ES2281095T3 - Peptido purificado, reactivo con anticuerpos autoinmunes procedentes de pacientes con artritis reumatoide, anticuerpo dirigido contra dicho peptido, y un procedimiento para la deteccion de anticuerpos autoinmunes. - Google Patents
Peptido purificado, reactivo con anticuerpos autoinmunes procedentes de pacientes con artritis reumatoide, anticuerpo dirigido contra dicho peptido, y un procedimiento para la deteccion de anticuerpos autoinmunes. Download PDFInfo
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PEPTIDO DERIVADO DE UN ANTIGENO RECONOCIDO POR AUTOANTICUERPOS; DICHO PEPTIDO REACCIONA CON ANTICUERPOS AUTOINMUNES QUE PROCEDEN DE UN PACIENTE QUE PADECE DE POLIARTRITIS REUMATOIDE. EL PEPTIDO DE ESTA INVENCION TIENE UN RESTO ARGININO MODIFICADO. ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UNOS ANTICUERPOS DIRIGIDOS CONTRA ESTE PEPTIDO, ASI COMO A UN PROCEDIMIENTO DE DETECCION DE ANTICUERPOS AUTOINMUNES.
Description
Péptido purificado, reactivo con anticuerpos
autoinmunes procedentes de pacientes con artritis reumatoide,
anticuerpo dirigido contra dicho péptido, y un procedimiento para la
detección de anticuerpos autoinmunes.
La presente invención se refiere a un péptido
que procede de un antígeno reconocido por los autoanticuerpos de
los pacientes con artritis reumatoide, péptido que es reactivo con
los anticuerpos autoinmunes de un paciente que padece de artritis
reumatoide.
Se conoce este péptido a partir de la solicitud
de patente europea 0 511 116 (Clonatec, S.A.). Esta solicitud
describe un antígeno que comprende un fragmento de filagrina o de
profilagrina. El péptido es reconocido por los anticuerpos
autoinmunes específicos de la artritis reumatoide. La artritis
reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune sistémica. Es la
enfermedad inflamatoria más común que se presenta de las
articulaciones, es crónica y puede conducir a una incapacidad
física grave.
Simon et al., J. Clin Invest. (1993)
volumen 92, en las páginas 1387 a 1393 revelan una proteína de 40 kD
que es inmunorreactiva con los anticuerpos de pacientes con
Artritis Reumatoide. Se demostró que la proteína era una forma
modificada de la filagrina, que contiene residuos de citrulina que
provienen de la conversión de la arginina.
La solicitud PCT WO 98/08946 fue registrada
anteriormente, pero se publicó después de la fecha de registro de
esta solicitud. La WO 98/08946 revela los antígenos reconocidos de
forma específica por los anticuerpos específicos de la Artritis
Reumatoide. Ventajosamente, el antígeno de la WO 98/08946 consiste
en un péptido que comprende todo o parte de al menos una secuencia
procedente de una de las secuencias identificadas en el listado de
secuencias de la WO 98/08946 bajo los números SEQ ID NO:3, SEQ ID
NO:5 y SEQ ID NO:6, en las cuales al menos un residuo de arginina
es sustituido por un residuo de citrulina.
Los anticuerpos producidos contra la filagrina
son conocidos por Simon et al., J. Invest. Dermatol., Volumen
105, páginas 432-437, 1995.
El objeto de la presente invención consiste en
proporcionar un péptido que sea reactivo con los anticuerpos
autoinmunes procedentes de un paciente que padece artritis
reumatoide, péptido que es adecuado para la investigación sobre
diagnóstico con una especificidad aumentada al mismo tiempo que es
útil para otros propósitos tales como la obtención (producción,
selección y aislamiento) de anticuerpos mono- y
poli-clonales.
Con este fin, el péptido de acuerdo con la
invención es un péptido purificado, reactivo con los anticuerpos
autoinmunes de pacientes con artritis reumatoide que son reactivos
con la (pro)filagrina, caracterizado porque la secuencia de
aminoácidos de dicho péptido procede de una molécula de mARN que
codifica para la (pro)filagrina o una parte de la misma
mediante la sustitución de al menos un residuo de arginina por un
residuo de citrulina, caracterizado porque el péptido es un péptido
cíclico.
Sorprendentemente, el péptido de acuerdo con la
invención demostró ser muy adecuado para el diagnóstico específico
de la artritis reumatoide.
Hasta hoy, no se dispone de ninguna prueba
serológica específica para la AR. La única prueba frecuentemente
empleada se basa en la determinación de los factores reumatoides
(FR; Ref. 1) que se encuentran en el 70% de los pacientes de AR.
Sin embargo, esta prueba no es muy específica y se caracteriza por
un número relativamente alto de positivos falsos. Para los
pacientes que padecen lupus eritematoso sistémico, el porcentaje de
falsos positivos es aproximadamente del 20% y para los individuos
sanos aproximadamente del 5%.
Según una realización favorable, el péptido es
un péptido cíclico debido a la presencia de un residuo de
cistina.
En algunos casos, un péptido cíclico como éste
muestra una afinidad inmunológica aumentada.
El péptido cíclico preferido es el péptido que
tiene la Fórmula XI en la hoja de fórmulas. Preferentemente, el
péptido es un péptido sintético.
El péptido reactivo de acuerdo con la invención
puede ser obtenido puro y en grandes cantidades por medio de la
síntesis orgánica, realizando las pruebas inmunológicas a la escala
más amplia posible.
Según una realización alternativa, el péptido de
acuerdo con la invención se caracteriza porque el péptido se
obtiene mediante el tratamiento proteolítico de la
(pro)filagrina, la separación de los fragmentos de péptido
formados por la proteolísis y la selección posterior en presencia de
un residuo de arginina modificado en un péptido que se formó
durante el tratamiento proteolítico.
De esta forma, los péptidos pueden ser
identificados lo que aumenta la sensibilidad de una prueba de
artritis reumatoide. Se debe entender en la presente solicitud que
el término "sensibilidad" significa la capacidad de una prueba
para identificar adecuadamente a un paciente que padece artritis
reumatoide.
El péptido ha demostrado ser muy adecuado para
pruebas de gran especificidad (pocos positivos falsos) para el
reúma.
La presente invención se refiere asimismo a un
anticuerpo que es reactivo cruzado con un anticuerpo producido
contra un péptido de acuerdo con la invención.
Un anticuerpo como éste es útil para la
indicación de artritis reumatoide mediante el análisis de trozos de
muestras de biopsia y las pruebas inmunológicas del tipo
sándwich.
El anticuerpo es preferentemente un anticuerpo
monoclonal.
Según otra realización preferida, el anticuerpo
se obtiene mediante la utilización como antígeno de un péptido de
acuerdo con la invención.
Un anticuerpo adecuado de acuerdo con la
invención se caracteriza porque es reactivo cruzado con el
anticuerpo tal como es producido por el Escherichia coli TG1
con el plásmido RA3, depositado en el Centraalbureau voor
Schimmelcultures, en Baarn, Holanda bajo el número de referencia
CBS143.96.
Finalmente, la invención se refiere a un método
para detectar los anticuerpos autoinmunes contra la artritis
reumatoide.
El método de acuerdo con la invención se
caracteriza porque en una prueba inmunológica, se utiliza al menos
una molécula inmunológicamente activa seleccionada a partir del
grupo compuesto de i) un péptido de acuerdo con la invención; ii)
un anticuerpo de acuerdo con la invención.
Además de la sensibilidad incrementada se logran
otras ventajas, en particular mejor reproducibilidad, información
cuantitativa y mejor aplicabilidad con propósitos de pronóstico.
Será evidente para una persona especializada en
el arte que existe una cantidad de variaciones posibles de la
presente invención tal como lo especifican las reivindicaciones
adjuntas. Por ejemplo, el péptido XI de la Figura 1 puede formar
parte también de otros oligopéptidos. Puede estar provisto en uno o
ambos extremos de uno o más aminoácidos distintos, mientras
también, dos o más péptidos de acuerdo con la invención pueden
formar parte de un oligopéptido. También es posible reducir el
péptido mediante uno o más aminoácidos, siempre que esto no tenga
un efecto notablemente contrario sobre la reactividad. El
especialista está familiarizado con la forma en la cual los
péptidos y compuestos orgánicos de acuerdo con la invención pueden
ser etiquetados opcionalmente o ser acoplados a un vehículo, y cómo
sobre la base de estos antígenos se puede desarrollar una prueba
inmunológica, mediante la utilización de las técnicas estándar bien
conocidas en el campo.
Ahora se explicará la invención con más detalles
por medio del siguiente ejemplo.
Síntesis de los péptidos: Se
seleccionaron los péptidos para su síntesis sobre la base de las
secuencias de aminoácidos procedentes de las secuencias conocidas
de cADN de profilagrina humana (Ref. 2; Ref. 3). Se sintetizaron
los péptidos en fase sólida por medio del método descrito por
Schellekens et al. (Ref. 4). Los péptidos eran puros en al
menos un 95%, tal como lo determina el perfil de elución por medio
de una cromatografía de fase inversa y la absorción relativa a 214
nm. La composición de los péptidos fue confirmada por medio de una
espectrometría de masas (MALDI-MS). Todos los
péptidos fueron sintetizados como amidas peptídicas.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
CUADRO
1
Péptidos
sintetizados
Los nombres de péptidos que empiezan por
"cf" se basan en el extremo C-terminal
(aminoácidos 306-324); y los nombres de péptidos
que empiezan por "nf" se basan en la secuencia cercana al
extremo N-terminal (aminoácidos
18-32 para nfc1).
Las secuencias de aminoácidos basadas en cADN de
una profilagrina se repiten.
Mediante una superficie de
N-oxisuccinimida los péptidos se acoplaron de forma
covalente a los pozos de las placas de microvaloración de 96 pozos
(placas de unión de amida Costar) en una cantidad de 1 \mug/pozo.
El acoplamiento tuvo lugar durante 16 horas en 4EC y con un pH de
9.0. Las placas fueron bloqueadas durante 1 hora con albúmina de
suero bovino al 2%. Se diluyeron los sueros 200 veces en un
diluyente (0,3% de BSA, 350 mM de NaCl, 10 mM de
Tris-HCl, pH de 7.6, 1% volumen/volumen de Triton
X-100, 0,5% peso en volumen de
Na-desoxicolato, 0,1% de SDS) complementado por un
10% de suero normal de conejo, e incubado durante una hora a
temperatura ambiente. Después de lavar las placas (3 veces con PBS
que contenía un 0,05% en volumen de Tween®29), se añadieron a los
pozos 100 \mul de IgG antihumano conjugado con peroxidasa (Dako
P214), 1000 veces diluido en un tampón de dilución. Después de la
incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron las
placas 3 veces con PBS/Tween®, y los anticuerpos ligados fueron
detectados con tetrametil-bencidina como substrato.
A los 10 minutos, se interrumpió la reacción mediante la adición de
100 \mul de 2 M de ácido sulfúrico por pozo. La lectura de salida
tuvo lugar en 450 nm. Los sueros que tenían un OD_{450} de 0,2,
después de la deducción del espacio en blanco para el suero
respectivo (un pozo sin péptido acoplado), fueron considerados
positivos.
Se relacionan los resultados en el Cuadro 2. En
total, se utilizaron 288 sueros procedentes de pacientes que
padecían enfermedades reumatoides, de los cuales 132 procedían de
pacientes que padecían artritis reumatoide.
CUADRO
2
Resultados con el péptido cfc1 a
cfc9 (Fórmula II a X de la hoja de
fórmulas)
Del total de 134 sueros de AR procedentes de
pacientes que padecen artritis reumatoide, 102 fueron positivos con
al menos un péptido procedente de las series cfc1 a cfc9. Por lo
tanto, cuando se utilizaron estos péptidos, la sensibilidad fue del
76% (102/134). Del total de 354 sueros de control, 13 sueros fueron
positivos sobre al menos un péptido procedente de las series cfc1 a
cfc9. Por lo tanto, la sensibilidad de la prueba, expresada en
porcentaje de positivos verdaderos, fue del 96%. De los 37 sueros
que fueron reactivos con cfc3, no hubo ninguno que no fuera
reconocido por el péptido cfc1 ó cfc23. De los sueros que fueron
reactivos con cfc7, cfc8 y cfc9, no hubo ninguno que no fuera
reconocido por cfc1, cfc2, cfc4, cfc5 o cfc5. Esto significa que
cfc2, cfc7, cfc8 y cfc9 no contribuyen a la sensibilidad de la
prueba y que se puede realizar la sensibilidad de una prueba del
76% mediante la utilización de la combinación de los péptidos cfc1,
cfc2, cfc4, cfc5 y cfc6.
Se debe observar que estos porcentajes dependen
del valor umbral de especificidad aplicado por los solicitantes.
Los mismos datos (procedentes de los experimentos con ELISA) pueden
ser interpretados como una sensibilidad del 80-85%
aproximadamente mediante la elección de una sensibilidad ligeramente
más baja, que a propósito, sigue siendo mucho mejor que la que se
puede obtener cuando se utiliza la prueba conocida del factor
reumatoide (Ref. 1).
Los sueros procedentes de pacientes que padecen
varias enfermedades infecciosas (Borrelia, sífilis, malaria,
endocarditis, Legionella, tuberculosis, micoplasma, Yersinia,
salmonella, parvovirus B19, virus de Epstein-Barr,
rubeola, esquistosomiasis, Toxoplasma, leishmaniasis, enfermedad de
Chagas) fueron sometidos a prueba en cuanto a la presencia de
anticuerpos reactivos con cfc1. De los 308 sueros sometidos a
prueba, 9 fueron positivos. Esto significa que la especificidad fue
del 97%, una mejora considerable en comparación con la prueba de
FR.
Las variantes de cfc1 en las cuales la citrulina
fue sustituida por un neutro (alanina; cfA), ácido (ácido
glutámico; cfE) o residuo de amida (glutamina; cfQ), no parecían ser
inmunológicamente reactivas. Lo mismo es aplicable al péptido de
control cf, que no posee un residuo de arginina modificado.
Con la ayuda del ELISA anteriormente descrito,
se sometió a prueba una variante cíclica (con la Fórmula XI en la
hoja de fórmulas, en la cual dos residuos de cisteína (C) están
unidos por medio de un puente de azufre) de cfc1 en busca de 134
sueros de AR. Se demostró que esta variante cíclica era reactiva con
85 sueros (63%), lo que significa un incremento en la sensibilidad.
De los 154 sueros de pacientes que padecen enfermedades reumáticas
distintas de la AR, 3 demostraron ser positivos (especificidad del
98%). El documento de prioridad de la presente solicitud indica 5
positivos falsamente determinados. Sin embargo, se ha demostrado que
en dos de estos casos los pacientes padecían realmente AR. Ni un
suero de los 59 individuos sanos fue positivo con este péptido
cíclico, ni tampoco con alguno de los péptidos cfc1 a cfc9. La
variante cíclica del péptido demostró ser reactiva con 4 sueros de
los 200 sueros de control adicionales (50 SLE, 50 SCC, 50 pSS, 50
PM/DM) de manera que la especificidad con respecto a estos sueros
fue del 98%. De los sueros procedentes de pacientes que padecen
varias enfermedades infecciosas (308 sueros tal como se ha descrito
anteriormente), 7 sueros demostraron ser positivos con la variante
cíclica del péptido de manera que en este caso también la
especificidad con respecto a estos sueros fue del 98%. La
utilización de la variante cíclica del péptido por lo tanto aumenta
la sensibilidad en comparación con las variantes individuales del
péptido lineal, pero la especificidad aumenta también debido a un
coeficiente mejorado de señal/ruido en la prueba ELISA descrita. Se
demostró que un segundo péptido sustituido por citrulina (nfc1) era
reactivo de forma específica con el 10% de los sueros de AR, pero
no con el péptido de control nf, que no incluye citrulina. De los
sueros de AR reactivos con nfc1, algunos no eran reactivos con cfc1
a cfc9. Por lo tanto, es posible incrementar la sensibilidad de un
prueba en busca de artritis reumatoide mediante la aplicación de
más péptidos que comprendan un residuo de arginina modificado.
Obviamente, un péptido puede comprender varios residuos de arginina
modificados, pero el péptido puede comprender también uno o más
residuos de arginina no-modificados.
El anticuerpo monoclonal recombinante descrito
por los solicitantes es reactivo con el péptido cfc1 pero no con
los péptidos de control cfA, cfE, cfQ o cf. El anticuerpo monoclonal
comercialmente disponible AKH1 (Ref. 5), dirigido contra la
filagrina humana, no es reactivo con cualquiera de los péptidos
descritos aquí y no es por lo tanto reactivo cruzado con un
anticuerpo producido contra un péptido de acuerdo con la invención.
El suero policlonal anti-54 kD (Ref. 5), producido
contra la filagrina, no es reactivo con cualquiera de los péptidos
descritos aquí y no es por lo tanto reactivo cruzado con un
anticuerpo reactivo con un péptido de acuerdo con la invención.
Esto sugiere que en una reacción inmune normal, no se forman
necesariamente anticuerpos que sean reactivos cruzados con un
anticuerpo producido contra un péptido de acuerdo con la
invención.
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Annals of the Rheumatic diseases 50, pp.
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Claims (8)
1. Un péptido purificado, reactivo con los
anticuerpos autoinmunes procedentes de pacientes con artritis
reumatoide que son reactivos con la (pro)filagrina, en los
cuales la secuencia de aminoácidos de dicho péptido procede de una
molécula de mARN que codifica para la (pro)filagrina o una
parte de la misma mediante la sustitución de al menos un residuo de
arginina por un residuo de citrulina, caracterizado porque el
péptido es un péptido cíclico.
2. Un péptido según la Reivindicación 1 y la
Fórmula XI de la Figura 1.
3. Un péptido según la Reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque el péptido es un péptido sintético.
4. Un anticuerpo producido contra un péptido
según las Reivindicaciones 1-3.
5. Un anticuerpo monoclonal que es reactivo
cruzado con un anticuerpo producido contra un péptido según las
Reivindicaciones 1 a 3.
6. Un anticuerpo reactivo cruzado con el
anticuerpo tal como lo produce el Escherichia coli TG1 con el
plásmido RA3, depositado en el Centraalbureau voor
Schimmelcultures, en Baarn, Holanda bajo el número de referencia
CBS143.96.
7. Un método para la detección de anticuerpos
autoinmunes procedentes de pacientes con artritis reumatoide,
caracterizado porque un péptido según las Reivindicaciones 1
a 3 es utilizado en una prueba inmunológica.
8. Un método para la detección de anticuerpos
autoinmunes procedentes de pacientes con artritis reumatoide,
caracterizado porque se utiliza un péptido purificado, y
caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de dicho
péptido procede de una molécula de mARN que codifica para la
(pro)filagrina o una parte de la misma mediante la
sustitución de un residuo de arginina por un residuo de citrulina,
caracterizado porque dicho método es un ensayo
inmunosorbente unido a enzimas (ELISA).
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL1004539A NL1004539C2 (nl) | 1996-11-15 | 1996-11-15 | Peptide afgeleid van een door auto-antilichamen van patiënten met reumatoïde artritis herkend antigeen, antilichaam daartegen en werkwijze voor het detecteren van auto-immuunantilichamen. |
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