JP4247737B2 - 細胞固定用基板の製造方法および細胞固定用基板 - Google Patents
細胞固定用基板の製造方法および細胞固定用基板 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4247737B2 JP4247737B2 JP2003065208A JP2003065208A JP4247737B2 JP 4247737 B2 JP4247737 B2 JP 4247737B2 JP 2003065208 A JP2003065208 A JP 2003065208A JP 2003065208 A JP2003065208 A JP 2003065208A JP 4247737 B2 JP4247737 B2 JP 4247737B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell
- substrate
- laminate
- hydrophilic polymer
- hydrophobic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0068—General culture methods using substrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2535/00—Supports or coatings for cell culture characterised by topography
- C12N2535/10—Patterned coating
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Photosensitive Polymer And Photoresist Processing (AREA)
- Exposure And Positioning Against Photoresist Photosensitive Materials (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞を固定することのできる細胞固定用基板を製造する方法および細胞固定用基板に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、医療分野および農業分野などにおいては、例えば核酸などの生体分子を研究対象として用いる生化学系の研究が進められている。
【０００３】
このような研究においては、例えば多数の生体分子を整列した状態で固定することのできる生体分子固定用基板を作製し（例えば、特許文献１〜特許文献２参照。）、この生体分子固定用基板上において生体分子の検査や合成などの実験が行われている。
【０００４】
また、最近は、核酸などの生体分子だけではなく、細胞が研究対象とされてきていることから、この細胞に係る実験を、生体分子固定用基板のような、研究対象である細胞を固定することのできる基板を用いて行いたいとの要請があるが、多数の細胞を整列した状態で固定するための基板を容易に製造するための方法は知られていない。
【０００５】
【特許文献１】
特開２０００−２０６７０２号公報
【特許文献２】
特開２００１−３２４８１６号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、以上のような事情に基づいてなされたものであって、その目的は、特定位置に細胞を固定することのできる細胞固定用基板を容易に製造することのできる方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、特定位置に細胞を固定することのできる細胞固定用基板を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の細胞固定用基板の製造方法は、疎水性樹脂基材の表面において親水性重合体層を形成することにより得られる積層体に対して、パターンマスクを介して光源から放射される紫外線を照射することにより、当該パターンマスクのパターンに対応する積層体の紫外線照射領域において、親水性重合体層部分および当該親水性重合体層部分と疎水性樹脂基材よりなる疎水性樹脂基材層部分との界面に存在する化学反応物を除去して疎水性樹脂基材に由来の疎水性表面を露出させる積層体処理工程と、
積層体処理工程において得られた基板材料に対して、下記（１）〜（３）のいずれかの表面処理を行う表面処理工程を有することを特徴とする。
（１）エキシマランプまたは低圧水銀ランプから放射される紫外線を照射する紫外線照射処理
（２）酸素プラズマ処理
（３）不活性ガスプラズマ処理
【００１１】
本発明の細胞固定用基板の製造方法においては、疎水性表面が露出されてなる底面を有する窪みを制御された形状で形成することが好ましい。
【００１２】
本発明の細胞固定用基板は、上記の細胞固定用基板の製造方法によって得られることを特徴とする。
【００１３】
【作用】
本発明の細胞固定用基板の製造方法によれば、疎水性樹脂基材層および親水性重合体層を有する積層体に対して、パターンマスクを介して紫外線を照射し、当該パターンマスクに対応する積層体の紫外線照射領域において親水性重合体層部分および当該親水性重合体層部分と疎水性樹脂基材層部分との界面に存在する化学反応物を除去して疎水性樹脂基材に由来の疎水性表面を露出させることにより、細胞が吸着されない非細胞吸着特性を有する親水性表面と、細胞が吸着される細胞吸着特性を有する疎水性表面とにより構成されるパターンを、当該疎水性表面において細胞を捕捉して固定する細胞捕捉部が所望の位置に配置されるよう形成することができるため、特定位置に細胞を固定することのできる細胞固定用基板を容易に得ることができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の細胞固定用基板の製造方法は、細胞を固定することのできる基板を形成するための方法であって、疎水性樹脂基材の表面において親水性重合体層を形成することにより得られる積層体に対してパターンマスクを介して紫外線を照射する積層体処理工程と、この積層体処理工程において得られた基板材料に対して特定の後処理を行う表面処理工程を有するものである。
以下、各工程について説明する。
【００１５】
（積層体処理工程）
先ず、例えばポリスチレンなどの疎水性樹脂よりなる、例えば厚さ１ｍｍの平板状の疎水性樹脂基材の表面に、例えばアクリルアミドなどの単量体よりなる親水性重合体材料を含有する親水性重合体材料含有溶液を塗布し、得られた塗膜に対して、例えば電子ビームを照射することにより、親水性重合体材料（この例においてはアクリルアミド）を重合処理し、例えば厚さ２０ｎｍの親水性重合体層１２を形成する。
このようにして、図１に示すように、疎水性樹脂基材よりなる疎水性樹脂基材層１１と、親水性重合体層１２とが積重してなる積層体（以下、「特定の積層体」ともいう。）１０が得られるが、この特定の積層体１０においては、塗膜を構成している親水性重合体材料の重合処理の際、親水性重合体材料と、疎水性樹脂基材を構成している疎水性樹脂とが塗膜と疎水性樹脂基材との界面において反応して生成した化学反応物が、疎水性樹脂基材層１１と親水性重合体層１２との界面に存在している。
【００１６】
次いで、図２に示すように、特定の積層体１０を構成する親水性重合体層１２の上方（図２において上方）に、光源ランプ（図示せず）を配置すると共に、最終的に得られる細胞固定用基板における細胞を固定する細胞捕捉部に対応する位置および当該細胞捕捉部の形状に対応する開口１５Ａを有するパターン（以下、「特定の開口パターン」ともいう。）が形成されたパターンマスク１５を用意し、特定の積層体１０の親水性重合体層１２と光源ランプとの間に形成される領域１９の所定の位置に配置する。
【００１７】
そして、光源ランプを点灯状態とし、パターンマスク１５を介して、特定の積層体１０に対して光源ランプから放射された紫外線を親水性重合体層１２側の表面（図２において上面）から照射する。
【００１８】
このようにして、特定の積層体１０に対する紫外線の照射をパターンマスク１５を介して行うことにより、当該特定の積層体１０におけるパターンマスク１５の開口１５Ａと対応する領域に選択的に紫外線が照射されることとなり、このパターンマスク１５の特定の開口パターンに対応する紫外線照射領域において、親水性重合体層部分および当該親水性重合体層部分の下方に存在している化学反応物が揮発（アブレーション）され、更に必要に応じて疎水性樹脂基材層１１の表面層部分が除去され、これにより、特定の積層体１０に、疎水性樹脂基材層１１を構成する疎水性樹脂基材に由来の疎水性表面が露出された状態の底面２１Ａを有する、例えば深さ１００ｎｍの微小な窪み（以下、「微小窪み」ともいう。）２１が、パターンマスク１５の特定の開口パターンに応じて形成される。
【００１９】
積層体処理工程において得られた微小窪み２１を有する基板材料２０は、形成されたすべての微小窪み２１が、その底面２１Ａ全面において完全に疎水性表面が露出された状態にある場合には、それらの微小窪み２１の各々は底面２１Ａ全面で細胞を吸着することができるために十分な細胞捕捉性能が得られることから、当該微小窪み２１はそのままの状態で細胞捕捉部として有効であり、従ってこの細胞捕捉部において細胞を固定する細胞固定用基板として用いることができる。
しかしながら、例えば図３（イ）に示すように、揮発処理によって除去された親水性重合体層部分または化学反応物に由来の付着物２４が微小窪み２１の表面に再付着したり、図３（ロ）に示すように、微小窪み２１の表面に再付着した付着物２４に由来する副生成物によって当該微小窪み２１の表面の一部または全部を覆う層（図３（ロ）においては全部を覆う層）２５が形成されたり、あるいは、化学反応物が完全に除去されずに残存することなどが原因となって、基板材料２０が、底面２１Ａの一部または全部が完全に露出されていない状態となっている微小窪み２１を有している場合がある。
このような理由から、積層体処理工程の後に、更に、前述の付着物２４、層２５および残存してる化学反応物などよりなる被覆物を除去するための後処理を行うことが好ましい。
【００２０】
（表面処理工程）
図４に示すように、基板材料２０の上方（図４において上方）に、エキシマランプまたは低圧水銀ランプよりなる表面処理用ランプ４１と、反射ミラー４２とを備えた表面処理用ランプ装置４０を配置し、例えば大気中などの酸素またはオゾンを含有する雰囲気中において、この表面処理用ランプ４１を、例えば表面処理用ランプ４１としてエキシマランプを用いる場合には、波長１７２ｎｍに係る照度が１０ｍＷ／ｃｍ2 となる条件で、また、表面処理用ランプ４１として低圧水銀ランプを用いる場合には、波長１８５ｎｍに係る照度が１５ｍＷ／ｃｍ2 となる条件で点灯状態とし、基板材料２０の微小窪み２１が形成されている面（図４において上面）全面に対して一斉に表面処理用ランプ４１から放射された紫外線を、例えば数秒間照射する。
【００２１】
このような処理においては、酸素またはオゾンが紫外線と作用することによって活性酸素が発生し、この活性酸素と被覆物が接触して当該被覆物が活性酸素による酸化反応によって灰化（アッシング）されて除去され、これにより、基板材料２０において、すべての微小窪み２１が、その底面２１Ａ全面において疎水性表面が完全に露出された状態となる。
【００２２】
以上のように、積層体処理工程、および必要に応じて表面処理工程を経ることにより、親水性重合体層１２よりなる親水性表面を有すると共に、パターンマスク１５の特定の開口パターンに係る所望のパターン状に形成された、疎水性表面が露出された状態の底面２１Ａを有する微小窪み２１よりなる細胞捕捉部３１を有する細胞固定用基板３０（図５参照）が形成される。
【００２３】
疎水性樹脂基材としては、ポリスチレンよりなるものを好適に用いることができるが、例えばポリエチレンテレフタレートなどよりなるものを用いることもできる。
また、疎水性樹脂基材の厚さは、通常、０．５〜３ｍｍであることが好ましい。
【００２４】
親水性重合体材料含有溶液としては、例えば水、エタノールなどの溶媒中に、親水性重合体材料を溶解させてなるものを用いることができる。
親水性重合体材料としては、アクリルアミドを好適に用いることができる。
【００２５】
特定の積層体１０においては、親水性重合体層１２の厚さは、通常、５０〜５００ｎｍであることが好ましい。
【００２６】
光源ランプとしては、紫外線を放射するランプを用いることができ、具体的には、例えば少なくとも波長２１４ｎｍ、２１５ｎｍ、２１９ｎｍおよび２２０ｎｍのいずれかの近辺、特に波長２１４ｎｍおよび２１９ｎｍのいずれかの近辺に輝線を有するランプを好適に用いることができる。
【００２７】
また、特定の積層体１０が、ポリアクリルアミドよりなる親水性重合体層１２を有するものである場合には、光源として、少なくともカドミウムと希ガスとを発光管内に封入した波長２００〜２３０ｎｍの範囲内に輝線を有するショートアークランプを用いることが好ましい。このようなショートアークランプとしては、例えば特許第３０２０３９７号公報に開示されている構成のものを用いることができる。
【００２８】
パターンマスク１５としては、例えば透明基板１７上に、特定の開口パターンを有する金属蒸着膜１８が形成されてなるフィルターを用いることができる。
パターンマスク１５における開口１５Ａの外径は、最終的に得られる細胞固定用基板３０の細胞捕捉部３１を構成する微小窪み２１の外径に対応することから、当該細胞固定用基板３０が固定すべき細胞の種類、および一の細胞捕捉部３１において固定すべき細胞の個数などによって異なるが、通常、３０〜５０μｍである。
【００２９】
表面処理用ランプ４１としては、エキシマランプまたは低圧水銀ランプが用いられるが、具体的に、波長１７２ｎｍに輝線を有するエキシマランプおよび波長１８５ｎｍに輝線を有する低圧水銀ランプを好適に用いることができる。
【００３０】
以上のような細胞固定用基板の製造方法によれば、疎水性樹脂基材層１１および親水性重合体層１２を有する特定の積層体１０に対して、特定の開口パターンが形成されたパターンマスク１５を介して光源ランプから放射される紫外線を照射することにより、特定の開口パターンに対応する特定の積層体１０の紫外線照射領域において親水性重合体層部分および当該親水性重合体層部分と疎水性樹脂基材層部分との界面に存在する化学反応物を除去し、更に疎水性樹脂基材層１１の表面層部分を除去して、疎水性表面を露出させることにより、親水性重合体層１２よりなる、細胞が吸着されない非細胞吸着特性を有する親水性表面を備えた特定の積層体１０に、細胞が吸着される細胞吸着特性を有する疎水性表面が露出された状態の底面２１Ａを備えた微小窪み２１よりなる細胞捕捉部３１を、パターンマスク１５の特定の開口パターンに係る所望のパターン状に形成することができることから、当該細胞捕捉部３１よりなる特定位置において細胞を固定することのできる細胞固定用基板３０を容易に得ることができる。
【００３１】
また、特に、表面処理工程を経ることにより、積層体処理工程において形成されたすべての微小窪み２１を、その底面２１Ａ全面において完全に疎水性表面が露出された状態とすることができるため、最終的に得られる細胞固定用基板３０は、すべての細胞捕捉部３１を構成する微小窪み２１の各々の底面２１Ａ全面において細胞を吸着することができるものとなる。従って、細胞捕捉部３１が十分な細胞捕捉性能を有し、当該細胞捕捉部３１において細胞を確実に捕捉することができる細胞固定用基板３０を得ることができる。
【００３２】
更に、例えば積層体処理工程に供する特定の積層体１０の親水性重合体層１２の厚みを制御すること、積層体処理工程に供するパターンマスク１５の開口１５Ａの形状を制御すること、積層体処理工程において特定の積層体１０に対する紫外線照射条件を制御することなどによって微小窪み２１を制御された形状で形成することにより、最終的に得られる細胞固定用基板３０を、細胞捕捉部３１よりなる特定位置に特定数の細胞を固定することができるものとすることができる。
【００３３】
具体的には、例えば図５に示すように、固定すべき細胞（以下、「対象細胞」ともいう。）３５の大きさに適用した外径を有すると共に、１個の対象細胞３５が、当該細胞固定用基板３０の微小窪み２１よりなる細胞捕捉部３１に捕捉されて固定された際に、当該対象細胞３５が細胞固定用基板３０の表面（図５において上面）３０Ａから突出した状態となるような深さを有するという制御された形状の微小窪み２１を形成することにより、最終的に得られる細胞捕捉用基板３０を、細胞捕捉部３１において１個の対象細胞を固定するものとすることができる。
【００３４】
この製造方法によって得られる細胞固定用基板３０は、細胞捕捉部３１が形成されてなる特定位置に選択的に細胞を固定することのできるものであることから、例えば複数の細胞を整列した状態で固定することができる。
具体的に、多数の細胞捕捉部３１が形成されている細胞固定用基板３０においては、例えば当該細胞固定用基板３０上に、固定すべき細胞（以下、「対象細胞」ともいう。）を多数個含有する生理食塩水を滴下すると、対象細胞は、各々、非細胞吸着特性を有する親水性表面よりなる表面３０Ａ上には留まらず、細胞捕捉部３１の疎水性表面が露出している底面２１Ａを有する微小窪み２１内において、当該底面２１Ａに接触することによって捕捉され、当該細胞捕捉部３１に固定される。
ここに、各細胞捕捉部３１を構成する微小窪み２１が制御された形状で形成され、固定すべき特定数の対象細胞に適用した形状を有するものである場合には、当該細胞捕捉部３１に特定数以上の対象細胞が固定されることはない。
【００３５】
以上、本発明について説明したが、本発明においては種々の変更を加えることができる。
例えば、表面処理工程においては、真空条件が不要であることから低コストにて表面処理を行うことができるため、エキシマランプまたは低圧水銀ランプを用いた紫外線照射による酸化洗浄処理によって被覆物の除去を行う手法を用いること好ましいが、下記の（Ａ）または（Ｂ）の手法によっても基板材料から被覆物を除去し、すべての微小窪みを、その底面全面において疎水性表面が露出された状態とすることができる。
【００３６】
（Ａ）基板材料を酸素プラズマ雰囲気にさらしてプラズマ処理することにより、被覆物を化学洗浄処理によって除去する手法
（Ｂ）基板材料を、例えばアルゴンガスプラズマなどの不活性ガスプラズマ雰囲気にさらしてプラズマ処理することにより、被覆物を物理的に除去する手法
【００３７】
【発明の効果】
本発明の細胞固定用基板の製造方法によれば、疎水性樹脂基材層および親水性重合体層を有する積層体に対して、パターンマスクを介して紫外線を照射し、当該パターンマスクに対応する積層体の紫外線照射領域において親水性重合体層部分および当該親水性重合体層部分と疎水性樹脂基材層部分との界面に存在する化学反応物を除去して疎水性樹脂基材に由来の疎水性表面を露出させることにより、細胞が吸着されない非細胞吸着特性を有する親水性表面と、細胞が吸着される細胞吸着特性を有する疎水性表面とにより構成されるパターンを、当該疎水性表面において細胞を捕捉して固定する細胞捕捉部が所望の位置に配置されるよう形成することができるため、特定位置に細胞を固定することのできる細胞固定用基板を容易に得ることができる。
【００３８】
また、表面処理工程を経る製造方法によれば、積層体処理工程において得られた基板材料に対して特定の処理を行うことにより、疎水性表面を被覆している状態の被覆物が除去され、当該疎水性表面を完全に露出された状態とすることができることから、最終的に得られる細胞固定用基板を、確実にすべての細胞捕捉部が十分な細胞捕捉性能を有するものとすることができる。
【００３９】
本発明の細胞固定用基板は、細胞が吸着されない非細胞吸着特性を有する親水性表面と、細胞が吸着される細胞吸着特性を有する疎水性表面とを備え、当該疎水性表面において細胞を捕捉して固定する細胞捕捉部が所望のパターン状に形成されたものであることから、特定位置に細胞を固定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】疎水性樹脂基材上に親水性重合体層が形成された状態を示す説明図である。
【図２】積層体に光源から放射された紫外線を照射することによって窪みが形成された状態を示す説明用断面図である。
【図３】（イ）は、基板材料の窪みに付着物が付着している状態を示す説明用断面図であり、（ロ）は、基板材料の窪みにその表面を覆う層が形成されている状態を示す説明用断面図である。
【図４】基板材料の上方に表面処理用ランプと反射ミラーとを備えた表面処理用ランプ装置を配置した状態を示す説明用断面図である。
【図５】本発明の細胞固定用基板の細胞捕捉部に１個の細胞が捕捉されて固定されている状態を示す説明用断面図である。
【符号の説明】
１０ 積層体
１１ 疎水性樹脂基材層
１２ 親水性重合体層
１５ パターンマスク
１５Ａ 開口
１７ 透明基板
１８ 金属蒸着膜
１９ 領域
２０ 基板材料
２１ 窪み
２１Ａ 底面
２４ 付着物
２５ 層
３０ 細胞固定用基板
３０Ａ 表面
３１ 細胞捕捉部
３５ 細胞
４０ 表面処理用ランプ装置
４１ 表面処理用ランプ
４２ 反射ミラー
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞を固定することのできる細胞固定用基板を製造する方法および細胞固定用基板に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、医療分野および農業分野などにおいては、例えば核酸などの生体分子を研究対象として用いる生化学系の研究が進められている。
【０００３】
このような研究においては、例えば多数の生体分子を整列した状態で固定することのできる生体分子固定用基板を作製し（例えば、特許文献１〜特許文献２参照。）、この生体分子固定用基板上において生体分子の検査や合成などの実験が行われている。
【０００４】
また、最近は、核酸などの生体分子だけではなく、細胞が研究対象とされてきていることから、この細胞に係る実験を、生体分子固定用基板のような、研究対象である細胞を固定することのできる基板を用いて行いたいとの要請があるが、多数の細胞を整列した状態で固定するための基板を容易に製造するための方法は知られていない。
【０００５】
【特許文献１】
特開２０００−２０６７０２号公報
【特許文献２】
特開２００１−３２４８１６号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、以上のような事情に基づいてなされたものであって、その目的は、特定位置に細胞を固定することのできる細胞固定用基板を容易に製造することのできる方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、特定位置に細胞を固定することのできる細胞固定用基板を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の細胞固定用基板の製造方法は、疎水性樹脂基材の表面において親水性重合体層を形成することにより得られる積層体に対して、パターンマスクを介して光源から放射される紫外線を照射することにより、当該パターンマスクのパターンに対応する積層体の紫外線照射領域において、親水性重合体層部分および当該親水性重合体層部分と疎水性樹脂基材よりなる疎水性樹脂基材層部分との界面に存在する化学反応物を除去して疎水性樹脂基材に由来の疎水性表面を露出させる積層体処理工程と、
積層体処理工程において得られた基板材料に対して、下記（１）〜（３）のいずれかの表面処理を行う表面処理工程を有することを特徴とする。
（１）エキシマランプまたは低圧水銀ランプから放射される紫外線を照射する紫外線照射処理
（２）酸素プラズマ処理
（３）不活性ガスプラズマ処理
【００１１】
本発明の細胞固定用基板の製造方法においては、疎水性表面が露出されてなる底面を有する窪みを制御された形状で形成することが好ましい。
【００１２】
本発明の細胞固定用基板は、上記の細胞固定用基板の製造方法によって得られることを特徴とする。
【００１３】
【作用】
本発明の細胞固定用基板の製造方法によれば、疎水性樹脂基材層および親水性重合体層を有する積層体に対して、パターンマスクを介して紫外線を照射し、当該パターンマスクに対応する積層体の紫外線照射領域において親水性重合体層部分および当該親水性重合体層部分と疎水性樹脂基材層部分との界面に存在する化学反応物を除去して疎水性樹脂基材に由来の疎水性表面を露出させることにより、細胞が吸着されない非細胞吸着特性を有する親水性表面と、細胞が吸着される細胞吸着特性を有する疎水性表面とにより構成されるパターンを、当該疎水性表面において細胞を捕捉して固定する細胞捕捉部が所望の位置に配置されるよう形成することができるため、特定位置に細胞を固定することのできる細胞固定用基板を容易に得ることができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の細胞固定用基板の製造方法は、細胞を固定することのできる基板を形成するための方法であって、疎水性樹脂基材の表面において親水性重合体層を形成することにより得られる積層体に対してパターンマスクを介して紫外線を照射する積層体処理工程と、この積層体処理工程において得られた基板材料に対して特定の後処理を行う表面処理工程を有するものである。
以下、各工程について説明する。
【００１５】
（積層体処理工程）
先ず、例えばポリスチレンなどの疎水性樹脂よりなる、例えば厚さ１ｍｍの平板状の疎水性樹脂基材の表面に、例えばアクリルアミドなどの単量体よりなる親水性重合体材料を含有する親水性重合体材料含有溶液を塗布し、得られた塗膜に対して、例えば電子ビームを照射することにより、親水性重合体材料（この例においてはアクリルアミド）を重合処理し、例えば厚さ２０ｎｍの親水性重合体層１２を形成する。
このようにして、図１に示すように、疎水性樹脂基材よりなる疎水性樹脂基材層１１と、親水性重合体層１２とが積重してなる積層体（以下、「特定の積層体」ともいう。）１０が得られるが、この特定の積層体１０においては、塗膜を構成している親水性重合体材料の重合処理の際、親水性重合体材料と、疎水性樹脂基材を構成している疎水性樹脂とが塗膜と疎水性樹脂基材との界面において反応して生成した化学反応物が、疎水性樹脂基材層１１と親水性重合体層１２との界面に存在している。
【００１６】
次いで、図２に示すように、特定の積層体１０を構成する親水性重合体層１２の上方（図２において上方）に、光源ランプ（図示せず）を配置すると共に、最終的に得られる細胞固定用基板における細胞を固定する細胞捕捉部に対応する位置および当該細胞捕捉部の形状に対応する開口１５Ａを有するパターン（以下、「特定の開口パターン」ともいう。）が形成されたパターンマスク１５を用意し、特定の積層体１０の親水性重合体層１２と光源ランプとの間に形成される領域１９の所定の位置に配置する。
【００１７】
そして、光源ランプを点灯状態とし、パターンマスク１５を介して、特定の積層体１０に対して光源ランプから放射された紫外線を親水性重合体層１２側の表面（図２において上面）から照射する。
【００１８】
このようにして、特定の積層体１０に対する紫外線の照射をパターンマスク１５を介して行うことにより、当該特定の積層体１０におけるパターンマスク１５の開口１５Ａと対応する領域に選択的に紫外線が照射されることとなり、このパターンマスク１５の特定の開口パターンに対応する紫外線照射領域において、親水性重合体層部分および当該親水性重合体層部分の下方に存在している化学反応物が揮発（アブレーション）され、更に必要に応じて疎水性樹脂基材層１１の表面層部分が除去され、これにより、特定の積層体１０に、疎水性樹脂基材層１１を構成する疎水性樹脂基材に由来の疎水性表面が露出された状態の底面２１Ａを有する、例えば深さ１００ｎｍの微小な窪み（以下、「微小窪み」ともいう。）２１が、パターンマスク１５の特定の開口パターンに応じて形成される。
【００１９】
積層体処理工程において得られた微小窪み２１を有する基板材料２０は、形成されたすべての微小窪み２１が、その底面２１Ａ全面において完全に疎水性表面が露出された状態にある場合には、それらの微小窪み２１の各々は底面２１Ａ全面で細胞を吸着することができるために十分な細胞捕捉性能が得られることから、当該微小窪み２１はそのままの状態で細胞捕捉部として有効であり、従ってこの細胞捕捉部において細胞を固定する細胞固定用基板として用いることができる。
しかしながら、例えば図３（イ）に示すように、揮発処理によって除去された親水性重合体層部分または化学反応物に由来の付着物２４が微小窪み２１の表面に再付着したり、図３（ロ）に示すように、微小窪み２１の表面に再付着した付着物２４に由来する副生成物によって当該微小窪み２１の表面の一部または全部を覆う層（図３（ロ）においては全部を覆う層）２５が形成されたり、あるいは、化学反応物が完全に除去されずに残存することなどが原因となって、基板材料２０が、底面２１Ａの一部または全部が完全に露出されていない状態となっている微小窪み２１を有している場合がある。
このような理由から、積層体処理工程の後に、更に、前述の付着物２４、層２５および残存してる化学反応物などよりなる被覆物を除去するための後処理を行うことが好ましい。
【００２０】
（表面処理工程）
図４に示すように、基板材料２０の上方（図４において上方）に、エキシマランプまたは低圧水銀ランプよりなる表面処理用ランプ４１と、反射ミラー４２とを備えた表面処理用ランプ装置４０を配置し、例えば大気中などの酸素またはオゾンを含有する雰囲気中において、この表面処理用ランプ４１を、例えば表面処理用ランプ４１としてエキシマランプを用いる場合には、波長１７２ｎｍに係る照度が１０ｍＷ／ｃｍ2 となる条件で、また、表面処理用ランプ４１として低圧水銀ランプを用いる場合には、波長１８５ｎｍに係る照度が１５ｍＷ／ｃｍ2 となる条件で点灯状態とし、基板材料２０の微小窪み２１が形成されている面（図４において上面）全面に対して一斉に表面処理用ランプ４１から放射された紫外線を、例えば数秒間照射する。
【００２１】
このような処理においては、酸素またはオゾンが紫外線と作用することによって活性酸素が発生し、この活性酸素と被覆物が接触して当該被覆物が活性酸素による酸化反応によって灰化（アッシング）されて除去され、これにより、基板材料２０において、すべての微小窪み２１が、その底面２１Ａ全面において疎水性表面が完全に露出された状態となる。
【００２２】
以上のように、積層体処理工程、および必要に応じて表面処理工程を経ることにより、親水性重合体層１２よりなる親水性表面を有すると共に、パターンマスク１５の特定の開口パターンに係る所望のパターン状に形成された、疎水性表面が露出された状態の底面２１Ａを有する微小窪み２１よりなる細胞捕捉部３１を有する細胞固定用基板３０（図５参照）が形成される。
【００２３】
疎水性樹脂基材としては、ポリスチレンよりなるものを好適に用いることができるが、例えばポリエチレンテレフタレートなどよりなるものを用いることもできる。
また、疎水性樹脂基材の厚さは、通常、０．５〜３ｍｍであることが好ましい。
【００２４】
親水性重合体材料含有溶液としては、例えば水、エタノールなどの溶媒中に、親水性重合体材料を溶解させてなるものを用いることができる。
親水性重合体材料としては、アクリルアミドを好適に用いることができる。
【００２５】
特定の積層体１０においては、親水性重合体層１２の厚さは、通常、５０〜５００ｎｍであることが好ましい。
【００２６】
光源ランプとしては、紫外線を放射するランプを用いることができ、具体的には、例えば少なくとも波長２１４ｎｍ、２１５ｎｍ、２１９ｎｍおよび２２０ｎｍのいずれかの近辺、特に波長２１４ｎｍおよび２１９ｎｍのいずれかの近辺に輝線を有するランプを好適に用いることができる。
【００２７】
また、特定の積層体１０が、ポリアクリルアミドよりなる親水性重合体層１２を有するものである場合には、光源として、少なくともカドミウムと希ガスとを発光管内に封入した波長２００〜２３０ｎｍの範囲内に輝線を有するショートアークランプを用いることが好ましい。このようなショートアークランプとしては、例えば特許第３０２０３９７号公報に開示されている構成のものを用いることができる。
【００２８】
パターンマスク１５としては、例えば透明基板１７上に、特定の開口パターンを有する金属蒸着膜１８が形成されてなるフィルターを用いることができる。
パターンマスク１５における開口１５Ａの外径は、最終的に得られる細胞固定用基板３０の細胞捕捉部３１を構成する微小窪み２１の外径に対応することから、当該細胞固定用基板３０が固定すべき細胞の種類、および一の細胞捕捉部３１において固定すべき細胞の個数などによって異なるが、通常、３０〜５０μｍである。
【００２９】
表面処理用ランプ４１としては、エキシマランプまたは低圧水銀ランプが用いられるが、具体的に、波長１７２ｎｍに輝線を有するエキシマランプおよび波長１８５ｎｍに輝線を有する低圧水銀ランプを好適に用いることができる。
【００３０】
以上のような細胞固定用基板の製造方法によれば、疎水性樹脂基材層１１および親水性重合体層１２を有する特定の積層体１０に対して、特定の開口パターンが形成されたパターンマスク１５を介して光源ランプから放射される紫外線を照射することにより、特定の開口パターンに対応する特定の積層体１０の紫外線照射領域において親水性重合体層部分および当該親水性重合体層部分と疎水性樹脂基材層部分との界面に存在する化学反応物を除去し、更に疎水性樹脂基材層１１の表面層部分を除去して、疎水性表面を露出させることにより、親水性重合体層１２よりなる、細胞が吸着されない非細胞吸着特性を有する親水性表面を備えた特定の積層体１０に、細胞が吸着される細胞吸着特性を有する疎水性表面が露出された状態の底面２１Ａを備えた微小窪み２１よりなる細胞捕捉部３１を、パターンマスク１５の特定の開口パターンに係る所望のパターン状に形成することができることから、当該細胞捕捉部３１よりなる特定位置において細胞を固定することのできる細胞固定用基板３０を容易に得ることができる。
【００３１】
また、特に、表面処理工程を経ることにより、積層体処理工程において形成されたすべての微小窪み２１を、その底面２１Ａ全面において完全に疎水性表面が露出された状態とすることができるため、最終的に得られる細胞固定用基板３０は、すべての細胞捕捉部３１を構成する微小窪み２１の各々の底面２１Ａ全面において細胞を吸着することができるものとなる。従って、細胞捕捉部３１が十分な細胞捕捉性能を有し、当該細胞捕捉部３１において細胞を確実に捕捉することができる細胞固定用基板３０を得ることができる。
【００３２】
更に、例えば積層体処理工程に供する特定の積層体１０の親水性重合体層１２の厚みを制御すること、積層体処理工程に供するパターンマスク１５の開口１５Ａの形状を制御すること、積層体処理工程において特定の積層体１０に対する紫外線照射条件を制御することなどによって微小窪み２１を制御された形状で形成することにより、最終的に得られる細胞固定用基板３０を、細胞捕捉部３１よりなる特定位置に特定数の細胞を固定することができるものとすることができる。
【００３３】
具体的には、例えば図５に示すように、固定すべき細胞（以下、「対象細胞」ともいう。）３５の大きさに適用した外径を有すると共に、１個の対象細胞３５が、当該細胞固定用基板３０の微小窪み２１よりなる細胞捕捉部３１に捕捉されて固定された際に、当該対象細胞３５が細胞固定用基板３０の表面（図５において上面）３０Ａから突出した状態となるような深さを有するという制御された形状の微小窪み２１を形成することにより、最終的に得られる細胞捕捉用基板３０を、細胞捕捉部３１において１個の対象細胞を固定するものとすることができる。
【００３４】
この製造方法によって得られる細胞固定用基板３０は、細胞捕捉部３１が形成されてなる特定位置に選択的に細胞を固定することのできるものであることから、例えば複数の細胞を整列した状態で固定することができる。
具体的に、多数の細胞捕捉部３１が形成されている細胞固定用基板３０においては、例えば当該細胞固定用基板３０上に、固定すべき細胞（以下、「対象細胞」ともいう。）を多数個含有する生理食塩水を滴下すると、対象細胞は、各々、非細胞吸着特性を有する親水性表面よりなる表面３０Ａ上には留まらず、細胞捕捉部３１の疎水性表面が露出している底面２１Ａを有する微小窪み２１内において、当該底面２１Ａに接触することによって捕捉され、当該細胞捕捉部３１に固定される。
ここに、各細胞捕捉部３１を構成する微小窪み２１が制御された形状で形成され、固定すべき特定数の対象細胞に適用した形状を有するものである場合には、当該細胞捕捉部３１に特定数以上の対象細胞が固定されることはない。
【００３５】
以上、本発明について説明したが、本発明においては種々の変更を加えることができる。
例えば、表面処理工程においては、真空条件が不要であることから低コストにて表面処理を行うことができるため、エキシマランプまたは低圧水銀ランプを用いた紫外線照射による酸化洗浄処理によって被覆物の除去を行う手法を用いること好ましいが、下記の（Ａ）または（Ｂ）の手法によっても基板材料から被覆物を除去し、すべての微小窪みを、その底面全面において疎水性表面が露出された状態とすることができる。
【００３６】
（Ａ）基板材料を酸素プラズマ雰囲気にさらしてプラズマ処理することにより、被覆物を化学洗浄処理によって除去する手法
（Ｂ）基板材料を、例えばアルゴンガスプラズマなどの不活性ガスプラズマ雰囲気にさらしてプラズマ処理することにより、被覆物を物理的に除去する手法
【００３７】
【発明の効果】
本発明の細胞固定用基板の製造方法によれば、疎水性樹脂基材層および親水性重合体層を有する積層体に対して、パターンマスクを介して紫外線を照射し、当該パターンマスクに対応する積層体の紫外線照射領域において親水性重合体層部分および当該親水性重合体層部分と疎水性樹脂基材層部分との界面に存在する化学反応物を除去して疎水性樹脂基材に由来の疎水性表面を露出させることにより、細胞が吸着されない非細胞吸着特性を有する親水性表面と、細胞が吸着される細胞吸着特性を有する疎水性表面とにより構成されるパターンを、当該疎水性表面において細胞を捕捉して固定する細胞捕捉部が所望の位置に配置されるよう形成することができるため、特定位置に細胞を固定することのできる細胞固定用基板を容易に得ることができる。
【００３８】
また、表面処理工程を経る製造方法によれば、積層体処理工程において得られた基板材料に対して特定の処理を行うことにより、疎水性表面を被覆している状態の被覆物が除去され、当該疎水性表面を完全に露出された状態とすることができることから、最終的に得られる細胞固定用基板を、確実にすべての細胞捕捉部が十分な細胞捕捉性能を有するものとすることができる。
【００３９】
本発明の細胞固定用基板は、細胞が吸着されない非細胞吸着特性を有する親水性表面と、細胞が吸着される細胞吸着特性を有する疎水性表面とを備え、当該疎水性表面において細胞を捕捉して固定する細胞捕捉部が所望のパターン状に形成されたものであることから、特定位置に細胞を固定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】疎水性樹脂基材上に親水性重合体層が形成された状態を示す説明図である。
【図２】積層体に光源から放射された紫外線を照射することによって窪みが形成された状態を示す説明用断面図である。
【図３】（イ）は、基板材料の窪みに付着物が付着している状態を示す説明用断面図であり、（ロ）は、基板材料の窪みにその表面を覆う層が形成されている状態を示す説明用断面図である。
【図４】基板材料の上方に表面処理用ランプと反射ミラーとを備えた表面処理用ランプ装置を配置した状態を示す説明用断面図である。
【図５】本発明の細胞固定用基板の細胞捕捉部に１個の細胞が捕捉されて固定されている状態を示す説明用断面図である。
【符号の説明】
１０ 積層体
１１ 疎水性樹脂基材層
１２ 親水性重合体層
１５ パターンマスク
１５Ａ 開口
１７ 透明基板
１８ 金属蒸着膜
１９ 領域
２０ 基板材料
２１ 窪み
２１Ａ 底面
２４ 付着物
２５ 層
３０ 細胞固定用基板
３０Ａ 表面
３１ 細胞捕捉部
３５ 細胞
４０ 表面処理用ランプ装置
４１ 表面処理用ランプ
４２ 反射ミラー
Claims (3)
- 疎水性樹脂基材の表面において親水性重合体層を形成することにより得られる積層体に対して、パターンマスクを介して光源から放射される紫外線を照射することにより、当該パターンマスクのパターンに対応する積層体の紫外線照射領域において、親水性重合体層部分および当該親水性重合体層部分と疎水性樹脂基材よりなる疎水性樹脂基材層部分との界面に存在する化学反応物を除去して疎水性樹脂基材に由来の疎水性表面を露出させる積層体処理工程と、
積層体処理工程において得られた基板材料に対して、下記（１）〜（３）のいずれかの表面処理を行う表面処理工程を有することを特徴とする細胞固定用基板の製造方法。
（１）エキシマランプまたは低圧水銀ランプから放射される紫外線を照射する紫外線照射処理
（２）酸素プラズマ処理
（３）不活性ガスプラズマ処理 - 疎水性表面が露出されてなる底面を有する窪みを制御された形状で形成することを特徴とする請求項１に記載の細胞固定用基板の製造方法。
- 請求項１または請求項２に記載の細胞固定用基板の製造方法によって得られることを特徴とする細胞固定用基板。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003065208A JP4247737B2 (ja) | 2003-03-11 | 2003-03-11 | 細胞固定用基板の製造方法および細胞固定用基板 |
| US10/792,748 US7358089B2 (en) | 2003-03-11 | 2004-03-05 | Process for producing a substrate for attachment of cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003065208A JP4247737B2 (ja) | 2003-03-11 | 2003-03-11 | 細胞固定用基板の製造方法および細胞固定用基板 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004267152A JP2004267152A (ja) | 2004-09-30 |
| JP4247737B2 true JP4247737B2 (ja) | 2009-04-02 |
Family
ID=32959179
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003065208A Expired - Lifetime JP4247737B2 (ja) | 2003-03-11 | 2003-03-11 | 細胞固定用基板の製造方法および細胞固定用基板 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7358089B2 (ja) |
| JP (1) | JP4247737B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8621593B2 (en) | 2003-07-28 | 2013-12-31 | Sony Corporation | Information processing apparatus and method, recording medium and program |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1712284B1 (en) * | 2005-04-15 | 2012-10-10 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Cell separation method using hydrophobic solid supports |
| US8158411B2 (en) | 2006-08-21 | 2012-04-17 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Method of separating microorganism using nonplanar solid substrate and device for separating microorganism using the same |
| EP2011630A1 (de) * | 2007-07-03 | 2009-01-07 | F. Hoffmann-La Roche AG | Verfahren zur Herstellung eines Analyseelementes |
| KR101079718B1 (ko) | 2008-09-09 | 2011-11-03 | 한국원자력연구원 | 방사선을 이용한 생분해성 고분자 재료상의 생체 분자 고정화 및 패턴 형성 방법 |
| JP5667352B2 (ja) * | 2009-09-02 | 2015-02-12 | フタムラ化学株式会社 | 微生物の保存方法及び微生物保存部材 |
| KR101138536B1 (ko) * | 2009-12-15 | 2012-04-25 | 가천대학교 산학협력단 | 미세유체 채널과 플라즈마를 이용한 세포 고정방법 |
| US9347037B2 (en) | 2013-02-11 | 2016-05-24 | Evan Masataka Masutani | Methods and apparatus for building complex 3D scaffolds and biomimetic scaffolds built therefrom |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3020397B2 (ja) | 1992-11-20 | 2000-03-15 | ウシオ電機株式会社 | ショートアーク型カドミウム希ガス放電ランプおよびこれを搭載した投影露光装置 |
| US5776748A (en) * | 1993-10-04 | 1998-07-07 | President And Fellows Of Harvard College | Method of formation of microstamped patterns on plates for adhesion of cells and other biological materials, devices and uses therefor |
| JP3686749B2 (ja) * | 1997-11-04 | 2005-08-24 | 太陽インキ製造株式会社 | パターン状無機質焼成被膜及びプラズマディスプレイパネルの製造方法 |
| JP4355384B2 (ja) | 1999-01-14 | 2009-10-28 | キヤノン株式会社 | パターン露光方法、露光装置、核酸アレイの形成方法及びペプチドアレイの形成方法 |
| ATE288478T1 (de) * | 1999-04-30 | 2005-02-15 | Massachusetts Gen Hospital | Herstellung von dreidimensionalem vaskularisierten gewebe mittels der verwendung von zweidimensionalen mikrohergestellten formen |
| JP2001324816A (ja) * | 2000-05-16 | 2001-11-22 | Nikon Corp | パターン形成方法及び露光装置 |
| JP4755368B2 (ja) * | 2001-07-24 | 2011-08-24 | 株式会社セルシード | 高密度細胞アレイ用基板、製造法、及びその利用方法 |
-
2003
- 2003-03-11 JP JP2003065208A patent/JP4247737B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-03-05 US US10/792,748 patent/US7358089B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8621593B2 (en) | 2003-07-28 | 2013-12-31 | Sony Corporation | Information processing apparatus and method, recording medium and program |
| US8763124B2 (en) | 2003-07-28 | 2014-06-24 | Sony Corporation | Information processing apparatus and method, recording medium and program |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20040180435A1 (en) | 2004-09-16 |
| JP2004267152A (ja) | 2004-09-30 |
| US7358089B2 (en) | 2008-04-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4247737B2 (ja) | 細胞固定用基板の製造方法および細胞固定用基板 | |
| US4923608A (en) | Micro/ultrafiltration membranes with a fixed pore size formed through irradiation with pulsed lasers and process for manufacturing the same | |
| KR20120017054A (ko) | 폴리머 매트릭스의 그 깊이 내에서의 화학적 변경 방법 | |
| TW200523989A (en) | Method for forming resist pattern and method for manufacturing semiconductor device | |
| Goessl et al. | Plasma lithography—thin-film patterning of polymeric biomaterials by RF plasma polymerization I: Surface preparation and analysis | |
| JP4201175B2 (ja) | パターン形成体の製造方法 | |
| JP2010078482A5 (ja) | ||
| JPH03159114A (ja) | 微細パターンの形成方法 | |
| Brétagnol et al. | Fabrication of functional nano-patterned surfaces by a combination of plasma processes and electron-beam lithography | |
| JP6808179B2 (ja) | 有機シリカ薄膜、その製造方法、それを用いたレーザー脱離イオン化質量分析用基板、及び、レーザー脱離イオン化質量分析法 | |
| JP2005098930A (ja) | 多層膜反射鏡、その再生方法及び露光装置 | |
| JP2003161803A5 (ja) | ||
| JP2003236390A (ja) | 光触媒リソグラフィー法 | |
| JP2004013042A (ja) | 薄膜パターンの形成方法 | |
| JP4074829B2 (ja) | バイオマイクロアレイ用基板およびバイオマイクロアレイ | |
| JP2015508997A (ja) | 改良されたパッチエリアの細胞付着性 | |
| WO2007049494A1 (ja) | パターニングされた物質の製造方法 | |
| JP2004188358A (ja) | 水素分離部材の製造方法 | |
| AU604318B2 (en) | Patterned metal interlayer in a matrix | |
| WO2020036971A1 (en) | Photoresist-free photolithography, photoprocessing tools, and methods with vuv or deep-uv lamps | |
| RU2002125410A (ru) | Способ анализа физических и/или химических свойств поверхностного слоя твердого тела (варианты) | |
| RU2002125557A (ru) | Способ получения асимметричной трековой мембраны | |
| JPH08288200A (ja) | パターン形成方法 | |
| JPH04173841A (ja) | 機能性基を有する高分子膜の部分的形成方法 | |
| JP3520312B2 (ja) | パターン形成方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050908 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080902 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081028 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20081222 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090104 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120123 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4247737 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130123 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130123 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140123 Year of fee payment: 5 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |