことを特徴とする一塩基多型検出用試薬キッ ト。
PCT/JP2003/011752 2002-09-17 2003-09-12 核酸増幅方法、核酸増幅用試薬キット、一塩基多型検出方法、及び、一塩基多型検出用試薬キット WO2004027060A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP03797599A EP1548112B1 (en) 2002-09-17 2003-09-12 Method of amplifying nucleic acid, reagent kit for amplifying nucleic acid, method of detecting single nucleotide polymorphism and reagent kit for detecting single nucleotide polymorphism
JP2004537561A JP4455335B2 (ja) 2002-09-17 2003-09-12 核酸増幅方法及び一塩基多型検出方法
DE60324819T DE60324819D1 (de) 2002-09-17 2003-09-12 Verfahren zur amplifikation von nukleinsäure, kit zur amplifikation von nukleinsäure, verfahren zum nachweis von einzelnukleotid-polymorphismus und reagentienkit zum nachweis von einzelnukleotid-polymorphismus
US11/081,949 US20050260631A1 (en) 2002-09-17 2005-03-17 Method of amplifying nucleic acids, reagent kit for amplifying nucleic acids, method of detecting single nucleotide polymorphism, and reagent kit for detecting single nucleotide polymorphism
US12/062,215 US7713700B2 (en) 2002-09-17 2008-04-03 Method of amplifying nucleic acids, reagent kit for amplifying nucleic acids, method of detecting single nucleotide polymorphism, and reagent kit for detecting single nucleotide polymorphism

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002-269645 2002-09-17
JP2002269645 2002-09-17

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US11/081,949 Continuation US20050260631A1 (en) 2002-09-17 2005-03-17 Method of amplifying nucleic acids, reagent kit for amplifying nucleic acids, method of detecting single nucleotide polymorphism, and reagent kit for detecting single nucleotide polymorphism

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004027060A1 true WO2004027060A1 (ja) 2004-04-01

Family

ID=32024815

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2003/011752 WO2004027060A1 (ja) 2002-09-17 2003-09-12 核酸増幅方法、核酸増幅用試薬キット、一塩基多型検出方法、及び、一塩基多型検出用試薬キット

Country Status (5)

Country Link
US (2) US20050260631A1 (ja)
EP (1) EP1548112B1 (ja)
JP (1) JP4455335B2 (ja)
DE (1) DE60324819D1 (ja)
WO (1) WO2004027060A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1522597A1 (en) * 2003-10-10 2005-04-13 Aisin Seiki Kabushiki Kaisha Nucleic acid amplification method
EP1674584A1 (en) * 2004-12-21 2006-06-28 Aisin Seiki Kabushiki Kaisha Activation method of protein derived from extremely thermophilic bacterium in nucleic acid amplification reaction and use thereof
JP2006325522A (ja) * 2005-05-27 2006-12-07 Aisin Seiki Co Ltd Ｄｎａポリメラーゼ伸長反応の不活性化制御用組成物、及び核酸の増幅方法。
JP2007325534A (ja) * 2006-06-07 2007-12-20 Institute Of Physical & Chemical Research ＲｅｃＡタンパク質を利用した核酸の等温増幅法
JP2008029222A (ja) * 2006-07-26 2008-02-14 Aisin Seiki Co Ltd 改変型の耐熱性ＲｅｃＡタンパク質、及び該タンパク質を用いた核酸増幅方法
WO2016013592A1 (ja) * 2014-07-24 2016-01-28 国立研究開発法人理化学研究所 改変型の耐熱性ＲｅｃＡタンパク質、該タンパク質をコードする核酸分子、該タンパク質を用いた核酸の増幅方法、及び核酸増幅用キット

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007010528A2 (en) * 2005-07-15 2007-01-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods and kits for identifying nucleic acid sequences

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991017267A1 (en) * 1990-05-07 1991-11-14 Sri International Process for nucleic acid hybridization and amplification

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5510473A (en) * 1990-11-09 1996-04-23 The United States Of American As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Cloning of the recA gene from thermus aquaticus YT-1
US6235480B1 (en) * 1998-03-13 2001-05-22 Promega Corporation Detection of nucleic acid hybrids
GB9901475D0 (en) 1999-01-22 1999-03-17 Pyrosequencing Ab A method of DNA sequencing
JP2005110621A (ja) * 2003-10-10 2005-04-28 Aisin Seiki Co Ltd 核酸増幅方法及び核酸増幅用試薬キット

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991017267A1 (en) * 1990-05-07 1991-11-14 Sri International Process for nucleic acid hybridization and amplification

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KATO R. ET AL.: "Observation of RecA protein monomer by small angle X-ray scattering with synchrotron radiation", FEBS LETTERS, vol. 482, 2000, pages 159 - 162, XP004337639 *
See also references of EP1548112A4 *
WETMUR J. G. ET AL.: "Cloning, sequencing, and expression of RecA proteins from three distently related thermophilic eubacteria", J. BIOL. CHEM., vol. 269, October 1994 (1994-10-01), pages 25928 - 25935, XP000604933 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1522597A1 (en) * 2003-10-10 2005-04-13 Aisin Seiki Kabushiki Kaisha Nucleic acid amplification method
EP1674584A1 (en) * 2004-12-21 2006-06-28 Aisin Seiki Kabushiki Kaisha Activation method of protein derived from extremely thermophilic bacterium in nucleic acid amplification reaction and use thereof
JP2006174722A (ja) * 2004-12-21 2006-07-06 Aisin Seiki Co Ltd 核酸増幅反応における高度好熱菌由来タンパク質の活性化方法およびその利用
US7662593B2 (en) 2004-12-21 2010-02-16 Aisin Seiki Kabushiki Kaisha Activation method of protein derived from extremely thermophilic bacterium in nucleic acid amplification reaction and use thereof
JP4534138B2 (ja) * 2004-12-21 2010-09-01 アイシン精機株式会社 核酸増幅反応における高度好熱菌由来タンパク質の活性化方法およびその利用
JP2006325522A (ja) * 2005-05-27 2006-12-07 Aisin Seiki Co Ltd Ｄｎａポリメラーゼ伸長反応の不活性化制御用組成物、及び核酸の増幅方法。
JP2007325534A (ja) * 2006-06-07 2007-12-20 Institute Of Physical & Chemical Research ＲｅｃＡタンパク質を利用した核酸の等温増幅法
JP2008029222A (ja) * 2006-07-26 2008-02-14 Aisin Seiki Co Ltd 改変型の耐熱性ＲｅｃＡタンパク質、及び該タンパク質を用いた核酸増幅方法
WO2016013592A1 (ja) * 2014-07-24 2016-01-28 国立研究開発法人理化学研究所 改変型の耐熱性ＲｅｃＡタンパク質、該タンパク質をコードする核酸分子、該タンパク質を用いた核酸の増幅方法、及び核酸増幅用キット
JP2016023179A (ja) * 2014-07-24 2016-02-08 アイシン精機株式会社 改変型の耐熱性ＲｅｃＡタンパク質、該タンパク質をコードする核酸分子、該タンパク質を用いた核酸の増幅方法、及び核酸増幅用キット

Also Published As

Publication number Publication date
EP1548112A1 (en) 2005-06-29
EP1548112B1 (en) 2008-11-19
JPWO2004027060A1 (ja) 2006-03-30
EP1548112A4 (en) 2005-11-09
DE60324819D1 (de) 2009-01-02
JP4455335B2 (ja) 2010-04-21
US7713700B2 (en) 2010-05-11
US20050260631A1 (en) 2005-11-24
US20080206775A1 (en) 2008-08-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7322063B2 (ja) 新規なプライマーおよびその使用
EP2031058B1 (en) Method of synthesizing polynucleotide
US10138518B2 (en) Annealing control primer and its uses
AU2002329104B2 (en) Annealing control primer and its uses
EP2069540B1 (en) Methods for amplifying and detecting nucleic acid sequences
JP4263612B2 (ja) アニーリング調節プライマーおよびその使用
JP5702148B2 (ja) １ステップｒｔ−ｐｃｒの阻害低減
US7713700B2 (en) Method of amplifying nucleic acids, reagent kit for amplifying nucleic acids, method of detecting single nucleotide polymorphism, and reagent kit for detecting single nucleotide polymorphism
WO2007123742A2 (en) Methods and compositions for increasing the fidelity of multiplex nucleic acid assembly
JP2005511096A6 (ja) アニーリング調節プライマーおよびその使用
JP4249186B2 (ja) 核酸の増幅方法
KR101557975B1 (ko) 염기 특이 반응성 프라이머를 이용한 핵산 증폭방법
EP1522597A1 (en) Nucleic acid amplification method
JP2013509885A (ja) 熱安定性ポリメラーゼとともに二本鎖核酸複合体を用いてデオキシリボヌクレオチド鎖を合成するための組成物および方法
Broude et al. High Multiplexity PCR Based on PCR Suppression
WO2006051988A1 (ja) 核酸の増幅方法
WO2005045073A1 (en) Method for amplifying unknown dna sequence adjacent to known sequence
WO2004063373A1 (en) Dna size markers and method for preparing them
JP2004141105A (ja) Ｄｎａ合成反応を促進する方法、およびそのための組成物
JP4793842B2 (ja) ランダムｒｎａプライマーを用いたｄｎａの増幅方法
JP2005261255A (ja) 核酸増幅方法
JP2007330101A (ja) 核酸の増幅方法

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004537561

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11081949

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003797599

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003797599

Country of ref document: EP