ES2259816T3 - Codificacion polinucleotida de un polipeptido con actividad heparanasa y expresion del mismo en celulas transducidas. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un polinucleótido (hpa) que codifica un polipéptido que presenta una actividad de heparanasa, a vectores que lo comprenden, a células transductadas que expresan la heparanasa, y a una proteína de recombinación que presenta una actividad de heparanasa.

Description

Codificación polinucleótida de un polipéptido con actividad heparanasa y expresión del mismo en células transducidas.

La presente invención se refiere a un polinucleótido, referido de aquí en adelante como hpa, que codifica un polipéptido con actividad heparanasa, vectores que incluyen el mismo y células transducidas que expresan la heparanasa. Además la invención hace referencia a una proteína recombinante con actividad heparanasa.

Heparan sulfato proteoglicanos: Heparan sulfatoproteoglicanos (HSPG) son macromoléculas ubicuas asociadas con la superficie de la célula y la matriz extracelular (MEC) de una amplia variedad de células de tejidos vertebrados e invertebrados (1-4). La estructura básica de HSPG incluye un núcleo de proteína en el que se le unen covalentemente varias cadenas lineales de heparan sulfato. Estas cadenas de polisacáridos están generalmente compuestas por unidades repetidas de disacáridos de ácido hialurónico y D-glucosamina que están sustituidas en diferente extensión por porciones de sulfato unidas a N- y O- y grupos acetilo unidos a N (1-4). Estudios acerca de la implicación de moléculas de la MEC en la adherencia celular, crecimiento y diferenciación revelaron un papel principal de los HSPG en la morfogénesis embrionaria, la angiogénesis, el desarrollo axonal y la reparación tisular (1-5). Los HSPG son componentes distinguidos de los vasos sanguíneos (3). En los vasos sanguíneos grandes se concentran mayoritariamente en las capas íntima y media interna, mientras que en los capilares se encuentran mayoritariamente en la membrana basal subendotelial dónde soportan las células endoteliales en proliferación y migración y estabilizan la estructura de la pared capilar. La habilidad de los HSPG para interaccionar con macromóleculas de la MEC tales cómo colágeno, laminina y fibronectina, y con diferentes sitios de adhesión en membranas plasmáticas sugiere un papel clave de este proteoglicano en el auto-ensamblaje y en la insolubilidad de los componentes de la MEC, así como en la adhesión celular y la locomoción. El fraccionamiento de las cadenas de heparan sulfato (HS) puede en consecuencia resultar en la degradación de las células de la MEC subendoteliales y, así pues, puede jugar un papel decisivo en la extravasación de células sanguíneas. El catabolismo de HS se observa en la inflamación, cicatrización, diabetes, y metástasis cancerosa, sugiriendo que enzimas que degradan HS juegan papeles importantes en procesos patológicos. La actividad heparanasa se ha descrito en células activadas del sistema inmune y en células cancerosas altamente metastásicas (6-8), pero la investigación ha sido obstaculizada por la falta de herramientas biológicas para explorar potenciales papeles causativos de la heparanasa en condiciones patológicas.

Implicación de la Heparanasa en la invasión de células tumorales y metástasis: Células tumorales circulantes retenidas en los lechos capilares de diferentes órganos pueden invadir el recubrimiento endotelial de la célula y degradar su membrana basal subyacente (MB) con el propósito de invadir el(los) tejido(s) extravascular(es) dónde establece metástasis (9-10). Células tumorales metastásicas a menudo se adhieren a, o cerca de, las uniones intercelulares entre células endoteliales adyacentes. A esta adhesión de las células metastásicas le sigue la ruptura de las uniones, la retracción de los bordes de la célula endotelial y la migración a través de la fisura en el endotelio hacia la MB subyacente expuesta (9). Una vez localizadas entre las células endoteliales y la MB, las células invasoras deben degradar las glicoproteínas subendoteliales y proteoglicanos de la MB con el objetivo de migrar fuera del compartimiento vascular. Varias enzimas celulares (pej, colagenasa IV, activador del plasminógeno, catepsina B, elastasa, etc.) se creen involucradas en la degradación de la MB (10). Entre estas enzimas existe una endo-\beta-D-glucuronidasa (heparanasa) la que fracciona el HS en sitios específicos intracatenarios (6, 8, 11). La expresión de una heparanasa de degradación de HS se correlacionó con el potencial metastático de linfoma de ratón (11), fibrosarcoma y células de melanoma (8). Además, se detectaron niveles incrementados de heparanasa en el suero de tumores metastásicos localizados en animales y pacientes con melanoma (8) y en biopsias tumorales de pacientes con
cáncer (12).

El control de la proliferación celular y la progresión tumoral por el microentorno local, centrándose en la interacción de las células con la matriz extracelular (MEC) producida por células endoteliales vasculares y células cultivadas de la córnea, fue investigado previamente por los presentes inventores. Esta MEC cultivada muy parecida al subendotelio in vivo en su apariencia morfológica y composición molecular. Contiene colágenos (mayoritariamente tipo III y IV, con pequeñas cantidades de los tipos I y V), proteoglicanos (mayoritariamente proteoglicanos heparan sulfato y dermatan sulfato, con pequeñas cantidades de proteoglicanos condroitin sulfato), laminina, fibronectina, entactina y elastina (13,14). La capacidad de las células para degradar HS en las MEC cultivadas se estudió permitiendo la interacción de las células con una MEC marcada metabólicamente con sulfato, seguido de un análisis por filtración en gel (Sepharose 6B) de los productos de degradación liberados al medio de cultivo (11). Mientras que los HSPG intactos son eluidos cerca del volumen de vacío de la columna (Kav<0,2, Mr \sim0,5x10^{6}), fragmentos de degradación marcados de cadenas laterales de HS son eluidos más hacia la Vt de la columna (0,5<kav<0,8, Mr =5-7x10^{3}) (11).

El efecto inhibitorio heparanasa de varias especies no-anticoagulantes de heparina que pueden ser de uso potencial en la prevención de la extravasación de células sanguíneas también fue investigado por los presentes inventores. La mejor inhibición de heparanasa se consiguió con variedades de heparina que contienen 16 o más unidades de azúcares y que tienen grupos sulfato en ambas posiciones de N y O. Mientras que la O-desulfatación abolió el efecto inhibidor heparanasa de la heparina, las heparinas O-sulfatadas,y N-acetiladas mantuvieron una elevada actividad inhibitoria, teniendo en cuenta que estas moléculas N-sustituidas tenían un peso molecular de unos 4.000 daltons o más (7). El tratamiento en animales de experimentación con inhibidores de heparanasa (pej., especies de heparina no-anticoagulantes) redujo marcadamente (>90%) la incidencia de metástasis pulmonares inducidas por melanoma B16, carcinoma pulmonar de Lewis y células de adenocarcinoma mamario (7, 8, 16). Fracciones de heparina con alta y baja afinidad para la anti-trombina III presentaron una actividad anti-metastásica elevada comparable, indicando que la actividad inhibitoria heparanasa de la heparina, más que su actividad anticoagulante, juega un papel importante en las propiedades anti-metastásicas del polisacárido (7).

Actividad Heparanasa en la orina de los pacientes con cáncer: En un intento de elucidar más la implicación de la heparanasa en la progresión del tumor y su relevancia en el cáncer humano, se cribaron muestras de orina para comprobar la actividad heparanasa (16a). Se detectó actividad heparanasa en la orina de algún paciente con cáncer, pero no en todos. Se determinaron altos niveles de actividad heparanasa en la orina de pacientes con enfermedad metastásica agresiva y no hubo actividad detectable en la orina de donantes sanos.

La actividad heparanasa también se encontró en la orina del 20% de pacientes normales y con diabetes mellitus insulino-dependiente microalbuminúricos (DMID), probablemente debido a nefropatía diabética, el trastorno aislado más importante que ocasiona fallo renal en adultos.

Posible implicación de la heparanasa en angiogénesis tumoral: Los factores de crecimiento de los fibroblastos son una familia de polipéptidos estructuralmente relacionados caracterizados por su alta afinidad por la heparina (17). Son altamente mitogénicos para células endoteliales vasculares y son, sin duda, los inductores más potentes de neovascularización (17, 18). Los factores de crecimiento de los fibroblastos básicos (bFGF) se extrajeron de la MEC subendotelial producida in vitro (19) y de las membranas basales de la córnea (2O); se sugirió que la MEC puede servir cómo reservorio para el bFGF. Una tinción immunohistoquímica reveló la localización del bFGF en membranas basales de distintos tejidos y vasos sanguíneos (21). A pesar de la presencia ubicua de bFGF en tejidos normales, la proliferación de las células endoteliales es normalmente muy baja, sugiriendo que el bFGF es de alguna manera secuestrado de su lugar de acción. Estudios acerca de la interacción del bFGF con la MEC revelaron que el bFGF se une a los HSPG en la MEC y puede ser liberado en una forma activa por acción de enzimas de degradación HS (15, 20, 22). Se demostró que la actividad heparanasa expresada en plaquetas, mastocitos, neutrófilos, y células de linfoma está involucrada en la liberación del bFGF activo a partir de la MEC y membranas basales (23), sugiriendo que la actividad heparanasa puede no sólo funcionar en la migración celular y la invasión, sino también puede despertar una respuesta neovascular indirecta. Estos resultados sugieren que los HSPG de la MEC proporcionan un depósito de almacenamiento natural para el bFGF y posiblemente otros factores promotores del crecimiento de unión a heparina (24, 25). El desplazamiento del bFGF de su lugar de almacenamiento en membranas basales y en la MEC puede en consecuencia proporcionar un nuevo mecanismo de inducción de la neovascularización en condiciones normales y patológicas.

Estudios recientes indican que la heparina y el HS están involucrados en la unión del bFGF a receptores de alta afinidad de la superficie celular y en la señalización celular del bFGF (26, 27). Además, el tamaño del HS requerido para un efecto óptimo era similar al de los fragmentos de HS liberados por heparanasa (28). Se obtuvieron resultados similares con los factores de crecimiento de células endoteliales vasculares (FCEV) (29), sugiriendo el funcionamiento de un mecanismo de receptor dual que involucra el HS en la interacción celular con los factores de crecimiento de unión a la heparina. Se propuso pues que la restricción de los factores de crecimiento endotelial en la MEC previene su acción sistémica en el endotelio vascular, manteniendo así un recambio muy bajo de las células endoteliales y crecimiento de los vasos. Por otro lado, la liberación del bFGF del lugar de almacenamiento en la MEC cómo un complejo con HS, puede promover la proliferación de células endoteliales localizadas y la neovascularización en procesos tales cómo cicatrización, inflamación y desarrollo tumoral (24, 25).

Expresión de heparanasa por células del sistema inmune: La actividad heparanasa se correlaciona con la capacidad de las células del sistema inmune de abandonar la circulación y promover respuestas inflamatorias y autoinmunes. La interacción de plaquetas, granulocitos, linfocitos T y B, macrófagos y mastocitos con la MEC subendotelial se asocia con la degradación de HS por una actividad heparanasa específica (6). La enzima es liberada de los compartimentos intracelulares (pej, lisosomas, gránulos específicos, etc.) en respuesta a varias señales de activación (pej, trombina, ionóforo de calcio, complejos inmunes, antígenos, mitógenos, etc.), sugiriendo su implicación reguladora en la inflamación e inmunidad celular.

Algunas de las observaciones respecto la enzima heparanasa se revisaron en la referencia No.6 y se listan a continuación:

Primero, una actividad proteolítica (activador del plasminógeno) y heparanasa participan sinérgicamente en degradaciones secuenciales de los HSPG de la MEC por leucocitos inflamatorios y células malignas.

Segundo, una gran proporción de heparanasa plaquetaria existe en forma latente, probablemente en forma de un complejo con sulfato de condroitina. La enzima latente es activada por factor(es) derivados de células tumorales y puede luego facilitar la invasión celular a través del endotelio vascular en el proceso de metástasis tumoral.

Tercero, la liberación de heparanasa plaquetaria de los gránulos \alpha es inducida por un potente estimulante (pej, trombina), pero no en respuesta de la activación plaquetaria en la MEC.

Cuarto, la heparanasa neutrófila es preferentemente y fácilmente liberada en respuesta a un umbral de activación y sobre incubación de las células en la MEC.

Quinto, el contacto de neutrófilos con la MEC inhibió la liberación de enzimas nocivas (proteasas, lisozima) y radicales oxígeno, pero no de enzimas (heparanasa, gelatinasa) que pueden facilitar la diapédesis. Este papel protector de la MEC subendotelial se observó cuando las células fueron estimuladas con factores solubles pero no con estimulantes fagocitables.

Sexto, la heparanasa intracelular se expresa al cabo de unos minutos después de la exposición de líneas celulares T a antígenos específicos.

Séptimo, los mitógenes (con A, LPS) inducen la síntesis y secreción de heparanasa por linfocitos T y B normales mantenidos in vitro. La heparanasa del linfocito T es inducida también por inmunización con un antígeno in vivo.

Octavo, la actividad heparanasa es expresada por linfomas pre-B y linfomas B, pero no por plasmacitomas y linfocitos B normales restantes.

Noveno, la actividad heparanasa es expresada por macrófagos activados durante la incubación con la MEC, pero hubo poca o nula liberación de la enzima en el medio de incubación. Resultados similares se obtuvieron en células de leucemia mieloide humana inducidas para diferenciarse a macrófagos maduros.

Décimo, la hipersensibilidad retardada mediada por células T y la autoinmunidad experimental son suprimidas por bajas dosis de especies de heparina no-anticoagulantes inhibidoras de heparanasa (30).

Undécimo, la actividad heparanasa expresada por plaquetas, neutrófilos y células tumorales metastásicas libera el bFGF activo a partir de la MEC y membranas basales. La liberación del bFGF de su lugar de almacenamiento en la MEC puede promover una respuesta neovascular localizada en procesos tales como la cicatrización, la inflamación y el desarrollo tumoral.

Duodécimo, entre los productos erróneos generados por heparanasa se encuentra un disacárido tri-sulfatado que puede inhibir la inflamación mediada por células T in vivo (31). Ésta inhibición fue asociada con un efecto inhibitorio del disacárido en la producción de TNF\alpha biológicamente activo por células T activadas in vitro (31).

Otras aplicaciones terapéuticas potenciales: Aparte de su implicación en la metástasis de células tumorales, la inflamación y la autoinmunidad, la heparanasa de mamíferos se puede aplicar para modular: la biodisponibilidad de factores de crecimiento de unión a la heparina (15); respuestas célulares a factores de crecimiento de unión a la heparina (pej, bFGF, FCEV) y citocinas (IL-8) (3la, 29); interacción celular con lipoproteínas plasmáticas (32); la susceptibilidad celular a ciertas infecciones virales y algunas bacterianas y protozoicas (33, 33a, 33b); y la desintegración de placas amiloides (34). La heparanasa puede así demostrar ser útil para condiciones tales como cicatrización, angiogénesis, restenosis, aterosclerosis, inflamación, enfermedades neurodegenerativas e infecciones virales. La heparanasa de mamíferos se puede utilizar para neutralizar la heparina plasmática; como un potencial sustituto de la protamina. Anticuerpos anti-heparanasa pueden ser utilizados para la inmunodetección y el diagnóstico de micrometastásis, lesiones autoinmunes y fallo renal en muestras de biopsia, muestras de plasma, y fluidos corporales. Se espera su uso de forma común en la investigación básica.

La identificación del gen hpa codificante de la enzima heparanasa permitirá la producción de una enzima recombinante en sistemas de expresión heterólogos. La disponibilidad de la proteína recombinante proporcionará el camino para solucionar la relación estructura función de la proteína y proporcionará una herramienta para la síntesis de nuevos inhibidores.

Infección viral: La presencia de heparan sulfato en superficies celulares se muestra como el principal requerimiento para la unión de los Virus Herpes Simplex(33) y Dengue (33a) a las células y para la posterior infección de éstas. La eliminación de heparan sulfato de la superficie de las células por la heparanasa puede, por lo tanto, suprimir la infección viral. De hecho, el tratamiento de células con heparitinasa bacteriana (degradando heparan sulfato) o heparanasa (degradando heparano) redujo la unión de dos virus Herpes animales asociados a las células y al menos las transformaron en células parcialmente resistentes a la infección vírica (33). Hay algunas indicaciones de que el heparan sulfato de la superficie de las células también está involucrado en la infección por VIH (33b).

Enfermedades neurodegenerativas: Proteoglicanos de heparan sulfato fueron identificados en las placas amiloides de proteínas priónicas del Síndrome de Genstmann- Straussler, Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob y Scrape (34). La heparanasa puede desintegrar estas placas amiloides de las cuales también se piensa que juegan un papel en la enfermedad de Alzheimer.

Restenosis y Aterosclerosis: La proliferación de las células del músculo liso arterial (CMLs) en respuesta a una lesión endotelial y acumulación de lipoproteínas ricas en colesterol son eventos básicos en la patogénesis de la aterosclerosis y restenosis (35). Aparte de su implicación en la proliferación de las CML (pej, receptores de baja afinidad para factores de crecimiento de unión a heparina), el HS también está involucrado en la unión, retención y absorción de lipoproteínas (36). Se demostró que los HSPG y la lipoprotein-lipasa participan en una nueva ruta catabólica que puede permitir una acumulación substancial celular e intersticial (32). Dicha ruta se espera que sea altamente aterogénica por promocionar la acumulación de lipoproteínas ricas en apoB y apoE (pej, LDL, VLDL, quilomicrones), independiente de la retroinhibición por el contenido celular de esteroles. Se espera que la eliminación del HS de las CML por heparanasa inhiba tanto la proliferación de las CML como la acumulación de lípidos y en consecuencia pueda detener la progresión de la restenosis y la aterosclerosis.

Así pues está ampliamente reconocida la necesidad de, y podría ser altamente ventajoso tener un polinucleótido codificante de un polipéptido que tuviera actividad heparanasa, vectores que incluyan el mismo, células transducidas que expresaran heparanasa y una proteína recombinante que tuviera actividad heparanasa.

Resumen de la invención

De acuerdo con la presente invención se proporciona un polinucleótido, mencionado de aquí en adelante como hpa, cADN hpa o gen hpa, que codifica un polipéptido con actividad heparanasa, vectores que incluyen el mismo y células transducidas que expresan la heparanasa y una proteína recombinante que tiene actividad heparanasa.

Se describe el clonaje del gen humano hpa que codifica la heparanasa, y la expresión de la heparanasa recombinante mediante células huésped infectadas.

Una preparación purificada de heparanasa aislada de las células humanas de hepatoma se sometió a digestión tríptica y a microsecuenciación. La secuencia revelada YGPDVGQPR (ID SEC No: 8) se usó para cribar bases de datos EST por homología a la secuencia correspondiente de ADN traducido. Dos secuencias EST estrechamente relacionadas fueron identificadas y al final resultaron ser idénticas. Ambos clones contenían un inserto de 1020 pb que incluían un marco de lectura abierto de 973 pb seguidas de una región 3' no traducida de 27 pb y una cola de Poli A. El sitio de inicio de la traducción no fue identificado.

La clonación del extremo 5' ausente de hpa se realizó por amplificación por PCR de ADN del complejo Marathon RACE (RIM) cADN de placenta utilizando cebadores seleccionados de acuerdo con las secuencias de los clones EST y los conectores del complejo. Se obtuvo un fragmento de PCR de 900 pb que parcialmente se solapaba con la región identificada 3' codificante de los clones EST. El fragmento de cADN unido (hpa), 1721 pb de longitud (ID SEC NO:9), contenía un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de 543 aminoácidos (ID de SEC NO:1O) con un peso molecular calculado de 61.192 daltons.

Fue posible clonar una secuencia 5' extendida a partir de la línea celular humana SK-hep1 por amplificación por PCR utilizando el Marathon RACE (RIM). La secuencia 5' extendida de SK-hep1 hpa cADN se ensambló con la secuencia de cADN hpa aislada de placenta humana (ID SEC NO:9). La secuencia ensamblada contenía un marco abierto de lectura, ID de SEC NOs: 13 y 15, que codifica, como se muestra en ID de SEC NOs: 14 y 15, un polipéptido de 592 aminoácidos con un peso molecular calculado de 66.407 daltons.

La habilidad del producto del gen hpa para catalizar la degradación de heparan sulfato en un ensayo in vitro fue examinada expresando el marco de lectura abierto completo de hpa en células de insectos, utilizando el sistema de expresión Baculovirus. Extractos y medios condicionados de células infectadas con el virus que contiene el gen hpa, demostraron un alto nivel de actividad de degradación de heparan sulfato en HSPG solubles derivados de la MEC y la MEC intacta. Esta actividad de degradación fue inhibida por la heparina, que es otro sustrato de la heparanasa. Células infectadas con una construcción similar que no contienen el gen hpa no tuvieron tal actividad, tampoco la tuvieron las células no infectadas. La capacidad de la heparanasa expresada del clon extendido 5' hacia la heparina fue demostrada en un sistema de expresión de mamíferos.

El patrón de expresión del ARN hpa en varios tejidos y líneas celulares se investigó utilizando RT-PCR. Se encontró que sólo se expresa en tejidos y células en las que previamente se conoce actividad heparanasa.

Un panel de híbridos de células somáticas monocromosómicas humano/CHO y humano/ratón se utilizó para localizar el gen de la heparanasa humana en el cromosoma 4. La nueva secuencia heparanasa aislada se puede utilizar para identificar una región del cromosoma que alberga el gen de la heparanasa humana en un cromosoma laxo.

De acuerdo con otros rasgos en realizaciones preferidas descritas a continuación, se proporciona un fragmento polinucleótido que incluye una secuencia polinucleótida codificante para un polipéptido con actividad heparanasa catalítica.

De acuerdo con otros rasgos en las realizaciones preferidas descritas a continuación el fragmento del polinucleótido incluye los nucleótidos 63-1691 de ID de la SEC NO: 9 o los nucleótidos 139-1869 de ID de SEC NO: 13, que codifica para la enzima heparanasa humana completa.

De acuerdo con otros rasgos en las realizaciones preferidas descritas se proporciona un fragmento del polinucleótido que incluye una secuencia polinucleótida capaz de hibridar con el cADN hpa, especialmente con los nucleótidos 1-721 de ID de SEC NO: 9.

De acuerdo con otros rasgos en las realizaciones preferidas descritas la secuencia polinucleótida que codifica el polipéptido con actividad heparanasa presenta un mínimo de 60% de homología, preferiblemente un mínimo de 70% de homología, más preferiblemente un mínimo de 80% de homología, siendo lo más preferible un mínimo de 90% de homología con ID de SEC NOs: 9 o 13.

De acuerdo con otros rasgos en las realizaciones preferidas descritas el fragmento del polinucleótido según la presente invención incluye una porción (fragmento) de ID de SEC NOs: 9, o 13. Por ejemplo, tales fragmentos podrían incluir los nucleótidos 63-721 de ID de SEC No: 9 y/o un segmento de ID de SEC NO: 9 que codifica un polipéptido con actividad catalítica heparanasa.

De acuerdo con otros rasgos en las realizaciones preferidas descritas el polipéptido codificado por el fragmento polinucleótido incluye una secuencia de aminoácidos ID de SEC NOs: 10 o 14 o una parte funcional de ésta.

De acuerdo con otros rasgos en las realizaciones preferidas descritas la secuencia polinucleótida que codifica el polipéptido con actividad heparanasa presenta un mínimo de 60% de homología, preferiblemente un mínimo de 70% de homología, más preferiblemente un mínimo de 80% de homología, siendo lo más preferible un mínimo de 90% de homología con la ID de SEC NOs: 10 o 14.

De acuerdo con otros rasgos en las realizaciones preferidas descritas el fragmento del polinucleótido codifica un polipéptido con actividad heparanasa, que puede ser luego un alélico, especies y/o variantes inducidas de la secuencia de aminoácidos expuesta en ID de SEC NOs: 10 o 14. Se entiende que cualquiera de tales variantes se puede considerar cómo un homólogo.

De acuerdo con otros rasgos en las realizaciones preferidas descritas se proporciona un fragmento del polinucleótido de cadena simple que incluye una secuencia polinucleótida complementaria a al menos una porción de una cadena de polinucleótido codificante de un polipéptido con actividad heparanasa catalítica cómo se describió anterior-
mente.

De acuerdo con otros rasgos en las realizaciones preferidas descritas se proporciona un vector que incluye una secuencia polinucleótida codificante de un polipéptido con actividad catalítica heparanasa.

El vector puede ser de cualquier tipo adecuado incluyendo un fago, virus, plásmido, fagomido, cosmido, bacmido, o también un cromosoma artificial, pero no queda limitado a esto. La secuencia polinucleótida codificante de un polipéptido con actividad catalítica debe incluir cualquiera de los fragmentos de polinucleótidos descritos
anteriormente.

De acuerdo con otros rasgos en las realizaciones preferidas descritas se proporciona una célula huésped que incluye un fragmento de polinucleótido exógeno que incluye una secuencia polinucleótida codificante de un polipéptido con actividad catalítica heparanasa.

El fragmento polinucleótido exógeno puede ser cualquiera de los fragmentos antes descritos. La célula huésped puede ser de cualquier tipo tal como una célula procariota, una célula eucariota, una línea celular, o una célula como porción de un organismo pluricelular (pej, células de un organismo transgénico).

De acuerdo con otros rasgos en las realizaciones preferidas descritas se proporciona una proteína recombinante que incluye un polipéptido con actividad catalítica heparanasa.

De acuerdo con otros rasgos en las realizaciones preferidas descritas se proporciona una composición farmacéutica que contiene como componente activo una proteína recombinante con actividad catalítica heparanasa.

De acuerdo con otros rasgos en las realizaciones preferidas descritas se proporciona un equipo médico que comprende un dispositivo médico que contiene, como componente activo una proteína recombinante con actividad catalítica heparanasa.

De acuerdo con otros rasgos en las realizaciones preferidas descritas se proporciona un sistema de sobreexpresión de heparanasa que contiene una célula que sobreexpresa actividad catalítica heparanasa.

De acuerdo con otros rasgos en las realizaciones preferidas descritas se proporciona un método de identificación de una región del cromosoma que alberga el gen heparanasa humano en un cromosoma laxo que comprende los pasos siguientes (a) hibridación del cromosoma expandido con una sonda polinucleótida codificante de heparanasa marcada; (b) lavado del cromosoma expandido, por ello se remueve el exceso de sonda no-hibridada; y (c) búsqueda de señales asociados a dicha sonda polinucleótida marcada hibridada, en dónde los señales detectados serán indicativos de la región cromosómica que alberga el gen heparanasa humano.

La presente invención puede ser utilizada para desarrollar nuevos fármacos para inhibir la metastásis de células tumorales, la inflamación y la autoinmunidad. La identificación del gen hpa codificante de la enzima heparanasa permite la producción de una enzima recombinante en sistemas de expresión heterólogos.

Breve descripción de las figuras

La invención aquí descrita, a modo de ejemplo, con referencia a las figuras acompañantes, en donde:

Fig. 1 presenta la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida del cADN hpa. La diferencia de un único nucleótido en la posición 199 (T por A) entre la EST (etiqueta de secuencia expresada) y el cADN amplificado por PCR (trascripción reversa de RNA) y la resultante sustitución de aminoácidos (Phe por Tyr) se indican por encima y por debajo de la unidad sustituida, respectivamente. Los residuos cisteína y la secuencia de poliadenilación de consenso están subrayados. El asterisco denota el codón stop TGA.

Fig. 2 demuestra la degradación de sustratos solubles de HSPG marcada con sulfato por lisados de células High Five (RIM) infectadas con el virus PFhpa2. Los lisados de células High Five (RIM) que fueron infectadas con el virus PFhpa2 (\bullet) o virus control pF2 (\Box) fueron incubadas (18 h, 37ºC) con HSPG solubles derivados de la MEC marcada con sulfato (pico I). El medio de incubación después se sometió a filtración en gel Sepharose 6B.

Fragmentos de degradación de HS de bajo peso molecular (pico II) se produjeron sólo durante la incubación con las células infectadas pFhpa2, pero no hubo degradación de sustratos de HSPG (\ding{71}) por lisados de células infectadas de pF2.

Figs. 3a-b demuestran la degradación de sustratos solubles de HSPG marcada con sulfato por el medio de cultivo de células infectadas con el pFhpa2 y el pFhpa4. El medio de cultivo de células High Five (RIM) infectadas con virus pFhpa2 (3a) o pFhpa4 (3b) (\bullet), o con virus control (\Box) se incubaron (18 h, 37ºC) con HSPG solubles derivados de la MEC marcada con sulfato (pico I,\ding{71}). El medio de incubación fue luego sometido a filtración en gel en Sepharose 6B. Fragmentos de degradación de HS de bajo peso molecular (pico II) se produjeron sólo durante la incubación con el gen hpa que contiene virus. No hubo degradación del sustrato de HSPG por el medio de cultivo de células infectadas con el virus control.

Fig. 4 presenta el fraccionamiento por tamaño de la actividad heparanasa expresada por células infectadas con el pFhpa2. El medio de cultivo de células High Five (RIM)infectadas con el pFhpa2 se aplicó a una membrana de 50 kDa de corte. Se encontró actividad heparanasa (conversión del sustrato pico I, (\ding{71}) en fragmentos de degradación HS pico II) en el compartimiento de alto (> 50 kDa) (\bullet), pero no bajo (< 50 kDa) (o) peso molecular.

Figs. 5a-b demuestran el efecto de la heparina en la actividad heparanasa expresada por células High Five (RIM) infectadas por pFhpa2 y pFhpa4. Los medios de cultivo de células High Five (RIM) infectadas por pFhpa2 (5a) y pFhpa4 (5b) se incubaron a (18 h, 37ºC) conHSPG derivados de la MEC marcada con sulfato (pico I,\ding{71}) en ausencia (\bullet) o presencia de (\Delta) 10 \mug/ml de heparina. La producción de fragmentos de degradación de HS de bajo peso molecular se eliminó completamente en presencia de heparina, un potente inhibidor de la actividad heparanasa (6,7).

Figs. 6a-b demuestran la degradación de la MEC intacta marcada con sulfato por células High Five (RIM) infectadas por virus y células Sf21. Se plaquearon células High Five (RIM) (6a) y células Sf21 (6b) en la MEC marcada con sulfato y se infectaran (48 h, 28ºC) con pFhpa4 (\bullet) o virus pFl control (\Box). Se plaquearon células control no infectadas Sf21 (R) también en la MEC marcada. El pH del medio de cultivo fue ajustado a 6,0-6,2 seguido de 24 h de incubación a 37ºC. El material marcado con sulfato liberado al medio de incubación fue analizado por filtración en gel Sepharose 6B. Se produjeron fragmentos de degradación HS sólo por células infectadas con virus que
contenían hpa.

Fig. 7a-b demuestra la degradación de MEC intacta marcada con sulfato por células High Five (RIM) infectadas por virus. Se plaquearon células High Five (RIM) (7a) y células Sf21 (7b) en la MEC marcada con sulfato y se infectaron (48 h, 28ºC) con pFhpa4 (\bullet) o el virus pFl control (\Box). Células control no infectadas Sf21 (R) también fueron plaqueadas en la MEC marcada. Se ajustó el pH del medio de cultivo a 6,0-6,2 seguido de 24 h de incubación a 28ºC. Se analizaron por filtración en gel Sepharose 6B los fragmentos de degradación marcados con sulfato liberados al medio de incubación. Fragmentos de degradación de HS fueron producidos sólo por células infectadas con hpa que contenían virus.

Figs. 8a-b demuestran la degradación de la MEC intacta marcada con sulfato por el medio de cultivo de células infectadas con pFhpa4. El medio de cultivo de células High Five (RIM) (8a) y células Sf21 (8b) que fueron infectadas con virus pFhpa4 (\bullet) o virus control pFl (\Box)se incubaron (48 h, 37ºC, pH 6,0) con MEC intacta marcada con sulfato. La MEC también fue incubada con medio de cultivo de células control no infectadas Sf21 (R). El material marcado con sulfato liberado a la mezcla de reacción se sometió a análisis por filtración en gel. La actividad heparanasa se encontró sólo en el medio de cultivo de células infectadas con pFhpa4.

Figs. 9a-b demuestran el efecto de la heparina en la actividad heparanasa en el medio de cultivo de células infectadas por pFhpa4. Se incubó la MEC marcada con sulfato (24 h, 37ºC, pH 6.0) con el medio de cultivo de células High Five (RIM) infectadas por pFhpa4 (9a) y células Sf21 (9b) en ausencia (\bullet) o presencia (V) de 10 \mug/ml de heparina. El material marcado con sulfato liberado al medio de incubación se sometió a filtración en gel Sepharose 6B. La actividad heparanasa (producción de fragmentos de degradación HS pico II) fue completamente inhibida en presencia de heparina.

Figs 10a-b demuestran la purificación de heparanasa recombinante en Sepharose-heparina. El medio de cultivo de células Sf21 infectadas con el virus pFhpa4 se sometió a cromatografía heparin-Sepharose. La elución de las fracciones se llevó a cabo con gradientes de 0,35-2 M NaCl (\ding{71}). La actividad heparanasa en las fracciones eluídas se demuestra en la figura 10a (\bullet). Las fracciones 15-28 se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS 15% seguida de una tinción con nitrato de plata. Se demuestra una correlación entre una banda proteica mayor (PM\sim63,000) en las fracciones 19 - 24 y la actividad heparanasa.

Figs. 11a-b demuestra la purificación de la heparanasa recombinante en una columna de filtración de gel Superdex 75. Las fracciones activas eluidas de Sepharose-heparina (Figura 10a) se juntaron, concentradas y aplicadas en una columna Superdex 75 FPLC. Las fracciones se recogieron y se examinó la actividad heparanasa de alícuotas de cada una de las fracciones (C, Figura 11a) se analizaron en gel de electroforesis SDS-poliacrilamida más tinción con nitrato de plata (Figura l1b). Se observó correlación entre la aparición de una banda proteica mayor (PM\sim63,000) en las fracciones 4-7 y la actividad heparanasa.

Figs. 12a-e demuestran la expresión del gen hpa por RT-PCR con ARN total a partir de tejidos embrionarios humanos (12a), tejidos extraembrionarios humanos (12b) y líneas celulares de distintos orígenes (12c-e). Los productos de la RT-PCR utilizando cebadores específicos hpa (I), cebadores para el gen constitutivo GADPH (II), y reacciones control sin transcriptasa reversa demostrando la ausencia de ADN genómico u otra contaminación en muestras de ARN (III). M- marcador de peso molecular de ADN VI (Boehringer Mannheim). Para 12a: carril 1- células neutrófilas (adulto), carril 2- músculo, carril 3- timo, carril 4- corazón, carril 5- suprarrenales. Para 12b: carril 1- riñón, carril 2- placenta (8 semanas), carril 3- placenta (11 semanas), carril 4-7 - mola (mola hidatiforme completa), carril 8 - células citotrofoblásticas (recién aisladas), carril 9- células citotrofoblásticas (1,5 h in vitro), carril10 - células citotrofoblásticas (6 h in vitro), carril 11- células citotrofoblásticas (18 h in vitro), carril 12 - células citotrofoblásticas (48 h in vitro). Para 12c: carril 1 - línea celular de vejiga JAR, carril 2 - línea celular de tumor testicular NCITT, carril 3 - línea celular de hepatoma humano SW-480, carril 4 - HTR (citotrofoblastos transformados por SV40), carril 5 - línea celular de carcinoma hepatocelular HPTLP-I, carril 6 - línea celular de carcinoma de vejiga EJ-28. Para 12d: carril 1- línea celular de hepatoma humano SK-hep-1, carril 2 - línea celular megacariocítica humana DAMI, carril 3 - línea celular DAMI + PMA, carril 4 - línea celular CHRF + PMA, carril 5 - línea celular CHRF. Para 12e: carril 1- células endoteliales aórticas bovinas ABAE_{,} carril 2 - línea célular ovárica humana 1063, carril 3 - línea celular de carcinoma mamario humano MDA435, carril 4 - línea celular de carcinoma mamario humano MDA231.

Fig. 13 presenta una comparación entre secuencias de nucleótidos del hpa humano y un fragmento cADN EST de ratón(ID de SEC NO: 12) que es 80% homólogo al extremo 3' (empezando por el nucleótido 1066 de ID de SEC NO: 9) del hpa humano. Los codones de terminación alineados están subrayados.

Fig. 14 demuestra la localización cromosomal del gen hpa. Productos PCR de ADN procedente de híbridos de células somáticas y de ADN genómico de hámster, ratón y humano se separaron en gel de agarosa 0,7% después de la amplificación con cebadores específicos. Carril 1- ADN Lambda digerido con BstEII, carril 2 - control no ADN, carriles 3 - 29, productos amplificación PCR. Carriles 3-5 - ADN genómico humano, de ratón y de hámster, respectivamente. Carriles 6-29, híbridos de células somáticas monocromosomales humanas representan los cromosomas 1-22 y X y Y, respectivamente. Carril 30 - ADN Lambda digerido con BstEII. Se observó un producto de amplificación de aproximadamente 2,8 Kb sólo en los carriles 5 y 9, representando ADN genómico humano y ADN derivado de la célula híbrida que lleva el cromosoma 4 humano, respectivamente. Estos resultados demuestran que el gen hpa se encuentra en el cromosoma 4 humano.

Descripción de las realizaciones preferidas

La presente invención es de un polinucleótido, referido de aquí en adelante de forma intercambiable como hpa, cADN hpa o gen hpa, codificante de un polipéptido con actividad heparanasa, vectores que incluyen el mismo, células transducidas que expresan actividad heparanasa y una proteína recombinante con actividad heparanasa.

Antes de explicar en detalle cómo mínimo una realización de la invención, se debe comprender que la invención no está limitada a su aplicación en los detalles de construcción y la organización de los componentes expuestos en la siguiente descripción o ilustrados en los dibujos.

Además, se debe entender que la fraseología y terminología aquí utilizada tiene un objetivo descriptivo y no debería ser visto cómo limitante.

La presente invención se puede utilizar para desarrollar el tratamiento de distintas enfermedades, para desarrollar ensayos de diagnóstico para éstas enfermedades y para aportar nuevas herramientas para la investigación básica especialmente en los campos de medicina y biología.

Específicamente, la presente invención puede ser utilizada para desarrollar nuevos fármacos para la inhibición de la metástasis de células tumorales, inflamación y autoinmunidad. La identificación del gen hpa codificante de la enzima heparanasa permite la producción de una enzima recombinante en sistemas de expresión heteróloga.

Además, la presente invención se puede utilizar para modular la biodisponibilidad de factores de crecimiento de unión a heparina, respuestas celulares a factores de crecimiento de unión a heparina (pej., bFGF, FCEV) y citocinas (IL-8), la interacción celular con lipoproteínas plasmáticas, la susceptibilidad celular a infecciones virales, protozoicas y algunas bacterianas, y la desintegración de placas neurodegenerativas. La heparanasa recombinante es pues un tratamiento potencial para la cicatrización, angiogénesis, restenosis, aterosclerosis, inflamación, enfermedades neurodegenerativas (tales cómo, por ejemplo, Síndrome Genstmann-Straussler, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, Scrape y enfermedad de Alzheimer) y ciertas infecciones virales y algunas bacterianas y protozoicas. La heparanasa recombinante se puede utilizar para neutralizar la heparina plasmática, como un potencial reemplazo de la protamina.

Cómo se utiliza aquí, el término "modular" incluye inhibir sustancialmente, disminuir o revertir la progresión de la enfermedad, mejorar sustancialmente los síntomas clínicos de una enfermedad o condición. Un "modulador" así pues incluye un agente que puede modular una enfermedad o condición. La modulación de infecciones virales, protozoicas y bacterianas incluye cualquier efecto que interrumpa sustancialmente, prevenga o reduzca cualquier actividad viral, bacteriana o protozoica y/o estadio del ciclo de vida viral, bacteriano o protozoico, o que reduzca o prevenga la infección por virus, bacteria o protozoo en un sujeto, tal cómo un humano o animal inferior.

Cómo se utiliza aquí, el término "herida" incluye cualquier lesión de cualquier parte del cuerpo de un sujeto incluyendo, pero no limitado a, condiciones agudas tales cómo quemaduras térmicas, quemaduras químicas, quemaduras por radiación, quemaduras causadas por exceso de exposición a radiación ultravioleta cómo quemadura solar, daño de tejidos corporales tales cómo el perineo debido al parto y nacimiento, incluyendo lesiones sostenidas durante procedimientos médicos tales cómo episiotomía, lesiones inducidas por trauma incluyendo cortes, aquellas lesiones producidas en automóviles y otros accidentes mecánicos, y aquellas causadas por balas, cuchillos y otras armas, y lesiones post-quirúrgicas, así como condiciones crónicas tales cómo llagas por presión, llagas en individuos encamados, condiciones relacionadas con diabetes y mala circulación, y todos los tipos de acné, etc.

Anticuerpos anti-heparanasa, obtenidos contra la enzima recombinante, podrían ser útiles para la inmunodetección y el diagnóstico de micrometástasis, lesiones autoinmunes y fallo renal en muestras de biopsia, muestras de sangre, y fluidos corporales. Tales anticuerpos también pueden servir como agentes neutralizantes de la actividad heparanasa.

El clonaje del gen hpa humano codificante de heparanasa y la expresión de la heparanasa recombinante por células transfectadas se describe aquí. Éste es el primer gen heparanasa de mamífero que se ha clonado.

Una preparación purificada de heparanasa aislada de células de hematoma humano se sometió a digestión tríptica y microsecuenciación.

La secuencia YGPDVGQPR (ID de SEC NO: 8) revelada se utilizó para el cribado de bases de datos EST por homología con la correspondiente secuencia de ADN traducida hacia atrás. Se identificaron dos secuencias EST estrechamente relacionadas y más adelante se determinó que eran idénticas.

Ambos clones contenían un inserto de 1024 pb que incluía un marco de lectura abiertode 973 pb seguido de una región no traducida 3' de 27 pb y una cola de Poli A, mientras que no se identificó el sitio de inicio de la traducción.

El clonaje del extremo 5' ausente se realizó por amplificación por PCR de ADN del complejo cADN Marathon RACE (RIM) de placenta utilizando cebadores seleccionados de acuerdo con las secuencias de los clones EST y los conectores del complejo.

Se obtuvo un fragmento PCR de 900 pb que parcialmente se solapa con los clones codificantes 3' identificados. El fragmento cADN adjunto (hpa), 1721 pb de longitud (ID de SEC NO: 9), contenía un marco abierto de lectura que codificaba, cómo se muestra en la Figura 1 e ID de SEC NO: 11, un polipéptido de 543 aminoácidos (ID de SEC ID NO: l0) con un peso molecular calculado de 61.192 daltons.

Se observó la diferencia de un único nucleótido en la posición 799 (T por A) entre los clones EST y los cADN amplificados por PCR. Ésta diferencia resulta en la sustitución de un único aminoácido (Phe por Tyr) (Figura 1). Además, las secuencias EST publicadas contenían un nucleótido no identificado, cuya posterior secuenciación de ADN de ambos clones EST fue resuelta en dos nucleótidos (G y C en las posiciones 1630 y 1631 en ID de SEC NO: 9, respectivamente).

La capacidad del producto génico hpa para catalizar la degradación de heparan sulfato en un ensayo in vitro se examinó expresando el marco de lectura abierto completo en células de insectos, utilizando el sistema de expresión Baculovirus.

Extractos y medios acondicionados de células infectadas con virus que contienen el gen hpa, demostraron una elevada actividad de degradación de heparan sulfato en los HSPG solubles derivados de la MEC y la MEC intacta, que fue inhibida con heparina, mientras que células infectadas con una construcción similar que no contenía el gen hpa no tuvieron tal actividad, ni tampoco las células no infectadas.

El patrón de expresión de ARN hpa en varios tejidos y líneas celulares se investigó utilizando RT-PCR. Se encontró que sólo se expresa en tejidos y células con actividad heparanasa previamente conocida.

El clonaje de una secuencia extendida 5' fue posible a partir de la línea celular humana SK-hep1 por amplificación por PCR utilizando el Marathon RACE (RIM). La secuencia 5' extendida del cADN SK-hepl hpa se ensambló con la secuencia de cADN hpa aislado de placenta humana (ID de SEC NO: 9). La secuencia ensamblada contenía un marco abierto de lectura, ID de SEC NOs: 13 y 15, que codifican, cómo se muestra en ID de SEC NOs: 14 y 15, un polipéptido de 592 aminoácidos, con un peso molecular de 66.447 daltons. Se reveló que este marco de lectura abierto dirige la expresión de heparanasa catalíticamente activa en un sistema de expresión en células mamíferas. La heparanasa expresada se detectó con anticuerpos anti-heparanasa por análisis Western blot.

Un panel de híbridos de células somáticas monocromosómicas humano/CHO y humano/ratón se utilizó para localizar el gen de la heparanasa humana en el cromosoma 4. La nueva secuencia heparanasa aislada se puede utilizar para identificar una región del cromosoma que alberga el gen de la heparanasa humana en un cromosoma laxo.

Así pues, de acuerdo con la presente invención se proporciona un fragmento polinucleótido (tanto ADN como RNA, tanto de cadena simple o cadena doble) que incluye una secuencia polinucleótida que codifica por un polipéptido con actividad catalítica heparanasa.

El término "actividad catalítica heparanasa" o su término equivalente "actividad heparanasa" ambas se refieren a una actividad hidrolítica endoglicosidasa de mamíferos que es específica para sustratos heparanproteoglicanos o heparan sulfato, de forma opuesta a la actividad de las enzimas bacterianas (heparinasa I, II y III) que degradan heparina o heparan sulfato mediante \beta-eliminación (37).

En una realización preferida de la invención el fragmento polinucleótido incluye los nucleótidos 63-1691 de ID de SEC NO: 9, o los nucleótidos 139-1869 de ID de SEC N9: 13, que codifican la enzima heparanasa humana completa.

Sin embargo, el alcance de la presente invención no está limitado a la heparanasa humana ya que es el primer descubrimiento de un marco de lectura abierto (ORF) codificante en una heparanasa de mamífero. Utilizando el cADN hpa, partes de éste u oligonucleótidos sintéticos diseñados de acuerdo con su secuencia permitirán a un experto en el campo identificar clones genómicos y/o cADN incluyendo secuencias homólogas de otras especies mamíferas.

La presente invención así pues también se dirige a un fragmento de polinucleótido que incluye una secuencia polinucleótida capaz de hibridar (emparejamiento de bases ya sea bajo condiciones astringentes o condiciones que permitan la hibridación, por ejemplo como se describe en Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.) con cADN hpa, especialmente con los nucleótidos 1-721 de ID de SEC NO: 9.

De hecho, cualquier secuencia polinucleótida que codifica un polipéptido con actividad heparanasa y que comparte un mínimo de 60% de homología, preferiblemente un mínimo de 70% de homología, más preferiblemente un mínimo de 80% de homología y lo más preferible un mínimo de 90% de homología con ID de SEC NOs: 9 o 13 está dentro del alcance de esta invención.

El fragmento de polinucleótido de acuerdo con la presente invención puede incluir cualquier parte de la ID de SEC NOs: 9 o 13. Por ejemplo, puede incluir nucleótidos. 63-721 de la ID de SEC.NO: 9, que es una secuencia nueva. Sin embargo, puede incluir algún segmento de la ID de SEC NOs: 9 o 13 la cual codifica un polipéptido con actividad catalítica heparanasa.

Cuando se utiliza la frase "codifica un polipéptido con actividad catalítica heparanasa" aquí y en la sección de reivindicaciones más adelante se refiere a la habilidad de dirigir la síntesis de un polipéptido el cual, si se requiere por su actividad, siguiendo modificaciones post-transcripcionales, pero no limitadas en, proteolisis (por ejemplo, extracción de un péptido señal y de una secuencia de pro- o preproteína), modificación de la metionina, glicosilación, alquilación (por ejemplo, metilación), acetilación, etc., es catalíticamente activa en degradación de, por ejemplo, MEC y superficies celulares asociadas a HS.

En una realización preferida de la invención el polipéptido codificado por el fragmento de polinucleótido incluye una secuencia de aminoácidos descrita en la ID de SEC NOs: l0 o 14 o una parte funcional de la misma, es decir, una parte de la actividad catalítica heparanasa.

Sin embargo, cualquier fragmento de polinucleótido el cual codifique un polipéptido con actividad heparanasa está dentro del propósito de la presente invención. En consecuencia, el polipéptido puede ser alélico, especies y/o una variante inducida de la secuencia de aminoácidos descrita en ID de SEC NOs: 10 o 14 o una parte funcional de la misma.

De hecho, cualquier secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido con actividad heparanasa y que comparte al menos un 60% de homología, preferiblemente al menos un 70% de homología, más preferiblemente un mínimo de 84% de homología, y lo más preferible un mínimo de un 90% de homología con la ID de SEC NOs: 10 o 14 está dentro del alcance de la presente invención.

La invención también está dirigida a proporcionar una cadena simple del fragmento de polinucleótido el cual incluye una secuencia de polinucleótidos complementaria de al menos una parte de una cadena de polinucleótidos codificada que tiene actividad catalítica heparanasa como se ha descrito. El término "complementario" tal como se utiliza aquí se refiere a la habilidad para aparear bases.

El fragmento de cadena simple de polinucleótidos puede ser ADN o ARN o incluso análogos de nucleótidos (por ejemplo., nucleótidos tioados), puede ser un oligonucleótido sintético o puede haber sido producido por células huéspedes transducidas, puede ser si se desea de longitud que aún proporcione aparemiento de base específico (por ejemplo, 8 o 10, preferiblemente más, nucleótidos largos) y puede incluir incompatibilidades que impidan el mal apareamiento de las bases.

La invención también está dirigida a proporcionar un vector que incluye una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido con actividad catalítica heparanasa.

El vector puede ser de cualquier tipo. Puede ser un fago que infecta una bacteria o un virus que infecta células eucariotas. Puede ser también un plásmido, fagémido, cósmido, bácmido o un cromosoma artificial. La secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido con actividad catalítica heparanasa puede incluir cualquiera de los fragmentos de polinucleótidos descritos anteriormente.

La invención también está dirigida a proporcionar una célula huésped que incluya un fragmento exógeno de polinucleótidos que codifica un polinucleótido con actividad catalítica heparanasa.

El fragmento exógeno de polinucleótidos puede ser cualquier fragmento de los que se describen anteriormente. La célula huésped puede ser de cualquier tipo. Puede ser una célula procariota, una célula eucariota, una linia celular, o una célula como parte de un organismo. El fragmento exógeno de polinucleótidos puede estar permanentemente o transitoriamente presente en la célula. En otras palabras, células transducidas siguiendo tranfección estable o transitoria, transformación o transducción están dentro del alcance de la invención. El término "exógeno" que se utiliza aquí se refiere al hecho que el fragmento de polinucleótidos se introduce externamente en la célula. Allí dentro puede estar presente como una o más copias, puede estar integrado en uno o más cromosomas en cualquier sitio o estar presente en forma de material extracromosomal.

La invención también está dirigida a proporcionar un sistema de sobreexpresión heparanasa que incluya una célula con actividad catalítica de sobreexpresión heparanasa. La célula puede ser una célula huésped transfectada estable o transitoriamente o transformada con algún vector apto que incluya una secuencia de polinucleótidos que codifique un polipéptido con actividad heparanasa y un promotor adecuado y secuencias potenciadoras para la sobreexpresión directa de heparanasa. Sin embargo la célula sobreexpresada puede ser también un producto de una inserción (pej., mediante recombinación homóloga) de una secuencia promotora y/o potenciadora corriente arriba del gen heparanasa endógeno de la célula que está expresando, el cual dirigirá la sobreexpresión desde el gen endógeno. El término "sobreexpresión" como se utiliza aquí en la especificación y en las reivindicaciones siguientes se refiere al nivel de expresión que es superior a un nivel basal de expresión típico que caracteriza una célula dada bajo por otro lado condiciones idénticas.

La invención también está dirigida para proporcionar una proteína recombinante que incluye un polipéptido con actividad catalítica heparanasa.

La proteína recombinante se puede purificar por un procedimiento convencional de purificación cerca de homogeneidad y/o mezclar con aditivos. La proteína recombinante puede ser elaborada utilizando alguna de las células descritas luego. La proteína recombinante puede estar en cualquier forma. Puede ser una forma cristalizada, unos polvos deshidratados o una solución. La proteína recombinante puede ser útil para obtener heparanasa pura, que a su vez puede ser útil para producir como respuesta anticuerpos anti-heparanasa, anticuerpos tanto poli como monoclonales, y para un principio activo cribado en un ensayo o sistema de cribaje de fármacos o inhibidores anti-
heparanasa.

La invención también está dirigida a proporcionar una composición farmacéutica que incluya como principio activo una proteína recombinante con actividad catalítica heparanasa.

Formulaciones para administración tópica pueden incluir, pero no se limitan a lociones, ungüentos, geles, cremas, supositorios, grageas, líquidos, aerosoles y polvos. Vehículos farmacéuticos convencionales, acuoso, polvo o bases oleosas, aglutinantes y similares pueden ser necesarios o deseables. Condones recubiertos, "stents", parches activos, y otros dispositivos médicos pueden también ser útiles. De hecho el alcance de la presente invención incluye cualquier equipamiento médico tal cómo un dispositivo médico que contenga, como un principio activo, una proteína recombinante con actividad heparanasa catalítica.

Composiciones para administración oral incluyen polvos o granulados, suspensiones o soluciones en agua o en medio no acuoso, sachet, cápsulas o comprimidos. Aglutinantes, diluyentes, saborizantes, agentes dispersantes, emulsificantes o enlazantes pueden ser provechosos.

Formulaciones para administración parenteral incluyen, pero no se limitan a, soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados.

La dosificación depende de la severidad y del grado de reacción de la condición a tratar, pero normalmente será una o más dosis por día, con una durada del tratamiento desde varios días hasta varios meses o hasta que sea efectuada una curación o se consiga una disminución del estado de enfermedad. Personas con conocimientos en el campo pueden determinar fácilmente dosis óptimas, metodologías de dosificación y tasas de repetición.

Además de acuerdo con la presente invención se proporciona un método para identificar una región cromosómica que alberga el gen heparanasa humana en un cromosoma laxo. El método se ejecuta implementando los siguientes pasos del método, en los que en el primer paso el cromosoma laxo (ya en interfase o metafase laxa) es hibridado con una sonda polinucleótida marcada codificante de heparanasa. El marcaje se hace preferiblemente con un marcador fluorescente. En un segundo paso de acuerdo con el método se lava el cromosoma laxo, para retirar el exceso de sonda no hibridado. Finalmente, se buscan señales asociadas con la sonda polinucleótida marcada hibridada, en dónde las señales detectadas son indicativas de una región cromosómica que alberga el gen heparanasa humano.

Uno con conocimientos en el campo sabrá cómo utilizar las secuencias aquí descritas en reacciones de marcaje adecuadas y cómo usar las sondas marcadas para detectar, utilizando hibridación in situ, una región cromosómica que albergue el gen heparanasa humano.

Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos, los cuales junto con las descripciones anteriores, ilustran la invención de una forma ilimitada.

Ejemplos

Los siguientes protocolos y detalles experimentales están referenciados en los Ejemplos que siguen:

Purificación y caracterización de heparanasa a partir de una línea celular de hepatoma humano y placenta humana: Se eligió una línea celular de hepatoma humano (Sk-hep-1) como fuente para la purificación de una heparanasa derivada de un tumor humano. La purificación fue esencialmente como se describe en la patente Estadounidense No. 5,362,641 a Fuks.

Brevemente, 500 litros, 5x10^{11} células se cultivaron en suspensión y la enzima heparanasa fue purificada unas 240.000 veces por aplicación de los siguientes pasos: (i) intercambio de cationes (CM-Sephadex) cromatografía realizada a pH 6,0, gradiente NaCl 0,3-1,4 M; (II)intercambio de cationes (CM-Sephadex) cromatografía realizada a pH 7,4 en presencia de CHAPS 0,1%, gradiente NaCl 0,3-1,1 M; (iii) cromatografía heparin-Sepharose realizada a pH 7,4 en presencia de CHAPS 0,1%, gradiente NaCl 0,35-1,1 M; (iv) cromatografía ConA-Sepharose realizada a pH 6,0 en un tampón que contiene CHAPS 0,1% y 1 M NaCl, elusión con 0,25 M \alpha-metilmanosa; y (v) intercambio catiónico HPLC (Mono-S) cromatografía realizada a pH 7,4 en presencia de CHAPS 0,1%, gradiente NaCl 0.25-1 M.

Las fracciones activas se agruparon, se hicieron precipitar con TCA y el precipitado se sometió a electroforesis en gel SDS poliacrilamida y/o digestión tríptica y HPLC de fase reversa. Los péptidos trípticos de la proteína purificada se separaron por HPLC de fase reversa (columna C8) y los picos homogéneos se sometieron a análisis de la secuencia de aminoácidos.

La enzima purificada se aplicó a HPLC de fase reversa y se sometió a secuenciación de los aminoácidos N-terminal utilizando el secuenciador de aminoácidos (Applied Biosystems).

Células: Cultivos de células endoteliales de córnea bovina (BCECs), se establecieron a partir de ojos de buey como se describe anteriormente (19,38). Cultivos en stock se mantuvieron en DMEM (1 g glucosa/litro) suplementado con un 10% de suero de becerro recién nacido y 5% FCS. Se añadió bFGF (1 ng/ml) cada día durante la fase activa de crecimiento celular 13,14).

Preparación de placas recubiertas con MEC: BCECs (pasaje segundo al quinto) se plaquearon en placas de 4 pocillos en una densidad inicial de 2 x 10^{5} células/ml, y se cultivaron en medio Fisher libre de sulfato más dextrano T-40 5% durante 12 días. Se añadió Na_{2}^{35}SO_{4} (25 \muCi/ml) el día 1 y 5 después de la siembra y los cultivos se incubaron con el marcador sin cambiar el medio. La MEC subendotelial se expuso disolviendo (5 min., temperatura ambiente) la línea celular con PBS conteniendo Triton X-100 0,5% y NH_{4}OH 20 mM, seguido de cuatro lavados con PBS. La MEC permaneció intacta; libre de restos celulares y firmemente unida al área completa de tejido de la placa de cultivo (l9, 22).

Para preparar proteoglicanos solubles marcados con sulfato (material pico I), la MEC fue digerida con tripsina (25 mg/ml, 6 h, 37ºC), el digesto se concentró por diálisis reversa y el material concentrado se aplicó a una columna de gel filtración de Sepharose 6B. El material resultante de alto peso molecular (Kav< 0,2, pico 1) se recogió. Más del 80% del material marcado resultó estar compuesto de proteoglicanos heparan sulfato (19,39).

Actividad heparanasa: Células (1 x 10^{6}/35-mm placa), lisados celulares o medio acondicionado se incubaron encima de MEC marcada con ^{35}S (18 h, 37ºC) en presencia de tampón fosfato 20 mM (pH 6,2). Lisados celulares y medio acondicionado también se incubaron con material del pico I marcado con sulfato (10-20 \mul). El medio de incubación fue recogido, centrifugado (18,000 x g, 4ºC, 3 min.), y el material marcado con sulfato se analizó por filtración en gel con columna de Sepharose CL-6B (0,9 x 30 cm). Se eluyeron fracciones (0,2 ml) con PBS en una velocidad de flujo de 5 ml/h y se contaron por radioactividad utilizando fluido de centelleo Bio-fluor. El volumen excluido (Vo) se marcó con dextrano azul y el volumen total incluido (V_{t}) con rojo de fenol. Se observó que éste último comigraba con sulfato libre (7, 11, 23). Fragmentos de degradación de cadenas laterales de HS fueron eluídos con Sepharose 6B
a 0,5 < Kav < 0,8 (pico II) (7,11,23). Un HSPG casi intacto liberado de MEC por tripsina - y en menor extensión, durante la incubación con PBS solo - fue eluído cerca de Vo (Kav < 0.2, pico 1). Las recuperaciones de material marcado en las columnas fueron del 85 al 95% en diferentes experimentos (11). Cada experimento se realizo como mínimo tres veces y la variación de posición de los eluídos (valores Kav) no excedieron de +/-15%.

Clonaje de cADN hpa: los clones cADN 257548 y 260138 se obtuvieron del I.M.A.G.E Consortium (2130 Memorial Parkway SW, Hunstville, AL 35801). Los cADN se clonaron originalmente en los sitios de clonaje EcoRI y NotI en el vector plasmídico pT3T7D-Pac. Aunque se describió que estos clones presentaban algunas diferencias, la secuenciación de ADN demostró que estos clones son idénticos. El complejo cADN Marathon RACE (RIM) (amplificación rápida de los extremos del cADN) de placenta humana (poli-A) fue un obsequio del Prof: Yossi Shiloh de la universidad de Tel Aviv. Este complejo no tiene vector, pues incluye fragmentos de cADN transcritos de forma reversa en ambos extremos de los cuales están unidos adaptadores de cadena doble, parcialmente simple. La construcción del complejo específico utilizado se describe en la referencia 39a.

La amplificación del fragmento PCR hp3 se realizó de acuerdo con el protocolo aportado por laboratorios Clontech. El molde utilizado para la amplificación era una muestra extraída del complejo anterior. Los cebadores utilizados para la amplificación fueron:

Primer paso: cebador-5': AP1: cebador -CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3', ID de SEC NO:1; cebador-3': HPL229: 5'-GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC-3', ID de SEC NO:2.

Segundo paso: anidado de cebador-5': AP2: 5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3'; ID de SEC NQ:3; anidado de cebador-3': HPLl71: 5'-GCATCTTAGCCGTCTTTCTTCG-3', ID de SEC ND:4. El HPL229 y HPL171 fueron seleccionados de acuerdo con la secuencia de los clones EST. Incluyen los nucleótidos 933-956 y 876-897 de ID de SEC NO:9, respectivamente.

El programa de PCR fue 94ºC - 4 min., seguido por 34 ciclos de 94ºC -40 seg., 62ºC -l min., 72ºC -2,5 min. La amplificación se realizó con Expand High Fidelity (Boehringer Mannheim). El producto PCR resultante ca. 900 pb hp3 se digirió con BfrI y PvuII. El clon 257548 (phpa1) fue digerido con EcoRI, seguido de relleno de los extremos y fue después también digerido con BfrI. Después de esto el fragmento PvuII - BfrI del producto de PCRhp3 se clonó en el extremo romo - extremo BfrI del clon phpa1 que resultó tener entero el cADN clonado en el vector pT3T7-pac, designado phpa2.

Secuenciación de DNA: Las determinaciones de las secuencias se realizaron con cebadores específicos de los vectores y específicos del gen, utilizando un secuenciador de ADN automático (Applied Biosystems, modelo 373A). Cada nucleótido se leyó como mínimo a partir de dos cebadores independientes.

Análisis de secuencias por ordenador: Búsquedas en bases de datos de similaridades de secuencia se realizaron utilizando el servicio en red Blast. El análisis de la secuencia y alineamiento de las secuencias de ADN y proteína se hicieron utilizando el paquete de software para análisi de secuencia de ADN desarrollado por el Genetic Cornputer Group (GCG) de la Universidad de Wisconsin.

RT-PCR: El ARN se preparó utilizando el reactivo TRI (Molecular research center Inc.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se sacaron 1,25 \mug para la reacción de transcripción reversa utilizando la transciptasa reversa MUMLV (Gibco BRL) y el cebador Oligo (dT)15, ID de SEC NO:5, (Promega). La amplificación de la primera cadena de cADN resultante se realizó con Taq polimerasa (Promega). Se utilizaron los cebadores siguientes: HPU 355: 5'-TTCGATCCCAAGAAGGAATCAAC-3', ID de SEC NO:6, nucleótidos 372-394 en ID de SEC NO:9 o 11.

HPL-229: 5'-GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC-3', ID de SEC NO:7, nucleótidos 933-956 en ID de SEC NO:9 o 11.

Programa de PCR: 94ºC - 4 min., seguido por 30 ciclos de 94ºC - 40 seg., 62ºC - l min., 72ºC-1 min.

Expresión de heparanasa recombinante en células de insectos: Células, High Five (RIM) y líneas celulares de insecto Sf21 se mantuvieron como cultivos monocapa en medio SF900II-SFM (GibcoBRL).

Baculovirus recombinante: El virus recombinante que contiene el gen hpa se construyó utilizando el sistema Bac to Bac (GibcoBRL). El vector de transferencia pFastBac fue digerido con SalI y NotI y ligado con un fragmento phpa2 de 1,7 Kb digerido con XhoI y NotI. El plásmido resultante se designó pFasthpa2. Se preparó un plásmido idéntico designado pFasthpa4 como un duplicado y los dos independientemente se usaron para próximos experimentos. El bácmido recombinante se generó de acuerdo con las instrucciones de la producción con pFasthpa2, pFasthpa4 y con pFastBac. El último se usó como un control negativo. Los ADNs del bácmido recombinante se transfectaron dentro de las células SF21 de insectos. Cinco días después de la transfección los virus recombinantes se cosecharon y se usaron para infectar High five cells(RIM), 3 x 10^{6} células en flascos T-25. Las células se cosecharon 2 - 3 días después de la infección. 4 x 10^{6} células se centrifugaron y se resuspendieron en una reacción tampón que contiene un tampón de citrato de fósforo 20 mM, NaCl 50 mM. Las células experimentaron tres ciclos de congelación y descongelación y las células lisadas se guardaron a -80ºC. El medio acondicionado se guardó a 4ºC.

Purificación parcial de heparanasa recombinante: La purificación parcial de la heparanasa recombinante se realizó mediante cromatografía en columna de heparin-Sepharose seguida de una columna de gel filtración Superdex 75. El medio de cultivo (150 ml) de las células Sf21 infectadas con virus pFhpa4 se sometió a cromatografía de heparin-Sepharose. Una elución de fracciones de 1 ml se realizó con un gradiente de 0,35 ml de NaCl 2 M en presencia de 0,1% CHAPS y DTT 1 mM en un tampón de acetato de sodio de 10 mM, PH 5,O. Una muestra de 25 \mul de cada fracción se probó por su actividad heparanasa. La actividad heparanasa se obtuvo en el rango de 0,65 -1,1 M NaCl (fracciones 18-26, Figura 10a). 5 \mul de cada fracción se sometieron a una electroforesis de gel SDS- poliacrilamida al 15% seguida de una coloración con nitrato de plata. Fracciones activas extraídas de la heparin-Sefarosa (Figura 10a) se combinaron y se concentraron (x 6) en la membrana cortada de YM3. 0,5 ml de la materia concentrada se aplicaron sobre una columna de 30 ml Superdex 75 FPLC equilibrada con un tampón de acetato de sodio 10 mM, pH 5,0, conteniendo NaCl 0,8 M, DTT 1 mM y CHAPS 0,1%. Las fracciones (0,56 ml) se aglomeraron a un índice de flujo de 4,75 ml/tnin: Alícuotas de cada fracción se probaron por la actividad heparanasa y se sometieron a una electroforesis en gel SDS- poliacrilamida seguida de una coloración con nitrato de plata (Figura 11b).

Ejemplo 1 Clonaje del gen hpa

La fracción purificada de la heparanasa aislada de células humanas de hepatoma (SK-hep-1) se sometió a una digestión tríptica y microsecuenciación. Las bases de datos de EST (Etiqueta de Secuencia Expresada) se cribaron por homología de la parte superior de secuencias de ADN traducido correspondiente a los péptidos obtenidos. Dos secuencias EST (entrada Nos. N41349 y N45367) contenían una secuencia de ADN codificando el péptido YGPDVGQPR (ID de SEC NO:8). Estas dos secuencias se obtuvieron a partir de las copias 257548 y 260138 (Consorcio I.M.A.G.E) preparadas a partir de la biblioteca de cADN (Soares) de placenta de 8 a 9 semanas. Los dos clones encontrados que eran identicas contenían un inserto de 1020 pb que incluía un marco de lectura abierto (ORF) de 973 bp seguido por una región no traducible de 27 pb y una cola Poli A. El sitio por donde no se empieza la traducción (AUG) se identificó en el extremo 5' de estas copias.

La clonaje del extremo 5' se realizó por amplificación PCR de ADN de una mezcla de cADN de placenta Marathon Race (RIM). Se obtuvo un fragmento de 900 pb (designado hp3), parcialmente imbricado con el extremo 3'de los clones identificados que codifican EST.

El fragmento de ADN unido, 1721 pb de largo (ID de SEC NO:9), contenía un marco de lectura abierto que codifica, como se muestra en la Figura I y ID de SEC NO:l1, un polipéptido de 543 aminoácidos (ID de SEC ID NO:10) con un peso molecular calculado de 61,192 daltons. Los extremos 3' de las partes de inserto de cADN contenidos en las copias 257548 y 264138 empezaban en el nucleótido G^{721} de ID de SEC. NO:9 y Figura 1.

Tal como se muestra en la figura 1 más adelante, había una sola discrepancia de secuencia entre las copias EST y la secuencia amplificada por PCR, la cual conduce a una sustitución aminoacídica del Tyr^{246} en el EST a Phe^{246} en el cADN amplificado. La secuencia nucleotídica del fragmento de cADN amplificado por PCR se verificó a partir de dos productos de amplificación independientes. El nuevo gen se designó hpa.

Tal y como se ha dicho antes, los extremos 3' de los insertos parciales de cADN contenidos en las copias EST 257548 y 264138 empezaron en el nucleótido 721 de hpa (ID de SEC NO:9). La habilidad del cADN de hpa para formar estructuras secundarias estables, tales como estructuras de tallo o de lazo que implican separación de nucleótidos en la vecindad de la posición 721 se investigó utilizando modulación informática. Se descubrió que estructuras estables de tallo y lazo son propensas a ser formadas implicando los nucleótidos 698-724 (ID de SEC NO:9). Además, un alto contenido en GC, más del 70%, caracteriza la región del extremo 5' del gen hpa, en comparación con solamente sobre el 44% en la región 3'. Estos descubrimientos pueden explicar la terminación inmadura y en consecuencia la ausencia de los extremos 5' en las copias EST.

Para examinar la capacidad del producto del gen hpa para catalizar la degradación de heparansulfato en un ensayo in vitro el marco de lectura abierto completo se expresó en células de insecto, utilizando el sistema de expresión de Baculovirus. Los extractos de la células infectadas con el virus que contiene el gen hpa, se demostró que tenían un alto nivel de actividad de degradación de heparansulfato, mientras células infectadas con una estructura similar sin el gen hpa no tenían esa actividad, tampoco las células no infectadas. Estos resultados se demuestran en los siguientes Ejemplos.

Ejemplo 2 Degradación de HSPG solubles derivados de la MEC

Cultivos en monocapa de High Five cells (RIM) fueron infectados (72 h, 28ºC) con Bacoluvirus recombinante que contenía el plásmido pFasthpa o con un virus control que contenía un inserto de plásmido libre. Las células se cosecharon y se degradaron en un tampón de reacción heparanasa por tres ciclos de congelación y descongelación. Los lisados de la célula se incubaron después (l8 h, 37ºC) con sulfato marcado, HSPG derivados de la MEC (pico I), seguido por un análisis de gel filtración (Sepharose 6B) de la mezcla de reacción.

Tal y como se muestra en la Figura 2, solamente el sustrato comprendía casi todo el material de alto peso molecular (Mr) eluído cerca al V_{o} (pico 1, fracciones 5-20, Kav <0,35). Un patrón de elución similar se obtuvo cuando el sustrato HSPG se incubó con lisados de células que fueron infectadas con un virus control. Al contrario,la incubación del sustrato HSPG con lisados de células infectadas con el hpa que contiene el virus resultó en una conversión completa del substrato de alto peso molecular a fragmentos marcados de degradación de bajo peso molecular (pico II, fracciones 22-35, 0.5 < Kav <. 0.75).

Fragmentos eluídos en el pico II resultaron ser productos de degradación de heparan sulfato, eran (i) 5- a 6-veces más pequeños que las cadenas laterales de heparan sulfato intactas. (Kav aprox. 0,33) liberados de la MEC por tratamiento con ya sea borohídruro alcalino opapaína; y (ii) resistente a posterior digestión con papaína o condroitinasa ABC, y susceptible a desaminación con ácido nitroso (6,11).

Resultados similares (no mostrados) se obtuvieron con células Sf21. De nuevo, se detectó actividad heparanasa en células infectadas con virus que contienen el hpa (pFhpa), pero no en los virus control (pF). Este resultado fue obtenido con dos virus recombinantes obtenidos independientemente. Lisados de células High Five (RIM) control no degradaron el sustrato HSPG.

En experimentos siguientes, los sustratos HSPG marcada fueron incubados con un medio acondicionado por High Five (RIM) infectadas o células Sf21.

Como se muestra en las Figuras 3a-b, la actividad heparanasa, reflejada por la conversión del sustrato del pico I de elevado peso molecular al pico II de bajo peso molecular que representa fragmentos de degradación de HS, se encontró en el medio de cultivo de células infectadas con virus pFhpa2 o pFhpa4, pero no con los virus control pFl o pF2. No se detectó actividad heparanasa en el medio de cultivo de células control no infectadas High Five (RIM) o células Sf21.

El medio de células infectadas con virus pFhpa4 se pasó a través de una membrana cortada de 50 kDa para obtener una estimación pura del peso molecular de la enzima heparanasa recombinante. Como se demuestra en la Figura 4, toda la actividad enzimática fue retenida en el compartimiento superior y no hubo actividad en el material que fluyó (<50 kDa). Este resultado concuerda con el peso molecular esperado del producto génico hpa.

Con el propósito de caracterizar más el efecto inhibitorio de la heparina sobre el producto hpa, se examinó un potente inhibidor de la degradación de HS mediada por heparanasa (40).

Como se muestra en las Figuras 5a-b, la conversión del sustrato pico I en fragmentos de degradación de HS pico II fue completamente eliminada en presencia de heparina.

Juntos, estos resultados indican que la enzima heparanasa se expresa en una forma activa por células de insectos infectadas con Baculovirus que contiene el recién identificado gen hpa humano.

Ejemplo 3 Degradación de HSPG en la MEC intacta

Después, se investigó la capacidad de las células de insectos infectadas intactas para degradar HS en una MEC intacta, producida de forma natural. Para éste propósito, células High Five (RIM) o Sf21 fueron cultivadas en una MEC marcada metabólicamente con sulfato y seguido por infección (48 H, 28ºC) ya sea con virus pFhpa4 o virus control pF2. El pH del medio se ajustó luego a 6,2-6,4 y las células se incubaron otra vez con la MEC marcada durante 48 h más a 28ºC o 24 h a 37ºC. El material marcado con sulfato liberado al medio de incubación se analizó por filtración en gel Sepharose 6B.

Como se muestra en las Figuras 6a-b y 7a-b, la incubación de la MEC con células infectadas con el virus control pF2 resultó en una liberación constante de material marcado que consistió casi enteramente (>90%) en fragmentos Mr de peso molecular elevado (pico I) eluidos con o cerca de Vo. Se mostró previamente que una actividad proteolítica permanente en la propia MEC y/o expresada por células es responsable de la liberación de material de peso molecular elevado (6). Éste HSPG casi intacto proporciona un sustrato soluble por subsecuente degradación con heparanasa, como también se indica por la relativamente elevada cantidad de material del pico I acumulado cuando la enzima heparanasa es inhibida por la heparina (6, 7, 12, Figura 9). Por otro lado, la incubación de la MEC marcada con células infectadas por el virus pFhpa4 resultó en la liberación del 60-70% de radioactividad asociada a la MEC en forma de fragmentos de peso molecular bajo marcada con sulfato (pico II, 0,5 <Kav< 0,75), sin tener en cuenta si las células infectadas fueron incubadas con la MEC a 28ºC o 37ºC. Las células control intactas Sf21 o High Five (RIM) no consiguieron degradar las cadenas laterales de HS en la MEC.

En experimentos subsecuentes, como se demuestra en las Figs. 8a-b, células High Five (RIM) y Sf21 fueron infectadas (96 h, 28ºC)con virus pFhpa4 o virus control pFl y el medio de cultivo se incubó con MEC marcada con sulfato. Fragmentos de degradación HS de bajo peso molecular se liberaron de la MEC sólo en incubación con medio acondicionado por células infectadas con pFhpa4. Como se muestra en la Figura 9, la producción de estos fragmentos fue eliminada en presencia de heparina. No se detectó actividad heparanasa en el medio de cultivo control, células no infectadas. Estos resultados indican que la enzima heparanasa expresada por células infectadas con el virus pFhpa4 es capaz de degradar HS cuando está complejada con otros componentes macromoleculares (pej fibronectina, laminina, colágeno) de una MEC intacta producida de forma natural, de una manera similar a la descrita en las células tumorales altamente metastásicas o células activadas del sistema inmunitario (6, 7).

Ejemplo 4 Purificación de la heparanasa recombinante

La heparanasa recombinante fue parcialmente purificada a partir de un medio de células Sf21 infectadas con pFhpa4 por cromatografía en Heparina-Sepharose (Figura l0a) seguido de filtración en gel de las fracciones activas agrupadas en una columna FPLC Superdex 75 (Figura 11a). Se observó una proteína de \sim 63 kDa, cuya cantidad, como fue detectada por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS con tinción de plata, correlacionó con la actividad heparanasa en las fracciones de la columna relevantes (Figuras l0b y 1lb, respectivamente). Esta proteína no se detectó en el medio de cultivo de células infectadas con el virus control pF1 virus y fue sometida a un fraccionamiento similar en heparina-Sepharose (no mostrado).

Ejemplo 5 Expresión del gen hpa en varios tipos celulares, órganos y tejidos

Refieriéndose ahora a las Figuras l2a-e, se aplicó RT-PCR para evaluar la expresión del gen hpa en varios tipos celulares y tejidos. Para este propósito, el ARN total fue transcrito de forma reversa y amplificado. El cADN esperado de 585 pb de longitud fue claramente evidenciado en riñón humano, placenta (8 y 11 semanas) y tejidos de mola, así como en células citotrofoblásticas humanas brevemente cultivadas (1,5-48 h) y recién aisladas (Figura 12a), en todas conocida su elevada expresión de actividad heparanasa (41). El transcrito hpa fue también expresado por neutrófilos humanos normales (Figura 12b). En contraste, no hubo expresión detectable del mARN de hpa en tejido muscular humano embrionario, timo, corazón y suprarrenal(Figura 12b). El gen hpa fue expresado en algunas, pero no todas, líneas celulares de carcinoma de vejiga (Figura 12c), hepatoma SK (SK-hep-1), carcinoma ovárico (OV 1063), carcinoma mamario (435, 231), líneas celulares humanas de melanoma y megacariocíticas (DAMI, CHRF) (Figuras 12d-e).

Se determinó que el patrón de expresión antes descrito del transcrito hpa tiene una muy buen correlación con los niveles de actividad heparanasa determinados en varios tejidos y tipos celulares (no mostrado).

Ejemplo 6 Genes homólogos hpa

Bases de datos EST se cribaron por secuencias homólogas al gen hpa. Tres EST de ratón fueron identificados (No. entrada Aal77901, de bazo de ratón, Aa067997 de piel de ratón, Aa47943 de embrión de ratón), ensambladas a un fragmento cADN de 824 pb que contiene un marco de lectura abierto parcial (un extremo 5' ausente) de 629 pb y una región 3' no traducida de 195 pb_{} (ID SEC NO: 12). Como se muestra en la Figura 13, la región codificante es similar en un 80% al extremo 3' de la secuencia del cADN de hpa. Estos EST son probablemente fragmentos cADN del hpa homólogo de ratón que codifica para la heparanasa de ratón.

La búsqueda de los dominios de consenso de la proteína reveló una homología amino terminal entre la heparanasa y varias proteínas precursoras tales cómo precursor Procolágeno Alfa 1, proteína tirosin-cinasa RYK, Fibulina 1, proteína de unión a factor de crecimiento tipo insulínico y algunos otros. El extremo amino es altamente hidrofóbico y contiene un dominio transmembrana potencial. La homología con las secuencias de péptidos señales conocidos sugiere que podría funcionar como un péptido de señalización para la localización proteica.

Ejemplo 7 Aislamiento de un extremo 5' extendido del cADN hpa a partir de la línea celular humana SK-hep1

El extremo 5' del cADN hpa fue aislado a partir de la línea celular SK-hep1 humana por amplificación por PCR utilizando el kit Marathon RACE (RIM) (amplificación rápida de extremos de cDNA) (Clontech). El ARN total se preparó a partir de células SK-hepl utilizando el reactivo TRI (Molecular research center Inc.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se aisló ARN + Poly A utilizando el kit separador de mARN (Clonetech).

El complejo cADN Marahton RACE SK-hep 1 se construyó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La primera ronda de amplificación se llevó a cabo utilizando un cebador específico del adaptador AP1: 5'-CCATCC
TAATACG ACTCACTATAGGGC-3', ID de SEC NO: 1, y un cebador antisentido específico para hpa hpl-629: 5'-CCCCAGGAGCAGCAGCATCAG-3', ID de SEC NO: 17, correspondiendo a los nucleótidos 119-99 de ID de SEC NO: 9. El producto de PCR resultante se sometió a una segunda ronda de amplificación utilizando un cebador anidado específico del adaptador AP2: 5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3', ID de SEC NO:3, y un cebador antisentido anidado específico para hpa hpl-666 5'-AGGCTTCGAGCGCAGCAGCAT-3', ID de SEC NO:18, correspondiendo a los nucleótidos 83-63 de ID de SEC NO: 9. El programa de PCR fue el siguiente: un inicio caliente a 94ºC durante 1 minuto, seguido por 30 ciclos de 90ºC - 30 segundos, 68ºC - 4 minutos. El fragmento de ADN de 300 pb se extrajo de un gel de agarosa y se clonó en el vector pGEM-T Easy (Promega). El plásmido recombinante resultante se designó pHPSK1.

La secuencia de nucleótidos del inserto de pHPSK1 fue determinado y se encontró que contenía 62 nucleótidos del extremo 5' de cADN hpa de placenta (ID de SEC NO: 9) y 178 nucleótidos corriente arriba, los primeros 178 nucleótidos de ID de SEC NOs: 13 y 15.

Se identificó una discrepancia en un único nucleótido entre el cADN de SK-hep1 y el cADN de placenta. El derivado de "T" en la posición 9 del cADN de placenta (ID de SEC NO: 9), se sustituye por un derivado de "C" a la correspondiente posición 187 del cADN de SK-hepl (ID de SEC NO: 13).

La discrepancia es probablemente debida a una mutación en el extremo 5' del clon cADN de placenta lo que se confirma con el análisis de secuencia de varios clones cADN adicionales aislados de placenta, que cómo el cADN SK-hep1 contenían C en la posición 9 de ID de SEC NO: 9.

La secuencia extendida 5' del cADN hpa SK-hepl se ensambló con la secuencia del cADN hpa aislado de placenta humana (ID de SEC NO: 9). La secuencia ensamblada contenía un marco abierto de lectura que codifica, como se muestra en ID de SEC NOs: 14 y 15, un polipéptido de 592 aminoácidos con un peso molecular calculado de 66.407 daltons. El marco abierto de lectura está flanqueado por la región 5' no traducida (UTR) de 93 pb.

Ejemplo 8 Aislamiento de una región genómica corriente arriba del gen hpa

La región corriente arriba del gen hpa se aisló utilizando el kit Genome Walker (Clontech) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El kit incluye cinco muestras de ADN genómico humano cada una digerida con una endonucleasa de restricción diferente creando extremos romos: EcoRV, ScaI, DraI, PvuII y SspI.

Los fragmentos de ADN con extremos romos son ligados a adaptadores de cadena parcialmente simple. Las muestras de ADN genómico se sometieron a amplificación por PCR utilizando el cebador específico del adaptador y un cebador específico para el gen. La amplificación se hizo con Expand High Fidelity (Boehringer Mannheim).

Una primera ronda de amplificación se realizó utilizando el cebador ap1: 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3', ID de SEC NO: 19, y el cebador antisentido específico de hpa hpl-666: 5'-AGGCTTCGAGCGCAGCAGCAT-3', ID de SEC NO: 18, correspondiendo a los nucleótidos 83 - 63 de ID de SEC NO: 9. El programa PCR fue el siguiente: un inicio caliente de 94ºC-3 minutos, seguido de 36 ciclos de 94ºC - 40 segundos, 67ºC - 4 minutos.

Los productos de PCR de la primera ronda de amplificación se diluyeron 1:50. Un \mul de la muestra diluida se utilizó como molde para una segunda amplificación utilizando un cebador anidado específico del adaptador ap2: 5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3', ID de SEC NO: 20, y un cebador antisentido específico para hpa hpl-690, 5'-CTTGGGCTCACCTGGCTGCTC-3', ID de SEC NO: 21, correspondiendo a los nucleótidos 62-42 de ID de SEC NO: 9. Los productos resultantes de la amplificación se analizaron utilizando electroforesis en gel de agarosa. Cinco productos PCR distintos se obtuvieron a partir de las cinco reacciones de amplificación. Un fragmento de ADN de aproximadamente 750 pb que se obtuvo de la muestra de ADN de SspI se extrajo con gel. El fragmento purificado se ligó en el vector del plásmido pGEM-T Easy (Promega). El plásmido recombinante resultante se designó pGHP6905 y se determinó la secuencia de nucleótidos del inserto hpa.

Una secuencia parcial de 594 nucleótidos se muestra en la ID de SEC NO: 16. El último nucleótido en ID de SEC NO: 13 corresponde al nucleótido 93 en la SEQ ID:13. La secuencia de ADN en la ID de SEC NO: 16 tiene la región 5' del cADN del hpa y 501 nucleótidos de la región genómica corriente arriba que se predice que contienen la región promotora del gen hpa.

Ejemplo 9 Expresión de los 592 aminoácidos del polipéptido HPA en una línea celular humana

Los 592 aminoácidos del marco de lectura abierto (ID de SEC NOs: 13 y 15) se construyeron por ligación de los 110 pb correspondientes al extremo 5' del cADN de SK-hep1 hpa con el cADN de placenta. Más específicamente el producto de la amplificación por PCR Marathon Race (RIM) del ADN de hpa de placenta se digerió con SacI y aproximadamente un fragmento de 1kb se ligó en un plásmido de SacI pGHP6905 digerido. El plásmido resultante se digerió con EarI y AatII. Los extremos cohesivos de EarI se convirtieron en romos y se aisló un fragmento de aproximadamente 280 pb EarI/romo-AatII. Este fragmento se ligó con pFasthpa digerido con EcoRI al cual se crearon extremos romos utilizando el fragmento Klenow y digiriendo luego con AatII. El plásmido resultante contenía un inserto de 1827 pb el cual incluía un marco de lectura abierto de 1776 pb, 31 pb de UTR 3' y 21 pb de UTR 5'. Este plásmido se designó pFastLhpa.

Un vector de expresión de mamífero se construyó para conducir la expresión del polipéptido heparanasa de 592 aminoácidos en células humanas. El cADN de hpa se extirpó de pFastLhpa con BssHII y NotI. El fragmento resultante de 1850 pb de BssHII se ligó al vector de expresión de un mamífero pSI (Promega) digerido con MluI y NotI. El plásmido recombinante resultante,pSIhpaMet2 se transfectó en una línea celular de riñón embrionaria 293.

La expresión transitoria de los 592 aminoácidos de la heparanasa se examinó mediante análisis Western Blot y la actividad enzimática se comprobó utilizando el ensayo de retraso en gel (gel shift). Ambos procedimientos se describen a lo largo en la solicitud de patente estadounidense No. 09/071,739, archivada 1 Mayo, 1998, que se incorpora por referencia como si se publicara completamente aquí. Las células se cultivaron 3 días después de la transfección. Las células cultivadas se resuspendieron en el tampón de lisis que contiene NaCl 150 mM, Tris 50 mM pH 7,5, Triton 1% X-100, PMSF 1 mM y cóctel inhibidor de proteasa (Boehringer Mannheim). Se utilizó 40 \mum de extracto de proteína de la muestra para la separación en un SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron a una membrana PVDF Hybond-P (Amersham). La membrana se incubó con un anticuerpo antiheparanasa policlonal purificado afín, como se describe en la solicitud de patente Estadounidense No. 09/071,739. Se observó una banda principal de aproximadamente 50 kDa en las células transfectadas así como una banda menor de aproximadamente 65 kDa. Se observó un modelo similar en extractos de células transfectadas con el pShpa como se demuestra en la solicitud de patente Estadounidense No. 09/071,739. Estas dos bandas probablemente representan dos formas de la proteína heparanasa recombinante producida por las células transfectadas. La proteína de 65 kDa probablemente representa un precursor de la heparanasa, mientras que se sugiere que la proteína de 50 kDa sea la forma procesada o madura.

La actividad catalítica de la proteína recombinada expresada en las células transfectadas pShpaMet2 se examinó con un ensayo de retraso en gel (gel shift). Los extractos celulares de las células transfectadas y de las células transfectadas falsas se incubaron durante la noche con heparina (6 \mug en cada reacción) a 37ºC, en presencia de un tampón de citrato fosfato 20 mM pH 5,4, 1 mM CaCl_{2}, DTT 1 mM y NaCl 50 mM. Las mezclas de reacción se separaron en un gel de poliacrilamida 10%. La actividad catalítica de la heparanasa recombinada se demostró claramente por una rápida migración de las moléculas incubadas de heparina con los extractos de las células transfectadas en comparación con el control. Una migraciónmásrápida indica la desaparición de moléculas de heparina de alto peso molecular y la generación de productos de degradación de bajo peso molecular.

Ejemplo 10 Localización cromosomal del gen hpa

El mapeo cromosomal del gen hpa se desempeñó utilizando un panel de híbridos celulares somáticos monocrosomales humano/CHO y humano/ratón, obtenido a partir del UK HGMP Resource Center (Cambridge, Inlgaterra).

40 ng de cada muestra de ADN de híbrido de célula somática se sometieron a una amplificación por PCR utilizando cebadores del hpa: hpu565 S;'-AGCTCTGTAGATGTGC TATACAC-3', ID de SEC NO:22, que corresponde a los nucleótidos 564-586 de la ID de SEC NO:9 y un cebador antisentido hpl171 5'-GCATCTTAGCCGTCTTTCTTCG-3', SEC ID: NO:23, que corresponde a los nucleótidos 897-876 de la ID de SEC NO:9.

El programa de PCR fue así: inicio caliente de 94ºC - 3 minutos, seguido de 7 ciclos de 94ºC - 45 segundos, 66ºC - 1
minuto, 68ºC - 5 minutos; seguido de 30 ciclos de 94 segundos, 62ºC - l minuto, 68ºC - 5 minutos, y una extensión final de 10 minutos a 72ºC.

Las reacciones se llevaron a cabo con PCR de amplia expansión (Boehringer Mannheim). Los productos de amplificación resultantes se analizaron utilizando electroforesis en gel de agarosa. Como se demuestra en la Figura 14, una única banda de aproximadamente 2,8 Kb se obtuvo a partir del cromosoma 4, así como a partir del ADN genómico humano control. Un producto de amplificación de 2,8 kb se espera que se base en la amplificación del clon genómico de hpa(datos no mostrados). Los productos no amplificados no se obtuvieron ni en la muestra control de ADN de hámster y ratón ni en híbridos somáticos de otros cromosomas humanos.

Lista de referencias anteriormente citadas por números

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Iris Pecker, Israel Vlodavsky y Elena Feinstein.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: CODIFICACIÓN POLINUCLEÓTIDA DE UN POLIPÉPTIDO CON ACTIVIDAD HEPARANASA Y EXPRESIÓN DEL MISMO EN CÉLULAS TRANSDUCIDAS

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 23

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(iv)

DIRECCIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DIRECCIÓN: mark M. Friedman c/o Robert Sheinbein

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 2940 Birchtree lane

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(C)

CIUDAD: Silver Spring

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(D)

ESTADO: Maryland

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(E)

PAIS: Estados Unidos de América

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

ZIP 20906

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(v)

FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: disco de 3,5'', 1,44 Mb

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: Twinhead* Slimnote-890TX

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS 6.2, Windows 3.11

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMAS: Word para windows 2.0 convertido en archivo ASCI

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE ARCHIVO:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

FECHA ANTERIOR DE SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/922.170

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE ARCHIVO: 2 SEP 1997

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(viii)

INFORMACIÓN DEL PROCURADOR/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Friedman, Mark M.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 33.883

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/ETIQUETA: 910/1

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 972-3-5625553

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FAX: 972-3-5625554

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(C)

TELEX:

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: simple

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº:1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº:2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAGTGATGC CATGTAACTG AATC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº:3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTCACTATA GGGCTCGAGC GGC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCATCTTAGC CGTCTTTCTT CG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTTTTTTTT TTTTT

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCGATCCCA AGAAGGAATC AAC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAGTGATGC CATGTAACTG AATC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 pares de bases

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(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Gly Pro Asp Val Gly Gln Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1721 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº:9:

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 543 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº:10:

\vskip1.000000\baselineskip

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1718 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº:11:

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 824 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº:12:

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1899 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº:13:

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 592 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº:14:

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1899 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº:15:

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 594 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº:16:

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº:17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCCAGGAGC AGCAGCATCA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº:18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGCTTCGAG CGCAGCAGCA T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº:19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAATACGAC TCACTATAGG GC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTATAGGGC ACGCGTGGT

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº:21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTGGGCTCA CCTGGCTGCT C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº:22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTCTGTAG ATGTGCTATA CAC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº:23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCATCTTAGC CGTCTTTCTT CG

\hfill

22

Claims (15)

1. Un fragmento aislado de polinucleótido que comprende una secuencia polinucleótida que codifica un polipéptido que tiene actividad catalítica heparanasa, en que dicho polipéptido comparte al menos un 70% de homología con la ID de SEC NOs: 10 o 14 o un fragmento funcional de la misma que tenga actividad catalítica heparanasa.

2. El fragmento polinucleótido de la reivindicación 1, en que dicha secuencia polinucleótida incluye los nucleótidos 63 - 1691 del ID de SEC NO: 9 o los nucleótidos 139 -1869 del ID de SEC NO: 13.

3. El fragmento polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en que dicha secuencia polinucleótida incluye los nucleótidos 63 - 721 de la ID de SEC NO: 9.

4. El fragmento polinucleótido de la reivindicación 1, en que dicho polinucleótido está en la ID de SEC NO: 9 o 13.

5. El fragmento polinucleótido de la reivindicación 1, en dónde dicho polipéptido incluye una secuencia de aminoácidos cómo la expuesta en ID de SEC NOs: 10 o 14.

6. Un fragmento polinucleótido que comprende una secuencia polinucleótida con un mínimo del 70% de homología con ID de SEC NOs: 9 o 13, dicha secuencia polinucleótida codifica un polipéptido con actividad catalítica heparanasa.

7. El fragmento polinucleótido de cualquier reivindicación precedente, en dónde dicha secuencia polinucleótida es seleccionada del grupo que consiste en ADN de doble cadena, ADN de cadena simple y ARN.

8. Un vector que contiene un fragmento polinucleótido de acuerdo con cualquier reivindicación precedente.

9. Una célula huésped que contiene un fragmento polinucleótido exógeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

10. Una proteína recombinante, que es un polipéptido de 543 aminoácidos como se expone en la ID de SEC NO: 10 con un peso molecular calculado de 61.192 daltons o una parte funcional de éste.

11. Un polipéptido de 592 aminoácidos que se expone en IDde SEC NO: 14 con un peso molecular calculado de 66.407 daltons o una parte funcional de éste.

12. Una composición farmacéutica que contiene, como un ingrediente activo, la proteína/polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 10 o 11 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. Un dispositivo médico que contiene, como un ingrediente activo, una proteína/polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 10 o 11.

14. Un sistema de sobreexpresión de heparanasa que contiene una célula que sobreexpresa heparanasa que comparte como mínimo un 70% de homología con ID de SEC NOs: 10 o 14 y codificada por un fragmento polinucleótido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

15. Un método para identificar la región del cromosoma que alberga el gen heparanasa en un cromosoma laxo que comprende los pasos:

(a) hibridación del cromosoma laxo con una sonda polinucleótida marcada de acuerdo con las reivindicaciones 6 o 7,

(b) lavado del cromosoma laxo, para retirar el exceso de sonda no hibridada; y

(c) búsqueda de señales asociadas con dicha sonda marcada hibridada, en dónde las señales detectadas son indicativas de la región del cromosoma que alberga el gen heparanasa.