JP4450644B2

JP4450644B2 - Ａｍｆ類を有効成分とする医薬製剤

Info

Publication number: JP4450644B2
Application number: JP2004058842A
Authority: JP
Inventors: 龍善船坂; 新世羽賀; 久光永瀬
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 2003-03-03
Filing date: 2004-03-03
Publication date: 2010-04-14
Anticipated expiration: 2024-03-03
Also published as: JP2004285057A

Description

本発明は、ＡＭＦ（ＡｕｔｏｃｒｉｎｅＭｏｔｉｌｉｔｙＦａｃｔｏｒ：自己分泌（型）運動（性）因子）類を含有する癌の増殖・転移・進展・播種の阻止又は予防、腹水の貯留抑制等に用いられる医薬製剤に関するものである。

癌細胞の運動は、転移等に深く関与する。癌細胞の運動には、原発腫瘍から隣接組織への浸潤、血管・リンパ管を通して循環することによる細胞の移動、転移部位への脈管からの遊走等がある。これらの事象に重要な働きをしている因子としては、補体、生理活性ペプチド、癌細胞によって分解されたラミニンやコラーゲンペプチド、癌細胞自身が分泌する自己分泌因子であるＡＭＦ等が挙げられる。

ＡＭＦは様々な癌に対して５０ｐｇ／ｍｌ程度の極低濃度で癌細胞の運動を刺激し、又、癌細胞からは同程度のわずかな量が分泌されている。渡辺らはヒト由来のこのタンパク質を精製し、アミノ酸配列からリンホカインの１種であるニューロロイキンと同一のタンパク質であると報告している。さらに、このタンパク質は生物の代謝経路である解糖系で重要な酵素であるヘキソース−６−リン酸イソメラーゼ（ＰＨＩ）と極めて高い相同性を示し、ほぼ同一のタンパク質と認められ、精製したタンパク質（ＡＭＦ）がＰＨＩ活性を示すことを報告している。（特許文献１、非特許文献１及び２参照）

又、特許文献１にはヘキソース−６−リン酸イソメラーゼの阻害剤が癌細胞の転移を抑制する作用について記載があるが、ｉｎｖｉｖｏ系での開示はなく、更に、腫瘍の増殖阻害に基づきＡＭＦを抗癌剤としての使用することについては示されていない。

現在までのところ、正常な細胞からＡＭＦが分泌されているという報告はなく、又、この分子には分泌シグナルペプチドが存在せず、ゴルジ体を介した分泌機構でもないと報告されており（非特許文献２参照）、どのように癌細胞から分泌されるのか、その機構は不明である。

船坂らは、非特許文献３にマウスのリコンビナントＡＭＦ（以下ｍｒＡＭＦと記す）をマウス皮内に局所投与すると、その部位の血管透過性が亢進すること等を報告している。

渡辺らは、ＰＨＩ活性を阻害する低分子化合物であるエリスリトール−４−リン酸によってｉｎｖｉｔｒｏでＡＭＦ分泌癌細胞の運動を抑制しうることを報告している。（非特許文献１参照）

又、リオッタらはヒトの癌由来の精製ＡＭＦをウサギ又はマウスに投与し得られるポリクローナル抗体によりｉｎｖｉｔｒｏで癌細胞の運動を抑制することを報告している。（非特許文献４参照）

一方、田中らはＡＭＦとエリスリトール−４−リン酸との複合体についてＸ線結晶構造解析を行い、アミノ酸１０７〜２８７までのＳｍａｌｌＤｏｍａｉｎがＡＭＦ活性に関与すると推定しているが、実際にこのアミノ酸部分がＡＭＦ活性を有するかどうかについては示されていない。（非特許文献５参照）

特開平８−２４５３９７号公報Ｈ．Ｗａｔａｎａｂｅ他、Ｔｕｍｏｒｃｅｌｌａｕｔｏｃｒｉｎｅｍｏｔｉｌｉｔｙｆａｃｔｏｒｉｓｔｈｅｎｅｕｒｏｌｅｕｋｉｎ／ｐｈｏｓｐｈｏｈｅｘｏｓｅｉｓｏｍｅｒａｓｅｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、第５６巻、第１３号、ｐ２９６０−２９６３（１９９６）Ｙ．Ｎｉｉｎａｋａ他、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆｎｅｕｒｏｌｅｕｋｉｎ／ｐｈｏｓｐｈｏｈｅｘｏｓｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ／ｍａｔｕｒａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒａｓａｕｔｏｃｒｉｎｅｍｏｔｉｌｉｔｙｆａｃｔｏｒｂｙｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、第５８巻、第１２号、ｐ２６６７−２６７４（１９９８）Ｔ．Ｆｕｎａｓａｋａ他、Ｔｕｍｏｒａｕｔｏｃｒｉｎｅｍｏｔｉｌｉｔｙｆａｃｔｏｒｉｎｄｕｃｅｓｈｙｐｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｏｆｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌａｎｄｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｌｅａｄｉｎｇｔｏａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆａｓｃｉｔｅｓｆｌｕｉｄ、ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、第２９３巻、第１号、ｐ１９２−２００（２００２）Ｒ．Ｇｕｉｒｇｕｉｓ他、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄｐｓｅｕｄｏｐｏｄｉａｌｐｒｏｔｒｕｓｉｏｎｉｓｃｏｕｐｌｅｄｔｏｔｕｍｏｕｒｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、第３２９巻、第６１３６号、ｐ２６１−２６３（１９８７）Ｎ．Ｔａｎａｋａ他、ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＣｙｔｏｋｉｎｅＡｃｔｉｖｉｔｙｏｆＨｕｍａｎＡｕｔｏｃｒｉｎｅＭｏｔｉｌｉｔｙＦａｃｔｏｒＥｘａｍｉｎｅｄｂｙＣｒｙｓｔａｌＳｔｒｕｃｔｕｒｅＡｎａｌｙｓｅｓａｎｄＳｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｓｔｕｄｉｅｓ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第３１８巻、第４号、ｐ９８５−９９７（２００２）

ＡＭＦは解糖系の酵素として生体内に存在しており、通常、生体内に存在する酵素に対して抗体が産生されないことはよく知られている。又、そのようなタンパク質に対する抗体ができた場合には、その動物は自己免疫疾患となり重大な問題を生じる恐れがある。従って、ＡＭＦ分泌性癌細胞に対する新規な抗癌剤が望まれている。

本発明者等は、担癌動物へ同種由来のＡＭＦ類を投与したところ、驚くべきことに癌の増殖抑制、腹水貯留の抑制、癌転移又は再発の抑制等を見出し、本発明を完成した。

即ち、本発明は
（１）担癌動物種と同種由来のＡＭＦ類を有効成分とする抗癌剤；
（２）担癌動物種と同種由来のＡＭＦ類を有効成分とする腫瘍細胞増殖抑制剤；
（３）担癌動物種と同種由来のＡＭＦ類を有効成分とする癌性腹水貯留抑制剤；
（４）担癌動物種と同種由来のＡＭＦ類を有効成分とする癌転移又は再発抑制剤；

（５）担癌動物種がヒトである上記（１）記載の抗癌剤；
（６）担癌動物種がヒトである上記（２）記載の腫瘍細胞増殖抑制剤；
（７）担癌動物種がヒトである上記（３）記載の癌性腹水貯留抑制剤；
（８）担癌動物種がヒトである上記（４）記載の癌転移又は再発抑制剤；
に関する。

本発明は、癌細胞の運動性に深く関与するＡＭＦを担癌動物に投与したところ、抗癌作用、腫瘍細胞増殖抑制作用、癌性腹水貯留抑制作用及び癌転移抑制作用を示すという驚くべき結果に基づいたものである。本発明により、癌の増殖・転移・進展・播種の予防及び治療に有用で、全身投与が可能で且つ実用性にも富む、担癌動物種と同種由来のＡＭＦ類を含有する抗癌剤、腫瘍細胞増殖抑制剤、癌性腹水貯留抑制剤、癌転移抑制剤、癌再発抑制剤が提供される。

本発明は担癌動物種と同種由来のＡＭＦ類を有効成分とする抗癌剤であり、腹水の貯留抑制剤であり、癌転移又は再発抑制剤である。担癌動物種と同種由来のＡＭＦ類とは、担癌動物種と同じ動物種のＡＭＦ類の意味である。例えば、後記の実施例に示すように、マウスのリコンビナントＡＭＦ（ｍｒＡＭＦ）を担癌マウスに施用することである。又、前記のようにヒトのＡＭＦも知られているので、ヒトに投与するためのヒトのＡＭＦを含有する抗癌剤、腫瘍細胞増殖抑制剤、腹水の貯留抑制剤及び癌転移抑制剤、癌再発抑制剤等も本発明に含まれる。更に、後記の実施例に示すＡＭＦ活性を有するヒトのＡＭＦの部分ペプチドも抗癌剤等の医薬製剤の有効成分となる。即ち、担癌動物種と同種由来のＡＭＦ類を用いることにより異種動物のＡＭＦの投与によるアナフィラキシー反応を回避することができる。

マウスにエーリッヒ癌細胞を腹腔内投与し、ｍｒＡＭＦを連日投与したところ、自己免疫疾患様の症状はなく腹水の貯留が抑制された。即ち、癌細胞移植後１４日における腹水の量を測定したところ、ＡＭＦの投与量に逆相関して腹水の量が減少するという結果が認められた。

又、マウスにｍｒＡＭＦを３日間連日投与した後に、同系腫瘍のＢ１６メラノーマを足蹠部に移植し、移植後、癌の増殖を観察したところ、ｍｒＡＭＦを投与したマウスで腫瘍の増殖の抑制が認められた。この結果は、ＡＭＦは腫瘍の増殖阻害についても有効であり、抗癌剤となることを示している。

更に、マウスの足蹠部に同系腫瘍のＢ１６メラノーマを皮下移植し、マウスの腹腔に２０μｇのｍｒＡＭＦを１４日連日投与した。腫瘍接種後１４日目にマウスの足を切断し腫瘍塊を切除した。腫瘍切除後１５日目（腫瘍接種後２９日目）にマウスの肺を取り出し、肺転移結節数を数えたところ、ｍｒＡＭＦ投与群は肺転移結節数が少なかった（後記実施例３に示す）。この結果は、ＡＭＦを含有する本発明の医薬製剤が癌転移抑制剤として用い得ることを示している。

本願発明に使用されるＡＭＦ類には、例えば上記非特許文献１及び２等に公知であるマウスまたはヒトＡＭＦ、そのアミノ酸配列から１個〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたタンパク質、若しくはＡＭＦと８０％以上の相同性を有するタンパク質、または配列表の配列番号：１記載のヒトＡＭＦのアミノ酸配列の１１７〜２８８に相当し、ＡＭＦ活性を有するペプチド、配列表の配列番号：２記載のヒトＡＭＦのアミノ酸配列の１１７〜５５９（３’末端）に相当し、ＡＭＦ活性を有するペプチド、それらのアミノ酸配列から１個〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたペプチド、若しくは配列表の配列番号：１または配列番号：２記載のペプチドと９０％以上の相同性を有するペプチドが含まれる。

それらのペプチドまたはタンパク質は、その配列に従いリコンビナント体の作成あるいは化学合成により得ることができる。更に、癌細胞等からＰＣＲ法等を用いて精製する通常の手法により得ることもできる。

ＡＭＦ類を含有する抗癌剤の使用し得る癌には特に制限はないが、上皮性癌、肉腫、血液癌等が挙げられ、具体的には肺癌、乳癌、膵臓癌、メラノーマ等が挙げられる。
ＡＭＦ類を含有する腹水貯留抑制剤における腹水の貯留原因は特に限定されないが、癌に起因する腹水が挙げられ、特に卵巣癌、胃癌等による腹水が挙げられる。

本発明に使用される医薬製剤中に含まれるＡＭＦ類の量は、凡そ０．０００１μｇ〜１０００ｍｇ程度である。又、安定化剤等の製剤学的に許容される添加剤を含んでいてもよい。通常、製剤の形態は、非経口投与剤としての注射剤（筋注、静注、腹腔内投与等）等が適用される。

本発明の医薬製剤を抗癌剤、癌性腹水貯留抑制剤、癌転移又は再発抑制剤として用いる場合、活性成分としてのＡＭＦ類使用量は成人１日当たり０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ程度である。これは、患者の病状、年齢、体重、性別等により適宜増減される。

本発明に使用される医薬製剤は徐放性製剤であってもよく、その際にはタンパク質製剤に通常用いられるリポソーム、ポリマー、イスコム等を用いた製剤であってもよい。

以下に本発明について実施例により例示するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本実施例のｍｒＡＭＦは、非特許文献３に記載の方法に準じて調製された。ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩液である。

実施例１ＡＭＦによる癌性腹水貯留の抑制
５Ｘ１０^６エーリッヒマウス腹水癌をＢＡＬＢ／Ｃマウス（８週齢、雄）の腹腔に移植し、翌日から連日ｍｒＡＭＦを１μｇ、１０μｇ、２０μｇ腹腔に投与した（各群ｎ＝４）。１４日後の腹水量を測定した。結果を表１に示す。

表１

ａＰ＜０．０５；ｂＰ＜０．００５；ｃＰ＜０．００１ｂｙＳｔｕｄｅｎｔ'ｓｔｔｅｓｔ
結果
表に示すように、ｍＡＭＦの投与量に比例して顕著に腹水の貯留の抑制が認められ、マウスＡＭＦを２０μｇ投与することにより腹水量は約１／８０となった。

実施例２ＡＭＦによる固形腫瘍増殖抑制
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８週齢、雌）の腹腔に２０μｇのｍｒＡＭＦを３回連日投与した（ｎ＝８）。対照群としてｍｒＡＭＦの替わりにＰＢＳを同量同回数投与した。１２日後、５Ｘ１０^５のＢ１６−ＢＬ６メラノーマをマウス足蹠部へ皮下接種し、足蹠に形成される腫瘍塊の体積を計測した。結果を図１に示す。

この結果から、ＡＭＦ投与群はＰＢＳ投与した対照群に比較して有為に腫瘍の増殖（腫瘍体積増加）を抑制した。

実施例３ＡＭＦによる転移抑制作用
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８週齢、雌）の足蹠部に５Ｘ１０^５のＢ１６−ＢＬ６メラノーマを皮下接種し、接種当日から１４日間マウスの腹腔に２０μｇのｍｒＡＭＦを１４回連日投与した。対照群には連日ＰＢＳを投与した。腫瘍接種後１４日目にマウスの足を切断し腫瘍塊を切除した。腫瘍切除後１５日目（腫瘍接種後２９日目）にマウスの肺を取り出し、肺転移結節数を数えた。結果を表２に示す。

表２ＡＭＦ投与による転移抑制効果

結果
表に示すように、腫瘍移植後ＡＭＦを投与することにより肺転移結節数が約半分となり、有意に腫瘍の肺転移の出現を抑制した。

実施例４ＡＭＦ部分ペプチドのＡＭＦ活性
ＰＣＲ反応によりヒト繊維芽肉腫細胞ｃＤＮＡライブラリから、ＡＭＦの５'末端から１１６、１１７〜２８８、２８９〜３'末端、５'末端〜２８８および１１７〜３'末端までの５種類のペプチドをコードするｃＤＮＡをそれぞれ増幅し、発現ベクターに組み込み大腸菌に各ペプチドを産生させた。プライマーの５'側にはそれぞれＥｃｏＲＩ切断部位をデザインしておき、ｐＧＥＸ６ＰマルチクローニングサイトのＥｃｏＲＩサイトにライゲーション反応によって挿入した。なお、ヒトＡＭＦの全アミノ酸配列とそれをコードする塩基配列は上記非特許文献１及び２等に知られている。
組み換えたプラスミドｐＧＥＸ６Ｐ／ｈＡＭＦ１−１１６、ｐＧＥＸ６Ｐ／ｈＡＭＦ１１７−２８８、ｐＧＥＸ６Ｐ／ｈＡＭＦ２８９−５５９、ｐＧＥＸ６Ｐ／ｈＡＭＦ１−２８８、ｐＧＥＸ６Ｐ／ｈＡＭＦ１１７−５５９を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。

形質転換させたＪＭ１０９株をアンピシリンを含むＬＢ培地を用いて３０℃で培養し、ＩＰＴＧを添加して組換えタンパク質を誘導させた。形質転換させた培養大腸菌を遠心分離によって集め、２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＮＰ−４０、ｓｏｄｉｕｍｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、１０ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＰＭＳＦに溶解した。菌の溶解液を超音波発生装置にかけ、菌体を破壊し、可溶性画分を遠心分離した。これを２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌで平衡化したＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂｃｏｌｕｍｎに添加し、４℃で結合させた。カラムに対する非結合分画を平衡化バッファーで洗浄し、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎｐｒｏｔｅａｓｅを添加してＧＳＴを切断し、各組換え型ｈＡＭＦ部分タンパク質を得た。

ＡＭＦの全配列と部分配列の関係を示した。上部の数字は５’末端から３’末端へのアミノ酸配列における番号を，ｂｐはアミノ酸をコードする塩基配列におけるベースペアを意味する。
これらの組換え型ｈＡＭＦ部分タンパク質の、細胞の示す方向性を持たないランダムな二次元運動に及ぼす作用をｐｈａｇｏｋｉｎｅｔｉｃｔｒａｃｋａｓｓａｙにより評価した。

即ち、ウシ血清アルブミンでコートした１８ｍｍ^２のカバーガラスに微細な金コロイドを吸着させたものを６穴の細胞培養プレートに用意した。１穴当たり２０００個のＨＴ−１０８０細胞を播種し、１時間後に試料を含む培地に交換し、さらに１６時間加湿インキュベーターで培養した。その後、パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、位走査顕微鏡下４０倍で観察、写真撮影した。細胞が動いて食作用によって生じた金コロイドの消失面積をＮＩＨｉｍａｇｅ解析ソフトウエアで計算した。各々の試料につき最低３０以上の細胞軌跡を計測しデータとした。
各組換え型ｈＡＭＦ部分タンパク質を０、１０、５０、１００（ｐｇ／ｍｌ）の濃度でＨＴ−１０８０細胞に曝露させ、ｐｈａｇｏｋｉｎｅｔｉｃｔｒａｃｋａｓｓａｙした結果を図２に示す。

この結果からＡＭＦ活性に重要な部位は、ｈＡＭＦの１１７〜２８８の配列であり，ｈＡＭＦ１−１１６およびｈＡＭＦ２８９−５５９はほとんどＨＴ−１０８０細胞の運動を刺激しない（図２の○および△）。また、ｈＡＭＦ１１７−２８８およびｈＡＭＦ
１−２８８はｈＡＭＦの細胞運動刺激活性に比較して約４０％程度に活性が減弱していた（□および■）。ｈＡＭＦ１１７−５５９はｈＡＭＦとほぼ同じ活性を保持していた（▲）。即ち、ｈＡＭＦのＮ−末端側は活性に必要がなく、ＡＭＦの活性に特に必要な部分がｈＡＭＦ１１７−２８８であることが示された。

ＡＭＦ投与によるマウスＢ１６−ＢＬ６メラノーマ固形腫瘍増殖抑制効果を腫瘍体積により示す。組換え型ｈＡＭＦ部分ペプチドのＡＭＦ活性をｐｈａｇｏｋｉｎｅｔｉｃｔｒａｃｋａｓｓａｙによる単位時間当たりの面積で示す。

Claims

担癌動物種と同種由来のＡＭＦ（自己分泌運動性因子）を有効成分とする抗癌剤。
担癌動物種と同種由来のＡＭＦを有効成分とする腫瘍細胞増殖抑制剤。
担癌動物種と同種由来のＡＭＦを有効成分とする癌性腹水貯留抑制剤。
担癌動物種と同種由来のＡＭＦを有効成分とする癌転移抑制剤。
担癌動物種がヒトである請求項１記載の抗癌剤。
担癌動物種がヒトである請求項２記載の腫瘍細胞増殖抑制剤。
担癌動物種がヒトである請求項３記載の癌性腹水貯留抑制剤。
担癌動物種がヒトである請求項４記載の癌転移抑制剤。