JP4943472B2 - ウシの品種の鑑別方法 - Google Patents
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Description
我国でも確認されるようになり、牛肉の安全性に対する消費者の不安から、一時、牛肉需要が激減した。また、外国産輸入牛肉を国産牛肉と偽称した事例に代表されるような、牛肉などの食品を不当な表示で販売するという不祥事も起きた。この偽称販売は輸入牛肉に対してだけではなく、国産牛肉に対しても行われている可能性を否定できない。例えば、上述の黒毛和種とホルスタイン種との第一代交雑種の毛色は、黒毛和種の毛色と見分けがつきにくいだけではなく、肉質も黒毛和種に近く、この第一代交雑種の中でも、特に肉質の良いものは黒毛和種とほとんど差が認められないこともある。このため、この第一代交雑種牛肉が、黒毛和種高級牛肉として偽称販売される可能性を否定することができない。
このような偽装を防止するため、農林水産省は素牛の誕生から市場までの流れをトレースできるシステム (トレーサビリティー) の構築に努めている。このシステムは、食肉の偽装販売を防ぎ、食肉の品質や安全性を保証する上でも重要な要素になると期待されている。また、このトレーサビリティーを補完する意味で、黒毛和種と第一代交雑種とを正しく鑑別する技術、ひいては牛品種を正しく鑑別する技術の確立が望まれている。しかし、現在に至るまで、科学的な手法に基づく客観的判定基準による品種鑑定技術は、実用化されていない。
。DNAの多型は遺伝標識として有用で、それをマーカーとして、家畜では、血統登録、個
体識別、親子判定、病原遺伝子のキャリア個体の除去などに利用されている。遺伝子多型の検索方法としては、特に限定されず、通常公知の方法、例えば、マイクロサテライト法、RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)法、Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) 法 (Vos, et al. 1995)等〔例えば、バイオマニュアルシリーズ1,遺伝子工学の基礎技術,山本 雅編,羊土社(1993)等を参照のこと]等や、これらの遺伝子検索方法の変法等を行うことが可能である。
、遺伝的類縁関係 (Nijiman, et al. 1999、Moreno, et al. 2002) 、QTL (quantitative
trait loci) 解析 (Otsen, et al. 1996) 、連鎖地図作成 (Barendse, et al. 1994、Lee, et al. 2002) 、cDNAを利用した発現遺伝子の解析 (Bracaccia, et al. 2001) などの幅広い研究に応用されており、本発明においても好適な遺伝子多型の検索法として応用することができる。すなわち、AFLP法 自体は、一度にゲノム全体の多型をスクリーニングするため、遺伝子座毎の遺伝子型の判定が不可能であるが、AFLP多型となっている原因(一塩基多型や、塩基の挿入若しくは欠損に基づく多型)を同定することにより、この同定情報を基に、PCR−RFLP法やハイブリダイズ法等により、被験牛の遺伝子型の判定を行うことが可能である。かかる遺伝子型の判定結果を集積して解析することにより、遺伝子頻度を推測し、牛の品種間の遺伝的構造の差異が予測することが可能となる。
本発明者は、黒毛和種と、ホルスタイン種またはホルスタイン種と黒毛和種の第一代交雑種(以下、F1ともいう)等とを峻別可能な遺伝子の多型マーカーを見つけだすために、AFLP法により、ホルスタイン種に高頻度で検出されるAFLP多型断片を中心に検索を行った。
種を51頭に増やして、2次スクリーニングを行った。
まず、牛の肝臓組織、リンパ節、血液(白血球)をホモジナイズした残渣を、ザルコシル、EDTAを含むTNE溶液に溶解後、Proteinase Kを加え、37℃で一晩インキュベートした
。次に、TE-フェノール抽出、フェノール/クロロフォルム/イソアミルアルコール抽出、
ジエチルエーテル抽出、およびエタノール沈殿によりDNAを抽出精製し、かかるDNAを遺伝子試料とした。
AFLP法における操作は、基本的には、Vosら (1995) の方法に従って行った。まず、500ngのDNAを制限酵素Taq IとEcoRIの組み合わせで切断し、表1に示したTaq IアダプターとEcoRIアダプターを付加し、これをPCRのためのテンプレートとした。PCR反応液は、アダプターを付加した鋳型DNA 溶液5μl、1×Ex Taq buffer、dNTP Mixture (0.2mM each)、TaKaRa Ex TaqTM Hot Start Version (1U)、1つの塩基を付加させたアダプターに特異的に結合する1st PCRプライマー(Taq IプライマーとEcoRIプライマー;表1参照)各75ngを含み、蒸留水で全量を50μlに調整した。1st PCR反応は、94℃ 30秒、56℃1分、72℃ 1分を1サイクルとして20サイクル繰り返した後、72℃ 10分の伸長反応を行った。なお、サーマルサイクラーは、PE BiosystemsのGeneAmp PCR system 9700Gを使用した。1st PCR産物は蒸留水で10倍希釈し−20℃で保存した。
合計500組のプライマーセットでスキャンニングした結果、黒毛和種に高頻度に検出され
た多型バンドが4本、ホルスタイン種に高頻度に検出された多型バンドが29本得られた(
図1参照)。これらのバンドが得られたプライマーセットを用い、黒毛和種50頭、ホルス
タイン種51頭に供試頭数を増やし2次スクリーニングを行ったところ、6種類のAFLP多型バンドの検出頻度が極端に偏っていた。よって、これら6種類の多型断片をBIMA(Breed Identified Markers derived from AFLP)1〜6とし、以降の解析を行った。
トを用いて、AFLPゲノムスキャニングを行った。その結果、さらに高精度の検出を可能とする5種類の新たな識別マーカー(BIMA7〜11)を得た。
次に、銀染色法により検出されたAFLP多型バンド(BIMA1〜11)をポリアクリルアミド
ゲルから切り出し、TE 20μlに浸してDNAを溶出させた。このDNA溶液をテンプレートとして2nd PCRと同じ条件でPCR反応を行い、1.5%アガロースゲルで20分間電気泳動した。UV
照射下でゲルからバンドを切り出し、Ultra CleanTM 15 DNA Purification Kit (MO BIO)
でDNAを抽出した。
)に挿入後、コンピテント大腸菌 (JM109)に導入し、抗生物質アンピシリン添加LB-アガ
ープレート上で、37℃で一晩培養した。プレートに生育した上記プラスミドで形質転換されたアンピシリン耐性の大腸菌のコロニーを滅菌爪楊枝で拾い上げ、少量を保存用プレートに殖菌した後、残りを0.2mg/ml Proteinase K、0.45% NP40、0.45% Tween20を含む溶
液でDNAを溶出させ、2nd PCRと同じ条件でPCR反応を行い、目的の断片がクローニングさ
れているか電気泳動により確認した。
ラスミドはアルカリ法で抽出し、RNase Aで混入しているRNAを分解後、フェノール/クロ
ロフォルム/イソアミルおよびジエチルエーテルで抽出後、エタノール沈殿したDNAを50μl 蒸留水に溶かした。
℃ 30秒、50℃ 15秒、70℃ 1分を1サイクルとして30サイクル繰り返した後、70℃ 7分間
の伸長反応を行い、ラベリングした。シークエンスにはLong Ranger Gelを用い、LI-COR
社DNAシーケンサーにて、0.8×TBE、2,000V、5時間以上通電し、解析した。
多型部位は、EcoRI、Taq Iの制限酵素認識部位である可能性があるため、AFLP多型断片の両端を含むフランキングサイトの塩基配列を、Universal GenomeWalkerTM Kit (BD Biosciences)を用いたPCR Walking法(Devic, et al. 1997)で決定した。無作為に選んだ黒毛和種1個体のDNAを、添付マニュアルに従い、Dra I、EcoRV、Pvu II、Stu Iの4種類の制限酵素で切断し、それぞれにGenome-Walker Adaptor(表2)をライゲーションし、ライブラリーを作成した。
ーPCRを行った。反応液は、1μlテンプレートDNA溶液、1×TthPCR Reaction Buffer、dNTP(0.2mM each)、1.1mM Mg(OAc)2、0.2μM Adaptor primer 1(表2)、0.2μM 1st PCR
プライマー(表3)、1×Advantage Genomic Polymerase Mixを含み、蒸留水で全量50μl
とし、94℃ 2秒、72℃ 3分を1サイクルとして7サイクル反応させた。この際、タッチダウンPCRにより67℃まで伸長反応の温度を下げた。その後、94℃ 2秒、67℃ 3分を1サイクルとして32サイクル反応させ、67℃で4分維持した。
片のクローニングと塩基配列の解析で用いられたクローニングおよびシークエンス方法と同様に、クローニング後、塩基配列を決定した。ただし、サブクローニングの確認は、PCR Walking法のセカンダリーPCRで使用したプライマーを用いた。
BIMA7〜11に対しても、同様の方法でフランキングサイトの塩基配列の決定を行った。
フランキングサイトの塩基配列に基づいて、制限酵素部位を挟みこめるプライマーセットを設計した。このプライマーセットを用いて黒毛和種とホルスタイン種のゲノムDNAでPCR反応を行った。反応条件は94℃ 2分間熱変性後、94℃ 30秒、65℃ 30秒、72℃ 1分を1
サイクルとして30サイクル反応させた後、72℃ 7分、伸長反応した。得られた産物はアガロースゲルから回収し、SILVER SEQUENCETM DNA Sequencing Reagentsを用い、添付プロ
トコールに従ってシーケンス反応を行い、銀染色法でバンドを検出した。シークエンス解析の結果から黒毛和種とホルスタイン種の塩基配列を比較し、BIMA1〜11の多型断片にお
いて多型の原因となっている変異を特定したところ、制限酵素認識部位の変異が原因であったものが8種類 (EcoRIが3種類、Taq Iが5種類)、欠失によるものが3種類であった。
種型に分けて開示する。
片(BIMA1a:配列番号1)であり、(2)は、黒毛和種型の断片(BIMA1b:配列番号2)である。図2により、BIMA1の多型断片における多型は、黒毛和種のウシの遺伝子DNA
における、配列番号2に示す塩基配列の164〜166番目における遺伝子多型が、「CTC」であるか、または、当該3塩基の欠失であるか、により表現される多型であることがわかる。
片(BIMA2a:配列番号3)であり、(2)は、黒毛和種型の断片(BIMA2b:配列番号4)である。図3により、BIMA2の多型断片における多型は、黒毛和種のウシの遺伝子DNA
における、配列番号4に示す塩基配列の589番目の塩基における遺伝子多型が、「G]であるか、または、「A」であるか、により表現される多型であることがわかる。
片(BIMA3a:配列番号5)であり、(2)は、黒毛和種型の断片(BIMA3b:配列番号6)である。図4により、BIMA3の多型断片における多型は、黒毛和種のウシの遺伝子DNA
における、配列番号6に示す塩基配列の560〜568番目の塩基における遺伝子多型が、「ACCCTCAGG」であるか、または、当該9塩基の欠失であるか、により表現される多型であることがわかる。
片(BIMA4a:配列番号7)であり、(2)は、黒毛和種型の断片(BIMA4b:配列番号8)である。図5により、BIMA4の多型断片における多型は、黒毛和種のウシの遺伝子DNA
における、配列番号8に示す塩基配列の445番目の塩基における遺伝子多型が、「C」であるか、または、「G」であるか、により表現される多型であることがわかる。
片(BIMA5a:配列番号9)であり、(2)は、黒毛和種型の断片(BIMA5b:配列番号10)である。図6により、BIMA5の多型断片における多型は、黒毛和種のウシの遺伝子DNA
における、配列番号10に示す塩基配列の344番目の塩基における遺伝子多型が、「C」であるか、または、「G」であるか、により表現される多型であることがわかる。
片(BIMA6a:配列番号11)であり、(2)は、黒毛和種型の断片(BIMA6b:配列番号12)である。図7により、BIMA6の多型断片における多型は、黒毛和種のウシの遺伝子DNA
における、配列番号12に示す塩基配列の524番目の塩基における遺伝子多型が、「A」であるか、または、当該塩基の欠失であるか、により表現される多型であることがわかる。
」であるか、または、「T」であるか、により表現される多型であることがわかる。
配列番号1の全塩基数は762であり、かつ、配列番号2の第164〜166番目に該当する部分を欠落部分としてカウントして表示する」こととする。
本発明は、下記1〜11で表されるウシの遺伝子の多型のうち、1種または2種以上の多型を指標として、被験牛の遺伝子DNAを検出することにより、当該被験牛が黒毛和種であるか否かを鑑別する、ウシの品種の鑑別方法(以下、本鑑別方法ともいう)を提供する発明である。
589番目の塩基「G」における遺伝子多型(以下、多型2ともいう)である。
多型2は、典型的には、当該遺伝子多型が、「G」であるか、または、「A」であるか、により表現される多型である。
多型4は、典型的には、当該遺伝子多型が、「C」であるか、または、「G」であるか、により表現される多型である。
の344番目の塩基「C」における遺伝子多型(以下、多型5ともいう)である。
9.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号18(BIMA9b)に示す塩基配列の1051番目の塩基における遺伝子多型(以下、多型9ともいう)である。
列の633番目の塩基における遺伝子多型(以下、多型10ともいう)である。
列の202〜204番目の塩基における遺伝子多型(以下、多型11ともいう)である。
本鑑別方法は、特に、被験牛が黒毛和種牛であるか、または、ホルスタイン種牛、若しくは、ホルスタイン種牛と黒毛和種牛の第一代交雑種であるか、を鑑別することができる方法として用いることが有用である。
の多型に基づく異なるアリルタイプを見出して完成された発明であり、被験牛の品種を的確、かつ、多様な観点から鑑別することが可能である。
本鑑別方法により、以下の観点から、被験牛の品種を鑑別することができる。
(第1段階)
被験牛における、多型1および/または6を検出し、当該遺伝子多型が非黒毛和種型を
示す場合には、当該被験牛を非黒毛和種と判定し、
(第2段階)
第1段階において、多型1および/または6の遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、第2段階として、多型2、4および5からなる群から選ばれる2若しくは3種の遺伝子多型を検出し、当該遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、当該被験牛を黒毛和種と判定する。
(第1段階)
被験牛における、多型7および/または8を検出し、当該遺伝子多型が非黒毛和種型を
示す場合には、当該被験牛を非黒毛和種と判定する工程である。
第1段階において、多型7および/または8の遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、第2段階として、多型1〜6、および、多型9〜11からからなる群から選ばれる2種以上の遺伝子多型を検出し、当該遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、当該被験牛を黒毛和種と判定する工程である。
本発明において見出されたBIMA1〜11における多型と、他の遺伝子の多型に対する情報
を組み合わせることによって、さらに多様な牛の品種の鑑別を行うことが可能である。
さらに、本発明は、本鑑別方法を行うための検出用キット(以下、本検出用キットともいう)を提供する発明である。
ライマーとして用いることができるヌクレオチド鎖。
5、好ましくは15〜40のヌクレオチド鎖が挙げられる(この態様のヌクレオチド鎖を、遺伝子増幅用プライマーの対の一方として用いて、被験牛の遺伝子を増幅して得られる遺伝子増幅産物を、所望するアリルタイプの判別情報として用いることができる)。
次に、多型部分の変異の種類に応じて、PCRやミスマッチPCR-RFLPなどによる大量試料
について簡便に遺伝子型判別を解析できる方法を構築した(表4、図14)。
反応液は、ゲノムDNA 50ng、1×PCR buffer、dNTP mixture (0.2mM each)、各プライマー 10pmol、DNA polymerase 1U (TaKaRa Ex TaqTM Hot Start Version) を含み、蒸留水で全量20μlとした。基本的なPCRの条件は、94℃ 2分熱変性後、94℃ 30秒、65(or 55)℃ 30秒、72℃ 1分を1サイクルとして30サイクル反応後、72℃ 7分の伸長反応を行った。ただし、増幅しにくいプライマーについては、65℃のアニーリング温度を62℃に下げて行った。PCR-RFLPを行うマーカーについては、以下の反応を行った。反応液は、PCR産物 10μl、制限酵素バッファー 3μl、制限酵素EcoRIまたはTaqI 5unitを含み蒸留水で全量30μlとし、EcoRIで切断するものは37℃、TaqIで切断するものは65℃でそれぞれ12時間以上インキュベートした。BIMA2、4、5、6の反応液は、3%アガロースゲルで100V、30分間、電気泳動後、エチジウムブロマイド染色によりバンドを検出した。BIMA1と3のPCR産物は、5%ポリアクリルアミドゲルで、1,800V、2時間、電気泳動後、銀染色(Silver sequence DNA staining reagents:Promega社)によりバンドを検出した。なお、ミスマッチPCR-RFLPとは、PCRプライマーセットの一方に、作為的に一塩基の置換を入れたプライマーを用いることで(表4参照)、RFLPで使用する制限酵素で認識される塩基配列をプライマー領域に持つPCR産物を作り出し、多型部分が制限酵素で切断されないアリルを鋳型としたPCR産物であっても、この部分が必ず切断される方法である(図14)。これは、PCR反応および制限酵素処理が正常に起きていることを裏付ける内部指標となる。
ゲノムDNA(10ng/μl)5μl、10×PCR buffer(100mM Tris-HCl, 15mM MgCl, 500mM KCl ;
pH8.6) 2.0μl、dNTP Mixture(2.5mM each)1.6μl、TaKaRa Ex TaqTMHot Start Version(5unit/μl)0.08μl、Forwardプライマー 10ngとReverseプライマー10ngをそれぞれ加え
、超純水で全量を20μlとして反応を行った。PCRの条件は基本的には以下のように設定した。94℃ 2分後、94℃30秒、65℃ 30秒、72℃ 1分を1サイクルとして30サイクル繰り返した後、72℃ 7分の伸長反応を行った。ただし、PCR増幅がしにくいプライマーについては
、65℃のアニーリング温度を下げて行った。
プロトコールに従った。
・2H2O 9.3g) 8.4ml、Long Ranger(R) Gel Solution 8.4ml、これに超純水を加えてよく撹拌し、尿素が完全に溶けた後、超純水を加えて全量を70mlにした。この溶液を0.45μm
のフィルターで濾過し、10分間脱気した。これに10%APS 350μl、TEMED 35μlを加え、
ゲル板にゆっくり流し込み、上部にコームを差し込み2時間以上放置した。電気泳動は、
スラブ型電気泳動装置を用いた。bufferには0.6×TBEを使用し、1,800Vで行った。
この方法を用いて、黒毛和種100頭、ホルスタイン種100頭およびF1 90頭について、各
マーカーでの遺伝子型頻度と遺伝子頻度を調べた(表5)。黒毛和種やホルスタイン種か
ら検出されたBIMAマーカーの遺伝子頻度は、F1においてほぼ半分の値を示した。この事から、各BIMAマーカーは、黒毛和種とホルスタイン種の集団において、ここで示された遺伝子頻度と同等の頻度で分布していることが示唆された。
また、同様の方法を用いて、(1)とは別個に黒毛和種296頭、ホルスタイン種10
0頭およびF196頭について、各マーカーでの遺伝子型頻度と遺伝子頻度を調べた(表6
)。
(1)BIMA1〜6
まず、黒毛和種においてアリルaの遺伝子頻度が小さいマーカーであるBIMA1と6をタイ
プIマーカー、ホルスタイン種においてBIMA1と6以外でアリルaの遺伝子頻度が高いマーカーであるBIMA2、4、5をタイプIIマーカーとした。これらのマーカーを組み合わせたときのF1の検出率と黒毛和種を誤ってF1と判定してしまう危険率を、表5の結果を用いてそれぞれ計算したところ、タイプIマーカー群では検出率73.01%、危険率1.00%(表7)、タイプIIマーカー群では検出率56.27%、危険率1.98%(表8)であった。
式:1−0.7301=0.2699
で表され、これに対して検出率56.27%のタイプIIマーカーを適用すると、新たに検出されるF1は、
式:0.2699×0.5627=0.1519
で表される。これは、タイプIマーカーで検出された個体以外に、新たに検出されるF1全
体に対する割合なので、全体の検出率は、
式:0.7301+0.1519=0.8820
で表され、F1全体の88.20%でアリルaが検出される、すなわち、検出率88.20%となる。
述の定義より、3マーカーのうちいずれか2個で検出される黒毛和種の割合と3マーカー全てで検出される割合を加えたものが危険率となる。すなわち、2マーカーで検出される組
み合わせである、BIMA2×4、BIMA4×5、BIMA5×2の危険率から、3マーカー全てで検出さ
れるBIMA2×4×5の危険率が重複する分を差し引いたものであるから、
式:0.088×0.107+0.107×0.0591+0.0591×0.088−2×0.088×0.107×0.0591=0.0198
で計算される。これを信頼度で表現する場合は、
式:1−0.0198=0.9802
で与えられ、98.02%となる。
の信頼度で鑑定可能と評価された。ただし、危険率は検出されたマーカー数および種類により変動するため、あくまで信頼度が低くなる場合の組み合わせにおける値として示した。
上記(1)の方法に準じて、BIMA1〜11の鑑定能についての検討を行った。その結果、こ
れらのマーカーを用いた場合の最高の品種鑑定能を得るマーカーの組み合わせは、BIMA1
、BIMA7、BIMA8、BIMA11を用いた場合であることが明らかとなった。その精度は、F1の検
出率91.7%、誤判別率0.7% (信頼度99.3%)であった。F1の検出率が向上すると共に、信頼度も98%から、99.3%に向上した。
のほとんどが黒毛和種であることを考えると、この誤判別率を減少できたことは重要である。
であることが明らかとなった。その精度は、ホルスタイン種の検出率99.3%、誤判別率0.7% (信頼度99.3%)であった。また2種類のみのマーカーを用いた場合(BIMA7,8)では、検出率81.1%、誤判別率0% (信頼度100%)であった。
Claims (9)
- 下記1、7、8、および、11で表されるウシの遺伝子の多型を指標として、被験牛の遺伝子DNAを検出して当該多型遺伝子がホモ型またはヘテロ型であるかを判定し、全ての判定結果の組み合わせにより、当該被験牛が、黒毛和種牛であるか、または、ホルスタイン種牛、若しくは、ホルスタイン種牛と黒毛和種牛の第一代交雑種であるか、を鑑別するウシの品種の鑑別方法。
1.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号2に示す塩基配列の164〜166番目の塩基が、「CTC」(黒毛和種型)であるか、または、当該3塩基の欠失(ホルスタイン型)であるか、により表現される遺伝子多型。
7.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号14に示す塩基配列の734番目の塩基が、「C」(黒毛和種型)であるか、または、「T」(ホルスタイン型)であるか、により表現される遺伝子多型。
8.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号16に示す塩基配列の1212番目の塩基が、「T」(黒毛和種型)であるか、または、「C」(ホルスタイン型)であるか、により表現される遺伝子多型。
11.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号22に示す塩基配列の202〜204番目の塩基が、「TGG」(黒毛和種型)であるか、または、当該3塩基の欠失(ホルスタイン型)であるか、により表現される遺伝子多型。 - 前記ウシの品種の鑑別方法において、下記(1)、(2)、(3)、および、(4)に従うことを特徴とする、請求項1記載のウシの品種の鑑別方法。
(1) 1で表される遺伝子多型を、配列番号1および2の164〜166番目の塩基部分に対して遺伝子増幅法を用いることにより得られる遺伝子増幅産物により検出する。
(2) 7で表される遺伝子多型を、配列番号13および14の734番目の塩基部分に対して遺伝子増幅法を用いることにより得られる遺伝子増幅産物により検出する。
(3) 8で表される遺伝子多型を、配列番号15および16の1212番目の塩基部分に対して遺伝子増幅法を用いることにより得られる遺伝子増幅産物により検出する。
(4) 11で表される遺伝子多型を、配列番号21および22の202〜204番目の塩基部分に対して遺伝子増幅法を用いることにより得られる遺伝子増幅産物により検出する。 - さらに下記6および9で表されるウシの遺伝子の多型を指標として、被験牛の遺伝子DNAを検出して当該多型遺伝子がホモ型またはヘテロ型であるかを判定することを特徴とする、請求項1または2記載のウシの品種の鑑別方法。
6.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号12に示す塩基配列の524番目の塩基が、「A」(黒毛和種型)であるか、または、当該塩基の欠失(ホルスタイン型)であるか、により表現される遺伝子多型。
9.黒毛和種のウシの遺伝子DNAにおける、配列番号18に示す塩基配列の1051番目の塩基が、「G」(黒毛和種型)であるか、または、「A」(ホルスタイン型)であるか、により表現される遺伝子多型。 - 前記ウシの品種の鑑別方法において、下記(a)および(b)に従うことを特徴とする、請求項3記載のウシの品種の鑑別方法。
(a) 6で表される遺伝子多型を、配列番号11および12の524番目の塩基部分に対して遺伝子増幅法を用いることにより得られる遺伝子増幅産物により検出する。
(b) 9で表される遺伝子多型を、配列番号17および18の1051番目の塩基部分に対して遺伝子増幅法を用いることにより得られる遺伝子増幅産物により検出する。 - 遺伝子多型の検出は、インベーダー・アッセイ法、SSCP法、RFLP法、HET法、DGGE法、DS法、CCM法、CDI法、PCR−SSCP法、または、PCR/ GC−clamp 法、によって行われる、請求項1〜4のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
- 下記1、7、8、および、11で表される塩基数が15〜40である、請求項1、2、および、5のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法を行うために用いる、黒毛和種鑑定用プライマーセットの組合せ。
1.配列番号1および2の164〜166番目の多型塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与えるように、前記多型塩基を挟み込む、配列番号1または2に示す塩基配列を基とした黒毛和種鑑定用プライマーセット。
7.配列番号13および14の734番目の多型塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与えるように、前記多型塩基を挟み込む、配列番号13または14に示す塩基配列を基にした黒毛和種鑑定用プライマーセット。
8.配列番号15および16の1212番目の多型塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与えるように、前記多型塩基を挟み込む、配列番号15または16に示す塩基配列を基にした黒毛和種鑑定用プライマーセット。
11.配列番号21および22の202〜204番目の多型塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与えるように、前記多型塩基を挟み込む、配列番号21または22に示す塩基配列を基にした黒毛和種鑑定用プライマーセット。 - 下記1、6、7、8、9、および、11で表される塩基数が15〜40である、請求項3、4、および、5のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法を行うために用いる、黒毛和種鑑定用プライマーセットの組合せ。
1.配列番号1および2の164〜166番目の多型塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与えるように、前記多型塩基を挟み込む、配列番号1または2に示す塩基配列を基とした黒毛和種鑑定用プライマーセット。
6.配列番号11および12の524番目の多型塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与えるように、前記多型塩基を挟み込む、配列番号11または12に示す塩基配列を基とした黒毛和種鑑定用プライマーセット。
7.配列番号13および14の734番目の多型塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与えるように、前記多型塩基を挟み込む、配列番号13または14に示す塩基配列を基にした黒毛和種鑑定用プライマーセット。
8.配列番号15および16の1212番目の多型塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与えるように、前記多型塩基を挟み込む、配列番号15または16に示す塩基配列を基にした黒毛和種鑑定用プライマーセット。
9.配列番号17および18の1051番目の多型塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与えるように、前記多型塩基を挟み込む、配列番号17または18に示す塩基配列を基にした黒毛和種鑑定用プライマーセット。
11.配列番号21および22の202〜204番目の多型塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与えるように、前記多型塩基を挟み込む、配列番号21または22に示す塩基配列を基にした黒毛和種鑑定用プライマーセット。 - 請求項6に記載の黒毛和種鑑定用プライマーセットの組合せを構成要素として含む、請求項1、2、および、5のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法を行うための、遺伝子検出用キット。
- 請求項7に記載の黒毛和種鑑定用プライマーセットの組合せを構成要素として含む、請求項3、4、および、5のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法を行うための、遺伝子検出用キット。
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