JP4197743B2 - リューマチ様の関節炎の患者からの自己抗体により認識される抗原から誘導されたペプチド、前記ペプチドを指向する抗体、抗原及び自己免疫抗体を検出する方法 - Google Patents
リューマチ様の関節炎の患者からの自己抗体により認識される抗原から誘導されたペプチド、前記ペプチドを指向する抗体、抗原及び自己免疫抗体を検出する方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、リューマチ様の関節炎の患者からの自己抗体により認識される抗原から誘導されたペプチドに関するもので、このペプチドは、リューマチ様の関節炎を患っている患者からの自己免疫抗体と反応するものである。
このようなペプチドは、ヨーロッパ特許出願0 511 116（Clontec S.A.）から知られるものである。この出願は、フィラグリン（filaggrin）またはプロフィラグリン（pro-filaggrin）フラグメンツからなる抗原を開示している。このペプチドは、リューマチ様の関節炎−特異的自己免疫抗体により認識される。リューマチ様の関節炎（ＲＡ）は、全身性（システミック）の自己免疫疾患である。それは、関節の最も一般的に発生する炎症性疾患であり、慢性なものであり、重度の身体障害になってしまう。
本発明の目的は、リューマチ様の関節炎を患っている患者からの自己免疫抗体と反応するペプチドを提供するもので、このペプチドは、極めて特異的な診断リサーチに適していると共にポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を取得する（透導、選別及び分離）ような他の目的にも適している。
この目的のために、本発明によるペプチドは、自己免疫抗体と反応する誘導されたペプチドが抗原のmRNA分子のコーディング部分に相当し、前記部分は、アルギニン残基のためのコドンを含み、前記自己免疫抗体と反応する前記誘導ペプチドにおける該アルギニン残基は、改変されたアルギニン残基であることを特徴とするものである。
驚く勿れ、改変アルギニン残基を有する発明によるペプチドは、リューマチ様の関節炎の特異的な診断に極めて有用であることが立証された。
今日まで、ＲＡについてなんら特異的な血清学上のテストも行えなかった。多用された唯一つのテストは、ＲＡ患者の７０％に見いだされるリューマチの因子（ＲＦ：Ref.1）の測定に基づくものである。しかしながら、このテストは、あまり特異的なものではなく、比較的多数の偽陽性により特徴付けられるものである。システミックな狼獪紅斑症の患者についての偽陽性のパーセンテージは、約２０％であり、健康な個体については、約５％である。
好ましくは、前記ペプチドは、改変されたアルギニン残基（residue）の側鎖がフォーミュラシートにおける構造式Ｉによる側鎖であることを特徴とするもので、該構造式において、
Ｘ＝ＮＨ2，ＣＨ3，ＮＨＣＨ3又はＮ（ＣＨ3）2；
Ｙ＝Ｏ，ＮＨ，ＮＨＣＨ3又はＮ（ＣＨ3）2；
Ｚ＝Ｏ，ＮＨ又はＣＨ2；及び
ｎは、Ｘ＝ＮＨ2及びＺ＝ＮＨのときに、ＹがＮＨではない条件により、２，３又は４であり；そして、改変されたアルギニン残基は、特にシトルリン残基である。シトルリンについては、Ｘ＝ＮＨ2、Ｙ＝Ｏ、Ｚ＝ＮＨ及びｎ＝３である。
好ましいペプチドは、フォーミュラシートにおける構造式II−Ｘを有するペプチド類のグループから選ばれるペプチドである。
構造式IIによるペプチドを使用することにより、リューマチ性関節炎を実際に患っている患者の約３６％において、リューマチ性関節炎の存在を確認することができると共に他の自己免疫疾患及び健康な個体についての偽陽性のパーセンテージは、２％以下である。
好ましい実施例によれば、ペプチドは、例えば、シスチン残基の存在による環状ペプチドである。
ある場合においては、そのような環状ペプチドは、向上した免疫学親和力を示す。
好ましい環状ペプチドは、フォーミュラシートの構造式ＸＩを有するペプチドである。
前記ペプチドは、合成ペプチドであることが好ましい。
本発明による反応性ペプチドは、有機合成の手段により純粋なものが大量に得られ、可能な限りの大きなスケールで免疫学テストを行うことができる。
代替実施例によれば、本発明によるペプチドは、（プロ）フィラグリンの蛋白質分解処理、蛋白質分解により形成されたペプチドフラグメンツの分離および前記蛋白質分解処理の間に形成されたペプチドにおける改変されたアルギニン残基の存在においての後続の選択によりペプチドを得ることを特徴とするものである。
この態様においては、ペプチド類は、リューマチ性関節炎テストの感受性を向上することができるものとして識別できる。感受性の用語は、本出願においては、リューマチ性関節炎を患っている患者を正しく識別するテストの能力を意味するものであると理解すべきである。
好ましい実施例によれば、抗原は、（プロ）フィラグリンであり、ペプチドは、（プロ）フィラグリンと反応するリューマチ性関節炎患者の自己免疫抗体と反応する。
前記ペプチドは、リューマチの高特異性テスト（偽陽性が僅少）に極めて適していることが示されている。
本発明は、又、本発明によるペプチドに対し誘導された（raised）抗体と交差反応性の抗体にも関するものである。
このような抗体は、生検サンプルのセクションの分析とサンドイッチされたタイプの免疫学テストによりリューマチ性関節炎を示すことに有用である。
この抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体である。
他の好ましい実施例によれば、前記抗体は、本発明によるペプチドを抗原として使用することにより得られる。
本発明による適切な抗体は、受入番号CBS143.96として、オランダ国バーン（Baarn）に所在のセントラルビューロー・フーア・シメルカルチュアーズ（the Centraal-bureau voor Schimmelcultures）に寄託されているプラスミドRA3をもつ大腸菌（Escherichia coli）TG1により作られるような抗体と交差反応性であることを特徴とする。
本発明は、前記ペプチドに特異的な抗体への結合に関して、請求項１から９の一つのペプチドと競合することができる部分を備える有機化合物にさらに関するもので、ここでは、前記有機化合物の少なくとも前記部分がコンビナトリアル・ケミストリー的手段により調製することができる。
このような有機化合物は、大腸菌（E.coli）CBS143.96により作られる抗体のような本発明の抗体による認識に関して本発明のペプチドが競合する、拮抗的選択により見いだされる。側鎖を有するか、又は、有していないアミノ酸類をベースおいてのみ調製される抗原よりも安く作れることが多い前記有機化合物は、ＲＡ診断用の免疫学キットに適している。また固体担体にカップリングした後、前記有機化合物を適用して、吸着作用によりＲＡを患っている患者の血液における自己免疫抗体のレベルを下げることができる。
最後ではあるが、本発明は、リューマチ性関節炎に対する自己免疫抗体を検出する方法に関するものである。
本発明による前記方法は、免疫学テストにおいて、i）本発明によるペプチド；ii）本発明による組換え有機分子；及びiii）本発明による抗体、からなるグループから選ばれる免疫学的に活性の分子を使用するものである。
感受性の増進に加えて、他の利点、特に、良好な再現性、量的インフォーメーション及び予知目的のためのより良好な適用性が達成される。
当業者にとって、添付の請求の範囲に特定された本発明に対し色々な変形が可能である。例えば、フォーミュラシートに記載のペプチド類は、また、他のオリゴペプチド類の部分であってもよい。これらは、一端または両端に一つ又はそれ以上のアミノ酸を有する一方でまた本発明による二つ又は二つ以上のペプチドは、一つのオリゴペプチドの部分であってもよい。また、一つ又はそれ以上のアミノ酸により前記ペプチド類を短くすることも可能であるが、これは、反応性に顕著な逆効果を与えないことを条件とする。専門家にとり、本発明によるペプチド類と有機化合物とをオプショナルに識別化し、又は、担体にカップルし、さらに、この分野で周知のスタンダードな技術を用いて前記のような抗体をベースにして免疫学テストをどのように展開するかの態様は、熟知するところである。
以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。
材料と方法
ペプチド合成：ヒトのプロフィラグリンの既知のｃＤＮＡ配列から導かれたアミノ酸配列に基づいて、合成のためのペプチド類を選択した（参考文献２；参考文献３）Schellekens他により記載された方法を用いて固体相で該ペプチド類を合成した（参考文献４）。前記ペプチド類は、逆相クロマトグラフィの手段による溶離プロファイルにより測定されたように、少なくとも９５％がピュアーなものであり、相対吸収度が２１４ｎｍであった。前記ペプチド類のコンポジションは、質量分析法（MALDIMS）の手段により確認された。すべてのペプチド類は、ペプチドアミド類として合成された。
ＥＬＩＳＡ手段による検出
Ｎ−オキシサクシンイミド（N-oxysuccinimide）サーフェースを介して前記ペプチド類を１μg/ウエルの量で９６ウエルの複数のマイクロ滴定プレート（Costerアミド結合プレート）の複数のウエルに共有結合した。カップリングには、4EC、pH3.0で１６時間を要した。これらプレートをウシ属の動物の２％血清アルブミンで１時間にわたりブロックした。これら血清を１０％のノーマルのラビットの血清を追加した希釈液（0.3% BSA, 350mM NaCl, 10mM 3倍-HC pH7.6, 1%vol./vol. トリトンX-100, 0.5% w./vol. Na-デオキシコール酸塩, 0.1% SDS）で２００倍に希釈し、室温で１時間にわたり培養した。前記複数のプレートを洗浄（登録商標Tween 20を容量当たり0.05%含むPBSで３回）した後、希釈バッファーで１０００倍に希釈された、ペルオキシダーゼで共役された抗人IgG100μlを前記複数のウエルに添加した。室温１時間の培養の後、前記複数のプレートをPBS/Tween（登録商標）で３回洗浄し、結合された抗体をサブストレイトとしてのテトラメチルベンジジンで検出した。１０分後2Mの硫酸100μlを添加して反応を停止させた。450nmで読み出しが起きた。それぞれの血清に対するブランク（カップルされたペプチドがないウエル）を減らした後、0.2のOD450を有する血清が陽性とみなされた。
結果
結果を表２にリストする。トータルで、リューマチ疾患の患者からの２８８の血清が使用され、その内１３２がリューマチ性関節炎を患っている患者からであった。
リューマチ性関節炎の患者からの全部で１３４のＲＡ血清の内、１０２のものがcfc1からcfc9シリーズの少なくとも一つのペプチドをもつ陽性であった。したがって、これらのペプチドを使用するとき、感受性は、７６％であった（102/134）。全部で３５４のコントロール血清の内、１３の血清がcfc1からcfc9シリーズの少なくとも一つのペプチドをもつ陽性であった。したがって、真性陽性のパーセンテージとして表現されるテスト感受性は、９６％であった。cfc3と反応した３７の血清の内、どの一つをもペプチドcfc1又はcfc23によって認識されなかった。cfc7, cfc8及びcfc9と反応した血清の内、どの一つをもcfc1, cfc2, cfc4, cfc5,又はcfc6によって認識されなかった。このことは、cfc2, cfc7, cfc8及びcfc9がテスト感受性に貢献せず、７６％のテスト感受性は、ペプチドcfc1, cfc2, cfc4, cfc5及びcfc6のコンビネーションを使用することにより実現される。
注目すべき点は、これらのパーセンテージが出願人による特異性−スレショールド値に基づいている点である。同じデータ（ELISA実験からの）は、極く僅か低い感受性を選ぶことにより約８０〜８５％の感受性として解釈でき、これは、ちなみに、既知のリューマチ因子テスト（参考文献１）を使用するとき得られるものよりもずっと優れているものでもある。
種々の感染症（ボレリア、梅毒、マラリア、心内膜炎、レジオネラ、結核症、マイコプラズマ、エルシニア、サルモネラ菌、パルボウイルスB19、エプスタイン−バーウイルス、風疹、住血吸虫症、トキソプラズマ、リーシュマニア症、シャガス病）を患っている患者からの血清をcfc1と反応する抗体の存在の有無についてテストした。テストした血清の３０８の内、９のものが陽性であった。これは、特異性が９７％であり、前記ＲＦテストに較べ格段によくなっていることを意味する。
シトルリンが中性の残基（アラニン；cfA）、酸性残基（グルタミン酸；cfE）またはアミド残基（グルタミン；cfQ）に置換されたcfc1の変種は、免疫学的に反応しないようであった。同じことをコントロール（対照）ペプチドに適用したものであるが、これは、改変されたアルギニン残基を有していない。
上記したELISAにより、cfc1の環状変種（二つのシステイン残基（C）が硫黄架橋手段により結合されているフォーミュラシートの構造式ＸＩをもつ）が１３４のＲＡ血清についてテストされた。この環状変種は、８５の血清（６３％）と反応するものとして示され、感受性の増進を表明している。ＲＡ以外のリューマチ症を患っている患者の１５４の血清の内、３つのものが陽性であるとして示された（特異性９８％）。本出願のプライオリティ・ドキュメントによれば、偽と測定された陽性が５つであるとリポートされている。
しかしながら、これらのケースにおいては、患者は、実際にＲＡを患っていたことが示されている。５９の健康な個体からの血清は、一つもこの環状ペプチドで陽性でないのみならず、ペプチドcfc1〜cfc9のいずれにおいてでも陽性でなかった。前記環状ペプチドの変種は、２００の追加のコントロール血清（50SLE, 50SCC, 50pSS, 50 PM/DM）の４つの血清に反応するものとして示され、その結果、これらの血清に関しての特異性は、９８％であった。種々の感染症の患者からの血清（上記した３０８の血清）の内、７つの血清が前記環状ペプチドの変種をもつ陽性であると示され、その結果、このケースにおいては、また、これらの血清に関しての特異性は、９８％であった。かくして、前記環状ペプチドの変種の使用が個々のリニアのペプチド変種に比較しての感受性を増進させるが、記載のELISAテストにおいてシグナル／ノイズレシオが改善されていることにより、特異性もまた増進する。
第２のシトルリン置換のペプチド（nfc1）は、１０％のＲＡ血清と特異的に反応する一方シトルリンを含んでいないコントロールペプチドnfと反応しないことが示されている。nfc1と反応するＲＡ血清の内、いくつかのものは、cfc1からcfc9とは反応しないものであった。したがって、改変されたアルギニン残基を含むペプチドを多く適用することにより、リューマチ性関節炎のテストの感受性を増進させることが可能になる。
明らかに、ペプチドは、いくつかの改変されたアルギニン残基を含んでいるが、該ペプチドは、また、一つ又は一つ以上の改変されていないアルギニン残基をも含む。
出願人の信ずるところによれば、改変されたアミノ酸類、特に、アルギニン残基から誘導されたものは、他の自己免疫症において一つの役目を果たすことができる可能性がある。この理由により、本発明は、ＲＡ以外の自己免疫症を患っている患者からの自己抗体と反応する改変されたアミノ酸類を含むペプチド類をも目指すものである。これは、特に、Ｘ＝NHCH3（ここで、Ｙ＝NH又はNCH3）又はNH（CH3）2である改変されたアルギニン残基を含むペプチド類に関するものであり、該ペプチド類は、ＳＬＥ，硬皮症、プライマリーのシエーグレン症候群及びポリマイオシチス／皮膚筋炎のような自己免疫症の検出に有用であり、そこにおいては細胞核自己抗原が役割を果たすものである。前記ペプチド類は、これらの疾患に対するモノクローナル抗体の発展並びに各自己免疫疾患の診断、特に、自己免疫疾患をかかる疑いの有る患者の血液、プラズマ及び血清のような体液における自己免疫抗体の検出に有用である。ここでもまた、前記ペプチド類及び抗体は、結合化学の助けをかりての有機化合物の展開の可能性を与えるもので、該化合物は、本発明の技術的範囲に包含される。
出願人により記載された組換え型モノクローナル抗体は、ペプチドcfc1と反応するが、コントロールペプチドcfA, cfE, cfQ又はcfとは反応しない。ヒトのフィラグリンに対しての商業的に利用可能なモノクローナル抗体AKH1（参考文献５）は、ここに記載のペプチド類のいずれにも反応せず、したがって、本発明によるペプチドに対して誘導される抗体とは交差反応性ではない。このことは、ノーマルな免疫反応において、本発明によるペプチドに対して誘導された抗体と交差反応性の抗体が必ずしも形成されないことを示唆する。
このようなペプチドは、ヨーロッパ特許出願0 511 116（Clontec S.A.）から知られるものである。この出願は、フィラグリン（filaggrin）またはプロフィラグリン（pro-filaggrin）フラグメンツからなる抗原を開示している。このペプチドは、リューマチ様の関節炎−特異的自己免疫抗体により認識される。リューマチ様の関節炎（ＲＡ）は、全身性（システミック）の自己免疫疾患である。それは、関節の最も一般的に発生する炎症性疾患であり、慢性なものであり、重度の身体障害になってしまう。
本発明の目的は、リューマチ様の関節炎を患っている患者からの自己免疫抗体と反応するペプチドを提供するもので、このペプチドは、極めて特異的な診断リサーチに適していると共にポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を取得する（透導、選別及び分離）ような他の目的にも適している。
この目的のために、本発明によるペプチドは、自己免疫抗体と反応する誘導されたペプチドが抗原のmRNA分子のコーディング部分に相当し、前記部分は、アルギニン残基のためのコドンを含み、前記自己免疫抗体と反応する前記誘導ペプチドにおける該アルギニン残基は、改変されたアルギニン残基であることを特徴とするものである。
驚く勿れ、改変アルギニン残基を有する発明によるペプチドは、リューマチ様の関節炎の特異的な診断に極めて有用であることが立証された。
今日まで、ＲＡについてなんら特異的な血清学上のテストも行えなかった。多用された唯一つのテストは、ＲＡ患者の７０％に見いだされるリューマチの因子（ＲＦ：Ref.1）の測定に基づくものである。しかしながら、このテストは、あまり特異的なものではなく、比較的多数の偽陽性により特徴付けられるものである。システミックな狼獪紅斑症の患者についての偽陽性のパーセンテージは、約２０％であり、健康な個体については、約５％である。
好ましくは、前記ペプチドは、改変されたアルギニン残基（residue）の側鎖がフォーミュラシートにおける構造式Ｉによる側鎖であることを特徴とするもので、該構造式において、
Ｘ＝ＮＨ2，ＣＨ3，ＮＨＣＨ3又はＮ（ＣＨ3）2；
Ｙ＝Ｏ，ＮＨ，ＮＨＣＨ3又はＮ（ＣＨ3）2；
Ｚ＝Ｏ，ＮＨ又はＣＨ2；及び
ｎは、Ｘ＝ＮＨ2及びＺ＝ＮＨのときに、ＹがＮＨではない条件により、２，３又は４であり；そして、改変されたアルギニン残基は、特にシトルリン残基である。シトルリンについては、Ｘ＝ＮＨ2、Ｙ＝Ｏ、Ｚ＝ＮＨ及びｎ＝３である。
好ましいペプチドは、フォーミュラシートにおける構造式II−Ｘを有するペプチド類のグループから選ばれるペプチドである。
構造式IIによるペプチドを使用することにより、リューマチ性関節炎を実際に患っている患者の約３６％において、リューマチ性関節炎の存在を確認することができると共に他の自己免疫疾患及び健康な個体についての偽陽性のパーセンテージは、２％以下である。
好ましい実施例によれば、ペプチドは、例えば、シスチン残基の存在による環状ペプチドである。
ある場合においては、そのような環状ペプチドは、向上した免疫学親和力を示す。
好ましい環状ペプチドは、フォーミュラシートの構造式ＸＩを有するペプチドである。
前記ペプチドは、合成ペプチドであることが好ましい。
本発明による反応性ペプチドは、有機合成の手段により純粋なものが大量に得られ、可能な限りの大きなスケールで免疫学テストを行うことができる。
代替実施例によれば、本発明によるペプチドは、（プロ）フィラグリンの蛋白質分解処理、蛋白質分解により形成されたペプチドフラグメンツの分離および前記蛋白質分解処理の間に形成されたペプチドにおける改変されたアルギニン残基の存在においての後続の選択によりペプチドを得ることを特徴とするものである。
この態様においては、ペプチド類は、リューマチ性関節炎テストの感受性を向上することができるものとして識別できる。感受性の用語は、本出願においては、リューマチ性関節炎を患っている患者を正しく識別するテストの能力を意味するものであると理解すべきである。
好ましい実施例によれば、抗原は、（プロ）フィラグリンであり、ペプチドは、（プロ）フィラグリンと反応するリューマチ性関節炎患者の自己免疫抗体と反応する。
前記ペプチドは、リューマチの高特異性テスト（偽陽性が僅少）に極めて適していることが示されている。
本発明は、又、本発明によるペプチドに対し誘導された（raised）抗体と交差反応性の抗体にも関するものである。
このような抗体は、生検サンプルのセクションの分析とサンドイッチされたタイプの免疫学テストによりリューマチ性関節炎を示すことに有用である。
この抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体である。
他の好ましい実施例によれば、前記抗体は、本発明によるペプチドを抗原として使用することにより得られる。
本発明による適切な抗体は、受入番号CBS143.96として、オランダ国バーン（Baarn）に所在のセントラルビューロー・フーア・シメルカルチュアーズ（the Centraal-bureau voor Schimmelcultures）に寄託されているプラスミドRA3をもつ大腸菌（Escherichia coli）TG1により作られるような抗体と交差反応性であることを特徴とする。
本発明は、前記ペプチドに特異的な抗体への結合に関して、請求項１から９の一つのペプチドと競合することができる部分を備える有機化合物にさらに関するもので、ここでは、前記有機化合物の少なくとも前記部分がコンビナトリアル・ケミストリー的手段により調製することができる。
このような有機化合物は、大腸菌（E.coli）CBS143.96により作られる抗体のような本発明の抗体による認識に関して本発明のペプチドが競合する、拮抗的選択により見いだされる。側鎖を有するか、又は、有していないアミノ酸類をベースおいてのみ調製される抗原よりも安く作れることが多い前記有機化合物は、ＲＡ診断用の免疫学キットに適している。また固体担体にカップリングした後、前記有機化合物を適用して、吸着作用によりＲＡを患っている患者の血液における自己免疫抗体のレベルを下げることができる。
最後ではあるが、本発明は、リューマチ性関節炎に対する自己免疫抗体を検出する方法に関するものである。
本発明による前記方法は、免疫学テストにおいて、i）本発明によるペプチド；ii）本発明による組換え有機分子；及びiii）本発明による抗体、からなるグループから選ばれる免疫学的に活性の分子を使用するものである。
感受性の増進に加えて、他の利点、特に、良好な再現性、量的インフォーメーション及び予知目的のためのより良好な適用性が達成される。
当業者にとって、添付の請求の範囲に特定された本発明に対し色々な変形が可能である。例えば、フォーミュラシートに記載のペプチド類は、また、他のオリゴペプチド類の部分であってもよい。これらは、一端または両端に一つ又はそれ以上のアミノ酸を有する一方でまた本発明による二つ又は二つ以上のペプチドは、一つのオリゴペプチドの部分であってもよい。また、一つ又はそれ以上のアミノ酸により前記ペプチド類を短くすることも可能であるが、これは、反応性に顕著な逆効果を与えないことを条件とする。専門家にとり、本発明によるペプチド類と有機化合物とをオプショナルに識別化し、又は、担体にカップルし、さらに、この分野で周知のスタンダードな技術を用いて前記のような抗体をベースにして免疫学テストをどのように展開するかの態様は、熟知するところである。
以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。
材料と方法
ペプチド合成：ヒトのプロフィラグリンの既知のｃＤＮＡ配列から導かれたアミノ酸配列に基づいて、合成のためのペプチド類を選択した（参考文献２；参考文献３）Schellekens他により記載された方法を用いて固体相で該ペプチド類を合成した（参考文献４）。前記ペプチド類は、逆相クロマトグラフィの手段による溶離プロファイルにより測定されたように、少なくとも９５％がピュアーなものであり、相対吸収度が２１４ｎｍであった。前記ペプチド類のコンポジションは、質量分析法（MALDIMS）の手段により確認された。すべてのペプチド類は、ペプチドアミド類として合成された。
Ｎ−オキシサクシンイミド（N-oxysuccinimide）サーフェースを介して前記ペプチド類を１μg/ウエルの量で９６ウエルの複数のマイクロ滴定プレート（Costerアミド結合プレート）の複数のウエルに共有結合した。カップリングには、4EC、pH3.0で１６時間を要した。これらプレートをウシ属の動物の２％血清アルブミンで１時間にわたりブロックした。これら血清を１０％のノーマルのラビットの血清を追加した希釈液（0.3% BSA, 350mM NaCl, 10mM 3倍-HC pH7.6, 1%vol./vol. トリトンX-100, 0.5% w./vol. Na-デオキシコール酸塩, 0.1% SDS）で２００倍に希釈し、室温で１時間にわたり培養した。前記複数のプレートを洗浄（登録商標Tween 20を容量当たり0.05%含むPBSで３回）した後、希釈バッファーで１０００倍に希釈された、ペルオキシダーゼで共役された抗人IgG100μlを前記複数のウエルに添加した。室温１時間の培養の後、前記複数のプレートをPBS/Tween（登録商標）で３回洗浄し、結合された抗体をサブストレイトとしてのテトラメチルベンジジンで検出した。１０分後2Mの硫酸100μlを添加して反応を停止させた。450nmで読み出しが起きた。それぞれの血清に対するブランク（カップルされたペプチドがないウエル）を減らした後、0.2のOD450を有する血清が陽性とみなされた。
結果
結果を表２にリストする。トータルで、リューマチ疾患の患者からの２８８の血清が使用され、その内１３２がリューマチ性関節炎を患っている患者からであった。
注目すべき点は、これらのパーセンテージが出願人による特異性−スレショールド値に基づいている点である。同じデータ（ELISA実験からの）は、極く僅か低い感受性を選ぶことにより約８０〜８５％の感受性として解釈でき、これは、ちなみに、既知のリューマチ因子テスト（参考文献１）を使用するとき得られるものよりもずっと優れているものでもある。
種々の感染症（ボレリア、梅毒、マラリア、心内膜炎、レジオネラ、結核症、マイコプラズマ、エルシニア、サルモネラ菌、パルボウイルスB19、エプスタイン−バーウイルス、風疹、住血吸虫症、トキソプラズマ、リーシュマニア症、シャガス病）を患っている患者からの血清をcfc1と反応する抗体の存在の有無についてテストした。テストした血清の３０８の内、９のものが陽性であった。これは、特異性が９７％であり、前記ＲＦテストに較べ格段によくなっていることを意味する。
シトルリンが中性の残基（アラニン；cfA）、酸性残基（グルタミン酸；cfE）またはアミド残基（グルタミン；cfQ）に置換されたcfc1の変種は、免疫学的に反応しないようであった。同じことをコントロール（対照）ペプチドに適用したものであるが、これは、改変されたアルギニン残基を有していない。
上記したELISAにより、cfc1の環状変種（二つのシステイン残基（C）が硫黄架橋手段により結合されているフォーミュラシートの構造式ＸＩをもつ）が１３４のＲＡ血清についてテストされた。この環状変種は、８５の血清（６３％）と反応するものとして示され、感受性の増進を表明している。ＲＡ以外のリューマチ症を患っている患者の１５４の血清の内、３つのものが陽性であるとして示された（特異性９８％）。本出願のプライオリティ・ドキュメントによれば、偽と測定された陽性が５つであるとリポートされている。
しかしながら、これらのケースにおいては、患者は、実際にＲＡを患っていたことが示されている。５９の健康な個体からの血清は、一つもこの環状ペプチドで陽性でないのみならず、ペプチドcfc1〜cfc9のいずれにおいてでも陽性でなかった。前記環状ペプチドの変種は、２００の追加のコントロール血清（50SLE, 50SCC, 50pSS, 50 PM/DM）の４つの血清に反応するものとして示され、その結果、これらの血清に関しての特異性は、９８％であった。種々の感染症の患者からの血清（上記した３０８の血清）の内、７つの血清が前記環状ペプチドの変種をもつ陽性であると示され、その結果、このケースにおいては、また、これらの血清に関しての特異性は、９８％であった。かくして、前記環状ペプチドの変種の使用が個々のリニアのペプチド変種に比較しての感受性を増進させるが、記載のELISAテストにおいてシグナル／ノイズレシオが改善されていることにより、特異性もまた増進する。
第２のシトルリン置換のペプチド（nfc1）は、１０％のＲＡ血清と特異的に反応する一方シトルリンを含んでいないコントロールペプチドnfと反応しないことが示されている。nfc1と反応するＲＡ血清の内、いくつかのものは、cfc1からcfc9とは反応しないものであった。したがって、改変されたアルギニン残基を含むペプチドを多く適用することにより、リューマチ性関節炎のテストの感受性を増進させることが可能になる。
明らかに、ペプチドは、いくつかの改変されたアルギニン残基を含んでいるが、該ペプチドは、また、一つ又は一つ以上の改変されていないアルギニン残基をも含む。
出願人の信ずるところによれば、改変されたアミノ酸類、特に、アルギニン残基から誘導されたものは、他の自己免疫症において一つの役目を果たすことができる可能性がある。この理由により、本発明は、ＲＡ以外の自己免疫症を患っている患者からの自己抗体と反応する改変されたアミノ酸類を含むペプチド類をも目指すものである。これは、特に、Ｘ＝NHCH3（ここで、Ｙ＝NH又はNCH3）又はNH（CH3）2である改変されたアルギニン残基を含むペプチド類に関するものであり、該ペプチド類は、ＳＬＥ，硬皮症、プライマリーのシエーグレン症候群及びポリマイオシチス／皮膚筋炎のような自己免疫症の検出に有用であり、そこにおいては細胞核自己抗原が役割を果たすものである。前記ペプチド類は、これらの疾患に対するモノクローナル抗体の発展並びに各自己免疫疾患の診断、特に、自己免疫疾患をかかる疑いの有る患者の血液、プラズマ及び血清のような体液における自己免疫抗体の検出に有用である。ここでもまた、前記ペプチド類及び抗体は、結合化学の助けをかりての有機化合物の展開の可能性を与えるもので、該化合物は、本発明の技術的範囲に包含される。
出願人により記載された組換え型モノクローナル抗体は、ペプチドcfc1と反応するが、コントロールペプチドcfA, cfE, cfQ又はcfとは反応しない。ヒトのフィラグリンに対しての商業的に利用可能なモノクローナル抗体AKH1（参考文献５）は、ここに記載のペプチド類のいずれにも反応せず、したがって、本発明によるペプチドに対して誘導される抗体とは交差反応性ではない。このことは、ノーマルな免疫反応において、本発明によるペプチドに対して誘導された抗体と交差反応性の抗体が必ずしも形成されないことを示唆する。
Claims (11)
- リューマチ様関節炎の患者からの自己抗体に認識されるペプチドであって、下記の式IIからXIのいずれかの構造を有する前記ペプチド：
（式中Xはシトルリンを表す） - 合成ペプチドであることを特徴とする、請求項１記載のペプチド。
- 環状であることを特徴とする、請求項１または２記載のペプチド。
- 請求項１〜３のいずれか１項記載のペプチドを抗原として用いて得ることのできる抗体。
- 請求項１〜３のいずれか１項記載のペプチドを抗原として用いて得られた抗体。
- 請求項１〜３のいずれか１項記載のペプチドと反応する抗体。
- 請求項１〜３のいずれか１項記載のペプチドに対する抗体と交差反応性の抗体。
- モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項４〜７のいずれか１項記載の抗体。
- オランダ国バーン（Baarn）に所在のセントラルビューロー・フーア・シメルカルチュアーズ（the Centraal-bureau voor Schimmelcultures）に寄託されているプラスミドRA3をもつ大腸菌（Escherichia coli）TG1（受託番号CBS143.96）により作られる抗体と交差反応性であることを特徴とする、請求項４〜８のいずれか１項記載の抗体。
- オランダ国バーン（Baarn）に所在のセントラルビューロー・フーア・シメルカルチュアーズ（the Centraal-bureau voor Schimmelcultures）に寄託されているプラスミドRA3をもつ大腸菌（Escherichia coli）TG1（受託番号CBS143.96）により産生される抗体。
- 自己免疫抗体を検出する方法であり、免疫学テストにおいて、
i）請求項１〜３のいずれか１項記載のペプチド；および、
ii）請求項４〜１０のいずれか１項記載の抗体、
からなるグループから選ばれる免疫学的に反応性の分子を使用することを特徴とする前記方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL1004539 | 1996-11-15 | ||
| NL1004539A NL1004539C2 (nl) | 1996-11-15 | 1996-11-15 | Peptide afgeleid van een door auto-antilichamen van patiënten met reumatoïde artritis herkend antigeen, antilichaam daartegen en werkwijze voor het detecteren van auto-immuunantilichamen. |
| PCT/NL1997/000624 WO1998022503A2 (en) | 1996-11-15 | 1997-11-14 | Peptide derived from an antigen recognized by autoantibodies from patients with rheumatoid arthritis, antibody directed against said peptide, a combinatorial antigen, and a method of detecting auto-immune antibodies |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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