JP4187408B2 - ヘパラナーゼ活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドおよび移入細胞での該ポリペプチドの発現 - Google Patents
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Description
【0001】
本発明はヘパラナーゼ活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド(以下、hpaという)、該ペプチドを含むベクターおよびヘパラナーゼを発現する移入細胞に関する。本発明はさらにヘパラナーゼ活性を有する組換えタンパク質に関する。
【0002】
ヘパラン硫酸プロテオグリカン
ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)は脊椎動物および無脊椎動物組織の広範な細胞の細胞表面と細胞外マトリックス(ECM)と会合している偏在性高分子である(1〜4)。基本的なHSPG構造はタンパクコアから構成され、それに幾つかの線状ヘパラン硫酸鎖が共有結合している。これら多糖鎖は一般に様々な程度でN−およびO−結合硫酸部分およびN−結合アセチル基により置換されたヘキスロン酸およびD−グルコサミン二糖単位の繰返しから構成される(1〜4)。細胞の付着、増殖および分化におけるECM分子の関与に関する研究は、胎児性形態形成、脈管形成、軸索派生および組織修復におけるHSPGの中心的役割を明らかにした(1〜5)。HSPGは血管の顕著な成分である(3)。大型の脈管ではそれらが殆ど動脈内膜と血管中脈に濃縮しているが、一方、毛管ではそれが内皮下の基底膜に主に見出される。そこでHSPGは内皮細胞の増殖と移動を支え、毛管壁の構造を安定化する。コラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンなどのECM高分子と相互作用する、また、血漿膜上の異なる付着部位と相互作用するHSPGの能力は、ECM成分の自己集合と不溶性においての、ならびに細胞の付着と運動においての、このプロテオグリカンの重要な役割を示唆している。従って、ヘパラン硫酸(HS)の切断は内皮下ECMの分解に至り、それ故、血液由来細胞の血管外遊出において決定的な役割を演じている可能性がある。HS異化作用は炎症、外傷修復、糖尿病、および癌転移において観察され、HSを分解する酵素が病状の経過において重要な役割を演じていることを示唆している。ヘパラナーゼ活性は活性化免疫系細胞および高度転移癌細胞において説明されているが(6〜8)、ヘパラナーゼが病的症状の潜在的引き金の役割を果たしているか否か探究するための生物学的手段が欠如するために、研究のハンディキャップとなっている。
【0003】
腫瘍細胞浸襲と転移におけるヘパラナーゼの関与:
異なる器官の毛管床に捕捉された循環腫瘍細胞は内皮細胞内膜に浸襲し、その下にある基底膜(BM)を分解して血管外組織に逃れようとするが、そこで腫瘍細胞は転移を確立する(9、10)。転移腫瘍細胞は多くの場合隣接する内皮細胞間の細胞間接合部位またはその近傍に接着する。転移細胞のかかる接着は、接合部の離断、内皮細胞縁の退縮、内皮の裂け目を通して露呈された下層BMへの移動へと続く(9)。内皮細胞とBMとの間に位置した浸襲細胞は、脈管区画外へ移動するために、BM内皮下の糖タンパク質およびプロテオグリカンを分解しなければならない。数種の細胞性酵素(例えば、コラゲナーゼIV、プラスミノーゲン活性化因子、カテプシンB、エラスターゼなど)はBMの分解に関与していると考えられている(10)。これらの酵素の内、特定の鎖内部位でHSを切断するのがエンド−β−D−グルクロニダーゼ(ヘパラナーゼ)である(6、8、11)。HS分解ヘパラナーゼの発現は、マウスのリンパ腫(11)、線維肉腫、および黒色腫(メラノーマ)(8)細胞の転移潜在力と相関することが見出された。さらに、上昇したヘパラナーゼのレベルは転移腫瘍担持動物とメラノーマ患者の血清(8)および癌患者の腫瘍生検(12)に検出された。
【0004】
局所の微小環境による細胞増殖および腫瘍の進行の制御は、培養した角膜および脈管内皮細胞により産生される細胞外マトリックス(ECM)と細胞との相互作用に焦点を絞り、本発明者らにより以前に検討された。この培養ECMはその形態学的な外観および分子組成においてin vivoでは内皮下層によく似ている。このものはコラーゲン(殆どがタイプIIIおよびIVであり、少量のタイプIおよびVを含む)、プロテオグリカン(殆どがヘパラン硫酸−およびデルマタン硫酸−プロテオグリカンであり、少量のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを含む)、ラミニン、フィブロネクチン、エンタクチンおよびエラスチンを含んでいる(13,14)。細胞が培養ECMにおいてHSを分解する能力については、細胞が代謝により硫酸標識されたECMと相互作用するようにして、次いで培地中に放出された分解産物をゲル濾過(セファロース6B)により分析することにより検討した(11)。未変化のHSPGがカラムのボイド容量の次に溶出される(Kav<0.2、Mr〜0.5×106)一方、HS側鎖の標識された分解フラグメントはカラムのよりVt方向で溶出される(0.5<kav<0.8、Mr=5〜7×103)(11)。
【0005】
血液由来細胞の血管外遊出防止に潜在的に使用し得る種々非抗凝血性種ヘパリンのヘパラナーゼ阻害効果についても本発明者らが検討した。ヘパラナーゼの阻害作用は、16以上の糖単位を含み、N位置とO位置双方に硫酸基を有するヘパリン類により最適に達成された。O−脱硫酸化がヘパリンのヘパラナーゼ阻害効果を無効にする一方、O−硫酸化、N−アセチル化ヘパリンは、該N−置換分子が約4,000ダルトン以上の分子サイズ有する場合に、高い阻害活性を維持した(7)。実験動物をヘパラナーゼ・インヒビター(例えば、ヘパリンの非−抗凝血種)で処理すると、B16メラノーマ、ルイス肺癌および乳房腺癌の細胞により誘発される肺転移の発生率を顕著に減少させた(>90%)(7、8、16)。抗トロンビンIIIに対し高度および低度親和性を有するヘパリンフラクションは同等の高い抗転移活性を示したが、このことは、ヘパリン活性を阻害するヘパラナーゼが、その抗凝血活性よりもむしろ、多糖の抗転移性において役割を果たしていることを示している(7)。
【0006】
癌患者尿のヘパラナーゼ活性:
ヘパラナーゼの腫瘍進行への関わりとそのヒト癌との関連性をさらに解明するために、ヘパラナーゼ活性用尿サンプルについてスクリーニングを試行した(16a)。ヘパラナーゼ活性はすべてではないが、一部癌患者の尿に検出された。高レベルのヘパラナーゼ活性が攻撃性転移疾患患者尿に定量されたが、健常提供者尿には検出し得る活性はなかった。
【0007】
ヘパラナーゼ活性は正常者および微量アルブミン尿インシュリン依存性糖尿病(IDDM)患者の20%の尿にも検出されたが、その殆どが糖尿病性腎症によると思われるもので、成人では腎不全に至る最も重要な独立の障害である。
【0008】
腫瘍脈管形成におけるヘパラナーゼ関与の可能性
線維芽細胞増殖因子はヘパリンに対する高い親和性により特徴づけられる一群の構造的に関連するポリペプチドである(17)。これらは血管内皮細胞にとって高度に分裂促進性であって、血管新生の最も強力な誘発物質の一つである(17,18)。塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)はin vitroで産生される内皮下のECMから(19)、また、角膜のBMから(20)抽出されるが、このことはECMがbFGFの貯臓所としての役割を担っている可能性を示唆している。免疫組織化学染色は多様な組織および血管の基底膜にbFGFが局在していることを明らかにした(21)。bFGFが正常組織の至る所に存在しているにもかかわらず、これら組織の内皮細胞増殖は通常非常に低く、bFGFがその作用部位から幾分隔離されていることを示唆している。bFGFとECMの相互作用に関する研究が解明したところによると、bFGFはECMのHSPGに結合し、HS分解酵素により活性型として放出される(15、20、22)。血小板、肥満細胞、好中球およびリンパ腫細胞により発現されるヘパラナーゼ活性はECMおよび基底膜からの活性なbFGF放出に関与しているが(23)、これはヘパラナーゼ活性が細胞移動と浸襲において機能するばかりではなく、間接的に血管新生応答を生じていることをも示唆している。これらの結果は、ECM HSPGがbFGFおよび恐らく他のヘパリン結合増殖促進因子の天然保存貯蔵所を提供していることを示唆する(24,25)。従って、基底膜とECM内のその貯蔵庫からbFGFを置換えることで、正常状態および病的状態での血管新生誘発に対する新しいメカニズムを提供し得る可能性がある。
【0009】
最近の研究が示すところによると、ヘパリンとHSはbFGFが高親和性細胞表面レセプターに結合する際に、またはbFGF細胞のシグナリングに関与している(26、27)。さらに、最適効果に必要なHSサイズはヘパラナーゼにより放出されるHSフラグメントのサイズに類似していた(28)。同様の結果が脈管内皮細胞増殖因子(VEGF)により得られたが(29)、これはヘパリン結合増殖因子との細胞相互作用にHSを巻き込む二重レセプターメカニズムの作用を示唆している。したがって、ECMの内皮細胞増殖因子を制限することで脈管内皮に対する全身作用を防止し、結果として非常に緩やかな内皮細胞交替と脈管増殖を維持しているのだとする提案がなされている。他方、HSフラグメントとの複合体としてbFGFのECM貯蔵庫からの放出が、外傷修復、炎症および腫瘍成長などの過程において、局在化した内皮細胞増殖と血管新生を促す可能性もある(24、25)。
【0010】
免疫系細胞によるヘパラナーゼの発現
ヘパラナーゼ活性は循環系に遊離する免疫系の活性化細胞能力と相関し、炎症と自己免疫応答の両方を引き出す。血小板、顆粒球、TおよびBリンパ球、マクロファージおよび肥満細胞と内皮下ECMとの相互作用は、特異的なヘパラナーゼ活性によるヘパラン硫酸(HS)の分解と関係している(6)。酵素は種々の活性化シグナル(例えば、トロンビン、カルシウムイオノホア、免疫複合体、抗原、分裂促進因子など)に応答して細胞内画分(例えば、リソソーム、特異顆粒など)から放出されるが、これは炎症と細胞免疫性においてそれが調整されて関与していることを示唆している。
【0011】
ヘパラナーゼ酵素に関する幾つかの所見が文献番号6に概括されており、リストにすると以下のとおりである
第一に、タンパク分解活性(プラスミノーゲン活性化因子)およびヘパラナーゼは炎症性白血球と悪性腫瘍細胞によるECM HSPGの連続的分解に相乗的に関与する。
【0012】
第二に、血小板ヘパラナーゼの大型の集団は、潜伏性の形状で、恐らくコンドロイチン硫酸との複合体として存在する。潜伏性酵素は腫瘍細胞誘導因子により活性化され、次いで腫瘍転移の過程で脈管内皮を通過する細胞浸襲を容易にする。
【0013】
第三に、α−顆粒からの血小板ヘパラナーゼ放出は強力な刺激因子(すなわち、トロンビン)により誘発されるが、ECM上の血小板活性化には応答しない。
【0014】
第四に、好中球ヘパラナーゼは閾値活性化に応答して、また、ECM上の細胞培養にもとづいて優先的に容易に放出される。
【0015】
第五に、好中球とECMの接触は有害な酵素(プロテアーゼ、リゾチーム)と酸素ラジカルの放出を阻害するが、血管外遊出を可能とする酵素(ヘパラナーゼ、ゲラチナーゼ)の放出は阻害しない。この内皮下ECMの防御的役割は、細胞を可溶性因子により刺激したときには観測されるが、貪食性刺激因子では観測されなかった。
【0016】
第六に、細胞内ヘパラナーゼはT細胞系を特異抗原に露呈して後、数分以内に分泌される。
【0017】
第七に、分裂促進因子(ConA、LPS)はin vitroで維持された正常TおよびBリンパ球によるヘパラナーゼの合成と分泌を誘導する。Tリンパ球ヘパラナーゼはin vivoにおいて抗原での免疫によっても誘導される。
【0018】
第八に、ヘパラナーゼ活性はプレ−Bリンパ腫およびBリンパ腫によって発現されるが、プラズマ細胞腫および休止正常Bリンパ球によっては発現されない。
【0019】
第九に、ヘパラナーゼ活性はECMとの培養において活性化マクロファージにより発現されるが、培養媒体中への該酵素は放出がわずかであるか、あるいは放出されない。同様の結果が成熟マクロファージに分化するよう誘発されたヒト骨髄性白血病細胞により得られた。
【0020】
第十に、T細胞介在遅延型過敏症および実験的自己免疫はヘパラナーゼ阻害性非抗凝集性種ヘパリンの低用量により抑制される(30)。
【0021】
第十一に、血小板、好中球および転移性腫瘍細胞により発現されるヘパラナーゼ活性はECMおよび基底膜から活性bFGFを放出する。ECMに貯留されたbFGFが放出されると、外傷の修復、炎症および腫瘍発生などの工程において局在化した血管新生応答を誘導する可能性がある。
【0022】
第十二に、in vivoでのT細胞介在炎症を阻害し得る三硫酸化二糖はヘパラナーゼにより生成したECMの分解産物の一つである(31)。この阻害は活性化T細胞によるin vitro生物活性TNFαの産生における該二糖の阻害効果と関連づけられた(31)。
【0023】
その他の有力な治療応用
腫瘍細胞転移、炎症および自己免疫にヘパラナーゼが関与していることとは別にして、哺乳動物ヘパラナーゼは、ヘパリン結合増殖因子の生物利用能を調整すること(15)、ヘパリン結合増殖因子(例、bFGF、VEGF)およびサイトカイン(IL−8)への細胞性応答を調整すること(31a、29)、血漿リポタンパク質との細胞相互作用を調整すること(32)、特定のウイルス性、ある種細菌性および原生動物性感染に対する細胞の感受性を調整すること(33、33a、33b)、およびアミロイド・プラークの分解を調整すること(34)などに応用し得る。このように、ヘパラナーゼは外傷修復、脈管形成、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、炎症、神経変性疾患およびウイルス感染などの症状に有用であることが分かる。哺乳動物ヘパラナーゼは血漿ヘパリンを中和するための有力なプロタミン置換体として使用することができる。抗ヘパラナーゼ抗体は、生検標本、血漿サンプルおよび体液における微小転移、自己免疫病変および腎不全の免疫検出および診断に応用し得る。基礎研究における一般的な使用も期待される。
【0024】
ヘパラナーゼ酵素をエンコードするhpa遺伝子の同定は異種発現系での組換え酵素産生を可能とする。組換えタンパク質を利用し得ることは、タンパク質の構造機能を解明する方法を確かなものとし、新規なインヒビターの開発手段を提供することとなる。
【0025】
ウイルス感染
細胞表面にヘパラン硫酸が存在することは、単純ヘルペス(33)およびデング熱ウイルス(33a)の結合にとって、また細胞の引続く感染にとっての主要な要件であることが示されている。したがって、ヘパラナーゼにより細胞表面ヘパラン硫酸を除去することがウイルス感染を妨げることになる。事実、(ヘパラン硫酸を分解する)細菌性ヘパリチナーゼまたは(ヘパランを分解する)ヘパリナーゼで細胞を処理すると、2種の関連する動物ヘルペスウイルスが細胞に結合するのを減少させ、かつ、ウイルス感染に対して細胞が少なくとも部分的に抵抗するようになった(33)。細胞表面ヘパラン硫酸はHIV感染にも関与しているという幾つかの徴候がある(33b)。
【0026】
神経変性疾患
ヘパラン硫酸プロテオグリカンはゲルストマン−シュトロイスラー症候群、クロイツフェルト−ヤコブ病およびスクラピーのプリオンタンパク質アミロイドプラーク中に同定された(34)。ヘパラナーゼはこれらのアミロイドプラークを分解させるが、該プラークはアルツハイマー病の病因的役割を演じるとも考えられる。
【0027】
再狭窄およびアテローム性動脈硬化症
内皮傷害に応答した動脈平滑筋細胞(SMC)の増殖とコレステロールに富むリポタンパク質の蓄積は、アテローム性動脈硬化症と再狭窄の病因における基本的事象である(35)。HSがSMC増殖に関与すること(すなわち、ヘパリン結合増殖因子に対する低親和性レセプター)とは別に、HSはリポタンパク質の結合、保持および取込みにも関与している(36)。HSPGおよびリポタンパク質リパーゼは、コレステロールに富むリポタンパク質の実質的細胞内および腸内蓄積を可能とする新しい異化経路に関わっていることが証明された(32)。後者の経路はアポBおよびアポEに富むリポタンパク質(すなわち、LDL、VLDL、キロミクロン)の蓄積を促進することにより高度にアテローム発生的であると予測されるが、細胞ステロール含有によるフィードバック阻害からは独立している。したがって、ヘパラナーゼによりSMC HSを除去すると、SMC増殖と脂質蓄積の両方が阻害されると期待され、したがって、再狭窄およびアテローム性動脈硬化症の進行を停止させる可能性がある。
【0028】
このように、ヘパラナーゼ活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド、それを保持するベクター、ヘパラナーゼを発現する形質導入細胞、およびヘパラナーゼ活性を有する組換えタンパク質に対する必要性が広く認識され、それらを所有することが非常に有利となろう。
【0029】
【発明の概要】
本発明によると、ヘパラナーゼ活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド(以下では、hpa、hpa cDNAまたはhpa遺伝子という)、それを保持するベクター、ヘパラナーゼを発現する形質導入細胞、およびヘパラナーゼ活性を有する組換えタンパク質が提供される。
【0030】
ヘパラナーゼをエンコードするヒトhpa遺伝子のクローニングおよび形質導入宿主細胞による組換えヘパラナーゼの発現を報告する。
【0031】
ヒト肝癌細胞から単離したヘパラナーゼの精製調製物をトリプシン消化およびミクロ配列決定に付した。解明したYGPDVGQPR(配列番号8)配列は、対応する逆翻訳DNA配列に対する相同性についてのESTデータベースをスクリーニングするのに用いた。2つの密接に関連するEST配列を同定し、その後同一であることを見出した。両クローンは1020bpの挿入断片を含んでおり、該挿入断片は973bpのオープン読み枠を含み、それに引き続いて27bpの3’非翻訳領域とポリA尾部を含んでいた。翻訳開始部位は同定されなかった。
【0032】
5’末端欠如hpaのクローニングは、胎盤マラソン(Marathon)RACEcDNA複合体からのDNAのPCR増幅により、ESTクローン配列に従い選択したプライマーと複合体のリンカーを用い実施した。同定した3’エンコードESTクローンと一部重なり合っている900bpのPCRフラグメントが得られた。接合したcDNAフラグメント(hpa)(1721bpの長さ、配列番号9)は、61,192ダルトンの計算値分子量を有する543アミノ酸のポリペプチド(配列番号10)をエンコードするオープン読み枠を含んでいた。
【0033】
伸長した5’配列のクローニングは、マラソンRACEを用いるPCR増幅によりヒトSK−hep1細胞系から可能であった。SK−hep1 hpa cDNAの5’伸長配列はヒト胎盤から単離したhpa cDNAの配列と統合した(配列番号9)。統合した配列は、66,407ダルトンの計算値分子量を有する592アミノ酸のポリペプチド(配列番号14と15に示した)をエンコードするオープン読み枠(配列番号13および15)を含んでいた。
【0034】
in vitroアッセイにおいてヘパラン硫酸の分解を触媒するhpa遺伝子産物の能力を、バキュロウイルス発現系を用い、昆虫細胞においてhpa全オープン読み枠を発現することにより試験した。hpa遺伝子含有ウイルスで感染させた細胞の抽出物と調整培地が、可溶性ECM誘導HSPGおよび未処理ECMに対する高レベルのヘパラン硫酸分解活性を示した。この分解活性は、ヘパラナーゼのもう一つの基質であるヘパリンにより阻害された。hpa遺伝子不含の同様の構築物を感染させた細胞はかかる活性を示さず、非感染細胞の活性をも示さなかった。伸長した5’クローンから発現したヘパラナーゼのヘパリンに対する能力は哺乳動物発現系において証明された。
【0035】
種々の組織および細胞系におけるhpaRNAの発現パターンは、RT−PCRにより検討した。ヘパラナーゼ活性を有することがすでに知られている組織および細胞においてのみ発現されることが判明した。
【0036】
単一染色体ヒト/CHOとヒト/マウス体細胞ハイブリッドのパネルを用い、ヒト染色体4にヒト・ヘパラナーゼ遺伝子を位置づけた。新たに単離したヘパラナーゼ配列を用い、染色体スプレッドのヒト・ヘパラナーゼ遺伝子を包含する染色体領域を同定することができる。
【0037】
以下に記載の本発明の好適な態様におけるさらなる特徴によると、ヘパラナーゼ触媒活性を有するポリペプチドエンコードポリヌクレオチド配列を包含するポリヌクレオチドフラグメントが提供される。
【0038】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、該ポリヌクレオチドフラグメントとは、全ヒトヘパラナーゼ酵素をエンコードする配列番号9のヌクレオチド63〜1691または配列番号13のヌクレオチド139〜1869である。
【0039】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、hpa cDNA、特に配列番号9のヌクレオチド1〜721とハイブリッド形成し得るポリヌクレオチド配列を包含するポリヌクレオチドフラグメントが提供される。
【0040】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、ヘパラナーゼ活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号9または13と少なくとも60%の相同性、好ましくは少なくとも70%の相同性、より好ましくは少なくとも80%の相同性、最も好ましくは少なくとも90%の相同性を有する。
【0041】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、本発明によるポリヌクレオチドフラグメントは配列番号9または13の一部(フラグメント)を包含する。例えば、かかるフラグメントはヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードする配列番号9のヌクレオチド63〜721および/または配列番号9のセグメントを包含し得た。
【0042】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、該ポリヌクレオチドフラグメントによりエンコードされるポリペプチドは配列番号10または14に記載のアミノ酸配列またはその機能的部分を包含する。
【0043】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、該ポリヌクレオチド配列はヘパラナーゼ活性保有ポリペプチドをエンコードし、該ポリペプチドは配列番号10または14と少なくとも60%の相同性、好ましくは少なくとも70%の相同性、より好ましくは少なくとも80%の相同性、最も好ましくは少なくとも90%の相同性を有する。
【0044】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、該ポリヌクレオチドフラグメントはヘパラナーゼ活性保有ポリペプチドをエンコードし、該ポリペプチドは、したがって、配列番号10または14に記載のアミノ酸配列の対立遺伝子、種および/または誘発変異体であってもよい。かかる変異体はいずれも相同体とも見なし得ると理解される。
【0045】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、上記ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド鎖の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチド配列を含む一本鎖ポリヌクレオチドフラグメントが提供される。
【0046】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列包含のベクターが提供される。
【0047】
該ベクターはファージ、ウイルス、プラスミド、ファージミド、コスミド、バクミドまたは人工染色体をも含む適切な形状のいずれであってもよいが、これらに限定されるものではない。ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列は上記のポリヌクレオチドフラグメントのいずれをも包含する。
【0048】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列包含の外来性ポリヌクレオチドフラグメントを包含する宿主細胞が提供される。
【0049】
該外来性ポリヌクレオチドフラグメントは上記フラグメントのいずれであってもよい。該宿主細胞は原核細胞、真核細胞、細胞系、または多細胞性生物の一部としての細胞(例、形質転換生物の細胞)などのいずれの形状であってもよい。
【0050】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドを含む組換えタンパク質が提供される。
【0051】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、ヘパラナーゼ触媒活性保有組換えタンパク質を活性成分として含んでなる製剤組成物が提供される。
【0052】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、ヘパラナーゼ触媒活性保有組換えタンパク質を活性成分として含む医療用装置からなる医療用機器が提供される。
【0053】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、ヘパラナーゼ触媒活性の過剰発現細胞を含んでなるヘパラナーゼ過剰発現系が提供される。
【0054】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、染色体スプレッドのヒト・ヘパラナーゼ遺伝子を包含する染色体領域を同定する方法であって、(a)該染色体スプレッドを、ヘパラナーゼをエンコードする標識ポリヌクレオチドプローブとハイブリッド形成させる工程、(b)染色体スプレッドを洗浄し、過剰のハイブリッド非形成プローブを除去する工程、および(c)当該ハイブリッド形成した標識ポリヌクレオチドプローブと会合したシグナルを検索し、検出されたシグナルがヒトヘパラナーゼ遺伝子を包含する染色体領域の指標であるとする工程からなる方法が提供される。
【0055】
本発明を用い、腫瘍細胞転移、炎症および自己免疫を阻害する新薬を開発することができる。ヘパラナーゼ酵素をエンコードするhpa遺伝子の同定が異種発現系においての組換え酵素産生を可能とする。
【0056】
【好適な実施例の説明】
本発明は、ヘパラナーゼ活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド(以下では置換え可能なものとして、hpa、hpa cDNAまたはhpa遺伝子という)、それを保持するベクター、ヘパラナーゼを発現する形質導入細胞、およびヘパラナーゼ活性を有する組換えタンパク質に関する。
【0057】
本発明の少なくとも一つの態様を詳細に説明する前に、本発明はその応用に当って、以下の説明で述べた、あるいは図面で説明した成分の構築および配列の細部に限定されるものではないことを理解すべきである。本発明は様々な方法で具体化され、または実用化され、または実施され得る。また、本明細書で採用した表現法および用語法は説明を目的とするものであり、制限することを意図したものではないことを理解すべきである。
【0058】
本発明を用い、種々疾患の治療法を開発し、これら疾患に対する診断アッセイ法を開発し、また、基礎研究、とりわけ医薬・生物学の領域における基礎研究のための新しい手段を提供することができる。
【0059】
特に、本発明を用い、腫瘍細胞転移、炎症および自己免疫を阻害するための新薬を開発することができる。ヘパラナーゼ酵素をエンコードするhpa遺伝子の同定が異種発現系においての組換え酵素産生を可能とする。
【0060】
さらに、本発明を用い、ヘパリン結合増殖因子の生物利用能、ヘパリン結合増殖因子(例、bFGF、VEGF)およびサイトカイン(IL−8)への細胞性応答、血漿リポタンパク質との細胞相互作用、ウイルス性、原生動物性およびある種細菌性感染に対する細胞の感受性、および神経変性プラークの分解などを調整することができる。このように、組換えヘパラナーゼは外傷修復、脈管形成、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、炎症、神経変性疾患(例えば、ゲルストマン−シュトロイスラー症候群、クロイツフェルト−ヤコブ病、スクラピーおよびアルツハイマー病など)および特定のウイルス感染およびある種細菌性および原生動物性感染などの有力な治療手段である。組換えヘパラナーゼは血漿ヘパリンを中和するための有力なプロタミン置換体として使用することができる。
【0061】
本明細書において使用する用語「調整する」とは、疾患の進行を実質的に阻害すること、減速すること、または逆行させること、あるいは疾患または症状の臨床症候を実質的に改善すること、あるいは疾患または症状の臨床症候発現を実質的に防止することを意味する。したがって、「モジュレーター」とは疾患または症状を調整し得る作因物質を意味する。ウイルス性、原生動物性および細菌性感染の調整とは、ウイルス、細菌または原生動物の活性および/またはウイルス、細菌または原生動物の生活環期を実質的に中断、防止または低下させる効果、あるいはヒトまたは他の動物などの被験体においてウイルス、細菌または原生動物による感染を低下または防止する効果を意味する。
【0062】
本明細書において使用する用語「外傷」とは、被験者身体のいずれかの部位に対する傷害を意味し、急性症状、例えば、熱傷、化学傷、放射線熱傷、日焼けなどの紫外線照射に過度に露出したことによる熱傷など、身体組織の損傷、例えば、分娩および出産の結果による会陰損傷などの医療処置に際し被る損傷、例えば、会陰切開、切傷などの外傷誘発損傷、例えば、自動車事故および他の機械事故において被る損傷、および弾丸、ナイフ、その他の武器類、および術後損傷など、ならびに慢性的症状、例えば、褥瘡、床擦れ、糖尿病および循環不全に関連する症状、およびすべてのタイプのざ瘡(にきび)などを意味するが、これらに限定されるものではない。
【0063】
組換え酵素に対して作製した抗ヘパラナーゼ抗体は、生検標本、血漿サンプルおよび体液における微小転移、自己免疫病変および腎不全の免疫検出および診断に有用である。かかる抗体はヘパラナーゼ活性に対する中和剤としても作用する。
【0064】
ヘパラナーゼをエンコードするヒトhpa遺伝子のクローニングおよび形質導入細胞による組換えヘパラナーゼの発現を本明細書に報告する。これはクローン化される最初の哺乳動物ヘパラナーゼ遺伝子である。
【0065】
ヒト肝癌細胞から単離したヘパラナーゼの精製調製物をトリプシン消化およびミクロ配列決定に付した。
【0066】
解明したYGPDVGQPR(配列番号8)配列は、対応する逆翻訳DNA配列に対する相同性についてのESTデータベースをスクリーニングするのに用いた。2つの密接に関連するEST配列を同定し、その後同一であることを見出した。
【0067】
両クローンは1020bpの挿入断片を含んでおり、該挿入断片は973bpのオープン読み枠を含み、それに引き続いて27bpの3’非翻訳領域とポリA尾部を含んでいた。翻訳開始部位は同定されなかった。
【0068】
5’末端欠如のクローニングは、胎盤マラソン(Marathon)RACEcDNA複合体からのDNAのPCR増幅により、ESTクローン配列に従い選択したプライマーと複合体のリンカーを用い実施した。
【0069】
同定した3’エンコードESTクローンと一部重なり合っている900bpのPCRフラグメントが得られた。接合したcDNAフラグメント(hpa)(1721bpの長さ、配列番号9)は、図1および配列番号11に示すように、61,192ダルトンの計算値分子量を有する543アミノ酸のポリペプチド(配列番号10)をエンコードするオープン読み枠を含んでいた。
【0070】
ESTとPCR増幅cDNAとの間の799位(AからT)に単一ヌクレオチドの差異が観察された。この差異は1個のアミノ酸置換(TyrからPhe)に至る(図1)。さらに、公開されたEST配列は未同定ヌクレオチドを含んでいたが、ESTクローン両方のDNA配列決定により2個のヌクレオチドに分解した(それぞれ、配列番号9の1630位および1631位のGおよびC)。
【0071】
in vitroアッセイにおいてヘパラン硫酸の分解を触媒するhpa遺伝子産物の能力を、バキュロウイルス発現系を用い、昆虫細胞中全オープン読み枠を発現することにより試験した。
【0072】
hpa遺伝子含有ウイルスで感染させた細胞の抽出物と調整培地が、可溶性ECM誘導HSPGおよび未処理ECMに対する高レベルのヘパラン硫酸分解活性を示したが、この分解活性は、ヘパリンにより阻害された。一方、hpa遺伝子不含の同様の構築物を感染させた細胞はかかる活性を示さず、非感染細胞の活性をも示さなかった。
【0073】
種々の組織および細胞系におけるhpaRNAの発現パターンは、RT−PCRにより検討した。ヘパラナーゼ活性を有することがすでに知られている組織および細胞においてのみ発現されることが判明した。
【0074】
伸長した5’配列のクローニングは、マラソンRACEを用いるPCR増幅によりヒトSK−hep1細胞系から可能であった。SK−hep1 hpa cDNAの5’伸長配列はヒト胎盤から単離したhpa cDNAの配列と統合した(配列番号9)。統合した配列は、66,407ダルトンの計算値分子量を有する592アミノ酸のポリペプチド(配列番号14と15に示した)をエンコードするオープン読み枠(配列番号13および15)を含んでいた。このオープン読み枠は哺乳動物細胞発現系において触媒的に活性なヘパラナーゼの発現を指向していることが示された。発現されたヘパラナーゼは抗ヘパラナーゼ抗体によりウエスターンブロット分析において検出し得た。
【0075】
単一染色体ヒト/CHOとヒト/マウス体細胞ハイブリッドのパネルを用い、ヒト染色体4にヒト・ヘパラナーゼ遺伝子を位置づけた。したがって、新たに単離したヘパラナーゼ配列を用い、染色体スプレッドのヒト・ヘパラナーゼ遺伝子を包含する染色体領域を同定することができる。
【0076】
このように、本発明によりヘパラナーゼ触媒活性を有するポリペプチドエンコードポリヌクレオチド配列を包含するポリヌクレオチドフラグメント(DNAまたはRNA、一本鎖または二本鎖)が提供される。
【0077】
用語「ヘパラナーゼ触媒活性」またはその等価の用語「ヘパラナーゼ活性」とは両方ともに、ヘパランまたはヘパラン硫酸プロテオグリカン基質に特異的な哺乳動物エンドグリコシダーゼ水解活性をいい、ヘパリンまたはヘパラン硫酸をβ−脱離により分解する細菌酵素(ヘパラナーゼI、IIおよびIII)の活性に対立するものである(37)。
【0078】
本発明の好適な態様において、ポリヌクレオチドフラグメントは、全ヒト・ヘパラナーゼ酵素をエンコードする配列番号9のヌクレオチド63〜1691または配列番号13のヌクレオチド139〜1869である。
【0079】
しかし、本発明の範囲は、ヒト・ヘパラナーゼが哺乳動物ヘパラナーゼをエンコードするオープン読み枠(ORF)の最初の開示である以上、ヒト・ヘパラナーゼに限定されるものではない。hpa cDNA、その一部またはその配列に従って設計した合成オリゴヌクレオチドを用いることは、当業者が他の哺乳動物種の相同配列を含むゲノムおよび/またはcDNAクローンの同定を可能とする。
【0080】
それゆえ、本発明は、hpa cDNA、とりわけ配列番号9のヌクレオチド1〜721とハイブリッド形成し得る(緊縮または許容ハイブリッド形成の条件下対合する塩基であって、例えば、サムブルーク、フリッシュ、マニアティス(Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T.)(1989)分子クローニング。実験室マニュアル。コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク)ポリヌクレオチド配列を包含するポリヌクレオチドフラグメントをさらに目的とする。
【0081】
事実、ヘパラナーゼ活性保有ポリペプチドをエンコードし、配列番号9または13と少なくとも60%の相同性、好ましくは少なくとも70%の相同性、より好ましくは少なくとも80%の相同性、最も好ましくは少なくとも90%の相同性を有するポリヌクレオチド配列は、本発明範囲内のものである。
【0082】
本発明によるポリヌクレオチドフラグメントは配列番号9または13のいずれの部分を包含してもよい。例えば、新規配列である配列番号9のヌクレオチド63〜721を包含する。しかし、ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードする配列番号9または13のセグメントも包含する。
【0083】
「ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードする」という文言を本文および下記請求項で用いる場合、それはポリペプチドの合成を指向する能力をいい、その活性を必要とする場合には、翻訳後修飾、例えば、これらに限定されるものではないが、タンパク質分解(例、シグナルペプチドの除去およびプロ−またはプレ−タンパク質配列の除去)、メチオニン修飾、糖化、アルキル化(例、メチル化)、アセチル化などの後に、例えば、ECMおよび細胞表面会合HSの分解において触媒的に活性となるポリペプチドの合成指向能力をいう。
【0084】
本発明の好適な態様において、ポリヌクレオチドフラグメントによりエンコードされるポリペプチドは、配列番号10または14に示したアミノ酸配列またはその機能的部分、すなわちヘパラナーゼ触媒活性を有する部分を含む。
【0085】
しかし、ヘパラナーゼ活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドフラグメントは本発明の範囲内のものである。したがって、該ポリペプチドは配列番号10または14に記載のアミノ酸配列またはその機能的部分の対立遺伝子、種および/または誘発変異体であってもよい。
【0086】
事実、ヘパラナーゼ活性保有ポリペプチドをエンコードし、配列番号10または14と少なくとも60%の相同性、好ましくは少なくとも70%の相同性、より好ましくは少なくとも80%の相同性、最も好ましくは少なくとも90%の相同性を有するポリヌクレオチド配列は、本発明範囲内のものである。
【0087】
また、本発明は上記ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド鎖の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチド配列を含む一本鎖ポリヌクレオチドフラグメントの提供をも目的とする。本明細書にて使用する「相補的」という用語は塩基が対合する能力をいう。
【0088】
一本鎖ポリヌクレオチドフラグメントはDNAまたはRNAであってもよく、あるいはヌクレオチド類似体(例、チオ化ヌクレオチド)を含んでいてもよく、それは合成オリゴヌクレオチドであっても、形質導入宿主細胞により作製されたものであってもよく、特異的な塩基対合を供与する限り所望の鎖長のものであってもよく(例えば、8または10、好ましくはより長いヌクレオチド)、また、塩基対合を妨害しない限りミスマッチを含んでいてもよい。
【0089】
本発明はさらにヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列を包含するベクターの提供を目的とする。
【0090】
ベクターはどのタイプのものであってもよい。例えば、細菌に感染するファージまたは真核細胞に感染するウイルである。また、プラスミド、ファージミド、コスミド、バクミド、または人工染色体であってもよい。ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列は、上記ポリヌクレオチドフラグメントのいずれを含んでいてもよい。
【0091】
本発明はさらにヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードする外来性ポリヌクレオチドフラグメントを包含する宿主細胞の提供を目的とする。
【0092】
外来性ポリヌクレオチドフラグメントは上記フラグメントのいずれであってもよい。該宿主細胞はどのタイプのものであってもよい。例えば、それは原核細胞、真核細胞、細胞系、または生物の一部としての細胞である。外来性ポリヌクレオチドフラグメントは該細胞中に永続的に、または一過性に存在するものであってよい。換言すると、安定的または一過性のトランスフェクション、形質転換または形質導入により得られる形質導入細胞はすべて本発明範囲内のものである。本明細書に用いる「外来性」という用語は、ポリヌクレオチドフラグメントが外部から細胞に導入されるという事実をいう。そこで該フラグメントは複数コピーの一つに存在してもよく、また、1以上の染色体のいずれの部位に集積していてもよく、また、染色体外物質として存在してもよい。
【0093】
本発明はさらにヘパラナーゼ触媒活性を過度に発現する細胞を含むヘパラナーゼ過度発現系の提供を目的とする。該細胞はヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列とヘパラナーゼ過度発現指向の適切なプロモーターおよびエンハンサー配列を含む適切なベクターを一過性にまたは安定的に移入したまたは形質転換した宿主細胞である。しかし、過度発現細胞は、発現細胞の内因性ヘパラナーゼ遺伝子下流のプロモーターおよび/またはエンハンサー配列挿入断片からの(例えば、相同性組換えによる)産物でもあり、該内因性遺伝子からの過度発現を指向する。本明細書本文および請求項にて使用する「過度発現」という用語は、発現のレベルが、他の点で同一の条件下にある所定の細胞を典型的に特徴づける基礎発現レベルよりも高いものをいう。
【0094】
本発明はさらにヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドを含む組換えタンパク質の提供を目的とする。
【0095】
該組換えタンパク質は簡便なタンパク質精製手法により均一に近い状態まで精製することおよび/または添加物と混合することが可能である。該組換えタンパク質は上記細胞のいずれかを用い生産することができる。該組換えタンパク質はいかなる形状であってもよい。それは結晶形、脱水粉末形または溶液でもよい。該組換えタンパク質は純粋なヘパラナーゼを得るのに有用であり、さらに抗ヘパラナーゼ抗体、すなわちポリまたはモノクローナル抗体の誘出に、また、抗ヘパラナーゼインヒビターまたは薬物スクリーニング検定またはシステムにおけるスクリーニング活性成分として有用である。
【0096】
本発明はさらにヘパラナーゼ触媒活性保有組換えタンパク質を活性成分として含む製剤組成物の提供を目的とする。
【0097】
局所投与用製剤はローション、軟膏、ゲル剤、クリーム、坐剤、ドロップ、液剤、噴霧剤および粉剤を包含するが、これらに限定されるものではない。常套の製剤担体、水剤、粉末または油性基剤、増粘剤などが必要な場合、また望ましい場合もある。被覆コンドーム、ステント、活性パッド、および他の医療装置もまた有用である。事実、本発明の範囲はヘパラナーゼ触媒活性保有組換えタンパク質を活性成分として含む医療装置などの医療機器を包含する。
【0098】
経口投与用組成物は粉剤または顆粒、水中または非水媒体中懸濁液または溶液、薬包、カプセルまたは錠剤などを包含する。増粘剤、希釈剤、矯味剤、分散剤、乳化剤または結合剤などが望ましい場合がある。
【0099】
非経口投与用製剤は、緩衝剤、希釈剤、および他の適切な添加物をも含み得る無菌水溶液を包含するが、これらに限定されるものではない。
【0100】
投与は治療すべき症状の重度および感受性にもよるが、通常、一日一回または数回、数日ないし数ヶ月、または治療効果が現われるまでの、あるいは病状の衰退が達成されるまでの連続した治療方針をもって実施する。当業者は最適の用量、投与方法および反復度数を容易に決定することができる。
【0101】
さらに本発明によると、染色体スプレッド中にヒト・ヘパラナーゼ遺伝子を含んでいる染色体領域の同定方法が提供される。該方法は以下の方法工程を満たして実施される。最初の工程においては、染色体スプレッド(静止期または中期いずれかのスプレッド)を、ヘパラナーゼをエンコードする標識ポリヌクレオチドプローブとハイブリッド形成させる。該標識は、好ましくは、蛍光標識である。本方法の第二工程において、染色体スプレッドは洗浄して、過剰のハイブリッド非形成プローブを除去する。最後に、ハイブリッド形成した標識ポリヌクレオチドプローブと会合したシグナルを検索し、ヒト・ヘパラナーゼ遺伝子を含んでいる染色体領域の標であるシグナルを検出する。当業者は適切な標識反応に際し本明細書に開示の配列をどのように用いるか、また、in situハイブリッド形成により、ヒト・ヘパラナーゼ遺伝子を含んでいる染色体領域を検出するために標識プローブをどのように用いるかを知悉しているはずである。
【0102】
以下に実施例について言及するが、これらは上記説明とともに本発明を例証するものであり、限定しようとするものではない。
【0103】
【実施例】
以下のプロトコールおよび実験の詳細を引続く実施例にて言及する。
【0104】
ヒト肝癌細胞系およびヒト胎盤からのヘパラナーゼの精製と特性化
ヒト肝癌細胞系(Sk−hep−1)をヒト腫瘍誘導ヘパラナーゼの精製源として選定した。精製は実質的にフックス(Fuks)の米国特許第5,362,641号(本明細書に全文引用したものとして、参照により組込む)記載どおりとした。手短に説明すると、5×1011個の細胞を500リットル懸濁液中増殖し、以下の工程に付して約240,000倍まで精製した。(i) カチオン交換クロマトグラフィー(CM−セファデックス)をpH6.0、0.3〜1.4M NaCl勾配で実施した。(ii)カチオン交換クロマトグラフィー(CM−セファデックス)をpH7.4、0.1%CHAPSの存在下に0.3〜1.1M NaCl勾配で実施した。(iii)ヘパリン−セファロース・クロマトグラフィーをpH7.4、0.1%CHAPSの存在下に0.35〜1.1M NaCl勾配で実施した。(iv)ConA−セファロース・クロマトグラフィーをpH6.0、0.1%CHAPSおよび1M NaCl含有緩衝液にて実施し、0.25Mα−メチルマンノシドにより溶出した。(v)HPLCカチオン交換クロマトグラフィー(Mono−S)をpH7.4、0.1%CHAPSの存在下に0.25〜1M NaCl勾配で実施した。
【0105】
活性フラクションをプールし、TCAで沈殿させ、次いで沈殿物をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動および/またはトリプシン消化および逆相HPLCに付した。精製タンパク質のトリプシンペプチドを逆相HPLC(C8カラム)により分離し、均一のピークをアミノ酸配列分析に付した。
【0106】
精製した酵素を逆相HPLCに付し、次いでアミノ酸配列決定装置によりN−末端アミノ酸配列決定に付した(アプライド・バイオシステムズ)。
【0107】
細胞
ウシ角膜内皮細胞(BCEC)の培養を既に記載されたとおりに去勢ウシの眼球から確立した(19、38)。保存培養株を10%ウシ新生仔血清、5%FCSを補ったDMEM(1gグルコース/リットル)中で維持した。活性細胞増殖期に一日おきにbFGF(1ng/ml)を添加した(13、14)。
【0108】
ECM被覆皿の調製
BCEC(2〜5回継代)を初期密度2×105細胞/mlとして4−穴プレートに塗付し、硫酸不含フィッシャー培地および5%デキストランT−40中、12日間培養した。植え付け後1日目および5日目にNa35SO4(25μCi/ml)を加え、培養物は培地を換えることなく標識とともに培養した。内皮下ECMは0.5%トリトンX−100および20mM NH4OH含有PBSにより細胞層を溶解することで露出し(5分間、室温)、次いでPBSにより4回洗浄した。ECMは未変化のままで細胞性残屑を含まず、組織培養皿全体に強固に付着した(19、22)。
【0109】
可溶性硫酸標識プロテオグリカン(ピークIの物質)を調製するために、ECMをトリプシンで消化し(25μg/ml、6時間、37℃)、消化物を逆浸透により濃縮し、濃縮物をセファロース6Bゲル濾過カラムに負荷した。得られる高分子量物質(Kav<0.2、ピークI)を収集した。80%を超える標識物質がヘパラン硫酸プロテオグリカンから構成されていると判明した(11、39)。
【0110】
ヘパラナーゼ活性
細胞(1×106/35mm皿)、細胞溶解物または調整培地を35S−標識ECMの上部で20mMリン酸バッファー(pH6.2)の存在下に培養した(18時間、37℃)。細胞溶解物および調整培地はまた、硫酸標識ピークI物質(10〜20μl)とともに培養した。培地を収集し、遠沈(18,000×g、4℃、3分間)して、硫酸標識物質をセファロースCL−6Bカラム(0.9×30cm)上のゲル濾過により分析した。フラクション(0.2ml)を5ml/時間の流速でPBSにより溶出し、バイオ−フルオア・液体シンチレーションにより放射活性をカウントした。排除した容量(Vo)はブルーデキストランでマークされ、全量がフェノールレッドによる容量(Vt)を含んでいた。後者は遊離の硫酸エステルとともに移動することが示された(7、11、23)。HS側鎖の分解フラグメントはセファロース6Bより、0.5<Kav<0.8(ピークII)で溶出した(7、11、23)。トリプシンによりECMから遊離された殆ど未変化のHSPGが(PBSのみでの培養ではより低い程度で)Voの次に溶出された(Kav<0.2、ピークI)。カラム上に負荷した標識物の回収率は異なる実験において85%ないし95%であった(11)。各実験とも少なくとも3回実施したが、溶出位置の変動(Kav値)は±15%を超えなかった。
【0111】
hpa cDNAのクローニング
cDNAクローン257548および260138はI.M.A.G.E.協会(2130メモリアルパークウエイSW、ハンストビル、アラバマ35801)より入手した。該cDNAは当初プラスミドベクターpT3T7D−PacのEcoRIおよびNotIクローニング部位でクローン化された。これらのクローンは多少異なっていると報告されているが、DNA配列決定が示すところによるとこれらクローンは互いに一致する。マラソンRACE(cDNA末端の迅速増幅)ヒト胎盤(ポリ−A)cDNA複合体は、テルアビブ大学のヨッシ・シロー(Yossi Shiloh)教授からの恵与であった。この複合体はベクター不含であり、逆転写cDNAフラグメントを含んでいて、該フラグメントの両側に二本鎖接着体、部分的には一本鎖接着体が結合している。採用した特異複合体の構築は文献39aに記載されている。
【0112】
hp3 PCRフラグメントの増幅はクロンテック・ラボラトリーの提供によるプロトコールに従い実施した。増幅に使用した鋳型は上記複合体から取出したサンプルであった。増幅に使用したプライマーは以下のとおりである:
【0113】
第一工程:5’−プライマー:AP1:5’−CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC−3’(配列番号1);3’−プライマー:HPL229:5’−GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC−3’(配列番号2)。
【0114】
第二工程:巣化5’−プライマー:AP2:5’−ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC−3’(配列番号3);巣化3’−プライマー:HPL171:5’−GCATCTTAGCCGTCTTTCTTCG−3’(配列番号4)。HPL229およびHPL171はESTクローンの配列に従い選択した。それらはそれぞれ配列番号9のヌクレオチド933〜956および876〜897を包含する。
【0115】
PCRプログラムは94℃−4分、次いで94℃−40秒、62℃−1分、72℃−2.5分を30サイクルとした。増幅はエキスパンド・ハイ・フィデリティ(ベーリンガーマンハイム)により実施した。得られた約900bpのhp3PCR産物をBfrIおよびPvuIIにより消化した。クローン257548(phpa1)をEcoRIで消化し、エンド・フィリングし、さらにBfrIで消化した。その後、hp3 PCR産物のPvuII−BfrIフラグメントをクローンphpa1の平滑断端−BfrI末端にクローン化し、pT3T7−pacベクターにクローン化した全cDNAを保有するに至らしめ、phpa2と命名した。
【0116】
DNA配列決定
配列決定は自動化DNA配列決定装置(アプライド・バイオシステムズ、モデル373A)を使用し、ベクター特異および遺伝子特異プライマーにより実施した。各ヌクレオチドを少なくとも2つの独立したプライマーから読み取った。
【0117】
配列のコンピューター分析
配列類似性についてのデータベース検索をブラスト(Blast)ネットワークサービスにより実施した。DNAおよびタンパク質配列の配列分析と整列化を、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ(GCG)の開発したDNA配列分析ソフトウエアパッケージを用い実施した。
【0118】
RT−PCR
RNAはTRI−試薬(モレキュラー・リサーチセンター・インク)を用い、製造業者の指示書に従い調製した。1.25μgを採り、MuMLV逆転写酵素(ギブコBRL)およびオリゴ(dT)15プライマー(配列番号5)(プロメガ)を用いて逆転写反応を実施した。得られた第一鎖cDNAの増幅はTaqポリメラーゼ(プロメガ)により実施した。以下のプライマーを使用した:
HPU−355:5’−TTCGATCCCAAGAAGGAATCAAC−3’(配列番号6、配列番号9または11のヌクレオチド372〜394)。
HPL−229:5’−GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC−3’(配列番号7、配列番号9または11のヌクレオチド933〜956)。
PCRプログラムは94℃−4分、次いで94℃−40秒、62℃−1分、72℃−1分を30サイクルとした。
【0119】
昆虫細胞における組換えヘパラナーゼの発現
細胞、ハイ・ファイブおよびSf21昆虫細胞系をSF900II−SFM培地(ギブコBRL)中、単層培養として維持した。
【0120】
組換えバキュロウイルス
hpa遺伝子を含む組換えウイルスを、Bac−to−Bacシステム(ギブコBRL)を用い構築した。伝達ベクターpFastBacをSalIとNotIにより消化し、XhoIとNotIで消化したphpa2の1.7kbフラグメントと接合した。得られるプラスミドをpFasthpa2と命名した。pFasthpa4と命名した同一のプラスミドを複製として調製し、両方はそれぞれにさらなる実験に使用した。組換えバクミドを製造業者の指示書に従い、pFasthpa2、pFasthpa4により、またpFastBacにより生成させた。後者は陰性対照として用いた。組換えバクミドDNAをSf21昆虫細胞中に移入した。トランスフェクションの5日後に、組換えウイルスを採取し、T−25フラスコ中、ハイ・ファイブ昆虫細胞3×106個に感染させるために用いた。感染の2〜3日後に細胞を採取した。細胞4×106個を遠心分離し、20mMリン酸・クエン酸バッファーと50mM NaCl含有の反応バッファーに再懸濁した。細胞に3サイクルの凍結・融解を施し、溶解物を−80℃に保存した。調整培地は4℃に保存した。
【0121】
組換えヘパラナーゼの部分精製
組換えヘパラナーゼの部分精製はヘパリン−セファロース・カラムクロマトグラフィーと引続くスーパーデックス75カラム・ゲル濾過により実施した。pFhpa4ウイルス感染Sf21細胞の培地(150ml)をヘパリン−セファロース・クロマトグラフィーに付した。フラクション1mlの溶出は、10mM酢酸ナトリウムバッファー(pH5.0)中0.1%CHAPSおよび1mM DTTの存在下に0.35〜2M NaCl勾配により実施した。各フラクションのサンプル25μlにつきヘパラナーゼ活性を試験した。ヘパラナーゼ活性は0.65〜1.1M NaCl(フラクション18〜26、図10a)の範囲に溶出された。各フラクション5μlを15%SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、次いで硝酸銀染色した。ヘパリン−セファロースから溶出された活性フラクション(図10a)をプールし、YM3カットオフ膜上濃縮した(×6)。濃縮物0.5mlを、0.8M NaCl、1mM DTTおよび0.1%CHAPS含有10mM酢酸ナトリウムバッファー(pH5.0)で平衡化したスーパーデックス75FPLCカラム30mlに負荷した。フラクション(0.56ml)を0.75ml/分の流速で収集した。各フラクションの一部につきヘパラナーゼ活性を試験し、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、次いで硝酸銀染色した(11b)。
【0122】
【実施例1】
hpa遺伝子のクローニング
ヒト肝癌細胞(SK−hep−1)から単離したヘパラナーゼの精製フラクションをトリプシン消化およびミクロ配列決定に付した。EST(Expressed Sequence Tag; 発現配列標識)データベースをスクリーニングし、得られたペプチドに相当する逆翻訳DNA配列についての相同性を探査した。2つのEST配列(受託番号N41349およびN45367)はYGPDVGQPR(配列番号8)のペプチドをエンコードするDNA配列を含んでいた。これら2つの配列は8ないし9週の胎盤cDNAライブラリー(ソアーズ)から調製したクローン257548および260138(I.M.A.G.E.協会)から誘導した。同一であることの判明した両クローンは1020bpの挿入断片を含んでおり、この断片は973bpのオープン読み枠(ORF)とそれに続く27bpの3’非翻訳領域とポリA尾部を含んでいた。これらクローンの5’末端には翻訳開始部位(AUG)が確認されなかった。
【0123】
欠失5’末端のクローニングは胎盤マラソンRACEcDNA複合体からのDNAのPCR増幅により実施した。同定された3’エンコードESTクローンと一部重なり合う900bpのフラグメント(hp3と命名)が得られた。
【0124】
接合したcDNAフラグメントは1721bpの鎖長(配列番号9)であり、61,192ダルトンの計算値分子量を有する543アミノ酸のポリペプチド(配列番号10)をエンコードするオープン読み枠を含んでいた(図1および配列番号11参照)。クローン257548および260138に含まれる部分cDNA挿入断片の3’末端は配列番号9および図1のヌクレオチドG721に開始点があった。
【0125】
図1にさらに示すように、ESTクローンとPCR増幅配列との間には一個の配列不一致があり、それによってアミノ酸が増幅cDNAにおいてESTのTyr246からPhe246に置換されていた。PCR増幅cDNAフラグメントのヌクレオチド配列は2つの個々の増幅産物から確認した。新しい遺伝子をhpaと命名した。
【0126】
上記のように、ESTクローン257548および260138に含まれる部分cDNA挿入断片の3’末端は、hpaのヌクレオチド721(配列番号9)に開始点があった。安定な二次構造、例えば721位前後のヌクレオチドストレッチを含む基部およびループを形成するhpa cDNAの能力をコンピューターモデル化により検討した。安定な基部およびループ構造はヌクレオチド698〜724(配列番号9)が関与して形成されるらしいことが判明した。さらに、70%までの高GC含量はhpa遺伝子の5’末端領域を特徴づけるが、3’領域の高々約40%と対照的である。これらの知見はESTクローンの未成熟終止とそれ故の5’末端欠如を説明する。
【0127】
in vitroアッセイにおいてヘパラン硫酸の分解を触媒するhpa遺伝子産物の能力を試験するために、全オープン読み枠を、バキュロウイルス発現系により昆虫細胞で発現させた。hpa遺伝子含有ウイルスを感染させた細胞の抽出物は高レベルのヘパラン硫酸分解活性を示したが、hpa遺伝子不含の同様構築物を感染させた細胞はかかる活性を示さず、非感染細胞とも違った。これらの結果はさらに以下の実施例でも証明される。
【0128】
【実施例2】
可溶性ECM誘導HSPGの分解
ハイ・ファイブ細胞の単層培養物をpFasthpaプラスミド含有組換えバキュロウイルスにより、または挿入断片不含プラスミド含有対照ウイルスにより感染させた(72時間、28℃)。細胞を収集し、ヘパラナーゼ反応バッファー中3サイクルの凍結・融解により溶解した。細胞溶解液を次いで硫酸標識ECM誘導HSPG(ピークI)とともに培養し(18時間、37℃)、引き続き反応混合物のゲル濾過分析(セファロース6B)を実施した。
【0129】
図2に示すように、基質はVoの次に溶出された殆ど全部の高分子量(Mr)物質のみを含んでいた(ピークI、フラクション5〜20、Kav<0.35)。同様の溶出パターンは、HSPG基質を対照ウイルス感染細胞の分解液と培養した場合に得られた。これに対し、hpa含有ウイルス感染細胞の溶解液でHSPG基質を培養すると、高Mr基質が完全に低Mr標識分解フラグメントに変換された(ピークII、フラクション22〜35、0.5<Kav<0.75)。
【0130】
ピークIIに溶出されたフラグメントがヘパラン硫酸の分解産物であることは、それらが (i) アルカリ性水素化ホウ素またはパパインで処理することによりECMから放出された完全ヘパラン硫酸側鎖(Kav約0.33)よりも5ないし6倍小さいこと、また、(ii)パパインまたはコンドロイチナーゼABCによるさらなる消化に抵抗し、硝酸による脱アミノ化を受けやすいことにより示された(6、11)。
【0131】
同様の結果(未開示)はSf21細胞についても得られた。再度、hpa含有ウイルス(pFhpa)により感染した細胞にはヘパラナーゼ活性が検出されたが、対照ウイルス(pF)によるものでは検出されなかった。この結果は2つの個々に生成させた組換えウイルスによって得られた。対照の未感染ハイ・ファイブ細胞の溶解液ではHSPG基質を分解し得なかった。
【0132】
引続く実験においては、標識HSPG基質を感染ハイ・ファイブまたはSf21細胞により調整した培地で培養した。
【0133】
図3a〜bに示すように、ヘパラナーゼ活性は、高MrピークI基質がHS分解フラグメントを表す低MrピークIIへ変換したことの反映であり、これがpFhpa2またはpFhpa4ウイルス感染細胞の培養培地中に見出されたが、対照のpF1またはpF2ウイルスによるものでは認めなかった。対照の非感染ハイ・ファイブまたはSf21細胞の培養培地にはヘパラナーゼ活性が検出されなかった。
【0134】
pFhpa4ウイルス感染細胞の培地を50kDaカットオフ膜に通し、大まかに見積もった分子量の組換えヘパラナーゼ酵素を得た。図4に示したように、酵素活性すべてが上部画部に保持されており、流下(<50kDa)物には活性がなかった。この結果は予期した分子量のhpa遺伝子産物と矛盾がない。
【0135】
hpa産物をさらに特性化するために、ヘパラナーゼ介在HS分解の強力なインヒビター(40)であるヘパリンの阻害効果を試験した。
【0136】
図5a〜bに示すように、ピークI基質がピークIIのHS分解フラグメントに変換されるのは、ヘパリンの存在下、完全に阻止された。
【0137】
これらの結果を総括すると、ヘパラナーゼ酵素は、新たに同定したヒトhpa遺伝子含有バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞により活性型で発現されることが示される。
【0138】
【実施例3】
未処理ECM中HSPGの分解
次いで、未処理天然産ECMにおいてHSを分解する未処理感染昆虫細胞の能力を検討した。この目的のためにハイ・ファイブまたはSf21細胞を、代謝的に硫酸標識したECM上に播種し、次いで、pFhpa4または対照pF2ウイルスを感染させた(48時間、28℃)。次いで、培地のpHを6.2〜6.4に調整し、細胞をさらに標識したECMとともに28℃で48時間または37℃で24時間培養した。培養培地中に放出された硫酸標識物をセファロース6B上のゲル濾過により分析した。
【0139】
図6a〜bおよび7a〜bに示すように、ECMを対照pF2ウイルス感染細胞とともに培養すると、殆ど全部(>90%)がVoとともにあるいはその次に溶出される高Mrフラグメント(ピークI)からなる標識物を定常的に放出するに至った。ECMそれ自体に存在するおよび/または細胞により発現されるタンパク質分解活性が、高Mr物質の放出によるものであることはすでに示されていた(6)。殆ど未処理のHSPGは引続くヘパラナーゼによる分解の可溶性基質であり、そのことはまたヘパラナーゼ酵素をヘパリンにより阻害したときに蓄積する比較的大量のピークI物質によっても示されている(6、7、12、図9)。他方、標識したECMをpFhpa4ウイルスで感染した細胞と培養すると、60〜70%のECM会合放射活性を低Mr硫酸標識フラグメントの形で放出するに至るが(ピークII、0.5<Kav<0.75)、これは感染細胞とECMとの培養を28℃で行ったか37℃で行ったかには関係ない。対照の未処理非感染Sf21またはハイ・ファイブ細胞はECM HS側鎖を分解しなかった。
【0140】
引続く実験においては、図8a〜bに示すように、ハイ・ファイブまたはSf21細胞をpFhpa4または対照pF1ウイルスで感染させ(96時間、28℃)、培地を硫酸標識ECMとともに培養した。低Mr HS分解フラグメントはpFhpa4で感染した細胞により調整した培地と培養したときにのみECMから放出された。図9に示すように、これらフラグメントの産生はヘパリン存在下に阻止された。対照の非感染細胞培養培地にはヘパラナーゼ活性が検出されなかった。これらの結果が示すのは、pFhpa4ウイルス感染細胞により発現されるヘパラナーゼ酵素が、天然産未処理ECMの他の巨大分子成分(すなわち、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン)に複合体形成したときにHSを分解し得るということであり、その様式は高度転移腫瘍細胞または免疫系の活性化細胞について報告されているものと同じである(6,7)。
【0141】
【実施例4】
組換えヘパラナーゼの精製
組換えヘパラナーゼをヘパリン−セファロース・クロマトグラフィーによりpFhpa4感染Sf21細胞の培地から部分精製し(図10a)、次いでプールした活性フラクションをFPLCスーパーデックス75カラム上ゲル濾過した(図11a)。〜63kDaのタンパク質を観測し、その量を銀染色SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により検出し、関連するカラムフラクションのヘパラナーゼ活性と相関させた(それぞれ、図10bおよび11b)。このタンパク質は対照pF1ウイルス感染細胞の培養培地には検出されず、ヘパリン−セファロース上同様の分別に付した(未開示)。
【0142】
【実施例5】
種々の細胞型、器官および組織におけるhpa遺伝子の発現
図12a〜eに関して、RT−PCRを適用し、種々の細胞型および組織によるhpa遺伝子の発現を評価した。この目的のために、全RNAを逆転写し、増幅した。予測した585bp鎖長のcDNAが、ヒト腎臓、胎盤(8および11週)および母斑組織に、ならびに単離したばかりの短時間(1.5〜48時間)培養ヒト胎盤細胞栄養層細胞(図12a)に明瞭に証明されたが、これらはすべて高いヘパラナーゼ活性を示すことが知られている(41)。hpa転写物は正常ヒト好中球によっても発現された(図12b)。これに対し、胎児性ヒト筋肉組織、胸腺、心臓および副腎には検出し得るhpa mRNAの発現がなかった(図12b)。hpa遺伝子は、これらがすべてではないが数種のヒト膀胱癌細胞系(図12c)、SK肝臓癌(SK−hep−1)、卵巣癌(OV1063)、乳癌(435,231)、メラノーマおよび巨核球(DAMI、CHRF)ヒト細胞系により発現された(図12d〜e)。
【0143】
上記hpa転写物の発現パターンは、種々の組織および細胞型において定量されたヘパラナーゼ活性レベルと非常に良好な相関関係にあることが決定された(未開示)。
【0144】
【実施例6】
hpa相同遺伝子
ESTデータベースによりhpa遺伝子に相同の配列をスクリーニングした。3種のマウスESTを同定し(受託番号Aa177901(マウス脾臓から)、Aa067997(マウス皮膚から)、Aa47943(マウス胚から))、629bpの部分的オープン読み枠(5’末端欠失)および195bpの3’非翻訳領域(配列番号12)を含む824bpのcDNAフラグメントに組込んだ。図13に示すように、コード領域はhpa cDNA配列の3’末端に80%類似している。これらEST類は恐らくマウスヘパラナーゼをエンコードするマウスhpa同族体のcDNAフラグメントである。
【0145】
共通タンパク質ドメインを検索して、ヘパラナーゼと数種の前駆体タンパク質、例えば、プロコラーゲンアルファ1前駆体、チロシン−タンパク質キナーゼ−RYK、フィブリン−1、インシュリン様成長因子結合タンパク質およびその他数種との間のアミノ末端相同性を明らかにした。アミノ末端基は高度に疎水性であり、潜在的なトランスメンブランドメインを含む。既知シグナルペプチド配列に対する相同性は、それがタンパク質局在化のためのシグナルペプチドとして機能し得ることを示唆する。
【0146】
【実施例7】
ヒトSK−hep1細胞系からのhpa cDNA伸長5’末端の単離
マラソンRACE(cDNA末端の迅速増幅)キット(クロンテック)を用い、hpa cDNAの5’末端をヒトSK−hep1細胞系から単離した。全RNAはTRI−試薬(モレキュラー・リサーチセンター・インク)を用い、製造業者の指示書に従いSK−hep1細胞から調製した。ポリA+RNAをmRNA分離機キット(クロンテック)を用い単離した。
【0147】
マラソンRACE SK−hep1cDNA複合体は製造業者の推奨に従い構築した。初回増幅はアダプター特異プライマーAP1:5’−CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC−3’(配列番号1)および配列番号9のヌクレオチド119〜99に相当するhpa特異アンチセンスプライマーhpl−629:5’−CCCCAGGAGCAGCAGCATCAG−3’(配列番号17)を用い実施した。得られたPCR産物を第2回の増幅に付し、その際アダプター特異巣化プライマーAP2:5’−ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC−3’(配列番号3)および配列番号9のヌクレオチド83〜63に相当するhpa特異アンチセンス巣化プライマーhpl−666:5’−AGGCTTCGAGCGCAGCAGCAT−3’(配列番号18)を用いた。PCRプログラムは以下のとおりとした:94℃−1分間のホットスタート、次いで90℃−30秒、68℃−4分を30サイクルとした。得られる300bpのDNAフラグメントをアガロースゲルから抽出し、ベクターpGEM−Tイージー(Easy)(プロメガ)にクローン化した。得られる組換えプラスミドをpHPSK1と命名した。
【0148】
pHPSK1挿入断片のヌクレオチド配列を決定し、それが胎盤hpa cDNAの5’末端62ヌクレオチド(配列番号9)およびさらに配列番号13おおび15の最初の178ヌクレオチドである上流178ヌクレオチドを含むことが判明した。
【0149】
1個のヌクレオチドの相違はSK−hep1cDNAと胎盤cDNAとの間で一致した。胎盤cDNAの9位(配列番号9)の「T」誘導体をSK−hep1cDNAの対応する187位(配列番号13)において「C」誘導体に置換えた。
【0150】
この相違は胎盤から単離された数種のさらなるcDNAクローンの配列分析により確認されるように、胎盤cDNAクローンの5’末端での突然変異によると思われるが、これはSK−hep1cDNA同様、配列番号9位のCを含んでいた。
【0151】
SK−hep1 hpa cDNAの5’伸長配列をヒト胎盤から単離したhpa cDNAの配列(配列番号9)に組入れた。組み上げた配列は、配列番号14および15に示すように、66,407ダルトンの計算値分子量を有する592アミノ酸のポリペプチドをエンコードするオープン読み枠を含んでいた。この読み枠は93bpの5’非翻訳領域(UTR)に隣接していた。
【0152】
【実施例8】
hpa遺伝子の上流ゲノム領域の単離
hpa遺伝子の上流領域をゲノム・ウオーカーキット(クロンテック)により製造業者の推奨に従い単離した。該キットは5種のヒトゲノムDNAサンプルを含み、それぞれのサンプルは異なる制限エンドヌクレアーゼ(EcoRV、ScaI、DraI、PvuIIおよびSspI)で消化して平滑末端を創出してある。
【0153】
平滑末端DNAを部分的に一本鎖としたアダプターに結合する。ゲノムDNAサンプルは、アダプター特異プライマーおよび遺伝子特異プライマーを用い、PCR増幅に付した。増幅はエキスパンド・ハイ・フィデリティ(ベーリンガーマンハイム)により実施した。
【0154】
初回増幅はap1プライマー:5’−GTAATACGACTCACTATAGGGC−3’(配列番号19)および配列番号9のヌクレオチド83〜63に相当するhpa特異アンチセンスプライマーhpl−666:5’−AGGCTTCGAGCGCAGCAGCAT−3’(配列番号18)を用い実施した。PCRプログラムは以下のとおりとした:94℃−3分間のホットスタート、次いで94℃−40秒、67℃−4分を36サイクルとした。
【0155】
初回増幅のPCR産物を1:50に希釈した。希釈したサンプル1μlを2回目の増幅の鋳型として用い、該増幅には巣化アダプター特異プライマーap2:5’−ACTATAGGGCACGCGTGGT−3’(配列番号20)および配列番号9のヌクレオチド62〜42に相当するhpa特異アンチセンスプライマーhpl−690:5’−CTTGGGCTCACCTGGCTGCTC−3’(配列番号21)を用いた。得られる増幅産物はアガロースゲル電気泳動により分析した。5種の異なるPCR産物を5回の増幅反応により得た。SspI消化DNAから得た約750bpのDNAフラグメントをゲル抽出した。精製したフラグメントをプラスミドベクターpGEM−Tイージー(プロメガ)に結合した。得られる組換えプラスミドをpGHP6905と命名し、hpa挿入断片のヌクレオチド配列を決定した。
【0156】
594ヌクレオチドの部分配列を配列番号16に示す。配列番号13の最終ヌクレオチドは配列番号13のヌクレオチド93に相当する。配列番号16のDNA配列はhpa cDNAの5’領域およびhpa遺伝子のプロモーター領域を含むと予測されるゲノム上流領域の501ヌクレオチドを含んでいる。
【0157】
【実施例9】
ヒト293細胞系における592アミノ酸HPAポリペプチドの発現
592アミノ酸のオープン読み枠(配列番号13および15)はSK−hep1 hpa cDNAの5’末端に相当する110bpを胎盤cDNAと結合させることにより構築した。より詳しくは、胎盤hpaDNAのマラソンRACE−PCR増幅産物をSacIで消化し、約1kbのフラグメントをSacI−消化pGHP6905プラスミドに結合した。得られるプラスミドをEarIおよびAatIIで消化した。EarI粘着性末端は平滑であり、約280bpのEarI/平滑−AatIIフラグメントを単離した。このフラグメントをEcoRIで消化したpFasthpa(クレノウフラグメントにより平滑末端とし、さらにAatIIで消化した)と結合した。得られるプラスミドは1827bpの挿入断片を含み、該断片は1776bpのオープン読み枠、31bpの3’UTRおよび21bpの5’UTRを含んでいた。このプラスミドをpFastLhpaと命名した。
【0158】
哺乳動物発現ベクターを構築し、ヒト細胞において592アミノ酸のヘパラナーゼポリペプチドの発現を稼動させた。hpa cDNAをBssHIIおよびNotIによりpFasthpaから切り出した。得られる1850bpのBssHII−NotIフラグメントをMluIおよびNotIで消化した哺乳動物発現ベクターpSI(プロメガ)に結合した。得られる組換えプラスミドpSIhpaMet2をヒト293胎児性腎臓細胞系に移入した。
【0159】
592アミノ酸ヘパラナーゼの一過性発現をウエスターンブロット分析により検討し、酵素活性をゲルシフトアッセイにより試験した。これらの手法は両方とも1998年5月1日出願の米国特許出願09/071,739にすべて記載されている(本出願を本明細書に全文記載したものとして参照により組込む)。トランスフェクションの3日後に細胞を取得した。取得した細胞を150mM NaCl、50mMトリスpH7.5、1%トリトンX−100、1mM PMSFおよびプロテアーゼインヒビターカクテル(ベーリンガーマンハイム)を含む溶解バッファーに再懸濁した。タンパク質抽出サンプル40μgをSDS−PAGEによる分離に用いた。タンパク質をPVDFハイボンド−P膜(アマシャム)に移した。該膜を米国特許出願09/071,739記載のとおりにアフィニティ精製ポリクローナル抗ヘパラナーゼ抗体と培養した。約50kDaの主バンドを移入膜に観察し、同様に約65kDaのマイナーバンドを観察した。同様のパターンを米国特許出願09/071,739に示されたとおりにpShpaを移入した細胞の抽出物に観察した。これら2つのバンドは恐らく移入細胞により産生された組換えヘパラナーゼタンパク質の2つの形状を表している。65kDaのタンパク質は恐らくヘパラナーゼ前駆体を表しており、50kDaのタンパク質がここでは処理工程を経たあるいは成熟した形状であることを示唆している。
【0160】
pShpaMet2移入細胞に発現された組換えタンパク質の触媒活性をゲルシフトアッセイにより試験した。移入細胞抽出物および偽移入細胞抽出物を、20mMリン酸・クエン酸バッファー(pH5.4)、1mM CaCl2、1mM DTTおよび50mM NaClの存在下にヘパリン(各反応において6μg)と37℃で一夜培養した。反応混合物を次いで10%ポリアクリルアミドゲル上で分離した。組換えヘパラナーゼの触媒活性は、移入細胞抽出物で培養したヘパリン分子が、対照に比較して、より速く移動することにより明瞭に証明された。急速な移動は高分子量ヘパリン分子の消失と低分子量分解産物の生成を示す。
【0161】
【実施例10】
hpa遺伝子の染色体局在化
hpa遺伝子の染色体地図化を、UK HGMPリソースセンター(ケンブリッジ、英国)から入手した単一染色体ヒト/CHOとヒト/マウス体細胞ハイブリッドのパネルを用いて実施した。
【0162】
体細胞ハイブリッドDNA各40ngをPCR増幅に付したが、その際、配列番号9のヌクレオチド564〜586に相当するhpaプライマー:hpu565:5’−AGCTCTGTAGATGTGCTATACAC−3’(配列番号22)および配列番号9のヌクレオチド897〜876に相当するアンチセンスプライマーhpl171:5’−GCATCTTAGCCGTCTTTCTTCG−3’(配列番号23)を使用した。
【0163】
PCRプログラムは以下のとおりとした:94℃−3分間のホットスタート、次いで94℃−45秒、66℃−1分、68℃−5分を7サイクルとし、次いで94℃−45秒、62℃−1分、68℃−5分を30サイクルとし、72℃での最終拡張10分とした。
【0164】
反応はエキスパンド・ロングPCR(ベーリンガーマンハイム)により実施した。得られる増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分析した。図14に示したように、約2.8Kbの単一バンドが染色体4から、同様に対照のヒトゲノムDNAから得られた。2.8kbの増幅産物はゲノムhpaクローンの増幅に基づくと期待される(データ未開示)。ハムスターおよびマウスの対照DNAサンプルにも、他のヒト染色体の体細胞ハイブリッドにも増幅産物は得られなかった。
【0165】
本発明をその特定の態様と関連づけて記載したが、多くの代替法、変更、および変法が当業者に明らかであることがはっきりしている。したがって、添付の特許請求の範囲の精神と広範な範囲に含まれるかかる代替法、変更、および変法をも包含することを意図するものである。
【0198】
【引用文献リスト】
1. Wight, T.N., Kinsella, M.G., and Qwarnstromm, E.E.(1992)。細胞接着、移動および増殖におけるプロテオグリカンの役割。Curr.Opin. Cell Biol. 4、793〜801。
2. Jackson, R.L., Busch, S.J., and Cardin, A.L.(1991)。グリコサミノグリカン:分子の性質、タンパク質相互作用および生理過程における役割。Physiol. Rev. 71、481〜539。
3. Wight, T.N.(1989)。動脈内プロテオグリカンの細胞生物学。Arteriosclerosis 9、1〜20。
4. Kjellen, L., and Lindahl, U.(1991)。プロテオグリカン:構造と相互作用。Annu. Rev. Biochem. 60、443〜475。
5. Rouslahti,E.,and Yamaguchi, Y.(1991)。増殖因子活性モジュレーターとしてのプロテオグリカン。Cell 64、867〜869。
6. Vlodavsky, I., Eldor, A., Haimovitz-Friedman, A., Matzner, Y., Ishai-Michaeli, R., Levi, E., Bashkin, P., Lider, O., Naparstek, Y., Cohen, I.R., and Fuks, Z.(1992)。血小板および免疫系の循環細胞によるヘパラナーゼの発現:血管外遊出および溢血関与の可能性。Invasion & Metastasis 12、112〜127。
7. Vlodavsky, I., Mohsen, M., Lider, O., Ishai-Michaeli, R., Ekre, H.−P., Svahn, C.M., Vigoda,M., and Peretz, T.(1995)。ヘパリンのヘパラナーゼ阻害種による腫瘍転移阻害。Invasion & Metastasis 14、290〜302。
8. Nakajima, M., Irimura, T., and Nicolson, G.L.(1988)。ヘパラナーゼおよび腫瘍転移。J. Cell Biochem. 36、157〜167。
9. Nicolson,G.L.(1988)。腫瘍転移の臓器特異性:特異的二次部位における悪性腫瘍細胞の選択接着、浸襲と増殖の役割。Cancer Met.Rev.,7、143〜188。
10. Liotta, L.A., Rao, C.N., and Barsky, S.H.(1983)。腫瘍浸襲および細胞外マトリックス。Lab. Invest. 49、639〜649。
11. Vlodavsky, I., Fuks, Z., Bar-Ner, M., Ariav, Y., and Schirrmacher, V.(1983)。内皮下細胞外マトリックスにおける硫酸化プロテオグリカンのリンパ腫細胞介在分解;腫瘍細胞転移との関連。Cancer Res. 43、2704〜2711。
12. Vlodavsky, I., Ishai-Michaeli, R., Bar-Ner, M., Fridman, R., Horowitz, A.T., Fuks, Z. and Biran, S.(1988)。腫瘍転移と脈管形成におけるヘパラナーゼの関与。Is. J. Med. 24、464〜470。
13. Vlodavsky, I., Liu, G.M., and Gospodarowicz, D.(1980)。プラスティックに対比し、細胞外マトリックス上に維持されたヒト腫瘍細胞の形態学的外観、増殖挙動および移動活性。Cell 19、607〜616。
14. Gospodarowicz, D.,Delgado, D., and Vlodavsky, I.(1980)。in vitro細胞増殖上の細胞外マトリックスの許容効果。Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77、4094〜4098。
15. Bashkin, P., Doctrow, S., Klagsbrun, M., Svahn, C.M., Folkman, J., and Vlodavsky, I. (1989)。塩基性線維芽細胞増殖因子は皮内下細胞外マトリックスに結合し、ヘパリナーゼおよびヘパリン様分子により放出される。Biochemistry, 28、1737〜1743。
16. Parish, C.R., Coombe, D.R., Jakobsen, K.B., and Underwood, P.A.(1987)。硫酸化多糖は腫瘍細胞誘導ヘパラナーゼをブロックすることにより腫瘍転移を阻害するという証拠。Int. J. Cancer 40:511〜517。
16a. Vlodavsky, I., Hua-Quan Miao., Benezra, M., Lider, O., Bar-Shavit, R., Schmidt, A., and Peretz, T.(1997)。脈管形成と転移における細胞外マトリックス、ヘパラン硫酸プロテオグリカンおよびヘパラン硫酸分解酵素の関与。腫瘍脈管形成。編集:C.E. Lewis, R. Bicknell & N. Ferrara。オックスフォード大学出版、オックスフォード、英国、125〜140頁。
17. Burgess, W.H., and Maciag, T.(1989)。タンパク質のヘパリン−結合(線維芽細胞)増殖因子ファミリー。Annu. Rev. Biochem. 58:575〜606。
18. Folkman, J., and Klagsbrun, M.(1987)。脈管形成因子。Science 235、442〜447。
19. Vlodavsky, I., Folkman, J., Sullivan, R., Fridman, R., Ishai-Michaeli, R., Sasse, J., and Klagsbrun, M.(1987)。内皮細胞誘導塩基性線維芽細胞増殖因子:合成と内皮下細胞外マトリックスへの析出。Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84、2292〜2296。
20. Folkman, J., Klagsbrun, M., Sasse, J., Wadzinski, M., Ingber, D., and Vlodavsky, I.(1980)。ヘパリン結合脈管形成タンパク質−塩基性線維芽細胞増殖因子−は基底膜内に貯蔵される。Am. J. Pathol.,130、393〜400。
21. Cardon-Cardo, C., Vlodavsky, I., Haimovitz-Friedman, A., Hicklin, D., and Fuks, Z.(1990)。正常ヒト組織における塩基性線維芽細胞増殖因子の発現。Lab. Invest. 63、832〜840。
22. Ishai-Michaeli, R., Svahn, C.-M., Chajek-Shaul, T., Korner, G., Ekre, H.-P., and Vlodavsky, I.(1992)。脈管内皮および細胞外マトリックスからの塩基性線維芽細胞因子放出におけるヘパリンのサイズと硫酸化の重要性。Biochemistry, 31、2080〜2088。
23. Ishai-Michaeli, R., Eldor, A., and Vlodavsky, I.(1990)。血小板、好中球およびリンパ腫細胞により発現されるヘパラナーゼ活性は細胞外マトリックスから活性線維芽細胞増殖因子を放出する。Cell Reg. 1、833〜842。
24. Vlodavsky, I., Bar-Shavit, R., Ishai-Michaeli, R., Bashkin, P., and Fuks, Z.(1991)。細胞外腐骨形成と線維芽細胞増殖因子の放出:調整メカニズム? Trends Biochem. Sci. 16、268〜271。
25. Vlodavsky, I., Bar-Shavit, R., Korner, G., and Fuks, Z.(1993)。細胞外マトリックス結合増殖因子、酵素および血漿タンパク質。基底膜において:細胞と分子からの観点(D.H. Rohrbach and R. Timpl編纂)、327〜343頁。アカデミック・プレス・インク、オルランド、フロリダ。
26. Yayon, A., Klagsbrun, M., Esko, J.D., Leder, P., and Ornitz, D.M.(1991)。塩基性線維芽細胞増殖因子がその高親和性レセプターに結合するには細胞表面ヘパリン様分子が要求される。Cell、64、841〜848。
27. Spivak-Kroizman, T., Lemmon, M.A., Dikic, I., Ladbury, J.E., Pinchasi, D., Huang, J., Jaye, M., Crumley, G., Schlessinger, J., and Lax, I.(1994)。FGF分子のヘパリン誘導オリゴマー化はFGFレセプターの二量化、活性化、および細胞増殖の原因である。Cell、79、1015〜1024。
28. Ornitz, D.M., Herr, A.B., Nilsson, M., West, a., J., Svahn, C.-M., and Waksman, G.(1995)。合成ヘパラン誘導二糖および三糖によるFGF結合とFGFレセプター活性化。Science、268、432〜436。
29. Gitay-Goren, H., Soker, S., Vlodavsky, I., and Neufeld, G.(1992)。細胞表面会合ヘパリン様分子は脈管内皮増殖因子(VEGF)がその細胞表面レセプターに結合するために必要である。J. Biol. Chem.,267、6093〜6098。
30. Lider, O., Baharav, E., Mekori, Y., Miller, T., Naparstek, Y., Vlodavsky, I., and Cohen, I.R.(1989)。Tリンパ球ヘパラナーゼのヘパリノイドインヒビターで動物を処理することによる実験的自己免疫疾患の抑制と同種異型移植片生存の延長。J. Clin. Invest., 83、752〜756。
31. Lider, O., Cahalon, L., Gilat, D., Hershkovitz, R., Siegel, D., Margalit, R., Shoseyov, O., and Cohn, I.R.(1995)。腫瘍壊死因子αを阻害する二糖は酵素ヘパラナーゼにより細胞外マトリックスから形成される。Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,92、5037〜5041。
31a. Rapraeger, A., Krufka, A., and Olwin, B.R.(1991)。bFGF介在線維芽細胞増殖と筋芽細胞分化に対するヘパラン硫酸の必要性。Science,252、1705〜1708。
32. Eisenberg, S., Sehayek, E., Olivecrona, T., and Vlodavsky, I.(1992)。リポタンパク質リパーゼはリポタンパク質が細胞表面および細胞外マトリックス上のヘパラン硫酸に結合するのを促進する。J. Clin. Invest.、90、2013〜2021。
33. Shieh, M-T., Wundunn, D., Montgomery, R.I., Esko, J.D., and Spear, P.G.J.(1992)。単純ヘルペスウイルスの細胞表面レセプターはヘパラン硫酸プロテオグリカンである。J. Cell Biol.,116、1273〜1281。
33a. Chen, Y., Maguire, T., Hileman, R.E., Fromm, J.R., Esko, J.D., Linhardt, R.J., and Marks, R.M.(1997)。デング熱ウイルスの感染性は標的細胞ヘパラン硫酸に結合するエンベロープタンパク質に依存する。Nature Medicine 3、866〜871。
33b. Putnak, J.R., Kanesa-Thasan, N., and Innis, B.L.(1997)。デング熱ウイルスの推定細胞レセプター。Nature Medicine 3、828〜829。
34. Narindrasorasak, S., Lowery, D., Gonzalez-DeWhitt, P., Poorman, R.A., Greenberg, B., Kisilevsky, R.(1991)。アルツハイマーβ−アミロイド前駆体タンパク質とヘパラン硫酸プロテオグリカンの基底膜型との間の高親和性相互作用。J. Biol. Chem.、266、12878〜83。
35. Ross, R.(1993)。アテローム性動脈硬化症の病因:1990年代の展望、Nature(Lond.)、362:801〜809。
36. Zhong-Sheng, J., Walter, J., Brecht, R., Miranda, D., Mahmood Hussain, M., Innerarity, T.L., and Mahley, W.R.(1993)。培養細胞によるアポリポタンパク質E−濃縮残余リポタンパク質の結合と取込みにおけるヘパラン硫酸プロテオグリカンの役割。J. Biol. Chem.、268、10160〜10167。
37. Ernst, S., Langer, R., Cooney, Ch.L., and Sasisekharan, R.(1995)。グリコサミノグリカンの酵素分解。Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5)、387〜444。
38. Gospodarowicz, D., Mescher, A.L., Birdwell, CR.(1977)。線維芽細胞および表皮増殖因子によるin vitro角膜内皮細胞増殖の促進。Exp Eye Res 25、75〜89。
39. Haimovitz-Friedman, A., Falcone, D.J., Eldor, A., Schirrmacher, V., Vlodavsky, I., and Fuks, Z.(1991)。腫瘍細胞誘導因子による血小板ヘパラナーゼの活性化。Blood 78、789〜796。
39a. Savitsky, K., Platzer, M., Uziel, T., Gilad, S., Sartiel, A., Rosental, A., Elroy-Stein, O., Siloh, Y. and Rotman, G.(1997)。毛細管拡張性失調症:非翻訳配列の構造多様性がATM遺伝子発現の複雑な翻訳後調整を示唆する。Nucleic Acids Res.25(9)、1678〜1684。
40. Bar-Ner, M., Eldor, A., Wasserman, L., Matner, Y., and Vlodavsky, I.(1987)。修飾非抗凝集ヘパリン種による細胞外マトリックスヘパラン硫酸のヘパラナーゼ介在分解の阻害。Blood、70、551〜557。
41. Goshen, R., Hochberg, A., Korner, G., Levi, E., Ishai-Micaeli, R., Elkin, M., de Grot, N., and Vlodavsky, I.(1996)。胎盤ヘパラナーゼの精製と特性化および培養細胞栄養層によるその発現。Mol. Human Reprod. 2、679〜684。
【図面の簡単な説明】
【図1】 hpa cDNAのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を表す。EST(発現配列標識)とPCR増幅cDNA(逆転写RNA)との間の799位(AからT)の1個のヌクレオチドの差異および得られるアミノ酸置換(TyrからPhe)について、それぞれ上と下に置換した単位示す。システイン残基とポリアデニル化共通配列に下線を付す。星印は停止コドンTGAを示す。
【図2】 pFhpa2ウイルス感染ハイ・ファイブ(High Five)細胞の溶解による可溶性硫酸標識HSPG基質の分解を示す。pFhpa2ウイルス感染したハイ・ファイブ細胞の溶解物(●)または対照pF2ウイルス(□)は硫酸標識ECM誘導可溶性HSPG(ピークI)と培養した(18時間、37℃)。培養した培地を次いでセファロース6B上ゲル濾過に付した。低分子量HS分解フラグメント(ピークII)はpFhpa2感染細胞との培養に際してのみ産生されたが、pF2感染細胞の溶解によるHSPG基質の分解(◇)はなかった。
【図3a−b】 pFhpa2およびpFhpa4感染細胞の培地による可溶性硫酸標識HSPG基質の分解を示す。pFhpa2(3a)またはpFhpa4(3b)ウイルス感染したハイ・ファイブ細胞の溶解物(●)または対照pF2ウイルス(□)は硫酸標識ECM誘導可溶性HSPG(ピークI、◇)と培養した(18時間、37℃)。培養した培地を次いでセファロース6B上ゲル濾過に付した。低分子量HS分解フラグメント(ピークII)はhpa遺伝子含有ウイルスとの培養に際してのみ産生された。対照ウイルス感染細胞の培地によるHSPG基質の分解はなかった。
【図4】 pFhpa2感染細胞により発現されるヘパラナーゼ活性のサイズ分画を示す。pFhpa2感染ハイ・ファイブ細胞の培地を50kDaカットオフ膜に負荷した。ヘパラナーゼ活性(ピークI基質(◇)のピークII HS分解フラグメントへの変換)は高分子量部(>50kDa)(●)に見出されたが、低分子量部(<50kDa)(○)には認めなかった。
【図5a−b】 pFhpa2およびpFhpa4感染ハイ・ファイブ細胞により発現されるヘパラナーゼ活性に対するヘパリンの影響を示す。pFhpa2(5a)およびpFhpa4(5b)感染ハイ・ファイブ細胞の培地を、ヘパリン10μg/mlの不存在下(●)または存在下(△)に、硫酸標識ECM誘導可溶性HSPG(ピークI、◇)と培養した(18時間、37℃)。低分子量HS分解フラグメントの産生はヘパラナーゼ活性の強力なインヒビターであるヘパリンの存在下に完全に消滅していた(6、7)。
【図6a−b】 ウイルス感染ハイ・ファイブ細胞およびSf21細胞による硫酸標識ECMの分解を示す。ハイ・ファイブ細胞(6a)およびSf21細胞(6b)を硫酸標識ECM上に塗付し、pFhpa4(●)または対照pF1(□)ウイルスとともに培養した(48時間、28℃)。対照非感染Sf21細胞(R)を同様に標識したECM上に塗付した。培養した培地のpHを6.0〜6.2に調整し、37℃で24時間培養した。培養培地中に放出された硫酸標識物質をセファロース6B上ゲル濾過により分析した。HS分解産物はhpa含有ウイルス感染細胞によってのみ産生された。
【図7a−b】 ウイルス感染細胞による硫酸標識未処理ECMの分解を示す。ハイ・ファイブ細胞(7a)およびSf21細胞(7b)を硫酸標識ECM上に塗付し、pFhpa4(●)または対照pF1(□)ウイルスで感染させた(48時間、28℃)。対照非感染Sf21細胞(R)を同様に標識したECM上に塗付した。培養した培地のpHを6.0〜6.2に調整し、28℃で48時間培養した。培養培地中に放出された硫酸標識分解フラグメントをセファロース6B上ゲル濾過により分析した。HS分解フラグメントはhpa含有ウイルス感染細胞によってのみ産生された。
【図8a−b】 pFhpa4感染細胞の培養培地による硫酸標識未処理ECMの分解を示す。pFhpa4(●)または対照pF1(□)ウイルスで感染したハイ・ファイブ細胞(8a)およびSf21細胞(8b)の培養培地を未処理硫酸標識ECMとともに培養した(48時間、37℃、pH6.0)。ECMも対照非感染Sf21細胞(R)の培地とともに培養した。反応混合物中に放出された硫酸標識物をゲル濾過分析に付した。ヘパラナーゼ活性はpFhpa4感染細胞の培養培地にのみ検出された。
【図9a−b】 pFhpa4感染細胞の培養培地におけるヘパラナーゼ活性に対するヘパリンの影響を示す。硫酸標識ECMをpFhpa4感染ハイ・ファイブ細胞(9a)およびSf21細胞(9b)とともに、ヘパリン10μg/mlの不存在下(●)または存在下(V)に培養した(24時間、37℃、pH6.0)。培地中に放出された硫酸標識物をセファロース6B上のゲル濾過に付した。ヘパラナーゼ活性(ピークII HS分解フラグメントの産生)はヘパリンの存在下に完全に阻害された。
【図10a−b】 ヘパリン−セファロース上の組換えヘパラナーゼの精製を示す。pFhpa4ウイルス感染Sf21細胞の培養培地をヘパリン−セファロース・クロマトグラフィーに付した。フラクションの溶出を0.35〜2M NaCl勾配により実施した(◇)。溶出フラクションのヘパラナーゼ活性を図10aに示す(●)。フラクション15〜28を15%SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、次いで硝酸銀染色した。フラクション19〜24の主要タンパク質バンド(MW〜63,000)およびヘパラナーゼ活性間には相関が示される。
【図11a−b】 スーパーデックス75ゲル濾過カラム上の組換えヘパラナーゼの精製を示す。ヘパリン−セファロースから溶出した活性フラクション(図10a)をプールし、濃縮してスーパーデックス75FPLCカラムに負荷した。フラクションを収集し、各フラクションの一部につきヘパラナーゼ活性を試験し(C、図11a)、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、次いで硝酸銀染色した(図11b)。フラクション4〜7の主要タンパク質バンド(MW〜63,000)の出現とヘパラナーゼ活性間には相関が見られる。
【図12a−e】 ヒト胚組織(12a)、ヒト胚外組織(12b)および他起源細胞系(12c〜e)からの全RNAを用いるRT−PCRによるhpa遺伝子の発現を示す。hpa特異プライマー(I)、GAPDHハウスキーピング遺伝子用プライマー(II)、および逆転写酵素なしの対照反応は、RNAサンプル(III)中にゲノムDNAあるいは他の汚染物が存在しないことを示している。M:DNA分子量マーカーVI(ベーリンガー・マンハイム)。図12aについて:レーン1:好中球細胞(成人);レーン2:筋肉;レーン3:胸腺;レーン4:心臓;レーン5:副腎。図12bについて:レーン1:腎臓;レーン2:胎盤(8週);レーン3:胎盤(11週);レーン4〜7:母斑(完全水胞型母斑);レーン8:栄養膜細胞層細胞(新鮮単離);レーン9:栄養膜細胞層細胞(in vitro1.5時間);レーン10:栄養膜細胞層細胞(in vitro6時間);レーン11:栄養膜細胞層細胞(in vitro18時間);レーン12:栄養膜細胞層細胞(in vitro48時間)。図12cについて:レーン1:JAR膀胱細胞系;レーン2:NCITT睾丸腫瘍細胞系;レーン3:SW−480ヒト肝癌細胞系;レーン4:HTR(SV40により形質転換した栄養膜細胞層);レーン5:HPTLP−I肝細胞癌細胞系;レーン6:EJ−28膀胱癌細胞系。図12dについて:レーン1:SK−hep1ヒト肝癌細胞系;レーン2:DAMIヒト骨髄巨核球細胞系;レーン3:DAMI細胞系+PMA;レーン4:CHRF細胞系+PMA;レーン5:CHRF細胞系。図12eについて:レーン1:ABAEウシ大動脈内皮細胞;レーン2:1063ヒト卵巣細胞系;レーン3:ヒト乳癌MDA435細胞系;レーン4:ヒト乳癌MDA231細胞系。
【図13】 ヒトhpaのヌクレオチド配列とマウスESTcDNAフラグメント(配列番号12)の比較を表し、後者がヒトhpaの3’末端(配列番号9のヌクレオチド1066から開始)に対し80%の相同性を示す。整列化した終止コドンに下線を付す。
【図14】 hpa遺伝子の染色体局在を示す。ハムスター、マウスおよびヒトの体細胞ハイブリッドから誘導されるDNAおよびゲノムDNAのPCR産物をhpa特異プライマーでの増幅後、0.7%アガロースゲル上分離した。レーン1:BstEIIで消化したラムダDNA;レーン2:DNA不在対照;レーン3〜29:PCR増幅産物。レーン3〜5:それぞれ、ヒト、マウスおよびハムスターゲノムDNA。レーン6〜29:それぞれ、染色体1〜22およびXとYを表すヒト単一染色体体細胞ハイブリッド。レーン30:BstEIIで消化したラムダDNA。約2.8Kbの増幅産物がレーン5および9にのみ観察されるが、これらはそれぞれヒトゲノムDNAおよびヒト染色体4を担持する細胞ハイブリッドから誘導されるDNAを表す。これらの結果はhpa遺伝子がヒト染色体4に局在していることを示している。
【配列表】
Claims (98)
- ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドフラグメントであって、該ポリペプチドが、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ(GCG)の開発したDNA配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号10または14の配列と少なくとも80%の同一性を共有することを特徴とするポリヌクレオチドフラグメント。
- 該ポリペプチドが配列番号10または14の配列と少なくとも90%の同一性を共有する、請求項1記載のポリヌクレオチドフラグメント。
- 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9のヌクレオチド63〜1691または配列番号13のヌクレオチド139〜1869を含む請求項1記載のポリヌクレオチドフラグメント。
- 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9のヌクレオチド63〜721を含む請求項1記載のポリヌクレオチドフラグメント。
- 該ポリヌクレオチドが配列番号9または13に記載したとおりのものである請求項1記載のポリヌクレオチドフラグメント。
- 該ポリペプチドが配列番号10または14に記載したアミノ酸配列を含むものである請求項1記載のポリヌクレオチドフラグメント。
- 該ポリヌクレオチド配列が二本鎖DNA、一本鎖DNAおよびRNAからなる群より選択されるものである請求項1記載のポリヌクレオチドフラグメント。
- ポリヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドフラグメントであって、該ポリヌクレオチド配列が、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ(GCG)の開発したDNA配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号9または13の配列と少なくとも80%の相同性を有し、かつ、ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするものであることを特徴とするポリヌクレオチドフラグメント。
- 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9または13の配列と少なくとも90%の相同性を共有する、請求項8記載のポリヌクレオチドフラグメント。
- 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9または13に記載したとおりのものである請求項8記載のポリヌクレオチドフラグメント。
- ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列を含んでなるベクターであって、該ポリペプチドが、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ(GCG)の開発したDNA配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号10または14の配列と少なくとも80%の同一性を共有することを特徴とするベクター。
- 該ポリペプチドが配列番号10または14の配列と少なくとも90%の同一性を共有する、請求項11記載のベクター。
- 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9のヌクレオチド63〜1691または配列番号13のヌクレオチド139〜1869を含む請求項11記載のベクター。
- 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9のヌクレオチド63〜721を含む請求項11記載のベクター。
- 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9または13に記載したとおりのものである請求項11記載のベクター。
- 該ポリペプチドが配列番号10または14に記載したアミノ酸配列を含むものである請求項11記載のベクター。
- 該ポリヌクレオチド配列が二本鎖DNA、一本鎖DNAおよびRNAからなる群より選択されるものである請求項11記載のベクター。
- 該ベクターがバキュロウイルスベクターである請求項11記載のベクター。
- ポリヌクレオチド配列を含んでなるベクターであって、該ポリヌクレオチド配列が、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ(GCG)の開発したDNA配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号9または13の配列と少なくとも80%の相同性を有し、かつ、ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするものであることを特徴とするベクター。
- 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9または13の配列と少なくとも90%の相同性を共有する、請求項19記載のベクター。
- 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9または13に記載したとおりのものである請求項19記載のベクター。
- ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列含有の外来性ポリヌクレオチドフラグメントを含んでなる宿主細胞であって、該ポリペプチドが、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ(GCG)の開発したDNA配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号10または14の配列と少なくとも80%の同一性を共有することを特徴とする宿主細胞。
- 該ポリペプチドが配列番号10または14の配列と少なくとも90%の同一性を共有する、請求項22記載の宿主細胞。
- 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9のヌクレオチド63〜1691または配列番号13のヌクレオチド139〜1869を含む請求項22記載の宿主細胞。
- 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9のヌクレオチド63〜721を含む請求項22記載の宿主細胞。
- 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9または13に記載したとおりのものである請求項22記載の宿主細胞。
- 該ポリペプチドが配列番号10または14に記載したアミノ酸配列を含むものである請求項22記載の宿主細胞。
- 該ポリヌクレオチド配列が二本鎖DNA、一本鎖DNAおよびRNAからなる群より選択されるものである請求項22記載の宿主細胞。
- 該細胞が昆虫細胞である請求項22記載の宿主細胞。
- ポリヌクレオチド配列を含んでなる宿主細胞であって、該ポリヌクレオチド配列が、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ(GCG)の開発したDNA配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号9または13の配列と少なくとも80%の相同性を有し、かつ、ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするものであることを特徴とする宿主細胞。
- 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9または13の配列と少なくとも90%の相同性を共有する、請求項30記載の宿主細胞。
- 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9または13に記載したとおりのものである請求項30記載の宿主細胞。
- ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドを含んでなる組換えタンパク質であって、該ポリペプチドが、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ(GCG)の開発したDNA配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号10または14の配列と少なくとも80%の同一性を共有することを特徴とする組換えタンパク質。
- 該ポリペプチドが配列番号10または14の配列と少なくとも90%の同一性を共有する、請求項33記載の組換えタンパク質。
- 該ポリペプチドが配列番号10または14に記載したとおりのものである請求項33記載の組換えタンパク質。
- ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドを含む組換えタンパク質を活性成分として含んでなる製剤組成物であって、該ポリペプチドが、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ(GCG)の開発したDNA配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号10または14の配列と少なくとも80%の同一性を共有することを特徴とする製剤組成物。
- 該ポリペプチドが配列番号10または14の配列と少なくとも90%の同一性を共有する、請求項36記載の製剤組成物。
- 該ポリペプチドが配列番号10または14に記載したとおりのものである請求項36記載の製剤組成物。
- ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドを含む組換えタンパク質を活性成分として含み、ヘパリン結合増殖因子、ヘパリン結合増殖因子およびサイトカインへの細胞性応答、血漿リポタンパク質との細胞相互作用、ウイルス、原生動物および細菌感染に対する細胞の感受性、または神経変性プラークの分解のモジュレーターであって、該ポリペプチドが、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ(GCG)の開発したDNA配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号10または14の配列と少なくとも80%の同一性を共有することを特徴とするモジュレーター。
- 該ポリペプチドが配列番号10または14の配列と少なくとも90%の同一性を共有する、請求項39記載のモジュレーター。
- 該ポリペプチドが配列番号10または14に記載したとおりのものである請求項39記載のモジュレーター。
- ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドを含む組換えタンパク質を活性成分として含有する医療装置を含んでなる医療機器であって、該ポリペプチドが、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ(GCG)の開発したDNA配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号10または14の配列と少なくとも80%の同一性を共有することを特徴とする医療機器。
- 該ポリペプチドが配列番号10または14の配列と少なくとも90%の同一性を共有する、請求項42記載の医療機器。
- 該ポリペプチドが配列番号10または14に記載したとおりのものである請求項42記載の医療機器。
- 組換えヘパラナーゼを発現する宿主細胞であって、該組換えヘパラナーゼが、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ(GCG)の開発したDNA配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号10または14の配列と少なくとも80%の同一性を共有するポリペプチドであることを特徴とする宿主細胞。
- 該ポリペプチドが配列番号10または14の配列と少なくとも90%の同一性を共有する、請求項45記載の宿主細胞。
- 該ポリペプチドが配列番号10または14に記載したとおりのものである請求項45記載の宿主細胞。
- 該細胞が昆虫細胞である請求項45記載の宿主細胞。
- 請求項22〜32および45〜48のいずれかに記載の宿主細胞の抽出物または培地を含んでなる細胞抽出物もしくは調整細胞培地または部分精製細胞抽出物もしくは調整細胞培地。
- 請求項49記載の細胞抽出物もしくは調整細胞培地または部分精製細胞抽出物もしくは調整細胞培地を含んでなるヘパラナーゼインヒビター・スクリーニングシステム。
- 請求項33〜35のいずれかに記載の組換えタンパク質を含んでなるヘパラナーゼインヒビター・スクリーニングシステム。
- ヘパラナーゼ触媒活性を過度に発現する細胞および培地を含んでなるヘパラナーゼ過度発現システムであって、該ヘパラナーゼ触媒活性が、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ(GCG)の開発したDNA配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号10または14の配列と少なくとも80%の同一性を共有するヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドによって達成されることを特徴とするヘパラナーゼ過度発現システム。
- 該ポリペプチドが配列番号10または14の配列と少なくとも90%の同一性を共有する、請求項52記載のシステム。
- 該ポリペプチドが配列番号10または14に記載したとおりのものである請求項52記載の発現システム。
- 染色体スプレッドのヘパラナーゼ遺伝子を包含する染色体領域を同定する方法であって、
(a)該染色体スプレッドを、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ(GCG)の開発したDNA配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号9または13の配列と少なくとも80%の相同性を有する標識ポリヌクレオチドプローブとハイブリッド形成させる工程であって、前記ポリヌクレオチドプローブはヘパラナーゼ遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができる工程、
(b)染色体スプレッドを洗浄し、過剰のハイブリッド非形成プローブを除去する工程、および
(c)当該ハイブリッド形成した標識ポリヌクレオチドプローブと会合したシグナルを検索し、検出されたシグナルがヘパラナーゼ遺伝子を包含する染色体領域の指標であるとする工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 該ポリヌクレオチドプローブが配列番号9または13の配列と少なくとも90%の相同性を共有する、請求項55記載の方法。
- 配列番号9のヌクレオチド226ないし721により規定されるポリヌクレオチド鎖に相補的なポリヌクレオチド配列を含んでなる一本鎖ポリヌクレオチドフラグメント。
- 配列番号10または14の配列と少なくとも80%の同一性を共有するヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドに特異的に結合する抗体。
- 該ポリペプチドが配列番号10または14の配列と少なくとも90%の同一性を共有する、請求項58記載の抗体。
- 前記ポリペプチドの少なくとも1つのエピトープによって誘発される、請求項58または59記載の抗体。
- 前記ポリペプチドが組換えである、請求項58〜60のいずれかに記載の抗体。
- ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体からなる群より選択される、請求項58〜61のいずれかに記載の抗体。
- ポリクローナル抗体が、アフィニティー精製ポリクローナル抗体を含む、請求項62記載の抗体。
- 請求項58〜63のいずれかに記載の抗体を含む、癌または転移を検出するためのアッセイキット。
- 癌または転移の診断または予後のための、請求項64記載のキット。
- 前記転移が微小転移を含む、請求項64または65記載のキット。
- 請求項58〜63のいずれかに記載の抗体を含む、自己免疫病変を検出するためのアッセ イキット。
- 請求項58〜63のいずれかに記載の抗体を含む、腎不全を検出するためのアッセイキット。
- 癌または転移の検出に利用するために身体から採取したサンプルにおいて請求項58〜63のいずれかに記載の抗体を用いてヘパラナーゼ活性をアッセイする方法。
- 癌または転移の診断または予後に利用するための、請求項69記載の方法。
- 前記転移が微小転移を含む、請求項69または70記載の方法。
- 自己免疫病変の検出に利用するために身体から採取したサンプルにおいて請求項58〜63のいずれかに記載の抗体を用いてヘパラナーゼ活性をアッセイする方法。
- 腎不全の検出に利用するために身体から採取したサンプルにおいて請求項58〜63のいずれかに記載の抗体を用いてヘパラナーゼ活性をアッセイする方法。
- 請求項58〜63のいずれかに記載の抗体を含む、身体から採取したサンプルにおいて炎症性の応答を検出するためのアッセイ方法。
- 前記身体から採取したサンプルが、生検標本、血液サンプル、血漿サンプル、および体液の少なくとも1つを含む、請求項69〜74のいずれかに記載の方法。
- 身体から採取したサンプルにおいてヘパラナーゼを検出するための、請求項58〜63のいずれかに記載の抗体のインビトロの使用。
- 配列番号9の配列と少なくとも80%の相同性を共有する配列を有し、ヘパラナーゼ触媒活性を有するポリペプチドをコードする核酸と特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む、アンチセンス核酸。
- 前記核酸配列が、配列番号9に含まれる配列を含む、請求項77記載のアンチセンス核酸。
- 配列番号9の配列と少なくとも80%の相同性を共有し、ヘパラナーゼ触媒活性を有するポリペプチドをコードする配列とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドフラグメント。
- 配列番号9の配列と少なくとも90%の相同性を共有する配列とハイブリダイズすることができる、請求項79記載のポリヌクレオチドフラグメント。
- 前記ポリヌクレオチドが、hpa cDNAを含む、請求項79記載のフラグメント。
- 前記hpa cDNAが配列番号9に示される配列を含む、請求項81記載のフラグメント。
- 前記配列が配列番号9のヌクレオチド1〜721を含む、請求項82記載のフラグメント。
- 生物サンプルにおいて、ヘパラナーゼ発現を検出する方法であって、
(a)生物サンプルと請求項79〜83のいずれかに記載のフラグメントとを反応させる工程、および
(b)フラグメントを検出する工程
を含む方法。 - 前記フラグメントが標識を有する、請求項84記載の方法。
- 前記標識が蛍光標識を含む、請求項85記載の方法。
- 生物サンプルにおいて、ヘパラナーゼ発現を検出する方法であって、
(a)生物サンプルと配列番号9の配列と少なくとも80%の相同性を共有するヘパラナーゼをエンコードする核酸に特異的な核酸配列を含む1つまたは複数のプローブとを反応させる工程、および
(b)該反応により、ヘパラナーゼの発現を検出する工程
を含む方法。 - 該ヘパラナーゼをエンコードする核酸が配列番号9の配列と少なくとも90%の相同性を共有する、請求項87記載の方法。
- 前記反応が、生物サンプルにおけるRNA増幅を含む、請求項87記載の方法。
- 前記ヘパラナーゼをエンコードする核酸がhpa cDNAを含む、請求項87〜89記載の方法。
- 前記hpa cDNAが配列番号9に示される配列を含む、請求項90記載の方法。
- 配列番号10もしくは14の配列と少なくとも80%の同一性を共有するヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチド。
- ポリペプチドが、配列番号10または14の配列と少なくとも90%の同一性を共有する、請求項92記載のポリペプチド。
- 配列番号10または14に記載したアミノ酸配列を含む請求項92記載のポリペプチド。
- 請求項92〜94のいずれかに記載の単離精製されたポリペプチド。
- 請求項92〜95のいずれかに記載の単離されたタンパク質/ポリペプチドを活性成分として含み、および薬学的に許容される担体を含む、製剤組成物。
- 配列番号10もしくは14の配列と少なくとも80%の同一性を共有するヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターによって、組換えヘパラナーゼを発現する細胞を遺伝子的に改変する工程を含む、組換えヘパラナーゼタンパク質を製造する方法。
- 該ポリペプチドが配列番号10または14の配列と少なくとも90%の同一性を共有する、請求項97記載の方法。
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US6177545B1 (en) | 1997-09-02 | 2001-01-23 | Insight Strategy & Marketing Ltd. | Heparanase specific molecular probes and their use in research and medical applications |
US20040213789A1 (en) * | 1997-09-02 | 2004-10-28 | Oron Yacoby-Zeevi | Heparanase activity neutralizing anti-heparanase monoclonal antibody and other anti-heparanase antibodies |
US6348344B1 (en) * | 1997-09-02 | 2002-02-19 | Insight Strategy & Marketing Ltd. | Genetically modified cells and methods for expressing recombinant heparanase and methods of purifying same |
US20030161823A1 (en) * | 1998-08-31 | 2003-08-28 | Neta Ilan | Therapeutic and cosmetic uses of heparanases |
US5968822A (en) * | 1997-09-02 | 1999-10-19 | Pecker; Iris | Polynucleotide encoding a polypeptide having heparanase activity and expression of same in transduced cells |
US20020088019A1 (en) * | 1997-09-02 | 2002-07-04 | Oron Yacoby-Zeevi | Methods of and pharmaceutical compositions for improving implantation of embryos |
US6699672B1 (en) | 1997-09-02 | 2004-03-02 | Insight Biopharmaceuticals Ltd. | Heparanase specific molecular probes and their use research and medical applications |
CN1280613A (zh) * | 1997-10-28 | 2001-01-17 | 澳大利亚国立大学 | 编码哺乳动物内切葡糖醛酸糖苷酶的分离的核酸分子及其应用 |
GB9802725D0 (en) * | 1998-02-09 | 1998-04-08 | Ciba Geigy Ag | Organic compounds |
EP1060252A2 (en) * | 1998-02-24 | 2000-12-20 | PHARMACIA & UPJOHN COMPANY | Human platelet heparanase polypeptides, polynucleotide molecules that encode them, and methods for the identification of compounds that alter heparanase activity |
WO2000012726A2 (en) * | 1998-08-27 | 2000-03-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Rationally designed heparinases derived from heparinase i and ii |
US7056504B1 (en) | 1998-08-27 | 2006-06-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Rationally designed heparinases derived from heparinase I and II |
US20020068054A1 (en) * | 2000-09-11 | 2002-06-06 | Insight Strategy & Marketing Ltd. And Hadasit Medical Research Services And Development Ltd. | Therapeutic and cosmetic uses of heparanases |
US20030217375A1 (en) * | 1998-08-31 | 2003-11-20 | Eyal Zcharia | Transgenic animals expressing heparanase and uses thereof |
AU2878600A (en) * | 1999-03-01 | 2000-09-21 | Hadasit Medical Research Services & Development Company Ltd | Polynucleotide encoding a polypeptide having heparanase activity and expression of same in genetically modified cells |
US6597996B1 (en) | 1999-04-23 | 2003-07-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for indentifying or characterizing properties of polymeric units |
US20040224922A1 (en) * | 1999-08-26 | 2004-11-11 | Malcolm King | Use of charged dextran as a mucoactive agent and methods and pharmaceutical compositions relating thereto |
JP2003510053A (ja) * | 1999-09-23 | 2003-03-18 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | ヘパラナーゼ蛋白質ファミリーの1種、ヘパラナーゼ−2 |
DE60029624T2 (de) * | 1999-12-22 | 2007-08-09 | Ucb S.A. | Homologe enzyme der humanen heparanase sowie alternative spleissformen davon |
ES2527853T3 (es) * | 2000-03-08 | 2015-01-30 | Massachusetts Institute Of Technology | Heparinasa III y sus usos |
EP1319183B1 (en) | 2000-09-12 | 2009-03-25 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and products related to low molecular weight heparin |
MXPA03002243A (es) | 2000-09-15 | 2004-12-03 | Reddy Therapeutics Inc | Metodos y composiciones para ensayos de glucosidasa. |
WO2002032283A2 (en) * | 2000-10-17 | 2002-04-25 | Insight Strategy And Marketing Ltd. | Methods of and pharmaceutical compositions for improving implantation of embryos |
EP1328260A2 (en) | 2000-10-18 | 2003-07-23 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and products related to pulmonary delivery of polysaccharides |
AU2002241532A1 (en) * | 2000-11-30 | 2002-06-11 | Sangamo Biosciences, Inc. | Human heparanase gene regulatory sequences |
FR2818131B1 (fr) * | 2000-12-14 | 2005-02-11 | Oreal | Composition cosmetique comprenant de l'heparanase |
US20040033218A1 (en) * | 2000-12-19 | 2004-02-19 | Oron Yacoby-Zeevi | Use of ecm degrading enzymes for the improvement of cell transplantation |
EP1353556A4 (en) * | 2001-01-23 | 2009-09-09 | Massachusetts Inst Technology | SYNTHESIS OF HEPARIN AND OTHER GLYCOSAMINOGLYCANS IN SOLID PHASE AND SOLUTION PHASE |
EP1417304A4 (en) * | 2001-07-13 | 2005-11-23 | Imclone Systems Inc | METHOD AND COMPOSITION FOR INHIBITING HEPARANASE ACTIVITY |
US6671189B2 (en) * | 2001-11-09 | 2003-12-30 | Minebea Co., Ltd. | Power converter having primary and secondary side switches |
CH696701A5 (de) | 2001-12-18 | 2007-10-15 | Hoffmann La Roche | Verfahren zum Testen eines Mittels auf dessen Fähigkeit, die Heparanaseaktivität zu hemmen. |
EP1532241B1 (en) * | 2002-06-03 | 2010-09-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Rationally designed polysaccharide lyases derived from chondroitinase b |
EP1382574A3 (en) * | 2002-06-21 | 2004-05-26 | Sanden Corporation | Mineral water making apparatus |
AU2003295411A1 (en) * | 2002-11-07 | 2004-06-03 | Celltech R & D | Human monoclonal antibodies to heparanase |
US7259140B2 (en) | 2003-03-28 | 2007-08-21 | Thomas Jefferson University | Heparin-binding peptides and uses thereof |
US20060269552A1 (en) * | 2003-06-09 | 2006-11-30 | Oron Yacoby-Zeevi | Heparanase activity neutralizing anti-heparanase monclonal antibody and other anti-heparanase antibodies |
JP2007506416A (ja) * | 2003-09-26 | 2007-03-22 | イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー | 合成ヘパラナーゼ分子及びその使用 |
WO2007034480A2 (en) * | 2005-09-20 | 2007-03-29 | Carmel-Haifa University Economic Corp. Ltd | Heparanases and splice variants thereof, ponucleotides encoding them and uses thereof |
WO2008057265A2 (en) * | 2006-10-27 | 2008-05-15 | University Of Maryland | Single nucleotide polymorphisms and the identification of lactose intolerance |
CN102711463B (zh) * | 2009-12-03 | 2015-05-13 | Opko健康公司 | 超硫酸化双糖制剂 |
AU2014225708B2 (en) * | 2013-03-05 | 2018-10-18 | Baylor College Of Medicine | Heparanase expression in human T lymphocytes |
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---|---|---|---|---|
US5061689A (en) * | 1986-12-24 | 1991-10-29 | Bioderm, Inc. | Zinc bacitracin containing wound dressing |
US5571506A (en) * | 1989-08-14 | 1996-11-05 | Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. | Aromatic oligomeric compounds useful as mimics of bioactive macromolecules |
EP0487627B1 (en) * | 1989-08-23 | 1998-06-10 | Hadassah Medical Organization | Wound healing preparations containing heparanase |
US5300059A (en) * | 1991-11-19 | 1994-04-05 | Hydro Slip Technologies Inc. | Bloodbag and method of making same |
WO1993018745A1 (en) * | 1992-03-23 | 1993-09-30 | Geda International S.A. | Use of antiviral coating for latex items such as condoms |
AU7368994A (en) * | 1993-07-29 | 1995-02-28 | Upjohn Company, The | Use of heparanase to identify and isolate anti-heparanase compound |
US5565193A (en) * | 1993-08-05 | 1996-10-15 | Procter & Gamble | Hair styling compositions containing a silicone grafted polymer and low level of a volatile hydrocarbon solvent |
ATE187501T1 (de) * | 1996-01-23 | 1999-12-15 | Rapigene Inc | Verfahren zur erkennung von ligandenpaar bindung mit erhöter empfindlichkeit |
US5968822A (en) * | 1997-09-02 | 1999-10-19 | Pecker; Iris | Polynucleotide encoding a polypeptide having heparanase activity and expression of same in transduced cells |
US6177545B1 (en) * | 1997-09-02 | 2001-01-23 | Insight Strategy & Marketing Ltd. | Heparanase specific molecular probes and their use in research and medical applications |
US6348344B1 (en) * | 1997-09-02 | 2002-02-19 | Insight Strategy & Marketing Ltd. | Genetically modified cells and methods for expressing recombinant heparanase and methods of purifying same |
CN1280613A (zh) * | 1997-10-28 | 2001-01-17 | 澳大利亚国立大学 | 编码哺乳动物内切葡糖醛酸糖苷酶的分离的核酸分子及其应用 |
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