JP4436674B2 - 1α,25−ジヒドロキシビタミンD3の低カルシウム血症性オキシム類似体 - Google Patents
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Description
本発明は、特に癌、皮膚障害、骨障害、甲状腺障害、創傷治癒および骨粗鬆症の治療および/または予防における、酵素CYP24の選択的阻害を示し、低カルシウム血症性および抗増殖性であるホルモン1α,25-ジヒドロキシビタミンD3の新規類似体、それらを含有する薬学的組成物および診断用組成物、ならびにそれらの医学的使用に関する。
ビタミンD代謝経路は、一定段階で高度に調節される肝要な内分泌系の一部であり、副甲状腺ホルモンの分泌を制御する代謝産物を産生する(Beckman M.,and DeLuca H.(1997),Methods in Enzymol.282,200-223;Jones G.,Strugnell S.,and DeLuca H.(1998),Physiol.Rev.78,1193-1231)。ビタミンD経路において産生するホルモンである、カルシトリオール(下記参照)としても知られる1α,25-ジヒドロキシビタミンD3は、血中のリン酸塩およびカルシウムレベルを調節し、順に骨量、骨の状態を制御し、そして皮膚および免疫系における細胞分化に影響を及ぼす(Armbrecht H.J.,Okuda K.,Wongsurawat N.,Nemani R.,Chen M.,and Boltz M.,(1992),J.Steroid Biochem.Molec.Biol.43,1073-1081)。ビタミンD経路では、シトクロムP450は、通常はビタミンD3の1、25および24位で、ヒドロキシル化によって官能基を誘導する酵素である(Beckman M.,and DeLuca H.(1997),Methods in Enzymol.282,200-223)。
酵素CYP24の選択的阻害、抗増殖性および低カルシウム血症性を示す1α,25-ジヒドロキシビタミンD3の新規16-エン-25-オキシムおよび16-エン-25-オキシムエーテル類似体が調製されている。
(式中、
R1およびR2はOH、OC1-6アルキル、およびハロからなる群より独立して選択される;
R3はC1-6アルキルである;
R4はH、C1-6アルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、C1-6アルキルは未置換、またはC1-4アルキル、OC1-4アルキル、OH、ハロ、NH2、NHC1-4アルキルおよびN(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)から独立して選択される1〜4個の基と置換されており、そしてアリールおよびヘテロアリールは未置換、またはC1-4アルキル、OC1-4アルキル、OH、CF3、OCF3、ハロ、SH、SC1-4アルキル、NH2、NHC1-4アルキル、N(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)、CN、C(O)OH、C(O)OC1-4アルキル、C(O)NHC1-4アルキル、NHC(O)C1-4アルキル、OC(O)C1-4アルキル、SOC1-4アルキル、SO2C1-4アルキル、SO2NHC1-4アルキルおよびSO2NH2から独立して選択される1〜5個の基と置換されている;
R5はC1-6アルキル、シクロ(C3-C6)アルキル、アリール、ヘテロアリール、アリール-C1-6アルキルおよびヘテロアリール-C1-6アルキルからなる群より選択され、C1-6アルキルは未置換、またはC1-4アルキル、OC1-4アルキル、OH、ハロ、NH2、NHC1-4アルキルおよびN(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)から独立して選択される1〜4個の基と置換されており、そしてシクロ(C3-C6)アルキル、アリール、ヘテロアリール、アリール-C1-6アルキルおよびヘテロアリール-C1-6アルキルは未置換、またはC1-4アルキル、OC1-4アルキル、OH、CF3、OCF3、ハロ、SH、SC1-4アルキル、NH2、NHC1-4アルキル、N(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)、CN、C(O)OH、C(O)OC1-4アルキル、C(O)NHC1-4アルキル、NHC(O)C1-4アルキル、OC(O)C1-4アルキル、SOC1-4アルキル、SO2C1-4アルキル、SO2NHC1-4アルキルおよびSO2NH2から独立して選択される1〜5個の基と置換されている;および
R6はどちらもHであるか、または一緒に=CH2を形成する)の化合物、ならびにそれらの薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、およびプロドラッグを提供する。
(式中、
R1〜R6は上記で定義した通りである)の化合物、ならびにそれらの薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、およびプロドラッグを提供する。
(i)副甲状腺では-副甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能低下症、偽性副甲状腺機能低下症、続発性副甲状腺機能亢進症;
(ii)膵臓では-糖尿病;
(iii)甲状腺では-髄様癌
(iv)皮膚では-乾癬、創傷治癒;
(v)肺では-サルコイドーシスおよび結核;
(vi)腎臓では-慢性腎疾患、低リン酸血症性VDRR、ビタミンD依存性くる病;
(vii)骨では-抗痙攣療法、骨線維形成不全、膿嚢性線維性骨炎、骨軟化症、骨粗鬆症、骨減少症、骨硬化症、腎性骨ジストロフィ、くる病;
(viii)腸では-グルココルチコイド拮抗作用、特発性高カルシウム血症、吸収不良症候群、脂肪便症、熱帯性スプルー、が含まれるがそれらに限定されない。
(式中、
R1およびR2はOH、OC1-6アルキル、OPGおよびハロからなる群より独立して選択される;
PGは保護基である;
R3はC1-6アルキルである;
R5はC1-6アルキル、シクロ(C3-C6)アルキル、アリール、ヘテロアリール、アリール-C1-6アルキルおよびヘテロアリール-C1-6アルキルからなる群より選択され、C1-6アルキルは未置換、またはC1-4アルキル、OC1-4アルキル、OH、ハロ、NH2、NHC1-4アルキルおよびN(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)から独立して選択される1〜4個の基と置換されており、そしてシクロ(C3-C6)アルキル、アリール、ヘテロアリール、アリール-C1-6アルキルおよびヘテロアリール-C1-6アルキルは未置換、またはC1-4アルキル、OC1-4アルキル、OH、CF3、OCF3、ハロ、SH、SC1-4アルキル、NH2、NHC1-4アルキル、N(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)、CN、C(O)OH、C(O)OC1-4アルキル、C(O)NHC1-4アルキル、NHC(O)C1-4アルキル、OC(O)C1-4アルキル、SOC1-4アルキル、SO2C1-4アルキル、SO2NHC1-4アルキルおよびSO2NH2から独立して選択される1〜5個の基と置換されている;および
R6はどちらもHであるか、または一緒に=CH2を形成する)の化合物、およびその塩、水和物および溶媒和物も提供する。
NH2-OR4
III、
(式中、R4はH、C1-6アルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、C1-6アルキルは未置換、またはC1-4アルキル、OC1-4アルキル、OH、ハロ、NH2、NHC1-4アルキルおよびN(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)から独立して選択される1〜4個の基と置換されており、そしてアリールおよびヘテロアリールは未置換、またはC1-4アルキル、OC1-4アルキル、OH、CF3、OCF3、ハロ、SH、SC1-4アルキル、NH2、NHC1-4アルキル、N(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)、CN、C(O)OH、C(O)OC1-4アルキル、C(O)NHC1-4アルキル、NHC(O)C1-4アルキル、OC(O)C1-4アルキル、SOC1-4アルキル、SO2C1-4アルキル、SO2NHC1-4アルキルおよびSO2NH2から独立して選択される1〜5個の基と置換されている)の化合物、またはその塩、水和物もしくは溶媒和物とを非求核性アミンの存在下で反応させ、その後に存在する場合はあらゆる保護基を除去する段階を含む方法を提供する。
I.定義
本明細書で使用する用語「C1-6アルキル」は1〜6個の炭素原子を含有する直鎖状および/または分枝状の飽和もしくは未飽和アルキルラジカルを意味しており、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、s-ブチル、t-ブチル、ネオペンチル、ビニル、アリル、ブテニル等を含む。
酵素CYP24の選択的阻害、抗増殖活性を示し、そして低カルシウム血症性である新規化合物が調製されている。そこで本発明の化合物は、癌等の細胞増殖性疾患を治療するために有用である。
(式中、
R1およびR2はOH、OC1-6アルキル、およびハロからなる群より独立して選択される;
R3はC1-6アルキルである;
R4はH、C1-6アルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、C1-6アルキルは未置換、またはC1-4アルキル、OC1-4アルキル、OH、ハロ、NH2、NHC1-4アルキルおよびN(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)から独立して選択される1〜4個の基と置換されており、そしてアリールおよびヘテロアリールは未置換、またはC1-4アルキル、OC1-4アルキル、OH、CF3、OCF3、ハロ、SH、SC1-4アルキル、NH2、NHC1-4アルキル、N(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)、CN、C(O)OH、C(O)OC1-4アルキル、C(O)NHC1-4アルキル、NHC(O)C1-4アルキル、OC(O)C1-4アルキル、SOC1-4アルキル、SO2C1-4アルキル、SO2NHC1-4アルキルおよびSO2NH2から独立して選択される1〜5個の基と置換されている;
R5はC1-6アルキル、シクロ(C3-C6)アルキル、アリール、ヘテロアリール、アリール-C1-6アルキルおよびヘテロアリール-C1-6アルキルからなる群より選択され、C1-6アルキルは未置換、またはC1-4アルキル、OC1-4アルキル、OH、ハロ、NH2、NHC1-4アルキルおよびN(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)から独立して選択される1〜4個の基と置換されており、そしてシクロ(C3-C6)アルキル、アリール、ヘテロアリール、アリール-C1-6アルキルおよびヘテロアリール-C1-6アルキルは未置換、またはC1-4アルキル、OC1-4アルキル、OH、CF3、OCF3、ハロ、SH、SC1-4アルキル、NH2、NHC1-4アルキル、N(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)、CN、C(O)OH、C(O)OC1-4アルキル、C(O)NHC1-4アルキル、NHC(O)C1-4アルキル、OC(O)C1-4アルキル、SOC1-4アルキル、SO2C1-4アルキル、SO2NHC1-4アルキルおよびSO2NH2から独立して選択される1〜5個の基と置換されている;および
R6はどちらもHであるか、または一緒に=CH2を形成する)の化合物、およびその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、およびプロドラッグを提供する。
(式中、R1〜R6は上記で定義した通りである)の化合物、およびその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物およびプロドラッグを提供する。式Iの化合物の相対的立体化学は好ましくは上記に示した通りであるが、そのような式Iの化合物は代替立体化学を有する一定量(例えば、20%未満、好ましくは10%未満、より好ましくは5%未満)の式Iの化合物を含有する可能性があると理解されなければならない。例えば、上記に示した天然1α,25-ジヒドロキシビタミンD3の1α,3β-立体化学を有する式Iの化合物は、非天然1β,3α-立体化学を有する20%未満、好ましくは10%未満、より好ましくは5%未満の式Iの化合物を含有する可能性がある。
およびその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物およびプロドラッグが含まれる。本発明の好ましい化合物には、上記のようなI(a)、I(c)、I(e)、I(g)、I(i)およびI(k)の化合物、およびその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物およびプロドラッグが含まれる。
(式中、
R1およびR2はOH、OC1-6アルキル、OPGおよびハロからなる群より独立して選択される;
PGは保護基である;
R3はC1-6アルキルである;
R5はC1-6アルキル、シクロ(C3-C6)アルキル、アリール、ヘテロアリール、アリール-C1-6アルキルおよびヘテロアリール-C1-6アルキルからなる群より選択され、C1-6アルキルは未置換、またはC1-4アルキル、OC1-4アルキル、OH、ハロ、NH2、NHC1-4アルキルおよびN(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)から独立して選択される1〜4個の基と置換されており、そしてシクロ(C3-C6)アルキル、アリール、ヘテロアリール、アリール-C1-6アルキルおよびヘテロアリール-C1-6アルキルは未置換、またはC1-4アルキル、OC1-4アルキル、OH、CF3、OCF3、ハロ、SH、SC1-4アルキル、NH2、NHC1-4アルキル、N(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)、CN、C(O)OH、C(O)OC1-4アルキル、C(O)NHC1-4アルキル、NHC(O)C1-4アルキル、OC(O)C1-4アルキル、SOC1-4アルキル、SO2C1-4アルキル、SO2NHC1-4アルキルおよびSO2NH2から独立して選択される1〜5個の基と置換されている;および
R6はどちらもHであるか、または一緒に=CH2を形成する)の化合物、およびその塩、水和物および溶媒和物を提供する。
の化合物、およびその塩、水和物および溶媒和物が含まれる。好ましい式IIの化合物は、上記のように化合物II(a)およびII(c)、ならびにその塩、水和物および溶媒和物である。
本発明の別の態様によると、本発明の化合物は当技術分野において確立された工程に類似する工程によって調製できる。このため、本発明の化合物は、例えばスキーム1に示した反応順序によって調製できる。
このため、式Iの化合物は、式II(式中、R1〜R3、R5およびR6は式IIで定義された通りである)の化合物と式III(式中、R4は式Iで定義された通りである)の試薬とを、好ましくは非求核性アミンの存在下において、約0℃〜約40℃の範囲内の温度、適切には室温で反応させ、その後に(存在する場合は)あらゆる保護基を除去することによって調製できる。非求核性アミンは、例えばピリジンのようなあらゆる第3級芳香族または脂肪族アミンであってよく、好ましくは過剰な量で存在する。ピリジンが非求核性アミンである場合は、それを式IIの化合物から式Iの化合物へ転換させるための溶媒としても使用するのが好ましい。このオキシム誘導段階は式IIの化合物の酸感受性共役トリエン単位を破壊することなく進行するので、そのようなオキシム化段階が新規および様々な25-オキシムエーテル類似体のライブラリーを生成する際に有用であろうことを示唆している。主として式IのE-オキシムアルキルエーテルが入手されるのは、対応するZ-オキシムアルキルエーテルでは強度に不都合である立体的過密が存在するためである(Hawkes G.E.and Herwig K.;Roberts,J.D.J.Org.Chem.1974,39,1017-1028を参照)。
(式中、
R1およびR2はOH、OC1-6アルキル、OPGおよびハロからなる群より独立して選択される;
PGは保護基である;
R3はC1-6アルキルである;
R5はC1-6アルキル、シクロ(C3-C6)アルキル、アリール、ヘテロアリール、アリール-C1-6アルキルおよびヘテロアリール-C1-6アルキルからなる群より選択され、C1-6アルキルは未置換、またはC1-4アルキル、OC1-4アルキル、OH、ハロ、NH2、NHC1-4アルキルおよびN(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)から独立して選択される1〜4個の基と置換されており、そしてシクロ(C3-C6)アルキル、アリール、ヘテロアリール、アリール-C1-6アルキルおよびヘテロアリール-C1-6アルキルは未置換、またはC1-4アルキル、OC1-4アルキル、OH、CF3、OCF3、ハロ、SH、SC1-4アルキル、NH2、NHC1-4アルキル、N(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)、CN、C(O)OH、C(O)OC1-4アルキル、C(O)NHC1-4アルキル、NHC(O)C1-4アルキル、OC(O)C1-4アルキル、SOC1-4アルキル、SO2C1-4アルキル、SO2NHC1-4アルキルおよびSO2NH2から独立して選択される1〜5個の基と置換されている;および
R6はどちらもHであるか、または一緒に=CH2を形成する)の化合物、またはその塩、水和物および溶媒和物と式III:
NH2-OR4
III、
(式中、R4はH、C1-6アルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、C1-6アルキルは未置換、またはC1-4アルキル、OC1-4アルキル、OH、ハロ、NH2、NHC1-4アルキルおよびN(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)から独立して選択される1〜4個の基と置換されており、そしてアリールおよびヘテロアリールは未置換、またはC1-4アルキル、OC1-4アルキル、OH、CF3、OCF3、ハロ、SH、SC1-4アルキル、NH2、NHC1-4アルキル、N(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)、CN、C(O)OH、C(O)OC1-4アルキル、C(O)NHC1-4アルキル、NHC(O)C1-4アルキル、OC(O)C1-4アルキル、SOC1-4アルキル、SO2C1-4アルキル、SO2NHC1-4アルキルおよびSO2NH2から独立して選択される1〜5個の基と置換されている)の化合物、またはその塩、水和物もしくは溶媒和物とを非求核性アミンの存在下で反応させ、その後に存在する場合はあらゆる保護基を除去する段階を含む方法を提供する。
に示した通りに調製できる。式V(式中、R3およびR5は式Iで定義された通りである)のケトンは、式VI(式中、R1、R2およびR6は式Iで定義された通りである)の酸化ホスフィンを用いてC-8(C-25での立体障害のため)で、標準Horner-Wadsworth-Emmons(HWE)結合条件下において化学特異的に(chemospecifically)モノオレフィン化することができる(Posner G.H.ら,J.Org.Chem.1997,62,3299-3314を参照)。このため、酸化ホスフィンVIは、例えばフェニルリチウム等のアルキルリチウムのような強塩基を用いて、不活性大気および例えばテトラヒドロフラン(THF)等の溶媒中の無水条件下で、約-60℃〜約-90℃の範囲内の温度、適切には約-78℃で処理される。結果として生じる中間物イリドには、無水条件を維持しながらTHF等の不活性溶媒に溶解された低温の、好ましくは約-78℃のケトンVの溶液が添加される。(必要であれば)標準化学反応を使用することによってあらゆる保護基を除去した後、式IIの化合物を入手できる。
スキーム3
に示したように調製できる。適切に保護された式VII(式中、R3およびR5は式Iで定義された通りであり、PGは適切な保護基である)の化合物は最初に脱保護基化され、その後ケトンVを生成させるために酸化される。例えば、PGがトリエチルシリル等のトリアルキルシリルである場合は、脱保護基化はTHF等の不活性溶媒中および不活性大気中において、適切には約室温で式VIIの化合物をフッ化テトラブチルアンモニウム(TBAF)と反応させることによって実行できる。結果として生じるアルコールの酸化は、例えば4-メチルモルホリン-N-オキシド(NMO)またはその他の適切な酸化剤を使用して、塩化メチレン等の不活性溶媒中において標準条件下で実施できる。
スキーム4
に示したように調製できる。式VIII(式中、R3は式Iで定義された通りであり、PGは適切な保護基である)の化合物は、式IX(式中、R5は式Iで定義された通りである)の化合物のアニオンと、無水条件下、約-60℃〜約-90℃の範囲内の温度、適切には約-78℃で反応させることができる。式IXの化合物のアニオンは、式IXの化合物を例えばn-ブチルリチウムまたはリチウムジイソプロピルアミド(LDA)等のアルキルリチウムのような強塩基により、不活性条件下、および例えばN1,N,N1,N1-テトラメチルエチレンジアミン(TMEDA)のようなヘキサメチルホスホルアミド(HMPA)の存在下で処理することによって調製できる。
スキーム5
に示されたような対応するアルコールの酸化によって調製できる。酸化剤の例には、重クロム酸ピリジウム(PDC)、m-クロロ過安息香酸(mCPBA)および二酸化マンガンが含まれる。
上記で言及したように、式IおよびIIの新規化合物が調製されている。したがって、本発明には、細胞増殖を調節するための治療方法および組成物におけるそれらの使用、診断アッセイ法におけるそれらの使用、ならびに他の化学実体の調製における研究用ツールおよび出発物質および/または中間物としてのそれらの使用を含む本発明の化合物のすべての使用が含まれる。
(i)副甲状腺では-副甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能低下症、偽性副甲状腺機能低下症、続発性副甲状腺機能亢進症;
(ii)膵臓では-糖尿病;
(iii)甲状腺では-髄様癌
(iv)皮膚では-乾癬、創傷治癒;
(v)肺では-サルコイドーシスおよび結核;
(vi)腎臓では-慢性腎疾患、低リン酸血症性VDRR、ビタミンD依存性くる病;
(vii)骨では-抗痙攣療法、骨線維形成不全、膿嚢性線維性骨炎、骨軟化症、骨粗鬆症、骨減少症、骨硬化症、腎性骨ジストロフィ、くる病;
(viii)腸では-グルココルチコイド拮抗作用、特発性高カルシウム血症、吸収不良症候群、脂肪便症、熱帯性スプルー、が含まれるがそれらに限定されない。
材料および方法
他に特別に言及しない限り、すべての反応は超高純度アルゴンの大気下で撹拌されるオーブン乾燥ガラス容器中で実施した。THFはNa/ベンゾフェノンケチルから蒸留し、CH2Cl2は使用直前にCaH2から蒸留した。オルガノリチウムは、以下のよく知られた方法によって使用前に滴定した(Suffert J.J.Org.Chem.1989,54,509-510)。塩化メチレン(CH2Cl2)およびトリエチルアミン(Et3N)は、使用前に水素化カルシウムから蒸留した。その他すべての試薬は、民間供給業者から受領したままで使用した。分析的TLC分析は、プリコートされたガラス裏張りシリカゲルプレート(Merck Kieselgel 60 F254、厚さ250mm)上で実施し、p-アニスアルデヒドもしくはKMnO4色素を用いて可視化した。カラムクロマトグラフィーは、ショートパス・シリカゲル(粒径<230メッシュ)またはフラッシュシリカゲル(粒径230〜400メッシュ)を使用して実施した。分取プレートクロマトグラフィは、シリカゲルをコートしたAnaltech社のガラス製分取プレート(500〜1,000μm)を使用して実施し、UVにより分析した。高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)は、C-18化学結合シリカとしての60Åシリカゲル(孔径8μm)が装填されたRainin Dynamax 10mm×250mm(セミ分取)カラムおよび265mmに設定したRainin Dynamax UV-Cデュアル・ビーム可変波長検出器を使用する2つの25mL/min分取ポンプヘッドを装備したRainin HPLXシステムを使用して実施した。収率は、純粋生成物(クロマトグラフィーおよび分光法でのそれらの均質性に基づくと>95%)について報告しており、最適化されていない。旋光度は、Perkin-Elmer 141旋光計を使用してNaラインで測定した。核磁気共鳴(NMR)スペクトルは、1Hに対しては400MHz、および13Cに対しては100MHzで作動するVarian XL-400分光計上で入手した。化学シフトはppm(δ)で報告し、CDCl3(1Hに対しては7.26ppm、および13Cに対しては77.0ppm)、およびテトラメチルシラン(TMS、1Hに対して0.00ppm)へ関連付けた。紫外線(UV)スペクトルは、周囲温度でCary Bio 400分光計を使用して入手した。赤外線スペクトル(IR)は、Perkin-Elmer 1600シリーズのFT-IR機器を使用して入手した。吸収バンドは波数(cm-1)で報告した。低分解能および高分解能質量スペクトル(LRMSおよびHRMS)は、オハイオ州立大学の質量分析法研究施設において、Micromass QTOFエレクトロスプレー質量分析計上で電子イオン化または化学イオン化(EIまたはCI)を用いて入手した。
15mLの丸底フラスコにトリイソプロピルアミン(42mg、0.41mmol、7.4当量-使用前に水素化カルシウムの上方で蒸留した)および2mLの蒸留THFを装填した。この溶液を-78℃へ冷却し、シリンジを介してn-ブチルリチウム(250μLの1.6M溶液、0.43mmol、7.2当量)を添加した。ピナコロン(IX、R5=t-ブチル)(39mg、0.39mmol、7.0当量-使用直前の24時間に炭酸カリウムおよび活性化モレキュラーシーブの上方で乾燥した)を1mLの蒸留THF中に溶解し、-78℃へ冷却し、その時点にカニューラを介して反応フラスコへ添加した。この反応液を30分間攪拌した。その後、シリンジを介してヘキサメチルホスホルアミド(HMPA、250μL)を添加し、さらに15分間攪拌し続けた。1mLのTHF中に溶解したヨウ化物(-)-VIII(R3=CH3、PG=トリエチルシリル(TES))(25mg、0.06mmol)を-78℃へ冷却し、カニューラを介して反応混合液へ添加した。この反応混合液を-78℃で2時間攪拌し、ドライアイス/アセトニトリル浴中で-41℃へ加温し、その時点から2時間にわたって室温へ加温するに任せ、さらに6時間攪拌し続けた。結果として生じた黄色溶液を水2mLで急冷し、酢酸エチル(3×25mL)によって抽出し、MgSO4の上方で乾燥し、濃縮し、そしてシリカゲル・カラムクロマトグラフィー(0〜20%酢酸エチル/石油エーテル)によって精製し、無色油(18mg、76%)を得た。
15mLの丸底フラスコへ5mLの蒸留THF中に溶解したtert-ブチルケトンVII(R3=CH3、R5=t-ブチル、PG=TES)(18mg、0.4mmol)を装填した。この反応フラスコへフッ化水素化テトラブチルアンモニウム(TBAF、112mg、10当量)および4Åモレキュラーシーブ(100mg)を添加し、この溶液を環流させながら4時間攪拌し続けた。分析用薄層クロマトグラフィー(TLC)で出発物質を視認できなくなるまで、追加部分のTBAFおよびモレキュラーシーブを4時間毎に添加した。過剰なTBAFおよびモレキュラーシーブを取り除くために、溶離剤として酢酸エチルを使用してこの反応液をシリカゲル栓に通して濾過した。この溶液を濃縮し、結果として生じた物質を5mLの蒸留ジクロロメタン(CH2Cl2)中に溶解して10mLの丸底フラスコへ装填した。この溶液に4Åモレキュラーシーブ(20mg)、4-メチルモルホリン-N-オキシド(NMO、10mg、0.09mmol、2当量)および触媒量の過ルテニウム酸テトラプロピルアンモニウム(TPAP)を添加した。1時間の攪拌後に、TLCにより出発物質の完全な消費が証明された。TPAPおよびモレキュラーシーブを取り除くために、溶離剤として酢酸エチルを使用することによりこの反応液をシリカゲルのプラグに通して濾過した。この反応溶液を濃縮し、シリカゲル・カラムクロマトグラフィー(20%酢酸エチル/石油エーテル)によって精製して無色油(9mg、71%)を得た。
無水酸化ホスフィン(±)-VI(R1,R2=O-t-ブチルジメチルシリル(OTBDMS))(79mg、0.14mmol、1.4当量)を2.5mLの蒸留THF中に溶解し、-78℃へ冷却した。シリンジを介してフェニルリチウム(シクロヘキサン-エーテル中の1.7M溶液88μL、0.15mmol、1.5当量)を滴下法で添加すると深紅色になった。この溶液を20分間攪拌し続けた。無水CD環状ケトン(+)-V(R3=CH3、R5=t-ブチル)(31mg、0.10mmol)を1.5mLの蒸留THF中に溶解し、-78℃へ冷却した。カニューラを介してこの溶液を反応混合液へ添加すると、赤色が持続した。この溶液を暗所の-78℃で7時間攪拌し、その時点で飽和炭酸カリウム(1mL)および酒石酸カリウムナトリウム(2mLの2M溶液)によって急冷した。生成物を酢酸エチル(4×60mL)によって抽出し、MgSO4を使用して乾燥し、濾過し、濃縮し、シリカゲル・カラムクロマトグラフィー(1%Et3Nを用いて緩衝した3〜10%酢酸エチル/ヘキサン)によって精製して無色油を得た。2.5mLのTHF中に溶解したこの油を5mLの丸底フラスコに装填し、TBAF水和物(241mg、0.92mmol、14当量)、4Åモレキュラーシーブ(100mg)、および3滴のEt3Nを連続的に装填した。この溶液を室温の暗所で8時間攪拌し続けた。シリカゲル・カラムクロマトグラフィー(1%Et3Nを用いて緩衝した99%酢酸エチル)によってこの反応混合液を直接的に精製するとジアステレオマーの混合物(1:3.5)としてII(a)およびII(b)(15mg、38%)が得られ、順相HPLCクロマトグラフィー(1%Et3Nを用いて緩衝した90%酢酸エチル/ヘキサン)によってこの混合物を分離すると、2mg(5%、全体では3%)の天然A環異性体II(b)が得られた。II(a)(1β,3α):
順相HPLCクロマトグラフィーを使用するとジアステレオマーを分離することはできたが、最高分離は極少量(〜200μg以下)の注入を使用した場合にのみ達成できた。
無水酸化ホスフィン(±)-VI(R1,R2=O-OTBDMS)(89mg、0.15mmol、2当量)を2.5mLの蒸留THF中に溶解し、-78℃へ冷却した。シリンジを介してフェニルリチウム(シクロヘキサン-エーテル中の1.8M溶液93μL、0.17mmol、2.2当量)を滴下法で添加すると深紅色が生じた。この溶液を20分間攪拌し続けた。無水CD環状ケトン(+)-II(R3=CH3、R5=t-ブチル)(23mg、0.08mmol)を1.5mLの蒸留THF中に溶解し、-78℃へ冷却した。カニューラを介してこの溶液を反応混合液へ添加すると、赤色が持続した。この溶液を-78℃の暗所で7時間攪拌し、その時点で飽和炭酸カリウム(1mL)および酒石酸カリウムナトリウム(2mLの2M溶液)によって急冷した。この生成物を酢酸エチル(4×60mL)によって抽出し、MgSO4を使用して乾燥し、濾過し、濃縮し、シリカゲル・カラムクロマトグラフィー(1%Et3Nを用いて緩衝した3〜10%酢酸エチル/ヘキサン)を用いて精製して無色油を得た。2mLの無水ピリジン中に溶解したこの物質(27mg、0.04mmol)を5mLの丸底フラスコに装填した。塩酸ヒドロキシルアミン(III、R4=H)(51mg、0.74mmol、20当量)を添加し、この反応液を室温の暗所で24時間攪拌し続けると、その時点にTLC分析で出発物質の完全な消費および新規のより極性生成物の外観が明らかになった。シリカゲル・カラムクロマトグラフィー(1%Et3Nを用いて緩衝した10%酢酸エチル/ヘキサン)を用いてこの物質を直接的に精製して無色油を得た。5mLの丸底フラスコへ、2.5mLのTHF中に溶解したこの油、TBAF水和物(135mg、0.52mmol、14当量)、4Åモレキュラーシーブ(60mg)、および3滴のEt3Nを連続的に装填した。この溶液を室温の暗所で8時間攪拌し続けた。この反応混合液をシリカゲル・カラムクロマトグラフィー(1%Et3Nを用いて緩衝した99%酢酸エチル)によってジアステレオマー(1:3.5)の混合物としてのI(a)およびI(b)(14mg、61%)へ直接に精製し、逆相HPLCクロマトグラフィー(38%H2O/アセトニトリル)によって分離すると2.3mg(16%、全体では5%)のI(a)および4.0mg(29%、全体では10%)のI(b)が得られた。I(a)(1β,3α):
無水酸化ホスフィン(±)-VI(R1,R2=OTBDMS、R6==CH2)(89mg、0.15mmol、2当量)を2.5mLの蒸留THF中に溶解し、-78℃へ冷却した。シリンジを介して滴下法でフェニルリチウム(シクロヘキサン-エーテル中の1.8M溶液93μL、0.17mmol、2.2当量)を添加すると深紅色になった。この溶液を20分間攪拌し続けた。無水CD環状ケトン(+)-II(R3=CH3、R5=t-ブチル)(23mg、0.08mmol)を1.5mLの蒸留THF中に溶解し、-78℃へ冷却した。カニューラを介してこの溶液を反応混合液へ添加すると、赤色が持続した。この溶液を-78℃の暗所で7時間攪拌し、その時点で飽和炭酸カリウム(1mL)および酒石酸カリウムナトリウム(2M溶液2mL)によって急冷した。酢酸エチル(4×60mL)によってこの生成物を抽出し、MgSO4を使用して乾燥し、濾過し、濃縮し、シリカゲル・カラムクロマトグラフィー(1%Et3Nを用いて緩衝した3〜10%酢酸エチル/ヘキサン)を用いて精製して無色油を得た。1.5mLの無水ピリジン中に溶解したこの物質の1部分(12mg、0.02mmol)を5mLの丸底フラスコに装填した。塩酸ヒドロキシルアミン(III、R4=CH3)(27mg、0.33mmol、20当量)を添加し、この反応液を室温の暗所で攪拌し続けた。追加部分のメトキシルアミンのを添加し(総計、60当量)、この反応液を計36時間攪拌した。この出発物質および生成物は極性が極めて類似していたので、TLC分析はこの反応の追跡に特に有用ではなかった。この物質をシリカゲル・カラムクロマトグラフィー(1%Et3Nを用いて緩衝した3%酢酸エチル/ヘキサン)によって直接的に精製して無色油を得た。5mLの丸底フラスコへ、2mLのTHF中に溶解したこの油、TBAF水和物(59mg、0.22mmol、14当量)、4Åモレキュラーシーブ(60mg)、および1滴のEt3Nを連続的に装填した。この溶液を室温の暗所で24時間攪拌し続けた。この反応混合液をシリカゲル・カラムクロマトグラフィー(1%Et3Nを用いて緩衝した99%酢酸エチル)によってジアステレオマー(1:3.5)の混合物としてのI(c)およびI(d)(6mg、59%)へ直接に精製し、逆相HPLCクロマトグラフィー(15%H2O/アセトニトリル)によって分離すると1.4mg(19%、全体では6%)のI(c)および2.8mg(37%、全体では12%)のI(d)が得られた。I(c)(1β,3α):
同様の方法で、以下の追加の化合物を調製した。
I(f)(1β,3α)についてのデータは、化合物の量が不十分であったため入手しなかった。
I(h)(1β,3α)MK-1625(NOAII)-TB-1についてのデータは、化合物の量が不十分であったため入手しなかった。
I(j)(1β,3α)についてのデータ
2.0mLの無水THF中に溶解した53mg(0.094mmol)の19-ノル-酸化ホスフィンVI(R1,R2=OTBDMS,R6=H)の溶液を-78℃へ冷却し、59μL(0.094mmol、ヘキサン中の1.6M)のn-BuLiを用いてアルゴン大気下で処理した。この混合液は深紅色へ変色し、-78℃で15分間撹拌した。この溶液へカニューラを介して1.5mLの無水THF中に溶解した10mg(0.031mmol)のCD環状ケトンV(R3=CH3、R5=t-ブチル、実施例2を参照)の前もって冷却した(-78℃)溶液を滴下法で添加した。赤みがかった橙色が黄色へ色あせするまでこの反応を持続させた(約2時間)。-78℃で1.0mLのpH7バッファーを添加することによってこの反応液を急冷し、その後室温へ加温し、EtOAc(20mL×2)によって抽出し、食塩液により洗浄し、MgSO4の上方で乾燥し、濃縮した。溶離剤としてEtOAc/ヘキサン(1/15)を用いるカラムクロマトグラフィーにこの残留物をかけると、無色油として11mg(52%)の結合生成物が得られた。
(i)材料および試薬:
1,25(OH)2D3 10-5M
[3H]-1,25(OH)2D3 25,000CPM/μL
HPK1A-ras細胞
48ウェルプレート
メタノール
ジクロロメタン
飽和KCl:KCl 30g、H2O 400mL
1.HPK1A-ras細胞の誘導(アッセイ前日)
HPK1A-ras細胞が80〜90%コンフルエントである場合は、プレート内の1mL培地へ1μLの10-5Mの1,25(OH)2D3を添加した(最終濃度は10-8Mである)。
2.細胞懸濁液の調製
18〜20時間の誘導後、培地を除去し、PBSを用いて細胞を2回洗浄した。その後プレートからの細胞をトリプシン化し、遠心し(2,000rpm、5分間)、細胞ペレットをDMEM培地+1%BSA中へ懸濁させた。
細胞を計数し、細胞密度を250,000/150μLへ調整し、48ウェルプレート内の各ウェルへ150μLの細胞懸濁液を添加した(細胞無含有対照としての3ウェル、および対照としての薬剤もしくは阻害剤を含まない3ウェルの細胞を含む)。
3.指定された各ウエル内に25μLのケトコナゾール(最終濃度10-5M、10-6M、10-7M、10-8M)または薬剤を添加した。このプレートを37℃で10分間維持した。
4.基質の調製
一定量のDMEM+1%BSA培地(25*ウェル数+200)μLを試験管へ入れ、一定量の3H-1,25(OH)2D3(ウェル数+2)μLおよび一定量の100mM DPPD(ウェル数/5)μLを添加し、それらをボルテックスミキサーで混合した。
5.インキュベーション
各ウェルに25μLを添加し、このプレートを37℃で3時間インキュベートした。総計数として計数プレート(2ウェル)へ25μLの基質を添加した。
6.脂質の抽出および計数
各ウェルへ500μLのメタノールを添加して反応を停止させ、それらを試験管へ移した。
250μLのジクロロメタンを添加し、ボルテックスミキサーで混合した。
250μLのジクロロメタンおよび250μLの飽和KClを添加し、ボルテックスミキサーで混合した。
4,000rpmで5分間遠心した。
100μLの水相(上相)をプラスチック製計数プレートへ移した。各ウェルに600μLのシンチレーション液を添加した。このプレートをシンチレーション計数管で計数した。
7.酵素活性の計算
NCCのCPMを差し引いた後の細胞対照のCPMが100%酵素活性である。
酵素活性=(試験化合物ウェル中のCPM-NCCウェル中のCPM)/(細胞対照中のCPM-NCCウェル中のCPM)*100%
ケトコナゾールの希釈
ストック溶液10-2M
試験化合物の希釈
ストック溶液10-3M
式I(a)、I(c)、I(e)、I(g)、I(i)およびI(k)の化合物はケトコナゾールに比較してCYP24の有意に大きな阻害を示した。ケトコナゾールと比較して化合物I(a)およびI(c)(各々BH1625(NOH)-(CTA062)TB-2およびBH-1625(NOMe)-TB-2(CTA065)として示した)によるCYP24活性の阻害を示したグラフは図1Aに示した。
(A)一過性トランスフェクション
(i)試薬および材料
1.COS-1細胞(50〜80%コンフルエント)
2.FuGene 6トランスフェクション試薬
3.CYP-1αヒドロキシラーゼcDNA(1μg/μL)を含有するPcDNAベクター
4.DMEM培地+10%FCS
5.DMEM培地(血清無含有)
6.6ウェルプレート
1.無菌試験管へ血清無含有培地(1ウェル当たり100μL)を添加し、さらにFuGene 6試薬(1ウェル当たり3μL)を添加した。混合するために軽くたたいた。順番に注意を払った。FuGene 6試薬を培地へ直接に添加し、未希釈FuGene 6試薬はピペットチップ以外のプラスチック表面と接触させなかった。
2.段階2からの事前に希釈したFuGene 6試薬へDNA溶液(1ウェル当たり1μg)を添加した。
3.内容物が混合するように試験管を軽くたたいた。ボルテックスミキサーにはかけなかった。室温で15分間インキュベートした(45分間を超えずに)。
1.COS-1細胞をトリプシン化し、細胞懸濁液を遠心し、DMEM培地+10%FCS中へ細胞ペレットを懸濁させた。
2.細胞懸濁液を750,000cell/mL(75cell/平方)へ希釈した。
1.1.7mLのDMEM培地+10%FCSを6ウェルプレートの各ウェルへ添加した。
2.正確な容量の細胞懸濁液(200μL/ウェル)をトランスフェクションカクテルへ移した。静かに混合した。
3.この混合液0.3mLを各ウェルへ添加した。各ウェルへ確実に同一量の細胞が添加されるようにした。確実に一様に分散するようにウェルを回転させた。
4.酵素活性アッセイ法を実施するまで、細胞を37℃、5%CO2で24時間インキュベートした。
(i)試薬および材料
DMEM培地+1%BSA
PBS
[3H-26,27]-25(OH)D3
DPPD 100mM
1.細胞をPBSにより1回洗浄した。付着した細胞を傷害しないように注意を払った。
2.各ウエルに0.55mLの培地(DMEM+1%BSA)を添加した。
3.試験化合物を含有する0.025mLの培地を添加した。
4.細胞を10分間インキュベートした。
5.[3H-26,27]-25(OH)D3(50,000CPM)およびDPPD(0.6μLストック溶液)を含有する0.025mLの培地を添加した。
6.細胞を2時間インキュベートした。
7.1.5mLのメタノールを添加して反応を停止させた。
8.内部標準物質を添加した。
9.培地をラベル表示した試験管へ移した。
10.0.75mLのジクロロメタンを添加し、ボルテックスミキサーにかけ、室温で15分間維持した。
11.0.75mLのジクロロメタンおよび0.75mLの飽和KClを添加した。
12.ボルテックスミキサーにかけ、遠心した。
13.上相を除去し、Speed-Vac内で下相を乾燥した。
14.110μLの移動相を添加し、ボルテックスミキサーにかけ、5分間遠心した。
15.HPLCバイアル内のインサートへ105μLを移した。
16.HPLC分析条件:
溶媒:ヘキサン/イソプロパノール/メタノール(91/7/2)
カラム:SIL 3μLカラム
流量:2mL/min
検出器:UV検出器および放射性検出器
式I(a)、I(c)、I(e)、I(g)、I(i)およびI(k)の化合物はCYP27B1の阻害をほとんどないし全く示さなかった(IC50>10,000nM)。化合物I(a)およびI(c)(各々BH1625(NOH)-(CTA062)TB-2およびBH-1625(NOMe)-TB-2(CTA065)として示した)によるCYP27B1活性の阻害をケトコナゾールと比較して示したグラフは図1Bに示した。
式I(a)、I(c)、I(e)、I(g)、I(i)およびI(k)の化合物はCYP27A1の阻害をほとんどないし全く示さなかった(IC50>10,000nM)。化合物I(a)およびI(c)(各々BH1625(NOH)-(CTA062)TB-2およびBH-1625(NOMe)-TB-2(CTA065)として示した)によるCYP27B1活性の阻害をケトコナゾールと比較して示したグラフは図1Cに示した。
(A)試薬および材料
1.VDR 9.3pmol/μL(ヒト、組換え、Biomol)
2.エタノール中の[3H]-1,25(OH)2D3
3.エタノール中の1,25(OH)2D3
4.TEK300
トリス-HCl 50mM
EDTA 1.5mM
KCl 300mM
pHを7.4へ調整した(25℃)
5.TEDK300
TEK300
DTT(ジチオトレイトール) 10mM(分子量154.24)
6.トリスバッファー
トリス-HCl 22.50g
H2O 500mL
トリスベース 13.25g
H2O 500mL
4℃で維持した
7.デキストラン-T70(分子量70,000) Pharmacia
8.活性炭(中性炭素脱色用、Norit) Fishery
9.ゼラチン(G-2625 Sigma)
1.活性炭デキストラン溶液
(1) トリスバッファー
等量のトリス-HClおよびトリスベースを混合した。
(2) Norit中性脱色用活性炭 2.0g
トリスバッファー 150mL
攪拌した
(3) デキストラン-T-70 0.2g
トリスバッファー 50mL
(4) 懸濁させたデキストランを活性炭溶液内に攪拌しながら緩徐に滴下した。
冷蔵庫に一晩保管した。
使用前の30分間、持続的に混合しながら氷上に保管した。
ブタゼラチン 50mg
TEDK300溶液 5mL
加熱し、攪拌し、その後4℃へ冷却した。
5mLのTEDK300溶液
1,25(OH)2D3:125、250、500、1,000、2,000、4,000pg/25μL(ストック溶液10-5M/25μL=100,000pg/25μL)
試験化合物:12,500、25,000、50,000、100,000、200,000および400,000pg/25μL(4*10-5M/25μL=400,000pg/25μL)
2.5mLのTEDK300/ゼラチン液(500μL/試験管)(氷上で保管した)中の1μLのストック溶液VDR
VDRからの50%の[3H]-1,25(OH)2D3を置換するための1,25(OH)2D3の量は、1,25(OH)2D3に対するB50として計算した。他の化合物のVDR結合は、1,25(OH)2D3に対する数値1に比較したB50として計算した。
トランスポーターDタンパク質(DBP)への化合物I(a)およびI(c)(各々BH-1625(NOH)-(CTA062)TB-2およびBH-1625(NOMe)-TB-2(CTA065)として示した)の結合を1α,25-ジヒドロキシビタミンD3および25-ジヒドロキシビタミンD3と比較して示したグラフは図2に示した。
(A)試薬および材料:
Mark Haussler博士およびKerr Whitfield博士(アリゾナ大学、トゥーソン、アリゾナ州)からのpSG5-hVDR1/3;Mark Haussler博士およびKerr Whitfield博士(アリゾナ大学、トゥーソン、アリゾナ州)からのpSG5ベクター(CT4)4TKGHのEcoRI部位に挿入されたhVDR1/3 DNA;ヒトGH遺伝子へ連結されたチミジンプロモーターを有するpTKGHベクター内へライゲーションかつアニーリングされたCT4合成ラットオステオカルシンVDREの4コピー
hGH ELISAキット Boehringer Mannheim
Fugene 6トランスフェクション試薬
COS-1細胞
DMEM培地およびDMEM培地+10%FCS
1,25(OH)2D3および試験化合物
1.トランスフェクション1日前に24ウェルプレート(5,000cell/プレート)内へCOS細胞を継代培養した。
2.カクテルの調製(量はトランスフェクトするウェル数に依存した)
(1)無菌試験管へ血清無含有培地(1ウェル当たり100μL)を添加し、さらにFuGene 6試薬(1ウェル当たり0.6μL)を添加した。混合するために軽くたたいた。順番に注意を払った。FuGene 6試薬を培地へ直接に添加し、未希釈FuGene 6試薬はピペットチップ以外のプラスチック表面と接触させなかった。
(2)段階2からの事前に希釈したFuGene 6試薬へDNA溶液(pSG5-hVDR1/3および(CT4)4TKGHベクター)(1ウェル当たり0.1μg)を添加した。
(3)内容物が混合するように試験管を軽くたたいた。ボルテックスミキサーにはかけなかった。室温で15分間インキュベートした(45分間は超えずに)。
3.培地を取り除き、0.4mLの新鮮培地と取り替えた。
4.滴下法で各ウェルへ100μLのカクテルを添加した。
トランスフェクションの30分間〜1時間後、1,25(OH)2D3(対照として)および試験化合物を20μL培地中の培地へ添加した。1,25(OH)2D3の濃度範囲は10-1〜10-8M(10-10、3*10-9、10-9、3*10-8、10-8M)であり、試験化合物の濃度範囲は3*10-9M〜10-7M(3*10-9、10-9、3*10-8、10-8、3*10-8、10-7M)であった。インキュベーションは24時間継続した。
24時間のインキュベーション後、ヒトGH測定のために培地の200μLの希釈アリコート(20〜50倍の希釈)を使用した。サンプルはhGH ELISAキットの取扱説明書によってアッセイした。
ビタミンD転写アッセイ法における化合物I(a)およびI(c)(各々BH1625(NOH)-(CTA062)TB-2およびBH-1625(NOMe)-TB-2(CTA065)として示した)の活性を1α,25-ジヒドロキシビタミンD3に比較して示したグラフは図3に示した。
(A)試薬:
1.トリスバッファー:
トリス-HCL 22.50g
H2O 500mL
2.トリスベース 13.25g
H2O 500mL
4℃で維持した。
3.デキストラン-T70(分子量70,000) Pharmacia
4.活性炭(中性炭素脱色用、norit) Fishery
5.DBP(ビタミンD結合タンパク質)(ヒト血漿)
6.[3H]25(OH)D3
7.ゼラチン(G-2625 Sigma)
1.トリスバッファー
等量の2種のトリスバッファーを混合した。
2.デキストランをコートした活性炭溶液
(1)活性炭溶液の調製
Norit中性脱色用活性炭 2.0g
トリスバッファー 150mL
撹拌した
(2)デキストラン溶液の調製
デキストランT-70 0.2g
トリスバッファー 50mL
(3)デキストランをコートした活性炭溶液の調製
デキストラン溶液を撹拌しながら活性炭溶液へ緩徐に滴下した。
冷蔵庫で一晩保存した。
使用前の30分間、継続的に撹拌しながら氷上で保管した。
この溶液を2ヵ月間、4℃で保管した。
3.トリスバッファー/ゼラチン溶液
ブタゼラチン 250mg
トリスバッファー 50mL
加熱し、撹拌し、氷上で冷却した。
使用直前に調製した。
4.DBP溶液
ヒト血漿はトリスバッファー/ゼラチン溶液を用いて1:5,000へ希釈した。
5.標準物質25(OH)D3の希釈
ストック溶液 10,000pg/50μL
エタノールを用いて0、62.5、125、250、500、750、1,000、10,000pg/50μLへ希釈した。
6.標準物質1,25(OH)2D3の希釈
ストック溶液 200,000pg/50μL(10-5M/50μL)
エタノールを用いて0、6,250、12,500、25,000、50,000、100,000、200,000pg/50μLへ希釈した。
7.試験化合物の希釈
ストック溶液 200,000pg/50μL(10-3M)
エタノールを用いて12,500、25,000、50,000、100,000、200,000および400,000pg/50μLへ希釈した。
8.[3H-26,27]-25(OH)2D3溶液
このストック溶液はトリスバッファー中で希釈した(20,000CPM/50μL)。
50%の[3H]-25(OH)D3を置換するための25(OH)D3の量は25(OH)D3DBP結合に対するB50として計算した。他の化合物のDBP結合は25(OH)D3に対する数値1に比較したB50として計算した。
ビタミンD受容体(VDR)結合アッセイ法における化合物I(a)およびI(c)(各々BH-1625(NOH)-(CTA62)TB-2およびBH-1625(NOMe)-TB-2(CTA65)として示した)の活性を1α,25-ジヒドロキシビタミンD3に比較して示したグラフは図4に示した。
式I(a)およびI(c)の化合物は、標準プロトコール(Posner G.H.ら,J.med.Chem.1992,35,3280-3287)を使用してマウスケラチノサイト中での抗増殖活性についてインビトロでアッセイした。ケラチノサイト増殖に化合物I(a)およびI(c)が及ぼす用量反応作用を1α,25-ジヒドロキシビタミンD3もしくはカルシトリオールに比較した示したグラフは図5に示した。
動物におけるそれらの安全性の尺度として、以前に記載された方法(Posner G.H.ら,J.Med.Chem.1999,42,3425-3435)を使用して、式I(a)の化合物をカルシトリオールへの類似用量(0.5μg/kg(体重))で1週間にわたり毎日、ラットへ経口投与した。ラット尿中のカルシウムレベルに式I(a)の化合物が及ぼす作用をカルシトリオール(1α,25-ジヒドロキシビタミンD3)と比較して示したグラフは図6に示した。
Claims (32)
- 式I:
(式中、
R1およびR2はOHであり;
R3はCH3であり;
R4はH、C1-6アルキル、フェニルおよびピリジルからなる群より選択され、C1-6アルキルは未置換、またはC1-4アルキル、OC1-4アルキル、OH、ハロ、NH2、NHC1-4アルキルおよびN(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)から独立して選択される1〜4個の基と置換されており、かつフェニルおよびピリジルは未置換、またはC1-4アルキル、OC1-4アルキル、OH、ハロ、NH2、NHC1-4アルキルおよびN(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)から独立して選択される1〜5個の基と置換されており;
R5はC1-6アルキルおよびシクロ(C3-C6)アルキルからなる群より選択され、C1-6アルキルは未置換、またはC1-4アルキルおよびハロから独立して選択される1〜4個の基と置換されており、かつシクロ(C3-C6)アルキルは未置換、またはC1-4アルキル、CF3およびハロから独立して選択される1〜5個の基と置換されており;および
R6はどちらもHであるか、または一緒に=CH2を形成する)の化合物、ならびにそれらの薬学的に許容される塩、水和物、および溶媒和物。 - R4がH、フェニル、およびC1-4アルキルからなる群より選択される、請求項1記載の化合物。
- R4がH、フェニル、アリル、およびCH3からなる群より選択される、請求項2記載の化合物。
- R5がイソプロピル、s-ブチル、t-ブチル、およびネオペンチルからなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか一項記載の化合物。
- R5がt-ブチルである、請求項4記載の化合物。
- オキシムのC=N二重結合についての幾何学的形状がトランスである、請求項1〜5のいずれか一項記載の化合物。
- 両方のR6がHである、請求項1記載の化合物。
- 化合物I(a)、I(c)、I(e)、I(g)、I(i)、およびI(k)からなる群より選択される、請求項8記載の化合物。
- R5がイソプロピル、s-ブチル、t-ブチル、およびネオペンチルからなる群より選択される、請求項11記載の化合物。
- 請求項1〜10のいずれか一項記載の化合物および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
- 1α,25-ジヒドロキシビタミンD3のレベルの調節から利益が得られる疾患を治療するための医薬品を調製するための、請求項1〜10のいずれか一項記載の化合物の使用。
- 1α,25-ジヒドロキシビタミンD3の異化作用の阻害から利益が得られる疾患を治療するための医薬品を調製するための、請求項1〜10のいずれか一項記載の化合物の使用。
- 疾患が癌、皮膚障害、および骨障害からなる群より選択される、請求項15〜16のいずれか一項記載の使用。
- 疾患が癌、乾癬、および骨粗鬆症からなる群より選択される、請求項17記載の使用。
- 細胞増殖を治療するための医薬品を調製するための、請求項1〜10のいずれか一項記載の化合物の使用。
- 細胞が癌細胞である、請求項19記載の使用。
- 癌が乳癌、肺癌、および前立腺癌から選択される、請求項20記載の使用。
- CYP24活性を阻害するための医薬品を調製するための、請求項1〜10のいずれか一項記載の化合物の使用。
- 1α,25-ジヒドロキシビタミンD3のレベルを調節する医薬品を調製するための、請求項1〜10のいずれか一項記載の化合物の使用。
- 1α,25-ジヒドロキシビタミンD3の異化作用を阻害する医薬品を調製するための、請求項1〜10のいずれか一項記載の化合物の使用。
- 細胞増殖を阻害するための、請求項1〜10のいずれか一項記載の化合物の使用。
- 細胞増殖を阻害する医薬品を調製するための、請求項1〜10のいずれか一項記載の化合物の使用。
- CYP24活性を阻害するための、請求項1〜10のいずれか一項記載の化合物の使用。
- CYP24活性を阻害する医薬品を調製するための、請求項1〜10のいずれか一項記載の化合物の使用。
- ビタミンD受容体アゴニストの有効性を上昇させる医薬品を調製するための、請求項1〜10のいずれか一項記載の化合物の使用。
- ビタミンD受容体アゴニストが1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(カルシトリオール)である、請求項29記載の使用。
- 式Iの化合物を調製する方法であって、請求項11〜13のいずれか一項記載の化合物と式III:
NH2-OR4
III、
(式中、R4はH、C1-6アルキル、フェニルおよびピリジルからなる群より選択され、C1-6アルキルは未置換、またはC1-4アルキル、OC1-4アルキル、OH、ハロ、NH2、NHC1-4アルキルおよびN(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)から独立して選択される1〜4個の基と置換されており、かつフェニルおよびピリジルは未置換、またはC1-4アルキル、OC1-4アルキル、OH、ハロ、NH2、NHC1-4アルキルおよびN(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)から独立して選択される1〜5個の基と置換されている)の化合物、またはその塩、水和物、もしくは溶媒和物とを非求核性アミンの存在下で反応させ、その後に存在する場合はあらゆる保護基を除去する段階を含む方法。 - アミンがピリジンである、請求項31記載の方法。
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