ES2283593T3

ES2283593T3 - Analogos de oxima poco calcemicos de 1alfa,25-dihidroxi vitamina d3.

Info

Publication number: ES2283593T3
Application number: ES02767010T
Authority: ES
Inventors: Gary H. Posner; Jay A. White; Glenville Jones; Bethany Halford; Mehmet Kahraman; Heung Bae Jeon
Original assignee: Cytochroma Inc; Johns Hopkins University
Current assignee: Cytochroma Inc; Johns Hopkins University
Priority date: 2001-10-12
Filing date: 2002-10-11
Publication date: 2007-11-01
Anticipated expiration: 2022-10-11
Also published as: EP1436257B1; US6982258B2; CA2463505C; DK1436257T3; DE60219655D1; DE60219655T2; CA2463505A1; JP4436674B2; JP2005536444A; PT1436257E; ATE360000T1; EP1436257A1; US20030171342A1; WO2003031400A1; CY1106638T1

Abstract

Compuesto de Fórmula I, y sus sales, hidratos, solvatos y profármacos farmacéuticamente aceptables: en la que R1 y R2 se seleccionan independientemente de entre el grupo constituido por OH, O-alquilo C1-6 y halo; R3 es alquilo C1-6; R4 se selecciona de entre el grupo constituido por H, alquilo C1-6, arilo y heteroarilo, estando el alquilo C1-6 insustituido o sustituido con 1 a 4 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C1-4, O-alquilo C1-4, OH, halo, NH2, NH-alquilo C1-4 y N(alquilo C1-4)(alquilo C1-4), y estando el arilo y el heteroarilo insustituidos o sustituidos con 1 a 5 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C1-4, O-alquilo C1-4, OH, CF3, OCF3, halo, SH, S-alquilo C1-4, NH2, NH-alquilo C1-4, N(alquilo C1-4)(alquilo C1-4), CN, C(O)OH, C(O)O-alquilo C1-4, C(O)NH-alquilo C1-4, NHC(O)-alquilo C1-4, OC(O)-alquilo C1-4, SO-alquilo C1-4, SO2-alquilo C1-4, SO2NH-alquilo C1-4 y SO2NH2; R5 se selecciona de entre el grupo constituido por alquilo C1-6, cicloalquilo (C3-C6), arilo y heteroarilo, arilalquilo C1-6 y heteroaril-alquilo C1-6, estando el alquilo C1-6 insustituido o sustituido con 1 a 4 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C1-4, O-alquilo C1-4, OH, halo, NH2, NH-alquilo C1-4 y N(alquilo C1-4)(alquilo C1-4), y estando el cicloalquilo (C3-C6), el arilo, el heteroarilo, el aril-alquilo C1-6 y el heteroaril-alquilo C1-6 insustituidos o sustituidos con 1 a 5 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C1-4, O-alquilo C1-4, OH, CF3, OCF3, halo, SH, S-alquilo C1-4, NH2, NH-alquilo C1-4, N(alquilo C1-4)(alquilo C1-4), CN, C(O)OH, C(O)O-alquilo C1-4, C(O)NH-alquilo C1-4, NHC(O)-alquilo C1-4, OC(O)-alquilo C1-4, SO-alquilo C1-4, SO2-alquilo C1-4, SO2NH-alquilo C1-4 y SO2NH2; y

Description

Análogos de oxima poco calcémicos de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3}.

La presente invención se realizó con ayuda del gobierno con la subvención del NIH número CA 44530. El gobierno presenta determinados algunos derechos en la invención.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos análogos de la hormona 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} que presenta inhibición selectiva de la enzima CYP24 y que son poco calcémicos y antiproliferativos, a las composiciones farmacéuticas y de diagnóstico que los contienen y a su utilización sanitaria, particularmente en el tratamiento y/o prevención del cáncer, los trastornos dermatológicos, los trastornos óseos, los trastornos de tiroides, la cicatrización de heridas y la osteoporosis.

Antecedentes de la invención

La serie de reacciones metabólicas de la vitamina D es parte de un sistema endocrino vital que está muy regulado en determinadas etapas y produce metabolitos que controlan la secreción de las hormonas de la glándula paratiroides (Beckman, M. y DeLuca, H. (1997) Methods in Enzymol. 282, 200-223; Jones, G., Strugnell, S. y DeLuca, H. (1998) Phystiol. Rev. 78, 1193-1231). La 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3}, conocida también como calcitriol (véase a continuación), una hormona producida en la serie de reacciones de la vitamina D, regula las concentraciones de fosfato y de calcio en la sangre que a su vez controlan la masa ósea, el estado de los huesos y afecta a la diferenciación celular en la piel y en el sistema inmunitario (Armbrecht, H. J., Okuda, K., Wongsurawat, N., Nemani, R., Chen, M. y Boltz, M. (1992) J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 43, 1073-1081). En la serie de reacciones de la vitamina D, los citocromos P450 son enzimas que introducen grupos funcionales por hidroxilación, normalmente en las posiciones 1, 25 y 24 de la vitamina D_{3} (Beckman, M. y DeLuca, H. (1997) Methods in Enzymol. 282, 200-223).

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La 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} se transforma en 1a,24,25-trihidroxi-D_{3} mediante una P450 mitocondrial conocida como CYP24 (Bell, N. H., (1998) J. Bone Miner. Res. 13, 350-35211). La CYP24 es producida por 1\alpha,25-dihidroxi-D_{3} y se encuentra en el riñón así como en otros tejidos diana de la vitamina D tales como las células de la paratiroides, queratinocitos, osteoblastos y enterocitos (Jones, G., Strugnell, S. y DeLuca, H. (1998) Physiol. Rev. 78, 1193-1231). La 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} (1,25-D_{3}) desempeña una importante función en los efectos antiproliferativos y de crecimiento sobre las células normales y neoplásicas (p. ej., las células del cáncer de próstata). La utilización clínica de los análogos de 1,25-D_{3} como fármacos eficaces requiere actividades antiproliferativos y de prodiferenciación. Existe una necesidad continua de análogos sintéticos de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} que presente selectivamente actividades farmacológicas deseables pero que no presente actividades hipercalcémicas y otras indeseables.

Sumario de la invención

Se han preparado nuevos análogos de 16-ene-25-oxima y de éter de 16-ene-25-oxima de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} que presentan inhibición selectiva de la enzima CYP24, actividad antiproliferativo y son poco calcémicos.

La presente invención proporciona por consiguiente compuestos de Fórmula I, y sales, hidratos, solvatos y profármacos farmacéuticamente aceptables de los mismos:

2

en la que

R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente de entre el grupo constituido por OH, O-alquilo C_{1-6} y halo;

R^{3} es alquilo C_{1-6};

R^{4} se selecciona de entre el grupo constituido por H, alquilo C_{1-6}, arilo y heteroarilo, estando el alquilo C_{1-6} insustituido o sustituido con 1 a 4 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, halo, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4} y N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}, y estando el arilo y el heteroarilo insustituidos o sustituidos con 1 a 5 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, CF_{3}, OCF_{3}, halo, SH, S-alquilo C_{1-4}, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4}, N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}), CN, C(O)OH, C(O)O-alquilo C_{1-4}, C(O)NH-alquilo C_{1-4}, NHC(O)-alquilo C_{1-4}, OC(O)-alquilo C_{1-4}, SO-alquilo C_{1-4}, SO_{2}-alquilo C_{1-4}, SO_{2}NH-alquilo C_{1-4} y SO_{2}NH_{2};

R^{5} se selecciona de entre el grupo constituido por alquilo C_{1-6}, arilo y cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), arilo, heteroarilo, arilalquilo C_{1-6} y heteroaril-alquilo C_{1-6}, estando el alquilo C_{1-6} insustituido o sustituido con 1 a 4 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, halo, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4} y N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}, y estando el cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), el arilo y el heteroarilo, el aril-alquilo C_{1-6} y el heteroaril-alquilo C_{1-6} insustituidos o sustituidos con 1 a 5 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, CF_{3}, OCF_{3}, halo, SH, S-alquilo C_{1-4}, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4}, N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}, CN, C(O)OH, C(O)O-alquilo C_{1-4}, C(O)NH-alquilo C_{1-4}, NHC(O)-alquilo C_{1-4}, OC(O)-alquilo C_{1-4}, SO-alquilo C_{1-4}, SO_{2}-alquilo C_{1-4}, SO_{2}NH-alquilo C_{1-4} y SO_{2}NH_{2}; y

R^{6} son ambos H o juntos forman =CH_{2}.

Preferentemente, los compuestos de la invención presentan la estereoquímica de la 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3}. Por lo tanto, en una forma de realización preferida, la presente invención proporciona compuestos de Fórmula I, y sales, hidratos, solvatos y profármacos farmacéuticamente aceptables de los mismos:

3

en la que

R^{1} a R^{6} son como se definieron anteriormente.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de Fórmula I y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Modulando selectivamente la CYP24, se modulan también la enzima que metaboliza 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} y las concentraciones de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3}. Las enfermedades que se benefician de una modulación de las concentraciones de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} pueden por consiguiente tratarse utilizando un modulador de CYP24. Actuando preferentemente sobre la CYP24, los efectos secundarios causados por la interacción con otras enzimas y receptores se reducirán. Por consiguiente, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar las enfermedades que se aprovecha de una modulación de las concentraciones de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} que comprende la administración de una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I a una célula o a un animal que lo necesite. La invención incluye también la utilización de un compuesto de Fórmula I para modular las concentraciones de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3}. Además, la invención incluye una utilización de un compuesto de Fórmula I para preparar un medicamento destinado a modular las concentraciones de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3}.

La inhibición de CYP24, inhibe el catabolismo de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} que prolongará la vida biológica de esta hormona y de esta manera permitirá que pequeñas cantidades de ella se utilicen para un tratamiento eficaz de la enfermedad. Dicha dosificación menor impedirá, o por lo menos minimizará, la toxicidad percalcémica asociada a la utilización medicinal de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} (calcitriol). Por tanto, en una forma de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar enfermedades que se aprovecha de la inhibición del catabolismo de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} que comprende administrar una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I a una célula o animal que lo necesita. La invención incluye también la utilización de un compuesto de Fórmula I para inhibir el catabolismo de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3}. Además, la invención incluye una utilización de un compuesto de Fórmula I para preparar un medicamento que inhiba el catabolismo de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3}.

Las enfermedades que pueden beneficiarse de una modulación en las concentraciones de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} incluyen, pero no se limitan a:

(i): en el paratiroides - hiper- e hipo-paratiroidismo, seudohipoparatiroidismo, hiperparatiroidismo secundario;

(ii): en el páncreas - diabetes;

(iii): en el tiroides - carcinoma medular;

(iv): en la piel - soriasis, cicatrización de heridas;

(v): en los pulmones - sarcoidosis y tuberculosis;

(vi): en el riñón - nefropatía crónica, VDRR hipofosfatémica, raquitismo dependiente de vitamina D;

(vii): en los huesos - tratamiento anticonvulsionante, fibrogénesis ósea imperfecta, osteítis fibrosa quística, osteomalacia, osteoporosis, osteopenia, osteosclerosis, osteodistrofia renal, raquitismo;

(viii): en los intestinos - antagonismo glucocorticoide, hipercalcemia idiopática, síndrome de malabsorción, esteatorrea y esprue tropical.

Los compuestos de Fórmula I, o las sales, solvatos, hidratos o profármacos de los mismos, pueden utilizarse solos o en combinación con otros agentes que modulan la actividad de la CYP24 o en combinación con otros tipos de tratamiento (que pueden modular o no la CYP24) para los trastornos proliferantes de las células u otros trastornos que se aprovechan de una modulación en las concentraciones de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} y/o una inhibición del catabolismo de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3}. Preferentemente los compuestos de Fórmula I se administran en combinación con 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} (calcitriol) u otros agonistas del receptor de la vitamina D. La presente invención proporciona por consiguiente un procedimiento para aumentar la eficacia de un agonista del receptor de vitamina D, preferentemente 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} (calcitriol), que comprende administrar conjuntamente una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I una cantidad eficaz del agonista del receptor de vitamina D, preferentemente 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} (calcitriol), y la utilización de un compuesto de Fórmula I para preparar un medicamento destinado a aumentar la eficacia de un agonista del receptor de vitamina D, preferentemente 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} (calcitriol).

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para modular la proliferación celular, que inhibe preferentemente la proliferación celular, que comprende administrar una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I a una célula o animal que lo necesita. La invención incluye también la utilización de un compuesto de Fórmula I para modular la proliferación celular, preferentemente para inhibir la proliferación celular. La invención incluye además la utilización de un compuesto de Fórmula I para preparar un medicamento para modular la proliferación celular, preferentemente para inhibir la proliferación celular.

En una forma de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para inhibir la proliferación de una célula cancerosa que comprende administrar una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I a una célula o animal que lo necesita. La invención incluye también la utilización de un compuesto de Fórmula I para inhibir la proliferación de una célula cancerosa. La invención incluye además la utilización de un compuesto de Fórmula I para preparar un medicamento para inhibir la proliferación de una célula cancerosa.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento de modulación de la actividad de CYP24 en una célula o animal administrando una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I. En un aspecto adicional, la invención proporciona un procedimiento de modulación de la actividad de CYP24, preferentemente inhibiendo la actividad de CYP24 administrando una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I a una célula o animal que lo necesita. La presente invención proporcionar además la utilización de un compuesto de Fórmula I para modular, preferentemente para inhibir la actividad de CYP24. La invención proporcionar además la utilización de un compuesto de Fórmula I para preparar un medicamento para modula la actividad de CYP24, preferentemente para inhibir la actividad de CYP24. Se aprecia que la inhibición del crecimiento celular por los compuestos de la invención pueda efectuarse por otros mecanismos.

La presente invención proporciona además nuevos compuestos útiles para la preparación de los compuestos de Fórmula I. Por consiguiente la presente invención proporciona además compuestos de Fórmula II, y sales, hidratos y solvatos de los mismos:

4

en la que

R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente de entre el grupo constituido por OH, O-alquilo C_{1-6}, OPG y halo;

PG es un grupo protector;

R^{3} es alquilo C_{1-6};

R^{5} se selecciona de entre el grupo constituido por alquilo C_{1-6}, arilo y cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), arilo, heteroarilo, arilalquilo C_{1-6} y heteroaril-alquilo C_{1-6}, estando el alquilo C_{1-6} insustituido o sustituido con 1 a 4 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, halo, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4} y N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}, y estando el cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), el arilo y el heteroarilo, el aril-alquilo C_{1-6} y el heteroaril- alquilo C_{1-6} insustituidos o sustituidos con 1 a 5 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, CF_{3}, OCF_{3}, halo, SH, S-alquilo C_{1-4}, NH_{2}, NH- alquilo C_{1-4}, N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}), CN, C(O)OH, C(O)O-alquilo C_{1-4}, C(O)NH-alquilo C_{1-4}, NHC(O)-alquilo C_{1-4}, OC(O)-alquilo C_{1-4}, SO-alquilo C_{1-4}, SO_{2}-alquilo C_{1-4}, SO_{2}NH- alquilo C_{1-4} y SO_{2}NH_{2}; y

R^{6} son ambos H o juntos forman =CH_{2}.

Además, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar un compuesto de Fórmula I que comprende hacer reaccionar un compuesto de Fórmula II, o una sal, hidrato o solvato del mismo, con un compuesto de Fórmula III, o una sal, hidrato o solvato del mismo;

IIINH_{2}-OR^{4},

en la que R^{4} se selecciona de entre el grupo constituido por H, alquilo C_{1-6}, arilo y heteroarilo, estando el alquilo C_{1-6} insustituido o sustituido con 1 a 4 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, halo, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4} y N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}), y estando el arilo y el heteroarilo insustituidos o sustituidos con 1 a 5 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, CF_{3}, OCF_{3}, halo, SH, S-alquilo C_{1-4}, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4}, N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}), CN, C(O)OH, C(O)O-alquilo C_{1-4}, C(O)NH-alquilo C_{1-4}, NHC(O)-alquilo C_{1-4}, OC(O)-alquilo C_{1-4}, SO-alquilo C_{1-4}, SO_{2}-alquilo C_{1-4}, SO_{2}NH-alquilo C_{1-4} y SO_{2}NH_{2},

en presencia de una amina no nucleófila, seguido de la eliminación de cualquier grupo protector, si está presente.

Otras características y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Debe apreciarse, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos aunque indican las formas de realización preferidas de la invención se proporcionan únicamente a título de ilustración, ya que varios cambios y modificaciones en el espíritu y alcance de la invención resultarán evidentes para los expertos en la materia a partir de la presente descripción detalla.

Breve descripción de los dibujos

La invención se describe a continuación haciendo referencia a los dibujos, en los que:

La Figura 1A es un gráfico que presenta la inhibición de la actividad de CYP24 por los compuestos I(a) y I(c) (indicados como BH1625(NOH)-TB-2 (CTA062) y BH-1625(NOMe)-TB-2-(CTA065) respectivamente) comparada con cetoconazol.

La Figura 1B es un gráfico que presenta la inhibición de la actividad de CYP27B1 por los compuestos I(a) y I(c) (indicados como BH1625(NOH)-TB-2 (CTA062) y BH-1625(NOMe)-TB-2-(CTA065) respectivamente) comparada con cetoconazol.

La Figura 1C es un gráfico que presenta la inhibición de la actividad de CYP27A1 por los compuestos I(a) y I(c) (indicados como BH1625(NOH)-TB-2 (CTA062) y BH-1625(NOMe)-TB-2-(CTA065) respectivamente) comparada con cetoconazol.

La Figura 2 es un gráfico que presenta la unión de los compuestos I(a) y I(c), (indicada como BH-1625(NOH)-TB-2 (CTA62) y BH-1625(NOMe)-TB-2-(CTA65) respectivamente) a la proteína D transportadora (DBP) comparada con 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} y 25-hidroxi vitamina D_{3}.

La Figura 3 es un gráfico que presenta la unión de los compuestos I(a) y I(c), (indicada como BH-1625(NOH)-TB-2 (CTA62) y BH-1625(NOMe)-TB-2-(CTA65) respectivamente) en el ensayo de transcripción de vitamina D comparada con 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3}.

La Figura 4 es un gráfico que presenta la actividad de los compuestos I(a) y I(c), (indicada como BH-1625(NOH)-TB-2 (CTA62) y BH-1625(NOMe)-TB-2-(CTA65) respectivamente) en el ensayo de unión del receptor de vitamina D (VDR) comparada con 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3}.

La Figura 5 es un gráfico que presenta los efectos de la respuesta a la dosis de los compuestos I(a) y I(c) sobre la proliferación de queratinocitos en comparación con 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} o calcitriol.

La Figura 6 es un gráfico que presenta el efecto del compuesto I(a) (indicado como BH1625(NOH)) sobre las concentraciones de calcio en la orina de rata en comparación con calcitriol (1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3}).

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

La expresión "alquilo C_{1-6}" tal como se utiliza en la presente memoria significa radicales alquilo saturados o insaturados con cadena lineal y/o ramificada que contienen de uno a seis átomos de carbono e incluye metilo, etilo, propilo, isopropilo, s-butilo, t-butilo, neopentilo, vinilo, alilo, butenilo y similares.

La expresión "alcoxi C_{1-6}" tal como se utiliza en la presente memoria significa radicales alcoxi saturados o insaturados con cadena lineal y/o ramificada que contienen de uno a seis átomos de carbono e incluye metoxi, etoxi, propiloxi, isopropiloxi, t-butoxi y similares.

La expresión "cicloalquilo (C_{3}-C_{6})" tal como se utiliza en la presente memoria significa radicales alquilo cíclicos, no aromáticos, saturados o insaturados que contienen de tres a seis átomos de carbono e incluye ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclopentenilo, ciclohexenilo y similares.

La expresión "alquilo C_{1-4}" tal como se utiliza en la presente memoria significa radicales alquilo saturados o insaturados con cadena lineal y/o ramificada que contienen de uno a cuatro átomos de carbono e incluye metilo, etilo, propilo, isopropilo, s-butilo, t-butilo y similares.

La expresión "alcoxi C_{1-4}" tal como se utiliza en la presente memoria significa radicales alcoxi saturados o insaturados con cadena lineal y/o ramificada que contienen de uno a cuatro átomos de carbono e incluye metoxi, etoxi, propiloxi, isopropiloxi, t-butoxi y similares.

El término "arilo" tal como se utiliza en la presente memoria significa radicales aromáticos mono- o bicíclicos insaturados o sustituidos que contienen de 6 a 10 átomos de carbonos e incluye fenilo y naftilo y similares.

El término "heteroarilo" tal como se utiliza en la presente memoria significa radicales heteroaromático mono- o bicíclicos insustituidos o sustituidos que contienen de 5 a 10 átomos, de los cuales 1 a 3 átomos pueden ser un heteroátomo seleccionado de entre el grupo constituido por S, O y N, e incluye furanilo, tienilo, pirrolo, piridilo, indolo, benzofuranilo y similares.

El término "aril-alquilo C_{1-6}" tal como se utiliza en la presente memoria significa radicales aromáticos mono o bicíclicos insustituidos o sustituidos que contienen de 6 a 10 átomos de carbono unidos a los compuestos de la invención mediante radicales alquileno ramificados o no ramificados que contienen de 1 a 6 átomos de carbono, estando los radicales alquileno, saturados o insaturados e insaturados o sustituidos con 1 a 4 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo- C_{1-4}, OH, halo, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4} y N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}) e incluye Ph-C(CH_{3})_{2}-, naftilmetilo, bencilo y similares.

El término "heteroaril-alquilo C_{1-6}" tal como se utiliza en la presente memoria significa radicales heteroaromáticos mono o bicíclicos insustituidos o sustituidos que contienen de 5 a 10 átomos de carbono, de los que 1 a 3 átomos pueden ser un heteroátomo seleccionado de entre el grupo constituido por S, O y N unidos a los compuestos de la invención mediante radicales alquileno ramificados o no ramificados que contienen de 1 a 6 átomos de carbono, estando los radicales alquileno, saturados o insaturados e insustituidos o sustituidos con 1 a 4 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, halo, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4} y N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}) e incluye tienil-CH_{2}-, piridil-CH_{2}-, indolo -CH_{2}- y similares.

El término "halo" tal como se utiliza en la presente memoria significa halógeno e incluye cloro, flúor, bromo, yodo y similares.

El término "solvato" tal como se utiliza en la presente memoria significa un compuesto de la invención, o una sal de un compuesto de la invención, en el que las moléculas de un disolvente adecuado se incorporan al retículo cristalino. Un disolvente adecuado es tolerable fisiológicamente a la dosis administrada. Ejemplos de disolventes adecuados son el etanol, el agua y similares. Cuando el disolvente es el agua, la molécula se denomina "hidrato".

La expresión "compuesto(s) de la invención" tal como se utiliza en la presente memoria significa el/los compues-
to(s) de Fórmulas I y II, y las sales, hidratos, solvatos y profármacos de los mismos.

La expresión "sal farmacéuticamente aceptable" significa una sal de adición de ácido o una sal de adición básica que es adecuada o compatible con el tratamiento de pacientes.

La expresión "sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable" tal como se utiliza en la presente memoria significa cualquier sal orgánica o inorgánica no tóxica de cualquier compuesto básico de la invención, o cualquiera de sus productos intermedios. Los compuestos básicos de la invención que pueden formar una sal de adición de ácido incluyen, por ejemplo, aquellos en los que arilo, heteroarilo y/o el grupo alquilo C_{1-6} de R^{4} y/o R^{5} se sustituye por un grupo que tiene un nitrógeno básico, por ejemplo NH_{2} y NH-alquilo C_{1-4}. Ácidos inorgánicos ilustrativos que forman las sales adecuadas incluyen los ácidos clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico y fosfórico, así como las sales metálicas tales como ortofosfato monobásico de sodio y bisulfato de potasio. Los ácidos orgánicos ilustrativos que forman sales adecuadas incluyen los ácidos mono- di- y tricarboxílicos tales como los ácidos glicólico, láctico, pirúvico, malónico, succínico, glutárico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, maleico, benzoico, fenilacético, cinnámico y salicílico, así como los ácidos sulfónicos tales como los ácidos p-toluensulfónico y metansulfónico. Pueden formarse sales mono- o diácidas, y dichas sales pueden existir en forma hidratada, solvatada o sustancialmente anhidra. En general las sales de adición de ácido de los compuestos de la invención son más solubles en agua y en varios disolventes orgánicos hidrófilos, y generalmente presentan puntos de fusión más altos en comparación con sus formas básicas libres. La selección de la sal apropiada es conocida por cualquier experto en la materia. Otras sales de adición de ácido no farmacéuticamente aceptables, p. ej. oxalatos, pueden utilizarse, por ejemplo, en el aislamiento de los compuestos de la invención, para su utilización en el laboratorio, o para la conversión posterior a una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable.

La expresión "sal de adición básica farmacéuticamente aceptable" tal como se utiliza en la presente invención significa cualquier sal de adición básica orgánica o inorgánica no tóxica o de cualquier compuesto ácido de la invención, o cualquiera de sus productos intermedios. Los compuestos ácidos de la invención que pueden formar una sal de adición básica incluyen, por ejemplo, aquellos en los que el arilo y/o heteroarilo está sustituido por un grupo con hidrógeno ácido, por ejemplo C(O)OH. Las bases inorgánicas ilustrativas que forman sales adecuadas incluyen el hidróxido de litio, sodio, potasio, calcio, magnesio o bario. Las bases orgánicas ilustrativas que forman sales adecuadas incluyen aminas orgánicas alifáticas, alicíclicas o aromáticas tales como metilamina, trimetilamina y picolina o amoniaco. La selección de la sal apropiada es conocida por cualquier experto en la materia. Otras sales de adición básicas no farmacéuticamente aceptables, pueden utilizarse, por ejemplo, en el aislamiento de los compuestos de la invención, para su utilización en el laboratorio, o para la conversión ulterior a una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable.

La expresión una "cantidad eficaz" o una "cantidad suficiente" de un agente tal como se utiliza en la presente memoria es a cantidad suficiente para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluyendo resultados clínicos, y, como tal, una "cantidad eficaz" depende del contexto en el que se esté aplicando. Por ejemplo, en el contexto de la administración de un agente que modula la actividad de CYP24, una cantidad eficaz de un agente es, por ejemplo, una cantidad suficiente para conseguir dicha modulación en la actividad de CYP24 en comparación con la respuesta obtenida sin la administración del agente.

Tal como se utiliza en la presente memoria, y se entiende también en la técnica, "tratamiento" es un procedimiento para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluyendo resultados clínicos. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados pueden incluir, pero no se limitan a, alivio o mejora de uno o más síntomas o afecciones, disminución del alcance de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, no empeorado) de la enfermedad, prevención de la propagación de la enfermedad, retardo o ralentización de la evolución de la enfermedad, mejora o mitigación de las condiciones patológicas, y remisión (ya sea parcial o total), bien detectable o indetectable. "Tratamiento" puede significar también la prolongación de la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento.

"Mitigar" una enfermedad o trastorno significa que el alcance y/o las manifestaciones clínicas indeseables de un trastorno o de un estado patológico han disminuido y/o el curso de la evolución se ha ralentizado o prolongado, en comparación sin tratamiento del trastorno.

El término "modular" tal como se utiliza en la presente memoria incluye la inhibición o supresión de una función o actividad (tal y como la actividad de CYP24) así como el aumento de una función o actividad.

"Inhibir" o "suprimir" o "reducir" una función o actividad, tal como la actividad de CYP24, consiste en reducir la función o actividad cuando se compara de otra manera con las mismas condiciones excepto para una condición o parámetro de interés, o alternativamente, en comparación con otras condiciones.

El término "animal" tal como se utiliza en la presente memoria incluye todos los miembros del reino animal incluyendo el humano. El animal es preferentemente un ser humano.

La expresión "una célula" tal como se utiliza en la presente memoria incluye una multitud de células. Administrar un compuesto a una célula incluye el tratamiento in vivo, ex vivo e in vitro.

La expresión "células cancerosas" tal como se utiliza en la presente memoria incluye todas las formas de cáncer o enfermedad neoplásica.

El término "catabolismo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un proceso metabólico mediante el cual los organismos convierten las sustancias en compuestos para su excreción.

El término "1\alpha,3\beta-estereoquímica" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la configuración relativa de los grupos, R^{1} y R^{2}, en la que R^{2} está por encima del plano de la página, y el R^{1} está por debajo del plano de la página. El término "1\beta,3\alpha-estereoquímica" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la configuración relativa de los grupos, R^{1} y R^{2}, en la que R^{1} está por encima del plano de la página, y el R^{2} está por debajo del plano de la página.

II. Compuestos de la invención

Se han preparado nuevos compuestos que presentan inhibición selectiva de la enzima CYP24, actividad antiproliferante y que son poco calcémicos. Como tales, los compuestos de la invención son útiles para tratar enfermedades proliferantes en células, tales como el cáncer.

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en la que

R^{3} es alquilo C_{1-6};

R^{5} se selecciona de entre el grupo constituido por alquilo C_{1-6}, arilo y cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), arilo, heteroarilo, arilalquilo C_{1-6} y heteroarilo-alquilo C_{1-6}, estando el alquilo C_{1-6} insustituido o sustituido con 1 a 4 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4} , O-alquilo C_{1-4}, OH, halo, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4} y N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}), y estando el cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), el arilo y el heteroarilo, el aril-alquilo C_{1-6} y el heteroaril-alquilo C_{1-6} insustituido o sustituidos con 1 a 5 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, CF_{3}, OCF_{3}, halo, SH, S-alquilo C_{1-4}, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4}, N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}, CN, C(O)OH, C(O)O-alquilo C_{1-4}, C(O)NH-alquilo C_{1-4}, NHC(O)-alquilo C_{1-4}, OC(O)-alquilo C_{1-4}, SO-alquilo C_{1-4}, SO_{2}-alquilo C_{1-4}, SO_{2}NH-alquilo C_{1-4} y SO_{2}NH_{2}; y

R^{6} son ambos H o juntos forman =CH_{2}.

Los compuestos de Fórmula I incluyen aquellos en los que R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente de entre el grupo constituido por OH, O-alquilo C_{1-6} y halo. En las formas de realización de la invención, R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente del grupo constituido por OH, OCH_{3} y fluoro. En una forma de realización adicional, R^{1} y R^{2} son ambos OH.

La presente invención también incluye compuestos de Fórmula I en los que R^{3} es alquilo C_{1-6}. En una forma de realización de la invención, R^{3} es alquilo C_{1-4}. En formas de realización adicionales, R^{3} es CH_{3}.

La presente invención incluye compuestos de Fórmula I en la que R^{4} se selecciona de entre el grupo constituido por H, alquilo C_{1-6}, arilo y heteroarilo, estando el alquilo C_{1-6} insustituido o sustituido con 1 a 4 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, halo, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4} y N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}, y estando el arilo y el heteroarilo insustituidos o sustituidos con 1 a 5 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, CF_{3}, OCF_{3}, halo, SH, S-alquilo C_{1-4}, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4}, N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}), CN, C(O)OH, C(O)O-alquilo C_{1-4}, C(O)NH-alquilo C_{1-4}, NHC(O)-alquilo C_{1-4}, OC(O)-alquilo C_{1-4}, SO-alquilo C_{1-4}, SO_{2}-alquilo C_{1-4}, SO_{2}NH-alquilo C_{1-4} y SO_{2}NH_{2}. En formas de realización de la invención, R^{4} se selecciona de entre el grupo constituido por H, alquilo C_{1-4} y fenilo, estando el alquilo C_{1-4} insustituido o sustituido con 1 a 2 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, halo, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4} y N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}), y estando el fenilo insustituidos o sustituidos con 1 a 3 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, CF_{3}, OCF_{3}, halo, SH, S-alquilo C_{1-4}, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4}, N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}), CN, C(O)OH, C(O)O-alquilo C_{1-4}, C(O)NH-alquilo C_{1-4}, NHC(O)-alquilo C_{1-4}, OC(O)-alquilo C_{1-4}, SO-alquilo C_{1-4}, SO_{2}-alquilo C_{1-4}, SO_{2}NH-alquilo C_{1-4} y SO_{2}NH_{2}. En otras formas de realización, R^{4} se selecciona de entre el grupo constituido por H, fenilo y alquilo C_{1-4}. Incluso en otras formas de realización, R^{4} se selecciona de entre el grupo constituido por H, fenilo, alilo y CH_{3}.

La presente invención incluye compuestos de Fórmula I en la que R^{5} se selecciona de entre el grupo constituido por alquilo C_{1-6}, cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), arilo y heteroarilo, arilalquilo C_{1-6} y heteroaril-alquilo C_{1-6}, estando el alquilo C_{1-6} insustituido o sustituido con 1 a 4 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, halo, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4} y N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}, y estando el cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), el arilo y el heteroarilo, el aril-alquilo C_{1-6} y el heteroaril-alquilo C_{1-6} insustituidos o sustituidos con 1 a 5 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, CF_{3}, OCF_{3}, halo, SH, S-alquilo C_{1-4}, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4}, N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}), CN, C(O)OH, C(O)O-alquilo C_{1-4}, C(O)NH-alquilo C_{1-4}, NHC(O)-alquilo C_{1-4}, OC(O)-alquilo C_{1-4}, SO-alquilo C_{1-4}, SO_{2}-alquilo C_{1-4}, SO_{2}NH-alquilo C_{1-4} y SO_{2}NH_{2}. En las formas de realización de la invención, R se selecciona de entre el grupo constituido por alquilo C_{1-4}, fenilo, y fenil-alquilo C_{1-6}, estando el alquilo C_{1-4} insustituido o sustituido con 1 a 2 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, halo, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4} y N(alquilo C_{1-4}(alquilo C_{1-4}), y estando el fenilo y el fenil-alquilo C_{1-6} insustituido o sustituido con 1 a 3 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, CF_{3}, OCF_{3}, halo, SH, S-alquilo C_{1-4}, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4}, N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}), CN, C(O)OH, C(O)O-alquilo C_{1-4}, C(O)NH-alquilo C_{1-4}, NHC(O)-alquilo C_{1-4}, OC(O)-alquilo C_{1-4}, SO-alquilo C_{1-4}, SO_{2}-alquilo C_{1-4}, SO_{2}NH-alquilo C_{1-4} y SO_{2}NH_{2}. En otras formas de realización de la invención, R^{5} se selecciona de entre el grupo constituido por alquilo C_{1-4}, fenilo, y fenil-alquilo C_{1-6}, estando el alquilo C_{1-4} insustituido o sustituido con 1 a 2 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-2}, O-alquilo C_{1-2}, OH, halo, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-2} y N(alquilo C_{1-2})(alquilo C_{1-2}), y estando el fenilo y el fenil-alquilo C1~ insustituido o sustituido con 1 a 3 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, CF_{3}, OCF_{3}, halo, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4}, N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}) y CN. Incluso en formas de realización adicionales, R^{5} se selecciona de entre isopropilo, s-butilo, t-butilo y neopentilo.

La presente invención incluye también compuestos de Fórmula I, en los que R^{6} son ambos H o juntos forman =CH_{2}. En las formas de realización de la invención, R^{6} son ambos H.

Todos los compuestos de Fórmula I tienen más de un centro asimétrico. Cuando los compuestos según la invención poseen más de un centro asimétrico, pueden existir como diastereómeros. Debe entenderse que todos los isómeros citados y sus mezclas en cualquier proporción están comprendidos dentro del alcance de la presente invención. Además, la invención se extiende a todos los isómeros geométricos de la presente invención. Por ejemplo, cuando existe un doble enlace en un compuesto de la invención, pueden existir isómeros geométricos, tales como isómeros cis y trans (conocidos también como Z y E). La estereoquímica de los compuestos de la invención es preferentemente la de la 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} natural. Por consiguiente, en una forma de realización preferida, la presente invención proporciona compuestos de Fórmula I con estereoquímica relativa como se presenta a continuación, y sales, hidratos, solvatos y profármacos de las mismas farmacéuticamente aceptables:

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en la que R^{1} a R^{6} son como se definieron anteriormente. Debe entenderse que aunque, la estereoquímica relativa de los compuestos de Fórmula I es preferentemente como se presentó anteriormente, dichos compuestos de Fórmula I pueden contener también determinadas cantidades (p. ej. inferiores al 20%, preferentemente inferiores al 10%, más preferentemente inferiores al 5%) de compuestos de Fórmula I que presentan estereoquímica alternativa. Por ejemplo, un compuesto de Fórmula I que presenta la estereoquímica 1\alpha,3\beta de la 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3}, mostrada anteriormente, puede contener menos del 20%, preferentemente menos del 10%, más preferentemente menos del 5%, de un compuesto de Fórmula I que presenta la estereoquímica 1\beta,3\alpha no natural.

En las formas de realización específicas de la presente invención los compuestos de la invención incluyen:

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y las sales, hidratos, solvatos y profármacos de los mismos farmacéuticamente aceptables. Los compuestos preferidos de la invención incluyen los compuestos I(a), I(c), I(e), I(g), I(i) e I(k) como se mostró anteriormente, y las sales, hidratos, solvatos y profármacos de los mismos farmacéuticamente aceptables.

La presente invención proporciona además nuevos compuestos útiles para la preparación de los compuestos de Fórmula I. Por lo tanto la presente invención proporciona además compuestos de Fórmula II, y sales, hidratos y solvatos de los mismos:

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en la que

PG es un grupo protector;

R^{3} es alquilo C_{1-6};

R^{5} se selecciona de entre el grupo constituido por alquilo C_{1-6}, cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), arilo y heteroarilo, arilalquilo C_{1-6} y heteroarilo-alquilo C_{1-6}, estando el alquilo C_{1-6} insustituido o sustituido con 1 a 4 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, halo, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4} y N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}), y estando el cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), el arilo y el heteroarilo, el aril-alquilo C_{1-6} y el heteroaril-alquilo C_{1-6} insustituidos o sustituidos con 1 a 5 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, CF_{3}, OCF_{3}, halo, SH, S-alquilo C_{1-4}, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4}, N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}, CN, C(O)OH, C(O)O-alquilo C_{1-4}, C(O)NH-alquilo C_{1-4}, NHC(O)-alquilo C_{1-4}, OC(O)-alquilo C_{1-4}, SO-alquilo C_{1-4}, SO_{2}-alquilo C_{1-4}, SO_{2}NH-alquilo C_{1-4} y SO_{2}NH_{2}; y

R^{6} son ambos H o juntos forman =CH_{2}.

Los compuestos de Fórmula II incluyen aquellos en los que R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente de entre el grupo constituido por OH, O-alquilo C_{1-6}, OPG y halo. En las formas de realización de la invención, R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente de entre el grupo constituido por OH, OCH_{3}, OPG y fluoro. En otra forma de realización, R^{1} y R^{2} son ambos OH o OPG. Además, PG significa que incluye cualquier grupo protector que proteja los grupos OH libres de R^{1} y/o R^{2} en los compuestos de Fórmula I de las reacciones secundarias no deseadas durante la conversión de los compuestos de Fórmula II a los compuestos de Fórmula I, y que pueden eliminarse en condiciones que no produzcan reacciones secundarias no deseadas con otros grupos funcionales en la molécula. Los grupos protectores adecuados incluyen grupos trialquilsililo, tal como t- butildimetilsililo.

La presente invención incluye además compuestos de Fórmula II en los que R^{3} es alquilo C_{1-6}. En las formas de realización de la invención, R^{3} es alquilo C_{1-4}. En otras formas de realización, R^{3} es CH_{3}.

La presente invención incluye compuestos de Fórmula II en la que R^{5} se selecciona de entre el grupo constituido por alquilo C_{1-6}, cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), arilo y heteroarilo, arilalquilo C_{1-6} y heteroaril-alquilo C_{1-6}, estando el alquilo C_{1-6} insustituido o sustituido con 1 a 4 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, halo, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4} y N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}), y estando el cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), el arilo y el heteroarilo, el aril-alquilo C_{1-6} y el heteroaril-alquilo C_{1-6} insustituidos o sustituidos con 1 a 5 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, CF_{3}, OCF_{3}, halo, SH, S-alquilo C_{1-4}, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4}, N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}, CN, C(O)OH, C(O)O-alquilo C_{1-4}, C(O)NH-alquilo C_{1-4}, NHC(O)-alquilo C_{1-4}, OC(O)-alquilo C_{1-4}, SO-alquilo C_{1-4}, SO_{2}-alquilo C_{1-4}, SO_{2}NH-alquilo C_{1-4} y SO_{2}NH_{2}. En otras formas de realización de la invención, R^{5} se selecciona de entre el grupo constituido por alquilo C_{1-4}, fenilo, y fenil-alquilo C_{1-6}, estando el alquilo C_{1-4} insustituido o sustituido con 1 a 2 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, halo, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4} y N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}), y estando el fenilo y el fenil-alquilo C_{1-6} insustituido o sustituido con 1 a 3 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, CF_{3}, OCF_{3}, halo, SH, S-alquilo C_{1-4}, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4}, N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}), CN, C(O)OH, C(O)O-alquilo C_{1-4}, C(O)NH-alquilo C_{1-4}, NHC(O)-alquilo C_{1-4}, OC(O)-alquilo C_{1-4}, SO-alquilo C_{1-4}, SO_{2}-alquilo C_{1-4}, SO_{2}NH-alquilo C_{1-4} y SO_{2}NH_{2}. En otras formas de realización de la invención, R^{5} se selecciona de entre el grupo constituido por alquilo C_{1-4}, fenilo, y fenil-alquilo C_{1-4}, estando el alquilo C_{1-4} insustituido o sustituido con 1 a 2 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-2}, O-alquilo C_{1-2}, OH, halo, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-2} y N(alquilo C_{1-2})(alquilo C_{1-2}), y estando el fenilo y el fenil-alquilo C_{1-4} insustituido o sustituido con 1 a 3 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, CF_{3}, OCF_{3}, halo, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4}, N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}) y CN. Incluso en otras formas de realización, R^{5} se selecciona de entre isopropilo, s-butilo, t-butilo y neopentilo.

En las formas de realización específicas de la presente invención, los compuestos de Fórmula II incluyen:

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y las sales, hidratos y solvatos de los mismos. Los compuestos preferidos de Fórmula II son los compuestos II(a) y II(c), como se describió anteriormente, y las sales, hidratos y solvatos de los mismos.

III. Procedimientos de preparación de compuestos de la invención

Según otro aspecto de la presente invención, los compuestos de la invención pueden prepararse por procedimientos análogos a los establecidos en la técnica. Por consiguiente, los compuestos de la presente invención pueden prepararse, por ejemplo, mediante la secuencia de reacción mostrada en el Esquema 1:

Esquema 1

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Por consiguiente, los compuestos de Fórmula I pueden prepararse haciendo reaccionar los compuestos de Fórmula II, en los que R^{1}-R^{3}, R^{5} y R^{6} son como se definen en la Fórmula II, con los reactivos de la Fórmula III, en la que R^{4} es como se define en la Fórmula I, preferentemente en presencia de una amina no nucleófila, a temperaturas comprendidas en el intervalo entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 40°C, propiamente a temperatura ambiente, seguida de la eliminación de cualquier grupo protector (si está presente). La amina no nucleófila puede ser cualquier amina terciaria aromática o alifática, por ejemplo piridina, y está preferentemente presente en cantidades en exceso. Cuando la piridina es la amina no nucleófila, se utiliza también preferentemente como disolvente para la transformación de los compuestos de Fórmula II en compuestos de Fórmula I. Esta etapa de instalación de la oxima procede sin destruir la unidad de trieno conjugada sensible al ácido de los compuestos de Fórmula II e indica que dicha etapa de oximación servirá para producir un banco de nuevos y diversos análogos de éter de 25-oxima. Se obtiene predominantemente el éter alquílico de E-oxima de Fórmula I debido a la muy desfavorable congestión estérica que estaría presente en el correspondiente éter alquílico de Z-oxima (véase Hawkes, G. E. y Herwig, K.; Roberts, J. D. J. Org. Chem. 1974, 39, 1017-1028).

Por consiguiente, la presente invención proporciona un procedimiento para la preparación de los compuestos de Fórmula I que comprende hacer reaccionar un compuesto de Fórmula II, o una sal, hidrato o solvato del mismo:

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en la que

PG es un grupo protector;

R^{3} es alquilo C_{1-6};

R^{5} se selecciona de entre el grupo constituido por alquilo C_{1-6}, cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), arilo y heteroarilo, arilalquilo C_{1-6} y heteroarilo-alquilo C_{1-6}, estando el alquilo C_{1-6} insustituido o sustituido con 1 a 4 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, halo, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4} y N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}), y estando el cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), el arilo y el heteroarilo, el aril-alquilo C_{1-6} y el heteroaril-alquilo C_{1-6} insustituidos o sustituidos con 1 a 5 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, CF_{3}, OCF_{3}, halo, SH, S-alquilo C_{1-4}, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4}, N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}), CN, C(O)OH, C(O)O-alquilo C_{1-4}, C(O)NH-alquilo C_{1-4}, NHC(O)-alquilo C_{1-4}, OC(O)-alquilo C_{1-4}, SO-alquilo C_{1-4}, SO_{2}-alquilo C_{1-4}, SO_{2}NH-alquilo C_{1-4} y SO_{2}NH_{2}; y

R^{6} son ambos H o juntos forman =CH_{2},

con un compuesto de Fórmula III, o una sal, hidrato o solvato del mismo:

IIINH_{2}-OR^{4},

Las cetonas de Fórmula II, en las que R^{1} a R^{3}, R^{5} y R^{6} son como se definen en la Fórmula I, pueden prepararse, por ejemplo, como se muestra en el Esquema 2:

Esquema 2

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Las cetonas de Fórmula V, en las que R^{3} y R^{5} son como se definen en la Fórmula I, pueden estar mono-olefinadas quimioespecíficamente en C-8 (debido al impedimento estérico en C-25) con óxidos de fosfina de Fórmula VI, en la que R^{2} y R^{6} son como se definen en la Fórmula I, en las condiciones de acoplamiento estándar de Horner-Wadsworth-Emmons (HWE) (véase Posner, G. H. et al., J. Org. Chem. 1997, 62, 3299-3324). Por consiguiente los óxidos de fosfina VI se tratan con una base fuerte, por ejemplo un alquil-litio tal como fenil-litio, en condiciones anhidras y en atmósfera inerte y disolvente, por ejemplo tetrahidrofurano (THF), a temperaturas comprendidas en el intervalo entre aproximadamente -60°C y aproximadamente -90°C, propiamente a aproximadamente -78°C. A la ilida intermedia resultante se le añade una solución fría, preferentemente a aproximadamente -78°C, de una cetona V en un disolvente inerte tal como THF, mientras se mantienen las condiciones anhidras. Tras la eliminación de cualquier grupo protector utilizando químicas normalizadas (si es necesario), pueden obtenerse los compuestos de Fórmula II.

Las cetonas de Fórmula V, en las que R^{3} y R^{5} son como se definen en la Fórmula I, pueden prepararse, por ejemplo, como se muestra en el Esquema 3:

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Esquema 3

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Los compuestos protegidos de forma adecuada de Fórmula VII, en la que R^{3} y R^{5} son como se definen en la Fórmula I y PG es un grupo protector adecuado, se desprotegen en primer lugar y a continuación se oxidan para proporcionar cetonas V. Por ejemplo, cuando PG es trialquilsililo, tal como trietilsililo, la desprotección puede ser afectada haciendo reaccionar los compuestos de Fórmula VII con fluoruro de tetrabutilamonio (TBAF) en un disolvente inerte, tal como THF, y en una atmósfera inerte, propiamente a aproximadamente la temperatura ambiente. La oxidación del alcohol resultante puede realizarse, por ejemplo, utilizando N-óxido de 4-metilmorfolina (NMO), o cualquier otro agente oxidante, en un disolvente inerte tal como cloruro de metileno, en condiciones normales.

Los compuestos de Fórmula VII, en los que R^{3} y R^{5} son como se definen en la Fórmula I y PG es un grupo protector adecuado, pueden obtenerse, por ejemplo, como se muestra en el Esquema 4:

Esquema 4

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Los compuestos de Fórmula VIII, en los que R^{3} es como se define en la Fórmula I y PG es un grupo protector adecuado, pueden hacerse reaccionar con el anión de los compuestos de Fórmula IX, en la que R^{5} es como se define en la Fórmula I en condiciones anhidras a temperaturas comprendidas en el intervalo entre aproximadamente -60°C y aproximadamente -90°C, de manera adecuada a aproximadamente -78°C. Los aniones de los compuestos de Fórmula IX pueden prepararse tratando los compuestos de Fórmula IX con una base fuerte, por ejemplo un alquil-litio tal como n-butil-litio o diisopropilamina de litio (LDA), en condiciones inertes y, en presencia de hexametil fosforamida (HMPA), por ejemplo, o N_{1}, N, N^{1}, N^{1}-tetrametil etilendiamina (TMEDA).

Los compuestos de Fórmula IX, en los que R^{5} es como se define en la Fórmula I están disponibles en el mercado o pueden prepararse, por ejemplo, mediante la oxidación de los alcoholes correspondientes como se muestra en el Esquema 5:

Esquema 5

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Los ejemplos de agentes oxidantes incluyen el dicromato de piridinio (PDC), el ácido m-cloroperbenzoico (mCPBA) y el dióxido de manganeso.

La preparación de los compuestos de Fórmula VIII, en los que R^{3} es como se define en la Fórmula I y PG es un grupo protector adecuado, es conocida en la técnica. Por consiguiente los compuestos de Fórmula VIII pueden prepararse según se describe en Posner, G. H. et al. J. Med. Chem. 1999, 42, 3425-3435.

La preparación de los compuestos de Fórmula VI, en la que R^{2} y R^{6} son como se definen en la Fórmula I es conocida en la técnica. Por consiguiente los compuestos de Fórmula VI pueden prepararse como se describe en Posner, G. H. et al. J. Med. Chem. 1992, 35, 3280-3287, cuyos contenidos se incorporan a la presente memoria como referencia.

La preparación de compuestos enantioméricamente puros de Fórmula I y/o II, puede llevarse a cabo utilizando los compuestos enantioméricamente puros de Fórmula V y VI en la reacción mostrada en el Esquema 2. En esta reacción, se obtiene típicamente una mezcla de los diastereómeros 1\alpha,3\beta y 1\beta,3\alpha, con el diastereómero 1\alpha,3\beta como producto principal. Estos diastereómeros pueden separarse utilizando cromatografía, por ejemplo utilizando cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

En algunos casos las químicas mencionadas anteriormente pueden tener que ser modificadas, por ejemplo mediante la utilización de grupos protectores, para impedir reacciones secundarias debidas a grupos reactivos, tales como los grupos reactivos unidos como sustituyentes. Esto puede conseguirse por medio de grupos protectores convencionales, por ejemplo como se describe en "Protective Groups in Organic Chemistry" McOmie, J. F. W. Ed., Plenum Press, 1973 y en Greene, T. W. y Wuts, P. G. M., "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, 1991.

La formación de un compuesto salino deseado se consigue utilizando técnicas normalizadas. Por ejemplo, el compuesto neutro se trata con un ácido o base en un disolvente adecuado y la sal formada se aísla por filtración, extracción o cualquier otro procedimiento adecuado.

La formación de solvatos de los compuestos de la invención variará dependiendo del compuesto y del solvato. En general, los solvatos se forman disolviendo el compuesto en el disolvente apropiado y aislando el solvato mediante enfriamiento o utilizando un antidisolvente. El solvato se seca o se forma una mezcla azeotrópica típicamente a las condiciones del ambiente.

Los profármacos de los compuestos de Fórmula I pueden ser, por ejemplo, ésteres convencionales formados con el grupo hidroxi, tiol, amino o carbonilo disponible. Por ejemplo, cuando R^{1} y/o R^{2} es OH puede acilarse utilizando un ácido activado en presencia de una base, y opcionalmente, en disolvente inerte (p. ej., un cloruro ácido en piridina). Algunos ésteres habituales que se han utilizado como profármacos son los ésteres de fenilo, ésteres (C_{8}-C_{24}) alifáticos, ésteres de aciloximetilo, carbamatos y ésteres de aminoácidos.

Puede prepararse un compuesto radiomarcado de la invención utilizando procedimientos normalizados conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede incorporarse tritio en un compuesto de la invención utilizando técnicas normalizadas, por ejemplo por hidrogenación de un precursor adecuado a un compuesto de la invención que utiliza tritio gaseoso y un catalizador. Alternativamente, puede prepararse un compuesto de la invención que contiene yodo radioactivo a partir del correspondiente derivado de trialquilestaño (propiamente trimetilestaño) utilizando condiciones de yodación normalizadas, tal como yoduro de sodio [^{125}I] en presencia de cloramina-T en un disolvente adecuado, tal como dimetilformamida. El compuesto de trialquilestaño puede prepararse a partir del halo no radioactivo correspondiente, propiamente yodo, compuesto que utiliza condiciones normalizadas de estanilación catalizada por paladio, por ejemplo hexametildiestaño en presencia de tetrakis(trifenilfosfina) paladio (0) en un disolvente inerte, tal como dioxano, y a temperaturas elevadas, propiamente entre 50 y 100°C.

IV. Utilizaciones

Como se mencionó anteriormente en la presente memoria, se han preparado nuevos compuestos de Fórmulas 1 y II. Por consiguiente, la presente invención comprende todas las utilizaciones de los compuestos de la invención incluyendo su utilización en los procedimientos y composiciones terapéuticos para modular la proliferación celular, su utilización en análisis de diagnóstico y su utilización como herramientas de investigación y como materiales de partida yio productos intermedios en la preparación de otras entidades químicas.

La inhibición del catabolismo del calcitriol prolongará la vida biológica de esta hormona y de esta manera permitirá utilizar menores cantidades de ella para quimioterapia humana eficaz; dicha dosificación menor impedirá, o por lo menos minimizará, la toxicidad hipercalcémica asociada a la utilización medicinal del calcitriol. Inhibiendo selectivamente la serie de reacciones enzimáticas del citocromo P450, mediante el cual se cataboliza el calcitriol (principalmente por hidroxilación de C-24), es una manera importante de prolongar la vida de esta hormona. Por consiguiente, en los compuestos de Fórmula I se analizó in vitro, utilizando un protocolo normalizado, su capacidad para inhibir específicamente CYP24, responsable de la 24-hidroxilación del calcitriol. El cetoconazol antimicótico, un fármaco utilizado clínicamente para la quimioterapia del cáncer de próstata humano (Trachtenberg, J. et al. J. Urol. 1984, J32, 61-63), se utilizó como una referencia estándar para la inhibición de CYP24. Los compuestos seleccionados de Fórmula I fueron más potentes que cetoconazol para inhibir la actividad de CYP24. Estos compuestos presentaron poca a ninguna inhibición de las enzimas CYP27A1 y CYP27B1, lo que indica que pueden inhibir selectivamente la actividad de CYP24.

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Se ha demostrado también que los compuestos seleccionados de Fórmula I presentan una actividad antiproliferante in vitro en los queratinocitos murinos. Asimismo, en análisis normalizados de hipercalcemia, los compuestos seleccionados de Fórmula I no aumentaron los niveles de calcio en la orina de una rata después de ser administrados por vía oral a las ratas a diario durante una semana. A dosis similares, el calcitriol produce un aumento significativo en las concentraciones de calcio en la orina.

Los compuestos de Fórmula I son moduladores de CYP24 y son útiles para modular la actividad de CYP24, incluyendo la inhibición de la actividad de CYP24, para el tratamiento de varias enfermedades tales como los trastornos celulares proliferantes. Por consiguiente, la invención proporciona un procedimiento de modulación de la actividad de CYP24 administrando una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I a una célula o animal que lo necesita. En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento de inhibición de la actividad de CYP24 administrando una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I a una célula o animal que lo necesita. La presente invención también incluye la utilización de un compuesto de Fórmula I para modular, preferentemente para inhibir, la actividad de CYP24 y una utilización de un compuesto de Fórmula I para preparar un medicamento para modular, preferentemente para inhibir, la actividad de CYP24.

Modulando selectivamente la CYP24, se modulará también la enzima que metaboliza 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} y las concentraciones de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3}. Las enfermedades que se benefician de una modulación de las concentraciones de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} pueden por lo tanto tratarse utilizando un modulador de CYP24. Actuando preferentemente sobre la CYP24, se reducirán los efectos secundarios causados por la interacción con otras enzimas y receptores. Por lo tanto, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar las enfermedades que se aprovecha de una modulación de las concentraciones de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} que comprende la administración de una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I a una célula o a un animal que lo necesite. La invención incluye también la utilización de un compuesto de Fórmula I para modular las concentraciones de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3}. Además, la invención incluye una utilización de un compuesto de Fórmula I para preparar un medicamento destinado a modular las concentraciones de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3}.

La inhibición de CYP24, inhibirá el catabolismo de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} que prolongará la vida biológica de esta hormona y de esta manera permitirá que se utilicen pequeñas cantidades de ella para un tratamiento eficaz de la enfermedad. Dicha dosificación más pequeña impedirá, o por lo menos minimizará, la toxicidad percalcémica asociada a la utilización medicinal de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} (calcitriol). Por lo tanto, en una forma de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar enfermedades que se aprovecha de la inhibición del catabolismo de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} que comprende administrar una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I a una célula o animal que lo necesita. La invención incluye también la utilización de un compuesto de Fórmula I para inhibir el catabolismo de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3}. Además, la invención incluye una utilización de un compuesto de Fórmula I para preparar un medicamento que inhiba el catabolismo de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3}.

(ii): en el páncreas - diabetes;

(iii): en la tiroides - carcinoma medular;

(iv): en la piel - soriasis, cicatrización de heridas;

(v): en los pulmones - sarcoidosis y tuberculosis;

En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para modular la proliferación celular que comprende administrar una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I a una célula o animal que lo necesite. Preferentemente, la invención proporciona un procedimiento de inhibición de la proliferación celular que comprende administrar una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I a una célula o animal que lo necesite. La presente invención comprende asimismo una utilización de un compuesto de Fórmula I para modular, preferentemente para inhibir, la proliferación celular. La presente invención incluye además una utilización de un compuesto de Fórmula I para preparar un medicamento destinado a modular, preferentemente a inhibir, la proliferación celular. En particular, el procedimiento de la invención resulta útil para inhibir la proliferación de células anormales pero no normales. Las células anormales incluyen cualquier tipo de célula que sea causante de enfermedad o afección o esté implicada en las mismas y en la que sea deseable modular o inhibir la proliferación de la célula anormal para tratar la enfermedad o afección. Ejemplos de células anormales incluyen las células malignas o cancerosas así como una célula que hiperprolifere en condiciones inflamatorias tales como en la soriasis. En una forma de realización de la invención, el trastorno celular proliferante es el cáncer, en particular el cáncer de mama, próstata y pulmón.

Aunque los compuestos de la invención pueden actuar modulando la actividad de CYP24, un experto en la materia apreciará que resultan posibles otros modos o mecanismos de acción para los compuestos de Fórmula I.

Un experto en la materia puede determinar qué compuestos de Fórmula I tendrían utilidad terapéutica, por ejemplo, en la inhibición de la proliferación celular en cualquier tipo de cáncer o trastorno celular proliferante. Los compuestos pueden examinarse por su eficacia en la inhibición del crecimiento celular en análisis de proliferación celular tal como la inhibición del crecimiento de queratinocitos murinos (línea celular PE) como se describe en el ejemplo 13 en la presente memoria, y para la inhibición de la actividad de ornitina descarboxilasa (ODC) producida por TPA como se describe en la patente US n° 5.830.885, cuyos contenidos se incorporan a la presente memoria como referencia. Los compuestos de Fórmula I pueden también identificarse por su propensión a producir hipercalcemia utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 14 en la presente memoria. Los compuestos que presentan hipercalcemia no son deseables.

Además del cáncer, los compuestos de Fórmula I resultan útiles en el tratamiento de otras afecciones que implican proliferación celular aberrante o anormal. Otros trastornos celulares proliferantes que pueden tratarse mediante la presente invención comprenden las enfermedades inflamatorias, alergias, enfermedades autoinmunitarias, rechazo del trasplante, soriasis, restenosis, arteroesclerosis y cualquier otro trastorno en el que sea deseable inhibir, prevenir o suprimir la proliferación celular. Puede determinarse la eficacia de los compuestos de Fórmula I en un trastorno de proliferación celular específico utilizando ensayos y técnicas conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, las referencias siguientes proporcionan ensayos para varias enfermedades: artritis reumatoide: "Regulation of IL-15 - Simulated TNF-alpha Production by Rolipram", Journal of Immunology (1999) volumen 163 página 8236 por C. S. Kasyapa et al.; Allergy: "A novel Lyn-Binding Peptide Inhibitor Blocks Eosinophil Differentiation, Survival, and Airway eosinophilic inflammation". Journal of Immunology (1999) volumen 163 página 939 por T. Adachi et al.; Soriasis: Journal of Immunology (2000) volumen 165 página 224 "Inhibition of Keratinocyte apoptosis by IL-15: a new parameter in the pathegenosis of soriasis" por R. Uchert; y Soriasis: International Archives of allergy and Immunology (2000) volumen 123 página 275. "T-cell receptor mimic peptides and their potential application in T-cell mediated disease" por A. H. Enk.

Los compuestos de Fórmula I se formulan preferentemente en composiciones farmacéuticas para la administración a pacientes humanos en una forma biológicamente compatible adecuada a la administración in vivo. Por consiguiente, en otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de Fórmula I, o una sal, hidrato, solvato o profármaco de la misma farmacéuticamente aceptable, mezclado con un diluyente o portador adecuado.

Las composiciones que contienen los compuestos de Fórmula I pueden prepararse por procedimientos conocidos para la preparación de composiciones farmacéuticamente aceptables que pueden administrarse a pacientes, de modo que una cantidad eficaz de la sustancia activa se combine en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos adecuados se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985). Sobre esta base, las composiciones incluyen, aunque no exclusivamente, soluciones de las sustancias en asociación con uno o más vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables, y contenidas en soluciones tamponadas con un pH adecuado e isoosmótico con los fluidos fisiológicos.

Los compuestos de Fórmula I pueden utilizarse farmacéuticamente en forma de base libre, en forma de sales, solvatos y en forma de hidratos. Todas las formas están comprendidas dentro del alcance de la invención. Las sales de adición de ácido y de base pueden formarse con los compuestos de la invención (es decir, los compuestos de Fórmulas I y II) para su utilización como fuentes de la forma de base libre incluso si la sal específica por sí misma se desea únicamente como producto intermedio como, por ejemplo, cuando la sal se forma únicamente para purificación e identificación. Todas las sales que pueden formarse con los compuestos de la invención están por consiguiente comprendidas dentro del alcance de la presente invención.

Según los procedimientos de la invención, los compuestos de Fórmula I descritos, o las sales, solvatos, hidratos o profármacos de los mismos, pueden administrarse a un paciente en varias formas dependiendo de la vía de administración seleccionada, como apreciará cualquier experto en la materia. Los compuestos de Fórmula I pueden administrarse, por ejemplo, por administración oral, parenteral, bucal, sublingual, nasal, rectal, en parches, bomba o transdérmica y las composiciones farmacéuticas formularse de acuerdo con éstas. La administración parenteral incluye los modos de administración intravenoso, intraperitoneal, subcutáneo, intramuscular, transepitelial, nasal, intrapulmonar, intratecal, rectal y tópico. La administración parenteral puede ser por infusión continua durante un periodo de tiempo seleccionado.

Un compuesto de Fórmula I se puede administrar por vía oral, por ejemplo con un diluyente inerte o con un portador comestible asimilable, o pueden introducirse en cápsulas de gelatina de cubierta dura o blanda, o pueden comprimirse en comprimidos, o pueden incorporarse directamente con el alimento de la dieta. Para la administración terapéutica oral, el compuesto de Fórmula I puede incorporarse con excipiente y utilizarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, grageas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares.

Un compuesto de Fórmula I se puede administrar también por vía parenteral. Las soluciones de un compuesto de Fórmula I pueden prepararse en agua mezclada de forma adecuada con un tensioactivo tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones pueden prepararse también en glicerol, polietilenglicoles líquidos, DMSO y mezclas de los mismos con o sin alcohol y en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y utilización, estas preparaciones contienen un conservante o impiden el crecimiento de microorganismos. Un experto en la materia conoce cómo preparar formulaciones adecuadas. Los procedimientos e ingredientes convencionales para la selección y preparación de formulaciones adecuadas se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (1990 - 18ª edición) y en The United States Pharmacopeia: The National Formulary (USP 24 NF19) publicada en 1999.

Las formas farmacéuticas adecuadas para su utilización inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas esterilizadas y polvos esterilizados para la preparación improvisada de soluciones o dispersiones inyectables esterilizadas. En todos los casos la forma debe estar esterilizada y debe ser fluida hasta el punto en que se produzca una fácil inyectabilidad.

Las composiciones para administración nasal pueden formularse convenientemente en forma de aerosoles, gotas, geles y polvos. Las formulaciones en aerosol comprenden típicamente una solución o suspensión fina de la sustancia activa en un disolvente acuoso o no acuoso fisiológicamente aceptable y se presentan normalmente en cantidades individuales o en multidosis en forma esterilizada en un recipiente sellado, que puede tener la forma de un cartucho o de relleno para su utilización con un disolvente de atomización. Alternativamente, el recipiente sellado puede ser un dispositivo dosificador unitario tal como un inhalador nasal de una sola dosis o un dosificador de aerosol provisto de una válvula de dosificación que está pensado para su eliminación después de la utilización. Cuando la forma galénica comprende un dosificador de aerosol, contendrá un propulsor que puede ser un gas comprimido tal como aire comprimido o un propulsor orgánico tal como fluoroclorohidrocarburo. Las formas galénicas de aerosol pueden también tener la forma de un atomizador de bomba.

Las composiciones adecuadas para administración bucal o sublingual incluyen comprimidos, tabletas y pastillas, en las que el ingrediente activo se formula con un portador tal como azúcar, acacia, tragacanto o gelatina y glicerina. Las composiciones para administración rectal son convencionalmente en forma de supositorios que contienen una base de supositorio convencional tal como manteca de cacao.

Los compuestos de Fórmula I, o las sales, solvatos, hidratos o profármacos de los mismos, pueden administrarse a un animal solos o en combinación con portadores farmacéuticamente aceptables, como se señaló anteriormente, cuya proporción se determina por la solubilidad y naturaleza química del compuesto, la vía de administración seleccionada y la práctica farmacéutica habitual.

La dosificación de los compuestos de Fórmula I y/o de las composiciones de la invención puede variar dependiendo de muchos factores tales como las propiedades farmacodinámicas del compuesto, del modo de administración, de la edad, salud y peso del receptor, de la naturaleza y alcance de los síntomas, de la frecuencia del tratamiento y del tipo de tratamiento simultáneo, si existe, y de la tasa de eliminación del compuesto en el animal que va a tratarse. Un experto en la materia puede determinar la dosificación apropiada basándose en los factores anteriores. Los compuestos de Fórmula I pueden administrarse inicialmente en una dosis adecuada que puede ajustarse como se requiera, dependiendo de la respuesta clínica. Para el tratamiento ex vivo de células durante un periodo corto, por ejemplo durante 30 minutos a 1 hora o más, pueden utilizarse dosis mayores del compuesto que para la terapia in vivo de larga duración.

Los compuestos de Fórmula I, o las sales, solvatos, hidratos o profármacos de los mismos, pueden utilizarse solos o en combinación con otros agentes que modulen la actividad de CYP24 o en combinación con otros tipos de tratamiento (que puede modular o no a CYP24) para los trastornos celulares proliferantes u otros trastornos que se aprovechan de una modulación en las concentraciones de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} y/o una inhibición del catabolismo de 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3}. Preferentemente los compuestos de Fórmula I se administran en combinación con 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} (calcitriol) u otros agonistas del receptor de vitamina D. Inhibiendo el catabolismo de los agonistas del receptor de vitamina D se prolongará la vida biológica o la eficacia de estas terapias y de esta manera se permitirá utilizar cantidades más pequeñas del fármaco para la quimioterapia humana eficaz; dicha dosificación menor permitirá, o por lo menos minimizará, la toxicidad hipercalcémica asociada a la utilización medicinal del calcitriol o de otros agonistas receptores de la vitamina D. La presente invención por lo tanto proporciona un procedimiento para aumentar la eficacia de un agonista del receptor de vitamina D, preferentemente 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} (calcitriol), que comprende la administración conjunta de una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I y una cantidad eficaz del agonista del receptor de vitamina D, preferentemente 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} (calcitriol). Además la invención incluye una utilización de un compuesto de Fórmula I para aumentar la eficacia de un agonista del receptor de vitamina D, preferentemente 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} (calcitriol), y una utilización de un compuesto de Fórmula I para preparar un medicamento destinado a aumentar la eficacia de un agonista del receptor de vitamina D, preferentemente 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} (calcitriol).

En otro aspecto de la presente invención los compuestos de Fórmula I, o las sales, solvatos, hidratos o profármacos de los mismos, pueden utilizarse en combinación con otras terapias o productos terapéuticos para tratar trastornos dermatológicos, trastornos óseos, trastornos de tiroides, cicatrización de heridas y osteoporosis.

Además de las utilizaciones terapéuticas mencionadas anteriormente, los compuestos de la invención son útiles también en el análisis de diagnóstico, análisis de identificación y como herramientas para investigación.

En el análisis de diagnóstico los compuestos de la invención (incluyendo los compuestos de Fórmula II, que se ha demostrado también que inhiben a CYP24, pero son calcémicos) pueden ser útiles en la identificación o detección de un trastorno celular proliferante. En dicha forma de realización, los compuestos de la invención pueden radiomarcarse (como se describió anteriormente en la presente memoria) y ponerse en contacto con una población de células. La presencia del producto radiomarcado en las células puede indicar un trastorno celular proliferante.

En los análisis de identificación, los compuestos de la invención (incluyendo los compuestos de Fórmula II) pueden utilizarse para identificar otros compuestos que modulen la proliferación celular o la actividad de CYP24. Como herramientas de investigación, los compuestos de la invención pueden utilizarse en análisis de unión al receptor y análisis para estudiar la localización de CYP24. En dichos análisis, los compuestos pueden también estar radiomarcados.

Los siguientes ejemplos no limitativos son ilustrativos de la presente invención:

Ejemplos Materiales y procedimientos

A menos que se indique de otro modo, todas las reacciones se realizaron en estufa seca de vidrio agitada bajo una atmósfera de argón de ultra alta pureza. Se destiló THF en Na/cetil benzofenona y se destiló CH_{2}Cl_{2} en CaH_{2} inmediatamente antes de su utilización. Se valoraron los organolitios antes de la utilización siguiendo procedimientos conocidos (Suffert, J. J. Org. Chem. 1989, 54, 509-510). Se destilaron cloruro de metileno (CH_{2}Cl_{2}) y trietilamina (Et_{3}N) en hidruro de calcio antes de su utilización. Todos los demás reactivos se utilizaron tal como se recibieron de los proveedores comerciales. El análisis por TLC analítico se realizó en placas recubiertas previamente de gel de sílice sobre soporte de vidrio (Merck Kieselgel 60 F_{254}, de 250 mm de espesor) y se observaron con p-anisaldehído o tinción con KMnO_{4}. Se realizó la cromatografía en columna utilizando gel de sílice de trayecto corto (tamaño de partícula <230 mesh) o gel de sílice flash (tamaño de partícula de 230 a 400 mesh). Se realizó la cromatografía en placa de preparación utilizando placas de preparación de vidrio recubiertas con gel de sílice (de 500 a 1.000 \mum) de Analtech y se analizaron por UV. Se realizó la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) utilizando un sistema Rainin HPLX equipado con cabezales de bombas de preparación de 25 ml/min utilizando columnas (de semipreparación) Rainin Dynamax 10 mm \times 250 mm rellenas con gel de sílice de 60 A (tamaño de poro de 8 \mum) como sílice ligada a C-18 y un detector de longitud de onda variable de rayo doble Rainin Dynamax UV-C ajustado a 265 nm. Se presentan los rendimientos para productos puros (>95% referido a su homogeneidad cromatrográfica y espectroscópica) y no están optimizados. Se midieron las rotaciones ópticas en la línea de Na utilizando un polarímetro 141 de Perkin-Elmer. Se obtuvo los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) en un espectrómetro XL-400 de Varian a 400 MHz para ^{1}H, y 100 MHz para ^{13}C. Los desplazamientos químicos están expresados en ppm (\delta) y están referidos a CDCl_{3} (7,26 ppm para ^{1}H y 77,0 ppm para ^{13}C), y tetrametilsilano (TMS, 0,00 ppm para ^{1}H). Se obtuvieron espectros ultravioleta (UV) utilizando un espectrofotómetro Cary Bio 400 a temperatura ambiente. Se obtuvieron espectros infrarrojos (IR) utilizando un instrumento FT-IR de la serie 1600 de Perkin Elmer. Las bandas de absorción se expresan en números de ondas (cm^{-1}). Se obtuvieron espectros de masas a baja y alta resolución (LRMS y HRMS) con ionización electrónica o química (EI o CI) en el equipo de espectrometría de masas en la Ohio State University en un espectrómetro de masas por electroatomización Micromass QTOF.

Ejemplo 1 Preparación de t-butilcetona VII (R^{3} = CH_{3}, R^{5} = t-butilo, PG = TES)

Se cargó un matraz de 15 ml de fondo redondo con triisopropilamina (42 mg, 0,41 mmoles, 7,4 eq., destilado sobre hidruro de calcio antes de su utilización) y se destilaron 2 ml de THF. Esta solución se enfrió a -78°C, y se añadió con jeringuilla n-butil-litio (250 \mul de solución 1,6 M, 0,43 mmoles, 7,2 eq.). Pinacolona (IX, R^{5} = t-butilo) (39 mg, 0,39 mmoles, 7,0 eq., secada sobre carbonato potásico y tamices moleculares activados durante 24 horas inmediatamente antes de su utilización) se disolvió en 1 ml de THF destilado y se enfrió a -78°C en cuyo momento se añadió al matraz de reacción por una cánula. La reacción se dejó en agitación durante 30 minutos. Se añadió con una jeringuilla a continuación hexametilfosforamida (HMPA, 250 \mul) y se dejó agitar la mezcla de reacción durante otros 15 minutos. Una solución de yoduro (-)-VIII (R^{3} = CH_{3}, PG = trietilsilil (TES)) (25 mg, 0,06 mmoles) en 1 ml de THF se enfrió a -78°C y se añadió a la mezcla de reacción por una cánula. La mezcla de reacción se agitó a -78°C durante dos horas y a continuación se calentó a -41°C en un baño de nieve carbónica/acetonitrilo donde se dejó calentar a temperatura ambiente durante dos horas y agitar durante otras 6 horas. La solución amarilla resultante se enfrió con 2 ml de agua, se extrajo con acetato de etilo (3 x 25 ml), se secó sobre MgSO_{4}, se concentró y se purificó utilizando cromatografía en columna de gel de sílice (0 a 20% de acetato de etilo/éter de petróleo) para dar un aceite incoloro (18 mg, 76%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 5,26 (t, J = 1,4 Hz, 1H), 4,11 (d, J =2,0 Hz, 1H), 2,46-1,25 (m, 16H), 1,13 (s, 9H), 1,00 (s, 3H), 0,98-0,96 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,97-0,93 (t, J = 8 Hz, 9H), 0,59-0,53 (q, J =7,8 Hz, 6H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 216,1, 160,2 119,7, 69,0, 55,1, 46,7, 44,1, 36,6, 36,2, 35,8, 35,0, 31,7, 30,7, 26,4, 22,3, 22,0, 18,7, 18,1, 6,9, 4,9; IR (puro) 2956, 1708, 1607, 1456, 1366, 1235, 1143, 1082, 1029, 972, 725 cm^{-1}; [\alpha]_{D} = +19,4; HRMS calc. para C_{26}H_{48}O_{2}SiNa [M+Na]: 443,3321, obtenido: 443,3318.

Ejemplo 2 Preparación de la cetona V con anillo CD (R^{3} = CH_{3}, R^{5} = t-butilo)

Se cargó un matraz de 15 ml de fondo redondo con terc-butilcetona VII (R^{3} = CH_{3}, R^{5} = t-butilo, PG = TES) (18 mg, 0,4 mmoles) disuelta en 5 ml de THF destilado. Se añadieron al matraz de reacción fluoruro de tetrabutilamonio hidratado (TBAF, 112 mg, 10 eq.) y tamices moleculares de 4 \ring{A} (100 mg) y esta solución se dejó agitar a reflujo durante cuatro horas. Las fracciones adicionales de TBAF y los tamices se añadieron cada cuatro horas hasta que el material de partida ya no fue más visible por cromatografía analítica en capa fina (TLC). La solución de reacción se filtró a través de una torunda de gel de sílice utilizando acetato de etilo como eluyente para eliminar el TBAF en exceso y los tamices moleculares. Esta solución se concentró y se cargó en un matraz de fondo redondo de 10 ml con el material resultante disuelto en 5 ml de diclorometano (CH_{2}Cl_{2}) destilado. A esta solución se añadieron tamices moleculares de 4 \ring{A} (20 mg), N-óxido de 4-metilmorfolina (NMO, 10 mg, 0,09 mmoles, 2 eq.) y una cantidad catalítica de perrutenato de tetrapropilamonio (TPAP). Después de agitar durante 1 hora, la TLC presentó el consumo completo del material de partida. Se filtró la solución de reacción a través de una torunda de gel de sílice utilizando acetato de etilo como eluyente para eliminar el TPAP y los tamices moleculares. Se concentró y purificó esta solución utilizando la cromatografía en columna de gel de sílice (20% de acetato de etilo/éter de petróleo) para proporcionar un aceite incoloro (9 mg, 71%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 5,29-5,28 (m, J =1,6 Hz, 1H), 2,87-2,82 (dd, J =10,6, 6,6 Hz, 1H), 2,47-1,31 (m, 16H), 1,12 (s, 9H), 1,05-1,04 (d, J =6,8 Hz, 3H), 0,80 (s, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 215,9, 211,1, 157,8, 120,3, 63,1, 53,8, 44,1, 40,5, 36,5, 36,0, 34,4, 32,9, 27,1, 26,4, 24,0, 21,9, 21,7, 17,25; IR (puro) 2955, 1702, 1461, 1367 cm^{-1}; [\alpha]_{D} = 15,6; HRMS calc. para C_{20}H_{32}O_{2}Na [M+Na]: 327,2300, obtenido: 327,2302.

Ejemplo 3 Preparación de II(a) y II(b)

Óxido de fosfina anhidro (\pm)-VI (R^{1},R^{2} = O-t-butildimetilsililo (OTBDMS)) (79 mg, 0,14 mmoles, 1,4 eq.) se disolvió en 2,5 ml de THF destilado y se enfrió a -78°C. Se añadió gota a gota con una jeringuilla fenil-litio (88 \mul de una solución 1,7 M en ciclohexano-éter, 0,15 mmoles, 1,5 eq.) produciendo un color rojo oscuro. Esta solución se dejó en agitación durante 20 minutos. Cetona con anillo CD anhidro (+)-V (R^{3} = CH_{3}, R^{5} = t-butilo) (31 mg, 0,10 mmoles) se disolvió en 1,5 ml de THF destilado y se enfrió a -78°C. Esta solución se añadió a continuación a la mezcla de reacción por una cánula, y persistió el color rojo. Esta solución se agitó a -78°C a la oscuridad durante 7 horas en cuyo momento se enfrió con carbonato de potasio saturado (1 ml) y tartrato de sodio y potasio (2 ml de una solución 2 M). El producto se extrajo con acetato de etilo (4 x 60 ml), se secó utilizando MgSO_{4}, se filtró, se concentró y se purificó utilizando cromatografía en columna de gel de sílice (3 a 10% de acetato de etilo/hexanos tamponado con 1% de Et_{3}N) para dar un aceite incoloro. Se cargó un matraz de fondo redondo de 5 ml con este aceite disuelto en 2,5 ml de THF, TBAF hidratado (241 mg, 0,92 mmoles, 14 eq.), tamices moleculares de 4 \ring{A} (100 mg), y 3 gotas de Et_{3}N sucesivamente. Esta solución se dejó en agitación a la oscuridad a temperatura ambiente durante 8 horas. La mezcla de reacción se purificó directamente utilizando cromatografía de columna en gel de sílice (99% de acetato de etilo tamponado con 1% de Et_{3}N) para dar II(a) y II(b) (15 mg, 38%) como mezcla de diastereómeros (1:3,5) que se separaron utilizando cromatografía HPLC en fase normal (90% de acetato de etilo/hexanos, tamponado con 1% de Et_{3}N) para proporcionar 2 mg (5%, 3% total) del isómero II(b) del anillo A natural. II(a) (1\beta,3\alpha): ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 6,41-6,38 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 6,11-6,08 (m, J = 11,2 Hz, 1H), 5,32 (m, 1H), 5,30 (m, 1H), 5,02 (m, 1H), 4,44 (m, 1H), 4,22 (m, 1H), 2,83-2,80 (dm, J = 11,6 Hz, 1H), 2,65-1,33 (m, 19H), 1,13 (s, 9H), 1,03-1,01 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,67 (s, 3H); [\alpha]^{D} = 4,3; HRMS calc. para C_{29}H_{44}O_{3}Na [M+Na]: 463,3188, obtenido: 463,3163; II(b) (1\alpha,3\beta) ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 6,39-6,36 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 6,12-6,09 (m, J = 11,2 Hz, 1H), 5,34-5,33 (t, J =1,6 Hz, 1H), 5,30-5,29 (t, J = 1,4 Hz, 1H), 5,01 (m, 1H), 4,45 (m, 1H), 4,24 (m, 1H), 2,83-2,79 (dm, J = 12 Hz, 1H), 2,62-2,58 (dm, J = 12,8 Hz, 1H), 2,47-1,33 (m, 18H), 1,12 (s, 9H), 1,03-1,01 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,68 (s, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 216,1, 159,6, 147,7, 142,6, 132,9, 124,9, 120,3, 116,8, 111,6, 70,6, 66,9, 58,3, 50,1, 45,2, 42;8, 36,6, 36,1, 35,3, 32,7, 29,7, 29,4, 28,8, 26,4, 23,6, 21,9, 21,6, 16,9; IR (puro) 3855, 3752, 3677, 3386, 2924, 2846, 1702, 1654, 1561, 1432, 1362, 1209, 1051, 1010, 846 cm^{-1}; UV (MeOH) \lambda_{máx} 264 nm (\varepsilon 8157); [\alpha]_{D} = +17,2; HRMS calc. para C_{29}H_{44}O_{3}Na [M+Na]: 463,3188, obtenido: 463,3175. Fue posible separar los diastereómeros utilizando HPLC en fase normal aunque la separación óptima se obtuvo solamente utilizando inyecciones muy pequeñas (\sim200 \mug o menos).

Ejemplo 4 Preparación de los compuestos I(a) y I(b)

Óxido de fosfina anhidro (\pm)-VI (R^{1},R^{2} = O-OTBDMS) (89 mg, 0,15 mmoles, 2 eq.) se disolvió en 2,5 ml de THF destilado y se enfrió a -78°C. Se añadió gota a gota con una jeringuilla fenil-litio (93 \mul de una solución 1,8 M en ciclohexano-éter, 0,17 mmoles, 2,2 eq.) produciendo un color rojo oscuro. Esta solución se dejó en agitación durante 20 minutos. Cetona con anillo CD anhidro (+)-II (R^{3} = CH_{3}, R^{5} = t-butilo) (23 mg, 0,08 mmoles) se disolvió en 1,5 ml de THF destilado y se enfrió a -78°C. Esta solución se añadió a continuación a la mezcla de reacción por una cánula, y persistió el color rojo. Esta solución se agitó a -78°C a la oscuridad durante 7 horas en cuyo momento se enfrió con carbonato de potasio saturado (1 ml) y tartrato de sodio y potasio (2 ml de una solución 2 M). El producto se extrajo con acetato de etilo (4 x 60 ml), se secó utilizando MgSO_{4}, se filtró, se concentró y se purificó utilizando cromatografía en columna de gel de sílice (3 a 10% de acetato de etilo/hexanos tamponado con 1% de Et_{3}N) para proporcionar un aceite incoloro. Se cargó un matraz de fondo redondo de 5 ml con una parte de este material (27 mg, 0,04 mmoles) disuelto en 2 ml de piridina anhidra. Se añadió hidrocloruro de hidroxilamina (III, R^{4} = H) (51 mg, 0,74 mmoles, 20 eq.) y la reacción se dejó en agitación a la oscuridad a temperatura ambiente durante 24 horas en cuyo momento se demostró por análisis TLC el consumo completo del material de partida y la aparición de un producto más polar. Este material se purificó directamente utilizando cromatografía de columna en gel de sílice (10% de acetato de etilo/hexanos tamponado con 1% de Et_{3}N) para proporcionar un aceite incoloro. Se cargó un matraz de fondo redondo de 5 ml con este aceite disuelto en 2,5 ml de THF, hidrato de TBAF (135 mg, 0,52 mmoles, 14 eq.), tamices moleculares de 4 \ring{A} (60 mg) y 3 gotas de Et_{3}N sucesivamente. Esta solución se dejó agitar a la oscuridad a temperatura ambiente durante 8 horas. La mezcla de reacción se purificó directamente utilizando cromatografía en columna de gel de sílice (99% de acetato de etilo tamponado con 1% de Et_{3}N) para dar I(a) y I(b) (14 mg, 61%) como mezcla de diastereómeros (1:3,5) que se separaron utilizando cromatografía HPLC en fase inversa (38% de H_{2}O/acetonitrilo) para proporcionar 2,3 mg (16%, 5% total) de I(a) y 4,0 mg (29%, 10% total) de I(b). I(a) (1\beta,3\alpha): ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 6,40-6,37 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 6,10-6,07 (m, J = 11,2 Hz, 1H), 5,32 (m, 1H), 5,29 (m, 1H), 5,02 (m, 1H), 4,45 (m, 1H), 4,22 (m, 1H), 2,83-2,80 (dm, J = 11,6 Hz, 1H), 2,64-2,60 (dd, J = 12,8 Hz, J = 3,4 Hz, 1H), 2,38-1,24 (m, 18H), 1,11 (s, 9H), 1,03-1,01 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,68 (s, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 167,7, 159,7, 147,1, 142,7, 132,7, 125,0, 120,3, 116,8, 112,7, 71,4, 66,7, 58,4, 50,0, 45,4, 42,8, 37,4, 37,2, 35,3, 32,6, 29,4, 28,8, 27,7, 26,1, 24,3, 23,6, 21,4, 17,0; [\alpha]_{D} =
-3,7; HRMS calc. para C_{29}H_{45}NO_{3}Na [M+Na]: 478,3297, obtenido: 478,3336; I(b) (1\alpha,3\beta): ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 6,39-6,36 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 6,12-6,09 (m, J = 11,6 Hz, 1H), 5,34-5,33 (t, J = 1,6 Hz, 1H), 5,30 (m, 1H), 5,02-5,01 (m, J = 1,6 Hz, 1H), 4,44 (m, 1H), 4,24 (m, 1H), 2,83-2,79 (dm, J = 12 Hz, 1H), 2,63-2,59 (dm, J = 13,6 Hz, 1H), 2,38-1,69 (m, 18H), 1,11 (s, 9H), 1,03-1,02 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,69 (s, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 167,7, 159,7, 147,6, 142,7, 132,9, 125,0, 120,3, 116,8, 111,7, 70,7, 66,8, 58,4, 50,0, 45,2, 42,8, 37,4, 37,2, 35,3, 32,6, 29,4, 28,8, 27,7, 26,1, 24,3, 23,6, 21,4, 17,0; IR (puro) 3331, 2955, 2919, 2837, 1661, 1461, 1367, 1349, 1049, 932, 797, 756 cm^{-1}; UV (MeOH) \lambda_{máx} 266 nm (\varepsilon 8502); [\alpha]_{D} = +4,8; HRMS calc. para C_{29}H_{45}NO_{3}Na [M+Na]: 478,3297, obtenido: 478,3336.

Ejemplo 5 Preparación de los compuestos I(c) y I(d)

Óxido de fosfina anhidro (\pm)-VI (R^{1},R^{2} = OTBDMS, R^{6} = CH_{2}) (89 mg, 0,15 mmoles, 2 eq.) se disolvió en 2,5 ml de THF destilado y se enfrió a -78°C. Se añadió gota a gota con una jeringuilla fenil-litio (93 \mul de una solución 1,8 M en ciclohexano-éter, 0,17 mmoles, 2,2 eq.) produciendo un color rojo oscuro. Esta solución se dejó en agitación durante 20 minutos. Cetona con anillo CD anhidro (+)-II (R^{3} = CH_{3}, R^{5} = t-butilo) (23 mg, 0,08 mmoles) se disolvió en 1,5 ml de THF destilado y se enfrió a -78°C. Esta solución se añadió a continuación a la mezcla de reacción por una cánula, y persistió el color rojo. Esta solución se agitó a -78°C a la oscuridad durante 7 horas enfriándose entonces con carbonato de potasio saturado (1 ml) y tartrato de sodio y potasio (2 ml de una solución 2 M). El producto se extrajo con acetato de etilo (4 x 60 ml), se secó utilizando MgSO_{4}, se filtró, se concentró y se purificó utilizando cromatografía en columna de gel de sílice (3 a 10% de acetato de etilo/hexanos tamponado con 1% de Et_{3}N) para proporcionar un aceite incoloro. Se cargó un matraz de fondo redondo de 5 ml con una parte de este material (12 mg, 0,02 mmoles) disuelto en 1,5 ml de piridina anhidra. Se añadió hidrocloruro de hidroxilamina (III, R^{4} = H) (27 mg, 0,33 mmoles, 20 eq.) y la reacción se dejó en agitación a la oscuridad a temperatura ambiente. Se añadieron porciones adicionales de metoxilamina (60 eq. en total) y la reacción se agitó durante un total de 36 horas. El material de partida y el producto eran de polaridad muy similar y el análisis TLC no fue particularmente útil para seguir la reacción. Este material se purificó directamente utilizando cromatografía de columna en gel de sílice (3% de acetato de etilo/hexanos tamponado con 1% de Et_{3}N) para dar un aceite incoloro. Se cargó un matraz de fondo redondo de 5 ml con este aceite disuelto en 2 ml de THF, hidrato de TBAF (59 mg, 0,22 mmoles, 14 eq.), tamices moleculares de 4 \ring{A} (60 mg) y 1 gota de Et_{3}N sucesivamente. Esta solución se dejó agitar a la oscuridad a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla de reacción se purificó directamente utilizando cromatografía en columna de gel de sílice (99% de acetato de etilo tamponado con 1% de Et_{3}N) para dar I(c) y I(d) (6 mg, 59%) como mezcla de diastereómeros (1:3,5) que se separaron utilizando cromatografía HPLC en fase inversa (15% de H_{2}O/acetonitrilo) para dar 1,4 mg (19%, 6% total) de I(c) y 2,8 mg (37%, 12% total) de I(d). I(c) (1\beta,3\alpha): ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 6,41-6,38 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 6,11-6,08 (m, J = 11,6 Hz, 1H), 5,32 (m, 1H), 5,29 (t, J = 1,2 Hz, 1H), 5,02 (m, 1H), 4,46-4,44 (m, 1H), 4,24-4,20 (m, 1H), 3,78 (s, 3H), 2,84-2,80 (dm, J = 11,8 Hz, 1H), 2,65-2,60 (dd, J = 13,0 Hz, J = 3,8 Hz, 1H), 2,38-1,35 (m, 18H), 1,09 (s, 9H), 1,03-1,01 (d, J = 76,8 Hz, 3H), 0,69 (s, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 166,8, 159,7, 147,1, 142,7, 132,7, 125,0, 120,3, 116,8, 112,5, 71,4, 66,9, 60,9, 58,3, 50,0, 45,2, 42,8, 37,1, 35,3, 32,6, 29,4, 28,8, 27,8, 26,5, 24,6, 23,6, 21,3, 17,0; [\alpha]_{D} = -2,4; HRMS calc. para C_{30}H_{48}NO_{3} [M+H]: 470,3634, obtenido: 470,3623; I(d) (1\alpha,3\beta): ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 6,39-6,37 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 6,12-6,09 (m, J = 11,2 Hz, 1H), 5,34-5,33 (t, J = 1,6 Hz, 1 H), 5,29 (t, J = 1,2 Hz, 1 H), 5,02 (m, 1 H), 4,46-4,43 (m, 1 H), 4,26-4,23 (m, 1 H), 3,78 (s, 3H), 2,84-2,80 (dm, J = 11,8 Hz, 1 H), 2,63-2,58 (dd, J = 13,6 Hz, 3,6 Hz, 1 H), 2,38-1,35 (m, 18H), 1,09 (s, 9H), 1,03-1,01 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 0,69 (s, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 166,8, 159,7, 147,6, 142,6, 132,9, 124,9, 120,3, 116,8, 111,7, 70,7, 66,8, 60,9, 58,4, 50,0, 45,2, 42,8, 37,1, 35,3, 32,6, 29,7, 29,4, 28,8, 27,8, 26,5, 24,6, 23,6, 21,3, 16,9; IR (puro) 3331, 2955, 2919, 2849, 1461, 1361, 1049, 885 cm^{-1}; UV (MeOH) \lambda_{máx} 264 nm (e 6923); [\alpha]_{D} = +6,0; HRMS calc. para C_{30}H_{48}NO_{3} [M+H]: 470,3634, obtenido: 470,3636.

De la misma manera se prepararon los compuestos adicionales siguientes:

Compuestos I(e) y I(f): Sustituyendo hidrocloruro de metoxilamina (III, R^{4} = CH_{3}) por hidrocloruro de O-etilhidro-
xilamina (III, R^{4} = Et). El producto de reacción en bruto se purificó por cromatografía en columna eluido con 99% de acetato de etilo en presencia de 1% de trietilamina para dar 4,8 mg de una mezcla de diastereómeros I(e) (1\alpha,3\beta) y I(f) (1\beta,3\alpha) con 63% de rendimiento en una proporción de 1,8:1, respectivamente. Esta mezcla diastereomérica se separó a continuación por HPLC (columna Phenomenex Luna, fase inversa, 3 ml/min) se eluyó con 15% de agua en acetonitrilo para dar 1,2 mg de I(e) (1\alpha,3\beta) y 0,6 mg de I(f) (1\beta,3\alpha) con 16% y 8% de rendimientos, respectivamente. El tiempo de retención para I(e) (1\alpha,3\beta) es de 55,48 min y para I(f) (1\beta,3\alpha) es de 53,23 min. Datos para I(e) (1\alpha,3\beta): [\alpha]^{25}_{D}= +4,66 (c=0,01, CHCl_{3}) ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta 6,38 (d, 1H, J = 10,8 Hz), 6,11 (d, 1H, J = 11,6 Hz), 5,34-5,30 (m, 2H), 5,02 (d, 1H, J = 1,2 Hz), 4,44 (m, 1H), 4,24 (m, 1H), 4,03 (q, 2H, J = 7,2 Hz), 2,84-2,79 (m, 1H), 2,62-2,59 (m, 1H), 2,39-2,30 (m, 2H), 2,23-1,87 (m, 7H), 1,79-1,66 (m, 4H), 1,56-1,38 (m, 6H), 2,21 (t, 3H, J = 7,2 Hz), 1,09 (s, 9H), 1,02 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 0,69 (s, 3H). ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 100 MHz): \delta 166,40, 159,78, 147,65, 142,70, 132,88, 124,99, 120,27, 116,84, 111,61, 70,68, 68,49, 66,88, 58,44, 50,03, 45,17, 42,86, 37,18, 37,15, 35,35, 32,55, 29,37, 28,79, 27,85, 26,52, 24,59, 23,63, 21,34, 16,97, 14,64. IR (película fina) 3345 (br, m), 2928 (s), 1666 (w), 1462 (w), 1365 (w), 1092 (w), 1053 (s), 916 (w), 873 (w), 801 (w) cm^{-1}. HRMS: calculado para C_{31}H_{49}NO_{3}Na^{+} [M+Na]: 506,3604 Obtenido: 506,3604. Los datos para I(f) (1\beta,3\alpha) no se obtuvieron debido a cantidad insuficiente de compuesto.

Compuestos I(g) y I(h): Sustituyendo hidrocloruro de metoxilamina (III, R^{4} = CH_{3}) por hidrocloruro de O-alilhidro-
xilamina (III, R^{4} = alil). El producto de reacción en bruto se purificó por cromatografía en columna eluido con 99% de acetato de etilo en presencia de 1% de trietilamina para dar 6,1 mg de una mezcla de diastereómeros I(g) (1\alpha,3\beta) y I(h) (1\beta,3\alpha) con 73% de rendimiento en una proporción de 2,0:1, respectivamente. Esta mezcla diastereomérica se separó a continuación por HPLC (columna Phenomenex Luna, fase inversa, 3 ml/min) se eluyó con 15% de agua en acetonitrilo para dar 1,1 mg de I(g) (1\alpha,3\beta) y 0,53 mg de I(h) (1\beta,3\alpha) con 13% y 6% de rendimientos, respectivamente. El tiempo de retención para I(g) (1\alpha,3\beta) es de 55,55 min y para I(h) (1\beta,3\alpha) es de 53,19 min. Datos para I(g) (1\alpha,3\beta) MK-1625 (NOAII)-TB-2: [\alpha]^{25}_{D}= +4,0 (c=0,01, CHCl_{3}) ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta 6,38 (d, 1H, J = 11,2 Hz), 6,11 (d, 1H, J = 11,2 Hz), 6,02-5,92 (m, 1H), 5,34-5,29 (m, 1H), 5,26-5,22 (m, 1H), 5,16-5,13 (m, 1H), 5,02 (br, 1H), 4,50-4,48 (m, 2H), 4,44 (br, 1H), 4,24 (br, 1H), 3,50 (br, 2H), 2,83-2,79 (m, 1H), 2,62-2,59 (m, 1H), 2,38-2,30 (m, 2H), 2,24-1,87 (m, 9H), 1,79-1,76 (m, 3H), 1,52-1,30 (m, 2H), 2,21 (t, 3H, J = 7,2 Hz), 1,09 (s, 9H), 1,02 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 0,68 (s, 3H). ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 100 MHz): \delta 166,88, 159,74, 147,66, 142,72, 134,90, 132,87, 124,99, 120,28, 116,82, 116,36, 111,60, 74,07, 70,69, 66,89, 54,43, 50,03, 45,18, 42,87, 37,17, 35,35, 32,58, 29,70, 29,36, 28,79, 27,81, 26,61, 24,62, 23,63, 21,40, 16,96. IR (película fina) 3353 (br, m), 2926 (s), 1668 (sh, w), 1462 (m), 1365 (m), 1261 (w), 1092 (w), 1048 (br, m), 915 (m), 802 (w), cm^{-1}. HRMS: calculado para C_{32}H_{49}NO_{3}Na^{+} [M+Na]: 518,3604 Obtenido: 518,3572. Datos para I(h) (1\beta,3\alpha) MK-1625 (NOAII)-TB-1 no se obtuvieron debido a cantidad insuficiente del compues-
to.

Compuestos I(i) y I(j): Sustituyendo hidrocloruro de metoxilamina (III, R^{4} = CH_{3}) por hidrocloruro de O-fenlilhi-
droxilamina (III, R^{4} = fenil). El producto de reacción en bruto se purificó por cromatografía en columna eluido con 99% de acetato de etilo en presencia de 1% de trietilamina para dar 11,8 mg de una mezcla de diastereómeros I(i) (1\alpha,3\beta) y I(j) (1\beta,3\alpha) con 83% de rendimiento en una proporción de 1,8:1, respectivamente. Esta mezcla diastereomérica se separó a continuación por HPLC (columna Phenomenex Luna, fase inversa, 3 ml/min) se eluyó con 15% de agua en acetonitrilo para dar 5,3 mg de I(i) (1\alpha,3\beta) y 2,8 mg de I(j) (1\beta,3\alpha) con 37% y 20% de rendimientos, respectivamente. El tiempo de retención para I(i) (1\alpha,3\beta) es de 67,86 min y para I(j) (1\beta,3\alpha) es de 64,85 min. Datos para I(i) (1\alpha,3\beta): [\alpha]^{25}_{D}= +0,31 (c=0,25, CHCl_{3}) ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta 7,30-7,26 (m, 2H), 7,16-7,13 (m, 2H), 6,98-6,94 (m, 1H), 6,37 (d, 1H, J = 11,2 Hz), 6,09 (d, 1H, J = 11,2 Hz), 5,34 (dd, 1H, J = 1,6 Hz, J = 1,6 Hz), 5,31-5,30 (m, 1H), 5,02-5,01 (m, 1H), 4,45-4,44 (m, 1H), 4,24-4,23 (m, 1H), 2,80 (dd, 1H, J = 4 Hz, J =12 Hz), 2,60 (dd, 1H, J = 13,6 Hz, J = 13,6 Hz), 2,37-2,30 (m, 4H), 2,20-2,13 (m, 2H), 2,07-1,87 (m, 3H), 1,78-1,44 (m, 9H), 1,20 (s, 9H), 1,03 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 0,68 (s, 3H). ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 100 MHz): \delta 170,34, 159,75, 159,57, 147,62, 132,89, 129,13, 124,95, 121,36, 120,41, 116,83, 114,33, 111,63, 70,69, 66,88, 58,42, 50,03, 45,17, 42,85, 37,99, 37,13, 35,32, 32,55, 29,34, 28,76, 27,73, 27,03, 24,87, 23,61, 21,42, 17,00. IR (película fina) 3357 (br, m), 2928 (s), 2856 (sh, m), 1590 (s), 1489 (sh, s), 1394 (m), 1219 (br, s), 1158 (w), 1052 (br, m), 1023 (w), 956 (m), 910 (s) cm^{-1}. HRMS: calculado para C_{35}H_{49}NO_{3}Na^{+} [M+Na]: 554,3604 Obtenido: 554,3601.

Datos para I(j) (1\beta,3\alpha): [\alpha]^{25}_{D}= -24,35 (c=0,27, CHCl_{3}) ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta 7,30-7,26 (m, 2H), 7,16-7,13 (m, 2H), 6,98-6,94 (m, 1H), 6,39 (d, 1H, J = 11,2 Hz), 6,08 (d, 1H, J = 11,6 Hz), 5,32-5,30 (m, 2H), 5,01 (d, 1H, J = 1,6 Hz), 4,45 (br, 1H), 4,23-4,21 (m, 1H), 2,81 (dd, 1H, J = 4,4 Hz, J =12 Hz), 2,63 (dd, 1H, J = 3,6 Hz, J = 13,2 Hz), 2,37-2,27 (m, 3H), 2,19-2,13 (m, 2H), 2,06-1,89 (m, 3H), 1,78-1,75 (m, 3H), 1,64-1,44 (m, 7H), 1,20 (s, 9H), 1,04 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 0,68 (s, 3H). ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 100 MHz): \delta 170,34, 159,75, 159,57, 147,08, 142,68, 132,71, 129,13, 124,99, 121,37, 120,41, 116,83, 114,33, 112,82, 71,51, 66,76, 58,41, 50,03, 45,51, 42,77, 37,99, 37,13, 35,30, 32,55, 29,38, 28,74, 27,73, 27,03, 24,86, 23,59, 21,39, 17,02. IR (película fina) 3350 (br, m), 2926 (s), 2850 (m), 1590 (m), 1490 (m), 1220 (br, s), 1158 (w), 1050 (br, m), 910 (s) cm^{-1}. HRMS: calculado para C_{35}H_{49}NO_{3}Na^{+} [M+Na]: 554,3604 Obtenido: 554,3578.

Ejemplo 6 Preparación del compuesto I(k)

Se enfrió a -78°C una solución de 53 mg (0,094 mmoles) de óxido de 19-nor-fosfina VI (R^{1}, R^{2} = OTBDMS, R^{6} =
H) en 2,0 ml de THF anhidro y se trató con 59 \mul (0,094 mmoles, 1,6 M en hexanos) de n-BuLi bajo atmósfera de argón. La mezcla se volvió rojiza oscura y se agitó durante 15 min a -78°C. La solución se añadió gota a gota a una solución preenfriada (-78°C) de 10 mg (0,031 mmoles) de cetona V con anillo C,D (R^{3} = CH_{3}, R^{5} = t-butilo, véase el Ejemplo 2) en 1,5 ml de THF anhidro por cánula. La reacción siguió adelante hasta que el color anaranjado rojizo se decoloreó a amarillo (aproximadamente 2 h). La reacción se enfrió añadiendo 1,0 ml de tampón de pH 7 a -78°C, a continuación se calentó a temperatura ambiente, se extrajo con EtOAc (20 ml x 2), se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO_{4} y se concentró. El residuo se sometió a cromatografía en columna con EtOAc/hexanos (1/15) como eluyente para dar 11 mg (52%) del producto acoplado como aceite incoloro.

El producto acoplado (10 mg, 0,015 mmoles) se disolvió en 1,0 ml de piridina anhidra y a esta solución se añadió hidrocloruro de O-etilhidroxilamina (26 mg, 20 eq.) y tamices moleculares en polvo de 4\ring{A} (10 mg) a temperatura ambiente. La solución de la mezcla se agitó a continuación a temperatura ambiente durante 20 h. Se controló la reacción por TLC. Esta mezcla de reacción se sometió a continuación directamente a cromatografía en columna con EtOAc/hexanos (1/15) como eluyente para dar 10 mg (97%) del producto de la oxima como aceite incoloro.

El producto oxima (8,9 mg, 0,013 mmoles) se disolvió en 2 ml de THF anhidro, y a la solución se añadió 0,19 ml (0,19 mmoles) de una solución 1,0 M de TBAF en THF. La mezcla resultante se agitó durante la noche a temperatura ambiente, a continuación se enfrió con 2 ml de agua. La solución se extrajo con EtOAc (20 ml x 3), se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO_{4} y se concentró. El residuo se sometió a cromatografía en columna con EtOAc como eluyente para dar 5,6 mg (94%) del producto en bruto de (-)- I(k) como aceite incoloro. El producto en bruto (4 mg de cada 5,6 mg) se purificó por HPLC en fase inversa (columna C-18 de semipreparación, 18% de H_{2}O en MeCN, 3 ml/min) para dar 2,5 mg de (-)-I(k) (1\alpha,3\beta, t_{R} = 38,7 min): [\alpha]^{24.}_{D} = -47,2 (c = 0,023, CHCl_{3}). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 6,31 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 5,95 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 5,31 (m, 1H), 4,13 (m, 1H), 4,06 (m, 1H), 3,78 (s, 3H), 2,75-2,81 (m, 2H), 2,49 (dd, J = 13,6, 3,6 Hz, 1H), 2,38 (dd, J = 11,2, 5,6 Hz, 1H), 2,10-2,29 (m, 6H), 1,94-2,06 (m, 2H), 1,36-1,82 (m, 12H), 1,09 (s, 9H), 1,02 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,69 (s, 3H). ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 166,8, 159,9, 142,6, 131,1, 123,8, 120,3, 115,1, 67,4, 67,2, 61,0, 58,4, 49,9, 44,6, 42,2, 37,2, 37,1, 35,3, 32,6, 29,4, 28,6, 27,8, 26,5, 24,6, 23,5, 21,3, 27,1. IR (puro, cm^{-1}) 3355, 2930, 1668 1463, 1364, 1054, 976, 886, 810. HRMS ([M+Na]^{+})
calc. 480,3448, obtenido 480,3427.

Ejemplo 7 Ensayo de la enzima CYP24 (células KPK1A-ras inducidas) (i) Material y reactivos

: 1,25(OH)_{2}D_{3} 10^{-5} M

: [^{3}H]-1,25(OH)_{2}D_{3} 25.000 CPM/\mul

: células HPK1A-ras

: placa de 48 pocillos

: metanol

: diclorometano

: KCl:KCl saturada 30 g, H_{2}O 400 ml

(ii) Procedimiento

1. Inducción de células HPK1A-ras (el día anterior al ensayo)

Cuando las células HPK1A-ras fueron confluentes entre el 80 y el 90%, se añadió 1 \mul de 1,25(OH)_{2}D_{3} 10^{-5} M a 1 ml de medio en la placa (la concentración final es de 10^{-8} M).

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2. Preparación de la suspensión celular

Después de 18 a 20 horas de inducción, se eliminó el medio y se lavaron dos veces las células con PBS. A continuación se tripsinizaron las células en la placa, se centrifugaron (2.000 rpm, 5 min) y se puso en suspensión el sedimento de las células en medio DMEM+1 % de BSA.

Se hizo el recuento de células y se ajustó la densidad de las células a 250.000/150 \mul, se añadieron 150 \mul de suspensión celular a cada pocillo en una placa de 48 pocillos (incluyendo 3 pocillos como referencia sin células, y 3 pocillos de células sin fármaco o inhibidor como referencia).

\vskip1.000000\baselineskip

3. Se añadieron 25 \mul de cetoconazol (concentración final 10^{-5} M, 10^{-6} M, 10^{-7} M, 10^{-8} M) o fármacos en cada pocillo designado. Se mantuvo la placa a 37°C durante 10 min.

4. Preparación del sustrato

Se toma determinada cantidad de medio DMEM+1% de BSA (número de pocillo 25*+200) \mul a un tubo, se añade cierta cantidad de ^{3}H-1,25(OH)_{2}D_{3} (número de pocillo+2) \mul y determinada cantidad de DPPD 100 mM (número de pocillo/5) \mul y se mezcla a continuación por agitación intensa.

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5. Incubación

Se añaden 25 \mul de sustrato a cada pocillo, se incuba la placa a 37°C durante 3 horas.

Se añaden 25 \mul de sustrato para el recuento de la placa (2 pocillos) como recuento total.

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6. Extracción de lípidos y recuento

Se añaden 500 \mul de metano) a cada pocillo para interrumpir la reacción, se transfieren a un tubo.

Se añaden 250 \mul de diclorometano y se agita intensamente.

Se añaden 250 \mul de diclorometano y 250 \mul de KCl saturado y se agita intensamente.

Se centrifuga a 4.000 rpm durante 5 min.

Se transfieren 100 \mul de la fase acuosa (fase superior) a la placa de plástico de recuento. Se añaden 600 \mul de fluido de centelleo a cada pocillo. Se hace el recuento de la placa en el contador de centelleo.

\vskip1.000000\baselineskip

7. Cálculo de la actividad enzimática

La CPM de la referencia celular tras la sustracción de la CPM de NCC es el 100% de actividad enzimática.

Actividad enzimática = (CPM en el pocillo con los compuestos de ensayo - CPM en el pocillo NCC)/(CPM en la referencia celular - CPM en el pocillos NCC) * 100%

\vskip1.000000\baselineskip

Dilución de cetoconazol

\hskip0.55cm Solución madre 10^{-2} M

22

\vskip1.000000\baselineskip

Dilución de los compuestos de la prueba

Solución madre 10^{-3} M

23

(iii) Resultados

Los compuestos de Fórmulas I(a), I(c), I(e), I(g), I(i) y I(k) presentaron significativamente mayor inhibición de CYP24 que el cetoconazol. En la Figura 1A se muestra un gráfico que presenta la inhibición de la actividad de CYP24 por los compuestos I(a) y I(c) (indicados como BH1625(NOH)-TB-2 (CTA062) y BH-1625(NOMe)-TB-2-(CTA065) respectivamente) en comparación con cetoconazol.

(iv) Referencias

Ray S., Ray R., Holick M. Metabolism of ^{3}H-1alpha, 25-dihydroxyvitamin D_{3} in the cultured human keratinocytes (1995) 59:117-122.

Dilworth F. J., Scott I., Green A., Strugnell S., Guo Y. D., Robert E. A., Kremer R., Calverley, M. J., Makin H. L. J., Jones G. Different mechanisms of hydroxylation site selection by liver and kidney cytochrome P450 species (CYP27 and CYP24) involved in Vitamin D metabolism. (1995) J. Biochem 270(28):16766-16774.

Ejemplo 8 Ensayo de CYP1-alfa hidroxilasa (utilizando células COS-1 transfectadas) (A) Transfección transitoria (i) Reactivos y materiales

1.: Células COS-1 (50 a 80% confluentes)

2.: Reactivo de transfección FuGene 6

3.: Vector ADNPc que contiene CYP-lalfahidroxilasa ADNc (1 \mug/\mul)

4.: Medio DMEM + 10% de FCS

5.: Medio DMEM (exento de suero)

6.: Placa de 6 pocillos

(ii) Transfección de la preparación de la mezcla (la cantidad dependía de cuántos pocillos se transfectaban)

1. A un tubo esterilizado, se añadió medio exento de suero (100 \mul por pocillo), a continuación se añadió reactivo FuGene 6 (3 \mul por pocillo). Se golpeó suavemente para mezclar. Se prestó atención al orden. Se añadió reactivo FuGene 6 directamente al medio, no se dejó que el reactivo FuGene 6 no diluido se pusiera en contacto con las superficies de plástico aparte de la punta de la pipeta.

2. Se añadió solución de ADN (1 \mug por pocillo) al reactivo FuGene 6 prediluido de la etapa 2.

3. Se golpeó suavemente el tubo para mezclar el contenido. No se agitó. Se incubó durante 15 min a temperatura ambiente (no más de 45 min).

(iii) Preparación de las células

1. Se tripsinizaron células Cos-1, se centrifugó la suspensión celular, se puso en suspensión el sedimento de células en medio DMEM +10% de FCS.

2. Se diluyó la suspensión celular a 750.000 células/ml (75 células/cuadrícula),

(iv) Transfección

1. Se añadieron 1,7 ml de medio DMEM+10% de FCS a cada pocillo de una placa de 6 pocillos.

2. Se transfirió el volumen correcto de la suspensión celular (200 \mul/pocillo) a la mezcla de transfección. Se mezcló suavemente.

3. Se añaden 0,3 ml de la mezcla a cada pocillo. Se aseguró que se añadió la misma cantidad de células a cada pocillo. Se agitaron intensamente los pocillos para asegurar la dispersión uniforme.

4. Se incubaron las células durante 24 horas a 37°C, 5% de CO_{2} hasta el ensayo de actividad enzimática

(B) Ensayo de actividad enzimática (i) Reactivos y materiales

: Medio DMEM+1% de BSA

: PBS

: [^{3}H-26,27]-25(OH)D_{3}

: DPPD 100 mM

(ii) Procedimiento

1. Se lavaron las células una vez con PBS. Se tuvo cuidado en no alterar las células unidas.

2. Se añadieron 0,55 ml de medio (DMEM+1% de BSA) a cada pocillo.

3. Se añadieron 0,025 ml de medio que contiene los compuestos de ensayo.

4. Se incubaron las células durante 10 minutos.

5. Se añadieron 0,025 ml de medio que contenía [^{3}H-26,27]-25(OH)D_{3} (50.000 CPM) y DPPD (0,6 \mul de solución madre).

6. Se incubaron las células durante 2 horas.

7. Se añadieron 1,5 ml de metanol para interrumpir la reacción.

8. Se añadió patrón interno.

9. Se transfirió el medio al tubo marcado.

10. Se añadieron 0,75 ml de diclorometano, se agitaron intensamente y se mantuvieron a temperatura ambiente durante 15 minutos.

11. Se añadieron 0,75 ml de diclorometano y 0,75 ml de KCl saturado.

12. Se agitó intensamente y se centrifugó.

13. Se eliminó la fase superior y se secó la fase inferior en Speed-Vac.

14. Se añadieron 110 \mul de la fase móvil, se agitaron intensamente y se centrifugaron durante 5 min.

15. Se transfirieron 105 \mul a la inserción en el vial de HPLC.

16. Condiciones del análisis de HPLC:

: Disolvente: hexano/isopropanol/metanol (91/7/2)

: Columna: columna SIL de 3 \mum

: Caudal: 2 ml/min

: Detector: detector de UV y detector radioactivo.

(C) Resultados

Los compuestos de Fórmulas I(a), I(c), I(e), I(g), I(i) y I(k) presentaron poca a ninguna (IC_{50} > 10.000 nM) inhibición de CYP27B1. En la Figura 1B se muestra un gráfico que presenta la inhibición de la actividad de CYP27B1 por los compuestos I(a) y I(c) (indicados como BH1625(NOH)-TB-2 (CTA062) y BH-1625(NOMe)-TB-2-(CTA065) respectivamente) en comparación con cetoconazol.

(D) Referencias

Shink T., Shimada H., Wakino S., Anazawa H., Hayashi M., Saruta T., Deluca H., Suda T. Cloning and expresión of rat 25-hydroxyvitamin D_{3}-1-alpha-hidroxylase cDNA. (1997) Pro. Natl. Acad. Sci. 94:12920-12925.

Muralidharan K. R., Rowland-goldsmith M., Lee S. A., Park G., Norman A. W., Henry H. L., Okamura W. H. Inhibitors of 25-hydroxyvitamin D_{3}-1alpha-hydroxylase: Thiavitamin D analogues and biological evaluation. (1997) J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 62(1):73-78.

\global\parskip0.930000\baselineskip

Ejemplo 9 Ensayo de la enzima CYP27A1 (A) Procedimiento

Tal como se describe en:

Dilworth F. J., Black S. M., Guo Y. D., Miller W. L., Jones G. Construction of a P450c27 fusion enzyme: a useful tool for analysis of vitamin D_{3}25-hydroxylase (1996) Biochem. J. 320:267-271.

Sawada N., Sakaki T., Ohta M., Inouye K. Metabolism of vitamin D (3) by human CYP27A1 (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 273(3):977-84.

(B) Resultados

Los compuestos de Fórmulas I(a), I(c), I(e), I(g), I(i) y I(k) presentaron poca a ninguna (IC_{50} > 10.000 nM) inhibición de CYP27A1. En la Figura 1C se muestra un gráfico que presenta la inhibición de la actividad de CYP27A1 por los compuestos I(a) y I(c) (indicados como BH1625(NOH)-TB-2 (CTA062) y BH-1625(NOMe)-TB-2-(CTA065) respectivamente) en comparación con cetoconazol.

Ejemplo 10 Ensayo de unión de VDR (A) Reactivas y materiales

1. \hskip0.15cm9,3 pmol/\mul de VDR (humano, recombinante, Biomol).

2. \hskip0.15cm[^{3}H]-1,25(OH)_{2}D_{3} en etanol

3. \hskip0.15cm1,25(OH)_{2}D_{3} en etanol

4. \hskip0.15cmTEK_{300}

\hskip0.5cmTris-HCl: 50 mM

\hskip0.5cmEDTA: 1,5 mM

\hskip0.5cmKCl: 300 mM

\hskip0.5cmSe ajustó el pH a 7,4 (25°C)

5. \hskip0.15cmTEDK_{300}

\hskip0.5cmTEK_{300}

\hskip0.5cmDTT (ditiotreitol): 10 mM (PM 154,24)

6. \hskip0.15cmTampón Tris

\hskip0.5cm22,50 g de Tris-HCl

\hskip0.5cm500 ml de H_{2}O

\hskip0.5cm13,25 g de Tris-base

\hskip0.5cm500 ml de H_{2}O

\hskip0.5cmSe mantuvo a 4°C

7. \hskip0.15cmDextrano-T70 (peso molecular 70.000) Pharmacia

8. \hskip0.15cmCarbón vegetal (carbón decolorante neutro, Norit) Fishery

9. \hskip0.15cmGelatina (G-2625 Sigma)

\global\parskip1.000000\baselineskip

(B) Preparación de reactivos

1. \hskip0.15cmSolución de dextrano con carbón vegetal

\hskip0.5cm(1) \hskip0.15cmTampón Tris

\hskip1.15cmSe mezcló una cantidad igual de Tris-HCl y Tris-base.

(2) \hskip0.15cmCarbón vegetal neutro decolorante de Norit: 2,0 g

\hskip0.65cmTampón Tris: 150 ml

\hskip1.15cmSe agitó

(3) \hskip0.15cmDextrano T-70: 0,2 g

\hskip0.65cmTampón Tris: 50 ml.

\hskip0.5cm(4) \hskip0.15cmSe añadió gota a gota lentamente el dextrano en suspensión en la solución en carbón vegetal con agitación.

\hskip1.15cmSe mantuvo en el refrigerador durante la noche.

\hskip1.15cmTreinta minutos antes de su utilización se almacenó en hielo con agitación continua

2. \hskip0.15cmTEK_{300}/solución de gelatina

\hskip0.5cm50 mg de gelatina de cerdo

\hskip0.5cm5 ml de solución de TEDK_{300}

\hskip0.5cmse calentó, se agitó y a continuación se enfrió a 4°C.

\hskip0.5cm5 ml de solución de TEDK_{300}

3. \hskip0.15cmPreparación de 1,25(OH)_{2}D_{3} y de los compuestos de ensayo en etanol

\hskip0.5cm1,25(OH)_{2}D_{3}: 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000 pg/25 \mul (solución madre 10-5 M/25 \mul = 100.000 pg/25 \mul)

\quad: Compuestos de ensayo: 12.500, 25.000, 50.000, 100.000, 200.000 y 400.000 pg/25 \mul. (4\times10-5 M/25 \mul = 400.000 pg/25 \mul)

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

4. \hskip0.15cmDilución de VDR:

\hskip0.5cm1 \mul de solución madre de VDR en 2,5 ml de TEDK_{300}/solución de gelatina (500 \mul/tubo), (mantenida en hielo)

(C) Ensayo

25

(D) Cálculos

Se calcula la cantidad de 1,25(OH)_{2}D_{3} para desplazar el 50% de [^{3}H]-1,25(OH)_{2}D_{3} de VDR como B_{50} para 1,25(OH)_{2}D_{3}. Se calcula la unión por VDR de otros compuestos como B_{50} en comparación con un valor de 1 para 1,25 (OH)_{2}D_{3}.

Dilución de 1,25(OH)D_{3}

26

Dilución de los compuestos de ensayo

27

(E) Resultados

En la Figura 2 se presenta un gráfico que muestra la unión de los compuestos I(a) y I(c), (indicada como BH-1625(NOH)-TB-2 (CTA62) y BH-1625(NOMe)-TB-2-(CTA65) respectivamente) para transportar la proteína D (DBP) en comparación con 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} y 25-hidroxi vitamina D_{3}.

(F) Referencias

1. Ross T. K., Prahl J. M., DeLuka H. Overproduction of rat 1,25-dihydroxyvitamin D_{3} receptor in insect cells using the baculovirus expression system. (1991) Proc. Natl Acd Sci USA 88:6555-6559.

2. Wecksler W. R., Norman A. W. An hydroxylapatite batch assay for the quantitation of 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D_{3}-receptor complexes (1979) Anal. Biochem. 92:314-323.

\global\parskip0.950000\baselineskip

Ejemplo 11 Ensayo de actividad de transcripción (A) Reactivos y materiales

El pSG5-hVDR1/3 de los Drs. Mark Haussler y Kerr Whitfield, (University of Arizona, Tucson, AZ); ADN de hVDR1/3 se insertó en la secuencia EcoRI del vector pSG5 (CT4)^{4}TKGH de los Drs. Mark Haussler y Kerr Whitfield, (University of Arizona, Tucson, AZ); cuatro copias de la VDRE de osteocalcina de rata sintética CT4 se ligaron y se hibridaron en el vector pTKGH que tiene un activador de timidina ligado al gen GH humano.

: Kit hGH de ELISA. Boehringer Mannheim

: Reactivo de transfección FuGene 6

: Células COS-1

: Medio DMEM y medio DMEM+10% de FCS

: 1,25(OH)_{2}D_{3} y compuestos de ensayo

(B) Transfección

1.: Se subcultivaron células COS en placa de 24 pocillos (5.000 células/pocillo) un día antes de la transfección.

2.: Preparación de la mezcla (la cantidad dependía del número de pocillos transfectados)

(1): A un tubo esterilizado, se añadió medio exento de suero (100 \mul por pocillo), a continuación se añadió reactivo FuGene 6 (0,6 \mul por pocillo). Se golpeó suavemente para mezclar. Se prestó atención al orden. Se añadió reactivo FuGene 6 directamente al medio, no se dejó que el reactivo FuGene 6 no diluido se pusiera en contacto con las superficies de plástico aparte de la punta de la pipeta.

(2): Se añadió solución de ADN (vectores pSG5-hVDR1/3 y (CT4)^{4}TKGH) (0,1 \mug cada uno por pocillo) al reactivo FuGene 6 prediluido de la etapa 2

(3): Se golpeó suavemente el tubo para mezclar el contenido. No se agitó. Se incubó durante 15 min a temperatura ambiente (no más de 45 min).

3.: Se eliminó el medio y se sustituyó por 0,4 ml de medio reciente

4.: Se añadieron 100 \mul de la mezcla a cada pocillo en forma de gotas.

(C) Tratamiento de células transfectadas con diferentes concentraciones de 1,25(OH)_{2}D_{3} y compuestos de ensayo

30 min a 1 hora después de la transfección, se añadieron 1,25(OH)_{2}D_{3} (como referencia) y compuestos de ensayos al medio en 20 \mul de medio. El intervalo de concentración para 1,25(OH)_{2}D_{3} fue 10^{-10} a 10^{-8} M (10^{-10}, 3x10^{-9}, 10^{-9}, 3x10^{-8}, 10^{-8} M) Y para los compuestos de la prueba fue desde 3x10^{-9} M hasta 10^{-7} M (3x10^{-9}, 10^{-9}, 3x10^{-8}, 10^{-8}, 3x10^{-8}, 10^{-7} M). La incubación continuó durante 24 horas.

(D) Medición del contenido de GH en el medio

Después de 24 horas de incubación, se utilizaron 200 \mul de alícuotas diluidas de medio (dilución de 20 a 50 veces) para la determinación del GH humano. Se analizó la muestra según la instrucción del kit hGH de ELISA.

(E) Resultados

En la Figura 3 se presenta un gráfico que muestra la actividad de los compuestos I(a) y I(c), (indicada como BH-1625(NOH)-TB-2 (CTA62) y BH-1625(NOMe)-TB-2-(CTA65) respectivamente) en el ensayo de transcripción de la vitamina D en comparación con 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3}.

(F) Referencias

Hashimoto Y., Ikeda I., Ikeda M., Takahashi Y., Hosaka M., Uchida H., Kono N., Fukui H., Makino T., Honjo M. Construccion of a specific and sensitive sándwich enzyme immunoassay for 20 KD human growth hormone (1998) J. Immunol. Methods 221:77-85.

Jone G., Byford V., Makin H. L. J., Kremer R., Rice R. H., deGraffenried L. A., Knutson J. C., Bishop C. W. Anti-proliferative activity and target cell catabolism of the vitamin D analogue 1alpha, 24(OH)2D2 in normal and immortalized human epidermal cells (1996) Biochem. Pharmacol. 52:133-140.

Ejemplo 12 Ensayo de fijación de DBP (plasma humano) (A) Reactivos

1. \hskip0.15cmTampón Tris:

\hskip0.5cm22,50 g Tris-HCl

\hskip0.5cm500 ml de H_{2}O

2. \hskip0.15cm13,25 g de Tris-base

\hskip0.5cm500 ml de H_{2}O

\hskip0.5cmMantenido a 4°C

3. \hskip0.15cmDextrano-T70 (peso molecular 70.000) Pharmacia

4. \hskip0.15cmCarbón vegetal (carbón decolorante neutro, Norit) Fishery

5. \hskip0.15cmDBP (proteína de unión de la vitamina D) (plasma humano)

6. \hskip0.15cm[^{3}H] 25(OH)D_{3}

7. \hskip0.15cmGelatina (G-2625 Sigma)

(B) Preparación de reactivos

1. \hskip0.15cmTampón tris

\hskip0.5cmVolumen igual mezclado de dos tampones Tris.

2. \hskip0.15cmSolución de carbón vegetal recubierta con dextrano

\hskip0.5cm(1) \hskip0.15cmpreparación de la solución de carbón vegetal

\hskip0.65cmCarbón vegetal neutro decolorante Noria: 2,0 g

\hskip0.65cmTampón Tris: 150 ml

\hskip1.15cmAgitación

\hskip0.5cm(2) \hskip0.15cmpreparación de la solución de dextrano

\hskip0.65cmDextrano T-70: 0,2 g

\hskip0.65cmTampón Tris: 50 ml

\hskip0.5cm(3) \hskip0.15cmPreparación de la solución de carbón vegetal recubierta con dextrano

\hskip1.15cmSe añadió gota a gota lentamente la solución de dextrano en la solución de carbón activo con agitación.

\hskip1.15cmSe mantuvo en el frigorífico toda la noche.

\hskip1.15cmTreinta minutos antes de su utilización, se mantuvo en hielo con mezcla continua.

\hskip1.15cmEsta solución se mantuvo a 4°C durante 2 meses.

3. \hskip0.15cmTampón Tris/solución de gelatina

\hskip0.5cm250 mg de gelatina de cerdo

\hskip0.5cm50 ml de tampón Tris

\hskip0.5cmse calentó, se agitó y se enfrió en hielo.

\hskip0.5cmSe preparó justo antes de su utilización.

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4. \hskip0.15cmSolución DBP

\hskip0.5cmSe diluyó plasma humano a 1:5.000 con tampón Tris/solución de gelatina

5. \hskip0.15cmDilución de patrón 25(OH)D_{3}

\hskip0.5cm10.000 pg de solución madre/50 \mul

\hskip0.5cmSe diluyó a 0, 62,5, 125, 250, 500, 750, 1.000, 10.000 pg/50 \mul con etanol

6. \hskip0.15cmDilución de patrón 1,25(OH)_{2}D_{3}

\hskip0.5cm200.000 pg de solución madre/50 \mul (10^{-5} M/50 \mul)

\hskip0.5cmSe diluyó a 6.250, 12.500, 25.000, 50.000, 100.000, 200.000 \mug/50 \mul con etanol

7. \hskip0.15cmDilución de compuestos de la prueba

\hskip0.5cm200.000 pg de solución madre/50 \mul (10^{-3} M)

\hskip0.5cmSe diluyó a 12.500, 25.000, 50.000, 100.000, 200.000 y 400.000 \mug/50 \mul con etanol

8. \hskip0.15cmSolución de [^{3}H-26,27]-25(OH)_{2}D_{3}

\hskip0.5cmLa solución madre se diluyó en tampón Tris, 20.000 CPM/50 \mul.

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(Tabla pasa a página siguiente)

28

(D) Cálculos

Se calcula la cantidad de 25(OH)D_{3} para desplazar el 50 por ciento de [^{3}H]-25(OH)D_{3} como B_{50} para la unión DBP a 25(OH)D_{3}. Se calcula la unión de otros compuestos como B_{50} en comparación con un valor de 1 para 25(OH)D_{3}.

(E) Dilución de 25(OH)D_{3}

29

(F) Dilución de 1,25(OH)D_{3}

30

(G) Dilución de los compuestos de ensayo

31

(H) Resultados

En la Figura 4 se presenta un gráfico que muestra la actividad de los compuestos I(a) y I(c), (indicada como BH-1625(NOH)-TB-2 (CTA62) y BH-1625(NOMe)-TB-2-(CTA65) respectivamente) en el ensayo de unión del receptor de vitamina D (VDR) en comparación con 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3}.

(I) Referencias

Bouillon R., van Baelen H., Moor P. D. Comparative study of the affinity of the serum vitamin D -binding protein. (1980) J. Steroid Biochem. 13:1029-44.

Jones L., Byrnes B., Palma F., Segev D., Mazur E. Displacement potency of vitamin D_{2} analogue in competitive protein-binding assay for 25-hydroxyvitamin D_{3}, 24,25-dihydroxyvitamin D_{3} and 1,25-dihydroxyvitamin D_{3} (1980) J. Clin. Endocrinol. Metab. 50:773-775.

Ejemplo 13 Proliferación de queratinocitos

Se analizó in vitro con los compuestos de Fórmula I(a) y I(c) la actividad antiproliferante en queratinocitos murinos utilizando un protocolo normalizado (Posner, G. H. et al. J. Med. Chem. 1992, 35, 3280-3287). En la Figura 5 se muestra un gráfico que presenta los efectos de la respuesta a la dosis de los compuestos I(a) y I(c) sobre la proliferación de queratinocitos en comparación con 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} o calcitriol.

Ejemplo 14 Excreción de calcio

Como medición de su seguridad en animales, se administró el compuesto de Fórmula I(a) por vía oral a ratas a diario durante 1 semana a una dosis similar (0,5 microgramos/kg de peso corporal) a la de calcitriol, utilizando un procedimiento descrito anteriormente (Posner G. H. et al. J. Med. Chem. 1999, 42, 3425-3435). En la Figura 6 se muestra un gráfico que presenta el efecto del compuesto I(a) (indicado como BH 1625(NOH)) sobre las concentraciones de calcio en orina de rata en comparación con calcitriol (1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3}).

Aunque la presente invención se ha descrito haciendo referencia a lo que se considera actualmente que son los ejemplos preferidos, debe entenderse que la invención no se limita a los ejemplos expuestos. Por el contrario, la invención se pretende que comprenda varias modificaciones y disposiciones equivalentes incluidas dentro del espíritu y del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente se incorporan a la presente memoria como referencia en su totalidad en la misma medida que si cada publicación, patente o solicitud de patente individual fuese específica e individualmente indicada para ser incorporada como referencia en su totalidad.

Claims

1. Compuesto de Fórmula I, y sus sales, hidratos, solvatos y profármacos farmacéuticamente aceptables:

32

en la que

R^{3} es alquilo C_{1-6};

R^{4} se selecciona de entre el grupo constituido por H, alquilo C_{1-6}, arilo y heteroarilo, estando el alquilo C_{1-6} insustituido o sustituido con 1 a 4 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, halo, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4} y N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}), y estando el arilo y el heteroarilo insustituidos o sustituidos con 1 a 5 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, CF_{3}, OCF_{3}, halo, SH, S-alquilo C_{1-4}, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4}, N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}), CN, C(O)OH, C(O)O-alquilo C_{1-4}, C(O)NH-alquilo C_{1-4}, NHC(O)-alquilo C_{1-4}, OC(O)-alquilo C_{1-4}, SO-alquilo C_{1-4}, SO_{2}-alquilo C_{1-4}, SO_{2}NH-alquilo C_{1-4} y SO_{2}NH_{2};

R^{5} se selecciona de entre el grupo constituido por alquilo C_{1-6}, cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), arilo y heteroarilo, arilalquilo C_{1-6} y heteroaril-alquilo C_{1-6}, estando el alquilo C_{1-6} insustituido o sustituido con 1 a 4 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, halo, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4} y N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}, y estando el cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), el arilo, el heteroarilo, el aril-alquilo C_{1-6} y el heteroaril-alquilo C_{1-6} insustituidos o sustituidos con 1 a 5 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, CF_{3}, OCF_{3}, halo, SH, S-alquilo C_{1-4}, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4}, N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}), CN, C(O)OH, C(O)O-alquilo C_{1-4}, C(O)NH-alquilo C_{1-4}, NHC(O)-alquilo C_{1-4}, OC(O)-alquilo C_{1-4}, SO-alquilo C_{1-4}, SO_{2}-alquilo C_{1-4}, SO_{2}NH-alquilo C_{1-4} y SO_{2}NH_{2}; y

R^{6} son ambos H o juntos forman =CH_{2}.

2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente de entre el grupo constituido por OH, OCH_{3} y fluoro.

3. Compuesto según la reivindicación 2, en el que R^{1} y R^{2} son ambos OH.

4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que R^{3} es CH_{3}.

5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que R^{4} se selecciona de entre el grupo constituido por H, fenilo y alquilo C_{1-4}.

6. Compuesto según la reivindicación 5, en el que R^{4} se selecciona de entre el grupo constituido por H, fenilo, alilo y CH_{3}.

7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que R^{5} se selecciona de entre el grupo constituido por isopropilo, s-butilo, t-butilo y neopentilo.

8. Compuesto según la reivindicación 7, en el que R^{5} es t-butilo.

9. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la geometría acerca del doble enlace C=N de la oxima es trans.

10. Compuesto según la reivindicación 1, en el que ambos R^{6} son H.

11. Compuesto según la reivindicación 1, que presenta una estereoquímica relativa como se muestra a continuación:

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33

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12. Compuesto según la reivindicación 1, que es seleccionado de entre el grupo constituido por:

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34

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39

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13. Compuesto según la reivindicación 11, que es seleccionado de entre el grupo constituido por el compuesto
I(a), I(c), I(e), I(g), I(i) e I(k).

14. Compuestos de Fórmula II, y sus sales, hidratos y solvatos del mismo:

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en la que

PG es un grupo protector;

R^{3} es alquilo C_{1-6};

R^{5} se selecciona de entre el grupo constituido por alquilo C_{1-6}, cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), arilo y heteroarilo, arilalquilo C_{1-6} y heteroarilo-alquilo C_{1-6}, estando el alquilo C_{1-6} insustituido o sustituido con 1 a 4 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, halo, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4} y N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}), y estando el cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), el arilo, el heteroarilo, el aril-alquilo C_{1-6} y el heteroaril-alquilo C_{1-6} insustituidos o sustituidos con 1 a 5 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, CF_{3}, OCF_{3}, halo, SH, S-alquilo C_{1-4}, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4}, N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}), CN, C(O)OH, C(O)O-alquilo C_{1-4}, C(O)NH-alquilo C_{1-4}, NHC(O)-alquilo C_{1-4}, OC(O)-alquilo C_{1-4}, SO-alquilo C_{1-4}, SO_{2}-alquilo C_{1-4}, SO_{2}NH-alquilo C_{1-4} y SO_{2}NH_{2}; y

R^{6} son ambos H o juntos forman =CH_{2}.

15. Compuesto según la reivindicación 14, en el que R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente de entre el grupo constituido por OH y OPG.

16. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 15, en el que R^{4} es alquilo C_{1-4}.

17. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que R^{5} se selecciona de entre el grupo constituido por isopropilo, s-butilo, t-butilo y neopentilo.

18. Compuesto según la reivindicación 14, seleccionado de entre el grupo constituido por:

41

42

19. Composición farmacéutica que comprende un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y un portador farmacéuticamente aceptable.

20. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para preparar un medicamento destinado a tratar enfermedades que se aprovechan de una modulación de las concentraciones de la 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3}.

21. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para preparar un medicamento destinado a tratar enfermedades que se aprovechan de una inhibición del catabolismo de la 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3}.

22. Utilización según la reivindicación 20 ó 21, en el que la enfermedad se selecciona de entre el grupo constituido por cáncer, trastornos dermatológicos y trastornos óseos.

23. Utilización según las reivindicaciones 20 a 21, en el que la enfermedad se selecciona de entre el grupo constituido por hiperparatiroidismo, hipoparatiroidismo, seudohipoparatiroidismo, hiperparatiroidismo secundario, diabetes, carcinoma medular, soriasis, cicatrización de heridas, sarcoidosis, tuberculosis, nefropatía crónica, VDRR hipofosfatémica, raquitismo dependiente de vitamina D, tratamiento anticonvulsionante, fibrogénesis ósea imperfecta, osteítis fibrosa quística, osteomalacia, osteoporosis, osteopenia, osteosclerosis, osteodistrofia renal, raquitismo, antagonismo glucocorticoide, hipercalcemia idiopática, síndrome de malabsorción, esteatorrea y esprue tropical.

24. Utilización según la reivindicación 22, en el que la enfermedad se selecciona de entre el grupo constituido por cáncer, soriasis y osteoporosis.

25. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para preparar un medicamento destinado a tratar la proliferación celular.

26. Utilización según la reivindicación 25, en el que la célula es una célula cancerosa.

27. Utilización según la reivindicación 26, en el que el cáncer se selecciona de entre cáncer de mama, cáncer de pulmón y cáncer de próstata.

28. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para preparar un medicamento destinado a inhibir la actividad de CYP24.

29. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para preparar un medicamento destinado a aumentar la eficacia del agonista del receptor de la vitamina D.

30. Utilización según la reivindicación 29, en la que el agonista del receptor de la vitamina D es la 1\alpha,25-dihidroxi vitamina D_{3} (calcitriol).

31. Procedimiento para preparar un compuesto de Fórmula I que comprende hacer reaccionar un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, con un compuesto de Fórmula III, o una sal, hidrato o solvato del mismo;

(III)NH_{2}-OR^{4}

en la que R^{4} se selecciona de entre el grupo constituido por H, alquilo C_{1-6}, arilo y heteroarilo, estando el alquilo C_{1-6} insustituido o sustituido con 1 a 4 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, halo, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4} y N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}), y estando el arilo y el heteroarilo insustituidos o sustituidos con 1 a 5 grupos independientemente seleccionados de entre alquilo C_{1-4}, O-alquilo C_{1-4}, OH, CF_{3}, OCF_{3}, halo, SH, S-alquilo C_{1-4}, NH_{2}, NH-alquilo C_{1-4}, N(alquilo C_{1-4})(alquilo C_{1-4}), CN, C(O)OH, C(O)O-alquilo C_{1-4}, C(O)NH-alquilo C_{1-4}, NHC(O)-alquilo C_{1-4}, OC(O)-alquilo C_{1-4}, SO-alquilo C_{1-4}, SO_{2}-alquilo C_{1-4}, SO_{2}NH-alquilo C_{1-4} y SO_{2}NH_{2}, en presencia de una amina no nucleófila, y la eliminación de cualquier grupo protector, si está presente.

32. Procedimiento según la reivindicación 31, en el que la amina es la piridina.