PT1436257E - Análogos oxima de calcemia baixa de 1-alfa, 25-di-hidroxivitamina d3 - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "ANÁLOGOS OXIMA DE CALCEMIA BAIXA DE 1-ALFA,25-DI-HIDROXIVITAMINA D3"

Esta invenção foi realizada com o financiamento do governo através da Bolsa NIH Número CA 44530. O governo tem determinados direitos na invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a novos análogos da hormona la,25-di-hidroxivitamina D3 que apresentam inibição selectiva da enzima CYP24 e que são de calcemia baixa e antiproliferativos, a composições farmacêuticas e de diagnóstico contendo-os e à sua utilização médica, de um modo particular, no tratamento e/ou prevenção do cancro, distúrbios dermatológicos, distúrbios ósseos, distúrbios da tiróide, cicatrização de lesões e osteoporose.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A via metabólica da vitamina D é parte de um sistema endócrino vital que é altamente regulado em certas fases e produz metabolitos que controlam a secreção das hormonas da glândula parótida (Beckman, M. e DeLuca, H. (1997) Methods in Enzymol. 282, 200-223; Jones, G., Strugnell, S., e DeLuca, H. (1998) Physio. Rev. 78, 1193-1231). A la,25-di-hidroxivitamina 1 D3, também conhecida por calcitriol (ver abaixo), uma hormona produzida na via da vitamina D, regula os níveis de fosfato e cálcio no sangue que, por sua vez, controlam a massa óssea, o estado dos ossos e afectam a diferenciação celular na pele e sistema imunitário (Armbrecht, H. J., Okuda, K., Wongsurawat, N., Nemani, R., Chen, M. e Boltz, M. (1992) J; Steroid Biochem. Molec. Biol. 43, 1073-1081) . Na via da vitamina D, os citocromos P450 são enzimas que introduzem grupos funcionais por hidroxilação, normalmente, nas posições 1, 25 e 24 da vitamina D3 (Beckman, M. e DeLuca, H. (1997) Methods in Enzymol. 282, 200-223) .

A la,25-di-hidroxivitamina D3 é convertida em la,24,25-tri-hidroxi-D3 por um P450 mitocondrial conhecido como CYP24 (Bell, N.H., (1998) J. Bone Miner. Res. 13, 350-35211). A CYP24 é induzida por la, 25-di-hidroxi-D3 e encontra-se no rim, bem como em outros tecidos alvo da vitamina D, tais como as células paratiroidais, queratinócitos, osteoblastos e enterócitos (Jones, G., Strugnell, S. e DeLuca, H. (1998) Physiol. Rev. 78, 1193-1231). A la,25-di-hidroxivitamina D3 (1,25-D3) tem uma função importante nos efeitos reguladores antiproliferativos e do crescimento nas células neoplásicas e normais (para e. g., células do cancro da próstata). A utilização clínica de análogos (1,25—D3) como fármacos eficazes que requerem actividades de pró- 2 diferenciação e antiproliferativas. Existe uma necessidade continua de análogos sintéticos de la,25-di-hidroxivitamina D3 que exibam, selectivamente, actividades farmacológicas desejáveis mas que não exibam hipercalcemia ou outras actividades indesejáveis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Foram preparados os novos análogos 16-eno-25-oxima e éter de 16-eno-25-oxima de la,25-di-hidroxivitamina D3 que apresentam uma inibição selectiva da enzima CYP24, actividade anti-proliferativa e são de calcemia baixa.

Deste modo, a presente invenção proporciona compostos de Fórmula I e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, hidratos, solvatos e pró-fármacos:

em que R1 e R2 são seleccionados, independentemente, do grupo consistindo de OH, OalquiloCi-6 e halo; 3 R3 é alquiloCi-6; R4 é seleccionado do grupo consistindo de H, alquiloCi-6, arilo e heteroarilo, com o alquiloCi-6 sendo não substituído ou substituído com 1-4 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, halo, NH2, NHalquiloCi-4 e N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) e com 0 arilo e o heteroarilo sendo não substituídos ou substituídos com 1-5 grupos, seleccionados independentemente de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, CF3, OCF3, halo, SH, SalquiloCi-4, NH2, NHalquiloCi-4, N (alquiloCi-4) (alquiloCi-4) , CN, C(0)0H, C (0) OalquilCi-4, C (0) NHalquiloCi-4, NHC (0) alquiloCi-4, OC (0) alquiloCi-4, S0alquiloCi-4, S02alquiloCi-4, S02NHalquiloCi-4 e S02NH2; R5 é seleccionado do grupo consistindo de alquiloCi-6, cicloalquilo (C3—Ce) , arilo, heteroarilo, arilalquiloCi-6 e heteroarilalquiloCi-6, com o alquiloCi-6 sendo não substituído ou substituído com 1-4 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, halo, NH2, NHalquiloCi-4 e N (alquili-4) (alquiloCi-4) e com cicloalquilo (C3-C6), arilo, heteroarilo, arilalquiloCi-6 e heteroarilalquiloCi-6, sendo não substituído ou substituído com 1-5 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, CF3, 0CF3, halo, SH, SalquiloCi-4, NH2, NHalquiloCi-4, N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) , CN, C (0) OH, C (0) OalquiloCi-4, C (0) NHalquiloCi-4, NHC (0) alquiloCi-4, OC (0) alquiloCi-4, S0alquiloCi-4, S02alquiloCi-4, S02NHalquiloCi-4 e S02NH2; e Rê são ambos H ou, em conjunto, formam =CH2.

De um modo preferido, os compostos da invenção possuem a estereoquímica de la,25-di-hidroxivitamina D3 natural. Por isso, 4 numa forma de realização preferida, a presente invenção proporciona compostos de Fórmula I e seus sais, solvatos, hidratos e pró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis, como apresentado abaixo:

em que í^-R6 são como definido abaixo.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, é proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo um composto de Fórmula I e um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

Ao modular, de um modo selectivo, a CYP24, a enzima que metaboliza a la,25-di-hidroxivitamina D3, os niveis de la,25-di-hidroxivitamina D3 são também modulados. As doenças que beneficiam de uma modulação dos niveis de la,25-di-hidroxivitamina D3 podem, deste modo, ser tratadas utilizando um modulador da CYP24. Ao actuar, preferencialmente, na CYP24, os efeitos secundários causados por interacção como 5 outras enzimas e receptores irá ser reduzido. Consequentemente, a presente invenção proporciona um método para o tratamento de doenças que beneficiam de uma modulação dos níveis de la,25-di-hidroxivitamina D3, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula I a uma célula ou animal, com essa necessidade. A invenção inclui, também, a utilização de um composto de Fórmula I para modular os níveis de la, 25-di-hidroxivitamina D3. Além disso, a invenção inclui a utilização de um composto de Fórmula I para preparar um medicamento para modular os níveis de la,25-di-hidroxivitamina D3. A inibição da CYP24 inibe o catabolismo de la, 25-di-hidroxivitamina D3 que irá prolongar o tempo de vida biológico desta hormona permitindo, assim, que sejam utilizadas quantidades mais pequenas desta para o tratamento eficaz da doença. Tal dose mais pequena irá evitar ou, pelo menos, minimizar, a toxicidade hipercalcémica associada com a utilização médica de la,25-di-hidroxivitamina D3 (calcitriol) . Deste modo, numa forma de realização, a presente invenção proporciona um método para tratar doenças que beneficiam da inibição do catabolismo de la,25-di-hidroxivitamina D3, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula I, a uma célula ou animal com essa necessidade. A invenção inclui também a utilização de um composto de Fórmula I para inibir o catabolismo de la,25-di-hidroxivitamina D3. Além disso, a invenção inclui a utilização de um composto de Fórmula I para preparar um medicamento para inibir o catabolismo de la,25-di-hidroxivitamina D3. 6

As doenças que podem beneficiar de uma modulação nos níveis de la,25-di-hidroxivitamina D3 incluem, mas não estão limitadas a: (i) na paratiróide - hiper e hipoparatiroidismo, Pseudo-hipoparatiroidismo, Hiperparatiroidismo secundário; (ii) no pâncreas - diabetes; (iii) na tiróide - carcinoma medular; (iv) na pele - psoríase, cicatrização de lesões; (v) no pulmão - sarcoidose e tuberculose; (vi) no rim - doença renal crónica, VDRR hipofosfatémico, raquitismo dependente de vitamina D; (vii) no osso - tratamento anticonvulsivo, fibrogénese óssea imperfeita, osteíte fibrosa cística, osteomalacia, osteoporose, osteopenia, osteosclerose, osteodistrofia renal, raquitismo; (viii) no intestino - antagonismo glucocorticóide, hipercalcemia idiopática, síndrome de malabsorçâo, esteatorreia, psilose tropical.

Os compostos de Fórmula I ou seus sais, solvatos, hidratos ou pró-fármacos, podem ser utilizados isoladamente ou em combinação com outros agentes que modulam a actividade da CYP24 ou em combinação com outros tipos de tratamento (que podem modular ou não modular a CYP24) para distúrbios de proliferação 7 celular ou outros distúrbios que beneficiam de uma modulação nos níveis de la,25-di-hidroxivitamina D3 e/ou uma inibição do catabolismo de la,25-di-hidroxivitamina D3. De um modo preferido, os compostos de Fórmula I são administrados em combinação com la,25-di-hidroxivitamina D3 (calcitriol) ou outros agonistas do receptor da vitamina D. Por isso, a presente invenção proporciona um método de aumentar a eficácia de um agonista do receptor da vitamina D, de um modo preferido, la, 25-di-hidroxivitamina D3 (calcitriol), compreendendo a co-administração de uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula I e uma quantidade eficaz do agonista do receptor da vitamina D, de um modo preferido, la, 25-di-hidroxivitamina D3 (calcitriol) . Além disso, a invenção inclui uma utilização de um composto de Fórmula I para aumentar a eficácia de um agonista do receptor da vitamina D, de um modo preferido, la, 25-di-hidroxivitamina D3 (calcitriol) e uma utilização de um composto de Fórmula I para preparar um medicamento para aumentar a eficácia de um agonista do receptor da vitamina D, de um modo preferido la, 25-di-hidroxivitamina D3 (calcitriol).

De acordo com outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método para modular a proliferação celular, de um modo preferido, a inibição da proliferação celular, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula I, a uma célula ou animal, com essa necessidade. A invenção inclui também a utilização de um composto de Fórmula I para modular a proliferação celular, de um modo preferido, para inibir a proliferação celular. A invenção inclui também uma utilização de um composto de Fórmula I para preparar um medicamento para modular a proliferação celular, de um modo preferido, inibir a proliferação celular.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um método de inibição da proliferação de uma célula cancerígena, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula I, a uma célula ou animal com essa necessidade. A invenção inclui também uma utilização de um composto de Fórmula I para inibir a proliferação de células cancerígenas. A invenção inclui também uma utilização de um composto Fórmula I para preparar um medicamento para inibir a proliferação de células cancerígenas.

Noutro aspecto, a invenção proporciona um método de modular a actividade da CYP24, numa célula ou animal, por administração de uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula I. Num aspecto adicional, a invenção proporciona um método de modulação da actividade da CYP24, de um modo preferido, a inibição da actividade da CYP24 por administração de uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula I,a uma célula ou animal, com essa necessidade. A presente invenção proporciona também uma utilização de um composto de Fórmula I para modular, de um modo preferido, para inibir a actividade da CYP24. A presente invenção proporciona também uma utilização de um composto de Fórmula I para preparar um medicamento para modular a actividade da CYP24, de um modo preferido, para inibir a actividade da CYP24. É evidente que a inibição do crescimento celular pelos compostos da invenção pode ser afectada por outros mecanismos. A presente invenção proporciona também novos compostos úteis na preparação dos compostos de Fórmula I. Deste modo, a presente invenção proporciona também compostos de Fórmula II e seus sais, hidratos e solvatos: 9

em que R1 e R2 são seleccionados, independentemente, do grupo consistindo de OH, OalquiloCi-6, OPG e halo; PG é um grupo de protecção; R3 é alquiloCi-6; R5 é seleccionado do grupo consistindo de alquiloCi-6, cicloalquilo (C3-C6) , arilo, heteroarilo, arilalquiloCi-6 e heteroarilalquiloCi-6, com o alquiloCi-ê sendo não substituído ou substituído com 1-4 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, halo, NH2, NHalquiloCi-4 e N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) e com cicloalquilo (C3-C6) , arilo, heteroarilo, arilalquiloCi-6 e heteroarilalquiloCi_6, sendo não substituídos ou substituídos com 1-5 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, CF3, OCF3, halo, SH, SalquiloCi-4, NH2, NHalquiloCi-4, N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) , CN, C(0)0H, C (0) OalquiloCi-4, C (0) NHalquiloCi-4, NHC (0) alquiloCi-4, OC (0) alquiloCi-4, S0alquiloCi-4, S02alquiloCi-4, S02NHalquiloCi-4 e S02NH2; e 10 R6 são ambos H ou em conjunto formam =0¾.

Além disso, a presente invenção proporciona um método para preparar um composto de Fórmula I compreendendo fazer reagir um composto de Fórmula II ou um seu sal, hidrato ou solvato, com um composto de Fórmula III ou um seu sal, hidrato ou solvato: NH2-OR4 III, em que R4 é seleccionado do grupo consistindo de H, alquiloCi-6, arilo e heteroarilo, com o alquiloCi-6 sendo não substituído ou substituído com 1-4 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, halo, NH2, NHalquiloCi_4 e N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) e com o arilo e o heteroarilo sendo não substituídos ou substituídos com 1-5 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, CF3, 0CF3, halo, SH, SalquiloCi-4, NH2, NHalquiloCi-4, N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) , CN, C(0)0H, C (0) 0alquiloCi-4, C (0) NHalquiloCi-4, NHC (0) alquiloCi-4, 0C (0) alquiloCi-4, S0alquiloCi-4, S02alquiloCi-4, S02NHalquiloCi-4 e S02NH2, na presença de amina não nucleofílica, seguida por remoção de quaisquer grupos de protecção, se presentes.

Outras características e vantagens da presente invenção tornar-se-ão evidentes a partir da descrição detalhada que se segue. No entanto, deverá ser entendido que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indicando formas de realização preferidas da invenção, são apresentados apenas como modo de ilustração, uma vez que as várias alterações e modificações dentro do contexto e âmbito da invenção serão 11 evidentes para os especialistas na técnica a partir desta descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A invenção irá agora ser descrita em relação aos desenhos, nos quais: A Figura IA é um gráfico que apresenta a inibição da actividade da CYP24 pelos compostos I (a) e I (c) (indicados como BH1625(NOH)-TB-2 (CTA062) e BH-1625(NOMe)-TB-2-(CTA065), respectivamente) em comparação com cetoconazole. A Figura 1B é um gráfico que apresenta a inibição da actividade da CYP27B1 pelos compostos I (a) e I(c) (indicados como BH1625(NOH)-TB-2 (CTA062) e BH-1625(NOMe)-TB-2-(CTA065), respectivamente), em comparação com cetoconazole. A Figura 1C um gráfico que apresenta a inibição da actividade da CYP27A1 pelos compostos I(a) e I (c) (indicados como BH1625(NOH)-TB-2 (CTA062) e BH-1625(NOMe)-TB-2-(CTA065), respectivamente), em comparação com cetoconazole. A Figura 2 um gráfico que apresenta a ligação dos compostos I (a) e I(c), (indicados como BH-1625(NOH)-TB-2 (CTA62) e BH-1625(NOMe)-TB-2-(CTA65), respectivamente) para transportar a proteina D (DBP), em comparação com la,25-di-hidroxivitamina D3 e 25-hidroxivitamina D3. A Figura 3 é um gráfico que apresenta a actividade dos compostos I(a) e I(c) (indicados como BH1625 (NOH)-TB-2 (CTA62) e 12 BH-1625(NOMe)-TB-2-(CTA65), respectivamente) no ensaio de transcrição da vitamina D em comparação com la,25-di-hidroxivitamina D3. A Figura 4 um gráfico que apresenta a inibição dos compostos I(a) e I (c) (indicados como BH-1625(NOH)-TB-2 (CTA62) e BH-1625(NOMe)-TB-2-(CTA65), respectivamente) no ensaio de ligação do receptor da vitamina D (VDR), em comparação com la,25-di-hidroxivitamina D3. A Figura 5 é um gráfico que apresenta os efeitos de resposta à dose dos compostos I(a) e I(c) na proliferação dos queratinócitos em comparação com la, 25-di-hidroxivitamina D3 ou calcitriol. A Figura 6 é um gráfico que apresenta o efeito dos compostos I(a) e I (c) (indicado como BH1625(NOH)) nos níveis de cálcio na urina de rato em comparação com calcitriol (la,25-Di-hidroxivitamina D3) . DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Definições 0 termo "alquiloCi-6", como aqui utilizado, significa radicais alquilo, saturados ou insaturados, de cadeia linear e/ou ramificada, contendo de um a seis átomos de carbono e inclui metilo, etilo, propilo, isopropilo, s-butilo, t-butilo, neopentilo, vinilo, alilo, butenilo e semelhantes. 13 0 termo "alcoxiloCi-6", como aqui utilizado, significa radicais alcoxilo, saturados ou insaturados, de cadeia linear e/ou ramificada, contendo de um a seis átomos de carbono e inclui metoxilo, etoxilo, propioxilo, isopropiloxilo, t-butoxilo e semelhantes. 0 termo "cicloalquilo (C3-C6) ", como aqui utilizado, significa radicais alquilo cíclicos não aromáticos, saturados ou insaturados, contendo de três a seis átomos de carbono e inclui ciclopropilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, ciclopentenilo, ciclo-hexenilo e semelhantes. 0 termo "alquiloCi-4", como aqui utilizado, significa radicais alquilo, saturados ou insaturados, de cadeia linear e/ou ramificada, contendo de um a quatro átomos de carbono e inclui metilo, etilo, propilo, isopropilo, s-butilo, t-butilo e semelhantes. 0 termo "alcoxiloCi-4", como aqui utilizado, significa radicais alcoxilo, saturados ou insaturados, de cadeia linear e/ou ramificada, contendo de um a quatro átomos de carbono e inclui metoxilo, etoxilo, propioxilo, isopropiloxilo, t-butoxilo e semelhantes. 0 termo "arilo", como aqui utilizado, significa radicais aromáticos mono ou bicíclicos, não substituídos ou substituídos, contendo de 6 a 10 átomos de carbono e inclui fenilo e naftilo e semelhantes. O termo "heteroarilo", como aqui utilizado, significa radicais heteroaromáticos mono ou bicíclicos, não substituídos ou substituídos, contendo de 5 a 10 átomos, dos quais 1-3 átomos 14 podem ser um heteroátomo seleccionado do grupo consistindo de S, 0 e N e inclui furanilo, tienilo, pirrolo, piridilo, indolo, benzofuranilo e semelhantes. 0 termo "arilalquiloCi_6", como aqui utilizado, significa radicais aromáticos, mono ou biciclicos, não substituídos ou substituídos, contendo de 6 a 10 átomos de carbono ligados aos compostos da invenção via radicais alquileno ramificados ou não ramificados, contendo de 1-6 átomos de carbono, sendo os radicais alquileno saturados ou insaturados e não substituídos ou substituídos com 1-4 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, halo, NH2, NHalquiloCi-4 e N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) e inclui Ph-C(CH3)2-, naftilmetilo, benzilo e semelhantes. 0 termo "heteroarilalquiloCi-g", como aqui utilizado, significa radicais heteroaromáticos, mono ou biciclicos, não substituídos ou substituídos contendo de 5 a 10 átomos, dos quais 1-3 átomos podem ser um heteroátomo seleccionado do grupo consistindo de S, O e N ligado aos compostos da invenção via radicais alquileno ramificados ou não ramificados contendo de 1-6 átomos de carbono, sendo os radicais alquileno saturados ou insaturados e não substituídos ou substituídos com 1-4 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi_4, OalquiloCi-4, OH, halo, NH2, NHalquiloCi-4 e N (alquilCi-4) (alquiloCi_4) e inclui tienil-CH2-, piridil-CH2-, indolo-CH2- e semelhantes. O termo "halo", como aqui utilizado, significa halogéneo e inclui cloro, fluoro, bromo, iodo e semelhantes. O termo "solvato", como aqui utilizado, significa um composto da invenção ou um sal de um composto da invenção, em 15 que as moléculas de um solvente adequado são incorporadas na estrutura de cristal. Um solvente adequado é fisiologicamente tolerável à dosagem administrada. Exemplos de solventes adequados são etanol, água e semelhantes. Quando o solvente é a água, a molécula é referida como um "hidrato". 0 termo "composto(s) da invenção", como aqui utilizado, significa composto (s) das Fórmulas I e II e seus sais, hidratos, solvatos e pró-fármacos. 0 termo "sal farmaceuticamente aceitável", significa um sal de adição de ácido ou um sal de adição de base que é adequado para ou compatível com o tratamento de doentes. 0 termo "sal de adição de ácidos farmaceuticamente aceitável", como aqui utilizado, significa qualquer sal orgânico ou inorgânico não tóxico de qualquer composto base da invenção ou qualquer dos seus intermediários. Os compostos básicos da invenção que podem formar um sal de adição de ácido incluem, por exemplo, aqueles onde o grupo arilo, heteroarilo e/ou alquiloCi-6 de R4 e/ou R5 é substituído com um grupo contendo um azoto básico, por exemplo, NH2 e NHalquiloCi-4. Os ácidos inorgânicos ilustrativos que formam sais adequados incluemm ácidos clorídrico, bromídrico, sulfúrico e fosfórico, bem como sais metálicos tais como mono-hidrogénoortofosfato de sódio e hidrogenossulfato de potássio. Os ácido orgânicos ilustrativos que formam sais adequados incluem, ácidos mono-, di- e tricarboxílicos, tais como ácido glicólico, láctico, pirúvico, malónico, succínico, glutárico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, maleico, benzóico, fenilacético, cinâmico e salicílico, bem como ácidos sulfónicos, tais como ácidos p-toluenossulfónico e metanossulfónico. Podem ser formados quer 16 os sais de mono ou di-ácidos e tais sais podem existir quer numa forma hidratada, solvatada ou substancialmente anidra. No geral, os sais de adição de ácidos dos compostos da invenção são mais solúveis em água e vários solventes orgânicos hidrofilicos e, geralmente, demonstram, pontos de fusão mais elevados em comparação com as suas formas de base livre. A selecção do sal apropriado irá ser conhecida para o especialista na técnica. Podem ser utilizados outros sais de adição de ácido não farmaceuticamente aceitáveis, e. g., oxalatos, por exemplo, no isolamento dos compostos da invenção, para utilização laboratorial ou para conversão subsequente num sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável. 0 termo "sal de adição de base farmaceuticamente aceitável", como aqui utilizado, significa qualquer sal de adição de base orgânico ou inorgânico não tóxico de qualquer composto ácido da invenção ou qualquer dos seus intermediários. Os compostos acidicos da invenção que podem formar um sal de adição de base incluem, por exemplo, aqueles onde o arilo e/ou heteroarilo é substituído com um grupo contendo hidrogénio acídico, por exemplo, C(0)0H. As bases inorgânicas ilustrativas que formam sais adequados incluem hidróxido de lítio, sódio, potássio, cálcio, magnésio ou bário. As bases orgânicas ilustrativas que formam sais adequados incluem, aminas orgânicas alifáticas, aliciclicas ou aromáticas, tais como metilamina, trimetilamina e picolina ou amónia. A selecção do sal apropriado será conhecida para um especialista na técnica. Podem ser utilizados outros sais de adição de base não farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, no isolamento dos compostos da invenção, para utilização laboratorial ou para conversão subsequente num sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável. 17 0 termo uma "quantidade eficaz" ou uma "quantidade suficiente" de um agente, como aqui utilizado, é a quantidade suficiente para produzir os resultados desejados ou benéficos, incluindo resultados clínicos e, como tal, uma "quantidade eficaz" depende do contexto no qual está a ser aplicada. Por exemplo, no contexto da administração de um agente que modula a actividade da CYP24, uma quantidade eficaz de um agente é, por exemplo, uma quantidade suficiente para atingir tal modulação na actividade da CYP24, quando comparada com a resposta obtida sem a administração do agente.

Como aqui utilizado e como bem entendido na técnica, "tratamento" é uma abordagem para obter os resultados desejados ou benéficos, incluindo resultados clínicos. Os resultados clínicos benéficos ou desejados podem incluir, mas não estão limitados a, alivio ou melhoria de um ou mais sintomas ou patologias, diminuição da extensão da doença, patologia da doença estabilizada (í. e. sem agravamento), prevenção da disseminação da doença, atraso ou abrandamento da progressão da doença, melhoria ou paliação do estado da doença e remissão (quer parcial ou total), quer detectável ou indetectável. "Tratamento" pode significar também prolongar a sobrevivência quando comparado com a sobrevivência esperada caso não receba o tratamento. "Paliação" de uma doença ou distúrbio, significa que a extensão e/ou manifestações clínicas indesejáveis de um distúrbio ou um estado de doença são atenuados e/ou o período de progressão é atrasado ou prolongado, quando comparado com o não tratamento do distúrbio. 18 0 termo "modulação", como aqui utilizado, inclui a inibição ou supressão de uma função ou actividade (tal como actividade de CYP24), bem como a potenciação de uma função ou actividade. "Inibir" ou "suprimir" ou "reduzir" uma função ou actividade, tal como a actividade da CYP24, é reduzir a função ou actividade quando comparada às, de outro modo, mesmas condições excepto para uma condição ou parâmetro de interesse ou, alternativamente, quando comparado com outras condições. 0 termo "animal", como aqui utilizado, inclui todos os membros do reino animal, incluindo humano. 0 animal é, de um modo preferido, um humano. 0 termo "célula", como aqui utilizado, inclui uma multiplicidade de células. Administrar um composto a uma célula inclui, tratamento in vivo, ex vivo e in vitro. 0 termo "células cancerígenas", como aqui utilizado, inclui todas as formas de cancro ou doença neoplástica. 0 termo "catabolismo" , como aqui utilizado, refere-se ao processo metabólico pelo qual os organismos convertem substâncias em compostos para excreção. 0 termo "la,3p-estereoquímica", como aqui utilizado, refere-se à configuração relativa dos grupos, R1 e R2, na qual R2 está acima do plano da página e o R1 está abaixo do plano da página. 0 termo "1β, 3a-estereoquímica", como aqui utilizado, refere-se à configuração relativa dos grupos, R1 e R2, na qual R1 está acima do plano da página e, o R2 está abaixo do plano da página. 19 II. Compostos da Invenção

Foram preparados novos compostos que apresentaram inibição selectiva da enzima CYP24, actividade antiproliferativa e que são de calcemia baixa. Como tal, os compostos da invenção são úteis para o tratamento de doenças de proliferação celular, tais como cancro.

Consequentemente, a presente invenção proporciona compostos de Fórmula I e seus sais, hidratos, solvatos e pró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis:

em que R1 e R2 são seleccionados, independentemente, do grupo consistindo de OH, OalquiloCi-6 e halo; R3 é alquiloCi-6; R4 é seleccionado do grupo consistindo de H, alquiloCi-6, arilo e heteroarilo, com o alquiloCi-6 sendo não substituído ou substituído com 1-4 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, halo, NH2, NHalquiloCi-4 e 20 N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) e com arilo e heteroarilo sendo não substituídos ou substituídos com 1-5 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, CF3, OCF3, halo, SH, SalquiloCi-4, NH2, NHalquiloCi-4, N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) , CN, C(0)0H, C (0) OalquiloCi-4, C (0) NHalquiloCi-4, NHC (0) alquiloCi-4, OC (0) alquiloCi-4, SOalquiloCi-4, S02alquiloCi-4, S02NHalquiloCi-4 e S02NH2; R5 é seleccionado do grupo consistindo de alquiloCi-6, cicloalquilo (C3-C6) , arilo, heteroarilo, arilalquiloCi_6 e heteroarilalquiloCi-6, com 0 alquiloCi-6 sendo não substituído ou substituído com 1-4 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, halo, NH2, NHalquiloCi-4 e N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) e com cicloalquilo (C3-C6) , arilo, heteroarilo, arilalquiloCi-6 e heteroarilalquiloCi-6, sendo não substituídos ou substituídos com 1-5 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, CF3, 0CF3, halo, SH, SalquiloCi-4, NH2, NHalquiloCi-4, N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) , CN, C(0)0H, C (0) OalquiloCi-4, C (0) NHalquiloCi-4, NHC (0) alquiloCi-4, OC (0) alquiloCi-4, SOalquiloCi-4, S02alquiloCi-4, S02NHalquiloCi-4 e SO2NH2; e R6 são ambos H ou em conjunto formam =CH2.

Os compostos de Fórmula I incluem aqueles nos quais R1 e R2 são seleccionados, independentemente, do grupo consistindo de OH, OalquiloCi-6 e halo. Em formas de realização da invenção, R1 e R2, são seleccionados, independentemente, do grupo consistindo de OH, 0CH3 e fluoro. Noutra forma de realização, R1 e R2 são ambos OH. 21 A presente invenção inclui também compostos de Fórmula I, em que R3 é alquiloCi-6. Numa forma de realização da invenção, R3 é alquiloCi-4. Noutras formas de realização, R3 is CH3. A presente invenção inclui compostos de Fórmula I em que R4 é seleccionado do grupo consistindo de H, alquiloCi-6, arilo e heteroarilo, com o alquiloCi-6 sendo não substituído ou substituído com 1-4 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, halo, NH2, NHalquiloCi-4 e N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) e com arilo e heteroarilo sendo não substituído ou substituído com 1-5 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, CF3, OCF3, halo, SH, SalquiloCi-4, NH2, NHalquiloCi-4, N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) , CN, C(0)0H, C (0) OalquiloCi-4, C (0) NHalquiloCi-4, NHC (0) alquiloCi-4, OC (0) alquiloCi-4, S0alquiloCi-4, S02alquiloCi-4, S02NHalquiloCi_4 e SO2NH2. Em formas de realização da invenção, R4 é seleccionado do grupo consistindo de H, alquiloCi-4 e fenilo, com o alquiloCi-4 sendo não substituído ou substituído com 1-2 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, halo, NH2, NHalquiloCi-4 e N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) e com fenilo sendo não substituído ou substituído com 1-3 grupos seleccionados independentemente de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, CF3, 0CF3, halo, SH, SalquiloCi-4, NH2, NHalquiloCi-4, N (alquilCi-4) (alquiloCi-4), CN, C (0) OH, C (0) OalquiloCi-4, C (0) NHalquiloCi-4, NHC (0) alquiloCi-4, OC (0) alquiloCi-4, SOalquiloCi-4, S02alquiloCi-4, S02NHalquiloCi-4 e S02NH2. Noutras formas de realização, R4 é seleccionado do grupo consistindo de H, fenilo e alquiloCi-4. Ainda noutras formas de realização, R4 é seleccionado do grupo consistindo de H, fenilo, alilo e CH3. 22 A presente invenção inclui compostos de Fórmula I em que R5 é seleccionado do grupo consistindo de alquiloCi-6, cicloalquilo (C3-C6), arilo e heteroarilo, aril-alquiloCi-6 e heteroaril-alquiloCi-6, com o alquiloCi-6 sendo não substituído ou substituído com 1-4 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, halo, NH2, NHalquiloCi_4 e N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) e com cicloalquilo (C3-C6), arilo, heteroarilo, aril-alquiloCi-6 e heteroaril-alquiloCi-6, sendo não substituídos ou substituídos com 1-5 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, CF3, OCF3, halo, SH, SalquiloCi-4, NH2, NHalquiloCi-4, N (alquilCi-4) (alquiloC1-4) , CN, C(0)0H, C (0) OalquiloCi-4, C (0) NHalquiloCi-4, NHC (0) alquiloCi-4, OC (0) alquiloCi-4, S0alquiloCi-4, S02alquiloCi-4, S02NHalquiloCi_4 e S02NH2. Em formas de realização da invenção, R5 é seleccionado do grupo consistindo de alquiloCi-4, fenilo e fenilalquiloCi-4 com o alquiloCi-4 sendo não substituído ou substituído com 1-2 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, 0alquiloCi-4, OH, halo, NH2, NHalquiloCi-4 e N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) e com fenilo e fenilalquiloCi-6 sendo não substituídos ou substituídos com 1-3 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, CF3, 0CF3, halo, SH, SalquiloCi-4, NH2, NHalquiloCi-4, N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) , CN, C(0)0H, C (0) OalquiloCi-4, C (0) NHalquiloCi-4, NHC (0) alquiloCi-4, OC (0) alquiloCi-4, SOalquiloCi-4, S02alquiloCi-4, S02NHalquiloCi-4 e S02NH2. Noutras formas de realização, R5 é seleccionado do grupo consistindo de alquiloCi-4, fenilo e fenil-alquiloCi-4, com o alquiloCi-4 sendo não substituído ou substituído com 1-2 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-2, OalquiloCi-2, OH, halo, NH2, NHalquiloCi-2 e N (alquilCi-2) (alquiloCi-2) e com fenilo e fenilalquiloCi-4 sendo não substituídos ou substituídos com 1-3 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, 23

OalquiloCi-4, OH, CF3, OCF3, halo, NH2, NHalquiloCi-4, N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) e CN. Ainda noutras formas de realização, R5 é seleccionado de isopropilo, s-butilo, t-butilo, neopentilo. A presente invenção inclui também compostos de Fórmula I, em que R6 são ambos H ou em conjunto formam =(¾. Em formas de realização da invenção, R6 são ambos H.

Todos os compostos de Fórmula I possuem mais de um centro assimétrico. Onde os compostos de acordo com a invenção possuem mais de um centro assimétrico, podem existir como diastereómeros. É para ser entendido que todos estes isómeros e suas misturas, em qualquer proporção, estão englobados no âmbito da presente invenção. Além disso, a invenção engloba todos os isómeros geométricos da presente invenção. Por exemplo, onde existe uma ligação dupla num composto da invenção, podem existir isómeros geométricos, tais como isómeros cis e trans (também conhecidos como Z e E) . A estereoquímica dos compostos da invenção é, de um modo preferido, a da la,25-di-hidroxivitamina D3 natural. Por isso, numa forma de realização preferida, a presente invenção proporciona compostos de Fórmula I com a estereoquímica relativa como apresentado abaixo e seus sais, hidratos, solvatos e pró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis: 24

em que í^-R6 são como definido previamente. É para ser entendido que enquanto a estereoquimica relativa dos compostos de Fórmula I é, de um modo preferido, como apresentado acima, tais compostos de Fórmula I podem conter também certas quantidades (e. g., menos de 20%, de um modo preferido, menos de 10%, de um modo mais preferido, menos de 5%) dos compostos de Fórmula I com estereoquimica alternada. Por exemplo, um composto de Fórmula I com estereoquimica 1α,3β da la,25-Di-hidroxiVitamina D3 natural, apresentada acima, pode conter menos de 20%, de um modo preferido, menos de 10%, de um modo mais preferido, menos de 5%, de um composto de Fórmula I com a estereoquimica 1α,3β não natural.

Nas formas de realização preferidas da presente invenção, os compostos da invenção incluem: 25

26

e seus sais, hidratos, solvatos e pró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis. Os compostos preferidos da invenção incluem os 27 compostos I(a), I (c), I (e), I (g), I (i) e I(k) como apresentado acima e seus sais, hidratos, solvatos e pró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis. A presente invenção proporciona também novos compostos úteis na preparação dos compostos de Fórmula I. Por isso, a presente invenção proporciona também compostos de Fórmula II e seus sais, hidratos e solvatos:

em que R1 e R2 são seleccionados, independentemente, do grupo consistindo de OH, OalquiloCi-6, OPG e halo ; PG é um grupo de protecção; R3 é alquilo Ci-6; R5 é seleccionado do grupo consistindo de alquiloCi_6, cicloalquilo (C3-C6) , arilo e heteroarilo, arilalquiloCi_6 e heteroarilalquiloCi-6, com o alquiloCi-6 sendo não substituído ou substituído com 1-4 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, halo, NH2, NHalquiloCi-4 e 28 N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) e com cicloalquilo (C3-C6) , arilo, heteroarilo, arilalquiloCi-6 e heteroari-alquiloCi-6 sendo não substituídos ou substituídos com 1-5 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, CF3, OCF3, halo, SH, SalquiloCi-4, NH2, NHalquiloCi-4, N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) , CN, C(0)0H, C (0) OalquiloCi-4, C (0) NHalquiloCi-4, NHC (0) alquiloCi-4, OC (0) alquiloCi-4, SOalquiloCi-4, S02alquiloCi-4, S02NHalquiloCi-4 e S02NH2; e R6 são ambos H ou em conjunto formam =CH2.

Os compostos de Fórmula II incluem aqueles nos quais R1 e R2 são seleccionados, independentemente, do grupo consistindo de OH, OalquiloCi-6, OPG e halo. Nas formas de realização da invenção, R1 e R2 são seleccionados, independentemente, do grupo consistindo de OH, 0CH3, OPG e fluoro. Noutra forma de realização, R1 e R2 são ambos OH ou OPG. Além disso, pretende-se que PG inclua qualquer grupo de protecção que proteja os grupos OH livres de R1 e/ou R2 nos compostos de Fórmula I de reacções secundárias não desejada durante a conversão dos compostos de Fórmula II em compostos de Fórmula I e que possam ser removidos sob condições que não provoquem reacções secundárias não desejadas com outros grupos funcionais na molécula. Os grupos de protecção adequados, incluem grupos trialquilsililo, tais como t-butildimetilsililo. A presente invenção inclui também compostos de Fórmula II, em que R3 é alquiloCi-6. Nas formas de realização da invenção, R3 é alquiloCi-4. Noutras formas de realização, R3 é CH3. A presente invenção inclui também compostos de Fórmula II, em que R5 é seleccionado do grupo consistindo de alquiloCi_6, 29 cicloalquilo (C3-C6), arilo e heteroarilo, arilalquiloCi-6 e heteroarilalquiloCi-6, com o alquiloCi-6 sendo não substituído ou substituído com 1-4 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, halo, NH2, NHalquiloCi-4 e N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) e com cicloalquilo (03-0δ) , arilo, heteroarilo, arilalquiloCi-6 e heteroarilalquiloCi-6, sendo não substituídos ou substituídos com 1-5 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, CF3, 0CF3, halo, SH, SalquiloCi-4, NH2, NHalquiloCi-4, N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) , CN, C(0)0H, C (0) 0alquiloCi-4, C (0) NHalquiloCi-4, NHC (0) alquiloCi-4, OC (0) alquiloCi-4, S0alquiloCi-4, S02alquiloCi-4, S02NHalquiloCi-4 e S02NH2. Nas formas de realização da invenção, R5 é seleccionado do grupo consistindo de alquiloCi-4, fenilo e fenilalquiloCi-4, com o alquiloCi-4 sendo não substituído ou substituído com 1-2 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, halo, NH2, NHalquiloCi-4 e N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) e com fenilo e fenil-alquiloCi-6 sendo não substituídos ou substituídos com 1-3 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, CF3, 0CF3, halo, NH2, NHalquiloCi-4, N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) , CN, C(0)0H, C (0) OalquiloCi-4, C (0) NHalquiloCi-4, NHC (0) alquiloCi-4, SOalquiloCi-4, S02alquiloCi-4, S02NHalquiloCi-4 e S02NH2. Noutras formas de realização, R5 é seleccionado do grupo consistindo de alquiloCi-4, fenilo e fenilalquiloCi-4, com o alquiloCi-4 sendo não substituído ou substituído com 1-2 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-2, OalquiloCi-2, OH, halo, NH2, NHalquiloCi-2 e N (alquilCi-2) (alquiloCi-2) e com fenil e fenilalquiloCi-4 sendo não substituídos ou substituídos com 1-3 grupo seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, CF3, 0CF3, halo, NH2, NHalquiloCi-4, N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) e CN. Ainda noutras formas de 30 realização, R5 é seleccionado de isopropilo, s-butilo, t-butilo, neopentilo. A presente invenção inclui também compostos de Fórmula I, em que R6 são mbos H ou, em conjunto, formam =CH2. Em formas de realização da invenção, R6 são ambos H.

Em formas de realização especificas da invenção, os compostos de Fórmula II incluem:

e seus sais, hidratos e solvatos. Os compostos preferidos de Fórmula II são os compostos II (a) e II (c), como apresentado acima e seus sais, hidratos e solvatos. 31 II. Métodos de Preparação dos Compostos da Invenção

De acordo com outro aspecto da presente invenção, os compostos da presente invenção podem ser preparados por processos análogos aos estabelecidos na técnica. Por isso, os compostos desta invenção podem ser preparados, por exemplo, pela sequência reaccional apresentada no Esquema 1:

Esquema 1

Deste modo, os compostos de Fórmula I, podem ser preparados por reacção dos compostos de Fórmula II, em que B}-R3, R5 e R6 são como definido na Fórmula II, com reagentes de Fórmula III, em que R4 é como definido na Fórmula I, de um modo preferido, na presença de uma amina não nucleofilica, a temperaturas na gama de cerca de 0 °C até cerca de 40 °C, de um modo adequado, à temperatura ambiente, seguido por remoção de quaisquer grupos de protecção (se presentes) . A amina não nucleofilica pode ser qualquer amina alifática ou aromática terciária, por exemplo, piridina e está, de um modo preferido, presente em quantidades 32 em excesso. Quando a piridina é a amina não nucleofílica é também utilizada, de um modo preferido, como um solvente para a transformação dos compostos de Fórmula II em compostos de Fórmula I. Este passo de instalação da oxima efectua-se sem destruir a unidade trieno conjugada sensível ao ácido dos compostos de Fórmula II e indica que tal passo de oximação será útil na preparação de uma biblioteca de novos e diversos análogos de éter de 25-oxima. 0 éter de alquilo de E-oxima da Fórmula I é obtido, predominantemente, devido à congestão estérica fortemente desfavorável que estará presente no éter de alquilo de Z-oxima correspondente (ver Hawkes, G.E. e Herwig, K.; Roberts, J.D. JOrg. Chem. 1974, 39, 1017-1028).

Consequentemente, a presente invenção proporciona um método para preparar um composto de Fórmula I, compreendendo a reacção de um composto de Fórmula II ou um seu sal, hidrato ou solvato:

em que R1 e R2 são seleccionados, independentemente, do grupo consistindo de OH, OalquiloCi-6, OPG e halo; PG é um grupo de protecção; 33 R3 é alquiloCi-s; R5 é seleccionado do grupo consistindo de alquiloCi-6, cicloalquilo (C3-C6) , arilo e heteroarilo, arilalquiloCi-6 e heteroarilalquiloCi-6, com o alquiloCi_6 sendo não substituído ou substituído com 1-4 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, halo, NH2, NHalquiloCi-4 e N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) e com cicloalquilo (C3—C6) , arilo, heteroarilo, arilalquiloCi-6 e heteroarilalquiloCi-6 sendo não substituídos ou substituídos com 1-5 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, CF3, OCF3, halo, SH, SalquiloCi-4, NH2, NHalquiloCi-4, N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) , CN, C(0)0H, C (0) OalquiloCi-4, C (0) NHalquiloCi-4, NHC (0) alquiloCi-4, OC (0) alquiloCi_4, SOalquiloCi-4, S02alquiloCi-4, S02NHalquiloCi-4 e S02NH2; e R6 são ambos H ou, em conjunto ,formam =CH2, com um composto de Fórmula III ou um seu sal, hidrato ou solvato: NH2-OR4 III, em que R4 é seleccionado do grupo consistindo de H, alquiloCi-6, arilo e heteroarilo, com alquiloCi_6 sendo não substituído ou substituído com 1-4 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, halo, NH2, NHalquiloCi-4 e N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) e com o arilo e o heteroarilo sendo não substituídos ou substituídos com 1-5 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi_4, OalquiloCi_4, OH, CF3, 0CF3, 34 halo, SH, SalquiloCi-4, NH2, NHalquiloCi-4, N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) , CN, C(0)0H, C (O) OalquiloCi-4, C (O)NHalquiloCi-4, NHC (O) alquiloCi-4, OC (0) alquiloCi-4, SOalquiloCi-4, S02alquiloCi-4, S02NHalquiloCi-4 e S02NH2, na presença de amina não nucleofílica, seguida por remoção de quaisquer grupos de protecção, se presentes.

As cetonas de Fórmula II, em que R3-R3, R5 e R6 são como definido na Fórmula I, podem ser preparadas, por exemplo, como apresentado no Esquema 2:

Esquema 2

As cetonas de Fórmula V, em que R3 e R5 são como definido na Fórmula I, podem ser mono-olefinadas quimioespecificamente no C-8 (devido ao bloqueio estérico no C-25) com óxidos de fosfina de Fórmula VI, em que R1, R2 e R6 são como definido na Fórmula I, sob condições de ligação de Horner-Wadsworth-Emmons (HWE) convencionais (ver Posner, G. H. et al. J Org. Chem. 1997, 62, 3299-3314). Deste modo, os óxidos de fosfina VI são tratados com uma base forte, por exemplo, um alquil-litio, tal como fenil-lítio, sob condições anidras numa atmosfera inerte e solvente, 35 por exemplo, tetra-hidrofurano (THF), a temperaturas na gama de cerca de -60 °C até cerca de -90 °C, de um modo adequado, a cerca de -78 °C. Ao intermediário ilido resultante, é adicionada uma solução fria de cetona V, de um modo preferido, a cerca de -78 °C, num solvente inerte, tal como THF, mantendo as condições anidras. Após remoção de quaisquer grupos de protecção utilizando técnicas de quimica convencional (se necessário), podem ser obtidos os compostos de Fórmula II.

As cetonas de Fórmula V, em que R3 e R5 são como definido na Fórmula I, podem ser preparadas, por exemplo, como apresentado no Esquema 3:

Esquema 3

PGO

VII

Os compostos adequadamente protegidos de Fórmula VII, em que R3 e R5 são como definido na Fórmula I e PG é um grupo de protecção adequado, são primeiro desprotegidos e depois oxidados para proporcionar as cetonas V. Por exemplo, quando o PG é um trialquilsililo, tal como trietilsililo, a desprotecção pode ser efectuada por reacção dos compostos de Fórmula VII com fluoreto de tetrabutilamónio (TBAF) num solvente inerte, tal como THF e numa atmosfera inerte, de um modo adequado, à temperatura ambiente. A oxidação do álcool resultante pode ser efectuada, 36 por exemplo, utilizando 4-metilmorfolina-N-óxido (NMO) ou qualquer outro aqente de oxidação adequado, num solvente inerte, tal como o cloreto de metileno, sob condições convencionais.

Os compostos de Fórmula VII, em que R3 e R5 são como definido na Fórmula I e PG é um grupo de protecção adequado, podem ser obtidos, por exemplo, como apresentado no Esquema 4:

Esquema 4

PGO

vn ΥΠΙ

Os compostos de Fórmula VIII, em que R3 é como definido na Fórmula I e PG é um grupo de protecção adequado, podem ser feitos reagir com o anião dos compostos de Fórmula IX, em que R5 é como definido na Fórmula I, sob condições anidras, a temperaturas na gama de cerca de -60 °C até cerca de -90 °C, de um modo adequando, a cerca de -78 °C. Os aniões dos compostos de Fórmula IX podem ser preparados por tratamento dos compostos de IX com uma base forte, por exemplo, um alquil-litio, tal como n-butil-lítio ou diisopropilamina de litio (LDA), sob condições inertes e, na presença de hexametilfosforamida (HMPA), por exemplo ou Ni,N,N1,N1-tetrametietilenodiamina (TMEDA).

Os compostos de Fórmula IX, em que R5 é como definido na Fórmula I, estão quer disponíveis comercialmente ou podem ser 37 preparados, por exemplo, por oxidação dos álcoois correspondentes, como apresentado no esquema 5:

Esquema 5

HO oxidação -►

R R5

IX

Os exemplos de agentes de oxidação incluem dicromato de piridio (PDC), ácido m-cloroperbenzóico (mCPBA) e dióxido de manganésio. A preparação dos compostos de Fórmula VIII, em que R3 é como definido na Fórmula I e PG é um grupo de protecção adequado, é conhecida na técnica. Deste modo, os compostos de Fórmula VIII podem ser preparados como descrito em Posner, G. H. et al. J Med Chem. 1999, 42, 3425-3435. A preparação dos compostos de Fórmula VI, em que R1, R2 e R6 são como definido na Fórmula I, é conhecida na técnica. Deste modo, os compostos de Fórmula VI podem ser preparados como descrito em Posner, G. H. et al. J. Med. Chem. 1992, 35, 3280-3287, cujos conteúdos estão aqui incorporados por referência . A preparação de compostos enantiomericamente puros de Fórmula I e ou II, pode ser efectuada por utilização de compostos enantiomericamente puros de Fórmula V e VI na reacção apresentada no Esquema 2. Nesta reacção, é obtida, tipicamente, 38 uma mistura dos diastereómeros 1α,3β e 1β,3α, com o diastereómero 1α,3β como o produto principal. Estes diastereómeros podem ser separados utilizando cromatografia, por exemplo, utilizando cromatografia liquida de elevado desempenho (HPLC).

Nalguns casos, as químicas descritas acima podem ter de ser alteradas, por exemplo, por utilização de grupos de protecção, para prevenir reacções secundárias devido a grupos reactivos, tais como grupos reactivos ligados como substituintes. Isto pode ser alcançado através de grupos de protecção convencionais, por exemplo, como descrito em "Protective Groups in Organic Chemistry" McOmie, J.F.W. Ed., Plenum Press, 1973 e em Greene, T.W. e Wuts, P.G.M., "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, 1991. A formação de um sal do composto desejado é alcançada utilizando técnica convencionais. Por exemplo, o composto neutro é tratado com um ácido ou base num solvente adequado e o sal formado é isolado por filtração, extracção ou através de qualquer outro método adequado. A formação de solvatos dos compostos da invenção irá variar dependendo do composto e do solvato. No geral, os solvatos são formados por dissolução do composto no solvente apropriado e isolando o solvato por arrefecimento ou utilizando um anti-solvente. 0 solvato é tipicamente seco ou submetido a azeotropia sob condições ambiente.

Os pró-fármacos dos compostos de Fórmula I podem ser, por exemplo, ésteres convencionais formados com grupo hidroxilo, tiol, amino ou carboxilo disponível. Por exemplo, quando R1 e/ou 39 R2 é OH, pode ser acilado utilizando um ácido activado na presença de uma base e, opcionalmente, num solvente inerte (e. g. um cloreto ácido em piridina) . Alguns ésteres comuns que têm sido utilizados como pró-fármacos são ésteres fenilicos, ésteres alifáticos (C8-C24) , ésteres aciloximetilicos, carbamatos e ésteres de aminoácidos.

Um composto marcado radioactivamente da invenção pode ser preparado utilizando métodos convencionais conhecidos na técnica. Por exemplo, pode ser incorporado tritio num composto da invenção utilizando técnicas convencionais, por exemplo, por hidrogenação de um precursor adequado num composto da invenção, utilizando tritio gasoso e um catalisador. Alternativamente, pode ser preparado um composto da invenção contendo iodo radioactivo a partir do derivado trialquilestanho correspondente (trimetilestanho adequado) utilizando condições de iodação convencionais, tais como iodeto de sódio[125I] na presença de cloramina-T num solvente adequado, tal como dimetilformamida. 0 composto trialquilestanho pode ser preparado a partir do composto halo não radioactivo correspondente, de um modo adequado, iodo, utilizando condições de estanilação catalisadas por paládio convencionais, por exemplo hexametildiestanho na presença de tetraquis(trifenilfosfina)paládio (0) num solvente inerte, tal como dioxano, e a temperaturas elevadas, de um modo adequado, 50-100 °C. IV. Utilizações

Como aqui definido anteriormente, foram preparados novos compostos das Fórmulas I e II. Consequentemente, a presente invenção inclui todas as utilizações dos compostos da invenção 40 incluindo a sua utilização em métodos terapêuticos e composições para modular a proliferação celular, sua utilização em ensaios de diagnóstico e sua utilização como ferramentas de pesquisa e como materiais de partida e/ou intermediários na preparação de outras entidades químicas.

Inibindo o catabolismo do calcitriol irá prolongar o tempo de vida biológico desta hormona e, assim, permitir que sejam utilizadas quantidades mais pequenas desta para uma quimioterapia humana eficaz; tal dosagem inferior irá evitar, ou pelo menos, minimizar a toxicidade hipercalcémica associada com a utilização médica do calcitriol. Inibir selectivamente a via enzimática do citocromo P450, através da qual o calcitriol é catabolizado (principalmente, a via de hidroxilação C-24), é uma via importante para prolongar o tempo de vida desta hormona. Deste modo, os compostos de Fórmula I foram testados in vitro, utilizando um protocolo convencional, para a sua capacidade para inibir, especificamente, a CYP24, responsável pela hidroxilação em 24 do calcitriol. 0 antimicótico cetoconazole, um fármaco utilizado clinicamente para a quimioterapia do cancro da próstata humano (Trachtenberg, J. et al. J. Urol. 1984, J32, 61-63), foi utilizado como um controlo convencional para a inibição da CYP24. Os compostos seleccionados de Fórmula I foram mais potentes que o cetoconazole na inibição da actividade da CYP24. Estes compostos apresentaram pouca a nenhuma inibição das enzimas CYP27A1 e CYP27B1, indicando que podem inibir selectivamente a actividade da CYP24.

Os compostos seleccionados de Fórmula I demonstraram também possuir actividade antiproliferativa in vitro em queratinócitos de murinos. Ainda, nos ensaios de hipercalcemia convecionais, os compostos seleccionados de Fórmula I não aumentaram os níveis de 41 cálcio na urina de um rato, após terem sido administrados oralmente aos ratos diariamente durante uma semana. A doses semelhantes, o calcitriol provoca um aumento significativo nos níveis de cálcio na urina.

Os compostos de Fórmula I são moduladores da CYP24 e são úteis na modulação da actividade da CYP24, incluindo a inibição da actividade da CYP24, para o tratamento de várias patologias, tais como distúrbios de proliferação celular. Consequentemente, a invenção proporciona um método para modular a actividade da CYP24, por administração de uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula I, a uma célula ou animal com essa necessidade. Num outro aspecto, a invenção proporciona um método de inibição da actividade da CYP24 por administração de uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula I, a uma célula ou animal com essa necessidade. A presente invenção inclui também a utilização de um composto de Fórmula I para modular, de um modo preferido, para inibir a actividade da CYP24 e uma utilização de um composto de Fórmula I para preparar um medicamento para modular, de um modo preferido, para inibir a actividade da CYP24.

Ao modular selectivamente a CYP24, a enzima que metaboliza a la,25-di-hidroxivitamina D3, os níveis de la,25-di-hidroxivitamina D3 serão modulados. As doenças que beneficiam de uma modulação dos níveis de la,25-di-hidroxivitamina D3 podem, deste modo, ser tratadas utilizando um modulador da CYP24. Ao actuar preferencialmente na CYP24, os efeitos secundários causados por interacção com outras enzima e receptores será reduzida. Consequentemente, a presente invenção proporciona um método para tratar doenças que beneficiam de uma modulação dos níveis de la, 25-di-hidroxivitamina D3, compreendendo administrar uma 42 quantidade eficaz de um composto de Fórmula I a uma célula ou animal com essa necessidade. A invenção inclui também a utilização de um composto de Fórmula I para modular os níveis de la,25-di-hidroxivitamina D3. Além disso, a invenção inclui uma utilização de um composto de Fórmula I, para preparar um medicamento, para modular os níveis de la,25-di-hidroxivitamina D3. A inibição da CYP24, irá inibir o catabolismo da la,25-di-hidroxivitamina D3 que irá prolongar o tempo de vida biológico desta hormona e permitir que sejam utilizadas quantidades mais pequenas para um tratamento eficaz da doença. Tal dose inferior irá evitar, ou pelo menos minimizar, a toxicidade hipercalcémica associada com a utilização médica de la,25-di-hidroxivitamina D3 (calcitriol). Deste modo, numa forma de realização, a presente invenção proporciona um método para tratar doenças que beneficaem da inibição do catabolismo de la,25-di-hidroxivitamina D3, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula I , a uma célula ou animal, com essa necessidade. A invenção inclui também a utilização de um composto de Fórmula I para inibir o catabolismo de la,25-di-hidroxivitamina D3. Além disso, a invenção inclui uma utilização de um composto de Fórmula I para preparar um medicamento para inibir o metabolismo de la,25-di-hidroxivitamina D3.

As doenças que podem beneficiar de uma modulação nos níveis de la,25-di-hidroxivitamina D3 incluem, mas não estão limitadas a: (i) na paratiróide - hiper e hipoparatiroidismo, Pseudo-hipoparatiroidismo, Hiperparatiroidismo secundário; 43 (ii) no pâncreas - diabetes; (iii) na tiróide - carcinoma medular; (iv) na pele - psoríase, cicatrização de lesões; (v) no pulmão - sarcoidose e tuberculose; (vi) no rim - doença renal crónica, VDRR hipofosfatémico, raquitismo dependente de vitamina D; (vii) no osso - tratamento anticonvulsivo, fibrogénese óssea imperfeita, osteíte fibrosa cística, osteomalacia, osteoporose, osteopenia, osteosclerose, osteodistrofia renal, raquitismo; (viii) no intestino - antagonismo glucocorticóide, hipercalcemia idiopática, síndrome de malabsorção, esteatorreia, psilose tropical.

Num aspecto, a presente invenção proporciona um método para modular a proliferação celular, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula I, a uma célula ou animal, com essa necessidade. De um modo preferido, a invenção proporcionar um método de inibição da proliferação celular compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula I a uma célula ou animal com essa necessidade. A presente invenção inclui também uma utilização de um composto de Fórmula I de modo a modular, de um modo preferido, a inibir a proliferação celular. A presente invenção inclui também uma utilização de um composto de Fórmula I para preparar um medicamento para modular, de um modo preferido, para inibir a 44 proliferação celular. Em particular, o método da invenção é útil na inibição da proliferação de células anormais mas não normais. As células anormais incluem qualquer tipo de célula que é causadora de ou está envolvida numa doença ou patologia e, em que é desejável modular ou inibir a proliferação da célula anormal para tratar a doença ou patologia. Exemplos de células anormais, incluem células malignas ou cancerosas, bem como célula que sobre-proliferou em patologias inflamatórias, tais como psoriase. Numa forma de realização da invenção, o distúrbio proliferativo celular é o cancro, em particular, cancro da mama, prostáta e pulmão.

Enquanto os compostos da invenção podem actuar por modulação da actividade da CYP24, será evidente para um especialista na técnica que são possíveis outros modos ou mecanismos de acção para os compostos de Fórmula I.

Um especialista na técnica pode determinar que compostos de Fórmula I possuem utilidade terapêutica, por exemplo, na inibição da proliferação celular em qualquer tipo de cancro ou distúrbio de proliferação celular. Os compostos podem ser examinados na sua eficácia em inibir o crescimento celular em ensaios de proliferação celular, tais como inibição do crescimento de células queratinócitos de murino (linha celular PE) , como aqui descrito no Exemplo 13 e para a inibição da actividade da ornitina descarboxilase (ODC) induzida por TPA, como descrito na Patente US. N° 5830885, cujos conteúdos estão aqui incorporados por referência. Os compostos de Fórmula I podem também ser rastreados para a sua propensão para causar hipercalcemia utilizando o método aqui descrito no Exemplo 14. Os compostos que apresentem hipercalcemia não são desejados. 45

Além do cancro, os compostos de Fórmula I são úteis no tratamento de outras patologias envolvendo proliferação célular anormal ou aberrante. Outros distúrbios de proliferação celular que podem ser tratados pela presente invenção incluem, doenças inflamatórias, alergias, doença autoimune, rejeição de enxerto, psoriase, restenose, aterosclerose e muitos outros distúrbios em que é desejável inibir, prevenir ou suprimir o crescimento celular. Os compostos de Fórmula I podem ser testados na sua eficácia num distúrbio de proliferação celular em particular, utilizando ensaios e técnicas conhecidas pelos especialistas na técnica. Por exemplo, as seguintes referências proporcionam ensaios para as várias patologias: Artrite Reumatóide: "Regulation of IL-15 - Simulated TNF-alpha Production by Rolipram", Journal of Immunology (1999) volume 163, página 8236 por C.S. Kasyapa et ai.; Alergia: "A novel Lyn-Binding Peptide Inhibitor Blocks Eosinophil Differentiation, Survival, and Airway eosinophilic inflammation". Journal of Immunology (1999) volume 163, página 939 por T. Adachi et ai.; Psoriase: Journal of Immunology (2000) volume 165, página 224 "Inhibition of Keratinocyte apoptosis by IL-15: a new parameter in the pathegenosis of psoriasis" por R. Ochers; e Psoriasis: International Archives of allergy and Immunology (2000) Volume 123, página 275. "T-cell receptor mimic peptides and their potential application in T-cell mediated disease" por A. H. Enk.

Os compostos de Fórmula I são, de um modo preferido, formulados em composições farmacêuticas para administração, a sujeitos humanos, numa forma biologicamente compatível adequada para administração in vivo. Consequentemente, noutro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um composto de Fórmula I ou um seu sal, hidrato, 46 solvato ou pró-fármaco farmaceuticamente aceitável, em mistura com um diluente ou veiculo adequado.

As composições contendo os compostos de Fórmula I podem ser preparadas por métodos conhecidos para a preparação de composições farmaceuticamente aceitáveis que podem ser administradas a indivíduos, de modo a que uma quantidade eficaz da substância activa seja combinada numa mistura com um veiculo farmaceuticamente aceitável. Os veiculos adequados são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985). Nesta base, as composições incluem, embora não exclusivamente, soluções de substâncias em associação com um ou mais veiculos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis e contidas em soluções tampão com um pH adequado e iso-osmóticas com os fluidos fisiológicos.

Os compostos de Fórmula I podem ser utilizados farmaceuticamente na forma da base livre, na forma de sais, solvatos e hidratos. Todas as formas estão incluídas no âmbito da invenção. Os sais de adição de ácidos e bases podem ser formados com os compostos da invenção (i. e., compostos de Fórmulas I e II) para utilização como fontes da forma de base livre, mesmo se o sal em particular per se é desejado apenas como um produto intermediário como, por exemplo, quando o sal é formado apenas com o objectivo de purificação e identificação. Todos os sais que podem ser formados com os compostos da invenção são, deste modo, incluídos no âmbito da presente invenção.

De acordo com os métodos da invenção, os compostos descritos de Fórmula I ou seus sais, solvatos, hidratos ou 47 pró-fármacos, podem ser administrados a um doente, em de várias formas, dependendo da via de administração seleccionada, como será evidente para o especialista na técnica. Os compostos de Fórmula I podem ser administrados, por exemplo, por administração oral, parentérica, bucal, sublingual, nasal, rectal, adesivo, bomba ou transdérmica e as composições farmacêuticas formuladas em conformidade. A administração parentérica inclui modos de administração intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, transepitelial, nasal, intrapulmonar, intratecal, rectal e tópica. A administração parentérica pode ser por infusão contínua ao longo de um período de tempo seleccionado.

Um composto de Fórmula I pode ser administrado oralmente, por exemplo, com um diluente inerte ou com um transportador comestível assimilável, ou pode ser introduzido em cápsulas de gelatina de capa mole ou pode ser moldado em comprimidos, ou pode ser incorporado directamente com o alimento de dieta. Para administração terapêutica oral, o composto de Fórmula I pode ser incorporado com excipiente e utilizado na forma de comprimidos ingerível, comprimidos bocais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, hóstias e semelhantes.

Um composto de Fórmula I pode também ser administrado parentericamente. Podem ser preparadas soluções de um composto de Fórmula I em água, adequadamente misturado com um tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulose. Podem também ser preparadas dispersões em glicerol, polietilenoglicóis líquidos, DMSO e suas misturas com ou sem álcool e em óleos. Sob condições normais de armazenamento e utilização, estas preparações contêm um conservante para prevenir o crescimento de microorganismos. Um especialista na técnica saberá como preparar formulações 48 adequadas. Os processos e ingredientes convencionais para a selecção e preparação de formulações adequadas são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences (1990—18a edição) e em The United States Pharmacopeia: The National Formulary (USP 24 NF19) publicada em 1999.

As formas farmacêuticas adequadas para utilização injectável incluem, soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injectáveis estéreis. Em todos os casos a forma deve ser estéril e deve ser fluida até que se exista facilidade na sua utilização em senringas.

As composições para administração nasal podem ser formuladas convenientemente como aerossóis, gotas, géis e pós. As formulações de aerossol compreendem, tipicamente, uma solução ou suspensão fina da substância activa num solvente aquoso ou não aquoso fisiologicamente aceitável e são, geralmente, apresentadas em quantidades individuais ou multidose, na forma estéril, num recipiente estéril, que pode ter a forma de um cartucho ou recarga para utilização com um dispositivo atomizador. Alternativamente, o recipiente selado pode ser um dispositivo de dispersão unitária, tal como um inalador nasal de dose individual ou um dispersor de aerossol adaptado com uma válvula doseadora que é descartável após utilização. Quando a forma de dosagem compreende um dispersor de aerossol, irá conter um propelante que pode ser um gás comprimido, tal como ar comprimido ou um propelante orgânico, tal como o fluorocloro-hidrocarboneto. As formas de dosagem de aerossol podem também ter a forma de um atomizador de bomba. 49

As composições adequadas para administração bucal ou sublingual incluem comprimidos, rebuçados e pastilhas em que o ingrediente activo é formulado com um veiculo, tal como açúcar, acácia, tragacanto ou gelatina e glicerina. As composições para administração rectal estão convenientemente na forma de supositórios contendo uma base para supositório convencional, tal como manteiga de cacau.

Os compostos de Fórmula I ou seus sais, solvatos, hidratos ou pró-fármacos podem ser administrados a um animal, individualmente ou em combinação com veículos farmaceuticamente aceitáveis como referido acima, cuja proporção é determinada pela solubilidade e natureza química do composto, via de administração escolhida e prática farmacêutica convencional. A dosagem dos compostos de Fórmula I e/ou composições da invenção pode variar dependendo de muitos factores, tais como propriedades farmacodinâmicas do composto, o modo de administração, a idade, saúde e peso do receptor, a natureza e extensão dos sintomas, a frequência do tratamento e o tipo de tratamento concorrente, caso exista, e a velocidade de eliminação do composto no animal a ser tratado. Um especialista na técnica pode determinar a dosagem apropriada com base nos factores anteriores. Os compostos de Fórmula I podem ser administrados, inicialmente, numa dosagem adequada que pode ser ajustada conforme necessário, dependendo da resposta clínica. Para tratamento ex vivo de células durante um curto período, por exemplo, durante 30 minutos a 1 hora ou mais, podem ser utilizadas doses mais elevadas do composto do que para terapia in vivo de longo termo. 50

Os compostos de Fórmula I ou seus sais, solvatos, hidratos ou pró-fármacos, podem ser utilizados individualmente ou em combinação com outros agentes que modulam a actividade da CYP24 ou em combinação com outros tipos de tratamento (que podem ou não modular a CYP24) para distúrbios de proliferação celular ou outros distúrbios que beneficiam de uma modulação nos níveis de la, 25-di-hidroxivitamina D3 e/ou uma inibição do catabolismo de la,25-di-hidroxivitamina D3. De um modo preferido, os compostos de Fórmula I são administrados em combinação com la,25-di-hidroxivitamina D3 (calcitriol) ou outros agonistas do receptor da vitamina D. Inibir o catabolismo dos agonistas do receptor da vitamina D irá prolongar o tempo de vida biológico ou eficácia destas terapias e, assim, permitir que sejam utilizadas quantidades mais pequenas de fármaco para uma quimioterapia humana eficaz; tais dosagens mais pequenas irão evitar ou, pelo menos, minimizar a toxicidade hipercalcémica associada com a utilização médica do calcitriol ou outros agonistas do receptor da vitamina D. Deste modo, a presente invenção proporciona um método para aumentar a eficácia de um agonista do receptor da vitamina D, de um modo preferido, la, 25-di-hidroxivitamina D3 (calcitriol), compreendendo co-administrar uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula I e uma quantidade eficaz do agonista do receptor da vitamina D, de um modo preferido, la, 25-di-hidroxivitamina D3 (calcitriol). Além disso, a invenção inclui a utilização de um composto de Fórmula I para aumentar a eficácia de um agonista da vitamina D, de um modo preferido, la, 25-di-hidroxivitamina D3 (calcitriol) e uma utilização de um composto de Fórmula I para preparar um medicamento para aumentar a eficácia de um agonista do receptor da vitamina D, de um modo preferido, la,25-di-hidroxivitamina D3 (calcitriol). 51

Noutro aspecto da presente invenção, os compostos de Fórmula I ou seus sais, solvatos, hidratos ou pró-fármacos, podem ser utilizados em combinação com outras terapias e terapêuticas para tratar distúrbios dermatológicos, distúrbios ósseos, distúrbios da tiróide, cicatrização de lesões e osteoporose.

Além das utilizações terapêuticas mencionadas anteriormente, os compostos da invenção são também úteis em ensaios de diagnóstico, ensaios de rastreio e como ferramentas de pesquisa.

Nos ensaios de diagnóstico, os compostos da invenção (incluindo os compostos de Fórmula II, que demonstraram também inibir a CYP24, mas são calcémicos) podem ser úteis na identificação ou detecção de um distúrbio de proliferação celular. Em tal forma de realização, os compostos da invenção podem ser marcados radioactivamente (como aqui descrito anteriormente) e colocados em contacto com uma população de células. A presença do marcador radioactivo nas células pode indicar um distúrbio de proliferação celular.

No ensaios de rastreio, os composto da invenção (incluindo os compostos de Fórmula II) podem ser utilizados para identificar outros compostos que modulam a proliferação celular ou actividade da CYP24. Os compostos da invenção podem ser utilizados como ferramentas de pesquisa em ensaios de ligação ao receptor e ensaios para estudar a localização da CYP24. Em tais ensaios, os compostos podem também ser marcados radioactivamente. 52

Os seguintes exemplos não limitativos são ilustrativos da presente invenção:

EXEMPLOS

Materiais e Métodos A não ser que seja especificado em contrário, todas as reacções foram efectuadas em material de vidro seco em forno, agitadas sob uma atmosfera de árgon de pureza ultra elevada. 0 THF foi destilado a partir de Na/cetil benzofenona e o CH2C12 destilado a partir de CaH2, imediatamente antes de utilização. Os organolitios foram titulados antes de utilização seguindo métodos conhecidos (Suffert, J. J. Org. Chem. 1989, 54,

509-510) . O cloreto de metileno (CH2C12) e tietilamina (Et2N) foram destilados a partir de hidreto de cálcio antes de utilização. Todos os outros reagentes foram utilizados como recebidos dos fornecedores comerciais. A análise por TLC analítica foi efectuada em placas de sílica gel pré-revestidas com vidro na parte portesrior (Merck Kieselgel 60 F254 , 250 mm de espessura) e visualizada com p-anisaldeído ou corantes de KMn04. Foi efectuada uma cromatografia de coluna utilizando sílica gel de percurso curto (tamanho de partícula, < malha 230) ou sílica gel flash (tamanho de partícula, malha 230-400). Foi efectuada uma cromatografia preparativa em placa utilizando placas preparativas de vidro revestidas com sílica gel (500-1000 ym) da Analtech e analisadas por UV. Foi efectuada uma cromatografia líquida de elevado desempenho (HPLC) utilizando um sistema Rainin HPLX equipado com duas cabeças de bomba preparativa de 25-mL/min, utilizando colunas Rainin Dynamax 10-mm x 250-mm (semipreparativas) empacotadas com sílica gel 60 Â (tamanho de 53 poro 8 μπι), como a sílica 018 ligada e um detector de duplo feixe com comprimento de onda variável Rainin Dynamax UV-C programado para 265 nm. São registados os rendimentos para os produtos puros (>95% com base na sua homogeneidade espectroscópica e cromatográfica) e não são optimizados. As rotações ópticas foram determinadas na linha de Na utilizando um Polarimetro Perkin-Elmer 141. Os espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) foram obtidos num espectrofotómetro Varian XL-400 operando a 400 MHz para αΗ e 100 MHz para 13C. Os desvios químicos são apresentados em ppm (δ) e têm como referência o CDC13 (7,26 ppm para 1H e 77,0 ppm para 13C), e tetrametilsilano (TMS, 0,00 ppm para 3Η) . Os espectros de ultravioleta (UV) foram obtidos utilizando um espectrofotómetro Cary Bio 400 à temperatura ambiente. Os espectros de infravermelhos (IR) foram obtidos utilizando um instrumento Perkin Elmer 1600 Série FT-IR. As bandas de absorção são apresentadas em números de onda (cm-1) . Os espectros de massa de resolução baixa e alta (LRMS e HRMS) foram obtidos com ionização electrónica ou química (EI ou Cl) nas instalações de espectrofotometria de massa da Universidade do Estado de Ohio num espectrómetro de massa Micromass QTOF Electrospray.

Exemplo 1: Preparação de t-Butilcetona VII (R3 = CH3, R5 = t-Butilo, PG = TES)

Um balão de fundo redondo de 15 mL foi carregado com triisopropilamina (42 mg, 0,41 mmol, 7,4 eq. - destilada sobre hidreto de cálcio antes de utilização) e 2 mL de THF destilado. Esta solução foi arrefecida para -78 °C e foi adicionado n-butil-lítio (250 pL de uma solução 1,6 M, 0,43 mmol, 7,2 eq.) via seringa. A pinacolona (IX, R5 = t-Butilo) (39 mg, 0,39 mmol, 54 7,0 eq. - seca sob carbonato de potássio e peneiros moleculares activados durante 24 horas, imediatamente antes de utilização) foi dissolvido em 1 mL de THF destilado e arrefecido para -78 °C, sendo adicionado, nesta altura, ao balão reaccional via cânula. A reacção foi deixada a agitar durante 30 minutos. Foi, então, adicionada hexametilfosforamida (HMPA, 250 yL) via seringa e a mistura reaccional foi deixada a agitar durante mais 15 minutos. Uma solução de iodo (-)-VIII (R3 = CH3, PG = trietilsililo (TES)) (25 mg, 0,06 mmol) em 1 mL de THF foi

arrefecido para -78 °C e adicionado à mistura reaccional via cânula. A mistura reaccional foi agitada a -78 °C durante duas horas e, depois, aquecida para -41 °C num banho de gelo seco/acetonitrilo onde foi deixada a aquecer até à temperatura ambiente durante duas horas e a agitar durante mais 6 horas. A solução amarela resultante foi arrefecida rapidamente com 2 mL de água, extraída com acetato de etilo (3 x 25 mL) , seca sobre MgSOí, concentrada e purificada utilizando cromatografia em coluna de sílica gel (acetato de etilo/éter de petróleo a 0-20%) para proporcionar um óleo incolor (18 mg, 7 6%) . RMN de 3H (400 MHz, CDCI3) δ 5,26 (t, J= 1,4 Hz, 1H) , 4,11 (d, J= 2,0 Hz, 1H) , 2,46-1,25 (m, 16H) , 1,13 (s, 9H) , 1,00 (s, 3H) , 0,98-0,96 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0, 97-0,93 (t, J= 8 Hz, 9H) , 0,59-0,53 (q, J= 7,8 Hz, 6H) ; RMN de 13C (100 MHz, CDCI3) δ 216,1, 160,2, 119.7, 69,0, 55,1, 46,7, 44,1, 36,6, 36,2, 35,8, 35,0, 31,7, 30.7, 26,4, 22,3, 22,0, 18,7, 18,1, 6,9, 4,9 ; IR (limpo) 2956, 1708, 1607, 1456, 1366, 1235, 1143, 1082, 1029, 972, 725 cm-1; [a] D = +19,4 ; HRMS cale. para Czef^CUSiNa [M+Na] : 443,3321, verificado: 443,3318. 55

Exemplo 2: Preparação de cetona de anel CD V (R3 = CH3, R5 = t-Butilo)

Um balão de fundo redondo de 15 mL foi carregado com cetona de terc-butilo VII (R3 = CH3, R5 = t-Butilo, PG = TES) (18 mg, 0,4 mmol) dissolvida em 5 mL de THF destilado. Foi adicionado hidreto de fluoreto de tetrabutilamónio (TBAF, 112 mg, 10 eq.) e peneiros moleculares 4 Â (100 mg) ao balão reaccional e esta solução foi deixada a agitar em refluxo durante quatro horas. Foram adicionadas porções adicionais de TBAF e peneiros a cada quatro horas até deixar de ser visível o material de partida por cromatografia de camada fina analítica (TLC). A solução reaccional foi filtrada através de uma tampa de sílica gel utilizando acetato como eluente para remover o excesso de TBAF e peneiros moleculares. Esta solução foi concentrada e um balão de fundo redondo de 10 mL foi carregado com o material resultante dissolvido em 5 mL de diclorometano destilado (CH2CI2) . A esta solução foram adicionados peneiros moleculares de 4 Â (20 mg) , 4-metilmorfolina-N-óxido (NMO, 10 mg, 0,09 mmol, 2 eq.) e uma quantidade catalítica de perrutenato de tetrapropilamónio (TPAP). Após agitação durante 1 hora, a TLC mostrou o consumo completo do material de partida. A solução reaccional foi filtrada através de uma tampa de sílica gel utilizando acetato de etilo como eluente para remover TPAP e peneiros moleculares. Esta solução foi concentrada e purificada utilizando cromatografia em coluna de sílica gel (acetato de etilo a 20%/éter de petróleo) para proporcionar um óleo incolor (9 mg, 71%) . RMN de 1H (400 MH z, CDCI3) δ 5,29- 5,28 (m, J = 1, 6 Hz , 1H), N) OO -O -2,82 (dd, J = 10, 6, 6,6 Hz, 1H) , 2,47- 1,31 (m, 16H) , 1 ,12 (s, 9H) , 1,05-1, ,04 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,80 (s, : 3H) ; RMN de 13c (100 MHz, CDCI3) δ 215, 9, 211,1, 157,8, 120,: 3, 63, 1, 53, 8, 44 ,1, LO 0 'vT1 , 36, 5, 36 ,0, 34, 4, 32,9, 27,1, 26,4, 24,0 f 21,9, 21 ,7, 56

17,25; IR (limpo) 2955, 1702, 1461, 1367 cm-1; [a]D = 15,6; HRMS calc. para C2oH32C>2Na [M+Na] : 327,2300, verificado: 327,2302.

Exemplo 3: Preparação de II (a) e II(b)

Foi dissolvido óxido de fosfina anidro (±)-VI (R^R2 = O-t-Butildimetilsililo (OTBDMS) ) (79 mg, 0,14 mmol, 1.4 eq.) em 2,5 mL de THF destilado e arrefecido para -78 °C.

Foi adicionado, gota a gota, fenil-lítio (88 yL de uma solução 1,7 M em ciclo-hexano-éter, 0,15 mmol, 1,5 eq.) via seringa, resultando numa coloração vermelho escuro. Esta solução foi deixada a agitar durante 20 minutos. A cetona de anel CD anidra (+)-V (R3 = CH3, R5 = t-Butilo) (31 mg, 0,10 mmol) foi dissolvida em 1,5 mL de THF destilado e arrefecida para -78 °C. Esta solução foi depois adicionada à mistura reaccional via cânula e persistiu a cor vermelha. Esta solução foi agitada a -78 °C no escuro durante 7 horas, sendo nesta altura arrefecida rapidamente com carbonato de potássio saturado (1 mL) e tartrato de sódio e potássio (2 mL de uma solução 2 M) . O produto foi extraido com acetato de etilo (4 x 60 mL), seco utilizando MgSCp, filtrado, concentrado e purificado utilizando cromatografia em coluna de silica gel (acetato de etilo a 3-10%/hexanos tamponada com Et3N a 1%) para proporcionar um óleo incolor. Um balão de fundo redondo de 5 mL foi carregado com este óleo dissolvido em 2.5 mL de THF, hidrato de TBAF (241 mg, 0,92 mmol, 14 eq.), peneiros moleculares 4 Â (100 mg) e 3 gotas de Et3N, sequencialmente. Esta solução foi deixada a agitar no escuro à temperatura ambiente durante 8 horas. A mistura reaccional foi purificada directamente utilizando cromatografia em coluna de silica gel (acetato de etilo a 99% tamponado com Et3N a 1%) , para proporcionar II (a) e II (b) (15 mg, 38%) como uma mistura de 57 diastereómeros (1:3,5) que foram separados utilizando cromatografia de HPLC de fase normal (acetato de etilo a 90%/hexanos, tamponado com Et3N a 1%) para proporcionar 2 mg (5%, 3% no total) do isómero do anel A natural II(b). II(a) (1β,3α): RMN de 2H (400 MHz, CDC13) δ 6,41-6,38 (d, J = 11,2 Hz, 1H) , 6,11-6,08 (m, J= 11,2 Hz, 1H), 5,32 (m, 1H), 5,30 (m, 1H) , 5,02 (m, 1H), 4,44 (m, 1H), 4,22 (m, 1H), 2,83-2,80 (dm, J= 11,6 Hz, 1H), 2,65-1,33 (m, 19H), 1,13 (s, 9H), 1,03-1,01 (d, J= 6,8 Hz, 3H) , 0,67 (s, 3H) ; [a]D = 4,3; HRMS calc. para C29H4403Na [M+Na] : 463,3188, verificado: 463,3163; II(b) (1α,3β) RMN de 2Η (400 MHz, CDC13) δ 6,39-6,36 (d, J = 11,2 Hz, 1H) , 6,12-6,09 (m, J= 11,2

Hz, 1H) , 5,34-5,33 (t, J = 1,6 Hz, 1H) , 5,30-5, 29 (t, J = 1,4 Hz, 1H) , 5,01 (m, 1H), 4,45 (m, 1H) , 4 ,24 (m, 1H), 2,83-2,79 (dm, J = 12 Hz, 1H) , 2,62-2,58 (dm, J= 12,8Hz, 1H), 2,47-1,33 (m, 18H) , 1,12 (s, 9H), 1,03-1,01 (d, J = 6,8Hz , 3H), 0,68 (s, 3H) ; RMN de 13C (100 MHz, CDCI3) δ 216, 1, 159, 6, 147, 7, 142, 6, 132,9, 124,9, 120,3, 116,8, 111,6, 70,6, 66,9, 58,3, 50,1, 45,2, 42,8, 36,6, 36,1, 35,3, 32,7, 29,7, 29,4, 28,8, 26,4, 23, 6, 21,9, 21,6, 16,9; IR (limpo) 3855, 3752 , 3677 , 3386, 2924, 2846, 1702, 1654, 1561, 1432, 1362, 1209, 1051, 1010, 846 cm' -1; UV (MeOH) Amax 264 nm (ε 8157) ; [Oí] D = +17,2 ; HRMS calc. para C29H4403Na [M+Na]: 463, 3188, verificado: 463, 3175. Foi possível separar dos diastereómeros utilizando HPLC de fase normal, embora a separação óptima apenas seja obtida utilizando injecções muito pequenas (~200 yg ou menos).

Exemplo 4: Preparação dos Compostos I(a) e I(b) O óxido de fosfina anidro (±)-VI (R1,R2 = O-OTBDMS) (89 mg, 0,15 mmol, 2 eq.) foi dissolvido em 2,5 mL de THF destilado e arrefecido para -78 °C. Foi adicionado, gota a gota, fenil-lítio 58 (93 yL de uma solução 1,8 M em ciclo-hexano-éter, 0,17 mmol, 2,2 eq.) via seringa, resultando numa coloração vermelho escura. Esta solução foi deixada a agitar durante 20 minutos. Foi dissolvida cetona de anel CD anidra (+) —II (R3 = CH3, R5 = t-Butilo) (23 mg, 0,08 mmol) em 1,5 mL de THF destilado e arrefecido para -78 °C. Esta solução foi, depois, adicionada à mistura reaccional via cânula e persistiu a cor vermelha. Esta solução foi agitada a -78 °C no escuro durante 7 horas, sendo nesta altura arrefecida rapidamente com carbonato de potássio saturado (1 mL) e tartrato de sódio e potássio (2 mL de uma solução 2 M) . O produto foi extraido com acetato de etilo (4 x 60 mL) , seco utilizando MgS04, filtrado, concentrado e purificado utilizando cromatografia em coluna de sílica gel (acetato de etilo a 3-10%/hexanos tamponado com Et3N a 1%) para proporcionar um óleo incolor. Um balão de fundo redondo de 5 mL foi carregado com uma porção deste material (27 mg, 0,04 mmol) dissolvido em 2 mL de piridina anidra. Foi adicionado cloridrato de hidroxilamina (III, R4 = H) (51 mg, 0,74 mmol, 20 eq.) e a reacção foi deixada a agitar no escuro à temperatura ambiente durante 24 horas, nesta altura a análise por TLC mostrou o consumo completo do material de partida e o aparecimento de um novo produto mais polar. Este material foi purificado directamente utilizando cromatografia em coluna de sílica gel (acetato de etilo a 10%/hexanos tamponado com Et3N a 1%) para proporcionar um óleo incolor. Um balão de fundo redondo de 5 mL foi carregado com este óleo dissolvido em 2,5 mL de THF, hidrato de TBAF (135 mg, 0,52 mmol, 14 eq.), peneiros moleculares de 4 Â (60 mg) e 3 gotas de Et3N, sequencialmente. Esta solução foi deixada a agitar no escuro à temperatura ambiente durante 8 horas. A mistura reaccional foi purificada directamente utilizando cromatografia em coluna de silica gel (acetato de etilo a 99% tamponado com Et3N a 1%) em I(a) e I(b) (14 mg, 61%) 59 como uma mistura de diastereómeros (1:3,5) que foram separados utilizando cromatografia de HPLC de fase reversa (38% de H20/acetonitrilo) para proporcionar 2,3 mg (16%, 5% no total) de I(a) e 4,0 mg (29%, 10% no total) de I (b). I(a) (1β,3α): RMN de 3H (400 MHz, CDC13) δ 6, 40-6, 37 (d, J= 11,2 Hz, 1H) , 6,10-6,07 (m, J= 11,2 Hz, 1H) , 5,32 (m, 1H) , 5,29 (m, 1H) , 5,02 (m, 1H) , 4,45 (m, 1H), 4,22 (m, 1H) , 2,83-2,80 (dm, J = 11,6 Hz, 1H) , 2,64-2,60 (dd, J= 12,8 Hz, J= 3,4 Hz, 1H), 2,38-1,24 (m, 18H), 1,11 (s, 9H) , 1,03-1,01 (d, J= 6,8Hz, 3H) , 0,68 (s, 3H); RMN de 13C (100 MHz, CDCI3) δ 167, 7, 159,7, 147,1, 142,7, 132,7, 125, 0, 120,3, 116,8, 112,7, 71,4, 66,7, 58,4, 50,0, 45,4, 42,8, 37,4, 37,2, 35,3, 32,6, 29,4, 28,8, 27,7, 26,1, 24,3, 23,6, 21,4, 17,0; [α] D = -3,7; HRMS calc. para Cz^sNOsNa [M+Na] : 478,3297, verificado: 478,3336; I (b) (1α,3β) RMN de ^ (400 MHz, CDC13) δ 6,39-6,36 (d, J= 11,6 Hz, 1H), 6,12-6,09 (m, J= 11,6 Hz, 1H), 5, 34-5, 33 (t, J = 1,6 Hz, 1H), 5,30 (m, 1H) , 5,02-5,01 (m, J = 1,6 Hz, 1H), 4,44 (m, 1H) , 4,24 (m, 1H) , 2,83-2,79 (dm, J= 12 Hz, 1H) , 2,63-2,59 (dm, J = 13,6 Hz, 1H) , 2,38-1, 69 (m, 18H), 1,11 (s, 9H), 1,03-1,02 (d, J= 6,8 Hz, 3H), 0,69 (s, 3H) ; RMN de 13C (100 MHz, CDC13) δ 167,7, 159,7, 147,6, 142,7, 132,9, 125,0, 120,3, 116,8, 111,7, 70,7, 66,8, 58,4, 50,0, 45,2, 42,8, 37.4, 37,2, 35,3, 32,6, 29,4, 28,8, 27,7, 26,1, 24,3, 23,6, 21.4, 17,0; IR (limpo) 3331, 2955, 2919, 2837, 1661, 1461, 1367, 1349, 1049, 932, 797, 756 cm-1; UV (MeOH) Àmax 266 nm (ε 8502); [oí] D = +4,8; HRMS calc. para C29H45N03Na [M+Na]: 478,3297, verificado: 478,3336.

Exemplo 5: Preparação dos Compostos I(c) e I(d)

O óxido de fosfina anidro ( + )-VI (R1,R2 = OTBDMS, R6 = =CH2) (89 mg, 0,15 mmol, 2 eq.) foi dissolvido em 2,5 mL de THF 60 destilado e arrefecido para -78 °C. Foi adicionado, gota a gota, fenil-litio (93 yL de uma solução 1,8 M em ciclo-hexano-éter, 0,17 mmol, 2,2 eq.) via seringa, resultando numa cor vermelho

escuro. Esta solução foi deixada a agitar durante 20 minutos. A cetona de anel CD anidra (+)—II (R3 = CH3, R5 = t-Butilo) (23 mg, 0,08 mmol) foi dissolvida em 1,5 mL de THF destilado e arrefecido para -78 °C. Esta solução foi depois adicionada à mistura reaccional via cânula e persistiu a cor vermelha. Esta solução foi agitada a -78 °C no escuro durante 7 horas, após as quais foi arrefecida rapidamente com carbonato de potássio saturado (1 mL) e tartrato de sódio e potássio (2 mL de uma solução 2 M) . O produto foi extraído com acetato de etilo (4 x 60 mL) , seco utilizando MgS04, filtrado, concentrado e purificado utilizando cromatografia em coluna de sílica gel (acetato de etilo a 3-10%/hexanos tamponado com Et3N a 1%) para proporcionar um óleo incolor. Um balão de fundo redondo de 5 mL foi carregado com uma porção deste material (12 mg, 0,02 mmol) dissolvido em 1,5 mL de piridina anidra. Foi adicionado cloridrato de metoxilamina (III, R4 = CH3) (27 mg, 0,33 mmol, 20 eq.) e a reacção foi deixada a agitar no escuro à temperatura ambiente. Foram adicionadas porções adicionais de metoxilamina (60 eq. Total) e a reacção foi agitada durante 36 horas. O material de partida e o produto foram muito semelhantes em polaridade e a análise por TLC não foi particularmente útil para seguir a reacção. Este material foi purificado directamente utilizando cromatografia em coluna de sílica gel (acetato de etilo a 3%/hexanos tamponado com Et3N a 1%) para proporcionar um óleo incolor. Um balão de fundo redondo de 5 mL foi carregado com este óleo dissolvido em 2 mL de THF, hidrato de TBAF (59 mg, 0,22 mmol, 14 eq.), peneiros moleculares 4 Â (60 mg) e 1 gota de Et3N, sequencialmente. Esta solução foi deixada a agitar no escuro à temperatura ambiente durante 24 horas. A mistura 61 reaccional foi purificada directamente utilizando cromatografia em coluna de silica gel (acetato de etilo a 99% tamponado com Et3N a 1%) para proporcionar I (c) e I (d) (6 mg, 59%) como uma mistura de diastereómeros (1:3,5) que foram separados utilizando cromatografia de HPLC de fase reversa (15% de H20/acetonitrilo) para proporcionar 1,4 mg (19%, 6% no total) de I (c) e 2,8 mg (37%, 12% no total) de I (d) . I (c) (1β,3α): RMN de 3H (400 MHz, CDC13) δ 6,41-6,38 (d, J = 11,2 Hz, 1H) , 6,11-6,08 (m, J = 11, 6 Hz, 1H) , 5,32 (m, 1H), 5 ,29 (t, J = 1,2 Hz, 1H), 5,02 (m, 1H) , 4,46-4, 44 (m, 1H) , 4, 24 -4,20 (m, 1H), 3,78 (S, 3H), 2,84 -2,80 (dm, J = 11,8 Hz, 1H), 2 , 65- 2,60 (dd, J = 13, 0 Hz, 3,8 Hz, 1H), 2,38-1 , 35 (m , 18H), 1 .,09 (s, 9H), 1,03- -1,01 (d, J = 76,8 Hz, 3H) , 0,69 (s, 3H) f RMN de 13C (100 MHz, CDC1 -3) δ 166.8, 159,7, 147,1, 142,7, 132,7, 125,0, 120,3, 116,8, 112,5, 71.4, 66,9, 60,9, 58,3, 50,0, 45,2, 42,8, 37,1, 35,3, 32,6,

29.4, 28,8, 27,8, 26,5, 24,6, 23,6, 21,3, 17,0; [a]D = -2,4; HRMS calc. para C30H48NO3 [M+H] : 470,3634, verificado: 470,3623; I (d) (1α,3β) RMN de 3Η (400 MHz, CDCI3) δ 6, 39-6, 37 (d, J = 11,2 Hz, 1H) , 6,12-6,09 (m, J= 11,2 Hz, 1H), 5, 34-5, 33 (t, J= 1,6 Hz, 1H) , 5,29 (t, J= 1,2 Hz, 1H), 5,02 (m, 1H), 4, 46-4,43 (m, 1H), 4,26-4,23 (m, 1H) , 3,78 (s, 3H) , 2,84-2,80 (dm, J = 11,8 Hz, 1H) , 2, 63-2,58 (dd, J = 13,6 Hz, 3,6 Hz, 1H) , 2,38-1,35 (m, 18H), 1,09 (s, 9H), 1,03-1,01 (d, J= 7,2 Hz, 3H) , 0,69 (s, 3H); RMN de 13C (100 MHz, CDC13) 166, 8, 159, 7, 147, 6, 142,6, 132,9, 124.9, 120,3, 116,8, 111,7, 70,7, 66,8, 60,9, 58,4, 50,0, 45,2, 42,8, 37,1, 35,3, 32,6, 29,7, 29,4, 28,8, 27,8, 26,5, 24,6, 23,6, 21,3, 16,9; IR (limpo) 3331, 2955, 2919, 2849, 1461, 1361, 1049, 885 cm'1; UV (MeOH) Àmâx 264 nm (ε 6923); [a]D = +6,0; HRMS calc. para C30QH48NO3 [M+H]: 470,3634, verificado: 470, 3636.

De um modo semelhante, foram preparados os seguintes compostos adicionais: 62

Compostos I (e) e I (f) : Por substituição do cloridrato de metoxilamina (III, R4 = CH3) com O-cloridrato de etil-hidroxilamina (III, R4 = Et) . 0 produto reaccional em bruto foi purificado por cromatografia em coluna eluída com acetato de etilo a 99% na presença de trietilamina a 1% para proporcionar 4.8 mg de uma mistura de diastereómeros I (e) (1α,3β) e I(f) (1β,3α) num rendimento de 63% e numa proporção de 1,8:1, respectivamente. Esta mistura diastereómerica foi depois separada por HPLC (coluna Phenomenex Luna, fase reversa, 3 mL/min) eluida com 15% de água em acetonitrilo para proporcionar 1,2 mg de I (e) (1α,3β) e 0,6 mg de I (f) (1β,3α), num rendimento de 16% e 8%, respectivamente. O tempo de retenção para I (e) (1α,3β) é de 55, 48 min e para I(f) (1β,3α) é de 53,23 min. Dados para I (e) (1α,3β): [a]25D= +4,66 (c=0,01, CHC13) RMN de 4H (CDC13, 400 MHz) : δ 6,38 (d, 1H, J= 10,8 Hz), 6,11 (d, 1H, J= 11,6 Hz), 5,34-5,30 (m, 2H) , 5,02 (d, 1H, J= 1,2 Hz), 4,44 (m, 1H), 4,24 (m, 1H) , 4,03 (q, 2H, J= 7,2 Hz), 2,84-2,79 (m, 1H) , 2,62-2,59 (m, 1H) , 2,39-2,30 (m, 2H) , 2,23-1,87 (m, 7H) , 1,79-1, 66 (m, 4H), 1,56-1,38 (m, 6H) , 2,21 (t, 3H, J= 7,2 Hz),

1.09 (s, 9H), 1,02 (d, 3H, J= 6,8 Hz), 0,69 (s, 3H) . RMN de 13C (CDC13, 100 MHz): δ 166,40, 159,78, 147,65, 142,70, 132,88, 124,99, 120,27, 116,84, 111,61, 70,68, 68,49, 66,88, 58,44, 50,03, 45,17, 42,86, 37,18, 37,15, 35,35, 32,55, 29,37, 28,79, 27,85, 26,52, 24,59, 23,63, 21,34, 16,97, 14,64. IR (Pelicula

Fina) 3345 (br, m), 2928 (s), 1666 (w), 1462 (w), 1365 (w) , 1092 (w) , 1053 (s) , 916 (w) , 873 (w) , 801 (w) cm'1. HRMS: calculada para C3iH49N03Na+ [M+Na] : 506,3604 Verificado: 506, 3604.

Os dados para I(f) (1β,3α) não foram obtidos devido a quantidade insuficiente de composto. 63

Compostos I (g) e I (h): Por substituição do cloridrato de metoxilamina (III, R4 = CH3) com cloridrato de O-alil-hidroxilamina (III, R4 = alilo) . 0 produto reaccional em bruto foi submetido a cromatografia flash em coluna eluida com acetato de etilo a 99% na presença de trietilamina a 1% proporcionou 6,1 mg de uma mistura de diastereómeros I (g) (1α,3β) e I (h) (1β,3α), num rendimento de 73% e numa proporção de 2,0:1, respectivamente. Esta mistura diastereomérica foi depois separada por HPLC (coluna Phenomenex Luna, fase reversa, 3 mL/min) eluida com 15% de água em acetonitrilo, para proporcionar 1,1 mg de I(g) (1α,3β) e 0,53 mg de I (h) (1β,3α) em rendimentos de 13% e 6%, respectivamente. 0 tempo de retenção para I(g) (ία, 3β) é de 55, 55 min e para I (h) (1β,3α) é de 53,19 min. Dados para i (g) (la,3 β) MK-1625 (NOA11)-TB-2: [a] 25d= +4,0 (c=0,01, CHC13) RMN de 4H (CDC13, 400 MHz) : δ 6,38 (d, 1H, J=ll, 2 Hz), 6,11 (d, 1H, J=ll,2 Hz), 6,02-5, 92 (m, 1H) , 5, 34-5, 29 (m, 1H) , 5,26-5, 22 (m, 1H) , 5,16-5, 13 (m, 1H) , 5,02 (br, 1H) , 4,50-4,48 (m, 2H), 4,44 (br, 1H) , 4,24 (br, 1H), 3,50 (br, 2 H) , 2,83-2,79 (m, 1H), 2,62 Oh LO CM 1 (m, 1H) , 2,38 -2,30 (m, 2H) , 2,24- -1,87 (m, 9H) , 1,79-1,76 (m, 3H) , 1,52- O PO \—1 1 (m, 2H), 2,21 (t, 3H, J=7,2 Hz), 1,09 (s, 9H) , 1,02 (d, 3H, J=6,8 Hz), 0,68 (s, 3H) . RMN de 13C (CDC13, 100 MHz): δ 166,88, 159,74, 147,66, 142,72, 134,90, 132,87, 124,99, 120,28, 116,82, 116,36, 111,60, 74,07, 70,69, 66,89, 54,43, 50,03, 45,18, 42,87, 37,17, 35,35, 32,58, 29,70, 29,36, 28,79, 27,81, 26,61, 24,62, 23,63, 21,40, 16, 96. IR (Pelicula Fina) 3353 (br, m) , 2926 (s) , 1668 (sh, w) , 1462 (m) , 1365 (m) , 1261 (w) , 1092 (w) , 1048 (br, m) , 915 (m) , 802 (w) , cm-1. HRMS: calculado para C32H4gN03Na+ [M+Na] : 518,3604 Verificado: 518,3572. Dados para I (h) (1β,3α) MK-1625 (NOAII)-TB-l não foram obtidas devido à quantidade insuficiente de composto. 64

Compostos I(i) e I(j): Por substituição do cloridrato de metoxilamina (III, R4 = CH3) com cloridrato de O-fenil-hidroxilamina (III, R4 = fenilo). 0 produto reaccional em bruto foi submetido a cromatografia flash em coluna eluida com acetato de etilo a 99% na presença de trietilamina a 1%, proporcionou 11,8 mg de uma mistura de diastereómeros I(i) (1α,3β) e I (j) (1β,3α) num rendimento de 83%, numa proporção de 1,8:1, respectivamente. Esta mistura diastereómerica foi depois separada por HPLC (coluna Phenomenex Luna, fase reversa, 3 mL/min) eluida com 15% de água em acetonitrilo, para proporcionar 5,3 mg de I(i) (1α,3β) e 2,8 mg de I(j) (1β,3α) num rendimento de 37% e 20%, respectivamente. O tempo de retenção para I(i) (1α,3β) é de 67,86 min e para I(j) (1β,3α) é de 64,85 min. Dados para I(i) (Ια, 3β) : [a] 25D= +0,31 (c =0,25, CHC13) RMN de 2H (CDC13, 400 MHz) : δ 7,30-7,26 (m, 2H), 7,16-7,13 (m, 2H) , (T) 1 co CT% vo (m, 1H), 6,37 (d, 1H, J=ll,2 Hz), 6,09 (d, 1H, J=ll,2 Hz) , 5,34 (dd, 1H, J=l,6 Hz, J= 1,6 Hz) , 5,31-5,30 (m, 1H), 5,02- 5,01 (m, 1H), 4,45-4,44 (m, 1H) , 4,24-4,23 (m, 1H) , 2,80 (dd, 1H, J=4 Hz, J=12 Hz), 2,60 (dd, 1H, J=3,6 Hz, J=13,6 Hz), 2,37-2,30 (m, 4H) , 2,20-2,13 (m, 2H) , 2,07-1,87 (m, 3H) , 1,78-1,44 (m, 9H) , 1,20 (s, 9H) , 1,03 (d, 3H, J=6,8 Hz), 0,68 (s, 3H) . RMN de 13C (CDC13, 100 MHz) : δ 170,34, 159,75, 159,57, 147,62, 132,89, 129,13, 124,95, 121,36, 120,41, 116,83, 114,33, 111,63, 70,69, 66,88, 58,42, 50,03, 45,17, 42,85, 37,99, 37,13, 35,32, 32,55, 29,34, 28,76, 27,73, 27,03, 24,87, 23,61, 21, 42, 17, 00. IR (Película Fina) 3357 (br, m), 2928 (s), 2856 (sh, m), 1590 (s), 1489 (sh, s) , 1394 (m) , 1219 (br, s) , 1158 (w) , 1052 (br, m) , 1023 (w) , 956 (m) , 910 (s) cm-1. HRMS: calculado para C35H49N03Na+ [M+Na] : 554,3604 Verificado: 554,3601.

Dados para I(j) (1β,3α): [a]25D= -24,35 (c=0,27, CHC13) RMN de 4H (CDC13, 400 MHz): δ 7,30-7,26 (m, 2H) , 7,16-7,13 (m, 2H) , 65 1 co -6, 94 (m, 1H) , 6,39 (d, 1H, J= =11,2 Hz) , 6,08 (d, 1H, J=ll, . 6 Hz; ), 5,32-5, 30 (m, 2H), 5,01 (d, . 1H, J=l, 6 Hz) , 4,45 (br, 1H) , 4, 23 -4,21 (m, 1H), 2 ,81 (dd, 1H, J=4,4 Hz, J=12 Hz) , 2,63 (dd, 1H l, J=3, 6 Hz, J=13,2 Hz) , , 2,37-2, 27 (m, - 3H), 2,19 -2,13 (m, 2H) , 2, 06 -1,89 (m, 3H), : 1,78- -1,75 (m, 3H), 1, 64· -1,44 (m, 7H) ,

1,20 (s, 9H), 1,04 (d, 3H, J=6,8 Hz), 0,68 (s, 3H) . RMN de 13C (CDC13, 100 MHz): δ 170,34, 159,75, 159,57, 147,08, 142,68, 132,71, 129,13, 124,99, 121,37, 120,41, 116,83, 114,33, 112,82, 71,51, 66,76, 58,41, 50,03, 45,51, 42,77, 37,99, 37,13, 35,30, 32,55, 29,38, 28,74, 27,73, 27,03, 24,86, 23,59, 21,39, 17,02. IR (Película Fina) 3350 (br, m), 2926 (s), 2850 (m), 1590 (m) , 1490 (m) , 1220 (br, s) , 1158 (w) , 1050 (br, m) , 910 (s) cm-1. HRMS: calculado C35H49N03Na+ [M+Na] : 554,3604 Verificado: 554,3578.

Exemplo 6: Preparação do Composto I(k)

Uma solução de 53 mg (0,094 mmol) de óxido de 19-nor-fosfina VI (R1, R2 = OTBDMS, R6 = H) em 2,0 mL de THF anidro foi arrefecida para -78 °C e tratada com 59 pL (0,094 mmol, 1,6 M em hexanos) de n-BuLi sob atmosfera de árgon. A mistura tornou-se vermelha escura e foi agitada durante 15 min a -78 °C. À solução foi adicionada, gota a gota, uma solução pré-arrefecida (-78 °C) de 10 mg (0,031 mmol) de cetona de anel C,D V (R3 = CH3, R5 = t-butilo, ver Exemplo 2) em 1,5 mL de THF anidro via cânula. A reacção prosseguiu até a cor laranja avermelhada se tornar amarela (cerca de 2 h). A reacção foi arrefecida rapidamente por adição de 1,0 mL de tampão a pH 7 a -78 °C, depois, aquecida para a temperatura ambiente, extraída com EtOAc (20 mL x 2), lavada com solução salina saturada, seca sobre MgS04, concentrada. O resíduo foi submetido a cromatografia em coluna 66 com EtOAc/hexanos (1/15) como eluente para proporcionar 11 mg (52%) do produto associado com um óleo incolor. 0 produto associado (10 mg, 0,015 mmol) foi dissolvido em 1,0 mL de piridina anidra e a esta solução foi adicionado cloridrato de O-etil-hidroxilamina (26 mg, 20 eq.) e peneiros ✓ £ moleculares em po 4 A (10 mg) a temperatura ambiente. A solução de mistura foi depois agitada à temperatura ambiente durante 20 h. A reacção foi monitorizada por TLC. Esta mistura reaccional foi depois submetida, directamente, a cromatografia em coluna com EtOAc/hexanos (1/15) como eluente, para proporcionar 10 mg (97%) de produto oxima, como um óleo incolor. O produto oxima (8,9 mg, 0,013 mmol) foi dissolvido em 2 mL de THF anidro e à solução foram adicionados 0,19 mL (0,19 mmol) de uma solução 1,0 M de TBAF em THF. A mistura resultante foi agitada de um dia para o outro à temperatura ambiente, depois arrefecida rapidamente com 2 mL de água. A solução foi extraída com EtOAc (20 mL x 3) , lavada com solução salina saturada, seca sobre MgSCt, concentrada. 0 resíduo foi sujeito a cromatografia em coluna com EtOAc como eluente para proporcionar 5,6 mg (94%) do produto em bruto de (-)-l(k), como um óleo incolor. O produto em bruto (4 mg de 5,6 mg) foi purificado por HPLC de fase reversa (coluna semi-preparativa C-18, 18% de H20 em MeCN, 3 mL/min) para proporcionar 2,5 mg de (-)-l(k) (1α,3β

tR = 38,7 min) : [a]24D = -47,2 (c = 0,023, CHC13) . RMN de 4H (400 MHz, CDC13) δ 6,31 (d, J= 11,2 Hz, 1H) , 5,95 (d, J= 11,2

Hz , 1H), 5,31 (m, 1H) , 4 ,13 (m, 1H), 4, 06 (m, 1H) , 3,78 (s, 3H) , 2, 75-2,81 (m, 2H) , 2, 49 (dd , J= 13,6, 3, 6 Hz, 1H) , 2,38 (dd, J= 11,2, 5, 6 Hz, 1H) t 2,10 -2,29 (m, 6H) t 1, 94 -2,06 (m, 2H) , 1, 36-1,82 (m, 12H) , 1, 09 (s, 9H), 1,02 (d, J = 6, 8 Hz, 3H) , 0, 69 (s , 3H) . RMN de 13C (100 MHz, CDCI3) δ 166,8, 159, 9, 142,6, 67 131,1, 123,8, 120,3, 115,1, 67,4, 67,2, 61,0, 58,4, 49,9, 44,6, 42,2, 37,2, 37,1, 35,3, 32,6, 29,4, 28,6, 27,8, 26,5, 24,6, 23, 5, 21,3, 27,1. IR (limpo, cm-1) 3355, 2930, 1668, 1463, 1364, 1054, 976, 886, 810. HRMS ([M+Na]+) calc. 480,3448, verificado 480,3427.

Exemplo 7: Ensaio da enzima CYP24 (Células KPKlA-ras Induzidas) 68

Quando as células HPKlA-ras apresentarem uma confluência de 80-90%, adicionar 1 pL de l,25(OH)2D3 10"5 M a 1 mL de meio na placa (a concentração final é de 10“8 M) . 2. Preparação da suspensão de células

Após 18 a 20 horas de indução, foi removido o meio as células lavadas duas vezes com PBS. Depois as células da placa foram tripsinizadas, centrifugadas (2000 rpm, 5 min) e o sedimento celular suspenso em meio DMEM + BSA a 1%.

Contar as células e ajustar a densidade celular para 250000/150 pL, adicionar 150 pL de suspensão celular a cada poço na placa de 48 poços, (incluindo 3 poços como controlo sem célula e 3 poços com células sem fármaco ou inibidor como controlo). 69 quantidade de DPPD 100 mM (número do poço/5) pL e misturados estes num vortex. 5. Incubação

Foram adicionados 25 pL de substrato a cada poço, a placa incubada a 37 °C durante 3 horas.

Foram adicionados 25 pL de substrato a uma placa de contagem (poço 2) como uma contagem total. 6. Extracção de lipido e contagem

Foram adicionados 500 pL de metanol a cada poço para parar a reacção, transferi-las para um tubo.

Foram adicionados 250 pL de diclorometano e vortexados.

Foram adicionados 250 pL de diclorometano e 250 pL de KCI saturado e vortexados.

Centrifugação a 4000 rpm durante 5 min.

Foram transferidos 100 pL de fase aquosa (fase superior) para uma placa de contagem de plástico. Foram adicionados 600 pL de fluido de cintilação a cada poço. Contagem da placa num contador de cintilação. 7. Cálculo da actividade enzimática 70

Os CPM do controlo das células após subtracção dos CPM de NCC é 100% da actividade enzimática.

Actividade enzimática = (CPM no poço dos compostos de teste - CPM no poço do NCC ) / (CPM no Controlo das células-CPM no poço do NCC) * 100%

Diluição do Cetoconazole

Stock 10”2 M

Concentração (final) Do passo anterior DMEM + BSA a 1% Concentração (actual) 10~3 M 4 4 96 8*10”3 M 10"b M 12,5 112,5 8*10"b M 10"' M 12,5 112,5 8*10"' M 10"B M 12,5 112,5 8*10”“ M

Diluição dos compostos de teste Stock 10"3 M

Concentração (final) Do passo anterior (pL) DMEM + BSA a 1% (pL) Concentração (actual) 10”3 M 10 115 -O 1 O \—1 -X co M 10"b M 12,5 112,5 8*10”b M s 1 O T-1 12,5 112,5 1 O T-1 -X co M 10"a M 12,5 112,5 8*10”“ M 71 (iii) Resultados:

Os compostos de Fórmula I (a), I(c), I (e), I (g), I (i) e I(k) apresentaram uma inibição significativamente superior de CYP24 que o cetoconazole. Na Figura IA é apresentado um gráfico apresentando a inibição da actividade de CYP24 pelos compostos I (a) e I(c) (indicados como BH1625(NOH)-TB-2(CTA062) e BH-1625(NOMe)-TB-2-(CTA065), respectivamente) em comparação com cetoconazole. (iv) Referências:

Ray S, Ray R, Holick M. Metabolism of 3H-lalpha,25-dihydroxyvitamin D3 in the cultured human keratinocytes (1995) 59: 117-122

Dilworth F J, Scott I, Green A, Strugnell S, Guo Y D, Roberts E A, Kremer R, Calverley, M J, Makin H L J, Jones G. Different mechanisms of hydroxylation site selection by liver and kidney cytochrome P450 species (CYP27 and CYP24) involved in Vitamin D metabolism. (1995) J Biochem 270 (28) : 16766-16774 72

Exemplo 8: Ensaios de CYPl-alfa hidroxilase (Utilizando Células COS-1 Transfectadas) (A) Transfecção em movimento (i) Reagentes e material 1. Células COS-1 (confluência de 50-80%) 2. Reagente de Transfecção FuGene 6 3. Vector ADNPc contendo ADNc de CYP-lalfa hidroxilase (1 pg/pL) 4. Meio DMEM + FCS a 10% 5. Meio DMEM (livre de soro) 6. Placa de 6 poços (ii) Preparação da mistura de transfecção (A quantidade dependeu de quantos poços foram transfectados) 1. A um tubo estéril, foi adicionado meio livre de soro (100 pL por poço), depois adicionado Reagente FuGene 6 (3 pL por poço) . Tapado cuidadosamente para misturar. Ter em atenção a ordem. Foi adicionado Reagente FuGene 6 directamente ao meio, não deixar que o Reagente Fugene 6 não diluido entre em contacto com outras superfícies de plástico que não as pontas da pipeta. 73 2.

Foi adiconada solução de ADN (1 yg por poço) ao Reagente FuGene 6 pré-diluído do passo 2 3. 0 tubo foi tapado cuidadosamente para misturar os conteúdos. Não se vortexou. Incubado durante 15 min à temperatura ambiente (não mais de 45 min). (iii) Preparação das células 1. As células Cos-1 foram tripsinizadas, a suspensão celular centrifugada, sedimento celular suspenso no meio DMEM + FCS a 10%. 2. A suspensão celular diluida para 750000 célula/mL (75 células/quadrado). (iv) Transfecção. 1. Foram adicionados 1,7 mL de meio DMEM + FCS a 10% a cada poço da placa de 6 poços. 2. O volume correcto da suspensão celular foi transferido (200 yL/poço) para a mistura de transfecção. Cuidadosamente misturados. 3. Foram adicionados 0,3 mL da mistura a cada poço. Garantiu-se que foram adicionadas as mesmas quantidades de células a cada poço. Os poços foram agitados para dispersão uniforme. 74 4. As células foram incubadas durante 24 horas a 37 °C, 5% de C02 até ao ensaio de actividade enzimática. (B) Ensaio de Actividade Enzimática (i) Reagentes e materiais

Meio DMEM + BSA a 1%

PBS

[3H-26,27] -25 (OH) D3 DPPD 100 mM (ii)Processo 1. As células foram lavadas uma vez com PBS. Garantiu-se que não que havia distúrbio das células ligadas. 2. Foram adicionados 0,55 mL de meio (DMEM+BSA a 1%) a cada poço. 3. Foram adicionados 0,025 mL de meio contendo os compostos de teste. 4. As células foram incubadas durante 10 minutos. 75 5. Foram adicionados 0,025 mL de meio contendo [3H-26,27] -25 (OH) D3 (50000 CPM) e DPPD (0,6 pL de stock). 6. As células foram incubadas durante 2 horas. 7. Foram adicionados 1,5 mL de Metanol para parar a reacção. 8. Foi adicionado padrão interno. 9. O meio foi transferido para o tubo marcado. 10. Foram adicionados 0,75 ml de diclorometano, vortexados e mantidos à temperatura ambiente durante 15 minutos. 11. Foram adicionados 0,75 mL de diclorometano e 0,75 mL de KCI saturado. 12. Vortexados e centrifugados. 13. Foi removida a fase superior e seca a fase inferior em Vácuo Rápido. 14. Foram adicionados 110 pL de fase móvel, vortexados e centrifugados durante 5 min. 15. Foram transferidos 105 pL para o interior de um frasco de HPLC. 16. Condições da análise por HPLC: 76

Solvente: Hexano/isopropanol/metanol (91/7/2)

Coluna: coluna SIL de 3 ym Fluxo: 2 mL/min

Detector: detector de UV e detector de radioactividade. (C) Resultados:

Os compostos de Fórmula I(a), I (c), I(e), I(g), I (i) e I (k) apresentaram pouca a nenhuma (IC50 > 10000 nM) inibição de CYP27B1. Na Figura 1B é apresentado um gráfico que mostra a inibição da actividade de CYP27B1 pelos compostos I(a) e I(c) (indicandos como BH1625(NOH)-TB-2(CTA062) e BH-1625(NOMe)-TB-2-(CTA065), respectivamente) em comparação com cetoconazole. (D) Referências

Shink T, Shimada H, Wakino S, Anazawa H, Hayashi M, Saruta T, Deluca H, Suda T. Cloning and expression of rat 25-hydroxyvitamin D3-l-alpha-hydroxylase cDNA. (1997) Pro. Natl Acad Sei 94: 12920-12925

Muralidharan K R, Rowland-goldsmith M, Lee S A, Park G, Norman A W, Henry H L, Okamura W H. Inhibitors of 25-hydroxyvitamin D3-lalpha- hydroxylase: Thiavitamin D analogues and biological evaluation. (1997) J Steroid Biochem. Molec. Biol. 62 (1): 73-78. 77

Exemplo 9: Ensaio enzimático de CYP27A1 (A) Processo:

Como descrito em:

Dilworth F J, Black S M, Guo Y D, Miller W L, Jones G. Construction of a P450c27 fusion enzyme: a useful tool for analysis of vitamin D3 25-hydroxylase (1996) Biochem J 320: 267-271

Sawada N, Sakaki T, Ohta M, Inouye K. Metabolism of vitamin D (3) by human CYP27A1 (2000) Biochem Biophys Res Commun 273 (3): 977-84 (B) Resultados:

Os compostos de Fórmula I (a), I (c), I (e), I(g), I (i) e I (k) apresentaram pouca a nenhuma (IC5o > 10000 nM) inibição de CYP27A1. Na figura C é apresentado um gráfico que mostra a inibição da actividade de CYP27A1 pelos compostos I (a) e I(c) (indicados como BH1625 (NOH)-TB-2(CTA062) e BH-1625(NOMe)-TB-2-(CTA065) , respectivamente) em comparação com cetoconazole. 78

Exemplo 10: Ensaio de Ligação do VDR (A) Reagentes e materiais 1. VDR 9,3 pmol/yL (humano, recombinante, Biomol) . 2. [3H]-1,25 (OH) 2D3 em etanol 3. l,25(OH)2D3 em etanol 4. TEK300

Tris-HCI 50 mM

EDTA 1,5 mM

KCI 300 mM pH ajustado para 7,4 (25 °C) 5. TEDK300 TEK3oo DTT (ditiotreitol) 10 mM (PM 154,24) 6. Tampão Tris 22,50 g de Tris-HCI 500 mL de H20 13,25 g de base Tris 79

500 mL de H2O

Mantido a 4 °C 7. Dextrano-T70 (Mol 70000) Pharmacia norit) 8. Carvão (carbono neutro descorante,

Fishery 9. Gelatina (G-2625 Sigma) (B) Preparação do Reagente 1. Solução de dextrano com carvão (1) Tampão Tris

Tris

Quantidades iguais de Tris-HCI e base misturadas. (2) Carvão neutro descorante Norit 2,0 g 150 mL de Tampão Tris

Agitar (3) Dextrano T-70 0,2 g 50 mL de Tampão Tris. 80 (4) 0 dextrano suspenso foi adicionado gota a gota lentamente, em solução de carvão com agitação.

Manter no frigorifico de um dia para o outro.

Trinta minutos antes de ser utilizado, foi armazenado em gelo com agitação continua 2. Solução de TEK30o/Gelatina 50 mg de gelatina de porco 5 mL de solução de TEDK30o

Aquecida, agitada, depois, arrefecida para 4 °C. 5 mL de solução de TEDK30o 3. Preparação de l,25(OH)2D3 e compostos de teste em etanol 1,25 (OH) 2D3: 125, 250, 500, 1000, 2000, 4000 pg/25 pL. (stock 10-5 M/25 μL = 100000 pg/25 pL)

Compostos de teste: 12500, 25000, 50000, 100000, 200000 e 40,000 pg/25 pL. (4*10-5 M/25 pL = 400000 pg/25 pL) 81

Marcador Concentração (ng/mL) Quantidade (PP/50 pL) O LO 125 Std F 10,0 250 Std G 20,0 500 Std H 40,0 1000 80,0 2000 Std I 160, 0 4000 4. Diluição de VDR: 1 pL de stock de VDR em 2,5 mL de TEDK30o/solução de Gelatina (500 pL/tubo), (manter no gelo) (C) Ensaio:

Marcador

Padrões

Tampão NSB TR 1 h 1,25 (OH)2D3 TR lh

Reagente C-carvão

Em gelo 30 mrn

Agitar a 4 °C

TC

Total NSB (b não específico)

25 pL

de reagente D logagâo bo Máx Padrão 25 pL de cada padrão

Teste 25 pL de cada ião concentrado da amostra

100 pL

500 pL

de reagente reagente A L 5 0 0 pL de reagente L

500 pL de reagente A misturar todos os tubos

50 pL de reagente B misturar todos os tubos

100 pL reagente

C misturar todos os tubos 2000 10 rpm, min

Foram adicionados 100 pL ao suporte de contagem

Contados 5-10 min 82

Diluição de 1,25 (OH)D3

Concentração (pg/25 pL) Concentração final M IO"5 M Etanol (pL) 4000 2*10~M 6 144 2000 10“M 70 70 1000 5*10”a 70 70 500 2,5*10”a 70 70 250 1,2 5 * 10-y 70 70 125 6,25*101U 70 70

Diluição dos compostos de teste

Concentração pg/50 pL) Concentração final M 10’JM Etanol 4000000 2*10"b 6 144 2000000 TÕ^ 70 70 10000 > O \—1 * LO 70 70 5000 2,5*10“' 70 70 25000 1,25*10“' 70 70 12500 6,25*10b 70 70 (E) Resultados:

Na Figura 2 é apresentado um gráfico que mostra a ligação dos compostos I(a) e I(c) , (indicados como BH-1625(NOH)-TB-2 (CTA62) e BH-1625 (NOMe)-TB-2-(CTA65) , respectivamente) para transportar a proteina D (DBP) em comparação com la,25-di-hidroxivitamina D3 e 25-hidroxivitamina D3. 83 (F) Referências: 1. Ross T K, Prahl J M, DeLuka H. Overproduction of rat 1,25-dihydroxyvitamin D3 receptor in insect cells using the baculovirus expression system. (1991) Proc Natl Acd Sei USA 88: 6555-6559 2. Wecksler W R, Norman A W. An hydroxylapatite batch assay for the quantitation of lalpha, 25-dihydroxyvitamin D3-receptor complexes (1979) Anal Biochem 92: 314-323

Exemplo 11: Ensaio de Actividade Transcricional (Ά) Reagentes e materiais: pSG5-hVDRl/3 de DRs. Mark Haussler e Kerr Whitfield, (Universidade do Arizona, Tucson, AZ); o AND de hVDRl/3 inserido no local EcoRI do vector pSG5 (CT4)4TKGH de DRs. Mark Haussler e Kerr Whitfield, (Universidade do arizona, Tucson, AZ); Quatro cópias de osteocalcina sintética VDRE de CT4 ligadas e ligada ao vector pTKGH que tem um promotor timidina ligado ao gene GH humano. kit hGH ELISA. Boehringer Mannheim

Reagente de transfecção Fugene 6 Células COS-1

Meio DMEM e meio DMEM + FCS a 10% 84 1,25(OH) 2D3 e compostos de teste (B) Transfecção: 1. Células COS subcultivadas em placa de 24 poços (5000 célula/poço) um dia antes da transfecção. 2. Preparação da mistura (a quantidade depende de quantos poços tranfectados). (1) A um tubo estéril, foi adicionado meio livre de soro (100 pL por poço), depois adicionado Reagente FuGene 6 (0,6 pL por poço). Tapado cuidadosamente para misturar. Teve-se em atenção a ordem. Foi adicionado Reagente FuGene 6 directamente ao meio, não permitir que o Reagente Fugene 6 não diluído entre em contacto com outras superfícies de plástico que não as das pontas das pipetas. (2) Foi adicionada solução de ADN (vectores pSG5-hVDRl/3 e (CT4)1 2 4TKGH) (0,1 pg por cada poço) ao Reagente FuGene 6 pré-diluído do passo 2 (3) Tapar, cuidadosamente, o tubo para misturar os conteúdos. Não vortexar. Incubar durante 15 min à temperatura ambiente (não mais de 45 min). 85 1 O meio foi removido e substituído por 0,4 mL de 2 meio fresco 4 . a cada poço.

Foram adicionados, gota a gota, 100 pL de mistura (C) Tratamento das células transfectadas com diferentes concentrações de l,25(OH)2D3 e compostos de teste: 30 min a 1 hora após a transfecção, foram adicionados l,25(OH)2D3 (como controlo) e compostos de teste ao meio em 20 pL de meio. A gama de concentração para l,25(OH)2D3 foi de IO'10 a ΙΟ"8 Μ (ΙΟ-10, 3*10"9, 10"9, 3*10"8, 10"8 M) e para compostos de teste foi de 3*10‘9 M a 10‘7 M (3*10“9, 10“9, 3*10“8, 10“8, 3*10“8, 10“7 M) . A Incubação prosseguiu durante 24 horas. (D) Determinação do conteúdo em GH no meio:

Após 24 horas de incubação, foram utilizadas aliquotas de 200 pL de meio diluido (diluição de 20-50 vezes) para a determinação de GH humano. A amostra foi testada de acordo com as instruções do kit de ELISA de hGH. (E) Resultados:

Na figura 3 é apresentado um gráfico que mostra a actividade dos compostos I (a) e I(c) (indicados como BH1625(NOH)-TB-2 (CTA62) e BH-1625(NOMe)-TB-2-(CTA65), respectivamente) no ensaio de transcrição da vitamina D em comparação com la,25-di-hidroxivitamina D3. 86 (F) Referências

Hashimoto Y, Ikeda I, Ikeda M, Takahashi Y, Hosaka M, Uchida Η, Kono N, Fukui H, Makino T, Honjo M. Construction of a specific and sensitive sandwich enzyme immunoassay for 20 KD human growth hormone (1998) J Immunol Methods 221: 77-85

Jone G, Byford V, Makin H L J, Kremer R, Rice R H, deGraffenried L A, Knutson J C, Bishop C W. Anti-proliferative activity and target cell catabolism of the vitamin D analogue 1 alpha, 24(OH)2D2 in normal and immortalized human epidermal cells (1996) Biochem Pharmacol 52: 133-140

Exemplo 12: Ensaio de Ligação de DBP (Plasma Humano) (A) Reagentes: 1. Tampão Tris: 22,50 g de Tris-HCI 500 mL de H20

2. 13,25 g de base Tris 500 mL de H20 Mantendo a 4 °C 87 3.

Dextran-T70 (Mol 70000) Pharmacia norit) (plasma 4. Carvão (carbono neutro de descoração,

Fishery 5. DBP (proteína de ligação à vitamina D) humano) 6. [3H] 25 (OH) D3 7. Gelatina (G-2625 Sigma) (B) Preparação do Reagente: 1. Tampão Tris

Misturar volume igual dos dois tampões Tris 2. Solução de carvão revestida com dextrano (1) preparação da solução de carvão

g mL

Carvão neutro descorante Norit 2,0

Tampão Tris 150

Agitação (2) preparação da solução de dextrano Dextrano T-70 0,2 g 88

Tampão Tris 50 mL (3) preparação da solução de carvão revestido com dextrano

Deitar lentamente a solução de dextrano na solução de carvão com agitação.

Manter no frigorifico de um dia para o outro.

Trinta minutos antes de utilizar, manter em gelo com mistura continua.

Esta solução poderá ser mantida a 4 °C durante 2 meses. 3. Tampão Tris/Solução de gelatina 250 mg de gelatina de porco 50 mL de tampão Tris aquecido, agitado e arrefecido em gelo.

Preparado pouco antes da utilização.

4 . Solução DBP O plasma humano foi diluído para 1:5000 com tampão Tris/solução de gelatina 5. Diluição do Padrão 25(OH)D3

Stock 10000 pg/50 yL 89

Diluído para 0,625, 125, 250, 500, 750, 1000, 10000 pg/50 pL com etanol 6. Diluição do Padrão l,25(OH)2D3

Stock 200000 pg/50 pL (10’5 M/50 pL)

Diluído para 6, 250, 12500, 25000, 50000, 100000, 200000 pg/50 pL com etanol 7. Diluição dos compostos de teste Stock 200000 pg/50 pL (10“3 M)

Diluído para 12500, 25000, 50000, 100000, 200000 e 400000 pg/50 pL com etanol 8. Solução de [3H-26, 27]-25 (OH) 2D3 A solução stock foi diluída em tampão Tris, 20000 CPM/50 pL. (C) Ensaio

Marcador 25(OH) d3 Compostos de teste 3H- 2 5 (OH)D3 (HL) DBP (HL) Super mix Incubação (Rm T) Carvão de dextrano (HL) Em gelo Centrifugação Contagem 1-3 (total 50 600 600 4-8 50 500 ' STD 50 " 50 _ 4 h 1 h 2000 rpm 15 min, 4 °C 200 pL Super + 600 pL de Supermix Teste 36- 50 50 90 (D) Cálculos: A quantidade de 25(OH)D3 para substituir 50 porcento de [3H]-25 (OH) D3 é calculada como B50 para ligação de 25 (OH) D3 DBP. A ligação de DBP de outros compostos é calculada como B50 relativamente a um valor de 1 para 25(OH)D3. (E) Diluição de 25(OH)D3:

Quantidade (mol/50 pL) Dos passos anteriores (pL) Etanol (pL) 2,5*10-11 (5*10'') 5*10"' M 2,5*10~13 40 360 1,875*10~13 90 30 1,25*10~13 130 130 6,25*10"1J 130 130 3,125*10~1J 130 130 1,5625*10-13 130 130 (F) Diluição de 1,25(OH)D3

Quantidade (mol em 50 pL) Dos passos anteriores (pL) Etanol (pL) 5*10~1U (10-3 M) 2,5*10~1U 130 130 1,25*10~iU 130 130 6,25*10-11 130 130 3,215*10_ii 130 130 1, 625*10-11 130 130 91 (G) Diluição dos compostos de teste:

Quantidade (mol em 50 pL) Dos passos anteriores (pL) Etanol (pL) Stock (10“J) l,0*10“a 5 245 5,0*10“1U 130 130 2,5*10~1U 130 130 l,25*10~iU 130 130 6,25*10-11 130 130 3,125*10_ii 130 130 (H) Resultados:

Na Figura 4 é apresentado um gráfico que mostra a actividade dos compostos I(a) e I(c) (indicados como BH-1625(NOH)-TB-2(CTA62) e BH-1625(NOMe)-TB-2-(CTA65), respectivamente) no ensaio de ligação do receptor da vitamina D (VDR) em comparação com la,25-di-hidroxivitamina D3. (I) Referências:

Bouillon R, van Baelen H, Moor P D. Comparative study of the affinity of the serum vitamin D-binding protein. (1980) J Steroid Biochem 13: 1029-44. 92

Jones L, Byrnes B, Palma F, Segev D, Mazur E. Displacement potency of vitamin D2 analogue in competitive protein-binding assay for 25-hydroxyvitamin D3, 24,25-dihydroxyvitamin D3 and 1,25-dihydroxyvitamin D3 (1980) J Clin Endocrinol Metab 50: 773-775

Exemplo 13: Proliferação de queratinócitos

Os compostos de Fórmula I(a) e I(c) foram testados in vitro para a actividade antiproliferativa em queratinócitos de murinos, utilizando um protocolo convencional (Posner, G.H. et al. J. med. Chem. 1992, 35, 3280-3287). Na Figura 5 é apresentado um gráfico que mostra os efeitos de resposta à dose dos compostos I (a) e I (c) na proliferação dos queratinócitos em comparação com la,25-di-hidroxivitamina D3 ou calcitriol.

Exemplo 14: Excreção de Cálcio

Como uma determinação da sua segurança em animais, o compostos de Fórmula I (a) foi administrado oralmente a ratos, diariamente durante 1 semana, a uma dose semelhante (0,5 micrograma/Kg de peso corporal) ao calcitriol, utilizando um processo descrito previamente (Posner G.H. et al. J. Med. Chem. 1999, 42, 3425-3435) . Na Figura 6 é apresentado um gráfico que mostra o efeito do composto I (a) (indicado como BH1625(NOH)) nos níveis de cálcio na urina de rato em comparação com o calcitriol (la,25-di-hidroxivitamina D3) . 93

Enquanto a presente invenção foi descrita com referência ao que é presentemente considerado como sendo os exemplos preferidos, é para ser entendido que a invenção não está limitada aos exemplos revelados. Pelo contrário, a invenção pretende abranger várias alterações e organizações equivalentes incluídas no âmbito e espírito das reivindicações em anexo.

Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes estão aqui incorporados por referência, na sua totalidade, na mesma extensão como se cada publicação individual, patente ou pedido de patente tenha sido individualmente e especificamente indicado como incorporado por referência na sua totalidade.

Lisboa, 9 de Maio de 2007 94

Claims (32)

1. REIVINDICAÇÕES Composto de Fórmula I e seus sais, hidratos, solvatos e pró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis:

   em que R1 e R2 são seleccionados, independentemente, do grupo consistindo de OH, OalquiloCi-6 e halo; R3 é alquiloCi-6; R4 é seleccionado do grupo consistindo de H, alquiloCi-6, arilo e heteroarilo, com o alquiloCi-s sendo não substituído ou substituído com 1-4 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, halo, NH2, NHalquiloCi-4 e N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) e com arilo e heteroarilo sendo não substituídos ou substituídos com 1-5 grupos, seleccionados independentemente de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, CF3, OCF3, halo, SH, SalquiloCi-4, NH2, NHalquiloCi-4, N (alquilCi_4) (alquiloCi_4) , CN, C(0)0H, C (0) OalquiloCi-4, C (0) NHalquiloCi-4, NHC (0) alquiloCi-4, 0C (0) alquiloCi-4, SOalquiloCi-4, S02alquiloCi-4, S02NHalquiloCi-4 e S02NH2; R5 é seleccionado do grupo consistindo de alquiloCi_6, cicloalquilo (C3-C6) , arilo, heteroarilo, arilalquiloCi_6 e heteroarilalquiloCi-6, com o alquiloCi-6 sendo não substituído ou substituído com 1-4 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi_4, OalquiloCi_4, OH, halo, NH2, NHalquiloCi-4 e N (alquilCi-4) (alquiloCi_4) e com cicloalquilo (C3-C6) , arilo, heteroarilo, arilalquiloCi-6 e heteroarilalquiloCi-6, sendo não substituído ou substituído com 1-5 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi_4, OH, CF3, 0CF3, halo, SH, SalquiloCi-4, NH2, NHalquiloCi-4, N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) , CN, C(0)0H, C (0) OalquiloCi-4, C (0) NHalquiloCi_4, NHC (0) alquiloCi-4, OC (0) alquiloCi-4, S0alquiloCi-4, S02alquiloCi-4, S02NHalquiloCi-4 e S02NH2; e R6 são ambos H ou em conjunto formam =CH2.
2. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que R1 e R2 são seleccionados, independentemente, do grupo consistindo de OH, 0CH3 e fluoro.
3. 3. Composto de acordo com a reivindicação 2, em que R1 e R2 são ambos OH.
4. 4. Composto de acordo com qualquer das reivindicações 1-3, em que R3 é CH3. 2
5. 5. Composto de acordo com qualquer das reivindicações 1-4, em que R4 é seleccionado do grupo consistindo de H, fenilo e alquiloCi-4.
6. 6. Composto de acordo com a reivindicação 5, em que R4 é seleccionado do grupo consistindo de H, fenilo, alilo e CH3-
7. 7. Composto de acordo com qualquer das reivindicações 1-6, em que R5 é seleccionado do grupo consistindo de isopropilo, s-butilo, t-butilo e neopentilo.
8. 8. Composto de acordo com a reivindicação 7, em que R5 é t-butilo.
9. 9. Composto de acordo com qualquer das reivindicações 1-8, em que a geometria em relação à dupla ligação C=N da oxima é trans.
10. 10. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que ambos R6 são H.
11. 11. Composto de acordo com a reivindicação 1, com uma estereoquimica relativa como apresentado abaixo: 3
12. 12. Composto de acordo com a reivindicação 1 que é seleccionado do grupo consistindo de:

    4

    5
13. 13. Composto de acordo com a reivindicação 11 que é seleccionado do grupo consistindo de composto I (a), I (c) , I (e) , I (g) , I (i) e I (k) .
14. 14. Composto de Fórmula II e seus sais, hidratos e solvatos:

    em que R1 e R2 são seleccionados, independentemente, do grupo consistindo de OH, OalquiloCi-6, OPG e halo; PG é um grupo de protecção; 6 R3 é alquiloCi-6; R5 é seleccionado do grupo consistindo de alquilo Ci-6, cicloalquilo (C3-C6), arilo, heteroarilo, arilalquiloCi-6 e heteroarilalquiloCi-6, com o alquiloCi-6 sendo não substituído ou substituído com 1-4 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, halo, NH2, NHalquiloCi_4 e N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) e com cicloalquilo (C3-C6) , arilo, heteroarilo, arilalquiloCi_6 e heteroarilalquiloCi-6, sendo não substituído ou substituído com 1-5 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi-4, OalquiloCi-4, OH, CF3, OCF3, halo, SH, SalquiloCi-4, NH2, NHalquiloCi-4, N (alquilCi_4) (alquiloCi_4), CN, C (0) OH, C (0) OalquiloCi-4, C (0) NHalquiloCi-4, NHC (0) alquiloCi-4, OC (0) alquiloCi-4, SOalquiloCi-4, S02alquiloCi-4, S02NHalquiloCi_4 e SO2NH2; e R6 são ambos H ou em conjunto formam =CH2.
15. 15. Composto de acordo com a reivindicação 14, em que R1 e R2 são seleccionados, independentemente, do grupo consistindo de OH e OPG.
16. 16. Composto de acordo com qualquer das reivindicações 14-15, em que R4 é alquiloCi-4
17. 17. Composto de acordo com qualquer das reivindicações 14-16, em que R5 é seleccionado do grupo consistindo de isopropilo, s-butilo, t-butilo e neopentilo. 7
18. 18. Composto de acordo com a reivindicação 14, seleccionado do grupo consistindo de:
19. 19. Composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com qualquer das reivindicações 1-13 e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
20. 20. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13 na preparação de um medicamento para tratar uma doença que beneficia com uma modulação dos níveis de la, 25-di-hidroxivitamina D3.
21. 21. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13 para preparar um medicamento para 8 tratar doenças que beneficiam com uma inibição do catabolismo da la,25-di-hidroxivitamina D3.
22. 22. Utilização de acordo com a reivindicação 20 ou 21, em que a doença é seleccionada do grupo consistindo de cancro, distúrbios dermatológicos e distúrbios ósseos.
23. 23. Utilização de acordo com a reivindicação 20-21, em que a doença é seleccionada do grupo consistindo de hiper-paratiroidismo, hipo-paratiroidismo, pseudo-hipoparatiroidismo, hiperparatiroidismo secundário, diabetes, carcinoma medular, psoriase, cicatrização de lesões, sarcoidose, tuberculose, doença crónica renal, VDEE hipofosfatémico, raquitismo dependente de vitamina D, tratamento anticonvulsivo, fibrogénese óssea imperfeita, osteomalacia, osteoporose, osteopenia, osteosclerose, osteodistrofia renal, antagonismo glucocorticóide, hipercalcemia idiopática, síndrome de malabsorção, esteatorreia, psilose tropical.
24. 24. Utilização de acordo com a reivindicação 22, em que a doença é seleccionada do grupo consistindo de cancro, psoriase e osteoporose.
25. 25. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13 para a preparação de um medicamento para tratar a proliferação celular.
26. 26. Utilização de acordo com a reivindicação 25, em que a célula é uma célula cancerígena. 9
27. 27. Utilização de acordo com a reivindicação 26, em que o cancro é seleccionado de cancro da mama, cancro do pulmão e cancro da próstata.
28. 28. Utilização de um composto de acordo com qualquer das reivindicações 1-13, para preparação de um medicamento para a inibição da actividade da CYP24.
29. 29. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13, para aumentar a eficácia de um agonista do receptor da vitamina D.
30. 30. Utilização de acordo com a reivindicação 29, em que o agonista do receptor da vitamina D é la,25-di- hidroxivitamina D3 (calcitriol).
31. 31. Método para preparar um composto de Fórmula I compreendendo fazer reagir um composto de acordo com qualquer das reivindicações 14-18, com um composto de Fórmula III ou um seu sal, hidrato ou solvato: NH2-OR4 III em que R4 é seleccionado do grupo consistindo de H, alquiloCi-6, arilo e heteroarilo, com o alquiloCi-6 sendo não substituído ou substituído com 1-4 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi_4, OalquiloCi_4, OH, halo, NH2, NHalquiloCi-4 e N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) e com arilo e heteroarilo sendo não substituídos ou substituídos com 1-5 grupos seleccionados, independentemente, de alquiloCi_4, OalquiloCi-4, OH, CF3, 0CF3, halo, SH, SalquiloCi-4, NH2, 10 NHalquiloCi-4, N (alquilCi-4) (alquiloCi-4) , CN, C(0)0H, C (0) OalquiloCi-4, OC (0) alquiloCi-4, C (0) NHalquiloCi-4, SOalquiloCi-4, NHC (0) alquiloCi-4, S02alquiloCi-4, S02NHalquiloCi-4 e SO2NH2, na presença de amina não nucleofílica; e por remoção de quaisquer grupos de protecção, se presentes.
32. 32. Método de acordo com a reivindicação 41, em que a amina é piridina. Lisboa, 09 de Maio de 2007 11