CZ2000754A3

Patents

Full documents

Title

Abstract

Claims

All

Any

Exact

Not

Add AND condition

These CPCs and their children

These exact CPCs

Add AND condition

Exact

Exact Batch

Similar

Substructure

Substructure (SMARTS)

Full documents

Claims only

Add AND condition

Application Numbers

Publication Numbers

Either

Add AND condition

Polynukleotid kódující polypeptid mající heparanasovou aktivitu a jeho exprese v transformovaných buňkách

Abstract

Polynukleotid (hpa) kódující polypeptid mající heparanasovou aktivitu, vektory obsahující uvedený polynukleotid, transformované buňky exprimujících heparanasu a rekombinantní protein, mající heparanasovou aktivitu.

Landscapes

Enzymes And Modification Thereof

CZ2000754A3

Czechia

Download PDF

Find Prior Art

Similar

Other languages: English
Inventor: Iris Pecker; Israel Vlodavsky; Elena Feinstein

1998

1998-08-31

Application filed by Insight Strategy & Marketing Ltd., Hadasit Medical Research Services & Development Ltd.

1998-08-31

Priority to CZ2000754A

2000-08-16

Publication of CZ2000754A3

Info: Legal events; Similar documents; Priority and Related Applications
External links: Espacenet; Global Dossier; Discuss

Description

Polynukleotid kódující polypeptid mající heparanasovou aktivitu a jeho exprese v transformovaných buňkách

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká polynukleotidů, který je zde dále označen jako hpa, kódujícího polypeptid mající heparanasovou aktivitu, vektorů obsahujících uvedený polynukleotid a transformovaných buněk exprimujících heparanasu. Vynález se dále týká rekombinantního proteinu majícího heparanasovou aktivitu.

Dosavadní stav techniky

Heparan-sulfátové proteoglykany: heparan-sulfátové proteoglykany (HSPG) jsou všudypřítomné makromolekuly asociované s povrchem buněk a extracelulární hmotou (ECM) mnoha typů buněk ve tkáních obratlovců i bezobratlých (1-4). Základní struktura HSPG je tvořena proteinovou kostrou, na kterou je kovalentně navázáno několik lineárních heparan-sulfátových řetězců. Tyto polysacharidové řetězce jsou obvykle složeny z opakujících se hexuronových a D-glukosaminových disacharidových jednotek, které jsou substituované v různém rozsahu N- a O-vázanými sulfátovými skupinami a N-vázanými acetylovými skupinami (1-4). Studie úlohy ECM molekul v buněčné vazbě, růstu a diferenciaci odhalily centrální úlohu HSPG v embryonální morfogenesi, angiogenesi, růstu neuritů a reparaci tkáně (1-5). HSPG jsou významnou složkou krevních cév (3). Ve velkých cévách jsou koncentrovány hlavně v lamina intima a vnitřní části lamina media, zatímco v kapilárách se nacházejí zejména v subendotelové bazální mefnbráně, kde podporují proiiferaci a migraci endotelových buhěk a étabilizújí struktury kapilární stěny. Schopnost iíSPG iriterá^ovat fe feCM makromolekulaníi jako je kolárek, laminin á hibfebněktiň, a s různými Vázebňými míéty ná jblafettíÁtlckých

membránách, ukazuje na klíčovou úlohu tohoto proteoglykanu v sestavování a nerozpustnosti složek ECM, stejně jako v buněčné adhesi a pohybu. Štěpení heparan-sulfatových (HS) řetězců může proto vést k degradaci subendotelové ECM a tak může mít rozhodující význam při extravasaci krevních buněk. Katabolismus HS je pozorován při zánětech, hojení ran, diabetů a metastasách zhoubných nádorů, což naznačuje, že enzymy degradující HS mají významnou úlohu v patologických procesech. Heparanasová aktivita byla popsána v aktivovaných buňkách imunitního systému a v nádorových buňkách s vysokým metastatickým potenciálem (6-8), ale výzkumy byly handikapovány chyběním biologického nástroje pro výzkum potenciální příčinné úlohy heparanasy u těchto patologických stavů.

Úloha heparanasy při invazi a metastasování nádorových buněk:

Cirkulující nádorové buňky v kapilárách různých orgánů musí provést invazi do endotelových buněk ohraničujících kapiláru a musí degradovat bazální membránu (BM) kapilár, aby se mohly šířit do extravaskulárních tkání,kde způsobí vznik metastas (9,10). Metastazující nádorové buňky se často uchytí v místě nebo poblíž místa mezibuněčného spoje mezi dvěma sousedními endotelovými buňkami. Po takové vazbě metastatických buněk následuje ruptura spoje, retrakce hranic endotelových buněk a migrace mezerou v endotelu směrem k bazální membráně (BM) (9). Po přesunu mezi endotelové buňky a BM musí metastatické buňky degradovat subendotelové glykoproteiny a proteoglykany BM, aby mohly migrovat z vaskulárního kompartmentu. Několik buněčných enzymů (například kolagenasas IV, aktivátor plasminogenu, kathepsin B, elastasa, atd.) se může účastnit degradace BM (10). Z těchto enzymů je to endo-E-D-glukuronidasa (heparanasa), která štěpí HS ve specifických intrařetězcových místech (6,8,11). Bylo zjištěno, že exprese HS degradující heparanasy koreluje s metastatickým potenciálem myších lymfomových (11), fibrosarkomových a • ··· ·· · · ···· • · · · · · · • · ··· · · · · ·· · melanomových (8) buněk. Kromě toho, elevované hladiny heparanasy byly detekovány v séru zvířat postižených metastazujícími nádory a v séru pacientů s melanomy (8) a v nádorových biopsií od pacientů se zhoubnými nádory (12).

Kontrola buněčné proliferace a progrese nádoru lokálním mikroprostředím, interakce buněk s extracelulární hmotou (ECM) produkovanou kultivovanými korneálními a vaskulárními endotelovými buňkami, byly zkoumány předkladateli vynálezu dříve. Tato kultivovaná ECM přesně napodobuje subendotel in vivo jak morfologicky, tak molekulárním složením. Obsahuje kolagen (zejména typ III a IV, s menším množstvím kolagenu typu I a V), proteoglykany (zejména heparan-sulfátové a dermatan-sulfátové proteoglykany, s menším množstvím chondroitin-sulfátových proteoglykanů), laminin, fibronektin, entactin a elastin (13,14). Schopnost buněk degradovat HS v kultivované ECM byla studována tak, že buňky se nechaly interagovat s metabolicky sulfátem značenou ECM a potom se provedla analýza produktů degradace uvolněných do kultivačního media gelovou filtrací (Sepharose 6B) (11). Zatímco intaktní HSPG jsou eluovány po neúčinném objemu kolony (Kav < 0,2, Mr + 0,5 x 10^s), značené degradované fragmenty vedlejších řetězců HS jsou eluovány blíže V kolony (0,5 < kav < 0,8, Mr = 5-7 χ 10³) (11) .

Inhibiční efekt na heparanasu různých druhů heparinů, které nemají antikoagulační účinek, který může mít potenciální použití v prevenci extravasaci krevních buněk, byl také zkoumán předkladateli vynálezu. Inhibice heparanasy byla nejúčinější při použití heparinů obsahujících 16 nebo více sacharidových jednotek a majících sulfátové skupiny jak v N-, tak O-pozici. Zatímco O-desulfatace ruší inhibiční efekt heparinů na heparanasu,

O-sulfátováný, N-acetylovaný heparin si zachovává značnou inhibiční aktivitu s tou podmínkou, že N-substituovaná molekula • · · · má molekulovou hmotnost přibližně 4000 daltonů nebo více (7) . Léčba pokusných zvířat inhibitory heparanasy (například typy heparinů bez antikoagulační aktivity) značně redukovala (>90%) incidenci plicních metastas indukovaných B16 melanomovými buňkami, buňkami Lewisova karcinomu plic a adenokarcinomovými buňkami prsní žlázy (7,8,16) . Frakce heparinů s vysokou a nízkou afinitou k antitrombinu III vykazovaly srovnatelně vysokou anti-metastatickou aktivitu, což naznačuje, že spíše než antikoagulační aktivita heparinů je pro antimetastatické vlastnosti polysacharidů významná inhibiční aktivita heparinů pro heparanasu.

Aktivita heparanasy v moči pacientů s nádorovým onemocněním: Při pokusu o další hodnocení role heparanasy v progresi nádorů a jejího významu pro nádorová onemocnění u člověka byly vyšetřovány vzorky moči na aktivitu heparanasy (16a). Vysoké hladiny heparanasové aktivity byly zjištěny v moči pacientů s agresivním metastatickým onemocněním a žádná detekovatelné aktivita nebyla zjištěna v moči od zdravých jedinců.

Aktivita heparanasy byla také zjištěna v moči 20% pacientů s diabetes mellitus závislým na inzulínu (NDDM) s nebo bez mikroalbuminurie, pravděpodobně z důvodu diabetické nefropatie, která je nej častějším onemocněním způsobujícím selhání ledvin u dospělých.

Možná účast heparanasy v nádorové angiogenesi: Fibroblastové růstové faktory jsou rodinou strukturálně příbuzných polypeptidů, které jsou charakterizovány vysokou afinitou k heparinů (17).

Jsou značně mitogenní pro vaskulárníendotelové buňky a patří mezi nejúčinější induktory neovaskularizace (17,18). Bazický fibroblastový růstový faktor (bFGF) byl extrahován ze subendotelové ECM produkované in vitro (19) a z bazálních membrán rohovky (20), což naznačuje, že ECM může sloužit jako zásobník pro bFGF. Imunohistochemické barvení ukázalo lokalizaci bFGF v bazálních membránách různých tkání a krevních cév (21). I přes všudypřítomnost bFGF v normálních tkáních je proliferace endotelových buněk v těchto tkáních obvykle velmi nízká, což naznačuje na to, že bFGF je nějakým způsobem sekvestrován z místa působení. Studie interakce bFGF s ECM ukázaly, že bFGF se váže na HSPG v ECM a může být uvolněn v aktivní formě působením enzymů degradujících HS (15,20,22). Bylo prokázáno, že heparanasová aktivita exprimovaná v trombocytech, žírných buňkách a lymfomových buňkách má roli v uvolňování aktivního bFGF z ECM a bazálních membrán (23), což naznačuje, že heparanasa může ovlivňovat nejen buněčnou migraci a invazi, ale může také vyvolávat nepřímou neovaskularizaci. Tyto výsledky naznačují, že ECM HSPG je přirozeným zásobníkem pro bFGF a pravděpodobně jiné faktory podporující růst, které se vážou na heparin (24,25). Uvolnění bFGF ze zásobníku v bazálních membránách a ECM může být proto novým mechanismem pro indukci neovaskularizace v normálních a patologických situacích.

Nedávné studie naznačily, že heparin a HS se účastní vazby bFGF na vysoce afinitní receptory buněčného povrchu a buněčné signalizace bFGF (26,27). Dále, velikost HS nutných pro optimání účinek byla stejná, jako velikost HS fragmentů uvolňovaných heparanasou (28). Podobné výsledky byly získány pro vaskulární endotelový růstový faktor (VEGF) (29), což ukazuje na přítomnost duálního receptorového mechanismu, který je ovlivňován HS při interakci s růstovými faktory vážícími se na heparin. Proto se předpokládá, že restrikce endotelových růstových faktorů v ECM zabrání jejich systémovému účinku na vaskulární endotel, což způsobí udržení velmi nízkého stupně obměny endotelových buněk a růstu cév. Na druhou stranu, uvolnění bFGF ze zásobníku v ECM v komplexu s HS fragmentem může vyvolat lokalizovanou proliferaci • ·

endotelových buněk a neovaskularizaci při takových stavech, jako je hojení ran, zánět a růst nádorů (24, 25).

Exprese heparanasy buňkami imunitního systému: Aktivita heparanasy koreluje se schopností aktivovaných buněk imunitního systému migrovat z cirkulace a vyvolávat jak zánětlivé, tak autoimunitní reakce. Interakce trombocytů, granulocytů, T a B lymfocytů, makrofágů a žírných buněk se subendotelovou ECM je spojena s degradací HS specifickou heparanasovou aktivitou (6). Enzym je uvolňován z intracelulární kompartmentů (například lysosomů, specifických granulí atd.) v reakci na různé aktivační podněty (například na trombin, vápníkové ionofory,imunokomplexy, antigeny, mitogeny atd.), což naznačuje, že tento enzym se účastní v regulaci zánětlivé a buněčné imunity.

Některé objevy týkající se enzymu heparanasy byly uvedeny v odkazu č. 6 a jsou vyjmenovány dále:

Za prvé, proteolytická aktivita (aktivátor plasminogenu) a heparanasa působí synergně v postupné degradaci ECM HSPG leukocyty v zánětu a maligními buňkami.

Za druhé, velká část trombocytární heparanasy existuje v latentní formě, pravděpodobně ve formě komplexu s chondroitin-sulfatem. Latentní enzym je aktivován faktory nádorových buněk a může potom usnadnit invazi nádorových buněk přes cévní endotel při procesu metastasování nádoru.

Za třetí, uvolňování trombocytární heparanasy z α-granulí je indukováno silným stimulačním podnětem (t.j. trombinem) , ale ne aktivací trombocytů na ECM.

Za čtvrté, heparanasa v neutrofilech je přednostně a lépe uvolňována v reakci na prahovou aktivaci a při inkubaci buněk na ECM.

Za páté, kontakt neutrofilů s ECM inhibuje uvolňování škodlivých enzymů (proteas, lysozymu) a kyslíkových radikálů, ale nikoliv enzymů (heparanasy, gelatinasy), které mohou umožnit diapedesu. Tato protektivní role subendotelové ECM byla pozorována tehdy, když byly buňky stimulovány solubilními faktory, ale nikoli fagocytovatelnými stimuly.

Za šesté, intracelulární heparanasa je secernována během minut po expozici T buněk specifickým antigenům.

Za sedmé, mitogeny (con A, LPS) indukují syntézu a sekreci heparanasy normálními T a B lymfocyty kultivovanými in vitro. T-lymfocytární heparanasa je také indukována imunizací antigenem in vivo.

Za osmé, heparanasa je exprimována buňkami pre-B lymfomů a B-lymfomů, ale ne buňkami plasmacytomů a klidovými normálními B-lymfocyty.

Za deváté, heparanasa je exprimována aktivovanými makrofágy během inkubace s ECM, ale je pozorováno malé nebo žádné uvolňování enzymu do kultivačního media. Podobné výsledky byly získány s buňkami lidské myeloidní leukemie, které byly indukovány k diferenciaci na zralé makrofágy.

Za desáté, T-buněčná oddálená přecitlivělost a pokusné autoimunitní reakce jsou suprimovány nízkými dávkami heparinů bez antikoagulační aktivity inhibujícího heparanasu (30).

Za jedenácté, heparanasa exprimovaná trombocyty, neutrofily a « · · metastasujícími nádorovými buňkami uvolňuje aktivní bFGF z ECM a bazálních membrán. Uvolnění bFGF ze zásobníku v ECM může vyvolat lokalizovanou neovaskularizační reakci při procesech jako je hojení ran, zánět a růst nádorů.

Za dvanácté, jedním z degradačních produktů ECM při působení heparanasy je tri-sulfatovaný disacharid, který může inhibovat T-buňkami zprostředkovanou zánětlivou reakci in vivo (31). Tato inhibice je spojena s inhibičním účinkem disacharidu na produkci biologicky aktivního TNFa aktivovanými T buňkami in vitro (31).

Jiné potenciální terapeutické aplikace: Kromě ovlivnění metastasování nádorových buněk, zánětlivých a autoimunitní reakcí může být savčí heparanasa použita pro ovlivnění: biologické dostupnosti růstových faktorů vážících se na heparin (15); buněčné odpovědi na faktory vážící se na heparin (například bFGF, VEGF) a cytokiny (IL-8) (31a, 29); buněčných interakcí s plasmatickými lipoproteiny (32); buněčnou citlivostí na něteré virové a některé bakteriální a protozoární infekce (33,33a,33b); a desintegrace amyloidových plaků (34). Heparanasa může být proto užitečná při stavech jako je hojení ran, angiogenese, restenosa, atherosklerosa, zánět, neurodegenerativní onemocnění a virové infekce. Savčí heparanasa může být použita pro neutralizaci plasmatického heparinu, jako potenciální náhrada protaminu. Anti-heparanasové protilátky mohou být použity pro imunologickou detekci a diagnostiku mikrometastas, autoimunitních lézí a renálního selhání v bioptických vzorcích, vzorcích plasmy a tělesných tekutinách. Dále se předpokládá použití v základním výzkumu.

Identifikace hpa genu kódujícího enzym heparanasu umožní produkci rekombinantního enzymu v heterologních expresních systémech. Dostupnost rekombinantního genu umožní výzkum funkce a • · • « vztahů proteinové struktury a dále umožní vývoj nových inhibitorů.

Virové infekce: Bylo zjištěno, že přítomnost heparan-sulfátu na povrchu buněk je základním požadavkem pro vazbu viru Herpes simplex (33) a Dengue (33a) na buňky a pro následnou infekci buněk. Odstranění heparan-sulfátu buněčného povrchu může proto zabránit infekci virem. Skutečně, léčba buněk bakteriální heparitinasou (degradující heparan-sulfát) nebo heparinasou (degradující heparan) redukuje vazbu dvou příbuzných zvířecích herpes virů na buňky a způsobuje alespoň částečnou resistenci buněk na virovou infekci (33). Existují určité náznaky toho, že heparan-sulfát buněčného povrchu se také účastní infekce HIV (33b).

Neurodegenerativní onemocnění: Heparan-sulfátové proteoglykany byly identifikovány v prion-proteinových amyloidových plácích při Genstmann-Strausslerově syndromu, Creutzfeldt-Jakobově nemoci a při scrapie (34). Heparanasa může degradovat tyto amyloidové plaky, které mají zřejmě také úlohu v patogenesi Alzheimerovi nemoci.

Restenosa a atherosklerosa: Proliferace buněk hladkého svalu arterií (SMC) v reakci na poškození endotelu a akumulace lipoproteinů bohatých na cholesterol jsou základními ději v patogenesi atherosklerosy a restenosy (35). Kromě účasti na proliferací SMC (t.j. nízko afinitních receptorů pro růstové faktory vážící se na heparin) se HS také účastní vazby lipoproteinů, jejich retence a vychytávání (36) . Bylo prokázáno, že HSPG a lipoproteinová lipasa participují v nové katabolické dráze, která umožňuje významnou buněčnou a intersticiální akumulaci lipoproteinů bohatých na cholesterol (32) . Předpokládá se, že tato dráha je vysoce atherogenní tím, že způsobuje akumulaci apoB a apoE bohatých lipoproteinů (t.j. LDL,

VLDL,chylomikron), nezávisle na zpětnovazebně inhibici buněčným obsahem sterolu. Proto se předpokládá, že odstranění SMC HS heparanasou bude inhibovat jak proliferaci SMC, tak akumulaci lipidů a proto že bude bránit progresi restenosy a atherosklerosy.

Proto v oboru existuje potřeba polynukleotidu kódujícího polypeptid s heparanasovou aktivitou, vektorů obsahujících takový polynukleotid, transformovaných buněk exprimujících heparanasu a rekombinantního proteinu majícího heparanasovou aktivitu.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález obsahuje polynukleotid, dále označovaný jako hpa, hpa cDNA nebo hpa gen, kódující polypeptid s heparanasovou aktivitou, vektory obsahující takový polynukleotid, transformované buňky exprimující heparanasu a rekombinantní protein mající heparanasovou aktivitu.

Je zde popsáno klonování lidského hpa genu, který kóduje heparanasu, a exprese rekombinantní heparanasy transformovanými rekombinantními buňkami.

Přečištěný přípravek heparanasy izolované z buněk lidského hepatomu byl zpracován trávením trypsinem a mikrosekvenováním. Zjištěná YGPDVGQPR (SEQ ID NO: 8) byla použita pro skríning EST databazí na homologii s příslušnou zpětně translatovanou DNA sekvencí. Byly identifikovány dvě blízce příbuzné EST sekvence a později bylo zjištěno, že jsou identické. Oba klony obsahovaly insert velikosti 1020 bp, který obsahovat otevřený čtecí rámec o 973 bp, po kterém následoval 27 bp 3'-netranslatovaný region a • · · « · · • · • · · ·· · ···· ··· · · · ···· • · ··· · ··· · · · 11 ·..··..· ·..··..· ·..··..·

Poly-A koncová sekvence. Počáteční místo translace nebylo ident i f ikováno.

Klonování chybějícího 5'-konce bylo provedeno PCR amplifikaci DNA z placentárního Marathon RACE cDNA kompozitu za použití primerů vybraných podle sekvence EST klonů a linkerů kompozitu. Byl identifikován 900 bp PCR fragment, částečně přesahující identifikovanou 3'-kódující část EST klonů. Spojený cDNA fragment (hpa), délky 1721 bp (SEQ ID NO: 9) obsahoval otevřený čtecí rámec kódující polypeptid o 543 aminokyselinách (SEQ ID NO: 10) s vypočítanou molekulovou hmotností 61192 daltonů.

Schopnost produktu hpa genu katalyzovat degradaci heparan-sulfatu v in vitro testu byla hodnocena pomocí exprese celého otevřeného čtecího rámce hpa ve hmyzích buňkách, za použití Baculovirového expresního systému. Extrakty a kondicionované medium buněk infikovaných virem obsahujícím hpa gen vykazovaly vysoké hladiny aktivity degradující heparan-sulfát, jak pro solubilní HSPG získaný z ECM, tak pro intaktní ECM. Degradační aktivita byla inhibována heparinem, který je dalším substrátem pro heparanasu. Buňky infikované podobným konstruktem neobsahujícím hpa gen nevykazovaly takovou aktivitu, stejně jako neinfikované buňky. Aktivita heparanasy exprimované z rozšířeného 5'-klonu k heparinú byla demonstrována •9 9999 ··· ·9 · · · 9 9 ·· · · · · ··· · · 9 • · V · · 9 · 9 · · · 9 v savčím expresním systému.

Charakter exprese hpa RNA v různých tkáních a buněčných liniích byl zkoumán za použití RT-PCR. Bylo zjištěno, že hpa RNA je exprimována pouze ve tkáních buňkách, o kterých bylo dříve známo, že mají heparanasovou aktivitu.

Panel monochromosomálních lidských/CHO a lidských/myších somatických hybridních buněk byl použit pro lokalizaci lidského genu pro heparanasu na lidský chromosom 4. Nově izolovaná heparanasová sekvence byla použita pro lokalizaci chromosomálního regionu nesoucího lidský gen pro heparanasu v chromosomálním nátěru.

Dalším aspektem předkládaného vynálezu je polynukleotidový fragment obsahující polynukleotidovou sekvenci kódující polypeptid mající heparanasovou katalytickou aktivitu.

Ještě dalším aspektem předkládaného vynálezu je polynukleotidový fragment obsahující nukleotidy 63-1691 SEQ ID NO: 9 nebo nukleotidy 139-1869 SEQ ID NO: 13, který kóduje celou lidskou heparanasu.

Ještě dalším aspektem předkládaného vynálezu je polynukleotidový fragment obsahující polynukleotidovou sekvenci, která je schopná hybridizace s hpa cDNA, zejména s nukleosidy 1-721 SEQ ID NO: 9.

Ještě dalším aspektem předkládaného vynálezu je polynukleotidová sekvence kódující polypeptid s heparanasovou aktivitou, která má alespoň 60% homologii, lépe alespoň 70% homologii, ještě lépe alespoň 80% homologii a nejlépe alespoň 90% homologii se SEQ ID NO: 9 nebo SEQ ID NO: 13.

«999

Ještě dalším aspektem předkládaného vynálezu je polynukleotidový fragment obsahující část (fragment) SEQ ID NO: 9 nebo SEQ ID NO: 13. Například mohou takové fragmenty obsahovat nukleotidy 63-721 SEQ ID NO: 9 a/nebo segment SEQ ID NO: 9, který kóduje polypeptid mající heparanasovou katalytickou aktivitu.

V dalším aspektu vynález obsahuje polypeptid kódovaný polynukleotidovým fragmentem, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 10 nebo SEQ ID NO: 14 nebo její funkční část.

Ještě dalším aspektem předkládaného vynálezu je polynukleotidová sekvence kódující polypeptid s heparanasovou aktivitou, který má alespoň 60% homologii, lépe alespoň 70% homologii, ještě lépe alespoň 80% homologii a nejlépe alespoň 90% homologii se SEQ ID NO: 10 nebo SEQ ID NO: 14.

Ještě dalším aspektem předkládaného vynálezu je polynukleotidová sekvence kódující polypeptid s heparanasovou aktivitou, který může být alelickou, druhovou a/nebo indukovanou variantou aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 10 nebo SEQ ID NO: 14. Je třeba si uvědomit, že jakákoliv taková varianta může být považována za homolog.

Ještě dalším aspektem předkládaného vynálezu je jednořetězcový polynukleotidový fragment, který obsahuje polynukleotidovou sekvenci komplementární k alespoň části polynukleotidového řetězce kódujícího polypeptid s heparanasovou katalytickou aktivitou, jak byl popsán výše.

Ještě dalším aspektem předkládaného vynálezu je vektor obsahující polynukleotidovou sekvenci kódující polypeptid s heparanasovou katalytickou aktivitou.

··** »4 ··*· • * · 4 · t · ··· 4· 4 ««44 • « 44· 4 · · · · · 4 • »4 · 4 · · · · 44 ·

4» ·· 4« · · · · 4*

Vektor může být jakéhokoliv vhodného typu, včetně například fágu, viru, plasmidu, fagemidu, kosmidu, bakmidu i arteficiálního chromosomu. Polynukleotidová sekvence kódující polypeptid s heparanasovou katalytickou aktivitou může obsahovat jakýkoliv z výše popsaných polynukleotidových fragmentů.

Ještě dalším aspektem předkládaného vynálezu je hostitelská buňka obsahující exogenní polynukleotidový fragment obsahující polynukleotidovou sekvenci kódující polypeptid s heparanasovou katalytickou aktivitou.

Ještě dalším aspektem předkládaného vynálezu je rekombinantní protein obsahující polypeptid s heparanasovou katalytickou aktivitou.

Ještě dalším aspektem předkládaného vynálezu je farmaceutický prostředek obsahující jako aktivní složku rekombinantní protein heparanasovou katalytickou aktivitou.

Ještě dalším aspektem předkládaného vynálezu je lékařské vybavení obsahující lékařský prostředek, který obsahuje jako aktivní složku rekombinantní protein heparanasovou katalytickou aktivitou.

Ještě dalším aspektem předkládaného vynálezu je systém pro nadměrnou expresi heparanasy, který obsahuje buňky nadměrně exprimující heparanasovou katalytickou aktivitu.

Ještě dalším aspektem předkládaného vynálezu je způsob pro identifikaci chromosomálního regionu nesoucího lidský gen pro heparanasu v chromosomálním nátěru, který obsahuje kroky: (a) hybridizaci chromosomálního nátěru značenou polynukleotidovou sondou kódující heparanasu; (b) promytí chromosomálního nátěru, pro odstranění sondy, která nehybridizovala; a (c) vyhledání signálů souvisejících s uvedenou hybridizovanou značenou polynukleotidovou sondou, kde tyto signály ukážou chromosomální region nesoucí lidský gen pro heparanasu.

Předkládaný vynález může být použit pro vývoj nových léků pro inhibici metastasování nádorových buněk, zánětlivých dějů a autoimunitních dějů. Identifikace hpa genu kódujícího heparanasu umožní produkci rekombinantního enzymu v heterologních expresních systémech.

Popis obrázků na připojených výkresech

Vynález je ilustrován v následujících výkresech:

Obr. 1 ukazuje nukleotidovou sekvenci a odvozenou aminokyselinovou sekvenci hpa cDNA. Rozdíl v jediném nukleotidu v pozici 799 (A vůči T) mezi EST (exprimovaném koncovém regionu sekvence) a PCR amplifikovanou cDNA (reversně transkribovaná RNA) a výsledná aminokyselinová substituce (Tyr za Phe) je uveden nad a pod substituovanou jednotkou, v příslušném pořadí. Cysteinové zbytky a polyadenylační konvenční sekvence jsou podtržené. Hvězdička označuje stop kodon TGA.

Obr. 2 ukazuje degradaci rozpustného sulfátem značeného HSPG substrátu lyzáty High Five buněk infikovaných pFhpa2 virem.

Lyzáty High Five buněk, které byly infikovány pFhpa2 virem (·) nebo kontrolním pF2 virem (a) byly inkubovány (18 h, 37 °C) se ···· ·· ·· ···· ·· · ·

sulfátem značeným solubilním HSPG odvozeným z ECM (pík I) . Inkubační medium bylo potom zpracováno gelovou filtrací na Sepharose 6B. Degradační fragmenty HS s nízkou molekulovou hmotností (pík II) byly produkovány pouze během inkubace s pFhpa2 infikovanými buňkami, ale nebyla prokázána degradace HSPG substrátu (❖) při použití lyzátů pF2 infikovaných buněk.

Obr. 3 ukazuje degradaci rozpustného sulfátem značeného HSPG substrátu kultivačním mediem buněk infikovaných pFhpa2 virem a pFhpa4 virem. Kultivační media High Five buněk, které byly infikovány pFhpa2 virem (3a) nebo pFhpa4 (3b) viry (·) , nebo kontrolními viry (cr) byly inkubovány (18 h, 37 °C) se sulfátem značeným solubilním HSPG odvozeným z ECM (pík I) . Inkubační medium bylo potom zpracováno gelovou filtrací na Sepharose 6B. Degradační fragmenty HS s nízkou molekulovou hmotností (pík II) byly produkovány pouze během inkubace s viry obsahujícími hpa gen. Nebyla prokázána degradace HSPG substrátu při použití kultivačního media buněk infikovaných kontrolními viry.

Obr. 4 ukazuje frakcionaci heparanasové aktivity exprimované buňkami infikovanými pFhpa2 podle velikosti. Kultivační medium High Five buněk infikovaných pFhpa2 bylo aplikováno na membrány s limitem propustnosti 50 kDa. Heparanasová aktivita (konverse substrátu píku I (Φ·) na HS degradační fragmenty (pík II)) byla zjištěna v kompartmentů s vyšší (>50 kDa) (·), ale nikoliv s nižší (<50 kDa) (o) molekulovou hmotností.

Obr. 5a-b ukazují efekt heparinu na heparanasovou aktivitu exprimovanou pFhpa2 a pFhpa4 infikovanými High Five buňkami. Kultivační medium pFhpa2 (5a) a pFhpa4 (5b) bylo inkubováno (18 h, 37 °C) se sulfátem značeným solubilním HSPG odvozeným z ECM (pík I, ), za absence (·) nebo za přítomnosti (Δ) 10 gg/ml heparinu. Produkce degradačních fragmentů HS s nízkou molekulovou

hmotností byla kompletně inhibována za přítomnosti heparinu, účinného inhibitoru heparanasové aktivity (6,7).

Obr. 6a-b ukazují degradaci sulfátem značené intaktní ECM High Five a Sf21 buňkami infikovanými virem. High Five (6a) a Sf21 (6b) buňky byly umístěny na sufatem značenou ECM a byly infikovány (48 h, 28 °C) pFhpa4 (·) nebo kontrolním pFl (□) virem. Kontrolní neinfikované Sf21 buňky byly také umístěny na značenou ECM. pH kultivačního media bylo upraveno na 6,0-6,2 a potom byla provedena 24 hodinová inkubace při 37 °C. Sulfátem značený materiál uvolněný do inkubačního media byl analyzován gelovou filtrací na Sepharose 6B. Degradační fragmenty HS byly produkovány pouze buňkami infikovanými virem obsahujícím hpa.

Obr. 7a-b ukazují degradaci sulfátem značené intaktní ECM buňkami infikovanými virem. High Five (7a) a Sf21 (7b) buňky byly umístěny na sufatem značenou ECM a byly infikovány (48 h, 28 °C) pFhpa4 (·) nebo kontrolním pFl (a) virem. Kontrolní neinfikované Sf21 buňky ( ) byly také umístěny na značenou ECM. pH kultivačního media bylo upraveno na 6,0-6,2 a potom byla provedena 24 hodinová inkubace při 37 °C. Sulfátem značený materiál uvolněný do inkubačního media byl analyzován gelovou filtrací na Sepharose 6B. Degradační fragmenty HS byly produkovány pouze buňkami infikovanými virem obsahujícím hpa.

Obr. 8a-b ukazují degradaci sulfátem značené intaktní ECM kultivačním mediem buněk infikovanými pFhpa4. Kultivační medium High Five (8a) a Sf21 (8b) buněk, které byly infikovány pFhpa4 (·) nebo kontrolním pFl (0) virem bylo inkubováno (48 h, 37 °C, pH 6,0) s intaktní značenou ECM. ECM byla také inkubována s kultivačním mediem kontrolních neinfikovaných Sf21 buněk ( ). Sulfátem značený materiál uvolněný do reakční směsi byl analyzován gelovou filtrací. Heparanasová aktivita byla

detekována pouze v kultivačním mediu buněk infikovaných pFhpa4.

Obr. 9a-b ukazují efekt heparinu na heparanasovou aktivitu v kultivačním mediu buněk infikovaných pFhpa4. Sulfátem značená ECM byla inkubována (24 h, 37 °C, pH 6,0) s kultivačním mediem High Five (9a) a Sf21 (9b) buněk infikovaných pFhpa4 za absence (·) nebo za přítomnosti (V) 10 /xg/ml heparinu. Sulfátem značený materiál uvolněný do inkubačního media byl analyzován gelovou filtrací na Sepharose 6B. Heparanasová aktivita (produkce degradačních fragmentů HS (pík II)) byla zcela inhibována v přítomnosti heparinu.

Obr. lOa-b ukazuje přečištění rekombinantní heparanasy na heparin-Sepharose. Kultivační medium Sf21 buněk infikovaných pFhpa4 virem bylo zpracováno chromatografií na heparin-Sepharose. Eluce frakcí byla provedena 0,35-2 M gradientem NaCl (·$·) . Heparanasová aktivita v eluovaných frakcích je ukázána na obr.

10a (·). Frakce 15-28 byly zpracovány elektroforesou na 15% SDS-polyakrylamidovém gelu, po které následovalo barvení dusičnanem stříbrným. Je ukázána korelace mezi hlavním proteinovým proužkem (Mol. hmot. přibližně 63000) ve frakcích 19-24 a heparanasovou aktivitou.

Obr. lla-b ukazuje přečištění rekombinantní heparanasy na Superdex 75 gelové filtrační koloně. Aktivní frakce eluované z heparin-Sepharosové kolony (obr. 10a) byly shromážděny, koncentrovány a aplikovány na Superdex 75 FPLC kolonu. Frakce byly odebírány a alikvoty každé frakce byly testovány na heparanasovou aktivitu (c, obr. 11a) a byly analyzovány elektroforesou na SDS-polyakrylamidovém gelu, po které následovalo barvení dusičnanem stříbrným (Obr. 11b). Je ukázána korelace mezi hlavním proteinovým proužkem (Mol. hmot. přibližně 63000) ve frakcích 4-7 a heparanasovou aktivitou.

Obr. I2a-e ukazují expresi hpa genu za použití RT-PCR s celkovou RNA z lidských embryonálních tkání (12a), lidských extraembryonálních tkání (12b) , a buněčných linií, různého původu (12c-e). RT-PCR produkty získané za použití hpa specifických primerů (I), primerů pro GADPH provozní gen (II) a produkty kontrolních reakcí bez reversní transkriptasy demonstrují absenc genomové DNA nebo jiné kontaminace v RNA vzorcích (III). M = markér molekulové hmotnosti DNA VI (Boehringer Mannheim). Pro 12a: dráha 1 - neutrofily (dospělý jedinec), dráha 2 - sval, dráha 3 - thymus, dráha 4 - srdce, dráha 5 - nadledvina. Pro 12b dráha 1 - ledviny, dráha 2 - placenta (8. týden), dráha 3 placenta (11. týden), dráhy 4-7 - mola (kompletní mola hydantiformis), dráha 8 - buňky cytotrofoblastu (čerstvě izolované), dráha 9 - buňky cytotrofoblastu (1,5 hodiny in vitro), dráha 10 - buňky cytotrofoblastu (6 hodin in vitro), dráha 11 - buňky cytotrofoblastu (18 hodin in vitro), dráha 12 buňky cytotrofoblastu (48 hodin in vitro). Pro 12 c: dráha 1 JAR buňky močového měchýře, dráha 2 - NCITT buněčná linie testikulárního nádoru, dráha 3 - SW-480 buněčná linie lidského hepatomu, dráha 4 - HTR (cytotrofoblasty transformované SV40), dráha 5 - HPTLP-I buněčná linie hepatocelulárního karcinomu, dráha 6 - EJ-28 buněčná linie karcinomu močového měchýře. Pro 12d: dráha 1 - Sk-hep-1 buněčná linie lidského hepatomu, dráha 2

- DAMI lidská megakaryocytární buněčná linie, dráha 3 - DAMI buněčná linie + PMA, dráha 4 - CHRF buněčná linie + PMA, dráha 5

- CHRF buněčná linie. Pro 12e: dráha 1 - ABAE hovězí aortální endotelové buňky, dráha 2 - 1063 lidská ovariální buněčná linie, dráha 3 - MDA435 buněčná linie lidského karcinomu prsu.

Obr. 13 ukazuje srovnání nukleotidových sekvencí lidského hpa a myšího EST cDNA fragmentu (SEQ ID NO: 12), který má 80% homologii k 3'-konci (od nukleotidu 1066 SEQ ID NO: 9) lidského hpa. Seřazené terminační kodony jsou podtrženy.

• · · · • · · · » · · · · ··

Obr. 14 ukazuje chromosomální lokalizaci hpa genu. PCR produkty DNA z somatických hybridních buněk a genomové DNA křečka, myši a člověka byly separovány na 0,7% agarosovém gelu a potom byla provedena amplifikace za použití hpa specifických primerů. Dráha 1 - lambda DNA trávená BstEII, dráha 2 - kontrola bez DNA, dráhy 3-29 - produkty PCR amplifikace. Dráhy 3-5 lidská, myší a křečci genomová DNA, v příslušném pořadí. Dráhy

6-29 - lidské monochromosomální somatické buněčné hybridy representující chromosomy 1-22 a X a Y, v příslušném pořadí. Dráha 30 - lambda DNA trávená BstEII. Amplifikační produkt velikosti přibližně 2,8 kb je pozorován pouze ve drahách 5 a 9, které representují lidskou genomovou DNA a DNA získanou z hybridních buněk nesoucích lidský chromosom 4, v příslušném pořadí. Tyto výsledky ukazují, že hpa gen je lokalizován na lidském chromosomu 4.

Popis výhodných provedení

Předmětem předkládaného vynálezu je polynukleotid, který je dále označován jako hpa, hpa cDNA nebo hpa gen, kódující polypeptid mající heparanasovou aktivitu, vektory obsahující uvedený polynukleotid, transformované buňky exprimujicí heparanasu a rekombinantní protein mající heparanasovou aktivitu

Před podrobnějším popisem alespoň jednoho provedení předkládaného vynálezu je třeba zdůraznit, že vynález není následujícím popisem a výhodnými provedeními omezen. Vynález zahrnuje také jiná provedení a může být proveden různými způsoby Také je třeba si uvědomit, že zde použitá frazeologie a terminologie je použita za účelem popisu a neměla by být považována za 1imituj ici.

Předkládaný vynález může být použit pro vývoj léků pro léčbu • · · · různých onemocnění, pro vývoj diagnostických testů na tato onemocnění a poskytuje nový nástroj pro základní výzkum, hlavně v oblasti medicíny a biologie.

Přesněji, předkládaný vynález může být použit pro vývoj nových léků pro inhibici metastasování nádorových buněk, zánětlivých dějů a autoimunitních dějů. Identifikace hpa genu kódujícího heparanasu umožní produkci rekombinantního enzymu v heterologních expresních systémech.

Dále, předkládaný vynález může být použit pro modulování biologické dostupnosti růstových faktorů vážících se na heparin, buněčné odpovědi na růstové faktory vážící se na heparin (například bFGF,VEGF) a cytokiny (IL-8) , interakcí buněk s plasmatickými lipoproteiny, citlivosti buněk na virové, protozoární a některé bakteriální infekce a pro desintegraci neurodegenerativních plaků. Rekombinantní heparanasa je proto potenciálním lékem pro hojení ran, angiogenesi, restenosu, atherosklerosu, zánět, neurodegenerativní onemocnění (jako je například Genstmann-Strausslerův syndrom, Creutzfeldt-Jakobova nemoc, scrapie a Alzheimerova němoc) a při některých virových a některých bakteriálních a protozoárních infekcích. Rekombinantní heparanasa může být použita pro neutralizaci plasmatického heparinu, jako potenciální náhrada protaminu.

Jak je zde použit, znamená termín modulování inhibici, zpomalení nebo zvrácení progrese onemocnění, významné zlepšení klinických příznaků onemocnění nebo stavu nebo prevenci vzniku klinických příznaků onemocnění nebo stavu. Termín modulátor proto zahrnuje činidla, která mohou modulovat onemocnění nebo stav. Modulací virových, protozoárních a bakteriálních infekcí se rozumí jakžýkoliv efekt, který ruší, brání nebo redukuje jakokoliv virovou, protozoární nebo bakteriální aktivitu a/nebo stadium životního cyklu viru, bakterie, protozoa, nebo který redukuje nebo brání infekci viru, bakterie nebo protozoa u jedince.

Jak je zde použit, označuje termín rána jakékoliv poškození jakékoliv části těla subjektu, včetně - bez omezení - akutních stavů jako jsou popáleniny, chemické poškození, radiační popáleniny, popáleniny způsobené expozicí ultrafialovému světlu, jako jsou sluneční popáleniny, poranění tělesných tkání, jako je perineum, vzniklé při porodu, včetně poranění způsobených lékařským zákrokem, jako je například episiotomie, traumatická poranění včetně řezných ran, poranění při autohaváriích a jiných nehodách a poranění způsobených kulkami, noži a jinými zbraněmi, a post-chirurgická poranění, a dále chronické stavy, jako jsou proleženiny, otlaky, stavy související s diabetem a špatnou cirkulací a všechny typy akné atd.

Anti-heparanasové protilátky namířené proti rekombinantnímu enzymu, budou užitečné pro imunodetekci a diagnostiku mikrometastas, autoimunitních lézí a renálního selhání v bioptických vzorcích, ve vzorcích plasmy a tělesných kapalin. Takové protilátky mohou také sloužit jako neutralizační činidla pro heparanasovou aktivitu.

V předkládaném vynálezu je popsáno klonování hpa genu kódujícího heparanasu a exprese rekombinantní heparanasy transfektovánými buňkami. Toto je poprvé, co byl klonován savčí gen pro heparanasu.

Přečištěný přípravek heparanasy izolované z buněk lidského hepatomu byl zpracován trávením trypsinem a mikrosekvenováním.

Zjištěná YGPDVGQPR (SEQ ID NO: 8) sekvence byla použita pro vyšetřování EST databází na homologii k příslušné zpětně translatované DNA sekvenci. Byly identifikovány dvě blízce příbuzné EST sekvence a později bylo zjištěno, že jsou identické.

Oba klony obsahovaly insert o 1020 bp, který obsahoval otevřený čtecí rámec o 973 bp, po kterém následoval 27 bp 3¹-netranslatovaný region a Poly-A koncová sekvence. Počáteční místo translace nebylo identifikováno.

Klonování chybějícího 5'-konce bylo provedeno PCR amplifikací DNA z placentárního Marathon RACE cDNA kompozitu za použití příměrů vybraných podle sekvence EST klonů a linkerů kompozitu.

Byl identifikován 900 bp PCR fragment, částečně přesahující identifikovanou 3'-kódující část EST klonů. Spojený cDNA fragment (hpa), délky 1721 bp (SEQ ID NO: 9) obsahoval otevřený čtecí rámec kódující - jak je uvedeno na obr. 1 a SEQ ID NO: 11 - polypeptid o 543 aminokyselinách (SEQ ID NO: 10) s vypočítanou molekulovou hmotností 61192 daltonů.

Byla zjištěna odlišnost v jednom nukleotidu v pozici 799 (A vůči T) mezi EST klony a PCR amplifikovanou cDNA. Tato odlišnost vede k aminokyselinové substituci (Tyr za Phe) (Obr.

1). Dále, publikované EST sekvence obsahovaly neidentifikovaný nukleotid, který byl po DNA sekvenováni obou EST klonů určen jako dva nukleotidy (G a C v pozici 1630 a 1631 SEQ ID NO: 9, v příslušném pořadí).

Schopnost produktu hpa genu katalyzovat degradaci heparan-sulfátu v in vitro testu byla hodnocena pomocí exprese celého otevřeného čtecího rámce hpa ve hmyzích buňkách, za použití Baculovirového expresního systému.

* ·« · β · · · · · « ·

Extrakty a kondicionované medium buněk infikovaných virem obsahujícím hpa gen vykazovaly vysoké hladiny aktivity degradující heparan-sulfát, jak pro solubilní HSPG získaný z ECM, tak pro intaktní ECM. Tato degradační aktivita byla inhibována heparinem, zatímco buňky infikované podobným konstruktem neobsahujícím hpa gen nevykazovaly žádnou takovou aktivitu, stejně jako neinfikované buňky.

Klonování rozšířené 5'-sekvence bylo provedeno z lidské SK-hepl buněčné linie za použití PCR amplifikace pomocí Marathon RACE. 5'-rozšířená sekvence SK-hepl hpa cDNA byla sestavena se sekvencí cDNA izolovanou z lidské placenty (SEQ ID NO: 9) . Sestavená sekvence obsahovala otevřený čtecí rámec, SEQ ID NO: 13 a SEQ ID NO: 15, který kodoval, jak je ukázáno v SEQ ID NO: 14 a 15, polypeptid o 592 aminokyselinách s vypočítanou molekulovou hmotností 66407 daltonů. Bylo prokázáno, že tento otevřený čtecí rámec řídí expresi heparanasy v expresním systému savčích buněk. Exprimované heparanasa byla detekovatelné anti-heparanasovými protilátkami v analýze westernovým přenosem.

Tak předkládaný vynález obsahuje polynukleotidový fragment (DNA nebo RNA, jednořetězcový nebo dvouřetězcový), který obsahuje polynukleotidovou sekvenci kódující polypeptid mající heparanasovou katalytickou aktivitu.

Termín heparanasová katalytická aktivita nebo ekvivalentní termín heparanasová aktivita označuje savčí endoglykosidasovou hydrolyzační aktivitu, která je specifická pro heparanové nebo heparan-sulfatové proteoglykanová substráty, což je v protikladu k aktivitě bakteriálních enzymů (heparinasy I, II a III), které degradují heparin nebo heparan-sulfat prostřednictvím β-eliminace (37) .

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu obsahuje polynukleotidový fragment nukleotidy 63-1691 SEQ ID NO: 9 nebo nukleotidy 139-1869 SEQ ID NO: 13, které kódují celou lidskou heparanasu.

Nicméně, rozsah předkládaného vynálezu není omezen na lidskou heparanasu, protože se jedná o první popis otevřeného čtecího rámce (ORF) kódujícího jakoukoliv savčí heparanasu. Pomocí hpa cDNA, jejích částí nebo syntetických oligonukleosidů navržených podle její sekvence může odborník v oboru identifikovat genomové a/nebo cDNA klony obsahující homologické sekvence z jiných savčích druhů.

Dalším aspektem předkládaného vynálezu je proto polynukleotidový fragment obsahující polynukleotidovou sekvenci, která je schopná hybridizace (párování baží při přísných nebo permisivních podmínkách hybridizace, jak je popsáno například v Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., (1989), Molecular

Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) s hpa cDNA, zejména s nukleosidy 1-721 SEQ ID NO: 9.

• · · · • · · ·

Skutečně, jakákoliv polynukleotidová sekvence kódující polypeptid s heparanasovou aktivitou, která má alespoň 60% homologii, lépe alespoň 70% homologii, ještě lépe alespoň 80% homologii a nejlépe alespoň 90% homologii se SEQ ID NO: 9 nebo

SEQ ID NO: 13, spadá do rozsahu předkládaného vynálezu.

Polynukleotidový fragment podle předkládaného vynálezu může obsahovat jakoukoliv část SEQ ID NO: 9 nebo SEQ ID NO: 13. Například mohou takové fragmenty obsahovat nukleotidy 63-721 SEQ ID NO: 9, které jsou novou sekvencí. Nicméně, fragment může obsahovat jakýkoliv segment SEQ ID NO: 9, který kóduje polypeptid mající heparanasovou katalytickou aktivitu.

Výraz kóduje polypeptid mající heparanasovou katalytickou aktivitu, jak je zde použit, označuje schopnost řízení syntézy polypeptidu, který je, po případných post-translačních modifikacích, jako je například proteolýza (například odstranění signálního peptidu a pro- nebo preproteinové sekvence) , methioninová modifikace, glykosylace, alkylace (například methylace), acetylace, atd., katalyticky aktivní v degradaci, například, ECM a HS spojených s buněčným povrchem.

Ve výhodném provedení vynález obsahuje polypeptid kódovaný polynukleotidovým fragmentem, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 10 nebo SEQ ID NO: 14 nebo její funkční část, t.j. část nesoucí heparanasovou katalytickou aktivitu.

Nicméně, jakýkoliv polynukleotidový fragment kódující polypeptid s heparanasovou aktivitou spadá do rozsahu předkládaného vynálezu. Tak může být polypeptid alelickou, druhovou a/nebo indukovanou variantou aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 10 nebo SEQ ID NO: 14 nebo jakákoliv funkční • · • · · · • · část uvedených sekvencí.

Skutečně, jakákoliv polynukleotidová sekvence kódující polypeptid s heparanasovou aktivitou, který má alespoň 60% homologii, lépe alespoň 70% homologii, ještě lépe alespoň 80% homologii a nejlépe alespoň 90% homologii se SEQ ID NO: 10 nebo SEQ ID NO: 14, spadá do rozsahu předkládaného vynálezu.

Jednořetězcový polynukleotidový fragment může být DNA nebo RNA nebo může obsahovat také nukleotidové analogy (například thio-modifikované nukleotidy), může se jednat o syntetický oligonukleotid nebo oligonukleotid vyrobený transformovanými hostitelskými buňkami, může mít jakoukoliv vybranou délku, které ještě umožňuje specifické párování baží (například 8 nebo 10, lépe více, nukleotidů) a může obsahovat chyby, které neovlivňují nežádoucím způsobem párování baží.

Vektor může být jakéhokoliv vhodného typu. Může jím být fág, který infikuje bakterie, nebo virus, který infikuje eukaryotické buňky. Může jím být také plasmid, fagemid, kosmid, bakmid nebo arteficiální chromosom. Polynukleotidová sekvence kódující polypeptid s heparanasovou katalytickou aktivitou může obsahovat jakýkoliv z výše popsaných polynukleotidových fragmentů.

Ještě dalším aspektem předkládaného vynálezu je hostitelská buňka obsahující exogenní polynukleotidový fragment kódující polypeptid s heparanasovou katalytickou aktivitou.

Exogenním polynukleotidovým fragmentem může být jakýkoliv z výše uvedených fragmentů. Hostitelskou buňkou může být buňka jakéhokoliv typu, včetně prokaryotických buněk, eukaryotických buněk, buněčných linií nebo buněk jako součástí organismu. Exogenní polynukleotidový fragment může být buňce přítomen trvale nebo přechodně. Jinými slovy, transformované buňky získané po stabilní nebo přechodné transfekci, transformaci nebo transdukci, spadají všechny do rozsahu předkládaného vynálezu. Termín exogenní, jak je zde použit, označuje skutečnost, že polynukleotidový fragment je zevně vložen do buňky. Může být přítomen v jedné kopii nebo v jakémkoliv počtu kopií, může být integrován do jednoho nebo více chromosomů v jakékoliv pozici nebo může být přítomen jako extrachromosomální materiál.

Vynález dále poskytuje systém pro nadměrnou expresi heparanasy, který obsahuje buňky nadměrně exprimující heparanasovou katalytickou aktivitu. Buňkou může být hostitelská buňka přechodně nebo stabilně transfektovaná nebo transformovaná jakýmkoliv vhodným vektorem, který obsahuje polynukleotidovou sekvenci kódující polypeptid s heparanasovou aktivitou a vhodné promotorové sekvence a zesilovače transkripce pro řízení nadměrné exprese heparanasy. Nicméně, buňky s nadměrnou expresí mohou být také výsledkem inserce (například pomocí homologické rekombinace) promotoru a/nebo zesilovače transkripce za endogenní heparanasový gen exprimující buňky, což může řídit nadměrnou expresi endogenního genu. Termín nadměrná exprese, jak je zde použit, označuje úroveň exprese, která je vyšší než bazální úroveň expresev dané buňce za jinak identických podmínek.

Rekombinantní protein může být přečištěn jakýmkoliv vhodným postupem pro přečištění proteinů do homogenity a/nebo směsi s aditivy. Rekombinantní protein může být vyroben pomocí jakýchkoliv buněk popsaných výše. Může být v krystalické formě, ve formě dehydratovaného prášku nebo v roztoku. Rekombinantní protein může být užitečný pro získání čisté heparanasy, která může být potom použita pro indukci anti-heparanasových protilátek, buď polyklonálních, nebo monoklonálních, a která může být dále použita při skríningu aktivních inhibitorů heparanasy nebo ve skríningových testech pro léčiva.

Ještě dalším aspektem předkládaného vynálezu je farmaceutický prostředek obsahující jako aktivní složku rekombinantní protein s heparanasovou katalytickou aktivitou.

Mezi prostředky pro lokální podání patří, například, pleťové vody, masti, gely, krémy, čípky, kapky, kapaliny, spreje a prášky. Běžné farmaceutické nosiče, vodné, práškové nebo olejové baze, zahušťovací činidla a podobné, mohou být nutné nebo žádoucí. Také mohou být použity potažené kondomy, stenty, aktivní muly a jiné lékařské prostředky. Předkládaný vynález zahrnuje jakékoliv lékařské vybavení, například prostředky, obsahující jako aktivní složku rekombinantní protein heparanasovou s katalytickou aktivitou.

Mezi prostředky pro orální podání patří prášky nebo granule, suspenze nebo roztoky ve vodném nebo nevodném mediu, oplatky, kapsle nebo tablety. Může být žádoucí obsažení zahušťovacích činidel, ředidel, chuťových korigens, dispergačních činidel, ··»· ·» ·· ··»· ·· ·· • · » ft · · ···· ·»· «·· · v · « emulgačních činidel nebo pojiv v prostředcích.

Mezi prostředky pro parenterální podání patří, například, sterilní vodné roztoky, které mohou také obsahovat pufry, ředidla a jiná vhodná aditiva.

Dávkování závisí na závažnosti a léčitelnosti léčeného stavu, ale obvykle se podává jedna nebo více dávek za den a trvání léčby je od několika dnů do několika měsíců, dokud není dosaženo vyléčení nebo zlepšení onemocnění. Odborníci v oboru snadno určí optimální dávky, dávkování a opakování dávek.

Ještě dalším aspektem předkládaného vynálezu je způsob pro identifikaci chromosomálního regionu nesoucího lidský gen pro heparanasu v chromosomálním nátěru. Uvedený způsob obsahuje následující kroky, kde prvním je hybridizace chromosomálního nátěru (chromosomů v interfázi nebo v metafázi) značenou polynukleotidovou sondou kódující heparanasu. Detekovatelnou značkou je výhodně fluorescentní značka. Druhým krokem je promytí chromosomálního nátěru, při kterém je odstraněno nadbytečné množství sondy, která nehybridizovala. Posledním krokem je vyhledání signálů souvisejících s uvedenou hybridizovanou značenou polynukleotidovou sondou, kde tyto signály ukážou chromosomální region nesoucí lidský gen pro heparanasu. Odborníků v oboru bude jasné použití zde popsaných sekvencí ve vhodných značících reakcích a použití značených sond pro detekci chromosomálního regionu nesoucího lidský gen pro heparanasu, za použití hybridizace in sítu.

Vynález je dále popsán pomocí následujících příkladů, které dokreslují předkládaný vynález a nejsou nijak omezující.

» » · · ·» 4 • · * • · • · · » ·>

• · fr «- ϋ * » · · “ ·

Příklady provedení vynálezu

Následující protokoly a materiály jsou použity v následujících příkladech.

Přečištění a charakterizace heparanasy z buněčné linie lidského hepatomu a lidské placenty: Buněčná linie lidského hepatomu (Sk-hep-1) byla vybrána jako zdroj pro přečištění heparanasy lidských nádorů. Přečištění bylo provedeno v podstatě způsobem popsaným v U.S. patentu č. 5362641 (Fuks), který je zde uveden jako odkaz. Stručně, 500 litrů, 5 x 10¹¹ buněk, bylo kultivováno v suspenzi a heparanasa byla přečištěnna přibližně 240000-krát za použití následujících kroků: (i) kationtové iontoměničové (CM-Sephadex) chromatografie provedené při pH 6,0, s gradientem 0,3-1,4 M NaCI; (ii) kationtové iontoměničové (CM-Sephadex) chromatografie provedené při pH 7,4 za přítomnosti 0,1% CHAPS, s gradientem 0,3-1,1 M NaCI; (iii) heparin-Sepharosové chromatografie provedené při pH 7,4 za přítomnosti 0,1% CHAPS, s gradientem 0,35-1,1 M NaCI; ConA-Sepharosové chromatografie provedené při pH 6,0 za přítomnosti pufru obsahujícího 0,1% CHAPS a 1 M NaCI, s elucí 0,25 M α-methylmannosidem; a (v) HPLC kationtové iontoměničové (Mono-S) chromatografie provedené při pH 7,4 za přítomnosti 0,1% CHAPS, s gradientem 0,25-1,1 M NaCI.

Aktivní frakce byly shromážděny, provedlo se vysrážení TCA a sraženina se zpracovala elektroforesou na SDS polyakrylamidovém gelu a/nebo trávením trypsinem a HPLC s reversní fází. Peptidy vzniklé z přečištěného proteinu po trávení trypsinem byly separovány HPLC s reversní fází (C8 kolona) a homogenní píky byly podrobeny analýze aminokyselinové sekvence.

Přečištěný enzym byl zpracován HPLC s reversní fází a dále

999* «9 *4 9 99 9 ·· ·* • « 9 O · · · ř » 9 • 99 i»· 9 * · 9 » «9 9 9 *·· « * 9 • 4 9 « 4 99 · 9 99 9 bylo provedeno sekvenování N-koncových aminokyselin za použití přístroje pro sekvenování aminokyselin (Applied Biosystems).

Buňky: Kultury hovězích korneálních endotelových buněk (BCECs) byly připraveny z dobytčích očí dříve popsaným způsobem (19, 38) . Zásobní kultury byly kultivovány v DMEM (1 g glukosy na litr) doplněném 10% fetálním telecím sérem a 5% FCS. bFGF (1 ng/ml) byl přidáván každý druhý den během fáze aktivního růstu buněk (13,

14) .

Příprava disků potažených ECM: BCEC (druhá až pátá pasáž) byly umístěny do 4-jamkových ploten v počáteční hustotě 2 χ 10⁵buněk/ml a byly kultivovány v bezsulfatovém Fisherově mediu plus 5% dextran T-40 po dobu 12 dnů. V den 1 a 5 po umístění buněk byl přidán Na2^3SSO4 (25 μCi/ml) a kultury byly inkubovány se sondou bez výměny media. Subendotelová ECM byla obnažena rozpuštěním buněčné vrstvy (5 minut, teplota okolí) PBS obsahujícím 0,5% Triton X-100 a 20 mM NH^OH, a potom čtyřmi proplachy PBS. ECM zůstávala intaktní, bez buněčné drtě, pevně navázaná na celé ploše tkáňového kultivačního disku (19, 22) .

Pro přípravu solubilních sulfátem značených proteoglykanů (materiál píku I) byla ECM značena trypsinem (25 gg/ml, 6 h, 37 °C) , trávený materiál byl koncentrován reversní dialýzou a koncentrovaný materiál byl zpracován na Sepharosa 6B gelové filtrační koloně. Byl odebírán výsledný materiál o vysoké molekulové hmotnosti (Kav < 0,2, pík I). Bylo zjištěno, že více než 80% značeného materiálu se skládá z heparansulfatových proteoglykanů (11, 39) .

Heparanasová aktivita: Buňky (1 x 10⁶/35 mm disk), buněčné lyzáty nebo kondicionované medium byly inkubovány na horní straně ³⁵S-značené ECM (18 h, 37 °C) za přítomnosti fosfátového pufru ···· ·· * · ···· ··· · · · ·»·· (pH 6,2) . Buněčné lyzáty a kondicionované medium byly také inkubovány se sulfátem značeným materiálem z píku I (10-20 μΐ). Inkubační medium bylo odebráno, bylo centrifugováno (18000 x g, 4 °C, 3 min.) a sulfátem značený materiál byl analyzován gelovou filtrací na Sepharose CL- b koloně (0,9 x 30 cm). Frakce (0,2 ml) byly eluovány PBS při průtoku 5 ml/hod a byla stanovena radioaktivita frakcí za použití Bio-fluor scintilační kapaliny. Vyjmutý objem (V ) byl značen modrým dextranem a celkový objem (V_t) byl značen fenolovou červení. Poslední uvedený migruje současně s volným sulfátem (7, 11, 23). Degradační fragmenty vedlejších řetězců HS byly eluovány ze Sepharose 6B kolony při 0,5 < Kav < 0,8 (pík II) (7, 11, 23). Téměř intaktní HSPG uvolněný z ECM trypsinem (a v menší míře také během inkubace se samotným PBS) byl eluován po V_q (Kav < 0,2, pík I). Zpětný zisk značeného materiálu zpracovaného na kolonách byl v různých pokusech v rozmezí od 85 do 95% (11).Každý pokus byl proveden alespoň třikrát a variace eluční pozice (Kav hodnoty) nepřesahovaly + 15%.

Klonování hpa cDNA: cDNA klony 257548 a 260138 byly získány od I.M.A.G.E. Consortium (2130 Memoriál Parkway SW, Hunstville, AL 35801). cDNA byla původně klonována v EcoRI a Notl klonovacích místech v plasmidovém vektoru pT3T7D-Pac. Ačkoliv bylo uvedeno, že tyto klony jsou mírně odličné, DNA sekvenování prokázalo, že tyto klony jsou identické. Marathon RACE (rychlá amplifikace cDNA konců) lidský placentární (poly-A) cDNA kompozit byl získán od prof. Yossi Shiloh z Tel Aviv University. Tento kompozit je bezvektorový, protože obsahuje reversně transkribovatelné cDNA fragmenty na které jsou na obou koncích navázány dvojité, částečně jednořetězcové adaptery. Konstrukce použitého kompozitu je popsána v odkazu 39a.

Amplifikace hp3 PCR fragmentu byla provedena podle protokolu • « k · · • · • · « · získaného od Clontech laboratoří. Templatem použitým pro amplifikaci byl vzorek z výše uvedeného kompozitu. Primery použité pro amplifikaci byly:

První krok: 5'-primer: API: 5 '-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3 ' , SEQ ID NO: 1; 3'-primer: HPL229: 5'-GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC-3', SEQ ID NO: 2.

Druhý krok: vnořený 5'-primer: AP2:

5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3', SEQ ID NO: 3, vnořený 3'-primer: HPL171: 5'-GCATCTTAGCCGTCTTTCTTCG-3', SEQ ID NO: 4. HPL229 a HPL171 byly vybrány podle sekvence EST klonů. Obsahují nukleotidy 933-956 a 876-897 SEQ ID NO: 9, v příslušném pořadí.

PCR program byl 94 °C - 4 min., potom 30 cyklů při 94 °C - 40 s, 62 °C - 1 min., 72 °C - 2,5 min. Amplifikace byla provedena s Expand High Fidelity (Boehringer Mannheim). Výsledný hp3 PCR produkt o přibližně 900 bp byl tráven Bfrl a PvuII. Klon 257548 (phpal) byl tráven EcoRI, potom bylo provedeno doplnění konců a klon byl dále tráven Bfrl. Potom byl PvuII-Bfrl fragment hp3 PCR produktu klonován do lepivého konce - Bfrl konce klonu phpal, což vedlo ke klonování celé cDNA v pT3T7-pac vetoru, který byl označen phpa2.

DNA sekvenování: Stanovení sekvence bylo provedeno za použití vektorově specifických a genově specifických primerů, pomocí automatizovaného DNA sekvenátoru (Applied Biosystems, model 373A). Každý nukleotid byl čten z alespoň dvou nezávislých primerů.

Počítačové analýzy sekvence: Prohledávání databází na podobnosti sekvence bylo provedeno za použití Blast sítě. Analýza sekvence a přiřazení DNA a proteinových sekvencí bylo provedeno • · • · za použití softwarového balíčku pro analýzu DNA sekvence, který byl vyvinut Genetic Computer Group (GCG) na University of Wisconsin.

RT-PCR: RNA byla připravena za použití Tri-Reagent (Molecular Search Center lne.) podle návodu výrobce. 1,25 ^g bylo odebráno pro reversní transkripci za použití MuMLV reversní transkriptasy (Gibco BRL) a 01igo(dT)__Ls primeru, SEQ ID NO: 5 (Promega) . Amplifikace výsledného prvního řetězce cDNA byla provedena za použití Taq polymerasy (Promega). Byly použity následující primery:

HPU355: 5'-TTCGATCCCAAGAAGGAATCAAC-3', SEQ ID NO: 6, nukleotidy 372-394 SEQ ID NO: 9 nebo 11;

HPL229: 5'-GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC-3', SEQ ID NO: 7, nukleotidy 933-956 SEQ ID NO: 9 nebo 11.

PCR program: 94 °C - 4 min, potom 30 cyklů při 94 °C - 40 s, 62 °C - 1 min., 72 °C - 1 min.

Exprese rekombinantní heparanasy ve hmyzích buňkách: Buňky,

High Five a Sf2l hmyzí buněčné linie byly kultivovány jako jednovrstvé kultury v SF900II-SFM mediu (Gibco BRL).

Rekombinantní bakulovirus: Rekombinantní virus obsahující hpa gen byl konstruován za použití Bac to Bac systému (Gibco BRL). Přenosový vektor pFastBac byl tráven Sáli a Notl a byl ligován s 1,7 kb fragmentem phpa2 tráveným Xhol a Notl. Výsledný plasmid byl označen pFasthpa2. Identický plasmid označený pFasthpa4 byl připraven jako duplikát a oba byly nezávisle použity pro další pokusy. Rekombinantní bakmid byl připraven podle návodu výrobců s pFasthpa2, pFasthpa4 a s pFastBac. pFastBac byl použit jako negativní kontrola. Rekombinantní bakmidové DNA byly transfektovány do Sf21 hmyzích buněk. Pět dnů po transfekci byly získávány rekombinantní viry a tyto viry byly použity pro infekci

High Five hmyzích buněk, 3 χ 10⁶ buněk v T-25 zkumavkách. Buňky byly sklízeny 2-3 dny po infikování. 4 x 10⁶buněk bylo centrifugováno a resuspendováno v reakčním pufru obsahujícím 20 mM fosfatového-citratového pufru, 50 mM NaCl. Buňky byly třikrát zmrazený a rozmraženy a lyzáty byly uskladněny při -80 °C. Kondicionované medium bylo skladováno při teplotě 4 °C.

Částečné přečištění rekombinantní heparanasy: Částečné přečištění rekombinantní heparanasy bylo provedeno chromatografií na heparin-Sepharosové koloně, po které následovala gelová filtrace na Superdex 75 koloně. Kultivační medium (150 ml) Sf2l buněk infikovaných pFhpa4 virem bylo zpracováno chromatografií na heparin-Sepharosové koloně. Eluce 1 ml frakcí byla provedena za použití 0,35-2 M gradientu nAcl za přítomnosti 0,1% CHAPS a 1 mM DTT v pufru 10 mM octanu sodného, pH 5,0. 25 μΐ vzorek z každé frakce byl testován na heparanasovou aktivitu. Heparanasová aktivita byla eluována v rozmezí 0,65-1,1 M NaCl (frakce 18-26, obr. 10a) . 5 μΐ každé frakce bylo zpracováno elektroforesou na 15% SDS-polyakrylamidovém gelu, po které následovalo barvení dusičnanem stříbrným. Aktivní frakce eluované z heparin-Sepharosové kolony (Obr. 10a) byly shromážděny a byly koncentrovány (x 6) na YM3 membráně. 0,5 ml koncentrovaného materiálu bylo zpracováno na 30 ml Superdex 75 FPLC koloně uvedené do rovnováhy 10 mM octanem sodným, pH 5,0, obsahujícím 0,8 M NaCl, 1 mM DTT a 0,1% CHAPS. Frakce (0,56 ml) byly odebírány při průtoku 0,75 ml/min. Alikvoty každé frakce byly testovány na heparanasovou aktivitu a byly zpracovány elektroforesou na SDS-polyakrylamidovém gelu, po které následovalo barvení dusičnanem stříbrným (obr. 11b) .

• · • · · · • ·

Příklad 1: Klonování hpa genu

Přečištěné frakce heparanasy izolované z buněk lidského hepatomu (SK-hep-1) byly tráveny trypsinem a mikrosekvenovány.

EST (Expressed Sequence Tag) database byly prohledávány na homologii se zpětně translatovánými DNA sekvencemi odpovídajícími získaným peptidům. Dvě EST sekvence (přírůstkové č. N41349 a N45367) obsahovaly DNA sekvence kódující peptid YGPDVGQPR (SEQ ID NO: 8). Tyto dvě sekvence byly získány z klonů 257548 a 260138 (I.M.A.G.E Consortium) připravených z cDNA knihovny 8-9 týdenní placenty (Soares). Oba klony, o který bylo zjištěno, že jsou identické, obsahovaly insert velikosti 1020 bp, který obsahoval otevřený čtecí rámec (ORF) o 973 bp, po kterém následoval 3'-netranslatovaný region o 27 bp a Póly A sekvence. Na 5'-konci těchto klonů nebylo identifikováno žádné start místo (AUG) pro translaci.

Klonování chybějícího 5'-konce bylo provedeno PCR amplifikaci DNA z placentárního Marathon RACE cDNA kompozitu. Byl identifikován 900 bp fragment (označený hp3), částečně přesahující identifikovanou 3'-kódující část EST klonů.

Spojený cDNA fragment, délky 1721 bp (SEQ ID NO: 9) obsahoval otevřený čtecí rámec kódující, jak je uvedeno na obr. 1 a v SEQ ID NO: 11, polypeptid o 543 aminokyselinách (SEQ ID NO: 10) s vypočítanou molekulovou hmotností 61192 daltonů. 3'-konec částečných cDNA insertů obsažených v klonech 257548 a 260138 začínal v nukleotidu G⁷²¹ SEQ ID NO: 9a obr. 1.

Jak je dále uvedeno na obr. 1, byla zjištěna odlišnost v jednom nukleotidu mezi EST klony a sekvencí amplifikovanou PCR, která způsobovala aminokyselinovou substituci z Tyr²⁴⁶ v EST na Phe^24e v amplifikované cDNA. Nukleotidová sekvence fragmentu cDNA amplifikovaného PCR byla verifikována ze dvou nezávislých produktů amplifikace. Nový gen byl označen hpa.

Jak bylo uvedeno výše, 3'-konec částečných cDNA insertů obsažených v klonech 257548 a 260138 začínal v nukleotidu 721 hpa (SEQ ID NO: 9) . Schopnost hpa cDNA tvořit stabilní sekundární struktury, jako například kmen a smyčky, v okolí nukleotidu 721, byla zkoumána pomocí počítačového modelování. Bylo zjištěno, že stabilní kmenové a smyčkové struktury budou pravděpodobně tvořeny za účasti nukleotidů 698-724 (SEQ ID NO: 9). Dále, vysoký obsah GC, více než 70%, charakterizuje 5'-koncový region hpa genu, ve srovnání s pouze 40% v 3'-regionu. Toto zjištění může vysvětlit nezralé zakončení a proto chybění 5'-konců v EST klonech.

Pro testování schopnosti produktu hpa genu katalyzovat degradaci heparansulfatu v in vitro testu byl celý otevřený čtecí rámec exprimován ve hmyzích buňkách, za použití Baculovirového expresního systému. Extrakty z buněk infikovaných virem obsahujícím hpa gen, -vykazovaly vysoké hladiny degradační aktivity pro heparansulfat, zatímco buňky infikované podobným konstruktem neobsahujícím hpa gen nevykazovaly žádnou takovou aktivitu, stejně jako neinfikované buňky. Tyto výsledky jsou dále popsány v následujících příkladech.

Příklad 2: Degradace HSPG ze solubilní ECM

Monovrstvé kultury High Five buněk byly infikovány (72 h, 28 °C) rekombinantním bakulovirem obsahujícím pFasthpa plasmid nebo kontrolním virem obsahujícím plasmid bez insertu. Buňkybyly sklízeny a byly lyžovány v heparanasovém reakčním pufru pomocí tří cyklů zmrazení a rozmražení. Buněčné lyzáty byly potom inkubovány (18 h, 37 °C) se sulfátem značeným HSPG z ECM (pík I) , a potom byla provedena analýza reakční směsi gelovou filtrací (Sepharosa 6B).

Jak je uvedeno na obr. 2, substrát samotný obsahoval téměř pouze materiál s vysokou molekulovou hmotností (Mr), který eluoval po νθ (pík I, frakce 5-20, Kav < 0,35) . Podobný charakter eluce byl pozorován tehdy, když byl HSPG substrát inkubován s lyzáty buněk, které byly infikovány kontrolním virem. Naopak, inkubace HSPG substrátu s lyzáty buněk infikovaných virem obsahujícím hpa vedla ke kompletní konversi substrátu s vysokou Mr na degradační fragmenty s nízkou Mr (pík II, frakce 22-35,

0,5 < Kav < 0,75).

Bylo zjištěno, že fragmenty eluované v píku II jsou degradační produkty heparansulfatu, protože byly (i) 5- až 6-krát menší než vedlejší řetězce heparansulfatu (Kav přibližně 0,33) uvolňované z ECM při zpracování alkalickým borohydridem nebo papainem; a (ii) resistentní na další trávení papainem nebo chondroitinasou ABC a citlivé na deaminaci kyselinou dusitou (6, 11).

Podobné výsledky (nejsou uvedeny) byly získány s Sf21 buňkami. Opět, heparanasová aktivita byla detekována v buňkách infikovaných virem obsahujícím hpa (pFhpa), ale nikoliv v buňkách infikovaných kontrolním virem (pF). Tento výsledek byl získán se dvěma nezávisle připravenými rekombinantními viry. Lyzáty kontrolních neinfikovaných High Five buněk nedegradovaly HSPG substrát.

V dalších pokusech byl HSPG substrát inkubován s mediem kondicionovaným infikovanými High Five nebo Sf21 buňkami.

Jak je uvedeno na obr. 3a-b, heparanasová aktivita, která se projevuje konversi píku I s vysokou molekulovou hmotností na pík II s nízkou molekulovou hmotností, který představuje HS

degradační fragmenty, byla zjištěna v kultivačním mediu buněk infikovaných pFhpa2 nebo pFhpa4 viry, ale ne v kultivačním mediu buněk infikovaných kontrolními pFl nebo pF2 viry. Žádná heparanasová aktivita nebyla detekována v kultivačním mediu kontrolních neinfikovaných High Five nebo Sf2l buněk.

Medium buněk infikovaných pFhpa4 virem bylo filtrováno přes membránu s limitem 50 kDa pro hrubé stanovení molekulové hmotnosti rekombinantní heparanasy. Jak je uvedeno na obr. 4, veškerá enzymatická aktivita byla zadržena v předním kompartmentu a žádná aktivita nebyla detekována v přefiltrovaném materiálu (< 50 kDa). Tento výsledek odpovídá očekávané molekulové hmotnosti produktu hpa genu.

Pro další charakterizaci hpa produktu byl zkoumán efekt heparinu, silného inhibitoru degradace HS způsobené heparanasou (40) .

Jak ukazují obe. 5a-b, konverse substrátu píku I na HS degradační fragmenty píku II byla kompletně inhibována za přítomnosti heparinu.

Dohromady tyto výsledky ukazují, že enzym heparanasa je exprimován v aktivní formě hmyzími buňkami infikovanými Baculovirem obsahujícím nově identifikovaný lidský hpa gen.

Příklad 3: Degradace HSPG v intaktní ECM

Dále byla zkoumána schopnost intaktních infikovaných hmyzích buněk degradovat HS v intaktní, přirozené ECM. Pro tento účel byly High Five nebo Sf21 buňky umístěny na metabolicky sulfátem značenou ECM po infekci (48 h, 28 °C) buď pFhpa4 nebo kontrolním pF2 virem. pH media bylo potom upraveno na pH 6,2-6,4 a buňky

byly dále inkubovány se značenou ECM po dobu dalších 48 hodin při °C nebo po dobu 24 hodin při 37 °C, Sulfátem značený materiál uvolněný do inkubačního media byl analyzován gelovou filtrací na

Sepharose 6B.

Jak je uvedeno na obr. 6a-b a 7a-b, inkubace ECM s buňkami infikovanými kontrolním pF2 virem vedla ke konstantnímu uvolňování značeného materiálu, který byl téměř zcela (>90%) tvořen fragmenty s vysokou molekulovou hmotností (pík I) eluovanými s nebo po V . Dříve bylo prokázáno, že proteolytická aktivita přítomná v ECM samotné a/nebo exprimovaná buňkami je odpovědná za uvolňování materiálu s vysokou molekulovou hmotností (6) . Tento téměř intaktní HSPG poskytuje solubilní substrát pro následnou degradaci heparanasou, jak je také dokázáno relativně vysokým množstvím materiálu píku I, který se akumuluje při inhibici heparanasy heparinem (6,7,12, obr. 9). Na druhé straně, inkubace značené ECM s buňkami infikovanými pFhpa4 virem vedla k uvolnění 60-70% radioaktivity asociované s ECM ve formě fragmentů značených sulfátem s nízkou molekulovou hmotností (pík II, 0,5 < Kav < 0,75), bez ohledu na to, zda byly infikované buňky inkubovány s ECM při 28 °C nebo 37 °C. Kontrolní intaktní neinfikované Sf2l nebo High Five buňky nedegradovaly HS vedlejší řetězce ECM.

V následujících pokusech, jak jsou uvedeny na obr. 8a-b, byly High Five a Sf21 buňky infikovány (96 h, 28 °C) pFhpa4 nebo kontrolním pFl virem a kultivační medium bylo inkubováno se sulfátem značenou ECM. Degradační fragmenty HS s nízkou molekulovou hmotností byly uvolňovány z ECM pouze při inkubaci s mediem kondicionovaným buňkami infikovanými pFhpa4. Jak je uvedeno na obr. 9, produkce těchto fragmentů byla inhibována za přítomnosti heparinu. Žádná heparanasová aktivita nebyla detekována v kultivačním mediu kontrolních, neinfikovaných buněk.

Tyto výsledky naznačují, že heparanasa exprimovaná buňkami infikovanými pFhpa4 virem je schopna degradovat HS v komplexu s jinými makromolekulárními složkami (t.j. fibronektinem, lamininem, kolagenem) přirozené intaktní ECM, stejným způsobem, jako je způsob popsaný pro metastazující nádorové buňky nebo pro aktivované buňky imunitního systému (6,7).

Příklad 4: Přečištění rekombinantní heparanasy

Rekombinantní heparanasa byla částečně přečištěna z media Sf21 buněk infikovaných pFhpa4 za použití heparin-Sepharose chromatografie (obr. 10a), po které následovala gelová filtrace shromážděných aktivních frakcí přes FPLC Superdex 75 kolonu (obr. 11a) . Byl detekován přibližně 63 kDa protein, jehož kvantita, jak byla stanovena SDS-polyakrylamidovou gelovou elektroforesou s barvením stříbrem, korelovala s heparanasovou aktivitou v příslušných frakcích z kolony (obr. 10b a 11b, v příslušném pořadí). Tento protein nebyl detekován v kultivačním mediu buněk infikovaných kontrolním pFl virem a byl zpracován podobnou frakcionací na heparin-Sepharose (není uvedeno).

Příklad 5: Exprese hpa genu v různých typech buněk, orgánů a tkání

Tento příklad je doprovázen obr. 12a-e. RT-PCR byla použita pro hodnocení exprese hpa genu různými typy buněk a tkání. Pro tento účel byla celková RNA reversně transkribována a amplifikována. Předpokládaná 585 bp cDNA byla jasně prokázána v lidské ledvině, placentě (8 a 11 týdnů), a tkáni moly, stejně jako v čerstvě izolovaných a krátkodobých (1,5-48 hodin) kulturách lidských placentárních cytotrofoblastů (obr. 12a), kde o všech uvedených tkáních je známo, že exprimují vysoké hladiny heparanasové aktivity (41) . Hpa transkript byl také exprimován v • · • * · • · normálních lidských neutrofilech (obr. 12b). Naopak, nebyla zjištěna detekovatelná exprese hpa mRNA v embryonální lidské svalové tkáni, thymu, srdci a nadledvinách (obr. 12b). Hpa gen exprimován v několika, ale ne ve všech, buněčných liniích lidského karcinomu močového měchýře (obr. 12c), SK hepatomu (SK-hep-1), ovariálního karcinomu (435, 231), melanomu a megakaryocytární (DAMI, CHRF) lidské buněčné linii (obr. 12d-e).

Bylo zjištěno, že výše uvedený charakter exprese hpa transkriptu velmi dobře koreluje s aktivitou heparanasy stanovenou v různých tkáních a typech buněk (není uvedeno).

Příklad 6: Geny homologní s hpa

EST databaze byly prohledávány na geny homologní s hpa genem. Byly identifikovány tři myší EST (přírůstkové č. Aal77901, z myší sleziny, Aa067997, z myší kůže a Aa47943 z myšího embrya) odpovídající 824 bp cDNA fragmentu, který obsahuje otevřený čtecí rámec (bez 5'-konce) o 629 bp a 3'-netranslatovaný region o 195 bp (SEQ ID NO: 12). Jak je uvedeno na obr. 13, kódující region má 80% podobnost s 3'-koncem hpa cDNA sekvence. EST jsou pravděpodobně cDNA fragmenty myšího homologů hpa, který kóduje myší heparanasu.

Vyhledávání konvenčních proteinových domén odhalilo amino-terminální homologii mezi heparanasou a několika prekursorovými proteiny, jako je prekursor prokolagen al, tyrosin-protein kinasa RYK, fibullin-1, vazebný protein pro insulinu podobný růstový faktor a několik dalších. Amino-konec je vysoce hydrofóbní a obsahuje potenciální transmembránovou doménu. Homologie se známými signálními peptidovými sekvencemi naznačuje, že může být signálním peptidem pro lokalizaci proteinu.

Příklad 7: Izolace rozšířeného 5' konce hpa cDNA z lidské SK-hep-1 buněčné linie

5'-konec hpa cDNA byl izolován z lidské SK-hep-1 buněčné linie PCR amplifikaci za použití Marathon RACE (rychlá amplifikace cDNA konců) kitu (Clontech). Celková RNA byla připravena z SK-l-hep-1 buněk za použití TRI-Reagent (Molecular Research Center Inc.) podle návodu výrobce. Póly A+ RNA byla izolována za použití mRNA separatorového kitu (Clontech).

Marathon RACE SK-hepl cDNA kompozit byl konstruován podle návodu výrobce. První kolo amplifikace bylo provedeno za použití adaptorového specifického primeru API:

5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ , SEQ ID NO: 1 a hpa specifického protismyslného primeru hpl-629:

5'-CCCCAGGAGCAGCAGCATCAG-3', SEQ ID NO: 17, který odpovídá nukleotidům 119-99 SEQ ID NO: 9. Výsledný PCR produkt byl zpracován ve druhém kole amplifikace za použití adaptorového specifického vnořeného primeru AP2:

5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3', SEQ ID NO: 3, a hpa specifického protismyslného vnořeného primeru hpl-666:

5'-AGGCTTCGAGCGCAGCAGCAT-3', SEQ ID NO: 18, který odpovídá nukleotidům 83-63 SEQ ID NO: 9. PCR program byl následující: horký začátek při 94 °C po dobu 1 minuty, potom 30 cyklů při 90 °C - 30 s, 68 °C - 4 min. Výsledný 300 bp DNA fragment byl extrahován z agarosového gelu a byl klonován do vektoru pGEM-T Easy )Promega). Výsledný rekombinantní plasmid byl označen pHPSKl.

Byla analyzována nukleotidová sekvence pHPSKl insertu a bylo zjištěno, že obsahuje 62 nukleotidů na 5'-onci placentární hpa cDNA (SEQ ID NO: 9) a dalších 178 nukleotidů proti směru kódující sekvence, t.j. prvních 178 nukleotidů SEQ ID NO: 13 a 15.

• · · ·

Mezi SH-hepl cDNA a placentami cDNA byl identifikován rozdíl v jednom nukleotidu. T derivát v pozici 9 placentární cDNA (SEQ

ID NO: 9) je nahrazen C derivátem v odpovídající pozici 187

SK-hepl CDNA (SEQ ID NO: 13).

Tato odlišnost je pravděpodobně způsobena mutací 5'-konce placentárního cDNA klonu, jak byla potvrzena analýzou sekvence několika daších cDNA klonů izolovaných z placenty, které podobně jako SK-hepl obsahovaly C v pozici 9 SEQ ID NO: 9.

5'-rozšířená sekvence SK-hepl cDNA byla sestavena se sekvencí hpa cNDA izolovanou z lidské placenty (SEQ ID NO: 9). Sestavená sekvence obsahovala otevřený čtecí rámec, který kóduje, jak je uvedeno v SEQ ID NO: 14 a 15, polypeptid o 592 aminokyselinách s vypočítanou molekulovou hmotností 66407 daltonů. Otevřený čtecí rámec sousedí s 93 bp 5'-netranslatovaným regionem (UTR).

Příklad 8: Izolace genomového regionu před hpa genem

Region před hpa genem byl izolován za použití Genome Walker kitu (Clontech) podle návodu výrobce. Kit obsahuje pět vzorků lidské genomové DNA, které jsou každý tráven jinou restrikční endonukleasou vytvářející jiná tupá zakončení: EcoRV, Seal, Dral, PvuII a SspI.

Tupě zakončené DNA fragmenty jsou ligovány do částečně jednořetězcových adaptorů. Vzorky genomové DNA byly zpracovány PCR amplifikaci za použití primerů specifických pro adaptory a primerů specifických pro gen. Amplifikace byla provedena za použití Expand High Fidelity (Boehringer Mannheim). První kolo amplifikace bylo provedeno za použití primerů apl:

5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3', SEQ ID NO: 19 a hpa specifického protismyslného primerů hpl-666: 5'-AGGCTTCGAGCGCAGCAGCAT-3', SEQ

ID NO: 18, který odpovídá nukleotidům 83-63 SEQ ID NO: 9. PCR program byl následující: horký začátek při 94 °C po dobu 1 minuty, potom 30 cyklů při 90 °C - 30 s, 68 °C - 4 min.

PCR produkty první amplifikace byly ředěny 1:50. 1 μΐ ředěného vzorku byl použit jako templát pro druhou amplifikaci za použití vnořeného primerů specifického pro adaptor ap2:

5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3', SEQ ID NO: 20, a protismyslného primerů specifického pro hpa hpl-690, 5'-CTTGGGCTCACCTGGCTGCTC-3' SEQ ID NO: 21, který odpovídá nukleotidům 62-42 SEQ ID NO: 9. Výsledné produkty amplifikace byly analyzovány elektroforesou na agarosovém gelu. Z pěti amplifikačních reakcí bylo získáno pět různých PCR produktů. DNA fragment velikosti přibližně 750 bp, který byl získán ze vzorku DNA trávené SspI byl extrahován z gelu. Přečištěný fragment byl ligován do plasmidového vektoru pGEM-Τ Easy (Promega). Výsledný rekombinantní plasmid byl označen pGHP6905 a byla určena nukleotidová sekvence hpa insertu.

Částečná sekvence 594 nukleotidů je uvedena v SEQ ID NO: 16. Poslední nukleotid v SEQ ID NO: 13 odpovídá nukleotidu 93 v SEQ ID NO: 13. DNA sekvence v SEQ ID NO: 16 obsahuje 5' region hpa cDNA a 501 nukleotidů genomového regionu před tímto regionem, o který se předpokládá, že obsahují promotorovy region hpa genu.

Příklad 9: Exprese 592 aminokyselinového HPA poiypeptidu v lidské 293 buněčné linii

Otevřený čtecí rámec pro 592 aminokyselin (SEQ ID NO: 13 a 15) byl konstruován ligaci 110 bp odpovídajících 5'-konci SK-hepl hpa cDNA s placentární cDNA. Přesněji, amplifikační produkt Marathon RACE-PCR placentární hpa DNA byl tráven Sací a přibližně 1 kb fragment byl ligován do Sací tráveného pGHP6905 plasmidů. Vzniklý plasmid byl tráven Earl a AatlI. Earl lepivé konce byly zarovnány • · » · a byl izolován přibližně 280 bp Earl/tupý-AatlI fragment. Tento fragment byl ligován s pFasthpa tráveným EcoRi, který byl zarovnán za použití Klenowova fragmentu a který byl dále tráven

AatlI. Výsledný plasmid obsahoval 1827 bp insert, který obsahoval otevřený čtecí rámec o 1776 bp, 31 bp 3' UTR a 21 bp 5' UTR.

Tento plasmid byl označen pFastLhpa.

Savčí expresní vektor byl konstruován pro řízení exprese 592 aminokyselinového heparanasového polypeptidu v lidských buňkách, hpa cDNA byla excidována z pFastLhpa za použití BssHII a Notl. Vzniklý BssHII-Notl fragment byl ligován do savčího expresního vektoru pSI (Promega) tráveného Mlul a Notl. Vzniklý rekombinantní plasmid, pSIhpaMet2, byl transfektován do lidské 293 embryonální ledvinné buněčné linie.

Transientní exprese 592 aminokyselinové heparanasy byla vyšetřována westernovým přenosem a enzymatická aktivita byla testována za použití testu průchodu gelem. Oba tyto postupy jsou podrobně popsány v U.S. patentové přihlášce č. 09/071739, podané 1.5.1998, která je zde uvedena v plném znění jako odkaz. Buňky byly sklízeny 3 dny po transfekci. Získané buňky byly resuspendovány v lyzačním pufru obsahujícím 150 mM NaCI, 50 mM Tris, pH 7,5, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF a kokteil inhibitorů proteas (Boehringer Mannheim). 40 /ig vzorky proteinových extraktů byly použity pro separaci na SDS-PAGE. Proteiny byly přeneseny na PVDF Hybond P membránu (Amersham). Membrána byla inkubována s afinitně přečištěnou polyklonální anti-heparanasovou protilátkou, která je popsána v U.S. patentové přihlášce č. 09/071739. Ve transfektovaných buňkách byl pozorován hlavní proužek velikosti přibližně 50 kDa, stejně jako vedlejší proužek velikosti přibližně 65 kDa. Podobný nález byl pozorován v extraktech buněk transfektovaných pShpa, jak je popsáno v U.S. patentové přihlášce č. 09/071739. Tyto dva proužky pravděpodobně představují dvě fc · ··» »· • * ♦ • · · • · ·

Α· ····

formy rekombinantní heparanasy, které jsou produkovány transfektovanými buňkami. 65 kDa protein pravděpodobně představuje prekursor heparanasy, zatímco 50 kDa protein je pravděpodobně zpracovanou zralou formou.

Katalytická aktivita rekombinantního prtoeinu exprimovaného v buňkách transfektovaných pShpaMet2 byla testována testem průchodu gelem. Buněčné extrakty z transfektovaných a falešně transfektovaných buněk byly inkubovány přes noc s heparinem (6 /zg v každé reakci) při 37 °C, za přítomnosti 20 mM fosfátového-citratového pufru, pH 5,4, 1 mM CaCl₂, 1 mM DTT a 50 mM NaCI. Reakční směsi byly potom separovány na 10% polyakrylamidovém gelu. Katalytická aktivita rekombinantní heparanasy byla jasně prokázána rychlejší migrací heparinových molekul inkubovaných s extrakty transfektovaných buněk, ve srovnání s kontrolou. Rychlejší migrace ukazuje na vymizení heparinových molekul o vysoké molekulové hmotnosti a na tvorbu degradačních produktů s nižší molekulovou hmotností.

Příklad 10: Chromosomální lokalizace hpa genu

Chromosomální mapování hpa genu bylo provedeno za použití panelu monochromosomšlních lidských/CHO a lidských/myších somatických buněčných hybridů, které byly získány od UK HGMP Resource Center (Cambridge, England).

ng DNA vzorků každé hybridu somatických buněk bylo zpracováno PCR amplifikaci za použití hpa primerů: hpu565,

5'-AGCTCTGTAGATGTGCTATACAC-3', SEQ ID NO: 22, který odpovídá nukleotidům 564-586 SEQ ID NO: 9a protismyslného primerů hpll71 5'-GCATCTTAGCCGTCTTTCTTCG-3 ' SEQ ID NO: 23, který odpovídá nukleotidům 897-876 SEQ ID NO: 9.

PCR program byl následující: horký začátek při 94 °C po dobu 3 minut, potom 7 cyklů při 94 °C - 45 s, 66 °C - 1 min., 68 °C 5 minut, a potom 30 cyklů o 94 °C - 45 sekund, 62 °C - 1 minuta, 68 °C - 5 minut a 10 minutová konečná extense při 72 °C.

Reakce byly provedeny s Expand long PCR (Boehringer Mannheim). Výsledné produkty amplifikace byly analyzovány za použití agarosové gelové elektroforesy. Jak je uvedeno na obr. 14, byl získán jeden proužek o přibližně 2,8 kb z chromosomu 4, stejně jako z kontrolní lidské genomové DNA. 2,8 kb amplifikační produkt je očekáván na základě amplifikace genomového hpa klonu (data nejsou uvedena). Žádné amplifikační produkty nebyly získány ani v kontrolních DNA vzorcích od křečka nebo myši, ani v somatických hybridech jiných lidských chromosomů.

Ačkoliv byl vynález popsán v souvislosti s jeho výhodnými provedeními, budou odborníků jasné mnohé alternativy, modifikace či variace provedení předkládaného -vynálezu. Takové alternativy, modifikace a variace spadají do rozsahu připojených patentových nároků.

• 9 ···· ·· « ····

Odkazy:

1. Wight, T.N., Kinsella, M.G., and Qwamstromn, E.E. (1992). The role of proteoglycans in cell adhesion, migration and proliferation. Curr. Opin. Cell Biol., 4,793-801.

2. Jackson, R.L., Busch, S.J., and Cardin, A.L. (1991). Glycosaminoglycans: Molecular properties, protein interactions and role in physiological processes. Physiol. Rev., ΊΙ, 481-539.

3. Wight, T.N. (1989). Cell biology of arterial proteoglycans. Arteriosclerosis, 9,1-20.

4. . Kjellen, L., and Lindahl, U. (1991). Proteoglycans: structures and interactions. Annu. Rev. Biochem., 60,443-475.

5. Ruoslahti, E., and Yamaguchi, Y. (1991). Proteoglycans as modulators of growth factor activities. Cell, 64, 867-869.

6. Vlodavsky, I., Eldor, A., Haimovitz-Friedman, A., Matzner, Y., Ishai-Michaeli, R., Levi, E., Bashkin, P., Lider, O., Naparstek, Y., Cohen, I.R., and Fuks, Z. (1992). Expression of heparanase by platelets and circulating cells of the immune systém: Possible involvement in diapedesis and extravasation. Invasion & Metastasis, 12,112-127.

7. Vlodavsky, I., Mohsen, M., Lider, O., Ishai-Michaeli, R., Ekre, H.P., Svahn, C.M., Vigoda, M., and Peretz, T. (1995). Inhibition of tumor metastasis by heparanase inhibiting species of heparin. Invasion & Metastasis, 14,290-302.

8. Nakajima, M., Irimura, T., and Nicolson, G.L. (1988). Heparanase and tumor metastasis. J. Cell. Biochem., 36, 157-167.

9. Nicolson, G.L. (1988). Organ specificity of tumor metastasis: Role of preferential adhesion, invasion and growth of malignant cells at specific secondary sites. Cancer Met. Rev., 7, 143-188.

• · • · · • * ·

10. Liotta, L.A., Rao, C.N., and Barsky, S.H. (1983). Tumor invasion and the extracellular matrix. Lab. Invest., 49, 639-649.

11. Vlodavsky, I., Fuks, Z., Bar-Ner, M., Ariav, Y., and Schirrmacher, V. (1983). Lymphoma cell mediated degradation of sulfated proteoglycans in the subendothelial extracellular matrix: Relationship to tumor cell metastasis. Cancer Res.. 43,2704-2711.

12. Vlodavsky, I., Ishai-Michaeli, R., Bar-Ner, M., Fridman, R., Horowitz, A.T., Fuks,Z. and Biran, S. (1988). Involvement of heparanase in tumor metastasis and angiogenesis. Is. J. Med., 24, 464-470.

13. Vlodavsky, I., Liu, G.M., and Gospodarowicz, D. (1980). Morphological appearance, growth behavior and migratory activity of human tumor cells maintained on extracellular matrix vs. plastic. Cell, 19, 607-616.

14. Gospodarowicz, D., Delgado, D., and Vlodavsky, I. (1980). Permissive effect of the extracellular matrix on cell proliferation in-vitro. Proč. Nati. Acad. Sci. USA., 77,4094-4098.

15. Bashkin, P., Doctrow, S., Klagsbrun, M., Svahn,· C.M., Folkman, J.,· and Vlodavsky, I. (1989). Basic fíbroblast growth factor binds to subendothelial extracellular matrix and is released by heparitinase and heparin-like molecules. Biochemistry, 28,1737-1743.

16. Parish, C.R., Coombe, D.R., Jakobsen/K.B., and Underwood, P.A. (1987). Evidence that sulphated polysaccharides inhibit tumor metastasis by blocking tumor cell-derived heparanase. Int. J. Cancer, 40,511-517.

16a. Vlodavsky, I., Hua-Quan Miao., Benezra, M., Lider, O., BarShavit, R., Schmidt, A., and Peretz, T. (1997). Involvement of the extracellular matrix, heparan sulfáte proteoglycans and heparan sulfáte degrading enzymes in angiogenesis and metastasis, In: Tumor Angiogenesis. Eds. C.E. Lewis, R. Bicknell & N. Ferrara. Oxford University Press, Oxford UK, pp. 125-140.

17. Burgess, W.H., and Maciag, T. (1989). The heparin-binding (fíbroblast) growth factor family of proteins. Annu. Rev. Biochem., 58,575-606.

• ·· *

18. Folkman, J., and Klagsbrun, M. (1987). Angiogenic factors. Science, 235,442-447.

19. Vlodavsky, I., Folkman, J., Sullivan, R., Fridman, R., IshaiMichaelli, R., Sasse, J., and Klagsbrun, M. (1987). Endothelial cell-derived basic fíbroblast growth factor: Synťhesis and deposition into subendothelial extracellular matrix. .Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84,2292-2296.

20. Folkman, I, Klagsbrun, M., Sasse, J., Wadzinski, M., Ingber, D., and Vlodavsky, I. (1980). A heparin-binding angiogenic protein - basic fíbroblast growth factor - is stored within basement membrane. Am. J. Pathol., 130,393-400.

21. Cardon-Cardo, C., Vlodavsky, I., Haimovitz-Friedman, A,, Hicklin, D., and Fuks, Z. (1990). Expression of basic fíbroblast growth factor in normál human tissues. Lab. Invest., 63, 832-840.

22. Ishai-Michaeli, R., Svahn, C.-M., Chajek-Shaul, T., Komer, G., Ekre, H.-P., and. Vlodavsky, I. (1992). Importance of size and sulfation of heparin in releasé of basic fíbroblast factor from the vascular endothelium and extracellular matrix. Biochemistry, 31,2080-2088.

23. Ishai-Michaeli, R., Eldor, A., and Vlodavsky, I. (1990). Heparanase activity expressed by platelets, neutrophils and lymphoma cells releases active fíbroblast growth factor from extracellular matrix. Cell Reg., 1, 833-842.

24. Vlodavsky, I., Bar-Shavit, R., Ishai-Michaeli, R., Bashkin, P., and Fuks, Z, (1991). Extracellular sequestration and releasc of fíbroblast growth factor: a regulátory mechanism? Trends Biochem. Sci., 16,268-271.

25. Vlodavsky, I., Bar-Shavit, R., Komer, G., and Fuks, Z. (1993). Extracellular matrix-bound growth factors, enzymes and plasma proteins. In Basement membranes: Cellular and molecular aspects (eds. D.H. Rohrbach and R. Timpl), pp327-343. Academie press lne., Orlando, Fl.

» ·

26. Yayon, A., Klagsbrun, M,, Esko, J.D., Leder, P., and Omitz, D.M. (1991). Cell surface, heparin-like molecules are required for binding of basic fibroblast growth factor to its high affmity receptor. Cell, 64,841-848.

27. Spivak-Kroizman, T., Lemmon, M.A., Dikic, I., Ladbury, J.E., Pinchasi, D., Huang, J., Jaye, M., Crumley, G., Schlessinger, J., and Lax, I. (1994). Heparin-induced oligomerization of FGF molecules is responsible for FGF receptor dimerization, activation, and cell proliferation. Cell, 79,1015-1024.

28. Omitz, D.M., Herr, A.B., Nilsson, M., West, a., J., Svahn, C.-M., and Waksman, G. (1995). FGF binding and FGF receptor activation by synťhetic heparan-derived di- and trisaccharides. Science, 268, 432-436.

29. Gitay-Goren, H., Soker, S., Vlodavsky, I., and Neufeld, G. (1992). Cell surface associated heparin-like molecules are required for the binding of vascular endothelial growth factor (VEGF) to its cell surface receptors. J. Biol. Chem., 267, 6093-6098.

30. Lider, O., Baharav, E., Mekori, Y., Miller, T.', Naparstek, Y., Vlodavsky, I., and Cohen, I.R. (1989). Suppression of experimental autoimmune diseases and prolongation of allograft survival by treatment of animals with heparinoid inhibitors of T lymphocyte heparanase. J. Glin. Invest., 83,752-756.

31. Lider, 0., Cahalon, L., Gilat, D., Hershkovitz, R., Siegel, D., Margalit, R., Shoseyov, O., and Cohn, I.R. (1995). A disaccharide that inhibits tumor necrosis factor a is formed from the extracellular matrix by the enzyme heparanase. Proč. Nati. Acad. Sci. USA., 92,5037-5041.

31a. Rapraeger, A., Krufka, A., and Olwin, B.R. (1991). Requirement of heparan sulfáte for bFGF-mediated fibroblast growth and myoblast differentiation. Science, 252,1705-1708.

32. Eisenberg, S., Sehayek, E., Olivecrona, T., and Vlodavsky, I. (1992). Lipoprotein lipase enhances binding of lipoproteins to heparan sulfáte on cell surfaces and extracellular matrix. J. Clin. Invest., 90,2013-2021.

33. Shieh, M-T., Wundunn, D., Montgomery, R.I., Esko, J.D., and Spear, P.G. J. (1992). Cell surface receptors for herpes simplex virus are heparan sulfáte proteoglycans. J Cell Biol., 116,1273-1281.

33a. Chen, Y., Maguire, T., Hileman, R.E., Fromm, J.R., Esko, J.D., Linhardt, R.J., and Marks, R.M. (1997). Dengue virus infectivity depends on envelope protein binding to target cell heparan sulfáte. Nátuře Medicine 3, 866871.

33b. Putnak, J.R., Kanesa-Thasan, N., and Innis, B.L. (1997). A putative cellular receptor for dengue viruses. Nátuře Medicine 3, 828-829.

34. Narindrasorasak, S., Lowery, D., Gonzalez-DeWhitt, P., Poorman, R.A., Greenberg, B., Kisilevsky, R. (1991). High affmity interactions between the Alzheimeťs beta-amyloid precursor protein and the basement membrane form of theparan sulfáte proteoglycan. J. Biol. Chem., 266,12878-83.

35. Ross, R. (1993). The paťhogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nátuře (Lond.)., 362:801-809.

36. Zhong-Sheng, J., Walter, J., Brecht, R., Miranda, D., Mahmood Hussain, M., Innerarity, T.L. and Mahley, W.R. (1993). Role of heparan sulfáte proteoglycans in the binding and uptake of apolipoprotein E-enriched remnant lipoproteins by cultured cells. J. Biol. Chem., 268, 10160-10167.

37. Ernst, S., Langer, R., Cooney, Ch.L., and Sasisekharan, R. (1995). Enzymatic degradation of glycosaminoglycans. Crítical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 30(5), 387-444.

38. Gospodarowicz, D., Mescher, AL., Birdwell, CR. (1977). Stimulation of comeal endothelial cell proliferation in vitro by fibroblast and epidermal growth factors. Exp Eye Res 25,75-89.

39. Haimovitz-Friedman, A., Falcone, D.J., Eldor, A., Schirrmacher, V-,

Vlodavsky, I., and Fuks, Z. (1991) Activation of platelet heparitinase by tumor cell-derived factors. Blood, 78,789-796.

• · · ·

39a. Savitsky, K., Platzer, M., Uziel, T., Gilad, S., Sartiel, A., Rosental,

A., Elroy-Stein, O., Siloh, Y. and Rotman, G. (1997). Ataxia-telangiectasia: structural diversity of untranslated sequences suggests complex post-translational regulation of ATM gene expression. Nucleic Acids Res. 25(9), 1678-1684.

40. Bar-Ner, M., Eldor, A., Wasserman, L., Matzner, Y., and I

Vlodavsky, I. (1987). Inhibition of heparanase mediated degradation of | extracellular matrix heparan sulfáte by modifíed and non-anticoagulant heparin species. Blood, 70, 551-557.

í i

41. Goshen, R., Hochberg, A., Komer, G., Levi, E., Ishai- Michaeli, R., Elkin, M., de Grot, N., and Vlodavsky, I. (1996). Purification and characterization of placental heparanase and its expression by cultured cytotrophoblasts. Mol. Human Reprod. 2, 679-684.

• · · · · ·

Seznam sekvencí (1) Obecné informace:

(i) Přihlašovatel: Iris Pecker, Israel Vlodavsky a Elena Feinstein (ii) Název vynálezu: Polynukleotid kódující polypeptid mající heparanasovou aktivitu a jeho exprese v transformovaných buňkách (iii) Počet sekvencí: 23 (iv) Adresa pro korespondenci (A) Adresa: Mark M. Friedman c/o Robert Sheinbein (B) Ulice: 2940 Birchtree Lané (C) Město: Silver Spring (D) Stát: Maryland (E) Země: USA (F) ZIP: 20906 (v) Počítačová čtecí forma:

(A) Typ media: 1.44 MB, 3,5'' mikrodisk (B) Počítač: Twinhead* Slimnote-890TX (C) Operační systém: MS-DOS verze 6.2

Windows verze 3.11 (D) Software: Word pro Windows verze 2.0 konvertovaný na

ASCI filé (vi) Údaje o současné přihlášce:

(A) Číslo přihlášky:

(B) Datum podání:

(vii) Předchozí data přihlášky:

(A) Číslo přihlášky: US 08/922170 (B) Datum podání: 2.10.1997 (viii) Zástupce/agent informace (A) Jméno: Friedmam, Mark M.

(B) Registrační číslo: 33883 (C) Reference/číslo rejstříku: 910/1 (ix) Telekomunikační informace:

(A) Telefon: 972-3-5625553 (B) Telefax: 972-3-5625554 (C) Telex:

(2) Informace pro SEQ ID NO: 1:

• · • · · · (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 27 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 1:

CCATCCTAAT ACCACTCACT ATAGGGC 27

2) Informace pro SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 24 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 2:

GTAGTGATGC CATGTAACTG AATC 24 (2) Informace pro SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 23 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 3:

ACTCACTATA GGGCTCGAGC GGC 23 (2) Informace pro SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 22 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 4:

GCATCTIACC CGTCTTTCTI CG 22 (2) Informace pro SEQ ID NO: 5:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 15 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 5:

(2) Informace pro SEQ ID NO: 6:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 23 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 6:

nCGATCCCA AGAACGAATC AAC 23 (2) Informace pro SEQ ID NO: 7:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 24 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 7:

GTAGTGATGC CATGTAACTG AATC 24 (2) Informace pro SEQ ID NO: 8:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 9 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 8:

Tyr Gly Pro Asp Val Cly Gin Pro Arg 5 9 • · · · · · • · • · · ·

(2) Informace pro SEQ ID NO: 9:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 1721 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 9:

CTAGAGCTTT CGACTCTCCG CTGCGCGGCA AGATGCTGCT GCGCTCGAAG CCTGCGCTGC CGCTGGGTCC CCTCTCCCCT CGCGCCCTGC ACCTGGACTT cTTCACCCAG CAGCCGCTGC CCATTGACGC CAACCTGGCC ACGGACCCGC TTCGTACCTT GGCCAGAGGC TTGTCTCCTG ACTTCCTAAT TTTCGATCCC AAGAAGGAAT CTCAAGTCAA CCAGGATATT TCCAAATATG IACGGTTGGA ATGGCCCTAC CAGGAGCAAT TCAAGAACAG CACCTACTCA AGAAGCTCTG CAGGACTGGA CTTGATCTTT GGCCTAAATG ACAGTTCTAA TGCTCAGTTG CTCCTGGACT GGGAACTAGG CAATGAACCT AACAGTTTCC CGCAGTTAGG AGAAGATTAT ATTCAATTGC ATGCAAAACT CIATGGTCCT GATGTTGGTC ACAGCTTCCT GAAGGCTGGT GGAGAAGTGA TGAATGGACG GACTGCTACC AGGGAAGATT TTICATCTGT GCAAAAAGTT TTCCAGGTGG GGTTAGGAGA AACAAGCTCT GCATATGGAG CAGCTGGCTT TATGTGGCTG GATAAATTGG TGATGAGGCA AGTATTCTTI GGAGCAGGAA CTTTACCTGA TTATTGGCTA TCTCTTCTGT TGGCAAGCGT GCAAGGTTCA AAGAGAAGGA CTGACAATCC AAGGTATAAA GAAGGAGATT TCACCAAGTA CTTGCGGTTA CCCTATCCTT TAAGACCTTI GGGACCTCAT GGATTACTTT TAAAGATGGI GGATGATCAA ACCTTGCCAC GTTCACTGGG CTTGCCAGCT TTCTCATATA CTCCTIGCAT CTCAAAATAA AATATACTAG

GCTGGCGGGG GGAGCAGCCA GGTGAGCCCA 60 CGCCGCCGCT GATGCTGCTG CTCCTGGGGC 120 CCCGACCTGC GCAAGCACAG GACGTCGTGG 180 ACCTGGTGAG CCCCTCGTTC CTGTCCGTCA 240 GGTTCCTCAT CCTCCTGGGT TCTCCAAAGC 300 CGTACCTGAG GTTTGGTGGC ACCAAGACAG 360 CAACCTTTGA AGAGAGAAGT TACTGGCAAT 420 GATCCATCCC TCCTGATGTG GAGGAGAAGT 480 TGCTACTCCG AGAACACTAC CAGAAAAAGT 540 TAGATGTGCT ATACACTTTT GCAAACTCCT 600 CGTTATTAAG AACAGCAGAT TTGCAGTGGA 660 ACTGCTCTTC CAAGGGGTAT AACATTICTT 720 TTAAGAAGGC TGATATTTTC ATCAATGGGT 780 ATAAACTTCr AAGAAAGTCC ACCTTCAAAA 840 AGCCTCGAAG AAAGACGGCT AAGATGCTGA 900 TTGATTCAGT TACATGGCAT CACTACTATT 960 TTCTAAACCC TGATGTATTG GACATTTTTA 1020 TTGAGAGCAC CAGGCCTGGC AAGAAGGTCT 1080 CCGGAGCGCC CTTGCTATCC GACACCTTTG 1140 GCCTGTCAGC CCGAATGGGA ATAGAAGTGG 1200 ACIACCATTI AGTGGATGAA AACTTCGATC 1260 TCAAGAAATT GGTGGGCACC AAGGTGTTAA 1320 AGCTTCGAGT ATACCTTCAT TGCACAAACA 1380 TAACTCTGTA TGCCATAAAC CTCCATAACG 1440 TTTCTAACAA GCAAGTGGAT AAATACCTTC ,500 CCAAATCTGT CCAACTCAAT CGTCTAACTC 1560 CTTTAATGGA AAAACCTCTC CGGCCAGGAA 1620 GTTTTTTTGT GATAAGAAAT GCCAAAGTTG 1680 TCCTGACACr G 1721 (2) Informace pro SEQ ID NO: 10:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 543 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 10:

Het

Leu

Arg

Ser

Lys

Pro

Ale

Leu

Pro

Leu

Het

Leu

Gly

Pro

Leu

Gly

Pro

Leu

Ser

Pro

Gly

Ala

Leu

Pro

Arg

Pro

Ala

Gin

Ala

Gin

Asp

Val

Asp

Leu

Asp

Phe

Thr

Gin

Glu

Pro

Leu

His

Leu

Val

Ser

Pro

Ser

Phe

Leu

Ser

Val

Thr

Ile

Asp

Ala

Asn

Leu

Ala

Thr

Asp

Pro

Arg

Phe

Leu

llc

Leu

Gly

Ser

Pro

Lys

Leu

Arg

Thr

Leu

Ala

Arg

cly

Leu

Ser

Pro

Ala

Tyr

Leu

Arg

Phe

Gly

Thr

Lys

Thr

Asp

Phe

Leu

Ile

Phe

Asp

Pro

Lys

Glu

Ser

Thr

Phe

100

105

110

Gtu

Glu

Arg

Ser

Tyr

Trp

Gin

Ser

Gin

Val

Asn

Gin

Asp

Ile

Cys

Lys

115

120

125

• · • · · · * · • · · · · a · · · · · • · · · · · · • · · · · * * «· · · «·

Pro

Tyr’

Gin

Glu

Gin

Leu

Arg

Glu

His

Tyr

Cln

Lys

Phe

145

150

,55

160

Lys

Asn

Ser

Thr

Tyr

Ser

Arg

Ser

Ser.

Val

Asp

Val

Leu

Tyr

Thr

Phe

165

170

175

Ala

Asn

Cys

Ser

Cly

Leu

Asp

Leu

Ile

Phe

Cly

Leu

Asn

Ala

Leu

ISO

185

190

Arg

Thr

Ala

Asp

Leu

Gin

Trp

Asn

Ser

Asn

Ala

Gin

Leu

195

200

205

Asp

Tyr

Cys

Ser

Lys

Gly

Tyr

Asn

Ile

Ser

Trp

Glu

Leu

Cly

Asn

210

215

220

Glu

Pro

Asn

Ser

Phe

Leu

Lys

Ala

Asp

Ile

Phe

Ile

Asn

Gly

Ser

225

230

235

240

Gin

Leu

cly

Glu

Asp

Tyr

Ile

Gin

Leu

His

Lys

Leu

Arg

Lys

Ser

245

250

255

Thr

Phe

tys

Asn

Ala

Lys

Leu

Tyr

cly

Pro

Asp

Val

Cly

Gin

Pro

Arg

260

265

270

Arg

Lys

Thr

Ala

Lys

Het

Leu

Lys

Ser

Phe

Leu

Lys

Ala

Gly

Glu

275

260

285

Val

(te

Asp

Ser

Val

Thr

Trp

His

Tyr

Leu

Asn

Gly

Arg

Thr

220

295

300

Ala

Thr

Arg

Glu

Asp

Phe

Leu

Asn

Pro

Asp

Vat

Leu

Asp

Ile

Phe

lte

305

310

315

320

Ser

Val

Gin

Lys

Val

Phe

Gin

Val

Glu

Ser

Thr

Arg

Pro

Cly

325

330

335

Lys

Val

Trp

Leu

Cly

Glu

Thr

Ser

Ala

Tyr

cly

Cly

Gly

Ala

340

345

350

Pro

Leu

Ser

Asp

Thr

Phe

Ala

cly

Phe

Het

Trp

Leu

Asp

Lys

355

360

365

Leu

Cly

Leu

Ser

Ala

Arg

Het

Cly

Ile

Glu

vat

Val

Het

Arg

Cln

Val

370

375

380

Phe

cly

Ala

Gly

Asn

Tyr

His

Leu

Vat

Asp

Glu

Asn

Phe

Asp

Pro

385

390

395

400

Leu

Pro

Asp

Tyr

Trp

Leu

Ser

Leu

Phe

Lys

Leu

Vat

Gly

Thr

405

410

415

Lys

Vat

Leu

Het

Ala

Ser.

Val

Gin

Cly

Ser

Lys

Arg

Lys

Leu

Arg

420

425

430

Val

Tyr

Leu

His

Cys

Thr

Asn

Thr

Asp

Asn

Pro

Arg

Tyr

Lys

Glu

Gly

435

440

445

Asp

Leu

Thr

Leu

Tyr

Ala

Ile

Asn

Leu

His

Asn

Vat

Thr

Lys

Tyr

Leu

450

455

460

Arg

Leu

Pro

Tyr

Pro

Phe

Ser

Asn

Lys

Gin

Val

Asp

Lys

Tyr

Leu

465

470

475

480

Arg

Pro

Leu

Cly

Pro

His

cly

Leu

Ser

Lys

Ser

Val

Gin

Leu

Asn

485

490

495

Cly

Leu

Thr

Leu

Lys

Het

Val

Asp

Gin

Thr

Leu

Pro

Leu

Het

500

505

510

Glu

Lys

Pro

Leu

Arg

Pro

Gly

Ser

Leu

Gly

Leu

Pro

Ala

Phe

Ser

515

520

525

Tyr

Ser

Phe

Val

Ile

Arg

Asn

Ala

Lys

Val

Ala

cys

Ile

530

535

540

543

(2) Informace pro SEQ ID NO: 11:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 1718 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární

xi)

sekvence

ID NO:

•

AGA

GCT

TTC

GAC

TCT

CCG

CTG

CGC

GGC

AGC

TGG

CGG

GGG

GAG

CAG

CCA

GGT

GAG

CCC

AAG

ATG

CTG

CGC

TCG

AAG

CCT

GCG

CTG

CCG

CTG

ATG

CTG

110

Met

Leu

Arg

Ser

Lys

Pro

Ala

Leu

Pro

Leu

Het

Leu

CTC

CTG

GGG

CCG

CTG

CGT

CCC

CTC

TCC

CCT

CGC

GCC

CTG

CCC

CGA

CCT

158

Leu

Gly

Pro

Leu

Gly

Pro

Leu

Ser

Pro

Gly

Ala

Leu

Pro

Arg

Pro

GCG

CAA

GCA

CAG

GAC

GTC

GTG

GAC

CTG

GAC

TTC

ACC

CAG

GAG

CCG

206

Ala

Gin

Ala

Gin

Asp

Val

Asp

Leu

Asp

Phe

Thr

Gin

Glu

Pro

CTG

CAC

CTG

AGC

CCC

TCG

TTC

CTG

TCC

GTC

ACC

ATT

GAC

GCC

AAC

254

Leu

His

Leu

Val

Ser

Pro

Ser

Phe

Leu

Ser

Val

Thr

Ile

Asp

Ala

Asn

CTG

GCC

ACG

GAC

CCG

CGG

TTC

CTC

ATC

CTC

CTG

GGT

TCT

CCA

AAG

CTT

302

Leu

Ala

Thr

Asp

Pro

Arg

Phe

'Leu

tle

Leu

Gly

Ser

Pro

lys

Leu

CGT

ACC

TTG

GCC

AGA

GGC

TTG

TCT

CCT

CCG

TAC

CTG

AGG

TTT

CGT

GGC

350

Arg

Thr

Leu

Ala

Arg

Gly

Leu

Ser

Pro

Ala

Tyr

Leu

Arg

Phe

Gly

ACC

AAG

ACA

GAC

TTC

CTA

ATT

TTC

GAT

CCC

AAG

GAA

TCA

ACC

TTT

398

Thr

Lys

Thr

Asp

Phe

Leu

Ile

Phe

Asp

Pro

lys

iys

Glu

Ser

Thr

Phe

100

105

110

GAA

GAG

ACA

AGT

TAC

TCG

CAA

TCT

CAA

GTC

AAC

CAG

GAT

ATT

TGC

AAA

446

Glu

Arg

Ser

Tyr

Trp

Gin

Ser

Gin

Val

Asn

Gin

Asp

Ile

Cys

Lys

115

120

125

TAT

GGA

tcc

ATC

CCT

GAT

GTG

GAG

AAG

TTA

CGG

TTG

GAA

TGG

494

Tyr

cly

Ser

Ile

Pro

Asp

Val

Glu

Lys

Leu

Arg

Leu

Glu

Trp

130

135

140

CCC

TAC

CAG

GAG

CAA

TTG

CTA

CTC

CGA

GAA

CAC

TAC

CAG

AAA

AAG

TTC

542

Pro

Tyr

Gin

Glu

Gin

Leu

Arg

Glu

His

Tyr

Gin

lys

Lys

Phe

145

•

150

155

160

AAG

AAC

AGC

ACC

TAC

TCA

AGA

AGC

TCT

GTA

GAT

GTG

CTA

TAC

ACT

TTT

590

Lys

Asn

Ser

Thr

Tyr

Ser

Arg

Ser

Val

Asp

Val

Leu

Tyr

Thr

Phe

165

170

175

GCA

AAC

TGC

TCA

GGA

CTG

GAC

TTG

ATC

TTT

GGC

CTA

AAT

GCG

TTA

638

Ala

Asn

cys

Ser

cly

Leu

Asp

Leu

Ile

Phe

cly

Leu

Asn

Ala

Leu

leu

180

185

190

AGA

ACA

CCA

CAT

TTG

CAG

TGG

AAC

AGT

TCT

AAT

GCT

CAG

TTG

CTC

CTG

686

Arg

Thr

Ala

Asp

Leu

Gin

Trp

Asn

Ser

Asn

Ala

Gin

Leu

195

200

205

GAC

TAC

TGC

TCT

TCC

AAG

GGG

TAT

AAC

ATT

TCT

TGG

GAA

CTA

GGC

AAT

734

Asp

Tyr

cys

Ser

Lys

Gly

Tyr

Asn

Ile

Ser

Trp

Glu

Leu

Gly

Asn

210

215

220

GAA

CCT

AAC

AGT

TTC

CTT

AAG

GCT

GAT

ATT

TTC

ATC

AAT

GGG

TCG

782

Glu

Pro

Asn

Ser

Phe

Leu

! Lys

tys

Ala

Asp

tle

Phe

tle

Asn

Gly

Ser

225

•

230

235

240

CAG TTA

CGA GAA GAT TAT Cly Clu Asp Tyr 245

ATT CAA TTC CAT

AAA CTT CTA AGA AAG TCC

830

Cln

Leu

1le Gin

Leu His 250

Lys Leu Leu

Arg

Lys 255

Ser

ACC

TTC

AAA

AAT

GCA

AAA

CTC

TAT

CGT

CCT

GAT

CTT

GCT

CAC

CCT

CGA

878

Thr

Phe

Lys

Asn

Ala

Lys

Leu

iyr

ciy

Pro

Asp

Vat

Cly Gin

Pro

Arg

260

265

270

ACA·.

AAG

ACC

GCT

AAG

ATG

CTG

AAG

AGC

TTC

CTG

AAG

CCT

GGT

CGA

CAA

926

Arg

Lys

Thr

Ala

Lys

Het

Leu

Lys

Ser

Phe

Leu

Lys

Ala

Cly Cly

Glu

275

280

285

GTG

ATT

GAT

TCA

CTT

ACA

TGG

CAT

CAC

TAC

TAT

TTC

AAT

GGA

CCG

ACT

974

Vat

Ile

Asp

Ser

Val

Thr

Trp

His

Tyr Tyr

Leu

Asn

Cly Arg

Thr

290

295

300

CCT

ACC

ACG

GAA

CAT

TTT

CTA

AAC

CCT

CAT

CTA

TTG

CAC

ATT

TTT

ATT

1019

Ala

Thr

Arg

Glu

Asp

Phe

Leu

Asn

Pro

Asp

Val

Leu

Asp

Ile

Phe

Ile

305

310

315

320

TCA

TCT

CTC

CAA

AAA

CTT

TTC

CAG

GTG

GTT

CAG

AGC

ACC

AGG

CCT

GGC

1067

Ser

Val

Cln

Lys

Val

Phe

Gin Val

Val

Clu

Ser

Thr

Arg

Pro

Cly

325

330

335

AAG

GTC

TGC

TTA

CGA

CAA

ACA

AGC

TCT

GCA

TAT

GCA

GGC

CGA

GCG

1115

tys

Lys

Val

Trp

Leu

Gly

Clu

Thr

Ser

Ala

Tyr Gly Gly Gly Ala

340

345

350

CCC

TTG

CTA

TCC

GAC

ACC

TTT

GCA

GCT

CGC

TTT

ATG

TGG

CTG

CAT

AAA

1163

Pro

Leu

Ser

Asp

Thr

Phe

Ala

Gly

Phe

Het

Trp

Leu

Asp

Lys

355

360

365

TTG

GGC

CTG

TCA

GCC

CGA

ATG

CCA

ATA

CAA

GTG

CTG

ATG

AGG

CAA

CTA

1211

Leu

Cly

Leu

Ser

Ala

Arg

Het

Cly

Ile

Glu

Val

Het

Arg

Gin

Vat

370

375

380

TTC

TTT

CGA

GCA

GGA

AAC

TAC

CAT

TTA

CTG

CAT

CAA

AAC

TTC

GAT

CCT

1259

Phe

Cly Ala

cly

Asn

Tyr

His

Leu

Val

Asp

Clu

Asn

Phe

Asp

Pro

385

390

395

400

TTA

CCT

CAT

TAT

TGG

CTA

TCT

CTT

CTG

TTC

AAG

AAA

TTG

GTC

GGC

ACC

1307

Leu

Pro

Asp Tyr

Trp

Leu

Ser

Leu

Phe

Lys

Leu

Val

Gly

Thr

405

410

415

AAG

CTG

TTA

ATC

CCA

AGC

CTC

CAA

CGT

TCA

AAC

AGA

AGG

AAG

CTT

CCA

1355

Lys

Val

Leu

Ket

Ala

Ser

Val

Cln

cly

Ser

Lys

Arg

Lys

Leu

Arg

420

425

' *”

430

CTA

TAC

CTT

CAT

TGC

ACA

AAC

ACT

GAC

AAT

CCA

AGG

TAT

AAA

GAA

GCA

1403

Val

Tyr

Leu

His

Cys

Thr

Asn

Thr

Asp

Asn

Pro

Arg

Tyr

Lys

Glu

¹ Gly

435

440

445

CAT Asp

TTA Leu 450

ACT Thr

CTG Leu

TAT Tyr

CCC Ala

ATA Ile 455

AAC Asn

CTC Leu

CAT His

AAC Asn

GTC Val 460

ACC Thr

AAG Lys

TAC Tyr

TTG Leu

1451

CGG

TTA

CCC

TAT

CCT

TTT

TCT

AAC

AAG

CAA

GTG

GAT

AAA

TAC

CTT

CTA

1499

Arg

Leu

Pro

Tyr

Pro

Phe

Ser

Asn

Lys

Cln

Val

Asp Lys

Tyr

Leu

465

470

475

480

AGA

CCT

TTG

GGA

CCT

CAT

CGA

TTA

CTT

TCC

AAA

TCT

GTC

CAA

CTC

AAT

1547

Arg

Pro

Leů

cly

Pro

His

Cly

Leu

Ser

Lys

Ser

Val

Cln

Leu

Asn

•

485

490

495

CGT

CTA

ACT

CTA

AAG

ATG

GTG

CAT

GAT

CAA

ACC

TTG

CCA

CCT

TTA

ATG

1595

Cly

Leu

Thr

Leu

Lys

Het

Val

Asp Asp

Cln

Thr

Leu

Pro

Leu

Het

500

505

510

GAA

AAA

CCT

CTC

CGG

CCA

GGA

AGT

TCA

CTG

CGC

TTG

CCA

CCT

TTC

TCA

1643

Glu

Lys

Pro

Leu Arg

Pro

Gly

Ser

Leu

cly

Leu

Pro

Ala

Phe

Ser

515

520

525

TAT

AGT

TTT

GTG

ATA

AGA

AAT

CCC

AAA

GTT

GCT

CCT

TGC

ATC

TCA

1691

Tyr

Ser

Phe

Val

Ile

Arg

Asn

Ala

Lys

Val

Ala

cys

tle

530

535

540

543

AAA TAA AAT ATA CTA CTC CTG ACA CTC

1718 • · • · · · • · · · (2) Informace pro SEQ ID NO: 12:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 824 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence:SEQ

ID NO: 12:

CTCGCAAGAA GGTCTGGTTG TGTCCAACAC CTTTCCAGCT TGGGCATAGA AGTCGTGATG ATGAAAACTT TGAGCCTTTA GTCCCAGGGT GTTACTGTCA TCCACTGCAC TAACGTCTAT TCAACCTCCA TAATGTCACC TCGATACGTA CCTTCTGAAG TGAACGGTCA AATTCTGAAG CTCTCCCCGC AGGAAGTGCA GAAATGCCAA AATCGCTGCT AAGCCGAGGG GGGTGTTATT GAGTTCCAGA GCTTCGGGAG CTCTAAGAAG AATACTGCAG

GGAGAGACGA GCTCAGCTTA GGCTTTATGT CCCTGGATAA AGGCAGGTGT TCTTCGGAGC CCTGATTACT GGCTCTCTCT AGAGTGAAAG GCCCAGACAG CACCCACGAT ATCAGGAAGG AAGCACTTGA AGGTACCGCC CCTTCGGGGC CGGATGGATT ATGGTGGATG AGCAGACCCT CTAAGCCTGC CTGCCTTTTC TGTATATGAA AATAAAAGGC CATAAAACAA AACCCTAGTT GGTGGGGTAC ACTTCAGTAT GTGGTGACAG TTAATAGCAC

CGGTGGCGGT GCACCCTTGC £0 ATTGGGCCTG TCAGCCCAGA 120 AGGCAACTAC CACTTAGTGG 180 TCTGTTCAAG AÁACTGGTAG 240 GAGCAAACTC CGAGTGTATC 300 AGATCTAACT CTGTATGTCC 360 TCCGTTGTTC AGGAAACCAG 420 ACTTTCCAAA TCTGTCCAAC 480 GCCAGCTTTG ACAGAAAAAC 540 CTATGGTTTT TTTGTCATAA 600 ATACGGTACC CCTGAGACAA 660 TAGGAGGCCA CCTCCTTGCC 720 TACATTCAGT GTGGTGTTCT 780 TGTG 824 (2) Informace pro SEQ ID NO: 13:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 1899 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 13:

GGGAAAGCGA GCAAGGAAGT AGGAGAGAGC CGGGCAGGCG GGGCGGGGTT GGATTGGGAG 60 CAGTGGGAGG GATGCAGAAG AGGAGTGGGA GGGATGGAGG GCGCAGTGGG AGGGGTGAGG 120 ACGCGTAACG GGGCGGAGGA AAGGAGAAAA GGGCGCTGGG GCTCGGCGGG AGGAAGTGCT 180 AGAGCTCTCG ACTCTCCGCT CCGCGGCAGC TGGCGGGGGG AGCAGCCAGG TGAGCCCAAG 240 ATGCTGCTGC GCTCGAAGCC TGCGCTGCCG CCGCCGCTGA TGCTGCTGCT CCTGGGGCCG 300 CTGGGTCCCC TCTCCCCTGG CGCCCTGCCC CGACCTGCGC AAGCACAGGA CGTCGTGGAC 360 CTCGACTTCT TCACCCAGGA GCCGCTGCAC CTGGTGAGCC CCTCGTTCCT GTCCGTCACC 420 ATTGACGCCA ACCTGGCCAC GGACCCGCGG TTCCTCATCC TCCTGGGTTC TCCAAAGCTT 480 CGTACCTTGG CCAGAGGCTT GTCTCCTGCG TACCTGAGGT TTGGTGGCAC CAAGACAGAC 540 TICCTAATTT TCGATCCCAA GAAGGAATCA ACCTTTGAAG AGAGAAGTTA CTGGCAATCT 600 CAAGTCAACC AGGATATTTG CAAATATGGA TCCATCCCTC CTGATGTGGA GGAGAAGTTA 660 CGGTIGGAAT GCCCCTACCA GGAGCAATTG CTACTCCGAG AACACTACCA GAAAAAGTTC 720 • · · · • ·

AACAACACCA CCTACTCAAG AAGCTCTGTA GATGTGCTAT ACACTTTTGC AAACTGCTCA 780 GGACTGGACT TGATCTTTGG CCTAAATGCG TTATTAAGAA CAGCAGATTT GCAGTGGAAC 840 AGTTCTAATG CTCAGTTGCT CCTGGACTAC TGCTCTTCCA AGGGGTATAA CATTTCTTGG 900 GAACTAGGCA ATGAACCTAA CAGTTTCCTT AAGAAGGCTG ATATTTTCAT CAATGGGTCG 960 CAGTTAGGAG AAGATTATAT TCAATTGCAT AAACTTCTAA GAAAGTCCAC CTTCAAAAAT 1020 GCAAAACTCT ATGGTCCTGA TGTTGGTCAG CCTCGAAGAA AGACGGCTAA GATGCTGAAG 1080 AGCTTCCTGA AGGCTGGTGG AGAAGTGATT GATTCAGTTA CATGGCATCA CTACTATTTG 1140 AATGGACGGA CTGCTACCAG GGAAGATTTT CTAAACCCTG ATGTATTGGA CATTTTTATT 1200 TCATCTGTGC AAAAAGITTT CCAGGTGGTT GAGAGCACCA GGCCTGGCAA GAAGGTCTGG 1260 TTAGGAGAAA CAAGCTCTGC ATATGGAGGC GGAGCGCCCT TGCTATCCGA CACCTTTGCA 1320 GCTGGCTTTA TGTGGCTGGA TAAATTGGGC CTGTCAGCCC GAATGGGAAT AGAAGTGGTG 1380 ATGAGGCAAG TATTCTTTGG AGCAGGAAAC TACCATTTAG TGGATGAAAA CTTCGATCCT 1440 TTACCTGATT ATTGGCTATC TCTTCTGTTC AAGAAATTGG TGGGCACCAA GGTGTTAATG 1500 GCAAGCGTGC AAGGTTCAAA GAGAAGGAAG CTTCGAGTAT ACCTTCATTG CACAAACACT 1560 GACAATCCAA GGTATAAAGA AGGAGATTTA ACTCTGTATC CCATAAACCT CCATAACGTC 1620 ACCAAGTACT TGCGGTTACC CTATCCTTTT TCTAACAAGC AAGTGGATAA ATACCTTCTA 1680 AGACCTTTGG GACCICATGG ATTACTTTCC AAATCTGTCC AACTCAATGG TCTAACTCTA 1740 AAGATGGTGG ATGATCAAAC CTTGCCACCT TTAATGGAAA AACCICTCCG GCCAGGAAGT 1800 TCACTGGGCT TGCCAGCTTT CTCATATAGT TTTTTTGTGA TAAGAAATGC CAAAGTTGCT 1860 GCTTGCATCT GAAAATAAAA TATACTAGTC CTGACACTG 1899 (2) Informace pro SEQ ID NO: 14:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 592 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 14:

Met Glu Gly Ala

Vat 5

Gly Gly Val Arg Arg Arg Asn Gly Ala Glu

Glu

Arg

Lys

Gly Arg Trp Gly

Ser

Ala Gly Gly

Ser

Ala

Arg

Ala

Leu

Asp

Ser

Pro

Leu

Arg

Gly

Ser

Trp Arg Gly

Gtu

Gin

Pro

Gly Glu

Pro

Lys

Het

Leu

Arg

Ser

Lys

Pro

Ala

Leu

Pro

•-50

Pro

Leu

Met

Leu

Cly

Pro

Leu

Gly

Pro

Leu

Ser

Pro

Gty

Ala

Leu

Pro

Arg

Pro

Ala

Gtn

Ala

Gin

Asp

Vat

Val

Asp

Leu

Asp

Phe

Thr

Gin

Glu

Pro

Leu

His

Leu

Val

Ser

Pro

Ser

Phe

100

105

Leu

Ser

Val

Thr

Ile

Asp

Ala

Asn

Lou

Ala

Thr Asp

Pro

Arg

Phe

110

115

120

Leu

Ile

Leu

cly

Ser

Pro

Lys

Leu

Arg

Thr

Leu

Ala

Arg Gly

125

130

135

Leu

Ser

Pro

Ala

Tyr

Leu

Arg

Phe

Gly Gly

Thr

Lys

Thr

Asp

Phe

140

145

150

Leu

Ile

Phe

Asp

Pro

Lys

Glu

Ser

Thr

Phe

Glu

Arg

Ser

155

160

165

Tyr

Trp

Gin

Ser

Gin

Val

Asn

Gin

Asp

Ile

Cys

Lys Tyr Gly

Ser

170

175

180

Ile

Pro

Asp

Val

Glu

Lys

Leu

Arg

Leu

Glu

Trp

Pro Tyr

185

190

195

Gin

Glu

Gin

Leu

Arg

Glu

His

Tyr

Gtn

Lys

Phe

lys

200

205

210

Asn

Ser

Thr

Tyr

Ser

Arg

Ser

Val

Asp

Val

Leu

Tyr

Thr

Phe

215

220

225

Ala

Asn

cys

Ser

Gly

Leu

Asp

Leu

Ile

Phe

Gly

Leu

Asn

Ala

Leu

230

235

240

Leu

Arg

Thr

Ala

Asp

Leu

Gin

Trp

Asn

Ser

Asn

Ala

Gin

Leu

245

250

255

Leu

Asp

Tyr

Cys

Ser

Lys

Gly Tyr

Asn

lte

Ser

Trp

Gtu

260

265

270

Leu

cly

Asn

Glu

Pro

Asn

Ser

Phe

Leu Lys

Lys

Ala

Asp

Ile

Phe

275

280

285

Ile

Asn

Gly

Ser

Gin

Leu

cly

Glu

Asp Tyr

Ile

Gin

Leu

His

lys

290

295

300

Leu

Arg

Lys

Ser

Thr

Phe

Lys

Asn

Ala

Lys

Leu

Tyr

Gly

Pro

305

310

315

Asp

Val

Cly

Gin

Pro

Arg

Lys

Thr

Ala

Lys

Met

Leu

Lys

Ser

320

325

330

Phe

Leu

Lys

Ala

Gly Gly

Glu

Val

Ile

Asp

Ser

Val

Thr

Trp

His

335

340

345

His

Tyr Tyr

Leu Asn Gly 350

Arg Thr Ala Thr Arg Glu Asp 355

Phe

Leu 360

Asn

Pro

Asp

Val

Leu

Asp

Ile

Phe

Ile

Ser

Val

Gin

Lys

Val

365

370

375

Phe

Gin

Val

Glu

Ser

Thr

Arg

Pro

Gly Lys

Lys

Val

Trp

Leu

380

385

390

Gly

Glu

Thr

Ser

Ala

Tyr

Gly Gly Gly Ala

Pro

Leu

Ser

395

400

405

Asp

Thr

Phe

Ala

cly

Phe

Het

Trp Leu Asp Lys

Leu

Gly

Leu

410

415

420

Ser

Ala

Arg

Het

Gly

Ile

Glu

Val

Het

Arg

Gin Vat

Phe

425

430

435

Civ Ala Gly Asn Tyr

His

Leu

Val

Asp

Glu

Asn

Phe Asp

Pro

Leu

440

445

450

Pro

Asp Tyr

Trp

Leu

Ser

Leu

Phe

Lys

Leu Val

Gly Thr

455

460

465

Lys

Val

Leu

Het

Ala

Ser

Val

Gin

Gly

Ser

Lys Arg Arg

Lys

Leu

470

475

480

Arg

Val

Tyr

Leu

His

Cys

Thr

Asn

Thr

Asp

Asn

Pro

Arg

Tyr

Lys

485

490

495

Glu

Gly Asp

Leu

Thr

Leu

Tyr

Ala

Ile

Asn

Leu

His

Asn

Val

Thr

500

505

510

Lys

Tyr

Leu

Arg

Leu 515 Arg

Pro

Tyr

Pro

Phe

Ser 520 His

Asn

Lys

Gin

Val

Asp 525

Lys

Tyr

Leu

Pro

Leu

cly

Pro

Gly

Leu

Ser

Lys

530

535

540

Ser

Val

Gin

Leu

Asn

cly

Leu

Thr

Leu

Lys

Het

Vat

Asp Asp

Gin

545

550

555

Thr

Leu

Pro

Leu

Het

Glu

tys

Pro

Leu

Arg

Pro

Cly Ser

Ser

560

565

570

Leu

cly

Leu

Pro

Ala

Phe

Ser

Tyr

Ser

Phe

Val

Ile Arg

Asn

575

580

585

Ala

Lys

Val

Ala

Cys

Ile

590

592

(2) Informace pro SEQ ID NO: 15:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 1899 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 15:

-GGC AAA GCG AGC AAC GAA GTA CGA CAG AGC CGG GCA GGC CGC GCG GGG

3 48 93 138

TTG ATC Het

GAT GAG Glu

TGG GAG CAG TGG GAG GGA TGC AGA ACA GGA GTG GGA GGG

GGC GCA Gly Ala

GTG GGA GGG GTG

AGG AGG CGT AAC GGG GCG

GAG Glu 15

Val 5

Gly Gly Val

Arg

Arg 10

Arg

Asn

Gly

Ala

GAA

AGG

AGA

AAA

GGG

CGC

TGG

GGC

TCG

GCG

GGA

AGT

GCT

AGA

183

Glu

Arg

Lys

Gly Arg

Trp Gly

Ser

Ala

Gly Gly

Ser

Ala

Arg

GCT

CTC

GAC

TCT

CCG

CTG

CGC

GGC

AGC

TGG

CGG

GAG

CAG

CCA

228

Ala

Leu

Asp

Ser

Pro

Leu

Arg

Gly

Ser

Trp Arg

Gly Glu

Gin

Pro

CGT

GAG

CCC

AAG

ATG

CTG

CGC

TCG

AAG

CCT

GCG

CTG

CCG

273

cly

Glu

Pro

Lys

Het

Leu

Arg

Ser

Lys

Pro

Ala

Leu

Pro

CCG

CTG

ATG

CTG

CTC

CTG

GGG

CCG

CTG

GGT

CCC

CTc

TCC

CCT

318

Pro

Leu

Het

Leu

Gly

Pro

Leu

Gly

Pro

Leu

Ser

Pro

GGC

GCC

CTG

CCC

CGA

CCT

GCG

CAA

GCA

CAG

GAC

GTc

CTG

CAC

CTG

363

Cly

Ala

Leu

Pro

Arg

Pro

Ala

Gin

Ala

Gin

Asp

Val

Asp

Leu

GAC

TTc

TTC

ACC

CAG

GAG

CCC

CTG

CAC

CTG

GTG

AGC

CCC

TCG

TTC

408

Asp

Phe

Thr

Gin

Glu

Pro

leu

His

Leu Val

Ser

Pro

Ser

Phe

100

105

CTG TCC CTC ACC ATT CAC CCC AAC CTG CCC ACC CAC CCC CCC TTC 453 • « «· · * · · · · · · • · · · · · ·*-♦ · · ·· · · · 9 · · 9 ·· · ·· · · ·· · · ·· * ·· ·· « · »· 9 9 9 9

Leu

Ser

Val

Thr

Ile

Asp

Ala

Asn

Leu

Ala

Thr

Asp

Pro

Arg

Phe

115

120

CIC

ATC

CTC

CTG

CGT

TCT

CCA

AAC

CTT

CCT

ACC

TTG

CCC

AGA

GGC

498

Leu

lte

Leu

cly

Ser

Pro

Lys

Leu

Arg

Thr

Leu

Ala

Arg

Gly

125

130

135

TCT

CCT

GCG

TAC

CTG

AGC

TTT

CGT

GCC

ACC

AAC

ACA

GAC

TTC

543

Leu

Ser

Pro

Ala

Tyr

Leu

Arg

Phe

Cly

Gly

Thr

Lys

Thr

Asp

Phe

«0

145

150

CTA

ATT

TTC

CAT

CCC

AAG

AAC

GAA

TCA

ACC

TTT

GAA

GAG

ACA

ACT

588

Leu

lte

Phe

Asp

Pro

Lys

Clu

Ser

Thr

Phe

Clu

Arg

Ser

155

160

165

TAC

TCG

CAA

TCT

CAA

CTC

AAC

CAG

CAT

ATT

TGC

AAA

TAT

CGA

TCC

633

Tyr

Trp

Cln

Ser

Gin

Val

Asn

Cln

Asp

Ile

Cys

Lys

Tyr

Gly

Ser

170

175

180

ATC

CCT

CAT

CTC

CAC

GAC

AAG

TTA

CCG

TTG

CAA

TGG

CCC

TAC

678

Ite

Pro

Asp

Val

Clu

Lys

Leu

Arg

Leu

GlU

Trp

Pro

Tyr

185

190

195

CAC

CAG

CAA

TTG

CTA

CTC

CCA

CAA

CAC

TAC

CAG

AAA

AAG

TTC

AAG

723

Gin

Clu

Cln

Leu

Arg

Glu

His

Tyr

Cln

Lys

Phe

Lys

200

205

210

AAC

ACC

TAC

TCA

AGA

AGC

TCT

CTA

CAT

CTC

CTA

TAC

ACT

TTT

768

Asn

Ser

Thr

Tyr

Ser

Arg

Ser

Val

Asp

Vat

Leu

Tyr

Thr

Phe

215

220

225

CCA

AAC

TCC

TCA

CCA

CTG

GAC

TTG

ATC

TTT

CGC

CTA

AAT

CCC

TTA

813

Ala

Asn

cys

Ser

Cly

Leu

Asp

Leu

Ile

Phe

Cly

Leu

Asn

Ala

Leu

230

235

240

TTA

AGA

ACA

GCA

CAT

TTG

CAG

TCG

AAC

AGT

TCT

AAT

GCT

CAG

TTC

858

Leu

Arg

Thr

Ala

Asp

Leu

Glri

Trp

Asn

Ser

Asn

Ala

Gin

Leu

245

250

255

CTC

CAC

TAC

TGC

TCT

TCC

AAG

CGC

TAT

AAC

ATT

TCT

TCG

CAA

903

Leu

Asp

Tyr

Cys

Ser

Lys

Cly

Tyr

Asn

Ile

Ser

Trp

Glu

260

265

270

CTA

CGC

AAT

CAA

CCT

AAC

AGT

TTC

CTT

AAG

CCT

CAT

ATT

TTC

948

Leu

Cly

Asn

Clu

Pro

Asn

Ser

Phe

Leu

Lys

Ala

Asp

Ile

Phe

275

280

285

ATC

AAT

CGG

TCG

CAC

TTA

GGA

GAA

GAT

TAT

ATT

CAA

TTC

CAT

AAA

993

tle

Asn

Gly

Ser

Gtn

Leu

Oly

Glu

Asp

Tyr

Ile

Cln

Leu

His

Lys

290

295

300

CTT

CTA

AGA

AAC

TCC

ACC

TTC

AAA

AAT

CCA

AAA

CTC

TAT

GGT

CCT

1033

Leu

Arg

Lys

Ser

Thr

Phe

Lys

Asn

Ala

Lys

Leu

Tyr

Gly

Pro

305

310

315

GAT

CTT

CGT

CAC

CCT

CCA

AGA

AAG

ACC

CCT

AAG

ATG

CTG

AAG

AGC

1083

Asp

Val

Cly

Gin

Pro

Arg

Lys

Thr

Ala

Lys

Ket

Leu

Lys

Ser

320

325

330

TTC

CTG

AAG

GCT

GGT

GCA

GAA

GTG

ATT

GAT

TCA

CTT

ACA

TGG

CAT

1128

Phe

Leu

Lys

Ala

Gly

oiy

Olu

Val

Ile

Asp

Ser

Val

Thr

Trp

His

335

340

345

CAC

TAC

TAT

TTG

AAT

CGA

CGG

ACT

GCT

ACC

AGG

CAA

GAT

TTT

CTA

1173

His

Tyr

Leu

Asn

cly

Arg

Thr

Ala

Thr

Arg

Clu

Asp

Phe

Leu

350

355

360

AAC

CCT

CAT

CTA

TTG

CAC

ATT

TTT

ATT

TCA

TCT

CTC

CAA

AAA

GT1

1218

Asn

Pro

Asp

Val

Leu

Asp

1 le

Phe

Ite

Ser

Val

Gin

tys

Val

365

370

375

TTC

CAC

CTG

GTT

CAC

ACC

CCT

GGC

AAG

CTC

TGG

TTA

1263

Phe

Cln

Val

Glu

Ser

Thr

Arg

Pro

Gly

Lys

Val

Trp

Leu

380

385

390

• · »

9 9 ·

CCA CAA Cly Clu

ACA Thr

ACC TCT CCA TAT CCA CGC CGA CCC CCC TTG CTA TCC

1308

Ser

Ser Ala Tyr Cly Cly 395

Cly <00

Ala

Pro Leu

Leu

Ser <05

GAC

ACC

TTT

GCA

CCT

CGC

TTT

ATG

TCG CTG GAT

AAA

TTG

GGC

CTG

1353

Asp

Thr

Phe

Ala

Gly Phe

Het

Trp Leu Asp Lys

Leu

Gly Leu

410

<15

<20

TCA

CCC

CCA

ATC

GGA

ata'

gAA

CTC

GTC

ATG

AGG

CAA

GTA

TTC

TTT

1398

Ser

Ala

Arg

Het

Gly

Ile

Clu

Val

Het

Arg

Gin Val

Phe

<25

<30

<35

CGA

CCA

GGA

AAC

TAC

CAT

TTA

GTG

CAT

GAA

AAC

TTC

GAT

CCT

TTA

1«3

Cly Ala

cly

Asn

Tyr

His

Leu

Val

Asp

Glu

Asn

Phe

Asp

Pro

Leu

«0

«5

<50

CCT

CAT

TAT

TGC

CTA

TCT

CTT

CTG

TTC

AAG

AAA

TTG

CTG

GGC

ACC

K88

Pro

Asp Tyr

Trp

Leu

Ser

Leu

Phe

Lys

Leu

Val

Cly

Thr

<55

<60

<65

AAG

CTC

TTA

ATC

GCA

ACC

CTG

CAA

CGT

TCA

AAG

AGA

AGG

AAG

CTT

1533

Lys

Vat

Leu

Het

Ala

Ser

Val

Cln

Cly

Ser

Lys

Arg

Lys

Leu

<70

<75

<80

CCA

CIA

TAC

CTT

CAT

TGC

ACA

AAC

ACT

GAC

AAT

CCA

AGG

TAT

AAA

1578

Arg

Val

Tyr

Leu

His

cys

Thr

Asn

Thr

Asp

Asn

Pro

Arg

Tyr

Lys

<85

<90

<95

CAA

CGA

CAT

TTA

ACT

CTC

TAT

CCC

ATA AAC

CTC

CAT

AAC

CTC

ACC

1623

Clu

Gly Asp

Leu

Thr

Leu

Tyr

Ala

Ile

Asn

Leu

His

Asn

Val

Thr

500

505

510

AAG

TAC

TTC

CCG

TTA

CCC

TAT

CCT

TTT

TCT

AAC

AAG

CAA

CTG

GAT

1668

Lys

Tyr

Leu

Arg

Leu

Pro

Tyr

Pro

Phe

Ser

Asn

Lys

Gin Val

Asp

515

520

525

AAA

TAC

CTT

CTA

ACA

CCT

TTG

GGA

CCT

CAT

GGA

TTA

CTT

TCC

AAA

1713

Lys

Tyr

Leu

Leu Arg

Pro

Leu

cly

Pro

His

cly

Leu

Ser

Lys

530

535

5<0

TCT

CTC

CAA

CTC

AAT

CCT

CTA

ACT

CTA

AAG

ATG

CTG

CAT

CAA

1758

Ser

Val

Gin

Leu

Asn

Gly

Leu

Thr

Leu

Lys

Het

Val

Asp Asp

Gin

5<5

550

555

ACC

TTG

CCA

CCT

TTA ATC

CAA

AAA

CCT

CTC

CGG

CCA

AGT

TCA

1803

Thr

Leu

Pro

Leu

Het

Glu

Lys

Pro

Leu Arg

Pro

Cly

Ser

560

565

570

CTC

GGC

TTC

CCA

GCT

TTC

TCA

TAT

AGT

TTT

GTG

ATA

AGA AAT

1848

Leu

cly

Leu

Pro

Ala

Phe

Ser

Tyr

Ser

Phe

Val

Ile

Arg Asn

575

580

585

GCC

AAA

GTT

CCT

GCT

TGC

ATC

TCA

AAA

TAA

AAT

ATA

CTA

GTC

CTG

1893

Ala

Lys

Val

Ala

Cys

Ile

590

592

ACA

CTC

1899

(2) Informace pro SEQ ID NO: 16:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 594 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární • » • r · · (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 16:

ATTACTATAG GGCACGCGTC GTCGACGGCC CGGGCTGGTA TTGTCTTAAT GAGAAGTTGA 60 TAAAGAATTT TGGGTGGTTG ATCTCTTTCC AGCTGCAGTT TAGCGTATGC TGAGGCCAGA 120 TTTTTTCAGG CAAAAGTAAA ATACCTCAGA AACTGCCTGG CCAGAGGACA ATCAGATTTT 180 GGCTGGCTCA AGTGACAAGC AAGTGTTTAT AAGCTAGATG CGAGAGGAAG GGATCAATAC 240 TCCATTGGAC GCTTTACTCG ACGGTCAGAC GGATACCCGG CGCCATCAGA ATGGGATCTG 300 GGAGTCGGAA ACGCTCGGTT CCCACGAGAG CGCGCAGAAC ACGTGCGTCA GGAAGCCTGG 360 TCCGGGATGC CCAGCGCTGC TCCCCGGGCG CTCCTCCCCG GGCGCTCCTC CCCAGGCCTC 420 CCOGCCGCTT GGATCCCGGC CATCTCCGCA CCCTTCAAGT GGGTGTGGGT GATTICGTAA 480 GTGAACGTGA CCGCCACCGG GGGGAAAGCG AGCAAGGAAG TAGGAGAGAG CCGGGCAGGC 540 GGGGCGGGGT TGGATTGGGA GCAGTGGGAG GGATGCAGAA GAGGAGTGGG AGGG 594 (2) Informace pro SEQ ID NO: 17:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 21 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 17:

CCCCAGGAGC AGCAGCATCA G 21 (2) Informace pro SEQ ID NO: 18:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 21 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 18:

AGGCTTCGAG CGCAGCAGCA T 21 (2) Informace pro SEQ ID NO: 19:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 22 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 19:

GTAATACGAC TCACTATAGG GC 22 (2) Informace pro SEQ ID NO: 20:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 19 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 20:

ACTATAGGCC ACGCGTGGT 19 (2) Informace pro SEQ ID NO: 21:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 21 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 21:

CTTGGGCTCA CCTGGCTGCT C 21 (2) Informace pro SEQ ID NO: 22:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 23 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 22:

AGCTCTGTAG ATGTGCTATA CAC 23 (2) Informace pro SEQ ID NO: 23:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 22 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 23:

GCATCTTAGC CGTCTTTCTT CG 22

Claims (58)

Hide Dependent

1. Polynukleotidový fragment obsahující polynukleotidovou sekvenci kódující polypeptid mající heparanasovou katalytickou aktivitu, kde uvedený polypeptid má alespoň 70% homologii se SEQ ID NO: 10 nebo 14, kde uvedená homologie je stanovena za použití standartních parametrů softwarového balíčku pro analýzu DNA sekvence, který byl vyvinut Genetic Computer Group (GCG) na University of Wisconsin.

2. Polynukleotidový fragment podle nároku 1, ve kterém uvedená polynukleotidová sekvence obsahuje nukleotidy 63-1691 SEQ ID NO:

9 nebo nukleotidy 139-1869 SEQ ID NO: 13.

3. Polynukleotidový fragment podle nároku 1, ve kterém uvedená polynukleotidová sekvence obsahuje nukleotidy 63-721 SEQ ID NO:

4. Polynukleotidový fragment podle nároku 1, kterým je polynukleotid popsaný v SEQ ID NO: 9 nebo 13.

5. Polynukleotidový fragment podle nároku 1, ve kterém uvedená polynukleotidová sekvence obsahuje segment SEQ ID NO: 9 nebo 13, kde uvedený segment kóduje polypeptid mající uvedenou heparanasovou katalytickou aktivitu.

6. Polynukleotidový fragment podle nároku 1, kde uvedený polypeptid obsahuje aminokyselinou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:

10 nebo 14.

7. Polynukleotidový fragment podle nároku 1, kde uvedený polypeptid obsahuje segment SEQ ID NO: 10 nebo 14, kde uvedený segment nese uvedenou heparanasovou katalytickou aktivitu.

8. Polynukleotidový fragment podle nároku 1, kde uvedená polynukleotidová sekvence je -vybrána ze skupiny skládající se z dvouřetězcové DNA, jednořetězcové DNA a RNA.

9. Polynukleotidový fragment obsahující polynukleotidovou sekvenci mající alespoň 70% homologii se SEQ ID NO: 9 nebo 13, kde uvedená homologie je stanovena za použití standartních parametrů softwarového balíčku pro analýzu DNA sekvence, který byl vyvinut Genetic Computer Group (GCG) na University of Wisconsin, kde tato polynukleotidová sekvence kóduje polypeptid mající heparanasovou katalytickou aktivitu.

10. Polynukleotidový fragment podle nároku 9, kde uvedená polynukleotidová sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 9 nebo 13.

11. Vektor obsahující polynukleotidovou sekvenci kódující polypeptid mající heparanasovou katalytickou aktivitu, kde uvedený polypeptid má alespoň 70% homologii se SEQ ID NO: 10 nebo 14, kde uvedená homologie je stanovena za použití standartních parametrů softwarového balíčku pro analýzu DNA sekvence, který byl vyvinut Genetic Computer Group (GCG) na University of Wisconsin.

12. Vektor podle nároku 11, ve kterém uvedená polynukleotidová sekvence obsahuje nukleotidy 63-1691 SEQ ID NO: 9 nebo nukleotidy 139-1869 SEQ ID NO: 13.

13. Vektor podle nároku 11, ve kterém uvedená polynukleotidová sekvence obsahuje nukleotidy 63-721 SEQ ID NO: 9.

14. Vektor podle nároku 11, ve kterém je uvedenou polynukleotidovou sekvencí SEQ ID NO: 9 nebo 13.

15. Vektor podle nároku 11, ve kterém uvedená polynukleotidová sekvence obsahuje segment SEQ ID NO: 9 nebo 13, kde uvedený segment kóduje polypeptid mající uvedenou heparanasovou katalytickou aktivitu.

16. Vektor podle nároku 11, ve kterém uvedený polypeptid obsahuje aminokyselinou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 10 nebo 14.

17. Vektor podle nároku 11, ve kterém uvedený polypeptid obsahuje segment SEQ ID NO: 10 nebo 14, kde uvedený segment nese uvedenou heparanasovou katalytickou aktivitu.

18. Vektor podle nároku 11, ve kterém je uvedená polynukleotidová sekvence vybrána ze skupiny skládající se z dvouřetězcové DNA, jednořetězcové DNA a RNA.

19. Vektor podle nároku 11, kterým je baculovirový vektor.

20. Vektor obsahující polynukleotidovou sekvenci mající alespoň 70% homologii se SEQ ID NO: 9 nebo 13, kde uvedená homologie je stanovena za použití standartních parametrů softwarového balíčku pro analýzu DNA sekvence, který byl vyvinut Genetic Computer Group (GCG) na University of Wisconsin, kde uvedená polynukleotidová sekvence kóduje polypeptid mající heparanasovou katalytickou aktivitu.

21. Vektor podle nároku 20, kde uvedenou polynukleotidovou sekvencí je SEQ ID NO: 9 nebo 13.

22. Hostitelská buňka obsahující exogenní polynukleotidový fragment obsahující polynukleotidovou sekvenci kódující polypeptid mající heparanasovou katalytickou aktivitu, kde uvedený polypeptid má alespoň 70% homologii se SEQ ID NO: 10 nebo • · • · * *

14, kde uvedená homologie je stanovena za použití standartních parametrů softwarového balíčku pro analýzu DNA sekvence, který byl vyvinut Genetic Computer Group (GCG) na University of

Wisconsin.

23. Hostitelská buňka podle nároku 22, kde uvedená polynukleotidová sekvence obsahuje nukleotidy 63-1691 SEQ ID NO: 9 nebo nukleotidy 139-1869 SEQ ID NO: 13.

24. Hostitelská buňka podle nároku 22, kde uvedená polynukleotidová sekvence obsahuje nukleotidy 63-721 SEQ ID NO:

25. Hostitelská buňka podle nároku 22, kde uvedenou polynukleotidovou sekvencí je SEQ ID NO: 9 nebo 13.

26. Hostitelská buňka podle nároku 22, kde uvedená polynukleotidová sekvence obsahuje segment SEQ ID NO: 9 nebo 13, kde uvedený segment kóduje polypeptid mající uvedenou heparanasovou katalytickou aktivitu.

27. Hostitelská buňka podle nároku 22, kde uvedený polypeptid obsahuje aminokyselinou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 10 nebo 14.

28. Hostitelská buňka podle nároku 22, kde uvedený polypeptid obsahuje segment SEQ ID NO: 10 nebo 14, kde uvedený segment nese uvedenou heparanasovou katalytickou aktivitu.

29. Hostitelská buňka podle nároku 22, kde uvedená polynukleotidová sekvence je vybrána ze skupiny skládající se z dvouřetězcové DNA, jednořetězcové DNA a RNA.

♦ ·

30. Hostitelská buňka podle nároku 22, kde uvedenou buňkou je hmyzí buňka.

31. Hostitelská buňka obsahující polynukleotidovou sekvenci mající alespoň 70% homologii se SEQ ID NO: 9 nebo 13, kde uvedená homologie je stanovena za použití standartních parametrů softwarového balíčku pro analýzu DNA sekvence, který byl vyvinut Genetic Computer Group (GCG) na University of Wisconsin, kde uvedená polynukleotidová sekvence kóduje polypeptid mající heparanasovou katalytickou aktivitu.

32. Hostitelská buňka podle nároku 31, kde uvedenou polynukleotidovou sekvencí je SEQ ID NO: 9 nebo 13.

33. Rekombinantní protein obsahující polypeptid mající heparanasovou katalytickou aktivitu, kde uvedený polypeptid má alespoň 70% homologii se SEQ ID NO: 10 nebo 14, kde uvedená homologie je stanovena za použití standartních parametrů softwarového balíčku pro analýzu DNA sekvence, který byl vyvinut Genetic Computer Group (GCG) na University of Wisconsin.

34. Rekombinantní protein podle nároku 33, kde uvedený polypeptid obsahuje segment SEQ ID NO: 10 nebo 14.

35. Rekombinantní protein podle nároku 33, kde uvedený polypeptid má sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 10 nebo 14.

36. Aminokyselinová sekvence uvedená v SEQ ID NO: 10 nebo 14.

37. Aminokyselinová sekvence homologní k SEQ ID NO: 10 nebo 14.

38. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku rekombinantní protein obsahující polypeptid mající heparanasovou katalytickou aktivitu, kde uvedený polypeptid má alespoň 70% homologii se SEQ ID NO: 10 nebo 14, kde uvedená homologie je stanovena za použití standartních parametrů softwarového balíčku pro analýzu DNA sekvence, který byl vyvinut Genetic Computer Group (GCG) na University of Wisconsin.

39. Farmaceutický prostředek podle nároku 38 vyznačuj ící se t i m, že uvedený polypeptid obsahuje segment SEQ ID NO: 10 nebo 14.

40. Farmaceutický prostředek podle nároku 38 vyznačuj ící se t i m, že uvedený polypeptid má sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 10 nebo 14.

41. Modulátor růstových faktorů vážících se na heparin, buněčné odpovědi na růstové faktory vážící se na heparin a cytokiny, buněčných interakcí s plasmatickými lipoproteiny, citlivosti buněk na virové, protozoární a bakteriální infekce nebo modulátor desintegrace neurodegenerativních plaků vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku rekombinantní protein obsahující polypeptid mající heparanasovou katalytickou aktivitu, kde uvedený polypeptid má alespoň 70% homologii se SEQ ID NO: 10 nebo 14, kde uvedená homologie je stanovena za použití standartních parametrů softwarového balíčku pro analýzu DNA sekvence, který byl vyvinut Genetic Computer Group (GCG) na University of Wisconsin.

42. Modulátor podle nároku 41 vyznačuj ící se tím, že uvedený polypeptid obsahuje segment SEQ ID NO: 10 nebo 14.

43. Modulátor podle nároku 41 vyznačující se tím, • « · · že uvedený polypeptid má sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 10 nebo 14.

44. Lékařské vybavení vyznačující se tím, že obsahuje lékařský prostředek obsahující jako aktivní složku rekombinantní protein obsahující polypeptid mající heparanasovou katalytickou aktivitu, kde uvedený polypeptid má alespoň 70% homologii se SEQ ID NO: 10 nebo 14, kde uvedená homologie je stanovena za použití standartních parametrů softwarového balíčku pro analýzu DNA sekvence, který byl vyvinut Genetic Computer Group (GCG) na University of Wisconsin.

45. Lékařské vybavení podle nároku 44 vyznačuj ící se tím, že uvedený polypeptid obsahuje segment SEQ ID NO: 10 nebo 14.

46. Lékařské vybavení podle nároku 44 vyznačující se tím, že uvedený polypeptid má sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:

10 nebo 14.

47. Hostitelská buňka exprimující rekombinantní heparanasu, kde uvedená rekombinantní heparanasa má alespoň 70% homologii se SEQ ID NO: 10 nebo 14, kde uvedená homologie je stanovena za použití standartních parametrů softwarového balíčku pro analýzu DNA sekvence, který byl vyvinut Genetic Computer Group (GCG) na University of Wisconsin.

48. Hostitelská buňka podle nároku 47, kde uvedený polypeptid obsahuje segment SEQ ID NO: 10 nebo 14.

49. Hostitelská buňka podle nároku 47, kde uvedený polypeptid má sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 10 nebo 14.

• · • ·

50. Hostitelská buňka podle nároku 47, kde uvedená buňka je hmyzí buňka.

51. Buněčný extrakt nebo kondicionované buněčné medium nebo částečně přečištěný buněčný extrakt nebo kondiconované buněčné medium vyznačující se tím, že obsahuje extrakt nebo medium hostitelských buněk podle jakéhokoliv z nároků 22-32 a 47-50.

52. Vyhledávací systém pro inhibitory heparanasy vyznačující se tím, že obsahuje buněčný extrakt nebo kondicionované buněčné medium nebo částečně přečištěný buněčný extrakt nebo kondiconované buněčné medium podle nároku 51.

53. Vyhledávací systém pro inhibitory heparanasy vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní protein podle jakéhokoliv z nároků 33-35.

54. Systém pro nadměrnou expresi heparanasy vyznačuj ící se t i m, že obsahuje buňky nadměrně exprimující heparanasovou katalytickou aktivitu, kde uvedená heparanasová katalytická aktivita je zprostředkována heparanasou mající alespoň 70% homologii se SEQ ID NO: 10 nebo 14, kde uvedená homologie je stanovena za použití standartních parametrů softwarového balíčku pro analýzu DNA sekvence, který byl vyvinut Genetic Computer Group (GCG) na University of Wisconsin.

55. Systém podle nároku 54 vyznačující se tím, že uvedený polypeptid obsahuje segment SEQ ID NO: 10 nebo 14.

56. Systém podle nároku 54 vyznačuj ící se tím, že uvedeným polypeptidem je SEQ ID NO: 10 nebo 14.

« ·

57. Způsob pro identifikaci chromosomálního regionu obsahujícího gen pro heparanasu v chromosomálním nátěru vyznačuj ící se t i m, že obsahuje kroky:

(a) hybridizaci chromosomálního nátěru značenou polynukleotidovou sondou mající alespoň 70% homologii se SEQ ID NO: 9 nebo 13, kde uvedená homologie je stanovena za použití standartních parametrů softwarového balíčku pro analýzu DNA sekvence, který byl vyvinut Genetic Computer Group (GCG) na University of Wisconsin;

(b) promytí chromosomálního nátěru, za účelem odstranění nehybridizované sondy; a (c) detekci signálu spojeného s uvedenou hybridizovanou značenou polynukleotidovou sondou, kdy detekovaný signál ukazuje chromosomální region nesoucí gen pro heparanasu.

58. Jednořetězcový polynukleotidový fragment obsahující polynukleotidovou sekvenci komplementární k alespoň části polynukleotidové řetězce definovaného nukleotidy 226-721 SEQ ID

Priority And Related Applications

Priority Applications (1)

Application Priority date Filing date Title

CZ2000754A

1998-08-31 1998-08-31 Polynukleotid kódující polypeptid mající heparanasovou aktivitu a jeho exprese v transformovaných buňkách

Applications Claiming Priority (1)

Application Filing date Title

CZ2000754A

1998-08-31 Polynukleotid kódující polypeptid mající heparanasovou aktivitu a jeho exprese v transformovaných buňkách

Legal Events

Date Code Title Description

2000-06-30 PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic

Concepts

Download

Name Image Sections Count Query match

heparanase

title,claims,abstract,description 206 0.000

Heparanase

title,claims,abstract,description 188 0.000

polynucleotide

title,claims,abstract,description 100 0.000

polynucleotide

title,claims,abstract,description 100 0.000

polynucleotide

title,claims,abstract,description 100 0.000

processed proteins & peptides

title,claims,abstract,description 83 0.000

processed proteins & peptides

title,claims,abstract,description 82 0.000

polypeptide

title,claims,abstract,description 80 0.000

effects

title,abstract,description 71 0.000

gene expression

title,description 27 0.000

exhibiting effect

title 1 0.000

vector

claims,abstract,description 25 0.000

Recombinant Fusion Proteins

claims,abstract,description 20 0.000

Recombinant Fusion Proteins

claims,abstract,description 20 0.000

fragment

claims,description 79 0.000

nucleotide group

claims,description 51 0.000

nucleotide

claims,description 49 0.000

catalytic effect

claims,description 43 0.000

heparin

claims,description 37 0.000

heparin

claims,description 37 0.000

DNA

claims,description 34 0.000

Heparin

claims,description 31 0.000

chromosomal effect

claims,description 21 0.000

Nucleic acid sequence

claims,description 20 0.000

binding

claims,description 16 0.000

(ribonucleotides)n+m

claims,description 15 0.000

genetic effect

claims,description 14 0.000

sample

claims,description 14 0.000

alpha amino acid group

claims,description 13 0.000

extract

claims,description 12 0.000

Hexapoda

claims,description 11 0.000

growth factor

claims,description 8 0.000

method

claims,description 8 0.000

Lipoproteins

claims,description 7 0.000

Lipoproteins

claims,description 7 0.000

inhibitor

claims,description 7 0.000

active ingredient

claims,description 6 0.000

conditioned effect

claims,description 6 0.000

overexpression

claims,description 6 0.000

virological effect

claims,description 6 0.000

Bacterial infection

claims,description 5 0.000

Viral infection

claims,description 5 0.000

bacterial infectious disease

claims,description 5 0.000

coating agent

claims,description 5 0.000

coating method

claims,description 5 0.000

pharmaceutical composition

claims,description 5 0.000

Protozoal infections

claims,description 4 0.000

Sequence Analysis

claims,description 4 0.000

cellular interaction

claims,description 4 0.000

complement effect

claims,description 4 0.000

Cytokines

claims,description 3 0.000

Cytokines

claims,description 3 0.000

cellular response

claims,description 3 0.000

mediated effect

claims,description 3 0.000

screening

claims,description 3 0.000

neurodegenerative effect

claims,description 2 0.000

sensitivity

claims,description 2 0.000

washing

claims,description 2 0.000

DNA

claims 6 0.000

Single-Stranded DNA

claims 3 0.000

protein component

claims 1 0.000

standard procedure

claims 1 0.000

Show all concepts from the description section

Data provided by IFI CLAIMS Patent Services