JP4450571B2 - リポソーム含有経口摂取用組成物 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リポソーム含有経口摂取用組成物を提供することに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ペプチド性化合物、フラボノイド等の生理活性物質を経口摂取した場合、胃酸や消化管内の種々の酵素の作用により分解され容易に不活化されてしまう。また、ペプチド性化合物等の生理活性物質は水溶性である場合が多く、その分子量も大きいため消化管粘膜からの膜透過性が悪いために、消化管からほとんど吸収されない。現在、ペプチド性化合物の吸収を上げるためには、主にタンパク分解酵素阻害剤を併用する方法と剤型修飾を施す方法とが検討されている。タンパク質分解酵素阻害剤の具体例としてはアプロチニンやバシトラシンなどが応用されている。一方、剤型修飾を施す方法としてはペプチドが胃酸によって分解されるのを防止するために腸溶性コーティングを施した製剤などが利用されている。しかし、腸溶剤は、固形製剤に限られ、液体製剤などの種々の形態とすることができず、特に食品に配合することが困難である。また、腸溶剤は、消化管粘膜からの透過性を改善することはできないため、消化管からの吸収にはあまり影響しない。
【０００３】
近年、剤型修飾を施す方法の一つとして微粒子製剤を薬物キャリアーとして利用する研究が精力的になされており、その中の一つとして、リポソームを経口投与の薬物キャリアーとして利用する検討も過去になされてきている。例示すれば、通常経口投与では無効とされていたインスリンを修飾したリポソームに封入することによって経口投与時のインスリンのバイオアベイラビリティーが増加することが認められている（非特許文献１〜３）。また、エリスロポエチンをリポソームに封入することによりそのバイオアベイラビリティーが上昇することも報告されている（非特許文献４）。しかしながら、これらのペプチド性化合物封入リポソームは注射に比べて高投与量が必要であることや吸収が変動し易いこと等の難点があり、現在においてまだ完全な実用化に至っておらず、ペプチド性化合物は臨床では注射剤として利用されているのが現状である。
【０００４】
【非特許文献１】
Hirofumi Takeuchi et al. ，"Enteral Absorption of Insulin in Rats from Mucoadhesive Chitosan-Coated Liposomes"， Pharmaceutical Research，13(6)，896-901，1996
【０００５】
【非特許文献２】
Muramatsu K et al.，"Dipalmitoylphosphatidylcholine Liposomes with Soybean-Derived Sterols and Cholesterol as a Carrier for the Oral Administration of Insulin in Rats"，Biological & Pharmaceutical Bulletin， 19(8), 1055-1058, 1996
【０００６】
【非特許文献３】
Kazunori Iwanaga et al.，" Application of surface-coated liposomes for oral delivery of peptide: Effects of coating the liposome's surface on the GI transit of insulin"，Journal of Pharmaceutical Sciences，88, 248-252, 1999
【０００７】
【非特許文献４】
Yoshie Maitani et al.，" Oral administration of recombinant human erythropoietin in liposomes in rats: Influence of lipid composition and size of liposomes on bioavailability"， Journal of Pharmaceutical Sciences，85, 440-445，1996
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、抗炎症、抗アレルギー作用等を有する経口摂取用組成物を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するために脂質膜微小運搬体であるリポソームに生理活性物質を封入することによって、抗炎症作用を有するリポソーム含有経口摂取用組成物としたものである。
【００１０】
即ち、本発明は、下記の各項に係る発明を提供するものである。
項１．生理活性物質が封入され、レシチン及びステロールを含んだリポソームを含有することを特徴とする経口摂取用組成物。
項２．レシチンのグリセロールの１位に炭素数１４〜２４の飽和脂肪酸、２位に炭素数１４〜２４の不飽和脂肪酸が結合していることを特徴とする項１に記載の経口摂取用組成物。
項３．レシチンが、卵黄レシチン及び大豆レシチンからなる群より選ばれる少なくとも１種である項１に記載の経口摂取用組成物。
項４．ステロールが、コレステロール及びフィトステロールからなる群より選ばれる少なくとも１種である項１〜３のいずれかに記載の経口摂取用組成物。
項５．レシチンとステロールのモル比が、５５：４５〜９５：５である項１〜４のいずれかに記載の経口摂取用組成物。
項６．生理活性物質が、生理活性蛋白質である項１〜５のいずれかに記載の経口摂取用組成物。
項７．生理活性蛋白質が、ラクトフェリン、トランスフェリン、インターフェロン、インターロイキン及びリゾチームからなる群より選ばれる少なくとも１種である項６に記載の経口摂取用組成物。
項８．生理活性蛋白質が、ラクトフェリンである項７に記載の経口摂取用組成物。
項９．経口摂取用組成物が食品組成物である項１〜８のいずれかに記載の組成物。
項１０．薬学的に許容される担体を含有し、経口摂取用組成物が医薬組成物である項１〜８のいずれかに記載の経口摂取用組成物。
項１１．医薬組成物が抗炎症剤である項１０に記載の経口摂取用組成物。
項１２．医薬組成物が歯周病予防又は治療剤、アトピー性皮膚炎予防又は治療剤又は肝炎予防又は治療剤である項１０に記載の経口摂取用組成物。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
リポソームはリン脂質を主体とした脂質を十分量の水で水和することにより形成される二分子膜を有する脂質小胞体である。現在、リポソームは脂質二重層の数に基づいて分類され、多重膜リポソーム(ＭＬＶ)と一枚膜リポソームに分類される。一枚膜リポソームは、そのサイズに応じて、更にＳＵＶ（small unilamella vesicle）、ＬＵＶ(large unilamella vesicle)、ＧＵＶ(giant unilamella vesicle)に分類される。本発明のリポソームは、これらのいずれであってもよい。好ましいのはＭＬＶである。
【００１３】
本発明のリポソームの大きさとしては、３０〜１０００ｎｍ程度が一般的であり、好ましくは３０〜３００ｎｍ、より好ましくは５０〜２００ｎｍである。
【００１４】
リポソームは水溶性薬物をその内水層に、脂溶性薬物を脂質二重層へ取り込むことができ、薬物のターゲティング、徐放化、副作用の軽減などを目的にＤＤＳ製剤の薬物運搬体としてその応用が試みられている。また、リポソームは生体膜の成分から構成されているため安全性が高いことも知られている。
【００１５】
経口摂取用組成物に含まれる生理活性物質の量は、リポソームの総脂質量の５０〜２０００重量％であることが好ましく、１００〜１０００重量％であることがより好ましい。なお、リポソームの総脂質量とは、リポソームを構成する油分の総和であり、当該油分にはレシチン、ステロールだけでなく、ビタミンＥ等も含まれる。
【００１６】
本発明では、レシチンとして、卵黄レシチン、大豆レシチン、ナタネレシチン、コーンレシチン、ひまわりレシチン、ピーナッツレシチンなどが挙げられる。本発明では、これらの水素添加物を用いることもできる。レシチンはホスファチジルコリン又は1,2-ジアシルグリセロール 3-ホスホコリンとも称され、一般的に、グリセロールの１位及び２位に脂肪酸が結合している。本発明では、上記例示のレシチンに加えて、１位及び２位の両方又は片方に炭素数１２〜２４の不飽和脂肪酸が結合しているレシチンを使用することが好ましく、１位に炭素数１２〜２４の飽和脂肪酸、２位に炭素数１２〜２４の不飽和脂肪酸が結合しているレシチンを使用することが特に好ましい。ここで、飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸は直鎖状及び分枝状のいずれでもよい。このようなレシチンを使用することにより、リポソームに封入された生理活性物質の腸吸収性が向上する。好ましい不飽和脂肪酸としては、炭素数１６〜１８の不飽和脂肪酸を使用でき、特に２位にオレイン酸、リノール酸が多く結合したレシチンを使用することにより、より腸吸収性の向上が期待できる。
【００１７】
また、本発明のレシチンとしては、これらの中でも、卵黄レシチン及び大豆レシチンが好ましい。
【００１８】
ステロールとしては、コレステロール、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロールなどの動物由来のステロール；スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロールなどの植物由来のステロール（フィトステロール）；チモステロール、エルゴステロールなどの微生物由来のステロール等が挙げられる。これらの中でも、コレステロール又はフィトステロールが好ましく用いられる。
【００１９】
リポソームにおけるレシチンとステロールのモル比は、５５：４５〜９５：５程度が好ましく、６０：４０〜９０：１０がより好ましく、７５：２５〜８５：１５が最も好ましい。モル比がこれらの範囲にあるとリポソーム膜の安定性が向上する。
【００２０】
本発明のリポソームに封入される生理活性物質としては、消化管内で分解されやすく、吸収を期待されるようなものであればよく、生理活性蛋白質、アミド結合を有する化合物、配糖体などが例示される。
【００２１】
生理活性蛋白質は、分子量１,０００〜２００,０００程度のものを好ましく用いることができる。具体的には、ラクトフェリン、トランスフェリン、インターフェロン、インターロイキン、リゾチームなどの蛋白質；インスリン、グルカゴン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、カリクレイン、ガストリン、セクレチン、成長ホルモン、エリスロポエチンなどのペプチドホルモン；インフルエンザワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチンなどのワクチン類が挙げられる。これらの中でも、特にラクトフェリン、トランスフェリン、インターフェロン、インターロイキン、リゾチームなどの蛋白質が好ましく、ラクトフェリンが更に好ましい。
【００２２】
生理活性物質の配合割合は、リポソームの総脂質量の５０〜２０００重量％程度が好ましく、１００〜１０００重量％程度がより好ましい。
【００２３】
生理活性物質を封入したリポソームは、従来の方法により製造することができる。例えば、所定量のレシチン及びステロールを、例えばエタノールなどの適当な有機溶媒で可溶化し、減圧下に溶媒を除去し、膜脂質を作成後、これに上記生理活性物質を含む水溶液を添加して、例えば、１０００〜３０００rpm程度で２〜５分間程度撹拌して、リポソーム懸濁液を調製することにより得ることができる。
【００２４】
得られた懸濁液に対しては、必要に応じて、リポソーム外液中の生理活性物質を除去する操作、例えば懸濁液を濾過後，得られた濾液を透析する操作を行ってもよい。
【００２５】
得られたリポソームの表面をコーティングすることができる。好ましいコーティングとしては、硫酸基を含有する多糖類でのコーティングが挙げられる。
【００２６】
硫酸基含有多糖類としては、フコイダン、カラギーナン、寒天、ヘパリンなどが挙げられる。また、本発明の硫酸基含有多糖類としては、硫酸基を含まない多糖を硫酸化したものであってもよく、例えば、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸などであってもよい。
【００２７】
本発明の硫酸基含有多糖類としては、分子量が５,０００〜３００,０００程度のものが好ましく用いられる。
【００２８】
本発明においては、これらの硫酸基含有多糖類の中でもフコイダン及びカラギーナンを好ましく用いることができ、特にフコイダンが好ましい。
【００２９】
硫酸基含有多糖類の使用量は、例えば、リポソームに含有されるレシチン１００重量部に対して、１０〜５００重量部程度が好ましく、２０〜２００重量部程度がより好ましい。
【００３０】
コーティングは、例えば、生理活性物質を封入したリポソームを含む懸濁液に、硫酸基含有多糖類を加え、１０００〜３０００rpm程度で２〜５分間程度撹拌することにより行うことができる。なお、１つのコーティング膜の中に複数のリポソームが含まれていてもよい。
【００３１】
リポソームが硫酸基含有多糖類でコーティングされたことは、例えば、リポソーム溶液のゼータ電位が、硫酸基含有多糖類を添加して撹拌することにより変化することにより確認できる。
【００３２】
リポソームの懸濁液は、液状のままでも使用できるが、凍結乾燥した乾燥物として使用することもできる。リポソームは、その乾燥物を錠剤やカプセル化したものをはじめ、様々な経口摂取に適した形態とすることが可能である。
【００３３】
本発明の経口摂取用組成物を食品組成物として利用する場合には、生理活性物質を封入したリポソームを必要に応じてその食品の形態に応じた可食性担体、食品素材、食品添加物などと組み合わせて、通常の方法により調製することができる。食品の形態としては、飲料などの液状の食品、錠剤、顆粒、チュアブルタブレットなどの固形の食品等として利用することができる。また、ヨーグルトなどの半固形の食品としても利用することができる。具体的な食品の形態としては、ジュース、清涼飲料水、ティー等の液体飲料；粉末ジュース、粉末スープ等の粉末飲料；チョコレート、キャンディー、チューインガム、アイスクリーム、ゼリー、クッキー、ビスケット、コーンフレーク、チュアブルタブレット、フィルムシート、ウエハース、グミ、煎餅、饅頭等の菓子類；ドレッシング、ソース等の調味料；パン類、麺類、こんにゃく、練り製品（かまぼこ等）、ふりかけ、口腔用スプレー、トローチ等が挙げられる。また、添加物として、乳酸菌などの生菌又は死菌、その他のプロバイオティクス素材、ビタミン、生薬、ハーブ等の植物そのものまたは抽出物を配合しても良い。
【００３４】
本発明の経口摂取用食品組成物は、リポソームに封入された生理活性物質の機能に応じた健康食品、機能性食品、特定保健用食品、病者用食品等の用途に用いることができる。
【００３５】
また、本発明の経口摂取用組成物は、生理活性物質を封入したリポソーム及び薬学的に許容される担体を含有し、液剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、粉剤などの固形剤或いは当該液剤又は固形剤を封入したカプセル剤等の経口投与可能な医薬組成物として使用できる。薬学的に許容される担体としては、賦形剤、希釈剤等が挙げられる。また、医薬組成物は香料等の各種添加剤を含むこともできる。このような医薬組成物は、リポソームに封入された生理活性物質の機能に応じ、各種疾患の予防又は治療剤として用いることができる。
【００３６】
特に、ラクトフェリンを封入したリポソームを含有する経口投与用組成物は、炎症性疾患、例えば、歯周病、口内炎、その他の歯肉及び口腔粘膜の炎症、急性肝炎、慢性肝炎、Ｃ型肝炎などのウイルス性肝炎、アレルギー性疾患（胃炎、関節炎、アトピー性皮膚炎、花粉症、喘息、鼻炎等）、腎炎、誤嚥性肺炎、慢性関節リウマチ、クローン病、関節炎、消化管の炎症等の予防、治療又は症状改善に有効である。
【００３７】
なお、ＴＮＦ−αは、免疫系に関与するサイトカインであり、体内においてＴＮＦ−αが過剰となると、好中球や血管内皮細胞をはじめとする種々の細胞膜表面のＴＮＦ−αレセプターにＴＮＦ−αが作用することによって、炎症、微小循環障害、インスリン抵抗性などが発生する。このため、ＴＮＦ−αの産生抑制は、歯周病、ウイルス性肝炎、関節炎などの炎症、アトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患、臓器の機能不全、全身性エリテマトーテス、リウマチ、クローン病などの膠原病、糖尿病などの疾患の予防又は治療に有効である。
【００３８】
また、ＧＯＴ及びＧＰＴは、細胞内に存在するアミノ基転移酵素であり、臓器障害に伴って細胞から血清中に遊出する。ＧＯＴ値は心筋梗塞や肝障害、ＧＰＴ値は肝障害の指標として用いられており、ウイルス性肝炎などをはじめとする肝障害でＧＯＴ、ＧＰＴ値が高くなることが知られている。このため、ＧＯＴ、ＧＰＴの産生を抑制することは、肝障害や心筋梗塞等の疾患の予防又は治療に有効であることを示している。
【００３９】
【実施例】
以下に実施例及び試験例を示して、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４０】
実施例１
ラクトフェリン封入リポソームの調製
薄膜水和法により、ラクトフェリンを封入したリポソーム製剤を調製した。卵黄レシチンとフィトステロールをモル比が７：３となるように量りとり(卵黄レシチン ６３．０ｍｇ、フィトステロール １４．５５ｍｇ)、エタノール ６ｍｌを加えて溶解した。この溶液からロータリーエバポレーターにて溶媒留去し、薄膜を形成させた。この薄膜にラクトフェリン１８０ｍｇを溶解させたクエン酸緩衝液(ｐＨ ６．６９)の６ｍｌを加え、ボルテックスミキサーにより２０００rpmにて３分間程度撹拌を行い、リポソーム懸濁液を得た。この懸濁液を０．４μｍの孔径のポリカーボネート膜を用いて濾過し、ラクトフェリン封入リポソームを得た。なお、このリポソームを１％リンタングステン酸処理によりネガティブ染色し、乾燥後、これを電子顕微鏡で観察して、多重膜リポソームが形成されていることを確認した。
【００４１】
実施例２
ラクトフェリン封入リポソーム経口投与によるマウス末梢血単球からのＴＮＦ−α産生抑制作用 (ex vivo)
ラクトフェリン含有クエン酸溶液（pH6.69のクエン酸緩衝液に30mg/mlの濃度でラクトフェリンを溶解）、実施例１と同様な方法で調製したラクトフェリン封入リポソーム溶液、及びコントロールとしてpH6.69のクエン酸緩衝液を調製した。これらのサンプルを、BALB/Cマウス(n=6)に、ラクトフェリンの濃度が300mg/kgとなるように（10ml/kgの量で）７日間連続で経口投与した。一方、ポジティブコントロール群(n=6)としてシクロホスファミド(30mg/kg)を６日目に腹腔内投与した。８日目に心臓穿刺によりすべての群のマウスより血液を採取し単球を単離した。各群３匹より得た単球(106個, n=2)をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）(1μｇ/ml)を添加したRPMI-1640培地中で37℃、24時間培養し、培養液中に産生されるTNF-α濃度をELISA法（TNF-α ELISA キット、ＧＴ社製）により測定した。測定結果を表１及び図１に示す。
【００４２】
【表１】
【００４３】
測定結果より、ラクトフェリン封入リポソームをマウスに７日間連続で経口投与することによって、マウス末梢血単球のＬＰＳ刺激によるＴＮＦ−αの産生がコントロールと比較して約７０％抑制されることが判明した。その作用はポジティブコントロールであるシクロホスファミドよりも強かった。ラクトフェリン緩衝液投与群においても弱いＴＮＦ−α産生抑制効果が認められるものの、その効果はラクトフェリン封入リポソーム投与群のそれよりも小さかった。
【００４４】
ＴＮＦ−αは炎症、アレルギーに関与するサイトカインであるため、ＴＮＦ−α産生抑制効果を有するラクトフェリン封入リポソームは抗炎症、抗アレルギー効果を有すると考えられる。また、シクロホスファミドは抗腫瘍剤としての効果が確認されており、ラクトフェリン封入リポソームも抗腫瘍効果を有すると考えられる。
【００４５】
また、本実施例で使用した機器等は以下のとおりである。
【００４６】
エクストルーダー(LIPEX)、パーティクルサイザー(NICOMP)、CO2インキュベーター(SANYO)、Centrifuge(HITACHI)、光学顕微鏡(OLYMPUS)、イムノリーダー (InterMed)。
【００４７】
実施例３
ラクトフェリン封入リポソームの経口投与によるラット急性肝障害抑制作用
コントロール(pH 6.69のクエン酸緩衝液)、ラクトフェリン含有クエン酸溶液(pH6.69のクエン酸緩衝液に30mg/mlの濃度でラクトフェリンを溶解)、実施例１と同様の方法で調製したラクトフェリン封入リポソーム溶液及びコントロールとしてpH6.69のクエン酸緩衝液を調製した。これらのサンプルを、Wister系ラット(n=5)にＣＣｌ4を経口投与(オリーブオイルとの1:1の溶液を1ml/kgの濃度で経口投与)する８０、５６、３２、８時間前に、10ml/kg（ラクトフェリン濃度が300mg/kg）で経口投与した。ＣＣｌ4投与２４時間後にラットより血清を採取し、血清中のglutamic pyruvate transaminase (GPT)及びglutamic oxaloacetate transaminase (GOT)をoptimized UV法（GPT・GOTアッセイキット(Wako)）で測定し、血清1リットルあたりのU(ユニット)として算出した。また、ポジティブコントロールとしてドイツで肝炎用医薬品として使用されているシリマリン（アルドリッチ社製）を使用した。シリマリンはＣＣｌ4投与の３０分前、及び投与後４、８時間後に300mg/kgの濃度で経口投与した。
【００４８】
試験結果を表２及び図２に示す。
【００４９】
【表２】
【００５０】
試験結果より、リポソーム化ラクトフェリンをＣＣｌ4で肝障害を誘発する３日前から経口投与することによって、血清中のＧＰＴ及びＧＯＴ濃度がコントロールと比較して有意に減少することが確認された。この効果は医薬品であるシリマリンとほぼ同等である。ラクトフェリン緩衝液投与群においても弱いＧＰＴ及びＧＯＴ濃度減少作用が認められるものの、その効果はラクトフェリン封入リポソームに比較して小さかった。
【００５１】
シリマリンは、アルコール肝臓障害患者、慢性肝炎患者、肝硬変患者に対する臨床試験においてＧＯＴ及びＧＰＴ量低下や病状悪化遅延効果が既に確認されており、ラクトフェリン封入リポソームも同様な効果を有すると示唆された。
【００５２】
なお、本実施例で使用した機器等は以下のとおりである。
エクストルーダー(LIPEX)、パーティクルサイザー(NICOMP 370)、電子顕微鏡(JEOL JEM-100SX)、Centrifuge（HITACHI）、Automatic analyzer（HITACHI model 7050）。
【００５３】
処方例
実施例１と同様な方法で調製したリポソーム化ラクトフェリンを含有する以下に示す食品を製造した。
【００５４】
上記の原料を使用し、一般的な製造法によりチューインガムを製造した。
【００５５】
上記の原料を使用し、一般的な製造法によりアイスクリームを製造した。
【００５６】
上記の原料を使用し、一般的な製造法によりチョコレートを製造した。
【００５７】
【発明の効果】
生理活性のある蛋白質を経口摂取したとき、胃酸や胃内、小腸内のタンパク質分解酵素によって分解され生理活性が抑制されてしまうため、経口摂取による利用が普及していなかったが、蛋白質をリポソームに封入することにより、蛋白質の生理活性の低下を抑制または生理活性を増強することができるため、このリポソームの経口摂取により蛋白質の生理活性を有効に利用できる。
【００５８】
特にラクトフェリン封入リポソームを経口投与すると、ラクトフェリンと比較して顕著なＴＮＦ−α産生抑制効果及びＧＯＴ、ＧＰＴ値抑制効果が示される。このため、ラクトフェリン封入リポソームを含有する経口摂取用組成物は、食品組成物、医薬組成物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２において測定された、マウス末梢血単球におけるＴＮＦ−α産生量（ｅｘ ｖｉｖｏ）を示すグラフである。
【図２】実施例３において測定された、ラットの急性肝障害における血清中のＧＰＴ濃度を示すグラフである。
【図３】実施例３において測定された、ラットの急性肝障害における血清中のＧＯＴ濃度を示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、リポソーム含有経口摂取用組成物を提供することに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ペプチド性化合物、フラボノイド等の生理活性物質を経口摂取した場合、胃酸や消化管内の種々の酵素の作用により分解され容易に不活化されてしまう。また、ペプチド性化合物等の生理活性物質は水溶性である場合が多く、その分子量も大きいため消化管粘膜からの膜透過性が悪いために、消化管からほとんど吸収されない。現在、ペプチド性化合物の吸収を上げるためには、主にタンパク分解酵素阻害剤を併用する方法と剤型修飾を施す方法とが検討されている。タンパク質分解酵素阻害剤の具体例としてはアプロチニンやバシトラシンなどが応用されている。一方、剤型修飾を施す方法としてはペプチドが胃酸によって分解されるのを防止するために腸溶性コーティングを施した製剤などが利用されている。しかし、腸溶剤は、固形製剤に限られ、液体製剤などの種々の形態とすることができず、特に食品に配合することが困難である。また、腸溶剤は、消化管粘膜からの透過性を改善することはできないため、消化管からの吸収にはあまり影響しない。
【０００３】
近年、剤型修飾を施す方法の一つとして微粒子製剤を薬物キャリアーとして利用する研究が精力的になされており、その中の一つとして、リポソームを経口投与の薬物キャリアーとして利用する検討も過去になされてきている。例示すれば、通常経口投与では無効とされていたインスリンを修飾したリポソームに封入することによって経口投与時のインスリンのバイオアベイラビリティーが増加することが認められている（非特許文献１〜３）。また、エリスロポエチンをリポソームに封入することによりそのバイオアベイラビリティーが上昇することも報告されている（非特許文献４）。しかしながら、これらのペプチド性化合物封入リポソームは注射に比べて高投与量が必要であることや吸収が変動し易いこと等の難点があり、現在においてまだ完全な実用化に至っておらず、ペプチド性化合物は臨床では注射剤として利用されているのが現状である。
【０００４】
【非特許文献１】
Hirofumi Takeuchi et al. ，"Enteral Absorption of Insulin in Rats from Mucoadhesive Chitosan-Coated Liposomes"， Pharmaceutical Research，13(6)，896-901，1996
【０００５】
【非特許文献２】
Muramatsu K et al.，"Dipalmitoylphosphatidylcholine Liposomes with Soybean-Derived Sterols and Cholesterol as a Carrier for the Oral Administration of Insulin in Rats"，Biological & Pharmaceutical Bulletin， 19(8), 1055-1058, 1996
【０００６】
【非特許文献３】
Kazunori Iwanaga et al.，" Application of surface-coated liposomes for oral delivery of peptide: Effects of coating the liposome's surface on the GI transit of insulin"，Journal of Pharmaceutical Sciences，88, 248-252, 1999
【０００７】
【非特許文献４】
Yoshie Maitani et al.，" Oral administration of recombinant human erythropoietin in liposomes in rats: Influence of lipid composition and size of liposomes on bioavailability"， Journal of Pharmaceutical Sciences，85, 440-445，1996
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、抗炎症、抗アレルギー作用等を有する経口摂取用組成物を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するために脂質膜微小運搬体であるリポソームに生理活性物質を封入することによって、抗炎症作用を有するリポソーム含有経口摂取用組成物としたものである。
【００１０】
即ち、本発明は、下記の各項に係る発明を提供するものである。
項１．生理活性物質が封入され、レシチン及びステロールを含んだリポソームを含有することを特徴とする経口摂取用組成物。
項２．レシチンのグリセロールの１位に炭素数１４〜２４の飽和脂肪酸、２位に炭素数１４〜２４の不飽和脂肪酸が結合していることを特徴とする項１に記載の経口摂取用組成物。
項３．レシチンが、卵黄レシチン及び大豆レシチンからなる群より選ばれる少なくとも１種である項１に記載の経口摂取用組成物。
項４．ステロールが、コレステロール及びフィトステロールからなる群より選ばれる少なくとも１種である項１〜３のいずれかに記載の経口摂取用組成物。
項５．レシチンとステロールのモル比が、５５：４５〜９５：５である項１〜４のいずれかに記載の経口摂取用組成物。
項６．生理活性物質が、生理活性蛋白質である項１〜５のいずれかに記載の経口摂取用組成物。
項７．生理活性蛋白質が、ラクトフェリン、トランスフェリン、インターフェロン、インターロイキン及びリゾチームからなる群より選ばれる少なくとも１種である項６に記載の経口摂取用組成物。
項８．生理活性蛋白質が、ラクトフェリンである項７に記載の経口摂取用組成物。
項９．経口摂取用組成物が食品組成物である項１〜８のいずれかに記載の組成物。
項１０．薬学的に許容される担体を含有し、経口摂取用組成物が医薬組成物である項１〜８のいずれかに記載の経口摂取用組成物。
項１１．医薬組成物が抗炎症剤である項１０に記載の経口摂取用組成物。
項１２．医薬組成物が歯周病予防又は治療剤、アトピー性皮膚炎予防又は治療剤又は肝炎予防又は治療剤である項１０に記載の経口摂取用組成物。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
リポソームはリン脂質を主体とした脂質を十分量の水で水和することにより形成される二分子膜を有する脂質小胞体である。現在、リポソームは脂質二重層の数に基づいて分類され、多重膜リポソーム(ＭＬＶ)と一枚膜リポソームに分類される。一枚膜リポソームは、そのサイズに応じて、更にＳＵＶ（small unilamella vesicle）、ＬＵＶ(large unilamella vesicle)、ＧＵＶ(giant unilamella vesicle)に分類される。本発明のリポソームは、これらのいずれであってもよい。好ましいのはＭＬＶである。
【００１３】
本発明のリポソームの大きさとしては、３０〜１０００ｎｍ程度が一般的であり、好ましくは３０〜３００ｎｍ、より好ましくは５０〜２００ｎｍである。
【００１４】
リポソームは水溶性薬物をその内水層に、脂溶性薬物を脂質二重層へ取り込むことができ、薬物のターゲティング、徐放化、副作用の軽減などを目的にＤＤＳ製剤の薬物運搬体としてその応用が試みられている。また、リポソームは生体膜の成分から構成されているため安全性が高いことも知られている。
【００１５】
経口摂取用組成物に含まれる生理活性物質の量は、リポソームの総脂質量の５０〜２０００重量％であることが好ましく、１００〜１０００重量％であることがより好ましい。なお、リポソームの総脂質量とは、リポソームを構成する油分の総和であり、当該油分にはレシチン、ステロールだけでなく、ビタミンＥ等も含まれる。
【００１６】
本発明では、レシチンとして、卵黄レシチン、大豆レシチン、ナタネレシチン、コーンレシチン、ひまわりレシチン、ピーナッツレシチンなどが挙げられる。本発明では、これらの水素添加物を用いることもできる。レシチンはホスファチジルコリン又は1,2-ジアシルグリセロール 3-ホスホコリンとも称され、一般的に、グリセロールの１位及び２位に脂肪酸が結合している。本発明では、上記例示のレシチンに加えて、１位及び２位の両方又は片方に炭素数１２〜２４の不飽和脂肪酸が結合しているレシチンを使用することが好ましく、１位に炭素数１２〜２４の飽和脂肪酸、２位に炭素数１２〜２４の不飽和脂肪酸が結合しているレシチンを使用することが特に好ましい。ここで、飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸は直鎖状及び分枝状のいずれでもよい。このようなレシチンを使用することにより、リポソームに封入された生理活性物質の腸吸収性が向上する。好ましい不飽和脂肪酸としては、炭素数１６〜１８の不飽和脂肪酸を使用でき、特に２位にオレイン酸、リノール酸が多く結合したレシチンを使用することにより、より腸吸収性の向上が期待できる。
【００１７】
また、本発明のレシチンとしては、これらの中でも、卵黄レシチン及び大豆レシチンが好ましい。
【００１８】
ステロールとしては、コレステロール、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロールなどの動物由来のステロール；スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロールなどの植物由来のステロール（フィトステロール）；チモステロール、エルゴステロールなどの微生物由来のステロール等が挙げられる。これらの中でも、コレステロール又はフィトステロールが好ましく用いられる。
【００１９】
リポソームにおけるレシチンとステロールのモル比は、５５：４５〜９５：５程度が好ましく、６０：４０〜９０：１０がより好ましく、７５：２５〜８５：１５が最も好ましい。モル比がこれらの範囲にあるとリポソーム膜の安定性が向上する。
【００２０】
本発明のリポソームに封入される生理活性物質としては、消化管内で分解されやすく、吸収を期待されるようなものであればよく、生理活性蛋白質、アミド結合を有する化合物、配糖体などが例示される。
【００２１】
生理活性蛋白質は、分子量１,０００〜２００,０００程度のものを好ましく用いることができる。具体的には、ラクトフェリン、トランスフェリン、インターフェロン、インターロイキン、リゾチームなどの蛋白質；インスリン、グルカゴン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、カリクレイン、ガストリン、セクレチン、成長ホルモン、エリスロポエチンなどのペプチドホルモン；インフルエンザワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチンなどのワクチン類が挙げられる。これらの中でも、特にラクトフェリン、トランスフェリン、インターフェロン、インターロイキン、リゾチームなどの蛋白質が好ましく、ラクトフェリンが更に好ましい。
【００２２】
生理活性物質の配合割合は、リポソームの総脂質量の５０〜２０００重量％程度が好ましく、１００〜１０００重量％程度がより好ましい。
【００２３】
生理活性物質を封入したリポソームは、従来の方法により製造することができる。例えば、所定量のレシチン及びステロールを、例えばエタノールなどの適当な有機溶媒で可溶化し、減圧下に溶媒を除去し、膜脂質を作成後、これに上記生理活性物質を含む水溶液を添加して、例えば、１０００〜３０００rpm程度で２〜５分間程度撹拌して、リポソーム懸濁液を調製することにより得ることができる。
【００２４】
得られた懸濁液に対しては、必要に応じて、リポソーム外液中の生理活性物質を除去する操作、例えば懸濁液を濾過後，得られた濾液を透析する操作を行ってもよい。
【００２５】
得られたリポソームの表面をコーティングすることができる。好ましいコーティングとしては、硫酸基を含有する多糖類でのコーティングが挙げられる。
【００２６】
硫酸基含有多糖類としては、フコイダン、カラギーナン、寒天、ヘパリンなどが挙げられる。また、本発明の硫酸基含有多糖類としては、硫酸基を含まない多糖を硫酸化したものであってもよく、例えば、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸などであってもよい。
【００２７】
本発明の硫酸基含有多糖類としては、分子量が５,０００〜３００,０００程度のものが好ましく用いられる。
【００２８】
本発明においては、これらの硫酸基含有多糖類の中でもフコイダン及びカラギーナンを好ましく用いることができ、特にフコイダンが好ましい。
【００２９】
硫酸基含有多糖類の使用量は、例えば、リポソームに含有されるレシチン１００重量部に対して、１０〜５００重量部程度が好ましく、２０〜２００重量部程度がより好ましい。
【００３０】
コーティングは、例えば、生理活性物質を封入したリポソームを含む懸濁液に、硫酸基含有多糖類を加え、１０００〜３０００rpm程度で２〜５分間程度撹拌することにより行うことができる。なお、１つのコーティング膜の中に複数のリポソームが含まれていてもよい。
【００３１】
リポソームが硫酸基含有多糖類でコーティングされたことは、例えば、リポソーム溶液のゼータ電位が、硫酸基含有多糖類を添加して撹拌することにより変化することにより確認できる。
【００３２】
リポソームの懸濁液は、液状のままでも使用できるが、凍結乾燥した乾燥物として使用することもできる。リポソームは、その乾燥物を錠剤やカプセル化したものをはじめ、様々な経口摂取に適した形態とすることが可能である。
【００３３】
本発明の経口摂取用組成物を食品組成物として利用する場合には、生理活性物質を封入したリポソームを必要に応じてその食品の形態に応じた可食性担体、食品素材、食品添加物などと組み合わせて、通常の方法により調製することができる。食品の形態としては、飲料などの液状の食品、錠剤、顆粒、チュアブルタブレットなどの固形の食品等として利用することができる。また、ヨーグルトなどの半固形の食品としても利用することができる。具体的な食品の形態としては、ジュース、清涼飲料水、ティー等の液体飲料；粉末ジュース、粉末スープ等の粉末飲料；チョコレート、キャンディー、チューインガム、アイスクリーム、ゼリー、クッキー、ビスケット、コーンフレーク、チュアブルタブレット、フィルムシート、ウエハース、グミ、煎餅、饅頭等の菓子類；ドレッシング、ソース等の調味料；パン類、麺類、こんにゃく、練り製品（かまぼこ等）、ふりかけ、口腔用スプレー、トローチ等が挙げられる。また、添加物として、乳酸菌などの生菌又は死菌、その他のプロバイオティクス素材、ビタミン、生薬、ハーブ等の植物そのものまたは抽出物を配合しても良い。
【００３４】
本発明の経口摂取用食品組成物は、リポソームに封入された生理活性物質の機能に応じた健康食品、機能性食品、特定保健用食品、病者用食品等の用途に用いることができる。
【００３５】
また、本発明の経口摂取用組成物は、生理活性物質を封入したリポソーム及び薬学的に許容される担体を含有し、液剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、粉剤などの固形剤或いは当該液剤又は固形剤を封入したカプセル剤等の経口投与可能な医薬組成物として使用できる。薬学的に許容される担体としては、賦形剤、希釈剤等が挙げられる。また、医薬組成物は香料等の各種添加剤を含むこともできる。このような医薬組成物は、リポソームに封入された生理活性物質の機能に応じ、各種疾患の予防又は治療剤として用いることができる。
【００３６】
特に、ラクトフェリンを封入したリポソームを含有する経口投与用組成物は、炎症性疾患、例えば、歯周病、口内炎、その他の歯肉及び口腔粘膜の炎症、急性肝炎、慢性肝炎、Ｃ型肝炎などのウイルス性肝炎、アレルギー性疾患（胃炎、関節炎、アトピー性皮膚炎、花粉症、喘息、鼻炎等）、腎炎、誤嚥性肺炎、慢性関節リウマチ、クローン病、関節炎、消化管の炎症等の予防、治療又は症状改善に有効である。
【００３７】
なお、ＴＮＦ−αは、免疫系に関与するサイトカインであり、体内においてＴＮＦ−αが過剰となると、好中球や血管内皮細胞をはじめとする種々の細胞膜表面のＴＮＦ−αレセプターにＴＮＦ−αが作用することによって、炎症、微小循環障害、インスリン抵抗性などが発生する。このため、ＴＮＦ−αの産生抑制は、歯周病、ウイルス性肝炎、関節炎などの炎症、アトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患、臓器の機能不全、全身性エリテマトーテス、リウマチ、クローン病などの膠原病、糖尿病などの疾患の予防又は治療に有効である。
【００３８】
また、ＧＯＴ及びＧＰＴは、細胞内に存在するアミノ基転移酵素であり、臓器障害に伴って細胞から血清中に遊出する。ＧＯＴ値は心筋梗塞や肝障害、ＧＰＴ値は肝障害の指標として用いられており、ウイルス性肝炎などをはじめとする肝障害でＧＯＴ、ＧＰＴ値が高くなることが知られている。このため、ＧＯＴ、ＧＰＴの産生を抑制することは、肝障害や心筋梗塞等の疾患の予防又は治療に有効であることを示している。
【００３９】
【実施例】
以下に実施例及び試験例を示して、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４０】
実施例１
ラクトフェリン封入リポソームの調製
薄膜水和法により、ラクトフェリンを封入したリポソーム製剤を調製した。卵黄レシチンとフィトステロールをモル比が７：３となるように量りとり(卵黄レシチン ６３．０ｍｇ、フィトステロール １４．５５ｍｇ)、エタノール ６ｍｌを加えて溶解した。この溶液からロータリーエバポレーターにて溶媒留去し、薄膜を形成させた。この薄膜にラクトフェリン１８０ｍｇを溶解させたクエン酸緩衝液(ｐＨ ６．６９)の６ｍｌを加え、ボルテックスミキサーにより２０００rpmにて３分間程度撹拌を行い、リポソーム懸濁液を得た。この懸濁液を０．４μｍの孔径のポリカーボネート膜を用いて濾過し、ラクトフェリン封入リポソームを得た。なお、このリポソームを１％リンタングステン酸処理によりネガティブ染色し、乾燥後、これを電子顕微鏡で観察して、多重膜リポソームが形成されていることを確認した。
【００４１】
実施例２
ラクトフェリン封入リポソーム経口投与によるマウス末梢血単球からのＴＮＦ−α産生抑制作用 (ex vivo)
ラクトフェリン含有クエン酸溶液（pH6.69のクエン酸緩衝液に30mg/mlの濃度でラクトフェリンを溶解）、実施例１と同様な方法で調製したラクトフェリン封入リポソーム溶液、及びコントロールとしてpH6.69のクエン酸緩衝液を調製した。これらのサンプルを、BALB/Cマウス(n=6)に、ラクトフェリンの濃度が300mg/kgとなるように（10ml/kgの量で）７日間連続で経口投与した。一方、ポジティブコントロール群(n=6)としてシクロホスファミド(30mg/kg)を６日目に腹腔内投与した。８日目に心臓穿刺によりすべての群のマウスより血液を採取し単球を単離した。各群３匹より得た単球(106個, n=2)をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）(1μｇ/ml)を添加したRPMI-1640培地中で37℃、24時間培養し、培養液中に産生されるTNF-α濃度をELISA法（TNF-α ELISA キット、ＧＴ社製）により測定した。測定結果を表１及び図１に示す。
【００４２】
【表１】
測定結果より、ラクトフェリン封入リポソームをマウスに７日間連続で経口投与することによって、マウス末梢血単球のＬＰＳ刺激によるＴＮＦ−αの産生がコントロールと比較して約７０％抑制されることが判明した。その作用はポジティブコントロールであるシクロホスファミドよりも強かった。ラクトフェリン緩衝液投与群においても弱いＴＮＦ−α産生抑制効果が認められるものの、その効果はラクトフェリン封入リポソーム投与群のそれよりも小さかった。
【００４４】
ＴＮＦ−αは炎症、アレルギーに関与するサイトカインであるため、ＴＮＦ−α産生抑制効果を有するラクトフェリン封入リポソームは抗炎症、抗アレルギー効果を有すると考えられる。また、シクロホスファミドは抗腫瘍剤としての効果が確認されており、ラクトフェリン封入リポソームも抗腫瘍効果を有すると考えられる。
【００４５】
また、本実施例で使用した機器等は以下のとおりである。
【００４６】
エクストルーダー(LIPEX)、パーティクルサイザー(NICOMP)、CO2インキュベーター(SANYO)、Centrifuge(HITACHI)、光学顕微鏡(OLYMPUS)、イムノリーダー (InterMed)。
【００４７】
実施例３
ラクトフェリン封入リポソームの経口投与によるラット急性肝障害抑制作用
コントロール(pH 6.69のクエン酸緩衝液)、ラクトフェリン含有クエン酸溶液(pH6.69のクエン酸緩衝液に30mg/mlの濃度でラクトフェリンを溶解)、実施例１と同様の方法で調製したラクトフェリン封入リポソーム溶液及びコントロールとしてpH6.69のクエン酸緩衝液を調製した。これらのサンプルを、Wister系ラット(n=5)にＣＣｌ4を経口投与(オリーブオイルとの1:1の溶液を1ml/kgの濃度で経口投与)する８０、５６、３２、８時間前に、10ml/kg（ラクトフェリン濃度が300mg/kg）で経口投与した。ＣＣｌ4投与２４時間後にラットより血清を採取し、血清中のglutamic pyruvate transaminase (GPT)及びglutamic oxaloacetate transaminase (GOT)をoptimized UV法（GPT・GOTアッセイキット(Wako)）で測定し、血清1リットルあたりのU(ユニット)として算出した。また、ポジティブコントロールとしてドイツで肝炎用医薬品として使用されているシリマリン（アルドリッチ社製）を使用した。シリマリンはＣＣｌ4投与の３０分前、及び投与後４、８時間後に300mg/kgの濃度で経口投与した。
【００４８】
試験結果を表２及び図２に示す。
【００４９】
【表２】
試験結果より、リポソーム化ラクトフェリンをＣＣｌ4で肝障害を誘発する３日前から経口投与することによって、血清中のＧＰＴ及びＧＯＴ濃度がコントロールと比較して有意に減少することが確認された。この効果は医薬品であるシリマリンとほぼ同等である。ラクトフェリン緩衝液投与群においても弱いＧＰＴ及びＧＯＴ濃度減少作用が認められるものの、その効果はラクトフェリン封入リポソームに比較して小さかった。
【００５１】
シリマリンは、アルコール肝臓障害患者、慢性肝炎患者、肝硬変患者に対する臨床試験においてＧＯＴ及びＧＰＴ量低下や病状悪化遅延効果が既に確認されており、ラクトフェリン封入リポソームも同様な効果を有すると示唆された。
【００５２】
なお、本実施例で使用した機器等は以下のとおりである。
エクストルーダー(LIPEX)、パーティクルサイザー(NICOMP 370)、電子顕微鏡(JEOL JEM-100SX)、Centrifuge（HITACHI）、Automatic analyzer（HITACHI model 7050）。
【００５３】
処方例
実施例１と同様な方法で調製したリポソーム化ラクトフェリンを含有する以下に示す食品を製造した。
【００５４】
【００５５】
【００５６】
【００５７】
【発明の効果】
生理活性のある蛋白質を経口摂取したとき、胃酸や胃内、小腸内のタンパク質分解酵素によって分解され生理活性が抑制されてしまうため、経口摂取による利用が普及していなかったが、蛋白質をリポソームに封入することにより、蛋白質の生理活性の低下を抑制または生理活性を増強することができるため、このリポソームの経口摂取により蛋白質の生理活性を有効に利用できる。
【００５８】
特にラクトフェリン封入リポソームを経口投与すると、ラクトフェリンと比較して顕著なＴＮＦ−α産生抑制効果及びＧＯＴ、ＧＰＴ値抑制効果が示される。このため、ラクトフェリン封入リポソームを含有する経口摂取用組成物は、食品組成物、医薬組成物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２において測定された、マウス末梢血単球におけるＴＮＦ−α産生量（ｅｘ ｖｉｖｏ）を示すグラフである。
【図２】実施例３において測定された、ラットの急性肝障害における血清中のＧＰＴ濃度を示すグラフである。
【図３】実施例３において測定された、ラットの急性肝障害における血清中のＧＯＴ濃度を示すグラフである。
Claims (8)
- ラクトフェリンが封入され、レシチン及びフィトステロールを含んだリポソームを含有することを特徴とする経口摂取用組成物。
- レシチンのグリセロールの１位に炭素数１４〜２４の飽和脂肪酸、２位に炭素数１４〜２４の不飽和脂肪酸が結合していることを特徴とする請求項１に記載の経口摂取用組成物。
- レシチンが、卵黄レシチン及び大豆レシチンからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の経口摂取用組成物。
- レシチンとフィトステロールのモル比が、５５：４５〜９５：５である請求項１〜３のいずれかに記載の経口摂取用組成物。
- 経口摂取用組成物が食品組成物である請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
- 薬学的に許容される担体を含有し、経口摂取用組成物が医薬組成物である請求項１〜５のいずれかに記載の経口摂取用組成物。
- 医薬組成物が抗炎症剤である請求項６に記載の経口摂取用組成物。
- 医薬組成物が歯周病予防又は治療剤、アトピー性皮膚炎予防又は治療剤あるいは肝炎予防又は治療剤である請求項７に記載の経口摂取用組成物。
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