JP2016023179A - 改変型の耐熱性RecAタンパク質、該タンパク質をコードする核酸分子、該タンパク質を用いた核酸の増幅方法、及び核酸増幅用キット - Google Patents
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Abstract
Description
(1)配列番号1〜4の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質
(2)配列番号1〜4の何れかのアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、かつ、前記配列番号1〜4の何れかのアミノ酸配列の202番目に相当する位置のアミノ酸がトリプトファンであるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、核酸増幅反応系において、配列番号6、8、10、又は12のアミノ酸配列からなる野生型の耐熱性RecAタンパク質に比べて、鋳型核酸に対するプライマーのミスアニーリングを低減させる機能を有するタンパク質
(3)配列番号1〜4の何れかのアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有し、かつ、前記配列番号1〜4の何れかのアミノ酸配列の202番目に相当する位置のアミノ酸がトリプトファンであるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、核酸増幅反応系において、配列番号6、8、10、又は12のアミノ酸配列からなる野生型の耐熱性RecAタンパク質に比べて、鋳型核酸に対するプライマーのミスアニーリングを低減させる機能を有するタンパク質
〔2〕野生型の耐熱性RecAタンパク質が、サーマス(Thermus)属細菌に由来する上記〔1〕の改変型の耐熱性RecAタンパク質。
〔3〕野生型の耐熱性RecAタンパク質が、サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)、又はサーマス・アクアティカス(Thermus aquaticus)に由来する上記〔1〕又は〔2〕の改変型の耐熱性RecAタンパク質。
〔4〕配列番号1〜3の何れかのアミノ酸配列からなる上記〔1〕〜〔3〕の何れかの改変型の耐熱性RecAタンパク質。
〔5〕配列番号4のアミノ酸配列からなる上記〔1〕〜〔3〕の何れかの改変型の耐熱性RecAタンパク質。
〔8〕前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応に基づく反応である上記〔7〕の核酸増幅方法。
前記野生型の耐熱性RecAタンパク質において、野生型の耐熱性RecAタンパク質の配列番号6、8、10、又は12のアミノ酸配列の202番目に相当する位置のアミノ酸をトリプトファンに置換する工程を有し、
ここで、前記野生型の耐熱性RecAタンパク質は、以下の(4)〜(6)のタンパク質から選択される、方法。
(4)配列番号6、8、10、又は12の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質
(5)配列番号6、8、10、又は12の何れかのアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(6)配列番号6、8、10、又は12の何れかのアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
〔11〕さらに、配列番号13のアミノ酸配列からなるC末端切断型の耐熱性RecAタンパク質に比べて、核酸増幅反応系において鋳型核酸に対するプライマーのミスアニーリングを低減させる上記〔10〕の方法。
〔12〕さらに、前記タンパク質が、配列番号13のアミノ酸配列からなるC末端切断型の耐熱性RecAタンパク質に比べて、鋳型核酸に対する増幅阻害を低減させる上記〔10〕又は〔11〕の方法。
〔13〕さらに、配列番号6、8、10、又は12のアミノ酸配列からなる野生型の耐熱性RecAタンパク質に比べて、相同組換え活性を増強させる上記〔10〕〜〔12〕の何れかの方法。
(1)相補的配列へのペアリング(相同対合)
(2)鎖交換
したがって、上記(1)及び(2)の双方のステージが円滑に進むことにより、相同組換え活性を増強させ、増幅反応におけるミスアニーリングを低減させることができる。つまり、相補的配列へのペアリングの後、ペアリングに間違いがあれば外れなければならない。これにより、増幅反応におけるミスアニーリングを防ぐことができる。例えば、以下で説明するPCR等においては、一本鎖DNAが相補的な二本鎖DNAにペアリングした後、鎖交換と共に一本鎖DNAは二本鎖DNAから外れていくことなる。上記Hyper-TthRecA変異体は、下記実施例3で確認した通り、上記(1)の活性のみ高い。そのため、二本鎖DNAへの一本鎖DNAのペアリングは円滑に進行するが、鎖交換反応の活性の向上が認められないために、一本鎖DNA及び当該タンパク質が二本鎖DNAから外れにくくなる傾向があり、ペアリングに間違いがあったとしてもその傾向が変わらない。一方、本発明の改変型の耐熱性RecAタンパク質は、上記(1)及び(2)の双方ステージの面から相同組換え活性を増強できることから、増幅反応におけるミスアニーリングを低減させることができる。
(1)鋳型核酸の熱変性
(2)プライマーのアニーリング
(3)耐熱性ポリメラーゼによる伸長反応
(1)鋳型核酸の熱変性
二本鎖核酸を加熱により、変性させ一本鎖に解離させる。好ましくは、92〜98℃で10〜60秒行われる。また、長いDNA領域を増幅する場合には、鋳型DNAの分解を防止するため、一番初めの熱変性のみを低温度(例えば、92℃程度)に設定することができる。
温度を下げることにより、上述の(1)において熱変性され一本鎖となった鋳型核酸とプライマーとのハイブリッドを形成する。アニーリングは、好ましくは30〜60秒間行われる。また、アニーリング温度はプライマーに用いるオリゴヌクレオチドのTmを推定し、このTmをアニーリング温度として設定することが好ましい。アニーリング温度が高いとプライマーの鋳型特異的な結合能が向上するが、アニーリング温度が高すぎるとプライマーが鋳型核酸に結合しなくなることが知られている。通常は、50〜70℃で行われる。
耐熱性ポリメラーゼによりプライマーからの核酸鎖の伸長反応が3´末端において行われる。伸長反応温度は、耐熱性ポリメラーゼの種類に応じて、適宜設定されるものであるが、65〜75℃で行うことが好ましい。また、伸長時間は、標的配列が1kb以下のときは1分程度で十分であり、それより長い場合には、1kbにつき1分の割合で長くすることが好ましい。
本発明は、タンパク質の鋳型核酸に対するプライマーのミスアニーリングを野生型の耐熱性RecAタンパク質に比べて低減させる方法を提供できる。そして、当該方法は以下の工程を有して構成される。
前記野生型の耐熱性RecAタンパク質において、野生型の耐熱性RecAタンパク質の配列番号6、8、10、又は12のアミノ酸配列の202番目に相当する位置のアミノ酸を他のアミノ酸に置換する工程。
1.本発明の改変型の耐熱性RecAタンパク質は、DNAライブラリーからの標的cDNAクローンの濃縮又は単離に適用することができる。
詳細には、濃縮又は単離を所望する標的cDNAの一部の配列をプライマーとして使用し、DNAライブラリーを鋳型として増幅反応を行う際に、本発明の改変型の耐熱性RecAタンパク質を適用できる。ここで、増幅反応に際しては、PCR他、公知の核酸増幅反応系等を利用することが可能である。これにより、標的cDNAと関連のない非特異的な増幅を抑制でき、標的cDNAのみを特異的に増幅可能となる。したがって、本発明の改変型の耐熱性RecAタンパク質の、DNAライブラリーからの標的DNAクローンのクローニング系への適用により、所望の標的cDNAクローンを特異的、かつ、効率的に濃縮、単離することが可能となる。特異的かつ効率的なcDNAクローニングは、遺伝子発現、発生、分化等の解析、並びに有用物質の産生の分野において大いに貢献し得る。
詳細には、逆転写酵素の存在下、ランダムへキサマープライマー、オリゴdTプライマー、標的遺伝子特異的プライマーを用いて、逆転写反応によりRNAからのcDNAの合成反応を行う際に本発明の改変型の耐熱性RecAタンパク質を適用することができる。更には、合成されたcDNAを鋳型として増幅反応を行う際にも適用することができる。ここで、増幅反応に際しては、PCRの他、公知の核酸増幅技術を利用することが可能である。これにより、標的RNAに関連のない非特異的なcDNAの合成を抑制でき、所望の標的RNAに対するcDNAの特異的な合成が可能となる。したがって、本発明の改変型の耐熱性RecAタンパク質の逆転写反応系への適用により、所望の標的RNAに対するcDNAを特異的、かつ、効率的に合成することが可能となる。RNAからcDNAへの変換は遺伝子工学上不可欠な手法であることから、遺伝子発現検出とその定量、RNAの構造解析、cDNAクローニング等、その利用価値は高い。
TthRecAタンパク質が、核酸増幅反応に与える影響について、好熱菌由来でない他のDNA結合タンパク質である大腸菌由来の一本鎖結合タンパク質(以下、「SSBタンパク質」と称する場合がある)と大腸菌由来RecAタンパク質を添加した場合とを比較した。
PCR反応液(25μl)は、鋳型核酸として0.8〜50 ngヒトゲノムDNA(Promega、 Human Genomic DNA)、0.4μg野生型TthRecAタンパク質(Storage buffer : 50 mM Tris-HCl pH7.5, 1.0 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 50% w/v グリセロール)、0.8 μMプライマー、2.0 U DNA ポリメラーゼ(Takara-Bio, rTaq DNA polymerase),0.2 mM dNTPs混合液、10 mM Tris-HCl pH8.3,50 mM KCl,1.5 mM MgCl2に混合することにより調製した。なお、鋳型核酸量は、50 ng、25 ng、13 ng、6 ng、3 ng、1.5 ng、及び0.8 ngとし、増幅産物量を比較した。
プライマーセットa:
5'−aacct cacaa ccttg gctga−3'(配列番号14)
5'−ttcac aactt aagat ttggc−3'(配列番号15)
結果を図1に示す。
図1のA〜Cは、電気泳動結果を示す図であり、Aは、野生型TthRecAタンパク質存在下での増幅結果、Bは、大腸菌由来SSBタンパク質存在下での増幅結果、Cは、大腸菌由来RecAタンパク質存在下での増幅結果である。そして、A〜Cのレーン1〜7は、夫々、鋳型核酸量50 ng、25 ng、13 ng、6 ng、3 ng、1.5 ng、0.8 ngでの結果である。
野生型TthRecAタンパク質のアミノ酸配列の202番目のチロシンを、トリプトファンに置換した変異体を調製した。そして、この変異体を「TthRecA-Y202W変異体」と命名した。
(1)遺伝子クローニング
野生型TthRecAタンパク質をコードする遺伝子の既知の配列情報(GenBank:BAA04215.1)に基づいて、以下のプライマーセットbを合成した。これは、野生型TthRecAタンパク質のアミノ酸配列(配列番号6)の202番目のチロシンを、トリプトファンに置換させるために設計されたプライマーである。
プライマーセットb:
5'−aaggt ggggg tcacg tgggg caacc ccgag acca−3'(配列番号16)
5'−tggtc tcggg gttgc cccac gtgac cccca cctt−3'(配列番号17)
て30秒、55℃にて60秒、68℃にて6 分の反応を1サイクルとした18サイクルの増幅反応を行った。
(1)で得たTthRecA-Y202W発現クローンを、100μg/mlのアンピシリンを含むLB液体培地中で37℃にてOD600 = 0.5まで培養した。さらに、0.5 mM IPTGを添加して4時間培養した後、遠心分離(6,000x g、15分)してタンパク質発現菌体を得た。TthRecA-Y202W変異体の精製は、集菌し凍結させたタンパク質発現菌体(2 g)を緩衝液(20 ml)(50 mM Tris-HCl pH8.0、25 % Sucroseを、5 mM 2-メルカプトエタノール、0.4 % ポリオキシエチレンセチルエーテル)に懸濁した。続いて、超音波処理にて菌体を破砕し、EDTA(終濃度5mM)、KCl(終濃度2M)を混合した後、遠心分離(4℃、60,000x g、60分)して上清を分取した。次に、熱処理(65℃、1時間)して急冷(0℃、10分)後、遠心分離(4℃、60,000x g、20分)して上清を分取した。上清を、疎水クロマトグラフィーカラム(東ソー、Butyl Toyopearl 650M)に供した。カラムの平衡化緩衝液(PEMG2K)は、50 mMリン酸カリウムpH6.5(200 ml)、1 mM EDTA、5 mM 2-メルカプトエタノール, 10 % グリセロール、2 M KClを使用した。PEM2K緩衝液(100 ml)で洗浄した後、緩衝液(PEMG : 50 mM リン酸カリウム pH6.5, 1 mM EDTA, 5 mM 2-メルカプトエタノール、10 % グリセロール)を用いてグラジエントをかけてタンパク質の溶出画分を分取した。次に、PEMG緩衝液を外液として透析を行った後、PEMG緩衝液(30 ml)にて平衡化した陽イオン交換リン酸セルロースクロマトグラフィーカラム(ワットマン、P11)に供した。PEMG緩衝液(50 ml)で洗浄した後、緩衝液(PEMG1K : 50 mM リン酸カリウム pH6.5(30 ml)、1 mM EDTA、5 mM 2-メルカプトエタノール、10 % グリセロール、1 M KCl)を用いてグラジエントをかけてタンパク質の溶出画分を分取した。次に、PEMG緩衝液を外液として透析を行った後、陰イオン交換セルロースクロマトグラフィーカラム(GE、Resource Q)に供した。カラムの平衡化緩衝液はPEMG(20 ml)を使用した。PEMG緩衝液(30 ml)で洗浄した後、PEMG1K緩衝液(60 ml)を用いてグラジエントをかけてタンパク質の溶出画分を分取した。最後に、TEDG(20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.1 mM DTT, 50% glycerol)緩衝液を外液として透析を行った。
結果を図2に示す。
図2は、電気泳動結果を示す図であり、レーン1は野生型TthRecAタンパク質、レーン2はTthRecA-Y202W変異体、レーン3は野生型TaqRecAタンパク質、レーン4はHyper-TthRecA変異体の電気泳動結果である。
実施例2で取得したTthRecA-Y202W変異体の相同組換え活性を、D-Loop形成反応により野生型TthRecAタンパク質、及びHyper-TthRecA変異体と比較検討することにより確認した。
二本鎖DNAとしてpBluescript SK(-) DNA(Novagen)を用い、その部分配列を有する90 merのオリゴヌクレオチド(5'- AAATC AATCT AAAGT ATATA TGAGT AAACT TGGTC TGACA GTTAC CAATG CTTAA TCAGT GAGGC ACCTA TCTCA GCGAT CTGTC TATTT -3'(配列番号18))を一本鎖DNAとして用いた。18μM 二本鎖DNA、0.05μM 一本鎖DNA (33Pで5'末端標識)、3.0μg TthRecA-Y202W変異体、1.3 mM ATPを、反応緩衝液(31 mM Tris-HCl pH7.5, 1.75 mM DTT、 0.09 mg/ml BSA、13 mM MgCl2、4.9 mM CP(クレアチンホスフェート)、7.8 U/μl CK(クレアチンキナーゼ))中で、37℃で0〜20分間保温した。反応後に、反応停止液(0.5% w/vol SDS、0.7 mg/ml Proteinase K)を加えて0℃で30 分間保温した。次に、反応液を1 %アガロースゲル電気泳動(泳動緩衝液: 0.5x TBE)した後、ゲルを乾燥させてRIイメージングアナライザー BAS2500 (富士フィルム)でシグナル検出した。
結果を図3、及び図4に示す。
図3は、電気泳動結果を示す図であり、A、B、及びCにおいて、矢印によりD-Loop生成物のバンドを示す。そして、Aは、野生型TthRecAタンパク質、Bは、TthRecA-Y202W変異体、Cは、Hyper-TthRecA変異体の相同組換え活性をD-Loop形成反応により確認したものである。そして、A〜Cのレーン1〜8は、夫々、0、0.5、1、1.5、2.5、5、10、及び20分間でのD-Loop形成反応の結果である。
実施例2で取得したTthRecA-Y202W変異体の相同組換え活性を、上述の実施例3に続いてD-Loop形成反応により野生型TthRecAタンパク質、及びHyper-TthRecA変異体と比較検討することにより確認した。本実施例では、野生型TthRecAタンパク質のアミノ酸配列の202番目のチロシンを、トリプトファンではなくアラニンに置換した変異体を調製し、これについてもD-Loop形成能を比較検討した。なお、この変異体を「TthRecA-Y202A変異体」と命名した。
二本鎖DNA及び一本鎖DNAは実施例3と同じものを使用した。15.5μM 二本鎖DNA、0.04μM 一本鎖DNA (33Pで5'末端標識)、3.0μg TthRecA-Y202W変異体、1.1 mM ATPを、反応緩衝液(25 mM Tris-HCl pH7.5、1.46 mM DTT、0.08 mg/ml BSA、10.9 mM MgCl2、4.1 mM CP(クレアチンホスフェート)、 6.5 U/μl CK(クレアチンキナーゼ))中で、55℃で0〜20分間保温した。反応後に、反応停止液(0.5 % w/vol SDS, 0.7 mg/ml Proteinase K)を加えて0℃で30分間保温した。次に、反応液を1 %アガロースゲル電気泳動(泳動緩衝液: 0.5x TBE)した後、ゲルを乾燥させてイメージングアナライザー(富士フィルム、BAS2500)でシグナル検出した。
プライマーセット:
5'- gaagg tgggg gtcac ggccg gcaac cccga gacc -3'(配列番号19)
5'- ggtct cgggg ttgcc ggccg tgacc cccac cttc -3'(配列番号20)
結果を図5に示す。
図5は、図4と同様にして、野生型TthRecAタンパク質、TthRecA-Y202W変異体、及びTthRecA-Y202A変異体の相同組換え活性をグラフにまとめたものであり、横軸は反応時間(分)、縦軸はD-Loop形成率(%)を示す。
実施例2で取得したTthRecA-Y202W変異体の相同組換え活性を、ATPase活性測定により野生型TthRecAタンパク質、及びHyper-TthRecA変異体と比較検討することにより確認した。
二本鎖DNAとしてpBluescript SK(-) DNA(Novagen)と、一本鎖DNAとしてM13 ssDNA (TAKARA)を用いた。22.6μM 二本鎖DNAまたは一本鎖DNA、3.0μg TthRecA-Y202W変異体、1.3 mM [α-32P] ATPを、反応緩衝液(31 mM Tris-HCl pH7.5, 1.75 mM DTT、0.09 mg/ml BSA、MgCl2を13 mM(一本鎖DNA)若しくは1 mM(二本鎖DNA)、4.9 mM CP(クレアチンホスフェート)、7.8U/μl CK(クレアチンキナーゼ))中で、55℃で30分間保温した。反応後に、等量の25mM EDTAを加え反応を停止した。反応停止後、サンプルを薄層クロマトグラフィーでATPとADPに分離した。分離後、Imaging Plate(IP)に一晩以上感光させ、RIイメージングアナライザー BAS2500 (富士フィルム)でATPと生成されたADPのシグナルを検出した。
結果を図6、及び7に示す。
図6、及び7は、野生型TthRecAタンパク質、TthRecA-Y202W変異体、及びHyper-TthRecA変異体のATPase活性を示すグラフであり、縦軸はADPの生成率(%)を示す。そして、図6は、一本鎖DNA依存的ATPase活性を、図7は、二本鎖DNA依存的ATPase活性を示す。
実施例2で取得したTthRecA-Y202W変異体が、核酸増幅精度に与える影響を、野生型TthRecAタンパク質と比較検討した。具体的には、プライマーと鋳型核酸の1〜5塩基のミスマッチを含むプライマーを使用したPCRにおける増幅産物量を比較することにより行った。
PCR反応液(25 μl)は、鋳型核酸として実施例1のヒトゲノムDNAを25 ng、野生型TthRecAタンパク質を0.5μg、プライマーを0.2 μM(最終濃度)、DNA ポリメラーゼ(Takara-Bio、Premix Taq Version 2.0) (当該PCR試薬キットの標準濃度)に混合することにより調製した。
プライマーセットc(ミスマッチの塩基数0):
5'- gccta aggtc acgtt gtccc-3’(配列番号21)
5'- gcagg cacca agaac tactg c-3’(配列番号22)
プライマーセットd(ミスマッチの塩基数1):
5'- gccta aggtc acgtt gtccc-3’(配列番号21)
5'- gcagg cacca Ggaac tactg c-3’(配列番号23)
プライマーセットe(ミスマッチの塩基数5):
5'- gccta aggtc acgtt gtccc-3’(配列番号21)
5'- gcGgg cGcca GgaaG tacGg c-3’(配列番号24)
結果を図8に示す。
図8は、電気泳動結果を示す図であり、Aは、コントロール、Bは、TthRecA-Y202W変異体存在下での増幅結果、Cは、野生型TthRecAタンパク質の存在下での増幅結果である。そして、A〜Cのレーン1〜3は、夫々、プライマーセットc、d、eでの増幅結果である。
TthRecA-Y202W変異体が、核酸の増幅精度に与える影響を、野生型TaqRecAタンパク質と比較検討した。具体的には、プライマーと鋳型核酸の1塩基のミスマッチを含むプライマーを使用したPCRにおける増幅産物量を比較することにより行った。
PCR反応液(25 μl)は、鋳型核酸として実施例1のヒトゲノムDNAを25 ng、TthRecA-Y202W変異体を0.5μg,プライマーを0.2 μM(final濃度)、DNA ポリメラーゼ(Takara-Bio, Premix Taq Version 2.0) (当該PCR試薬キットの標準濃度)に混合することにより調製した。
プライマーセットf(ミスマッチの塩基数0):
5’-gccta aggtc acgtt gtccc-3’(配列番号25)
5'- gcagg cacca agaac tactgc-3’(配列番号26)
プライマーセットg(ミスマッチの塩基数1):
5’-gccta aggtc acgtt gtccc-3’(配列番号25)
5'- gcagg cacca Ggaac tactgc-3’(配列番号27)
結果を図9に示す。
図9は、電気泳動結果を示す図であり、Aは、コントロール、Bは、TthRecA-Y202W変異体存在下での増幅結果、Cは、野生型TthRecAタンパク質の存在下での増幅結果、Dは、野生型TaqRecAタンパク質の存在下での増幅結果を示す。そして、A〜Dのレーン1及び2は、夫々、プライマーセットf及びgでの増幅結果である。
実施例2で取得したTthRecA-Y202W変異体が、核酸の増幅精度に与える影響を、野生型TthRecAタンパク質、野生型TaqRecAタンパク質、Hyper-TthRecA変異体と比較した。プライマーと鋳型核酸の1塩基のミスマッチを含むプライマーを使用したPCRにおける増幅産物量を比較することにより行った。
PCR反応液(25 μl)は、鋳型核酸として実施例1のヒトゲノムDNAを25 ng、TthRecA-Y202W変異体を0.5μg,プライマーを0.2 μM(最終濃度)、DNAポリメラーゼ(Takara-Bio, Premix Taq Version 2.0) (当該PCR試薬キットの標準濃度)に混合することにより調製した。
プライマーセットh(ミスマッチの塩基数0):
5’-gccta aggtc acgtt gtccc-3’(配列番号28)
5'- gcagg cacca agaac tactgc-3’(配列番号29)
プライマーセットi(ミスマッチの塩基数1):
5’-gccta aggtc acgtt gtccc-3’(配列番号28)
5'- gcagg cacca Ggaac tactgc-3’(配列番号30)
結果を図10に示す。
図10は、電気泳動結果を示す図であり、Aは、プライマーセットhでの増幅結果、Bは、プライマーセットiでの増幅結果を示す。そして、A及びBのレーン1〜4は、夫々、野生型TthRecAタンパク質、TthRecA-Y202W変異体、野生型TaqRecAタンパク質、Hyper-TthRecA変異体の存在下の結果を示す。
上述の実施例6〜8の結果により、TthRecA-Y202W変異体が、核酸の増幅精度を向上させることは確認できた。次に、PCRサイクルの経過に伴う当該効果の持続性について調べた。具体的には、プライマーと鋳型核酸の1塩基のミスマッチを含むプライマーを使用したPCRにおける増幅産物量を指標にして、PCRのサイクルを30回と35回で比較することにより行った。
PCR反応液(25 μl)は、鋳型核酸として実施例1のヒトゲノムDNAを25 ng、TthRecA-Y202W変異体を0.5μg、プライマーを各0.2 μM(最終濃度)、DNA ポリメラーゼ(Takara-Bio, Premix Taq Version 2.0) (当該PCR試薬キットの標準濃度)に混合することにより調製した。
プライマーセットj(ミスマッチの塩基数1):
5’-gccta aggtc acgtt gtccc-3’(配列番号31)
5'- gcagg cacca Ggaac tactgc-3’(配列番号32)
結果を図11に示す。
図11は、電気泳動結果を示す図であり、Aは、30サイクルの増幅結果、Bは、35サイクルの増幅結果を示す。そして、A及びBのレーン1〜3は、夫々、コントロール、野生型TthRecAタンパク質、TthRecA-Y202W変異体存在下での結果である。
Claims (13)
- 以下の(1)〜(3)のタンパク質から選択される改変型の耐熱性RecAタンパク質。
(1)配列番号1〜4の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質
(2)配列番号1〜4の何れかのアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、かつ、前記配列番号1〜4の何れかのアミノ酸配列の202番目に相当する位置のアミノ酸がトリプトファンであるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、核酸増幅反応系において、配列番号6、8、10、又は12のアミノ酸配列からなる野生型の耐熱性RecAタンパク質に比べて、鋳型核酸に対するプライマーのミスアニーリングを低減させる機能を有するタンパク質
(3)配列番号1〜4の何れかのアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、かつ、前記配列番号1〜4の何れかのアミノ酸配列の202番目に相当する位置のアミノ酸がトリプトファンであるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、核酸増幅反応系において、配列番号6、8、10、又は12のアミノ酸配列からなる野生型の耐熱性RecAタンパク質に比べて、鋳型核酸に対するプライマーのミスアニーリングを低減させる機能を有するタンパク質 - 前記野生型の耐熱性RecAタンパク質が、サーマス(Thermus)属細菌に由来する請求項1に記載の改変型の耐熱性RecAタンパク質。
- 前記野生型の耐熱性RecAタンパク質が、サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)、又は、サーマス・アクアティカス(Thermus aquaticus)に由来する請求項1又は2に記載の改変型の耐熱性RecAタンパク質。
- 配列番号1〜3の何れかのアミノ酸配列からなる請求項1〜3の何れか一項に記載の改変型の耐熱性RecAタンパク質。
- 配列番号4のアミノ酸配列からなる請求項1〜3の何れか一項に記載の改変型の耐熱性RecAタンパク質。
- 請求項1〜5の何れか一項に記載の改変型の耐熱性RecAタンパク質をコードする核酸分子。
- 請求項1〜5の何れか一項に記載の改変型の耐熱性RecAタンパク質を添加して核酸の増幅反応を行う核酸増幅方法。
- 前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応に基づく反応である請求項7に記載の核酸増幅方法。
- 耐熱性DNAポリメラーゼ、と
請求項1〜5の何れか一項に記載の改変型の耐熱性RecAタンパク質、とを含む核酸を増幅するための核酸増幅用キット。 - タンパク質の鋳型核酸に対するプライマーのミスアニーリングを野生型の耐熱性RecAタンパク質に比べて低減させる方法であって、
前記野生型の耐熱性RecAタンパク質において、野生型の耐熱性RecAタンパク質の配列番号6、8、10、又は12のアミノ酸配列の202番目に相当する位置のアミノ酸をトリプトファンに置換する工程を有し、
ここで、前記野生型の耐熱性RecAタンパク質は、以下の(4)〜(6)のタンパク質から選択される、方法。
(4)配列番号6、8、10、又は12の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質
(5)配列番号6、8、10、又は12の何れかのアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(6)配列番号6、8、10、又は12の何れかのアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。 - さらに、配列番号13のアミノ酸配列からなるC末端切断型の耐熱性RecAタンパク質に比べて、核酸増幅反応系において鋳型核酸に対するプライマーのミスアニーリングを低減させる請求項10に記載の方法。
- さらに、前記タンパク質が、配列番号13のアミノ酸配列からなるC末端切断型の耐熱性RecAタンパク質に比べて、鋳型核酸に対する増幅阻害を低減させる請求項10又は11に記載の方法。
- さらに、配列番号6、8、10、又は12のアミノ酸配列からなる野生型の耐熱性RecAタンパク質に比べて、相同組換え活性を増強させる請求項10〜12の何れか一項に記載の方法。
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