JP4394969B2 - ウシの品種の鑑別方法 - Google Patents
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Description
このような偽装を防止するため、農林水産省は素牛の誕生から市場までの流れをトレースできるシステム (トレーサビリティー) の構築に努めている。このシステムは、食肉の偽装販売を防ぎ、食肉の品質や安全性を保証する上でも重要な要素になると期待されている。また、このトレーサビリティーを補完する意味で、黒毛和種と第一代交雑種とを正しく鑑別する技術、ひいては牛品種を正しく鑑別する技術の確立が望まれている。しかし、現在に至るまで、科学的な手法に基づく客観的判定基準による品種鑑定技術は、実用化されていない。
本発明者は、黒毛和種と、ホルスタイン種またはホルスタイン種と黒毛和種の第一代交雑種(以下、F1ともいう)等とを峻別可能な遺伝子の多型マーカーを見つけだすために、AFLP法により、ホルスタイン種に高頻度で検出されるAFLP多型断片を中心に検索を行った。
まず、牛の肝臓組織、リンパ節、血液(白血球)をホモジナイズした残渣を、ザルコシル、EDTAを含むTNE溶液に溶解後、Proteinase Kを加え、37℃で一晩インキュベートした。次に、TE-フェノール抽出、フェノール/クロロフォルム/イソアミルアルコール抽出、ジエチルエーテル抽出、およびエタノール沈殿によりDNAを抽出精製し、かかるDNAを遺伝子試料とした。
AFLP法における操作は、基本的には、Vosら (1995) の方法に従って行った。まず、500ngのDNAを制限酵素Taq IとEcoRIの組み合わせで切断し、表1に示したTaq IアダプターとEcoRIアダプターを付加し、これをPCRのためのテンプレートとした。PCR反応液は、アダプターを付加した鋳型DNA 溶液5μl、1×Ex Taq buffer、dNTP Mixture (0.2mM each)、TaKaRa Ex TaqTM Hot Start Version (1U)、1つの塩基を付加させたアダプターに特異的に結合する1st PCRプライマー(Taq IプライマーとEcoRIプライマー;表1参照)各75ngを含み、蒸留水で全量を50μlに調整した。1st PCR反応は、94℃ 30秒、56℃1分、72℃ 1分を1サイクルとして20サイクル繰り返した後、72℃ 10分の伸長反応を行った。なお、サーマルサイクラーは、PE BiosystemsのGeneAmp PCR system 9700Gを使用した。1st PCR産物は蒸留水で10倍希釈し−20℃で保存した。
次に、銀染色法により検出されたAFLP多型バンド(BIMA1〜11)をポリアクリルアミドゲルから切り出し、TE 20μlに浸してDNAを溶出させた。このDNA溶液をテンプレートとして2nd PCRと同じ条件でPCR反応を行い、1.5%アガロースゲルで20分間電気泳動した。UV照射下でゲルからバンドを切り出し、Ultra CleanTM 15 DNA Purification Kit (MO BIO) でDNAを抽出した。
多型部位は、EcoRI、Taq Iの制限酵素認識部位である可能性があるため、AFLP多型断片の両端を含むフランキングサイトの塩基配列を、Universal GenomeWalkerTM Kit (BD Biosciences)を用いたPCR Walking法(Devic, et al. 1997)で決定した。無作為に選んだ黒毛和種1個体のDNAを、添付マニュアルに従い、Dra I、EcoRV、Pvu II、Stu Iの4種類の制限酵素で切断し、それぞれにGenome-Walker Adaptor(表2)をライゲーションし、ライブラリーを作成した。
BIMA7〜11に対しても、同様の方法でフランキングサイトの塩基配列の決定を行った。
フランキングサイトの塩基配列に基づいて、制限酵素部位を挟みこめるプライマーセットを設計した。このプライマーセットを用いて黒毛和種とホルスタイン種のゲノムDNAでPCR反応を行った。反応条件は94℃ 2分間熱変性後、94℃ 30秒、65℃ 30秒、72℃ 1分を1サイクルとして30サイクル反応させた後、72℃ 7分、伸長反応した。得られた産物はアガロースゲルから回収し、SILVER SEQUENCETM DNA Sequencing Reagentsを用い、添付プロトコールに従ってシーケンス反応を行い、銀染色法でバンドを検出した。シークエンス解析の結果から黒毛和種とホルスタイン種の塩基配列を比較し、BIMA1〜11の多型断片において多型の原因となっている変異を特定したところ、制限酵素認識部位の変異が原因であったものが8種類 (EcoRIが3種類、Taq Iが5種類)、欠失によるものが3種類であった。
本発明は、下記1〜11で表されるウシの遺伝子の多型のうち、1種または2種以上の多型を指標として、被験牛の遺伝子DNAを検出することにより、当該被験牛が黒毛和種であるか否かを鑑別する、ウシの品種の鑑別方法(以下、本鑑別方法ともいう)を提供する発明である。
多型2は、典型的には、当該遺伝子多型が、「G」であるか、または、「A」であるか、により表現される多型である。
4.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号8(BIMA4b)に示す塩基配列の445番目の塩基「C」における遺伝子多型(以下、多型4ともいう)である。
9.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号18(BIMA9b)に示す塩基配列の1051番目の塩基における遺伝子多型(以下、多型9ともいう)である。
本鑑別方法は、特に、被験牛が黒毛和種牛であるか、または、ホルスタイン種牛、若しくは、ホルスタイン種牛と黒毛和種牛の第一代交雑種であるか、を鑑別することができる方法として用いることが有用である。
本鑑別方法により、以下の観点から、被験牛の品種を鑑別することができる。
(第1段階)
被験牛における、多型1および/または6を検出し、当該遺伝子多型が非黒毛和種型を示す場合には、当該被験牛を非黒毛和種と判定し、
(第2段階)
第1段階において、多型1および/または6の遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、第2段階として、多型2、4および5からなる群から選ばれる2若しくは3種の遺伝子多型を検出し、当該遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、当該被験牛を黒毛和種と判定する。
(第1段階)
被験牛における、多型7および/または8を検出し、当該遺伝子多型が非黒毛和種型を示す場合には、当該被験牛を非黒毛和種と判定する工程である。
第1段階において、多型7および/または8の遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、第2段階として、多型1〜6、および、多型9〜11からからなる群から選ばれる2種以上の遺伝子多型を検出し、当該遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、当該被験牛を黒毛和種と判定する工程である。
本発明において見出されたBIMA1〜11における多型と、他の遺伝子の多型に対する情報を組み合わせることによって、さらに多様な牛の品種の鑑別を行うことが可能である。
さらに、本発明は、本鑑別方法を行うための検出用キット(以下、本検出用キットともいう)を提供する発明である。
このように、本発明は、本鑑別方法を行うために、遺伝子増幅用プライマー等として用いることができる、特定のヌクレオチド鎖(以下、本ヌクレオチド鎖ともいう)を提供する発明である。
次に、多型部分の変異の種類に応じて、PCRやミスマッチPCR-RFLPなどによる大量試料について簡便に遺伝子型判別を解析できる方法を構築した(表4、図14)。
反応液は、ゲノムDNA 50ng、1×PCR buffer、dNTP mixture (0.2mM each)、各プライマー 10pmol、DNA polymerase 1U (TaKaRa Ex TaqTM Hot Start Version) を含み、蒸留水で全量20μlとした。基本的なPCRの条件は、94℃ 2分熱変性後、94℃ 30秒、65(or 55)℃ 30秒、72℃ 1分を1サイクルとして30サイクル反応後、72℃ 7分の伸長反応を行った。ただし、増幅しにくいプライマーについては、65℃のアニーリング温度を62℃に下げて行った。PCR-RFLPを行うマーカーについては、以下の反応を行った。反応液は、PCR産物 10μl、制限酵素バッファー 3μl、制限酵素EcoRIまたはTaqI 5unitを含み蒸留水で全量30μlとし、EcoRIで切断するものは37℃、TaqIで切断するものは65℃でそれぞれ12時間以上インキュベートした。BIMA2、4、5、6の反応液は、3%アガロースゲルで100V、30分間、電気泳動後、エチジウムブロマイド染色によりバンドを検出した。BIMA1と3のPCR産物は、5%ポリアクリルアミドゲルで、1,800V、2時間、電気泳動後、銀染色(Silver sequence DNA staining reagents:Promega社)によりバンドを検出した。なお、ミスマッチPCR-RFLPとは、PCRプライマーセットの一方に、作為的に一塩基の置換を入れたプライマーを用いることで(表4参照)、RFLPで使用する制限酵素で認識される塩基配列をプライマー領域に持つPCR産物を作り出し、多型部分が制限酵素で切断されないアリルを鋳型としたPCR産物であっても、この部分が必ず切断される方法である(図14)。これは、PCR反応および制限酵素処理が正常に起きていることを裏付ける内部指標となる。
ゲノムDNA(10ng/μl)5μl、10×PCR buffer(100mM Tris-HCl, 15mM MgCl, 500mM KCl ; pH8.6) 2.0μl、dNTP Mixture(2.5mM each)1.6μl、TaKaRa Ex TaqTMHot Start Version(5unit/μl)0.08μl、Forwardプライマー 10ngとReverseプライマー10ngをそれぞれ加え、超純水で全量を20μlとして反応を行った。PCRの条件は基本的には以下のように設定した。94℃ 2分後、94℃30秒、65℃ 30秒、72℃ 1分を1サイクルとして30サイクル繰り返した後、72℃ 7分の伸長反応を行った。ただし、PCR増幅がしにくいプライマーについては、65℃のアニーリング温度を下げて行った。
この方法を用いて、黒毛和種100頭、ホルスタイン種100頭およびF1 90頭について、各マーカーでの遺伝子型頻度と遺伝子頻度を調べた(表5)。黒毛和種やホルスタイン種から検出されたBIMAマーカーの遺伝子頻度は、F1においてほぼ半分の値を示した。この事から、各BIMAマーカーは、黒毛和種とホルスタイン種の集団において、ここで示された遺伝子頻度と同等の頻度で分布していることが示唆された。
また、同様の方法を用いて、(1)とは別個に黒毛和種296頭、ホルスタイン種100頭およびF196頭について、各マーカーでの遺伝子型頻度と遺伝子頻度を調べた(表6)。
(1)BIMA1〜6
まず、黒毛和種においてアリルaの遺伝子頻度が小さいマーカーであるBIMA1と6をタイプIマーカー、ホルスタイン種においてBIMA1と6以外でアリルaの遺伝子頻度が高いマーカーであるBIMA2、4、5をタイプIIマーカーとした。これらのマーカーを組み合わせたときのF1の検出率と黒毛和種を誤ってF1と判定してしまう危険率を、表5の結果を用いてそれぞれ計算したところ、タイプIマーカー群では検出率73.01%、危険率1.00%(表7)、タイプIIマーカー群では検出率56.27%、危険率1.98%(表8)であった。
式:1−0.7301=0.2699
で表され、これに対して検出率56.27%のタイプIIマーカーを適用すると、新たに検出されるF1は、
式:0.2699×0.5627=0.1519
で表される。これは、タイプIマーカーで検出された個体以外に、新たに検出されるF1全体に対する割合なので、全体の検出率は、
式:0.7301+0.1519=0.8820
で表され、F1全体の88.20%でアリルaが検出される、すなわち、検出率88.20%となる。
式:0.088×0.107+0.107×0.0591+0.0591×0.088−2×0.088×0.107×0.0591=0.0198
で計算される。これを信頼度で表現する場合は、
式:1−0.0198=0.9802
で与えられ、98.02%となる。
上記(1)の方法に準じて、BIMA1〜11の鑑定能についての検討を行った。その結果、これらのマーカーを用いた場合の最高の品種鑑定能を得るマーカーの組み合わせは、BIMA1、BIMA7、BIMA8、BIMA11を用いた場合であることが明らかとなった。その精度は、F1の検出率91.7%、誤判別率0.7% (信頼度99.3%)であった。F1の検出率が向上すると共に、信頼度も98%から、99.3%に向上した。
Claims (17)
- 下記1〜11で表されるウシの遺伝子の多型のうち、1種または2種以上の多型を指標として、被験牛の遺伝子DNAを検出することにより、当該被験牛が、黒毛和種牛であるか、または、ホルスタイン種牛、若しくは、ホルスタイン種牛と黒毛和種牛の第一代交雑種であるか、を鑑別するウシの品種の鑑別方法であって、第1段階として、被験牛における、下記1および/または6の遺伝子多型を検出し、当該遺伝子多型が非黒毛和種型を示す場合には、当該被験牛を非黒毛和種と判定し、当該第1段階において、下記遺伝子多型1および/または6の遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、第2段階として、上記の被験牛における下記2、4および5からなる群から選ばれる2種若しくは3種の遺伝子多型を検出し、当該遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、当該被験牛を黒毛和種と判定することを含む、ウシの品種の鑑別方法。
1.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号2に示す塩基配列の164〜166番目の塩基が、「CTC」であるか、または、当該3塩基の欠失であるか、により表現される遺伝子多型。
2.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号4に示す塩基配列の589番目の塩基が、「G」であるか、または、「A」であるか、により表現される遺伝子多型。
3.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号6に示す塩基配列の560〜568番目の塩基が、「ACCCTCAGG」であるか、または、当該9塩基の欠失であるか、により表現される遺伝子多型。
4.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号8に示す塩基配列の445番目の塩基が、「C」であるか、または、「G」であるか、により表現される遺伝子多型。
5.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号10に示す塩基配列の344番目の塩基が、「C」であるか、または、「G」であるか、により表現される遺伝子多型。
6.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号12に示す塩基配列の524番目の塩基が、「A」であるか、または、当該塩基の欠失であるか、により表現される遺伝子多型。
7.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号14に示す塩基配列の734番目の塩基が、「C」であるか、または、「T」であるか、により表現される遺伝子多型。
8.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号16に示す塩基配列の1212番目の塩基が、「T」であるか、または、「C」であるか、により表現される遺伝子多型。
9.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号18に示す塩基配列の1051番目の塩基が、「G」であるか、または、「A」であるか、により表現される遺伝子多型。
10.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号20に示す塩基配列の633番目の塩基が、「G」であるか、または、「A」であるか、により表現される遺伝子多型。
11.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号22に示す塩基配列の202〜204番目の塩基が、「TGG」であるか、または、当該3塩基の欠失であるか、により表現される遺伝子多型。 - 下記1〜11で表されるウシの遺伝子の多型のうち、1種または2種以上の多型を指標として、被験牛の遺伝子DNAを検出することにより、当該被験牛が、黒毛和種牛であるか、または、ホルスタイン種牛、若しくは、ホルスタイン種牛と黒毛和種牛の第一代交雑種であるか、を鑑別するウシの品種の鑑別方法であって、被験牛における、下記7および/または8の遺伝子多型を検出し、当該遺伝子多型が非黒毛和種型を示す場合には、当該被験牛を非黒毛和種と判定することを含む、ウシの品種の鑑別方法。
1.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号2に示す塩基配列の164〜166番目の塩基が、「CTC」であるか、または、当該3塩基の欠失であるか、により表現される遺伝子多型。
2.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号4に示す塩基配列の589番目の塩基が、「G」であるか、または、「A」であるか、により表現される遺伝子多型。
3.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号6に示す塩基配列の560〜568番目の塩基が、「ACCCTCAGG」であるか、または、当該9塩基の欠失であるか、により表現される遺伝子多型。
4.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号8に示す塩基配列の445番目の塩基が、「C」であるか、または、「G」であるか、により表現される遺伝子多型。
5.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号10に示す塩基配列の344番目の塩基が、「C」であるか、または、「G」であるか、により表現される遺伝子多型。
6.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号12に示す塩基配列の524番目の塩基が、「A」であるか、または、当該塩基の欠失であるか、により表現される遺伝子多型。
7.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号14に示す塩基配列の734番目の塩基が、「C」であるか、または、「T」であるか、により表現される遺伝子多型。
8.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号16に示す塩基配列の1212番目の塩基が、「T」であるか、または、「C」であるか、により表現される遺伝子多型。
9.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号18に示す塩基配列の1051番目の塩基が、「G」であるか、または、「A」であるか、により表現される遺伝子多型。
10.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号20に示す塩基配列の633番目の塩基が、「G」であるか、または、「A」であるか、により表現される遺伝子多型。
11.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号22に示す塩基配列の202〜204番目の塩基が、「TGG」であるか、または、当該3塩基の欠失であるか、により表現される遺伝子多型。 - 下記1〜11で表されるウシの遺伝子の多型のうち、1種または2種以上の多型を指標として、被験牛の遺伝子DNAを検出することにより、当該被験牛が、黒毛和種牛であるか、または、ホルスタイン種牛、若しくは、ホルスタイン種牛と黒毛和種牛の第一代交雑種であるか、を鑑別するウシの品種の鑑別方法であって、第1段階として、被験牛における、下記7および/または8の遺伝子多型を検出し、当該遺伝子多型が非黒毛和種型を示す場合には、当該被験牛を非黒毛和種と判定し、当該第1段階において、下記遺伝子多型7および/または8の遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、第2段階として、上記の被験牛における下記1〜6、9〜11からなる群から選ばれる2種以上の遺伝子多型を検出し、当該遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、当該被験牛を黒毛和種と判定する、ウシの品種の鑑別方法。
1.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号2に示す塩基配列の164〜166番目の塩基が、「CTC」であるか、または、当該3塩基の欠失であるか、により表現される遺伝子多型。
2.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号4に示す塩基配列の589番目の塩基が、「G」であるか、または、「A」であるか、により表現される遺伝子多型。
3.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号6に示す塩基配列の560〜568番目の塩基が、「ACCCTCAGG」であるか、または、当該9塩基の欠失であるか、により表現される遺伝子多型。
4.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号8に示す塩基配列の445番目の塩基が、「C」であるか、または、「G」であるか、により表現される遺伝子多型。
5.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号10に示す塩基配列の344番目の塩基が、「C」であるか、または、「G」であるか、により表現される遺伝子多型。
6.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号12に示す塩基配列の524番目の塩基が、「A」であるか、または、当該塩基の欠失であるか、により表現される遺伝子多型。
7.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号14に示す塩基配列の734番目の塩基が、「C」であるか、または、「T」であるか、により表現される遺伝子多型。
8.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号16に示す塩基配列の1212番目の塩基が、「T」であるか、または、「C」であるか、により表現される遺伝子多型。
9.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号18に示す塩基配列の1051番目の塩基が、「G」であるか、または、「A」であるか、により表現される遺伝子多型。
10.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号20に示す塩基配列の633番目の塩基が、「G」であるか、または、「A」であるか、により表現される遺伝子多型。
11.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号22に示す塩基配列の202〜204番目の塩基が、「TGG」であるか、または、当該3塩基の欠失であるか、により表現される遺伝子多型。 - 上記第1段階において、被験牛の上記遺伝子多型7および/または8の遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、第2段階として、上記1および11の遺伝子多型を検出し、当該遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、当該被験牛を黒毛和種と判定する、請求項3記載のウシの品種の鑑別方法。
- 上記第1段階において、被験牛の上記遺伝子多型7および/または8の遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、第2段階として、上記1および11、並びに、6および/または9の遺伝子多型を検出し、当該遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、当該被験牛を黒毛和種と判定する、請求項3記載のウシの品種の鑑別方法。
- 遺伝子多型を、配列番号1および2の164〜166番目の塩基部分を、遺伝子増幅法により得られる遺伝子増幅産物により検出する、請求項1〜5のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
- 遺伝子多型を、配列番号3および4の589番目の塩基部分を、遺伝子増幅法により得られる遺伝子増幅産物により検出する、請求項1〜6のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
- 遺伝子多型を、配列番号5および6の560〜568番目の塩基部分を、遺伝子増幅法により得られる遺伝子増幅産物により検出する、請求項1〜7のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
- 遺伝子多型を、配列番号7および8の445番目の塩基部分を、遺伝子増幅法により得られる遺伝子増幅産物により検出する、請求項1〜8のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
- 遺伝子多型を、配列番号9および10の344番目の塩基部分を、遺伝子増幅法により得られる遺伝子増幅産物により検出する、請求項1〜9のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
- 遺伝子多型を、配列番号11および12の524番目の塩基部分を、遺伝子増幅法により得られる遺伝子増幅産物により検出する、請求項1〜10のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
- 遺伝子多型を、配列番号13および14の734番目の塩基部分を、遺伝子増幅法により得られる遺伝子増幅産物により検出する、請求項1〜11のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
- 遺伝子多型を、配列番号15および16の1212番目の塩基部分を、遺伝子増幅法により得られる遺伝子増幅産物により検出する、請求項1〜12のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
- 遺伝子多型を、配列番号17および18の1051番目の塩基部分を、遺伝子増幅法により得られる遺伝子増幅産物により検出する、請求項1〜13のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
- 遺伝子多型を、配列番号19および20の633番目の塩基部分を、遺伝子増幅法により得られる遺伝子増幅産物により検出する、請求項1〜14のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
- 遺伝子多型を、配列番号21および22の202〜204番目の塩基部分を、遺伝子増幅法により得られる遺伝子増幅産物により検出する、請求項1〜15のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
- 下記1〜11に示す群からなる、1種または2種以上の、塩基数が15〜40である、請求項1〜16のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法を行うために用いる、黒毛和種鑑定用プライマーセットの組合せ。
1.配列番号1または2の164〜166番目の多型塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与えるように、前記多型塩基を挟み込む、配列番号1または2に示す塩基配列を基とした黒毛和種鑑定用プライマーセット。
2.配列番号3または4の589番目の多型塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与えるように、前記多型塩基を挟み込む、配列番号3または4に示す塩基配列を基とした黒毛和種鑑定用プライマーセット。
3.配列番号5または6の560〜568番目の多型塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与えるように、前記多型塩基を挟み込む、配列番号5または6に示す塩基配列を基とした黒毛和種鑑定用プライマーセット。
4.配列番号7または8の445番目の多型塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与えるように、前記多型塩基を挟み込む、配列番号7または8に示す塩基配列を基とした黒毛和種鑑定用プライマーセット。
5.配列番号9または10の344番目の多型塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与えるように、前記多型塩基を挟み込む、配列番号9または10に示す塩基配列を基とした黒毛和種鑑定用プライマーセット。
6.配列番号11または12の524番目の多型塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与えるように、前記多型塩基を挟み込む、配列番号11または12に示す塩基配列を基とした黒毛和種鑑定用プライマーセット。
7.配列番号13または14の734番目の多型塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与えるように、前記多型塩基を挟み込む、配列番号13または14に示す塩基配列を基にした黒毛和種鑑定用プライマーセット。
8.配列番号15または16の1212番目の多型塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与えるように、前記多型塩基を挟み込む、配列番号15または16に示す塩基配列を基にした黒毛和種鑑定用プライマーセット。
9.配列番号17または18の1051番目の多型塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与えるように、前記多型塩基を挟み込む、配列番号17または18に示す塩基配列を基にした黒毛和種鑑定用プライマーセット。
10.配列番号19または20の633番目の多型塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与えるように、前記多型塩基を挟み込む、配列番号19または20に示す塩基配列を基にした黒毛和種鑑定用プライマーセット。
11.配列番号21または22の202〜204番目の多型塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与えるように、前記多型塩基を挟み込む、配列番号21または22に示す塩基配列を基にした黒毛和種鑑定用プライマーセット。
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