DE69833667T2 - Polynukleotid, kodierend für ein polypeptid mit heparanase-aktivität und dessen expression in transduzierten zellen - Google Patents

Polynukleotid, kodierend für ein polypeptid mit heparanase-aktivität und dessen expression in transduzierten zellen Download PDF

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Description

  • GEBIET UND HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein hierin folgend als hpa bezeichnetes Polynucleotid, welches ein Polypeptid mit Heparanase-Aktivität codiert, Vektoren, die dieses einschließen, und transduzierte Zellen, die Heparanase exprimieren. Die Erfindung betrifft ferner ein rekombinantes Protein mit Heparanase-Aktivität.
  • Heparansulfatproteoglycane: Heparansulfatproteoglycane (HSPG) sind ubiquitäre Makromoleküle, die mit der Zelloberfläche sowie der extrazellulären Matrix (EZM) einer großen Auswahl von Zellen aus Geweben von Wirbeltieren und Wirbellosen assoziiert sind (1–4). Die grundlegende HSPG-Struktur umfasst einen Proteinkern, an den mehrere lineare Heparansulfate kovalent gebunden sind. Diese Polysaccharidketten sind typischerweise aus sich wiederholenden Hexuron- und D-Glucosamin-Einheiten zusammengesetzt, welche in unterschiedlichem Ausmaß mit N- oder O-verbundenen Sulfateinheiten und N-verbundenen Acetylgruppen substituiert sind (1–4). Untersuchungen über die Beteiligung von EZM-Molekülen bei der Anhaftung, dem Wachstum und der Differenzierung von Zellen offenbarten eine zentrale Rolle von HSPG in der embryonalen Morphogenese, der Angiogenese, dem Auswachsen von Axonen und der Gewebereparatur (1–5). HSPG sind bedeutende Bestandteile der Blutgefäße (3). In großen Blutgefäßen sind sie zumeist in der Intima und der inneren Media konzentriert, wohingegen man sie in Kapillaren hauptsächlich in der subendothelialen Basalmembran findet, wo sie proliferierende und wandernde Endothelzellen unterstützen und die Wandstruktur der Kapillaren stabilisieren. Die Fähigkeit von HSPG, mit Makromolekülen der EZM wie Kollagen, Laminin und Fibronectin sowie mit unterschiedlichen Anhaftungsstellen auf Plasmamembranen zu interagieren, legt den Schluss nahe, dass dieses Proteoglycan eine Schlüsselrolle beim Selbstaufbau und der Unlöslichkeit der Bestandteile der EZM sowie in der Zelladhäsion und -fortbewegung spielt. Eine Spaltung der Heparansulfat (HS)-Ketten kann daher zu einem Abbau der subendothelialen EZM führen und kann daher eine entscheidende Rolle bei der Extravasation von aus dem Blut stammenden Zellen spielen. Ein Abbau von HS wird bei Entzündung, Wundheilung, Diabetes und Krebsmetastase beobachtet, was den Schluss nahelegt, dass HS-abbauende Enzyme wichtige Rollen bei pathologischen Prozessen spielen. Heparanase-Aktivität wurde in aktivierten Zellen des Immunsystems und hoch metastatischen Krebszellen beschrieben (6–8), der Mangel an biologischen Werkzeugen hat die Forschung jedoch bislang dabei behindert, die möglichen ursächlichen Rollen von Heparanase bei krankhaften Zuständen zu erforschen.
  • Beteiligung von Heparanase beim Eindringen von Tumorzellen und Metastase: Im Kreislauf befindliche Tumorzellen, die in den Kapillarbetten verschiedener Organe festgehalten werden, müssen in die von endothelialen Zellen gebildete Auskleidung der Gefäßwände eindringen und deren darunter liegende Basalmembran (BM) abbauen, um in das/die extravaskuläre/n Gewebe einzudringen, wo sie Metastasen bilden (9, 10). Metastatische Tumorzellen heften sich häufig an oder in der Nähe der Zellverbindungen zwischen aneinander grenzenden Endothelzellen an. Eine solche Anhaftung metastatischer Zellen wird gefolgt von einem Bruch der Zellverbindungen, einem Zurückziehen der Ränder der Endothelzellen und einer Wanderung durch die Einbruchstelle im Endothel zu der ungeschützten darunter liegenden BM (9). Sobald sich die eindringenden Zellen zwischen den Endothelzellen und der BM befinden, müssen sie die subendothelialen Glycoproteine und Proteoglycane der BM abbauen, um aus dem vaskulären Kompartiment auswandern zu können. Man nimmt an, dass mehrere zelluläre Enzyme (z.B. Kollagenase IV, Plasminogenaktivator, Cathepsin B, Elastase etc.) am Abbau der BM beteiligt sind (10). Unter diesen Enzymen ist eine Endo-β-D-Glucuronidase (Heparanase), welche HS an spezifischen Stellen innerhalb der Kette spaltet (6, 8, 11). Man fand, dass die Expression einer HS-abbauenden Heparanase mit dem metastatischen Potential von Lymphom(11), Fibrosarkom- und Melanomzellen (8) der Maus korreliert. Überdies wurden erhöhte Heparanase-Spiegel in Seren von Tieren mit metastatischen Tumoren und Melanompatienten (8) und in Tumorbiopsien von Krebspatienten entdeckt (12).
  • Die jetzigen Erfinder haben früher die Kontrolle der Zellproliferation und Tumorprogression durch die lokale Mikroumgebung untersucht, wobei sie sich auf die Interaktion von Zellen mit der von gezüchteten Cornea- und Gefäß-Endothelzellen gebildeten extrazellulären Matrix (EZM) konzentrierten. Diese in Zellkultur gebildete EZM ähnelt dem Subendothel in vivo in ihrem morphologischen Erscheinungsbild und ihrer molekularen Zusammensetzung. Sie enthält Kollagene (hauptsächlich Typ III und IV, mit kleineren Mengen der Typen I und V), Proteoglycane (hauptsächlich Heparansulfat- und Dermatansulfat-Proteoglycane, mit kleineren Mengen von Chondroitinsulfat-Proteoglycanen), Laminin, Entactin und Elastin (13, 14). Die Fähigkeit von Zellen, HS in der in Zellkultur gebildeten EZM abzubauen, wurde untersucht, indem man die Zellen mit metabolisch Sulfat-markierter EZM interagieren ließ, gefolgt von einer Gelfiltrationsanalyse (Sepharose 6B) der ins Kulturmedium freigesetzten Abbauprodukte (11). Während intakte HSPG unmittelbar nach dem Ausschlussvolumen der Säule eluieren (Kav < 0,2, Mr ~ 0,5 × 106), eluieren die markierten Abbaufragmente von HS-Seitenketten mehr zum Vt der Säule hin (0,5 < kav < 0,8, Mr = 5–7 × 103) (11).
  • Die Heparanase-hemmende Wirkung verschiedener nicht-antikoagulierender Arten von Heparin, welche möglicherweise zur Verhinderung des Gefäßaustritts von aus dem Blut stammenden Zellen eingesetzt werden können, wurde ebenfalls von den jetzigen Erfindern untersucht. Eine Hemmung der Heparanase wurde am besten durch Heparinarten erreicht, welche 16 oder mehr Zuckereinheiten enthalten und die sowohl an den N- als auch den O-Positionen Sulfatgruppen aufweisen. Während eine O-Desulfatierung die Heparanase-hemmende Wirkung von Heparin aufhob, behielt N-acetyliertes Heparin eine hohe Hemmaktivität, sofern die N-substituierten Moleküle eine Molekülgröße von etwa 4.000 Dalton oder mehr aufwiesen (7). Eine Behandlung von Versuchstieren mit Heparanase-Hemmern (z.B. nicht-antikoagulierender Arten von Heparin) ergab eine deutlich verringerte Inzidenz (>90%) von Lungenmetastasen, welche durch B16-Melanom-, Lewis Lungenkarzinom- und Brustadenokarzinom-Zellen hervorgerufen werden (7, 8, 16). Heparinfraktionen mit hoher und niedriger Affinität zu Antithrombin III zeigten eine vergleichbar hohe antimetastatische Aktivität, was darauf hinweist, dass viel mehr die Heparanasehemmende Aktivität von Heparin denn seine anti-koagulierende Aktivität eine Rolle für die anti-metastatischen Eigenschaften des Polysaccharids spielt (7).
  • Heparanase-Aktivität im Urin von Krebspatienten: In einem Versuch, die Beteiligung von Heparanase an der Tumorprogression und deren Relevanz für Krebs beim Menschen weiter aufzuklären, wurden Urinproben auf Heparanase-Aktivität durchmustert (16a). Heparanase-Aktivität wurde im Urin von einigen, aber nicht von allen Krebspatienten festgestellt. Hohe Spiegel an Heparanase-Aktivität wurden im Urin von Patienten mit einer aggressiven, metastatischen Erkrankung bestimmt, und es gab keine nachweisbare Aktivität im Urin von gesunden Spendern.
  • Heparanase-Aktivität wurde auch im Urin von 20% aller Patienten mit normalem und mit einer Mikroalbuminurie assoziiertem Insulin-abhängigen Diabetes mellitus (IDDM) gefunden, höchstwahrscheinlich auf Grund einer diabetischen Nephropathie, der wichtigsten einzelnen Funktionsstörung, die zu einem Nierenversagen bei Erwachsenen führt.
  • Mögliche Beteiligung von Heparanase an der Tumorangiogenese: Fibroblasten-Wachstumsfaktoren sind eine Familie strukturell verwandter Polypeptide, welche durch eine hohe Affinität zu Heparin gekennzeichnet sind (17). Diese sind hochgradig mitogen für vaskuläre Endothelzellen und zählen zu den wirksamsten Auslösern der Neovaskularisation (17, 18). Basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) ist aus subendothelialer, in vitro gebildeter EZM (19) und von Basalmembranen der Cornea (20) extrahiert worden, was darauf hinweist, dass die EZM als ein Reservoir für bFGF dienen kann. Immunhistochemische Färbungen zeigten die Lokalisierung von bFGF in Basalmembranen verschiedener Gewebe und Blutgefäße (21). Trotz der ubiquitären Gegenwart von bFGF in normalen Geweben ist die Proliferation der Endothelzellen in diesen Geweben normalerweise sehr niedrig, was dafür spricht, dass bFGF irgendwie von seinem Wirkort abgesondert ist. Untersuchungen zur Interaktion von bFGF mit der EZM ergaben, dass bFGF an HSPG in der EZM bindet und durch HS-abbauende Enzyme in einer aktiven Form freigesetzt werden kann (15, 20, 22). Es wurde gezeigt, dass von Thrombocyten, Mastzellen, Neutrophilen und Lymphomzellen exprimierte Heparanase-Aktivität an der Freisetzung von aktivem bFGF von der EZM und Basalmembranen beteiligt ist (23), was dafür spricht, dass Heparanase-Aktivität nicht nur eine Funktion bei der Zellwanderung und dem Eindringen von Zellen hat, sondern auch eine indirekte Neovaskularisationsantwort auslösen kann. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass die EZM-HSPG ein natürliches Speicherdepot für bFGF und möglicherweise andere Heparin-bindende, Wachstum fördernde Faktoren darstellen (24, 25). Eine Verlagerung von bFGF von seinem Speicher in Basalmembranen und der EZM kann daher einen neuen Mechanismus für die Auslösung von Neovaskularisation in normalen und pathogenen Zuständen darstellen.
  • Kürzliche Untersuchungen weisen darauf hin, dass Heparin und HS an der Bindung von bFGF an Zelloberflächen-Rezeptoren mit hoher Affinität und an der bFGF-vermittelten Signalübertragung der Zelle beteiligt ist (26, 27). Überdies war die für eine optimale Wirkung erforderliche Größe der HS ähnlich der von durch Heparanase freigesetzten HS-Fragmenten (28). Ähnliche Ergebnisse wurden mit vaskulärem Endothelzellen-Wachstumsfaktor (VEGF) erhalten (29), was darauf hindeutet, dass ein Mechanismus mit einem zweifachen Rezeptor operiert, welcher HS in die Zellinteraktion mit Heparin-bindenden Wachstumsfaktoren einbezieht. Es wird daher vorgeschlagen, dass eine Beschränkung von Endothelzellen-Wachstumsfaktoren in der EZM deren systemische Wirkung auf das vaskuläre Endothel verhindert und somit eine sehr geringe Rate der Erneuerung von Endothelzellen und des Gefäßwachstums aufrechterhält. Auf der anderen Seite kann die Freisetzung von bFGF aus dem Speicher in der EZM in Form eines Komplexes mit einem HS-Fragment eine örtliche Proliferation von Endothelzellzellen und Neovaskularisation in Prozessen wie z.B. der Wundheilung, Entzündung und der Tumorentwicklung auslösen (24, 25).
  • Expression von Heparanase durch Zellen des Immunsystems: Die Heparanase-Aktivität korreliert mit der Fähigkeit der aktivierten Zellen des Immunsystems, den Kreislauf zu verlassen und sowohl entzündliche als auch Autoimmunantworten auszulösen. Die Interaktion von Thrombocyten, Granulocyten, T- und B-Lymphocyten, Makrophagen und Mastzellen mit der subendothelialen EZM wird von einem Abbau von HS durch eine spezifische Heparanase-Aktivität begleitet (6). Das Enzym wird aus intrazellulären Kompartimenten (z.B. Lysosomen, spezifischen Granula etc.) in Reaktion auf verschiedene Aktivierungssignale (z.B. Thrombin, Calcium-Ionophore, Immunkomplexe, Mitogene etc.) freigesetzt, was auf eine gesteuerte Mitwirkung an der Entzündung sowie zellulärer Immunität hindeutet.
  • Einige der das Heparanase-Enzym betreffenden Beobachtungen wurden in der Druckschrift Nr. 6 besprochen und sind hierin nachstehend aufgeführt: Erstens, eine proteolytische Aktivität (Plasminogen-Aktivator) und Heparanase sind synergistisch am sequenziellen Abbau der ECM-HSPG durch entzündliche Leukocyten und maligne Zellen beteiligt.
  • Zweitens, ein großer Anteil der thrombocytären Heparanase liegt in einer inaktiven Form vor, wahrscheinlich als ein Komplex mit Chondroitinsulfat. Das inaktive Enzym wird durch (einen) von Tumorzellen stammenden Faktor(en) aktiviert und kann dann das Eindringen der Zellen durch das vaskuläre Endothel während der Metastasenbildung des Tumors erleichtern.
  • Drittens, die Freisetzung von thrombocytärer Heparanase aus α-Granula wird durch einen starken Stimulus (d.h. Thrombin) induziert, nicht aber in Reaktion auf die Aktivierung von Thrombocyten auf der EZM.
  • Viertens, die Neutrophilen-Heparanase wird bevorzugt und leicht in Reaktion auf eine Schwellenaktivierung und auf die Inkubation der Zellen auf der EZM freigesetzt.
  • Fünftens, der Kontakt von Neutrophilen mit der EZM hemmte die Freisetzung von schädlichen Enzymen (Proteasen, Lysozym) und Sauerstoffradikalen, nicht aber von Enzymen (Heparanase, Gelatinase), welche die Diapedese ermöglichen können. Diese Schutzfunktion der subendothelialen EZM wurde beobachtet, wenn die Zellen mit löslichen Faktoren, nicht aber mit phagocytierbaren Stimulantien stimuliert wurden.
  • Sechstens, intrazelluläre Heparanase wird innerhalb von Minuten nach der Exposition von T-Zelllinien gegenüber spezifischen Antigenen ausgeschüttet.
  • Siebtens, Mitogene (Con A, LPS) induzieren die Synthese und Sekretion von Heparanase durch normale T- und B-Lymphocyten, welche in vitro gehalten werden. Heparanase von T-Lymphocyten wird auch durch Immunisierung mit Antigen in vivo induziert.
  • Achtens, Heparanase-Aktivität wird von Prä-B-Lymphomen und B-Lymphomen, nicht aber von Plasmacytomen und ruhenden normalen B-Lymphocyten exprimiert.
  • Neuntens, Heparanase-Aktivität wird von aktivierten Makrophagen während der Inkubation mit der EZM exprimiert, es gab jedoch eine geringe oder keine Freisetzung des Enzyms in das Inkubationsmedium. Ähnliche Ergebnisse wurden mit menschlichen myeloiden Leukämiezellen erhalten, welche dazu induziert wurden, sich in reife Makrophagen zu differenzieren.
  • Zehntens, T-Zell-vermittelte Spättyp-Hypersensitivität und experimentelle Autoimmunität werden durch geringe Dosen von Heparanase-hemmenden, nicht-antikoagulierenden Heparinarten unterdrückt (30).
  • Elftens, von Thrombocyten, Neutrophilen und metastatischen Tumorzellen exprimierte Heparanase-Aktivität setzt aktives bFGF aus der EZM und den Basalmembranen frei. Die Freisetzung von bFGF aus dem Speicher in der EZM kann eine örtliche neovaskuläre Antwort in Prozessen wie Wundheilung, Entzündung und Tumorentwicklung auslösen.
  • Zwölftens, unter den durch die Heparanase gebildeten Abbauprodukten der EZM ist ein dreifach sulfatiertes Disaccharid, welches die T-Zell-vermittelte Entzündung in vivo hemmen kann (31). Diese Hemmung war mit einer hemmenden Wirkung des Disaccharids auf die Synthese von biologisch aktivem TNF-α durch aktivierte T-Zellen in vitro assoziiert (31).
  • Andere mögliche therapeutische Anwendungen: Neben ihrer Beteiligung an der Metastase von Tumorzellen, Entzündungen und Autoimmunität kann Säugetier-Heparanase zur Modulation folgender Prozesse eingesetzt werden: der Bioverfügbarkeit von Heparin-bindenden Wachstumsfaktoren (15); zellulärer Reaktionen auf Heparin-bindende Wachstumsfaktoren (z.B. bFGF, VEGF) und Cytokine (IL-8) (31a, 29); Zellinteraktionen mit Plasmalipoproteinen (32); zellulärer Anfälligkeit gegenüber bestimmten viralen und manchen bakteriellen sowie von Protozoen verursachten Infektionen (33, 33a, 33b) und zum Auflösen amyloider Plaques (34). Heparanase kann sich daher bei Zuständen wie z.B. Wundheilung, Angiogenese, Restenose, Atherosklerose, Entzündung, neurodegenerativen Erkrankungen und viralen Infektionen als nützlich erweisen. Säugetier-Heparanase kann als ein möglicher Ersatz für Protamin für die Neutralisierung von Plasma-Heparin eingesetzt werden. Anti-Heparanase-Antikörper können für den Immunnachweis und die Diagnose von Mikrometastasen, Autoimmunläsionen und Nierenversagen in Biopsieproben, Plasmaproben und Körperflüssigkeiten zum Einsatz kommen. Es wird eine allgemeine Verwendung in der Grundlagenforschung erwartet.
  • Die Identifizierung des hpa-Gens, welches das Heparanase-Enzym codiert wird die Herstellung eines rekombinanten Enzyms in heterologen Expressionssystemen ermöglichen. Die Verfügbarkeit eines rekombinanten Proteins wird den Weg für die Lösung der Beziehung zwischen Proteinstruktur und Funktion ebnen und ein Werkzeug zur Verfügung stellen, um neue Inhibitoren zu entwickeln.
  • Virale Infektion: Es ist gezeigt worden, dass die Anwesenheit von Heparansulfat auf Zelloberflächen die Hauptvoraussetzung für die Bindung von Herpes simplex- (33) und Dengueviren (33a) an Zellen sowie für die nachfolgende Infektion der Zellen ist. Die Entfernung des Heparansulfats an der Zelloberfläche durch Heparanase kann daher eine Virusinfektion aufheben. In der Tat verminderte die Behandlung von Zellen mit bakterieller Heparitinase (welche Heparansulfat abbaut) die Bindung zweier verwandter tierischer Herpesviren an Zellen und machte die Zellen zumindest teilweise resistent gegenüber einer Virusinfektion (33). Es gibt einige Hinweise darauf, dass das an der Zelloberfläche vorliegende Heparansulfat auch an der HIV-Infektion beteiligt ist (33b).
  • Neurodegenerative Erkrankungen: Heparansulfat-Proteoglycane wurden in den amyloiden Plaques von Prionproteinen des Gerstmann-Sträussler-Syndroms, der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit und Scrapie identifiziert (34). Heparanase löst diese amyloiden Plaques, von denen man annimmt, dass sie bei der Pathogenese der Alzheimerschen Krankheit eine Rolle spielen, möglicherweise auf.
  • Restenose und Atherosklerose: Die Proliferation arterieller glatter Muskelzellen (SMCs) in Reaktion auf eine Verletzung des Endothels und die Anreicherung Cholesterin-reicher Lipoproteine sind grundlegende Ereignisse in der Pathogenese der Atherosklerose und der Restenose (35). Neben seiner Beteiligung an der Proliferation der SMCs (d.h. Rezeptoren niedriger Affinität für Heparin-bindende Wachstumsfaktoren) ist HS auch an der Bindung, der Retention und der Aufnahme von Lipoproteinen beteiligt (36). Es ist gezeigt worden, dass HSPG und Lipoprotein-Lipase an einem neuen katabolischen Stoffwechselweg mitwirken, der möglicherweise eine beträchtliche zelluläre und interstitielle Anreicherung Cholesterin-reicher Lipoproteine erlaubt (32). Es ist zu erwarten, dass der letztere Stoffwechselweg in hohem Maße atherogen wirkt, indem er die Anreicherung von apoB- und apoE-reichen Lipoproteinen (d.h. LDL, VLDL, Chylomikronen) begünstigt, unabhängig von der Rückkopplungshemmung über den zellulären Steringehalt. Es ist daher zu erwarten, dass die Entfernung von SMC-HS durch Heparanase sowohl die Proliferation von SMC als auch die Lipidanreicherung hemmt und auf diese Weise das Fortschreiten der Restenose und Atherosklerose stoppen kann.
  • Es gibt daher einen weithin anerkannten Bedarf für ein Polynucleotid (und es wäre sehr vorteilhaft, ein solches zur Verfügung zu haben), welches ein Polypeptid mit Heparanase-Aktivität codiert, für Vektoren, welche dieses einschließen, für transduzierte Zellen, die Heparanase exprimieren, und ein rekombinantes Protein mit Heparanase-Aktivität.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Polynucleotid, welches hierin folgend als hpa, als hpa-cDNA oder als hpa-Gen bezeichnet wird, welches ein Polypeptid mit Heparanase-Aktivität codiert, sowie Vektoren, welche dieses einschließen, transduzierte Zellen, welche Heparanase exprimieren, und ein rekombinantes Protein mit Heparanase-Aktivität bereitgestellt.
  • Die Clonierung des menschlichen hpa-Gens, welches Heparanase exprimiert, und die Expression rekombinanter Heparanase durch transfizierte Wirtszellen wird berichtet.
  • Eine gereinigte Präparation von aus menschlichen Hepatomzellen isolierter Heparanase wurde einem Trypsinverdau unterzogen und mikrosequenziert. Die hierbei aufgedeckte Sequenz YGPDVGQPR (SEQ ID NO:8) wurde verwendet, um EST-Datenbanken nach Homologien zu der entsprechenden rückübersetzten DNA-Sequenz zu durchmustern. Zwei eng verwandte EST-Sequenzen wurden identifiziert, und es wurde hernach festgestellt, dass diese identisch waren. Beide Clone enthielten eine 1020 bp lange Insertion, welche einen 973 bp langen offenen Leserahmen enthielt, gefolgt von einer 27 bp langen 3'-untranslatierten Region und einem Poly(A)-Schwanz. Die Translationsstartstelle wurde nicht identifiziert.
  • Die Clonierung des fehlenden 5'-Endes des hpa-Gens wurde mittels PCR-Amplifikation von DNA aus dem Plazenta-Marathon-RACETM-cDNA-Komposit unter Verwendung von Primern durchgeführt, welche entsprechend der Sequenz der EST-Clone und der Linker des Komposits ausgewählt wurden. Ein 900 bp langes PCR-Fragment wurde erhalten, welches teilweise mit den die 3'-Region codierenden EST-Clonen überlappte. Das zusammengesetzte cDNA-Fragment (hpa) war 1721 bp lang (SEQ ID NO: 9) und enthielt einen offenen Leserahmen, der ein Polypeptid von 543 Aminosäuren (SEQ ID NO: 10) mit einem berechneten Molekulargewicht von 61.192 Dalton codiert.
  • Die Clonierung einer verlängerten 5'-Sequenz aus der menschlichen SK-hep1-Zelllinie wurde durch eine PCR-Amplifikation mit Hilfe der MarathonTM RACE ermöglicht. Die am 5'-Ende verlängerte Sequenz der hpa-cDNA aus SK-hep1 wurde mit der Sequenz der aus der menschlichen Plazenta isolierten hpa-cDNA (SEQ ID NO: 9) zusammengefügt. Die zusammenfügte Sequenz enthielt einen offenen Leserahmen, SEQ ID NOs: 13 und 15, welcher, wie in den SEQ ID NOs: 14 und 15 gezeigt, ein Polypeptid von 592 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 66.407 Dalton codiert.
  • Die Fähigkeit des hpa-Genprodukts, den Abbau von Heparansulfat in einem in vitro-Assay zu katalysieren, wurde untersucht, indem man den gesamten offenen Leserahmen von hpa in Insektenzellen exprimierte, wobei das Baculovirus-Expressionssystem verwendet wurde. Extrakte und konditionierte Medien von Zellen, die mit einem das hpa-Gen enthaltenden Virus infiziert waren, zeigten einen hohen Spiegel an Heparansulfat abbauender Aktivität, sowohl gegenüber löslichen, von der EZM abgeleiteten HSPG als auch gegenüber intakter EZM. Diese Abbau-Aktivität wurde durch Heparin gehemmt, welches ein anderes Substrat von Heparanase ist. Zellen, die mit einem ähnlichen Konstrukt infiziert wurden, welches kein hpa-Gen enthielt, wiesen keine derartige Aktivität auf, noch war dies bei nicht-infizierten Zellen der Fall. Die Funktionalität der von dem erweiterten 5'-Clon exprimierten Heparanase gegenüber Heparin wurde in einem Säugetier-Expressionssystem nachgewiesen.
  • Das Expressionsmuster von hpa-RNA in verschiedenen Geweben und Zelllinien wurde mittels RT-PCR untersucht. Man fand, dass sie nur in Geweben und Zellen exprimiert wurde, von denen vorher bekannt war, dass sie Heparanase-Aktivität aufwiesen.
  • Eine Reihe monochromosomaler somatischer Zellhybride aus Mensch/CHO und Mensch/Maus wurde verwendet, um das menschliche Heparanasegen auf dem menschlichen Chromosom 4 zu lokalisieren. Die neu isolierte Heparanasesequenz kann verwendet werden, um in einer Chromosomenspreitung eine Chromosomenregion zu identifizieren, welche ein menschliches Heparanase-Gen beherbergt.
  • Gemäß weiteren Merkmalen in bevorzugten Ausführungsformen der nachfolgend beschriebenen Erfindung wird ein Polynucleotidfragment bereitgestellt, das eine Polynucleotidsequenz einschließt, welche ein Polypeptid mit katalytischer Heparanase-Aktivität codiert.
  • Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen schließt das Polynucleotidfragment die Nucleotide 63-1691 von SEQ ID NO: 9 oder die Nucleotide 139-1869 von SEQ ID NO: 13 ein, welche das gesamte menschliche Heparanase-Enzym codieren.
  • Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen wird ein Polynucleotidfragment bereitgestellt, welches eine Polynucleotidsequenz einschließt, welche in der Lage ist, mit hpa-cDNA zu hybridisieren, insbesondere mit den Nucleotiden 1-721 von SEQ ID NO: 9.
  • Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen weist die Polynucleotidsequenz, welche das Polypeptid mit Heparanase-Aktivität codiert, eine mindestens 60%ige Homologie, bevorzugt eine mindestens 70%ige Homologie, stärker bevorzugt eine mindestens 80%ige Homologie, am meisten bevorzugt eine mindestens 90%ige Homologie mit den SEQ ID NOs: 9 oder 13 auf.
  • Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen schließt das Polynucleotidfragment der vorliegenden Erfindung einen Teil (ein Fragment) von den SEQ ID NOs: 9 oder 13 ein. Zum Beispiel könnten solche Fragmente die Nucleotide 63–721 von SEQ ID NO: 9 einschließen und/oder ein Segment von SEQ ID NO: 9, welches ein Polypeptid mit der katalytischen Heparanase-Aktivität codiert.
  • Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen schließt das von dem Polynucleotidfragment codierte Polypeptid eine Aminosäuresequenz ein, wie sie in den SEQ ID NOs: 10 oder 14 dargestellt ist bzw. einen funktionellen Teil davon.
  • Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen codiert die Polynucleotidsequenz ein Polypeptid mit Heparanase-Aktivität, welches eine mindestens 60%ige Homologie, bevorzugt eine mindestens 70%ige Homologie, stärker bevorzugt eine mindestens 80%ige Homologie, am meisten bevorzugt eine mindestens 90%ige Homologie mit den SEQ ID NOs: 10 oder 14 aufweist.
  • Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen codiert das Polynucleotidfragment ein Polypeptid mit Heparanase-Aktivität, welches daher eine allelische, eine Spezies- und/oder eine induzierte Variante der in der SEQ ID NOs: 10 oder 14 dargestellten Aminosäurensequenz sein kann. Es ist selbstverständlich, dass eine jede solche Variante auch als ein Homolog betrachtet werden kann.
  • Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen wird ein einzelsträngiges Polynucleotidfragment bereitgestellt, welches eine Polynucleotidsequenz einschließt, die komplementär zu mindestens einem Teil des Polynucleotidstrangs ist, welcher ein Polypeptid mit katalytischer Heparanase-Aktivität wie vorstehend beschrieben codiert.
  • Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen wird ein Vektor bereitgestellt, welcher eine Polynucleotidsequenz einschließt, die ein Polypeptid mit katalytischer Heparanase-Aktivität codiert.
  • Der Vektor kann von jedem beliebigen geeigneten Typ sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf einen Phagen, ein Virus, ein Plasmid, ein Phagemid, ein Cosmid, ein Bacmid oder sogar ein künstliches Chromosom. Die Polynucleotidsequenz, welche ein Polypeptid mit katalytischer Heparanase-Aktivität codiert, kann jedes beliebige der vorstehend beschriebenen Polynucleotidfragmente einschließen.
  • Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen wird eine Wirtszelle bereitgestellt, welche ein exogenes Polynucleotidfragment beinhaltet, welches eine Polynucleotidsequenz einschließt, die ein Polypeptid mit katalytischer Heparanase-Aktivität codiert.
  • Das exogene Polynucleotidfragment kann jedes beliebige der vorstehend beschriebenen Fragmente sein. Die Wirtszelle kann von jeder beliebigen Art sein, wie z.B. eine prokaryontische Zelle, eine eukaryontische Zelle, eine Zelllinie oder eine Zelle als ein Teil eines vielzelligen Organismus (z.B. Zellen eines transgenen Organismus) sein.
  • Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Aus führungsformen wird ein rekombinantes Protein bereitgestellt, welches ein Polypeptid mit katalytischer Heparanase-Aktivität einschließt.
  • Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen wird ein Arzneimittel bereitgestellt, welches als aktiven Wirkstoff ein rekombinantes Protein mit katalytischer Heparanase-Aktivität umfasst.
  • Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen wird eine medizinische Ausrüstung bereitgestellt, umfassend eine medizinische Vorrichtung, die als aktiven Wirkstoff ein rekombinantes Protein mit katalytischer Heparanase-Aktivität enthält.
  • Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen wird ein Heparanase überexprimierendes System bereitgestellt, welches eine Zelle umfasst, die eine katalytische Heparanase-Aktivität überexprimiert.
  • Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen wird ein Verfahren bereitgestellt, um in einer Chromosomenspreitung eine Chromosomenregion zu identifizieren, welche ein menschliches Heparanase-Gen beherbergt, umfassend die Schritte: (a) Hybridisierung der Chromosomenspreitung mit einer markierten Polynucleotidsonde, welche Heparanase codiert; (b) Waschen der Chromosomenspreitung, wobei überschüssige, nicht hybridisierte Sonde entfernt wird; und (c) Suchen nach Signalen, die mit der hybridisierten markierten Sonde assoziiert sind, wobei entdeckte Signale ein Hinweis auf eine Chromosomenregion sind, welche ein menschliches Heparanase-Gen beherbergt.
  • Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um neue Arzneistoffe zu entwickeln, um die Metastase von Tumorzellen, Entzündung und Autoimmunität zu hemmen. Die Identifizierung des hpa-Gens, welches ein Heparanase-Enzym codiert, erlaubt die Herstellung eines rekombinanten Proteins in heterologen Expressionssystemen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • Die Erfindung wird hierin, nur als Beispiel, unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren beschrieben, wobei:
  • 1 die Nucleotidsequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz der hpa-cDNA darstellt. Ein Unterschied von einem einzelnen Nucleotid an Position 799 (A nach T) zwischen dem EST (Expressed Sequence Tag) und der mittels PCR amplifizierten cDNA (reverse transkribierte RNA) und die sich daraus ergebende Aminosäurensubstitution (Tyr nach Phe) sind oberhalb bzw. unterhalb der ersetzten Einheit angegeben. Cysteinreste und die Konsensus-Sequenz für die Polyadenylierung sind unterstrichen. Das Sternchen markiert das Stopcodon TGA.
  • 2 zeigt den Abbau von löslichem, Sulfat-markiertem HSPG-Substrat durch Lysate von High FiveTM-Zellen, die mit pFhpa2-Virus infiziert sind. Lysate von High FiveTM-Zellen, die mit pFhpa2-Virus (•) oder Kontroll-pF2-Virus (☐) infiziert waren, wurden mit Sulfat-markierten, EZM-abgeleiteten löslichen HSPG (Peak I) inkubiert (18 h, 37°C). Das Inkubationsmedium wurde dann einer Gelfiltration auf Sepharose 6B unterzogen. Niedermolekulare HS-Abbaufragmente (Peak II) wurden nur während der Inkubation mit den pFhpa2-infizierten Zellen erzeugt, es gab jedoch keinen Abbau des HSPG-Substrats (⟡) durch Lysate von pF2-infizierten Zellen.
  • 3a–b zeigen den Abbau von löslichem, Sulfat-markiertem HSPG-Substrat durch das Kulturmedium von pFhpa2- und pFhpa4-infizierten Zellen. Kulturmedien von High FiveTM-Zellen, welche mit pFhpa2- (3a) oder pFhpa4-Viren (3 b) (•) oder mit Kontrollviren (☐) infiziert waren, wurden mit Sulfat-markierten, EZM-abgeleiteten löslichen HSPG (Peak I, ⟡) inkubiert (18 h, 37°C). Die Inkubationsmedien wurden dann einer Gelfiltration auf Sepharose 6B unterzogen. Niedermolekulare HS-Abbaufragmente (Peak II) wurden nur während der Inkubation mit den das hpa-Gen enthaltenden Viren erzeugt. Es gab keinen Abbau des HSPG-Substrats durch Kulturmedien von Zellen, die mit Kontrollviren infiziert waren.
  • 4 zeigt die Größenfraktionierung der durch pFhpa2-infizierte Zellen exprimierten Heparanase-Aktivität. Kulturmedium von pFhpa2-infizierten High FiveTM-Zellen wurde auf eine Membran mit einer Ausschlussgrenze von 50 kD gegeben. Heparanase-Aktivität (Umsetzung des Peak I-Substrats, (⟡) in die Peak II-HS-Abbaufragmente) wurde in dem hochmolekularen (> 50 kD) (•), jedoch nicht in dem niedermolekularen (< 50 kD) (O) Kompartiment gefunden.
  • 5a–b zeigen den Effekt von Heparin auf die von pFhpa2- und pFhpa4-infizierten High FiveTM-Zellen exprimierte Heparanase-Aktivität. Kulturmedien von mit pFhpa2 (5a) und pFhpa4 (5b) infizierten High FiveTM-Zellen wurden mit Sulfatmarkierten, EZM-abgeleiteten HSPG (Peak I, ⟡) in Abwesenheit (•) oder in Gegenwart (Δ) von 10 μg/ml Heparin inkubiert (18 h, 37°C). Die Erzeugung von niedermolekularen HS-Abbaufragmenten wurde in Gegenwart von Heparin, einem starken Hemmstoff der Heparanase-Aktivität (6, 7), vollständig aufgehoben.
  • 6a–b zeigen den Abbau von Sulfat-markierter, intakter EZM durch Virusinfizierte High FiveTM- und Sf21-Zellen. High FiveTM- (6a) und Sf21-Zellen (6b) wurden auf Sulfat-markierter EZM ausplattiert und mit pFhpa4-Viren (•) oder pF1-Kontrollviren (☐) infiziert (48 h, 28°C). Nicht-infizierte Sf21-Kontrollzellen
    Figure 00150001
    wurden ebenfalls auf der markierten EZM ausplattiert. Der pH-Wert des Kulturmediums wurde auf 6,0 bis 6,2 eingestellt, gefolgt von einer 24stündigen Inkubation bei 37°C. Das ins Inkubationsmedium freigesetzte, Sulfat-markierte Material wurde durch Gelfiltration auf Sepharose 6B analysiert. HS-Abbaufragmente wurden nur von Zellen erzeugt, die mit einem hpa-enthaltenden Virus infiziert waren.
  • 7a–b zeigen den Abbau von Sulfat-markierter, intakter EZM durch Virusinfizierte Zellen. High FiveTM-(7a) und Sf21-Zellen (7b) wurden auf Sulfatmarkierter EZM ausplattiert und mit pFhpa4-Viren (•) oder pF1-Kontrollviren (☐) infiziert (48 h, 28°C). Nicht-infizierte Sf21-Kontrollzellen
    Figure 00150002
    wurden ebenfalls auf der markierten EZM ausplattiert. Der pH-Wert des Kulturmediums wurde auf 6,0 bis 6,2 eingestellt, gefolgt von einer 48stündigen Inkubation bei 28°C. Die ins Inkubationsmedium freigesetzten, Sulfat-markierten Abbauprodukte wurden durch Gelfiltration auf Sepharose 6B analysiert. HS-Abbaufragmente wurden nur von Zellen erzeugt, die mit einem hpa-enthaltenden Virus infiziert waren.
  • 8a–b zeigen den Abbau von Sulfat-markierter, intakter EZM durch das Kulturmedium von pFhpa4-infizierten Zellen. Kulturmedien von High FiveTM- (8a) und Sf21-Zellen (8b), die mit pFhpa4 (•) oder pF1-Kontrollviren (☐) infiziert waren, wurden mit intakter, Sulfat-markierter inkubiert (48 h, 37°C, pH 6,0). Die EZM wurde auch mit dem Kulturmedium von nicht-infizierten Sf21-Kontrollzellen
    Figure 00160001
    inkubiert. Das ins Reaktionsgemisch freigesetzte, Sulfat-markierte Material wurde einer Gelfiltration auf Sepharose 6B unterzogen. Heparanase-Aktivität wurde nur im Kulturmedium von pFhpa4-infizierten Zellen nachgewiesen.
  • 9a–b zeigen die Wirkung von Heparin auf die Heparanase-Aktivität im Kulturmedium von pFhpa4-infizierten Zellen. Sulfat-markierte EZM wurde mit Kulturmedium von pFhpa4-infizierten High FiveTM-Zellen (9a) und Sf21-Zellen (9b) in Abwesenheit (•) oder in Gegenwart (Δ) von 10 μg/ml Heparin inkubiert (24 h, 37°C, pH 6,0). Das ins Inkubationsmedium freigesetzte, Sulfat-markierte Material wurde einer Gelfiltration auf Sepharose 6B unterzogen. Heparanase-Aktivität (Erzeugung von Peak II- Abbaufragmenten von HS war in Gegenwart von Heparin vollständig gehemmt.
  • 10a–b zeigen die Reinigung von rekombinanter Heparanase auf Heparin-Sepharose. Kulturmedium von mit pFhpa4-Virus infizierten Sf21-Zellen wurde einer Heparin-Sepharose-Chromatographie unterzogen. Die Elution der Fraktionen wurde mit einem 0,35–2 M NaCl-Gradienten (⟡) durchgeführt. Die Heparanase-Aktivität in den eluierten Fraktionen ist in 10a gezeigt (•). Die Fraktionen 15–28 wurden einer Gelelektrophorese auf einem 15%igen SDS-Polyacrylamidgel unterzogen, gefolgt von einer Färbung mit Silbernitrat. Es wird eine Korrelation zwischen einer stärkeren Proteinbande (MW ~ 63.000) in den Fraktionen 19–24 und der Heparanase-Aktivität aufgezeigt.
  • 11a–b zeigen die Reinigung von rekombinanter Heparanase auf einer Superdex 75-Gelfiltrationssäule. Aktive Fraktionen, die von der Heparin-Sepharose (10a) eluiert worden waren, wurden vereinigt, konzentriert und auf eine Superdex 75-FPLC-Säule aufgetragen. Es wurden Fraktionen gesammelt und Aliquots einer jeden Fraktion auf Heparanase-Aktivität (O, 11a) untersucht und durch Elektrophorese auf einem SDS-Polyacrylamidgel analysiert, gefolgt von einer Färbung mit Silbernitrat, (11b). Es ist eine Korrelation zwischen dem Auftreten einer stärkeren Proteinbande (MW ~ 63.000) in den Fraktionen 4–7 und der Heparanase-Aktivität zu sehen.
  • 12a–e zeigen die Expression des hpa-Gens über RT-PCR aus Gesamt-RNA von menschlichen embryonalen Geweben (12a), menschlichen extraembryonalen Geweben (12b) und Zelllinien unterschiedlicher Herkunft (12c–e). RT-PCR-Produkte unter Verwendung von hpa-spezifischen Primern (I), Primern für das GADPH-„Housekeeping"-Gen (II) und Kontrollreaktionen ohne Reverse Transkriptase (III), welche die Abwesenheit von genomischer DNA oder anderer Kontaminationen in den RNA-Proben zeigen. M – DNA-Molekulargewichtsmarker VI (Boehringer Mannheim). Für 12a: Spur 1 – neutrophile Zellen (reif), Spur 2 – Muskel, Spur 3 – Thymus, Spur 4 – Herz, Spur 5 – Nebenniere. Für 12b: Spur 1 – Niere, Spur 2 – Placenta (8 Wochen), Spur 3 – Placenta (11 Wochen), Spuren 4–7 – Mole (gesamte Blasenmole), Spur 8 – Cytotrophoblasten-Zellen (frisch isoliert), Spur 9 – Cytotrophoblasten-Zellen (1,5 h in vitro), Spur 10 – Cytotrophoblasten-Zellen (6 h in vitro), Spur 11 – Cytotrophoblasten-Zellen (18 h in vitro), Spur 12 – Cytotrophoblasten-Zellen (48 h in vitro). Für 12c: Spur 1 – Blasenzelllinie JAR, Spur 2 – Hodentumor-Zelllinie NCITT, Spur 3 – menschliche Hepatom-Zelllinie SW-480, Spur 4 – HTR (durch SV40 transformierte Cytotrophoblasten), Spur 5 – leberzellige Carcinom-Zelllinie HPTLP-I, Spur 6 – Blasencarcinom-Zelllinie EJ-28. Für 12d: Spur 1 – menschliche Hepatom-Zelllinie SK-hep1, Spur 2 – menschliche Megakaryocyten-Zelllinie DAMI, Spur 3 – DAMI-Zelllinie + PMA, Spur 4 – CHRF-Zelllinie + PMA, Spur 5 – CHRF-Zelllinie. Für 12e: Spur 1 – ABAE Rinderaorten-Endothelzellen, Spur 2 – menschliche Ovarialzelllinie 1063, Spur 3 – menschliche Brustcarcinom-Zelllinie MDA435, Spur 4 – menschliche Brustcarcinom-Zelllinie MDA231.
  • 13 zeigt einen Vergleich zwischen den Nucleotidsequenzen des menschlichen hpa- und einem EST-cDNA-Fragment der Maus (SEQ ID NO: 12), welches 80% homolog zu dem 3'-Ende (beginnend bei Nucleotid 1066 der SEQ ID NO: 9) des menschlichen hpa ist. Die untereinander ausgerichteten Terminationscodons sind unterstrichen.
  • 14 zeigt die chromosomale Lokalisierung des hpa-Gens. PCR-Produkte von aus somatischen Zellhybriden abgeleiteter DNA und von genomischer DNA aus Hamster, Maus und Mensch wurden nach Amplifikation mit hpa-spezifischen Primern auf einem 0,7%igen Agarosegel getrennt. Spur 1 – mit BstEII verdaute Lambda-DNA, Spur 2 – Kontrolle ohne DNA, Spuren 3–29 – PCR-Amplifikationsprodukte.
  • Spuren 3–5 – genomische DNA von Mensch, Maus bzw. Hamster, Spuren 6–29 – menschliche monochromosomale somatische Zellhybride, die jeweils die Chromosomen 1–22 sowie X und Y darstellen. Spur 30 – mit BstEII verdaute Lambda-DNA. Ein Amplifikationsprodukt von etwa 2,8 kb ist nur in den Spuren 5 und 9 zu beobachten, welche menschliche genomische DNA darstellen bzw. DNA, die von dem Zellhybrid abgeleitet ist, welches das menschliche Chromosom 4 trägt. Diese Ergebnisse zeigen, dass das hpa-Gen auf dem menschlichen Chromosom 4 lokalisiert ist.
  • BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polynucleotid, welches hierin folgend abwechselnd als hpa, hpa-cDNA oder hpa-Gen bezeichnet wird, welches ein Polypeptid mit Heparanase-Aktivität codiert, Vektoren, die dieses einschließen, transduzierte Zellen, welche Heparanase exprimieren und ein rekombinantes Protein mit Heparanase-Aktivität.
  • Bevor wenigstens eine Ausführungsform im Detail erklärt wird, sollte es selbstverständlich sein, dass die Erfindung in ihrer Anwendung nicht auf die Konstruktionseinzelheiten und die Anordnung der Bestandteile beschränkt ist, die in der folgenden Beschreibung dargestellt oder in den Figuren veranschaulicht sind. Es sollte auch selbstverständlich sein, dass die hierein verwendete Ausdrucksweise und Terminologie dem Zweck der Beschreibung dienen und nicht als beschränkend anzusehen sind.
  • Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um Behandlungen für verschiedene Krankheiten zu entwickeln, um diagnostische Tests für diese Krankheiten zu entwickeln und neue Werkzeuge für die Grundlagenforschung bereitzustellen, insbesondere auf den Gebieten der Medizin und der Biologie.
  • Die vorliegende Erfindung kann speziell dafür verwendet werden, um neue Arzneimittel zu entwickeln, welche die Metastase von Tumorzellen, Entzündung und Autoimmunität hemmen. Die Identifizierung des hpa-Gens, welches das Heparanase-Enzym codiert, erlaubt die Herstellung eines rekombinanten Enzyms in heterologen Expressionssystemen.
  • Des Weiteren kann die vorliegende Erfindung dazu verwendet werden, die Bioverfügbarkeit von Heparin-bindenden Wachstumsfaktoren, die zellulären Reaktionen auf Heparin-bindende Wachstumsfaktoren (z.B. bFGF, VEGF) sowie Cytokine (IL-8), die Interaktion von Zellen mit Plasma-Lipoproteinen, die Anfälligkeit von Zellen gegenüber viralen, Protozoen- und bakteriellen Infektionen und die Auflösung neurodegenerativer Plaques zu modulieren. Rekombinante Heparanase stellt somit eine mögliche Behandlung für Wundheilung, Angiogenese, Restenose, Atherosklerose, Entzündung, neurodegenerative Erkrankungen (wie z.B. das Gerstmann-Sträussler-Syndrom, die Creutzfeld-Jakob-Krankheit, Scrapie und die Alzheimersche Krankheit) sowie bestimmte Infektionen durch Viren sowie einige Bakterien und Protozoen dar. Rekombinante Heparanase kann eingesetzt werden, um Plasmaheparin zu neutralisieren, als ein möglicher Ersatz für Protamin.
  • Wie hierin verwendet schließt der Begriff „modulieren" im Wesentlichen das Hemmen, Verlangsamen oder Umkehren des Fortschreitens einer Krankheit ein sowie im Wesentlichen eine Verbesserung der klinischen Symptome einer Krankheit oder eines Zustands oder im Wesentlichen das Verhindern des Auftretens von klinischen Symptomen einer Krankheit oder eines Zustands. Ein „Modulator" schließt daher einen Wirkstoff ein, der eine Krankheit oder einen Zustand modulieren kann. Die Modulation von viralen, Protozoen- und bakteriellen Infektionen schließt jede beliebige Wirkung ein, welche eine beliebige Aktivität von Viren, Protozoen oder Bakterien und/oder Stadium des Lebenszyklus der Viren, Bakterien oder Protozoen im Wesentlichen unterbricht, verhindert oder vermindert oder welche die Infektion durch das Virus, das Bakterium oder das Protozoon in einem Testorganismus wie z.B. einem Menschen oder einem niederen Tier vermindert oder verhindert.
  • Wie hierin verwendet schließt der Begriff „Wunde" jegliche Verletzung eines beliebigen Körperteils eines Probanden ein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Akutzustände wie z.B. Verbrennungen durch Hitze, Verbrennungen durch chemische Substanzen, Verbrennungen durch Strahlung, Verbrennungen, welche durch übermäßige Exposition gegenüber ultravioletter Strahlung entstehen wie z.B. Sonnenbrand, Schaden an Körpergeweben wie dem Damm als Folge von Wehen und Kindsgeburt, einschließlich Verletzungen, welche während medizinischen Behandlungsmethoden erlitten werden wie z.B. Dammschnitte, durch Gewalt einwirkung hervorgerufene Verletzungen einschließlich Schnittwunden, solchen Verletzungen, wie sie bei Autounfällen oder anderen Maschinenunfällen erlitten werden, und solche, die durch Kugeln, Messer und andere Waffen verursacht werden, und post-operative Verletzungen sowie chronische Zustände wie z.B. Druckgeschwüre, Wundliegen, Zustände, die mit Diabetes und schwachem Kreislauf in Beziehung stehen und alle Arten von Akne etc.
  • Anti-Heparanase-Antikörper, welche gegen das rekombinante Enzym erzeugt werden, können für den Immunnachweis und die Diagnose von Mikrometastasen, Autoimmunläsionen und Nierenversagen in Biopsieproben, Plasmaproben und Körperflüssigkeiten dienlich sein. Solche Antikörper können auch als Neutralisierungsmittel für die Heparanase-Aktivität dienen.
  • Die Clonierung des menschlichen hpa-Gens, welches Heparanase codiert und die Expression von rekombinanter Heparanase durch transfizierte Zellen wird hierin berichtet. Dies ist das erste Heparanase-Gen, welches aus Säugern cloniert wurde.
  • Eine gereinigte Präparation von aus menschlichen Hepatom-Zellen isolierter Heparanase wurde einem Trypsinverdau unterzogen und mikrosequenziert.
  • Die hierbei aufgedeckte Sequenz YGPDVGQPR (SEQ ID NO: 8) wurde verwendet, um EST-Datenbanken auf Homologie zu den entsprechenden rückübersetzten DNA-Sequenzen zu durchmustern. Zwei eng verwandte EST-Sequenzen wurden identifiziert, und es wurde hernach festgestellt, dass diese identisch waren.
  • Beide Clone enthielten eine 1020 bp lange Insertion, welche einen 973 bp langen offenen Leserahmen enthielt, gefolgt von einer 27 bp langen 3'-untranslatierten Region und einem Poly(A)-Schwanz. Eine Translations-Startstelle wurde hingegen nicht identifiziert.
  • Die Clonierung des fehlenden 5'-Endes wurde mittels PCR-Amplifikation von DNA aus dem Plazenta-Marathon-RACETM-cDNA-Gemisch unter Verwendung von Primern durchgeführt, welche entsprechend der Sequenz der EST-Clone und der Linker des Komposits ausgewählt wurden.
  • Ein 900 bp langes PCR-Fragment wurde erhalten, welches teilweise mit den die 3'-Region codierenden EST-Clonen überlappte. Das zusammengesetzte cDNA-Fragment (hpa) war 1721 bp lang (SEQ ID NO: 9) und enthielt einen offenen Leserahmen, der, wie in 1 und SEQ ID NO: 11 gezeigt, ein Polypeptid von 543 Aminosäuren (SEQ ID NO: 10) mit einem berechneten Molekulargewicht von 61.192 Dalton codiert.
  • Es wurde ein Unterschied von einem einzelnen Nucleotid an Position 799 (A nach T) zwischen den EST-Clonen und der mittels PCR amplifizierten cDNA beobachtet. Dieser Unterschied führt zu einer Substitution einer einzelnen Aminosäure (Tyr nach Phe) (1). Des Weiteren enthielten die veröffentlichten EST-Sequenzen ein unidentifiziertes Nucleotid, welches nach der DNA-Sequenzierung der beiden EST-Clone in zwei Nucleotide (G und C an den Positionen 1630 bzw. 1631 in SEQ ID NO: 9) aufgetrennt wurde.
  • Die Fähigkeit des hpa-Genprodukts, den Abbau von Heparansulfat in einem in vitro-Assay zu katalysieren, wurde untersucht, indem man den gesamten offenen Leserahmen von hpa in Insektenzellen exprimierte, wobei das Baculovirus-Expressionssystem verwendet wurde.
  • Extrakte und konditionierte Medien von Zellen, die mit einem das hpa-Gen enthaltenden Virus infiziert waren, zeigten einen hohen Spiegel an Heparansulfat abbauender Aktivität, sowohl gegenüber löslichen, von der EZM abgeleiteten HSPG als auch gegenüber intakter EZM, welche durch Heparin gehemmt wurde, wohingegen Zellen, die mit einem ähnlichen Konstrukt infiziert waren, welches kein hpa-Gen enthielt, keine solche Aktivität aufwiesen, noch war dies bei nicht-infizierten Zellen der Fall.
  • Das Expressionsmuster von hpa-RNA in verschiedenen Geweben und Zelllinien wurde mittels RT-PCR untersucht. Man fand, dass sie nur in Geweben und Zellen exprimiert wurde, von denen vorher bekannt war, dass sie Heparanase-Aktivität aufwiesen.
  • Die Clonierung einer erweiterten 5'-Sequenz aus der menschlichen SK-hep1-Zelllinie wurde durch eine PCR-Amplifikation mit Hilfe der Marathon-RACETM ermög licht. Die am 5'-Ende verlängerte Sequenz der hpa-cDNA aus SK-hep1 wurde mit der Sequenz der aus der menschlichen Plazenta isolierten hpa-cDNA (SEQ ID NO: 9) zusammengefügt. Die zusammenfügte Sequenz enthielt einen offenen Leserahmen, SEQ ID NOs: 13 und 15, welcher, wie in den SEQ ID NOs: 14 und 15 gezeigt, ein Polypeptid von 592 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 66.407 Dalton codiert. Es wurde gezeigt, dass dieser offene Leserahmen die Expression einer katalytisch aktiven Heparanase in einem Säugetier-Expressionssystem steuerte. Die exprimierte Heparanase konnte mit Anti-Heparanase-Antikörpern in einer Westernblot-Analyse nachgewiesen werden.
  • Eine Reihe von monochromosomalen somatischen Zellhybriden aus Mensch/CHO und Mensch/Maus wurde verwendet, um das menschliche Heparanasegen auf dem menschlichen Chromosom 4 zu lokalisieren. Die neu isolierte Heparanase-Sequenz kann daher verwendet werden, um eine Chromosomenregion in einer Chromosomenspreitung zu identifizieren, welche ein menschliches Heparanase-Gen beherbergt.
  • Somit wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Polynucleotidfragment (entweder DNA oder RNA, entweder einzelsträngig oder doppelsträngig) bereitgestellt, das eine Polynucleotidsequenz einschließt, welche ein Polypeptid mit katalytischer Heparanase-Aktivität codiert.
  • Der Begriff „katalytische Heparanase-Aktivität" oder dessen gleichwertiger Begriff „Heparanase-Aktivität" beziehen sich beide auf eine hydrolysierende Endoglycosidase-Aktivität in Säugern, welche spezifisch für Heparan- oder Heparansulfat-Proteoglycansubstrate ist, im Gegensatz zur Aktivität von bakteriellen Enzymen (Heparinase I, II und III), welche Heparin oder Heparansulfat mittels β-Eliminierung abbauen (37).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung schließt das Polynucleotidfragment die Nucleotide 63–1691 von SEQ ID NO: 9 oder die Nucleotide 139–1869 von SEQ ID NO: 13 ein, welche das gesamte menschliche Heparanase-Enzym codieren.
  • Der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht auf mensch liche Heparanase beschränkt, da dies die erste Offenbarung eines offenen Leserahmens (ORF) darstellt, welcher eine Säuger-Heparanase codiert. Die Verwendung der hpa-cDNA, von Teilen davon oder von synthetischen Oligonucleotiden, welche in Anlehnung an deren Sequenz konstruiert werden, wird es einem durchschnittlich gebildeten Fachmann gestatten, genomische und/oder cDNA-Clone zu identifizieren, einschließlich homologer Sequenzen von anderen Säugerarten.
  • Die vorliegende Erfindung ist daher weiter auf ein Polynucleotidfragment gerichtet, welches eine Polynucleotidsequenz einschließt, die in der Lage ist, mit hpa-cDNA, besonders mit den Nucleotiden 1–721 von SEQ ID NO: 9 zu hybridisieren (Eingehen von Basenpaarungen unter entweder stringenten oder permissiven Hybridisierungsbedingungen, wie z.B. in Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York beschrieben).
  • In der Tat liegt jede beliebige Polynucleotidsequenz, welche ein Polypeptid mit Heparanase-Aktivität codiert und die mindestens 60% Homologie, bevorzugt mindestens 70% Homologie, stärker bevorzugt mindestens 80% Homologie, am meisten bevorzugt mindestens 90% Homologie mit SEQ ID NOs: 9 oder 13 aufweist, im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung.
  • Das Polynucleotidfragment gemäß der vorliegenden Erfindung kann jeden beliebigen Teil der SEQ ID NOs: 9 oder 13 einschließen. Zum Beispiel kann es die Nucleotide 63–721 von SEQ ID NO: 9 einschließen, welche eine neuartige Sequenz darstellen. Es kann jedoch jedes beliebige Segment der SEQ ID NOs: 9 oder 13 einschließen, welches ein Polypeptid mit katalytischer Heparanase-Aktivität codiert.
  • Wenn hierin und im nachstehenden Abschnitt mit den Ansprüchen der Ausdruck „codiert ein Polypeptid mit katalytischer Heparanase-Aktivität" verwendet wird, bezieht sich dieser auf die Fähigkeit, die Synthese eines Polypeptids zu steuern, welches, falls dies für dessen Aktivität notwendig ist, nach posttranslationalen Modifikationen wie z.B., jedoch nicht beschränkt auf, Proteolyse (z.B. Entfernung eines Signalpeptids und einer Pro- oder Präproteinsequenz), Methioninmodifizierung, Glycosylierung, Alkylierung (z.B. Methylierung), Acetylierung etc. beim Abbau von beispielsweise EZM oder Zelloberflächen-assoziierten HS katalytisch aktiv ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung schließt das von dem Polynucleotidfragment codierte Polypeptid eine Aminosäuresequenz ein wie sie in SEQ ID NOs: 10 oder 14 oder einem funktionellen Teil hiervon, d.h. einem Teil, welcher die katalytische Heparanase-Aktivität beherbergt, dargestellt ist.
  • Es liegt indes jedes beliebige Polynucleotidfragment im Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung, welches ein Polypeptid mit Heparanase-Aktivität codiert. Daher kann das Polypeptid eine allelische, eine Spezies- und/oder eine induzierte Variante der in der SEQ ID NOs: 10 oder 14 dargestellten Aminosäurensequenz oder eines funktionellen Teils davon sein.
  • In der Tat liegt jede Polynucleotidsequenz, welche ein Polypeptid mit Heparanase-Aktivität codiert und welche mindestens 60% Homologie, bevorzugt mindestens 70% Homologie, stärker bevorzugt mindestens 80% Homologie, am meisten bevorzugt mindestens 90% Homologie mit SEQ ID NOs: 10 oder 14 aufweist, im Schutzbereich der Erfindung.
  • Die Erfindung ist auch darauf gerichtet, ein einzelsträngiges Polynucleotidfragment bereitzustellen, welches eine Polynucleotidsequenz einschließt, die komplementär zu mindestens einem Teil eines Polynucleotidstrangs ist, welcher ein Polypeptid mit katalytischer Heparanase-Aktivität wie vorstehend beschrieben kodiert. Der Begriff „komplementär" wie hierin verwendet bezieht sich auf die Fähigkeit zur Basenpaarung.
  • Das einzelsträngige Polynucleotidfragment kann DNA oder RNA sein oder sogar Nucleotidanaloga (z.B. thiolierte Nucleotide) einschließen, es kann ein synthetisches Oligonukleotid sein oder von transduzierten Wirtszellen synthetisiert werden, es kann jede beliebige Größe aufweisen, die noch eine spezifische Basenpaarung gewährleistet (z.B. eine Länge von 8 oder 10, bevorzugt mehr, Nucleotiden aufweisen) und es kann Fehlpaarungen aufweisen, welche die Basenpaarung nicht behindern.
  • Die Erfindung ist weiter darauf gerichtet, einen Vektor bereitzustellen, der eine Polynucleotidsequenz einschließt, welche ein Polypeptid mit katalytischer Heparanase-Aktivität codiert.
  • Der Vektor kann von jedem beliebigen Typ sein. Es kann ein Phage sein, der Bakterien infiziert oder ein Virus, das eukaryontische Zellen infiziert. Es kann auch ein Plasmid, eine Phagemid, ein Cosmid, ein Bacmid oder ein künstliches Chromosom sein. Die Polynucleotidsequenz, welche ein Polypeptid mit katalytischer Heparanase-Aktivität codiert, kann beliebige der vorstehend beschriebenen Polynucleotidfragmente einschließen.
  • Die Erfindung ist weiter darauf gerichtet, eine Wirtszelle bereitzustellen, welche ein exogenes Polynucleotidfragment einschließt, das ein Polypeptid mit katalytischer Heparanase-Aktivität codiert.
  • Das exogene Polynucleotidfragment kann ein beliebiges der vorstehend beschriebenen Fragmente sein. Die Wirtszelle kann von jedem beliebigen Typ sein. Sie kann eine prokaryontische Zelle, eine eukaryontische Zelle oder eine Zelle als Teil eines Organismus sein. Das exogene Polynucleotidfragment kann dauerhaft oder vorübergehend in der Zelle vorliegen. Mit anderen Worten, transduzierte Zellen, welche nach einer stabilen oder einer transienten Transfektion, Transformation oder Transduktion erhalten werden, liegen alle im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung. Der Begriff „exogen" wie hierin verwendet bezieht sich auf die Tatsache, dass das Polynucleotidfragment extern in die Zelle eingeführt wird. In dieser kann es als Einzelkopie oder einer beliebigen Anzahl von Kopien vorliegen, es kann in eines oder mehrere Chromosome an jeder beliebigen Stelle integriert sein oder als extrachromosomales Material vorliegen.
  • Die Erfindung ist weiter darauf gerichtet, ein Heparanase überexprimierendes System bereitzustellen, welches eine Zelle einschließt, die katalytische Heparanase-Aktivität überexprimiert. Die Zelle kann eine Wirtszelle sein, die transient oder stabil mit einem beliebigen geeigneten Vektor transfiziert oder transformiert ist, der eine Polynucleotidsequenz einschließt, welche ein Polypeptid mit katalytischer Heparanase-Aktivität codiert, und einen geeigneten Promotor und Enhancersequenzen aufweist, um die Überexpression der Heparanase steuern. Die überexprimierende Zelle kann jedoch auch das Produkt einer Insertion (z.B. über homologe Rekombination) eines Promotors und/oder von Enhancersequenzen stromaufwärts vom endogenen Heparanase-Gen der exprimierenden Zelle sein, welche die Überexpression des endogenen Gens steuern. Der Begriff „Überexpression", wie hierin in der Beschreibung und den nachstehenden Ansprüchen verwendet, bezieht sich auf einen Expressionsspiegel, der höher ist als der basale Expressionsspiegel, der normalerweise für eine bestimmte Zelle unter sonst identischen Bedingungen charakteristisch ist.
  • Die Erfindung ist weiter darauf gerichtet, ein rekombinantes Protein bereitzustellen, welches ein Polypeptid mit katalytischer Heparanase-Aktivität einschließt.
  • Das rekombinante Protein kann durch jede beliebige herkömmliche Proteinaufreinigungsprozedur bis nahe der Homogenität aufgereinigt werden und/oder mit Zusatzstoffen gemischt werden. Das rekombinante Protein kann unter Verwendung von jeder beliebigen der vorstehend beschriebenen Zellen hergestellt werden. Das rekombinante Protein kann in jeder beliebigen Form vorliegen. Es kann in kristallisierter Form, als dehydriertes Pulver oder in Lösung vorliegen. Das rekombinante Protein kann nützlich dafür sein, gereinigte Heparanase zu gewinnen, was wiederum nützlich dafür sein kann, Anti-Heparanase-Antikörper hervorzurufen, entweder poly- oder monoclonale Antikörper, und als ein Wirkstoff zur Durchmusterung in einem Test oder System zur Durchmusterung von Anti-Heparanase-Hemmstoffen.
  • Die Erfindung ist weiter darauf gerichtet, ein Arzneimittel bereitzustellen, welches als Wirkstoff ein rekombinantes Protein mit katalytischer Heparanase-Aktivität einschließt.
  • Rezepturen für die lokale Anwendung können, ohne darauf beschränkt zu sein, Lotionen, Salben, Gele, Cremes, Zäpfchen, Tropfen, Flüssigkeiten, Sprays und Pulver einschließen. Herkömmliche pharmazeutische Träger, wässrige, pulvrige oder ölige Grundstoffe, Verdickungsmittel und dergleichen können notwendig oder wünschenswert sein. Beschichtete Kondome, Stents, Wundbinden und andere medizinische Hilfsmittel können ebenfalls nützlich sein. In der Tat schließt der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung jede beliebige medizinische Vorrichtung ein, wie z.B. ein Medizinprodukt, welches als Wirkstoff ein rekombinantes Protein mit katalytischer Heparanase-Aktivität enthält.
  • Zusammensetzungen für die orale Verabreichung schließen Pulver oder Gra nulatkörner, Suspensionen oder Lösungen in Wasser oder nicht-wässrigen Medien, Sachets, Kapseln oder Tabletten ein. Verdickungsmittel, Verdünnungsmittel, Geschmacksstoffe, Dispergierungshilfen, Emulgatoren oder Bindemittel können wünschenswert sein.
  • Rezepturen für die parenterale Verabreichung können, ohne hierauf beschränkt zu sein, sterile wässrige Lösungen einschließen, die auch Puffer, Verdünnungsmittel und andere geeignete Zusatzstoffe enthalten können.
  • Die Dosierung ist abhängig von der Schwere und Ansprechbarkeit des zu behandelnden Zustands, wird aber normalerweise eine oder mehrere Gaben pro Tag umfassen, wobei der Behandlungsverlauf von mehreren Tagen bis zu mehreren Monaten reichen kann oder bis eine Heilung eingetreten oder eine Verbesserung des Krankheitszustands erreicht worden ist. Durchschnittlich ausgebildete Fachleute können leicht die optimalen Dosierungen, Dosierungsmethodiken und Wiederholungsraten bestimmen.
  • Des Weiteren wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereitgestellt, um in einer Chromosomenspreitung eine Chromosomenregion zu identifizieren, welche ein menschliches Heparanase-Gen beherbergt. Das Verfahren wird durchgeführt, indem die folgenden Methodenschritte angewandt werden, wobei in einem ersten Schritt die Chromosomenspreitung (entweder eine Interphase- oder eine Metaphase-Spreitung) mit einer markierten Polynucleotidsonde hybridisiert wird, welche Heparanase codiert. Die Markierung ist bevorzugt eine Fluoreszenzmarkierung. In einem zweiten Schritt wird die Chromosomenspreitung gemäß dem Verfahren gewaschen, wobei überschüssige nicht-hybridisierte Sonde entfernt wird. Zuletzt wird nach den Signalen gesucht, welche mit der hybridisierten markierten Polynucleotidsonde assoziiert sind, wobei nachgewiesene Signale ein Hinweis darauf sind, dass eine Chromosomenregion das menschliche Heparanase-Gen beherbergt. Ein durchschnittlich gebildeter Fachmann würde wissen, wie die hierin offenbarten Sequenzen in geeigneten Markierungsreaktionen einzusetzen sind und wie die markierten Sonden zu verwenden sind, um mittels in situ-Hybridisierung eine Chromosomenregion nachzuweisen, welche ein menschliches Heparanase-Gen beherbergt.
  • Es wird nun Bezug auf die folgenden Beispiele genommen, welche zusammen mit den vorstehenden Beschreibungen die Erfindung in einer nicht beschränkenden Weise veranschaulichen.
  • BEISPIELE
  • Auf die folgenden Protokolle und experimentellen Einzelheiten wird in den Beispielen Bezug genommen, welche folgen.
  • Aufreinigung und Charakterisierung von Heparanase aus einer menschlichen Hepatom-Zelllinie und menschlicher Placenta: Eine menschliche Hepatom-Zelllinie (Sk-hep-1) wurde als Quelle für die Aufreinigung einer von einem menschlichen Tumor abgeleiteten Heparanase ausgewählt. Die Aufreinigung war im Wesentlichen wie im U.S. Pat. No. 5,362,641 von Fuks beschrieben. In Kürze, 500 Liter, 5 × 1011 Zellen wurden in Suspension gezüchtet, und das Heparanase-Enzym wurde etwa 240.000-fach aufgereinigt, indem die folgenden Schritte durchgeführt wurden: (i) eine Kationenaustausch-Chromatographie (CM-Sephadex) wurde bei pH 6,0 mit einem 0,3–1,4M NaCl-Gradienten durchgeführt; (ii) eine Kationenaustausch-Chromatographie (CM-Sephadex) wurde bei pH 7,4 in Gegenwart von 0,1 % CHAPS mit einem 0,3–1,1 M NaCl-Gradienten durchgeführt; (iii) eine Heparin-Sepharose-Chromatographie wurde bei pH 7,4 in Gegenwart von 0,1% CHAPS mit einem 0,35–1,1M NaCl-Gradienten durchgeführt; (iv) eine ConA-Sepharose-Chromatographie wurde bei pH 6,0 in einem Puffer durchgeführt, welcher 0,1 % CHAPS und 1 M NaCl enthielt, die Elution erfolgte mit 0,25M α-Methylmannosid; und (v) eine HPLC-Kationenaustausch-Chromatographie (Mono-S) wurde bei pH 7,4 in Gegenwart von 0,1 % CHAPS mit einem 0,25–1 M NaCl-Gradienten durchgeführt.
  • Aktive Fraktionen wurden vereinigt, mit TCA gefällt, und das Präzipitat wurde einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und/oder einem Verdau mit Trypsin und einer Umkehrphasen-HPLC (C8-Säule) unterzogen. Tryptische Peptide des gereinigten Proteins wurden über Umkehrphasen-Chromatographie aufgetrennt, und homogene Peaks wurden einer Aminosäuren-Sequenzanalyse unterzogen.
  • Das aufgereinigte Enzym wurde auf eine Umkehrphasen-HPLC aufgetragen und einer N-terminalen Aminosäurensequenzierung mit Hilfe eines Aminosäurensequenziergeräts (Applied Biosystems) unterzogen
  • Zellen: Kulturen von Endothelzellen aus Rinder-Cornea (BCECs) wurden aus Ochsenaugen wie zuvor beschrieben (19, 38) hergestellt. Stammkulturen wurden in DMEM (1g Glucose/Liter) gehalten, welches mit 10% Neugeborenen-Kälberserum und 5% fötalem Kälberserum ergänzt war. bFGF (1 ng/ml) wurde jeden zweiten Tag während der aktiven Wachstumsphase der Zellen zugegeben (13, 14).
  • Herstellung von mit EZM beschichteten Platten: BCECs (zweite bis fünfte Passage) wurden in Platten mit 4 Vertiefungen mit einer Anfangsdichte von 2 × 105 Zellen/ml ausplattiert und in Sulfat-freiem Fisher-Medium plus 5% Dextran T-40 für 12 Tage gezüchtet. Na2 35SO4 (25 μCi/ml) wurde am Tag 1 und 5 nach der Aussaat der Zellen zugegeben, und die Kulturen wurden mit der Markierungssubstanz ohne Mediumwechsel inkubiert. Die subendotheliale EZM wurde freigelegt, indem man die Zellschicht mit PBS auflöste, das 0,5% Triton X-100 und 20 mM NH4OH enthielt (5 Min., bei Raumtemperatur), gefolgt von vier Waschschritten mit PBS. Die EZM blieb intakt, frei von zellulären Trümmerteilen und über die gesamte Fläche der Gewebekulturplatte fest angehaftet (19, 22).
  • Um lösliche, Sulfat-markierte Proteoglycane herzustellen (Peak I-Material), wurde die EZM mit Trypsin (25 μg/ml, 6 h, 37°C) verdaut, das verdaute Material wurde durch Umkehrdialyse aufkonzentriert und das konzentrierte Material auf eine Sepharose 6B-Gelfiltrationssäule aufgetragen. Das so erhaltene hochmolekulare Material (Kav < 0,2, Peak I) wurde gesammelt. Es wurde gezeigt, dass mehr als 80% des markierten Materials aus Heparansulfat-Proteoglycanen bestand (11, 39).
  • Heparanase-Aktivität: Zellen (1 × 106/35 mm-Platte), Zelllysate oder konditionierte Medien wurden auf der Oberfläche von 35S-markierter EZM in Gegenwart von 20 mM Phophatpuffer (pH 6,2) inkubiert (18 h, 37°C). Zelllysate und konditionierte Medien wurden auch mit Sulfat-markiertem Peak I-Material (10–20 μl) inkubiert. Das Inkubationsmedium wurde gesammelt, zentrifugiert (18.000 × g, 4°C, 3 Min.), und das Sulfat-markierte Material wurde mittels Gelfiltration auf einer Sepharose CL-6B-Säule (0,9 × 30 cm) analysiert. Fraktionen (0,2 ml) wurden mit PBS bei einer Flussrate von 5 ml/h eluiert und die Radioaktivität unter Verwendung von Biofluor-Szintillationsflüssigkeit in einem Zählgerät gemessen. Das Ausschlussvolumen (V0) wurde durch Dextranblau und das Gesamtvolumen (Vt) durch Phenol rot markiert. Es wurde gezeigt, dass letzteres mit freiem Sulfat comigriert (7, 11, 23). Abbauprodukte von HS-Seitenketten eluieren von Sepharose 6B bei 0,5 < Kav < 0,8 (Peak II) (7, 11, 23). Ein fast intaktes, von der EZM durch Trypsin freigesetztes HSPG – und, in einem geringeren Ausmaß, während der Inkubation mit PBS alleine – eluierte direkt nach V0 (Kav < 0,2, Peak I). Die Wiederfindungsraten des markierten Materials, welches auf die Säule aufgetragen worden war, reichten von 85 bis 95% in verschiedenen Experimenten (11). Jedes Experiment wurde mindestens dreimal durchgeführt, und die Streubreite der Elutionspositionen (Kav-Werte) war nicht größer als +/– 15%.
  • Clonierung der hpa-cDNA: cDNA-Clone 257548 und 260138 wurden vom I.M.A.G.E.-Konsortium (2130 Memorial Parkway SW, Huntsville, AL 35801) erhalten. Die cDNAs waren ursprünglich in die EcoRI- und NotI-Clonierungsstellen des Plasmidvektors pT3T7D-Pac cloniert. Obgleich berichtet wurde, dass diese Clone etwas unterschiedlich waren, zeigte eine DNA-Sequenzierung, dass diese miteinander identisch waren. Das MarathonTM RACE (schnelle Amplifikation von cDNA-Enden)-menschliche Placenta (poly-A)-cDNA-Komposit war ein Geschenk von Prof. Yossi Shiloh von der Universität Tel Aviv. Dieses Komposit ist frei von Vektor, da es reverse transkribierte cDNA-Fragmente beinhaltet, an welche an beiden Seiten doppel-, teilweise einzelsträngige Adapter angebracht sind. Die Konstruktion des speziellen verwendeten Komposits ist in der Druckschrift 39a beschrieben.
  • Die Amplifikation des hp3-PCR-Fragments wurde gemäß dem von Clontech Laboratories zur Verfügung gestellten Protokoll durchgeführt. Die für die Amplifikation verwendete Matrize war eine Probe des vorstehenden Komposits. Die für die Amplifikation benutzten Primer waren:
    • Erster Schritt: 5'-Primer: AP1: 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGG C-3', SEQ ID NO: 1; 3'-Primer: HPL229: 5'-GTAGTGATGCCATGTAACTGA ATC-3', SEQ ID NO: 2.
    • Zweiter Schritt: 5'-Primer für die ineinandergeschachtelte PCR: AP2: 5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCG GC-3', SEQ ID NO: 3; 3'-Primer für die ineinandergeschachtelte PCR: HPL171: 5'-GCATCTTAGCCGTCT TTCTTCG-3', SEQ ID NO: 4.
  • HPL229 und HPL171 wurden nach der Sequenz der EST-Clone ausgewählt. Diese beinhalten die Nucleotide 933–956 bzw. 876–897 von SEQ ID NO: 9.
  • Das PCR-Programm war 94°C – 4 Min., gefolgt von 30 Zyklen von 94°C – 40 Sek., 62°C – 1 Min., 72°C – 2,5 Min. Die Amplifikation wurde mit Expand High Fidelity (Boehringer Mannheim) durchgeführt. Das so erhaltene, ca. 900 bp lange hp3-PCR-Produkt wurde mit BfrI und PvuII verdaut. Clon 257548 (phpa1) wurde mit EcoRI verdaut, gefolgt von einem Auffüllen der Enden, und wurde dann weiter mit BfrI verdaut. Sodann wurde das PvuII- BfrI-Fragment des hp3-PCR-Produkts in das glatte Ende – das BfrI-Ende, des Clons phpa1 cloniert, was darin resultierte, dass die gesamte cDNA im Vektor pT3T7-pac cloniert vorlag, welche mit phpa2 bezeichnet wurde.
  • Sequenzierung der DNA: Sequenzbestimmungen wurden mit Vektorspezifischen und Gen-spezifischen Primern unter Verwendung eines automatischen Sequenziergeräts (Applied Biosystems, Modell 373A) durchgeführt. Jedes Nucleotid wurde von mindestens zwei unabhängigen Primern gelesen.
  • Computeranalyse der Sequenzen: Datenbanksuchen nach Sequenzähnlichkeiten wurden mit dem BLAST-Netzwerkdienst durchgeführt. Die Sequenzanalyse und die Ausrichtung der DNA- und Proteinsequenzen wurden mit dem Softwarepaket für DNA-Sequenzanalyse durchgeführt, das von der „Genetic Computer Group" (GCG) an der Universität von Wisconsin entwickelt worden war.
  • RT-PCR: RNA wurde unter Verwendung von TRI-Reagent (Molecular Research Center Inc.) nach den Anleitungen des Herstellers präpariert. 1,25 μg wurden für die Reverse Transkription-Reaktion eingesetzt, für die MuMLV-Reverse Transkriptase (Gibco BRL) und Oligo(dT)15-Primer, SEQ ID NO: 5 (Promega) verwendet wurde. Die Amplifikation des so erhaltenen ersten Strangs der cDNA wurde mit Taq-Polymerase (Promega) durchgeführt. Hierfür wurden die folgenden Primer verwendet:
    • HPU-355: 5'-TTCGATCCCAAGAAGGAATCAAC-3', SEQ ID NO: 6, Nucleotide 372–394 in SEQ ID NO: 9 oder 11.
    • HPL-229: 5'-GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC-3', SEQ ID NO: 7, Nucleotide 933–956 in SEQ ID NO: 9 oder 11.
  • PCR-Programm: 94°C – 4 Min., gefolgt von 30 Zyklen von 94°C – 40 Sek., 62°C – 1 Min., 72°C – 1 Min.
  • Expression rekombinanter Heparanase in Insektenzellen: Zellen, die Insektenzelllinien High FiveTM und Sf21, wurden als Einzelschicht-Kulturen in SF900II-SFM Medium (Gibco BRL) gehalten.
  • Rekombinanter Baculovirus: Ein rekombinantes Virus, welches das hpa-Gen enthielt, wurde unter Verwendung des „Bac to Bac"-Systems (Gibco BRL) konstruiert. Der Transfervektor pFastBac wurde mit SalI und NotI verdaut und mit einem 1,7 kb langen Fragment von phpa2 ligiert, welches mit XhoI und NotI verdaut worden war. Das so erhaltene Plasmid wurde als pFasthpa2 bezeichnet. Ein identisches Plasmid, welches als pFasthpa4 bezeichnet wurde, wurde als ein Duplikat hergestellt, und beide wurden unabhängig voneinander für weitere Experimente eingesetzt. Ein rekombinantes Bacmid wurde nach den Anleitungen des Herstellers mit pFasthpa2, pFasthpa4 und pFastBac hergestellt. Letzteres diente als Negativ-Kontrolle. Rekombinante Bacmid-DNAs wurden in Sf21-Insektenzellen transfiziert. Fünf Tage nach Transfektion wurden die rekombinanten Viren geerntet und dazu verwendet, High FiveTM-Insektenzellen zu infizieren, 3 × 106 Zellen in T-25-Flaschen. Die Zellen wurden 2–3 Tage nach Infektion geerntet. 4 × 106 Zellen wurden zentrifugiert und in einem Reaktionspuffer resuspendiert, der 20 mM Phosphatcitrat-Puffer, 50 mM NaCl enthielt. Die Zellen wurden drei Einfrier-Auftau-Zyklen ausgesetzt, und die Lysate wurden bei –80°C gelagert. Konditionierte Medien wurden bei 4°C gelagert.
  • Teilweise Aufreinigung der rekombinanten Heparanase: Eine teilweise Aufreinigung der rekombinanten Heparanase wurde mit Hilfe einer Heparin-Sepharose-Säulenchromatographie durchgeführt, gefolgt von einer Gelfiltration auf einer Superdex 75-Säule. Kulturmedium (150 ml) von mit pFhpa4-Virus infizierten Sf21-Zellen wurde einer Heparin-Sepharose-Chromatographie unterzogen. Elution von 1 ml -Fraktionen wurde mit einem 0,35–2M NaCl-Gradienten in Gegenwart von 0,1 % CHAPS und 1 mM DTT in 10 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,0 durchgeführt. Eine 25 μl-Probe von jeder Fraktion wurde auf Heparanase-Aktivität getestet. Heparanase-Aktivität eluierte im Bereich von 0,65–1,1 M NaCl (Fraktionen 18–26, 10a). 5 μl von jeder Fraktion wurden einer Elektrophorese auf einem 15%igen SDS-Polyacrylamidgel unterzogen, gefolgt von einer Silbernitrat-Färbung. Aktive Fraktionen, die von Heparin-Sepharose (10a) eluierten, wurden vereinigt und auf einer YM3-Trennmembran aufkonzentriert (× 6). 0,5 ml des aufkonzentrierten Materials wurde auf eine 30 ml große Superdex 75 FPLC-Säule aufgetragen, welche mit 10 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,0 äquilibriert war. Dieser Puffer enthielt 0,8 M NaCl, 1 mM DTT und 0,1% CHAPS. Fraktionen (0,56 ml) wurden bei einer Flussrate von 0,75 ml/Min. gesammelt. Aliquots von jeder Fraktion wurden auf Heparanase-Aktivität getestet und wurden einer Elektrophorese auf einem SDS-Polyacrylamidgel unterzogen, gefolgt von einer Silbernitratfärbung (11b).
  • BEISPIEL 1
  • Clonierung des hpa-Gens
  • Eine aufgereinigte Fraktion von aus menschlichen Hepatomzellen (SK-hep-1) isolierter Heparanase wurde einem Trypsin-Verdau unterzogen und mikrosequenziert. EST (Expressed Sequence Tag)-Datenbanken wurden nach Homologie zu den rücktranslatierten DNA-Sequenzen durchmustert, welche den erhaltenen Peptiden entsprachen. Zwei EST-Sequenzen (Hinterlegungsnummern N41349 und N45367) enthielten eine DNA-Sequenz, die das Peptid YGPDVGQPR (SEQ ID NO: 8) codiert. Diese beiden Sequenzen wurden aus den Clonen 257548 und 260138 (I.M.A.G.E. Konsortium) abgeleitet, welche von einer cDNA-Bank aus 8 bis 9 Wochen alter Placenta gewonnen wurden (Soares). Beide Clone, von denen man fand, dass sie identisch waren, enthielten eine Insertion von 1020 bp, welche einen offenen Leserahmen (ORF) von 973 bp beinhaltete, gefolgt von einer 3'-untranslatierten Region von 27 bp und einem Poly(A)-Schwanz. Es wurde keine Translations-Startstelle (AUG) am 5'-Ende dieser Clone identifiziert.
  • Die Clonierung des fehlenden 5'-Endes wurde mittels PCR-Amplifikation von DNA aus einem MarathonTM RACE cDNA-Komposit aus Placenta durchgeführt. Ein 900 bp langes Fragment (als hp3 bezeichnet) wurde erhalten, welches teilweise mit den identifizierten EST-Clonen überlappte, die das 3'-Ende codierten.
  • Das zusammengesetzte 1721 bp lange cDNA-Fragment (SEQ ID NO: 9) enthielt einen offenen Leserahmen, der, wie in 1 und SEQ ID NO: 11 gezeigt, ein Polypeptid von 543 Aminosäuren (SEQ ID NO: 10) mit einem berechneten Molekulargewicht von 61.192 Dalton codiert. Das in den Clonen 257548 und 260138 enthaltene 3'-Ende der partiellen cDNA-Insertionen begann bei Nucleotid G721 von SEQ ID NO: 9 und 1.
  • Wie weiter in 1 gezeigt, gab es eine einzelne Sequenzabweichung zwischen den EST-Clonen und der PCR-amplifizierten Sequenz, welche zur Substitution einer Aminosäure von Tyr246 in dem EST zu Phe246 in der amplifizierten cDNA führte. Die Nucleotidsequenz des PCR-amplifizierten cDNA-Fragments wurde in zwei unabhängigen Amplifikationsprodukten überprüft. Das neue Gen wurde als hpa bezeichnet.
  • Wie vorstehend angegeben, begann das 3'-Ende der partiellen cDNA-Insertionen, welche in den EST-Clonen 257548 und 260138 enthalten waren, bei Nucleotid 712 von hpa (SEQ ID NO: 9). Die Fähigkeit der hpa-cDNA, stabile Sekundärstrukturen auszubilden, wie z.B. Stamm- und Schleifen-Strukturen, welche die Nucleotidbereiche in der Nähe von Position 712 umfassen, wurde mit Hilfe von Computermodellierungen untersucht. Es zeigte sich, dass wahrscheinlich stabile Stamm- und Schleifen-Strukturen gebildet werden, welche die Nucleotide 698–724 (SEQ ID NO: 9) umfassen. Außerdem zeichnet sich die 5'-Region des hpa-Gens durch einen hohen GC-Gehalt von bis zu 70% aus, verglichen mit nur etwa 40% in der 3'-Region. Diese Befunde erklären vielleicht die unreife Termination und daher das Fehlen der 5'-Enden in den EST-Clonen.
  • Um die Fähigkeit des hpa-Genprodukts zu untersuchen, den Abbau von Heparansulfat in einem in vitro-Assay zu katalysieren, wurde der gesamte offene Leserahmen in Insektenzellen exprimiert, wobei das Baculovirus-Expressionssystem verwendet wurde. Extrakte von Zellen, welche mit dem Virus infiziert wurden, welcher das hpa-Gen enthielt, wiesen einen hohen Spiegel an Heparansulfatabbauender Aktivität auf, wohingegen Zellen, die mit einem ähnlichen Konstrukt infiziert worden waren, welches kein hpa-Gen enthielt, keine derartige Aktivität aufwiesen, noch war dies bei nicht infizierten Zellen der Fall. Diese Ergebnisse werden in den folgenden Beispielen weiter dargestellt.
  • BEISPIEL 2
  • Abbau von löslichen, EZM-abgeleiteten HSPG
  • Einzelschicht-Kulturen von High FiveTM-Zellen wurden (72 h, 28°C) mit rekombinantem Baculovirus, welcher das pFasthpa-Plasmid enthielt, oder mit einem Kontroll-Virus, welches ein Plasmid ohne Insertion enthielt, infiziert. Die Zellen wurden geerntet und in Heparanase-Reaktionspuffer durch drei Einfrier-Auftau-Zyklen lysiert. Die Zelllysate wurden dann mit Sulfat-markierten, aus der EZM abgeleiteten HSPG (Peak I) inkubiert (18 h, 37°C), gefolgt von einer Gelfiltrationsanalyse (Sepharose 6B) des Reaktionsgemisches.
  • Wie in 2 gezeigt ist, enthielt das Substrat alleine fast vollständig Material mit hohem Molekulargewicht (Mr), welches unmittelbar nach V0 (Peak I, Fraktionen 5–20, Kav < 0,35) eluierte. Ein ähnliches Elutionsmuster wurde gefunden, wenn das HSPG-Substrat mit Lysaten von Zellen inkubiert wurde, die mit Kontrollvirus infiziert worden waren. Im Gegensatz dazu führte eine Inkubation des HSPG-Substrats mit Lysaten von Zellen, welche mit dem hpa-enthaltenden Virus infiziert worden waren, zu einer vollständigen Umwandlung des Substrats mit hohem Molekulargewicht in markierte Abbauprodukte mit niedrigem Molekulargewicht (Peak II, Fraktionen 22–35, 0,5 < Kav < 0,75).
  • Es zeigte sich, dass die in Peak II eluierten Fragmente Abbauprodukte von Heparansulfat waren, da sie (i) 5–6 mal kleiner als intakte Heparansulfat-Seitenketten (Kav ungefähr 0,33) waren, die aus der EZM durch Behandlung mit entweder alkalischem Borhydrid oder Papain freigesetzt wurden; und (ii) resistent gegenüber weiterer Verdauung mit Papain oder Chondroitinase ABC und empfindlich gegenüber Deaminierung mit salpetriger Säure (6, 11).
  • Ähnliche Ergebnisse (nicht gezeigt) wurden mit Sf21-Zellen erhalten. Wieder wurde die Heparanase-Aktivität in Zellen nachgewiesen, welche mit dem hpa-enthaltenden Virus (pFhpa) infiziert worden waren, aber nicht in Zellen, die mit dem Kontroll-Virus (pF) infiziert worden waren. Lysate von nicht infizierten High FiveTM-Kontrollzellen bauten das HSPG-Substrat nicht ab.
  • In nachfolgenden Experimenten wurde das HSPG-Substrat mit von infizierten High FiveTM- oder Sf21-Zellen konditioniertem Medium inkubiert.
  • Wie in den 3a–b gezeigt, wurde Heparanase-Aktivität, welche sich durch eine Umwandlung des Peak I-Substrats mit hohem Molekulargewicht in den Peak II mit niedrigem Molekulargewicht (der HS-Abbaufragmente darstellt) zeigt, im Kulturmedium von Zellen gefunden, welche mit den pFhpa2- oder pFhpa4-Viren infiziert worden waren, jedoch nicht in denen, die mit den pF1- oder pF2-Kontrollviren infiziert worden waren. Es wurde keine Heparanase-Aktivität im Kulturmedium von nicht infizierten High FiveTM- oder Sf21-Kontrollzellen nachgewiesen.
  • Das Medium von Zellen, die mit dem pFhpa4-Virus infiziert worden waren, wurde durch eine Membran mit einer Ausschlussgrenze von 50 kDa passiert, um eine grobe Schätzung des Molekulargewichts der rekombinanten Heparanase zu erhalten. Wie in 4 gezeigt, wurde die gesamte enzymatische Aktivität in dem oberen Kompartiment zurückgehalten, und es gab keine Aktivität im Durchfluss (< 50 kDa)-Material. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit dem erwarteten Molekulargewicht des hpa-Genprodukts.
  • Um das hpa-Produkt näher zu charakterisieren, wurde die hemmende Wirkung von Heparin, einem wirksamen Hemmstoff des Heparanase-vermittelten Abbaus von HS (40), untersucht.
  • Wie in den 5a–b gezeigt, wurde die Umwandlung des Peak I-Substrats in die Peak II-Abbaufragmente von HS in Gegenwart von Heparin vollständig aufgehoben.
  • Alles in allem weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass das Heparanase-Enzym von Insektenzellen, welche mit einem Baculovirus infiziert werden, der das neu identifizierte menschliche hpa-Gen enthält, in einer aktiven Form exprimiert wird.
  • BEISPIEL 3
  • Abbau von HSPG in intakter EZM
  • Als nächstes wurde die Fähigkeit intakter infizierter Insektenzellen untersucht, HS in intakter, natürlich hergestellter EZM abzubauen. Zu diesem Zweck wurden High FiveTM- oder Sf21-Zellen auf metabolisch Sulfat-markierter EZM ausgesät, gefolgt von einer Infektion (48 h, 28°C) mit entweder pFhpa4-Viren oder pF2-Kontrollviren. Der pH-Wert des Mediums wurde dann auf pH 6,2–6,4 eingestellt und die Zellen weiter mit der markierten EZM für weitere 48 h bei 28°C oder 24 h bei 37°C inkubiert. Sulfat-markiertes Material, welches in das Inkubationsmedium freigesetzt wurde, wurde durch Gelfiltration auf Sepharose 6B untersucht.
  • Wie in den 6a–b und 7a–b gezeigt ist, führte die Inkubation der EZM mit Zellen, welche mit dem pF2-Kontrollvirus infiziert waren, zu einer gleichmäßigen Freisetzung von markiertem Material, welches fast vollständig (>90%) aus Fragmenten mit hohem Molekulargewicht (Peak I) bestand, welche mit oder unmittel bar nach V0 eluierten. Es war früher gezeigt worden, dass eine proteolytische Aktivität, welche in der EZM selbst vorhanden ist und/oder von den Zellen exprimiert wird, für die Freisetzung des Materials mit hohem Molekulargewicht verantwortlich ist (6). Dieses fast intakte HSPG stellt ein lösliches Substrat für einen nachfolgenden Abbau durch Heparanase zur Verfügung, was auch an der relativ großen Menge von Peak I-Material zu erkennen ist, welches sich anhäuft, wenn das Heparanase-Enzym durch Heparin gehemmt wird (6, 7, 12, 9). Auf der anderen Seite führte die Inkubation der markierten EZM mit Zellen, welche mit dem pFhpa4-Virus infiziert worden waren, zu einer Freisetzung von 60–70% der EZM-assoziierten Radioaktivität in Form von niedermolekularen Sulfat-markierten Fragmenten (Peak II, 0,5 < Kav < 0,75), egal ob die infizierten Zellen mit der EZM bei 28°C oder bei 37°C inkubiert wurden. Intakte, nicht infizierte Sf21- oder High FiveTM-Kontrollzellen bauten die HS-Seitenketten der EZM nicht ab.
  • In nachfolgenden Experimenten wurden, wie in den 8a–b gezeigt ist, High FiveTM- und Sf21-Zellen mit pFhpa4-Viren oder pF1-Kontrollviren infiziert (96 h, 28°C) und das Kulturmedium mit Sulfat-markierter EZM inkubiert. HS-Abbaufragmente mit niedrigem Molekulargewicht wurden aus der EZM nur nach Inkubation mit Medium freigesetzt, welches von pFhpa4-infizierten Zellen konditioniert worden war. Wie in 9 gezeigt ist, wurde die Erzeugung dieser Fragmente in der Gegenwart von Heparin aufgehoben. Es wurde keine Heparanase-Aktivität im Kulturmedium von nicht infizierten Kontrollzellen nachgewiesen. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das Heparanase-Enzym, welches von mit pFhpa4-Virus infizierten Zellen exprimiert wird, in der Lage ist, HS abzubauen, wenn diese mit anderen makromolekularen Bestandteilen (z.B. Fibronectin, Laminin, Kollagen) einer natürlich hergestellten intakten EZM in einem Komplex vorliegen, auf eine ähnliche Weise wie dies für hoch metastatische Tumorzellen oder aktivierte Zellen des Immunsystems berichtet wurde (6, 7).
  • BEISPIEL 4
  • Aufreinigung von rekombinanter Heparanase
  • Die rekombinante Heparanase wurde aus dem Medium von pFhpa4-infizierten Sf21-Zellen durch Heparin-Sepharose-Chromatographie teilweise aufgereinigt (10a), gefolgt von einer Gelfiltration der vereinigten aktiven Fraktionen über eine Superdex 75-FPLC-Säule (11a). Es wurde ein ~ 63 kDa großes Protein beobachtet, dessen Menge, wie über Silber-gefärbte SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt wurde, mit der Heparanase-Aktivität in den entsprechenden Säulenfraktionen korrelierte (10b bzw. 11b). Dieses Protein wurde nicht im Kulturmedium von Zellen nachgewiesen, die mit dem pF1-Kontrollvirus infiziert worden waren und welches einer ähnlichen Auftrennung auf Heparin-Sepharose unterzogen worden war (nicht gezeigt).
  • BEISPIEL 5
  • Expression des hpa-Gens in verschiedenen Zelltypen, Organen und Geweben
  • Es wird nun Bezug auf die 12a–e genommen. Eine RT-PCR wurde durchgeführt, um die Expression des hpa-Gens durch verschiedene Zelltypen und Gewebe zu bestimmen. Zu diesem Zweck wurde Gesamt-RNA revers transkribiert und amplifiziert. Die erwartete 585 bp lange cDNA konnte eindeutig in menschlicher Niere, Placenta (8 und 11 Wochen) und Molengewebe nachgewiesen werden, ebenso wie in frisch isolierten und kurzzeitig (1,5–48 h) in Kultur genommenen menschlichen Cytotrophoblastenzellen der Placenta (12a), von denen allen bekannt ist, dass sie eine hohe Heparanase-Aktivität exprimieren (41). Das hpa-Transkript wurde auch von normalen menschlichen Neutrophilen exprimiert (12b). Im Gegensatz hierzu gab es keine nachweisbare Expression der hpa-mRNA in embryonalem menschlichen Muskelgewebe, Thymus, Herz und Nebenniere (12b). Das hpa-Gen wurde in einigen, aber nicht allen, menschlichen Blasencarcinom-Zelllinien (12c), in SK Hepatom- (SK-hep-1), in ovarialen Carcinom-(OV 1063), in Brustcarcinom- (435, 231), in Melanom- und Megakaryocyten-Zellinien (DAMI, CHRF) des Menschen exprimiert (12d–e).
  • Es wurde festgestellt, dass das vorstehend beschriebene Expressionsmuster des hpa-Transkripts sehr gut mit den Heparanase-Aktivitäts-Spiegeln korrelierte, die in verschiedenen Geweben und Zelltypen bestimmt wurden (nicht gezeigt).
  • BEISPIEL 6
  • Gene mit Homologie zu hpa
  • EST-Datenbanken wurden nach Sequenzen durchmustert, welche homolog zu dem hpa-Gen waren. Es wurden drei Maus-ESTs identifiziert (Hinterlegungsnummer Aa177901 aus muriner Milz, Aa067997 aus muriner Haut, Aa47943 aus Maus-Embryonen), die in ein 824 bp langes cDNA-Fragment zusammengesetzt wurden, welches einen partiellen offenen Leserahmen von 629 bp (dem ein 5'-Ende fehlt) und eine 3'-untranslatierte Region von 195 bp (SEQ ID NO: 12) enthält. Wie in 13 gezeigt ist, weist die codierende Region eine 80%ige Ähnlichkeit mit dem 3'-Ende der hpa-cDNA-Sequenz auf. Dieses ESTs sind wahrscheinlich cDNA-Fragmente des Maus-hpa-Homologs, welches die murine Heparanase codiert.
  • Die Suche nach Konsensus-Proteindomänen offenbarte eine Homologie der aminoterminalen Regionen zwischen der Heparanase und mehreren Vorläufer-Proteinen wie z.B. Prokollagen Alpha 1-Vorläufer, Tyrosin-Proteinkinase-RYK, Fibulin-1, Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-Bindungsprotein und verschiedenen anderen. Die aminoterminale Region ist stark hydrophob und enthält eine mögliche Transmembrandomäne. Die Homologie zu bekannten Signalpeptidsequenzen legt den Schluss nahe, dass diese Region als Signalpeptid für die Lokalisierung des Proteins dienen könnte.
  • BEISPIEL 7
  • Isolierung eines erweiterten 5'-Endes der hpa-cDNA aus der menschlichen SK-hep1-Zelllinie
  • Das 5'-Ende der hpa-cDNA wurde aus der menschlichen SK-hep1-Zelllinie durch PCR-Amplifikation mit Hilfe des MarathonTM RACE (schnelle Amplifikation von cDNA-Enden)-Kits (Clontech) isoliert. Gesamt-RNA wurde aus SK-hep1-Zellen mit Hilfe des TRI-Reagent (Molecular Research Center Inc.) nach den Anleitungen des Herstellers präpariert. PolyA+-RNA wurde mit Hilfe des mRNA-Separator-Kits (Clontech) isoliert.
  • Das MarathonTM RACE SK-hep1-cDNA-Komposit wurde nach den Empfehlungen des Herstellers konstruiert. Die erste Amplifikationsrunde wurde unter Verwendung eines Adaptor-spezifischen Primers AP1: 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3', SEQ ID NO: 1 und eines hpa-spezifischen Antisense-Primers hpl-629: 5'-CCCCAGGAGCAGCAGCATCAG3', SEQ ID NO: 17 (entsprechend den Nucleotiden 119-99 von SEQ ID NO: 9) durchgeführt. Das so erhaltene PCR-Produkt wurde einer zweiten Amplifikationsrunde mit einem Adaptorspezifischen ineinandergeschachtelten Primer AP2: 5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC3', SEQ ID NO: 3, und einem hpa-spezifischen ineinandergeschachtelten Antisense-Primer hpl-666 5'-AGGCTTCGAGCGCAGCAGCAT-3', SEQ ID NO: 18 (entsprechend den Nucleotiden 83-63 von SEQ ID NO: 9) unterzogen. Das PCR-Programm war wie folgt: ein Heißstart von 94°C für 1 Minute, gefolgt von 30 Zyklen von 90°C – 30 Sekunden, 68°C – 4 Minuten. Das so erhaltene 300 bp lange DNA-Fragment wurde aus einem Agarosegel extrahiert und in den Vektor pGEM-T Easy (Promega) cloniert. Das so erhaltene rekombinante Plasmid wurde als pHPSK1 bezeichnet.
  • Die Nucleotidsequenz der pHPSK1-Insertion wurde bestimmt. Man fand, dass diese 62 Nucleotide des 5'-Endes der Placenta-hpa-cDNA (SEQ ID NO: 9) und weitere 178 Nucleotide stromaufwärts (die ersten 178 Nucleotide von SEQ ID NOs: 13 und 15) enthielt.
  • Ein Unterschied von einem einzelnen Nucleotid wurde zwischen der SK-hep1-cDNA und der Placenta-cDNA identifiziert. Der „T"-Abkömmling an Position 9 der Placenta-cDNA (SEQ ID NO: 9) ist durch einen „C"-Abkömmling an der entsprechenden Position 187 der SK-hep1-cDNA (SEQ ID NO: 13) ersetzt.
  • Der Unterschied ist wahrscheinlich auf eine Mutation am 5'-Ende der Placenta-cDNA zurückzuführen, wie durch Sequenzanalyse von mehreren weiteren aus Placenta isolierten cDNA-Clonen bestätigt wurde. Diese enthielten wie die SK-hep1-cDNA ein C an Position 9 der SEQ ID NO: 9.
  • Die 5'-verlängerte Sequenz der SK-hep1-cDNA wurde mit der Sequenz der aus menschlicher Placenta (SEQ ID NO: 9) isolierten hpa-cDNA zusammengesetzt. Die zusammengesetzte Sequenz enthielt einen offenen Leserahmen, der, wie in SEQ ID NOs: 14 und 15 gezeigt ist, ein Polypeptid von 592 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 66.407 Dalton codiert. Der offene Leserahmen wird durch eine 93 bp lange 5'-untranslatierte Region (UTR) flankiert.
  • BEISPIEL 8
  • Isolierung der stromaufwärts gelegenen genomischen Region des hpa-Gens
  • Die stromaufwärts gelegene Region des hpa-Gens wurde mit Hilfe des „Genome Walker"-Kits (Clontech) nach den Empfehlungen des Herstellers isoliert. Das Kit schließt fünf Proben von menschlicher genomischer DNA ein, von denen jede mit einer anderen Restriktionsendonuclease verdaut ist, welche glatte Enden erzeugen: EcoRV, ScaI, OraI, PvuII und SspI.
  • Die glattendigen DNA-Fragmente werden mit partiell einzelsträngigen Adaptern ligiert. Die Proben genomischer DNA werden einer PCR-Amplifikation unter Verwendung des Adapter-spezifischen Primers und eines Gen-spezifischen Primers unterzogen. Die Amplifikation wurde mit Expand High Fidelity (Boehringer Mannheim) durchgeführt.
  • Eine erste Amplifikationsrunde wurde mit dem Primer ap1: 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3', SEQ ID NO: 19 und dem hpa-spezifischen Antisense-Primer hpl-666: 5'-AGGCTTCGAGCGCAGCAGCAT-3', SEQ ID NO: 18, (entsprechend den Nucleotiden 83–63 von SEQ ID NO: 9) durchgeführt. Das PCR-Programm war wie folgt: ein Heißstart von 94°C – 3 Minuten, gefolgt von 36 Zyklen von 94°C – 40 Sekunden, 67°C – 4 Minuten.
  • Die PCR-Produkte der ersten Amplifikation wurden 1:50 verdünnt. Ein μl der verdünnten Probe wurde als Matrize für eine zweite Amplifikation eingesetzt, wobei ein ineinandergeschachtelter, Adapter-spezifischer Primer ap2: 5'-ACTATAGGGCACGCGT GGT-3', SEQ ID NO: 20, und ein hpa-spezifischer Antisense-Primer hpl-690, 5'-CTTGGGCTCACC TGGCTGCTC-3', SEQ ID NO: 21 (entsprechend den Nucleotiden 62–42 von SEQ ID NO: 9) verwendet wurden. Die so erhaltenen Amplifikationsprodukte wurden mit Hilfe der Agarosegelelektrophorese untersucht. Fünf verschiedene PCR-Produkte wurden aus den fünf Amplifikationsreaktionen erhalten. Ein DNA-Fragment von ungefähr 750 bp, welches aus der mit SspI verdauten DNA-Probe erhalten worden war, wurde aus dem Gel extrahiert. Das aufgereinigte Fragment wurde in den Plasmidvektor pGEM-T Easy (Promega) cloniert. Das so erhaltene Plasmid wurde als pGHP6905 bezeichnet und die Nucleotidsequenz der hpa-Insertion wurde bestimmt.
  • Eine Teilsequenz von 594 Nucleotiden ist in SEQ ID NO: 16 gezeigt. Das letzte Nucleotid in SEQ ID NO: 13 entspricht dem Nucleotid 93 in SEQ ID NO: 13. Die DNA-Sequenz in SEQ ID NO: 16 enthält die 5'-Region der hpa-cDNA und 501 Nucleotide der stromaufwärts gelegenen genomischen Region, welche voraussichtlich die Promotor-Region des hpa-Gens enthalten.
  • BEISPIEL 9
  • Expression des 592 Aminosäuren langen HPA-Polypeptids in einer menschlichen 293-Zelllinie
  • Der 592 Aminosäuren lange offene Leserahmen (SEQ ID NOs: 13 und 15) wurde durch Ligierung der dem 5'-Ende der SK-hep1-hpa-cDNA entsprechenden 110 bp mit der Placenta-cDNA konstruiert. Genauer gesagt wurde das MarathonTM RACE-PCR-Amplifikationsprodukt der Placenta-hpa-DNA mit SacI verdaut und ein ungefähr 1 kb großes Fragment in ein mit SacI verdautes pGHP6905-Plasmid ligiert. Das so erhaltene Plasmid wurde mit EarI und AatII verdaut. Die durch EarI erzeugten kohäsiven Enden wurden in glatte Enden überführt und ein ungefähr 280 bp großes EarI/glattendig/AatII-Fragment wurde isoliert. Dieses Fragment wurde mit pFasthpa ligiert, welcher mit EcoRI verdaut, unter Verwendung von Klenow-Fragment mit glatten Enden versehen und weiter mit AatII verdaut worden war. Das so erhaltene Plasmid enthielt eine 1827 bp lange Insertion, welche einen offenen Leserahmen von 1776 bp, 31 bp eines 3'-UTR und 21 bp eines 5'-UTR einschließt. Dieses Plasmid wurde als pFastLhpa bezeichnet.
  • Ein Säuger-Expressionsvektor wurde konstruiert, um die Expression des 592 Aminosäuren langen Heparanase-Polypeptids in menschlichen Zellen zu steuern. Die hpa-cDNA wurde aus pFastLhpa mit BssHII und NotI herausgeschnitten. Das so erhaltene 1850 bp lange BssHII-NotI-Fragment wurde in den Säuger-Expressionsvektor pSI (Promega) cloniert, welcher mit MluI und NotI verdaut worden war. Das so erhaltene rekombinante Plasmid, pSIhpaMet2, wurde in eine menschliche 293- embryonale Nierenzelllinie transfiziert.
  • Die transiente Expression der 592 Aminosäuren langen Heparanase wurde in einer Western Blot-Analyse untersucht und die enzymatische Aktivität wurde in einem Gel-Shift-Assay getestet. Beide Verfahren sind in der am 1. Mai 1998 eingereichten U.S. Patentanmeldung Nr. 09/071,739 ausführlich beschrieben, welche durch Bezugnahme aufgenommen wird, als ob sie hierin in voller Länge dargestellt wäre. Die Zellen wurden drei Tage nach der Transfektion geerntet. Geerntete Zellen wurden in einem Lysepuffer resuspendiert, der 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5, 1 Triton X-100, 1 mM PMSF und einen Proteaseinhibitor-Cocktail (Boehringer Mannheim) enthielt. 40 μg-Proben des Proteinextrakts wurden für die Auftrennung auf einer SDS-PAGE eingesetzt. Die Proteine wurden auf eine PVDF Hybond-P-Membran (Amersham) transferiert. Die Membran wurde, wie in der U.S. Patentanmeldung Nr. 09/071,739 beschrieben, mit einem Affinitäts-gereinigten polyclonalen Anti-Heparanase-Antikörper inkubiert. Es wurde eine stärkere Bande von ungefähr 50 kDa in den transfizierten Zellen beobachtet, ebenso eine schwächere Bande von ungefähr 65 kDa. Ein ähnliches Muster wurde in Extrakten von Zellen beobachtet, die mit dem pShpa transfiziert worden waren, wie in US-Patentanmeldung Nr. 09/071,739 gezeigt. Diese zwei Banden stellen wahrscheinlich zwei Formen des rekombinanten Heparanase-Proteins dar, die von den transfizierten Zellen erzeugt werden. Das 65 kDA große Protein ist wahrscheinlich ein Heparanase-Vorläufer, während es sich bei dem 50 kDa großen Protein, wie hierin nahegelegt, um die prozessierte oder reife Form handeln dürfte.
  • Die katalytische Aktivität des rekombinanten Proteins, welches in den mit pShpaMet2 transfizierten Zellen exprimiert worden war, wurde mit einem Gel-Shift-Assay getestet. Zellextrakte von infizierten und scheininfizierten Zellen wurden über Nacht mit Heparin (6 μg in jeder Reaktion) bei 37°C in Gegenwart von 20 mM Phosphatcitrat-Puffer, pH 5,4, 1 mM CaCl2, 1 mM DTT und 50 mM NaCl inkubiert. Die Reaktionsgemische wurden sodann auf einem 10%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die katalytische Aktivität der rekombinanten Heparanase wurde eindeutig durch die schnellere Migration der Heparinmoleküle nachgewiesen, welche mit dem infizierten Zellextrakt inkubiert worden waren (im Vergleich zur Kontrolle). Eine schnellere Migration weist auf das Verschwinden von hochmolekularen Heparin molekülen und die Bildung von niedermolekularen Abbauprodukten hin.
  • BEISPIEL 10
  • Chromosomale Lokalisierung des hpa-Gens
  • Eine chromosomale Kartierung des hpa-Gens wurde durchgeführt, indem eine Reihe von monochromosomalen Mensch/CHO- und Mensch/Maus- somatischen Zellhybriden eingesetzt wurde, welche vom UK HGMP Resource Center (Cambridge, England) erhalten wurden.
  • 40 ng von jeder DNA-Probe der somatischen Zellhybride wurden einer PCR-Amplifikation unter Verwendung der hpa-Primer: hpu565 5'-AGCTCTGTAGATGTG CTATACAC-3', SEQ ID NO: 22 (entsprechend den Nucleotiden 564–586 von SEQ ID NO: 9) und einem Antisense-Primer hp1171 5'-GCATCTTAGCCGTCTTT CTTCG-3', SEQ ID NO: 23 (entsprechend den Nucleotiden 897–876 von SEQ ID NO: 9) unterzogen.
  • Das PCR-Programm war wie folgt: ein Heißstart bei 94°C – 3 Minuten, gefolgt von 7 Zyklen von 94°C – 45 Sekunden, 66°C – 1 Minute, 68°C – 5 Minuten, gefolgt von 30 Zyklen von 94°C – 45 Sekunden, 62°C – 1 Minute, 68° – 5 Minuten und eine 10-minütige finale Verlängerung bei 72°C.
  • Die Reaktionen wurden mit Expand long PCR (Boehringer Mannheim) durchgeführt. Die so erhaltenen Amplifikationsprodukte wurden mittels Agarosegelelektrophorese untersucht. Wie in 14 gezeigt ist, wurde eine einzelne Bande von ungefähr 2,8 kb vom Chromosom 4 sowie von der als Kontrolle eingesetzten menschlichen genomischen DNA erhalten. Ein 2,8 kb großes Amplifikationsprodukt ist auf Grund der Amplifikation des genomischen hpa-Clons zu erwarten (Daten nicht gezeigt). Weder von den Kontroll-DNA-Proben aus Hamster und Maus noch von den somatischen Hybriden der anderen menschlichen Chromosomen wurden Amplifikationsprodukte erhalten.
  • LISTE DER HIERIN VORSTEHEND ZITIERTEN DOKUMENTE NACH NUMMERN
    • 1. Wight, T.N., Kinsella, M.G., and Qwarnstromn, E.E. (1992). The role of proteoglycans in cell adhesion, migration and proliferation. Curr. Opin. Cell Biol., 4, 793–801.
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    • 4. Kjellen, L., and Lindahl, U. (1991). Proteoglycans: structures and interactions. Annu. Rev. Biochem., 60, 443–475.
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    • 6. Vlodavsky, I., Eldor, A., Haimovitz-Friedman, A., Matzner, Y., Ishai-Michaeli, R., Levi, E., Bashkin, P., Lider, O., Naparstek, Y., Cohen, I.R., and Fuks, Z. (1992). Expression of heparanase by platelets and circulating cells of the immune system: Possible involvement in diapedesis and extravasation. Invasion & Metastasis, 12, 112–127.
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Claims (15)

  1. Isoliertes Polynucleotidfragment, umfassend eine Polynucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, das Heparanase-katalytische Aktivität besitzt, wobei das Polypeptid mindestens 70% Homologie mit SEQ ID NR:10 oder 14 oder einem funktionalen Fragment davon mit Heparanase-katalytischer Aktivität aufweist.
  2. Polynucleotidfragment nach Anspruch 1, wobei die Polynucleotidsequenz Nucleotide 63–1691 von SEQ ID NR:9 oder Nucleotide 139–1869 von SEQ ID NR:13 umfasst.
  3. Polynucleotidfragment nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Polynucleotidsequenz Nucleotide 63–721 von SEQ ID NR:9 umfasst.
  4. Polynucleotidfragment nach Anspruch 1, wobei das Polynucleotid wie in SEQ ID NR:9 oder 13 dargestellt ist.
  5. Polynucleotidfragment nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid eine wie in SEQ ID NR:10 oder 14 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst.
  6. Polynucleotidfragment, umfassend eine Polynucleotidsequenz mit mindestens 70% Homologie mit SEQ ID NR:9 oder 13, wobei die Polynucleotidsequenz ein Polypeptid mit Heparanase-katalytischer Aktivität codiert.
  7. Polynucleotidfragment nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Polynucleotidsequenz ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus doppelsträngiger DNA, einzelsträngiger DNA und RNA.
  8. Vektor, umfassend ein Polynucleotidfragment nach einem der vorangegangenen Ansprüche.
  9. Wirtszelle, umfassend ein exogenes Polynucleotidfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
  10. Rekombinantes Protein, welches ein Polypeptid mit 543 Aminosäuren ist, wie dargestellt in SEQ ID NR:10, mit einem berechneten Molekulargewicht von 61.192 Dalton, oder ein funktionelles Fragment davon.
  11. Polypeptid mit 592 Aminosäuren, wie dargestellt in SEQ ID NR:14, mit einem berechneten Molekulargewicht von 66.407 Dalton, oder ein funktionelles Fragment davon.
  12. Arzneimittel, umfassend, als einen aktiven Bestandteil, das isolierte Protein/Polypeptid nach Anspruch 10 oder 11 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
  13. Medizinprodukt, enthaltend, als einen aktiven Bestandteil, ein isoliertes Protein/Polypeptid nach Anspruch 10 oder 11.
  14. Heparanase-Überexpressionssystem, umfassend eine Zelle, welche eine Heparanase überexprimiert, die mindestens 70% Homologie mit SEQ ID NR:10 oder 14 aufweist und durch ein Polynucleotidfragment gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 codiert wird.
  15. Verfahren zur Identifizierung einer Chromosomenregion, die ein Heparanasegen enthält, in einer Chromosomenansammlung, umfassend die Schritte: (a) Hybridisieren der Chromosomenansammlung mit einer markierten Polynucleotidsonde nach einem der Ansprüche 6 oder 7; (b) Waschen der Chromosomenansammlung, wobei ein Überschuss von nicht hybridisierter Sonde entfernt wird; und (c) Suchen nach Signalen, die mit der hybridisierten markierten Sonde assoziiert sind, wobei der Nachweis von Signalen auf eine Chromosomenregion hinweist, die ein Heparanasegen enthält.
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