JP2001514855A - ヘパラナーゼ活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドおよび移入細胞での該ポリペプチドの発現 - Google Patents
ヘパラナーゼ活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドおよび移入細胞での該ポリペプチドの発現Info
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Abstract
Description
ド(以下、hpaという)、該ペプチドを含むベクターおよびヘパラナーゼを発
現する移入細胞に関する。本発明はさらにヘパラナーゼ活性を有する組換えタン
パク質に関する。
の広範な細胞の細胞表面と細胞外マトリックス(ECM)と会合している偏在性
高分子である(1〜4)。基本的なHSPG構造はタンパクコアから構成され、
それに幾つかの線状ヘパラン硫酸鎖が共有結合している。これら多糖鎖は一般に
様々な程度でN−およびO−結合硫酸部分およびN−結合アセチル基により置換
されたヘキスロン酸およびD−グルコサミン二糖単位の繰返しから構成される(
1〜4)。細胞の付着、増殖および分化におけるECM分子の関与に関する研究
は、胎児性形態形成、脈管形成、軸索派生および組織修復におけるHSPGの中
心的役割を明らかにした(1〜5)。HSPGは血管の顕著な成分である(3)
。大型の脈管ではそれらが殆ど動脈内膜と血管中脈に濃縮しているが、一方、毛
管ではそれが内皮下の基底膜に主に見出される。そこでHSPGは内皮細胞の増
殖と移動を支え、毛管壁の構造を安定化する。コラーゲン、ラミニンおよびフィ
ブロネクチンなどのECM高分子と相互作用する、また、血漿膜上の異なる付着
部位と相互作用するHSPGの能力は、ECM成分の自己集合と不溶性において
の、ならびに細胞の付着と運動においての、このプロテオグリカンの重要な役割
を示唆している。従って、ヘパラン硫酸(HS)の切断は内皮下ECMの分解に
至り、それ故、血液由来細胞の血管外遊出において決定的な役割を演じている可
能性がある。HS異化作用は炎症、外傷修復、糖尿病、および癌転移において観
察され、HSを分解する酵素が病状の経過において重要な役割を演じていること
を示唆している。ヘパラナーゼ活性は活性化免疫系細胞および高度転移癌細胞に
おいて説明されているが(6〜8)、ヘパラナーゼが病的症状の潜在的引き金の
役割を果たしているか否か探究するための生物学的手段が欠如するために、研究
のハンディキャップとなっている。
下にある基底膜(BM)を分解して血管外組織に逃れようとするが、そこで腫瘍
細胞は転移を確立する(9、10)。転移腫瘍細胞は多くの場合隣接する内皮細
胞間の細胞間接合部位またはその近傍に接着する。転移細胞のかかる接着は、接
合部の離断、内皮細胞縁の退縮、内皮の裂け目を通して露呈された下層BMへの
移動へと続く(9)。内皮細胞とBMとの間に位置した浸襲細胞は、脈管区画外
へ移動するために、BM内皮下の糖タンパク質およびプロテオグリカンを分解し
なければならない。数種の細胞性酵素(例えば、コラゲナーゼIV、プラスミノ
ーゲン活性化因子、カテプシンB、エラスターゼなど)はBMの分解に関与して
いると考えられている(10)。これらの酵素の内、特定の鎖内部位でHSを切
断するのがエンド−β−D−グルクロニダーゼ(ヘパラナーゼ)である(6、8
、11)。HS分解ヘパラナーゼの発現は、マウスのリンパ腫(11)、線維肉
腫、および黒色腫(メラノーマ)(8)細胞の転移潜在力と相関することが見出
された。さらに、上昇したヘパラナーゼのレベルは転移腫瘍担持動物とメラノー
マ患者の血清(8)および癌患者の腫瘍生検(12)に検出された。
び脈管内皮細胞により産生される細胞外マトリックス(ECM)と細胞との相互
作用に焦点を絞り、本発明者らにより以前に検討された。この培養ECMはその
形態学的な外観および分子組成においてin vivoでは内皮下層によく似ている。 このものはコラーゲン(殆どがタイプIIIおよびIVであり、少量のタイプIおよ びVを含む)、プロテオグリカン(殆どがヘパラン硫酸−およびデルマタン硫酸
−プロテオグリカンであり、少量のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを含む
)、ラミニン、フィブロネクチン、エンタクチンおよびエラスチンを含んでいる
(13,14)。細胞が培養ECMにおいてHSを分解する能力については、細
胞が代謝により硫酸標識されたECMと相互作用するようにして、次いで培地中
に放出された分解産物をゲル濾過(セファロース6B)により分析することによ
り検討した(11)。未変化のHSPGがカラムのボイド容量の次に溶出される
(Kav<0.2、Mr〜0.5×106)一方、HS側鎖の標識された分解フ
ラグメントはカラムのよりVt方向で溶出される(0.5<kav<0.8、M
r=5〜7×103)(11)。
ンのヘパラナーゼ阻害効果についても本発明者らが検討した。ヘパラナーゼの阻
害作用は、16以上の糖単位を含み、N位置とO位置双方に硫酸基を有するヘパリ
ン類により最適に達成された。O−脱硫酸化がヘパリンのヘパラナーゼ阻害効果 を無効にする一方、O−硫酸化、N−アセチル化ヘパリンは、該N−置換分子が約 4,000ダルトン以上の分子サイズ有する場合に、高い阻害活性を維持した(
7)。実験動物をヘパラナーゼ・インヒビター(例えば、ヘパリンの非−抗凝血
種)で処理すると、B16メラノーマ、ルイス肺癌および乳房腺癌の細胞により
誘発される肺転移の発生率を顕著に減少させた(>90%)(7、8、16)。
抗トロンビンIIIに対し高度および低度親和性を有するヘパリンフラクションは 同等の高い抗転移活性を示したが、このことは、ヘパリン活性を阻害するヘパラ
ナーゼが、その抗凝血活性よりもむしろ、多糖の抗転移性において役割を果たし
ていることを示している(7)。
ために、ヘパラナーゼ活性用尿サンプルについてスクリーニングを試行した(1
6a)。ヘパラナーゼ活性はすべてではないが、一部癌患者の尿に検出された。
高レベルのヘパラナーゼ活性が攻撃性転移疾患患者尿に定量されたが、健常提供
者尿には検出し得る活性はなかった。
(IDDM)患者の20%の尿にも検出されたが、その殆どが糖尿病性腎症によ
ると思われるもので、成人では腎不全に至る最も重要な独立の障害である。
の構造的に関連するポリペプチドである(17)。これらは血管内皮細胞にとっ
て高度に分裂促進性であって、血管新生の最も強力な誘発物質の一つである(1
7,18)。塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)はin vitroで産生される内
皮下のECMから(19)、また、角膜のBMから(20)抽出されるが、この
ことはECMがbFGFの貯臓所としての役割を担っている可能性を示唆してい
る。免疫組織化学染色は多様な組織および血管の基底膜にbFGFが局在してい
ることを明らかにした(21)。bFGFが正常組織の至る所に存在しているに
もかかわらず、これら組織の内皮細胞増殖は通常非常に低く、bFGFがその作
用部位から幾分隔離されていることを示唆している。bFGFとECMの相互作
用に関する研究が解明したところによると、bFGFはECMのHSPGに結合
し、HS分解酵素により活性型として放出される(15、20、22)。血小板
、肥満細胞、好中球およびリンパ腫細胞により発現されるヘパラナーゼ活性はE
CMおよび基底膜からの活性なbFGF放出に関与しているが(23)、これは
ヘパラナーゼ活性が細胞移動と浸襲において機能するばかりではなく、間接的に
血管新生応答を生じていることをも示唆している。これらの結果は、ECM H SPGがbFGFおよび恐らく他のヘパリン結合増殖促進因子の天然保存貯蔵所
を提供していることを示唆する(24,25)。従って、基底膜とECM内のそ
の貯蔵庫からbFGFを置換えることで、正常状態および病的状態での血管新生
誘発に対する新しいメカニズムを提供し得る可能性がある。
表面レセプターに結合する際に、またはbFGF細胞のシグナリングに関与して
いる(26、27)。さらに、最適効果に必要なHSサイズはヘパラナーゼによ
り放出されるHSフラグメントのサイズに類似していた(28)。同様の結果が
脈管内皮細胞増殖因子(VEGF)により得られたが(29)、これはヘパリン
結合増殖因子との細胞相互作用にHSを巻き込む二重レセプターメカニズムの作
用を示唆している。したがって、ECMの内皮細胞増殖因子を制限することで脈
管内皮に対する全身作用を防止し、結果として非常に緩やかな内皮細胞交替と脈
管増殖を維持しているのだとする提案がなされている。他方、HSフラグメント
との複合体としてbFGFのECM貯蔵庫からの放出が、外傷修復、炎症および
腫瘍成長などの過程において、局在化した内皮細胞増殖と血管新生を促す可能性
もある(24、25)。
と自己免疫応答の両方を引き出す。血小板、顆粒球、TおよびBリンパ球、マク
ロファージおよび肥満細胞と内皮下ECMとの相互作用は、特異的なヘパラナー
ゼ活性によるヘパラン硫酸(HS)の分解と関係している(6)。酵素は種々の
活性化シグナル(例えば、トロンビン、カルシウムイオノホア、免疫複合体、抗
原、分裂促進因子など)に応答して細胞内画分(例えば、リソソーム、特異顆粒
など)から放出されるが、これは炎症と細胞免疫性においてそれが調整されて関
与していることを示唆している。
トにすると以下のとおりである 第一に、タンパク分解活性(プラスミノーゲン活性化因子)およびヘパラナー
ゼは炎症性白血球と悪性腫瘍細胞によるECM HSPGの連続的分解に相乗的 に関与する。
ロイチン硫酸との複合体として存在する。潜伏性酵素は腫瘍細胞誘導因子により
活性化され、次いで腫瘍転移の過程で脈管内皮を通過する細胞浸襲を容易にする
。
、トロンビン)により誘発されるが、ECM上の血小板活性化には応答しない。
培養にもとづいて優先的に容易に放出される。
酸素ラジカルの放出を阻害するが、血管外遊出を可能とする酵素(ヘパラナーゼ
、ゲラチナーゼ)の放出は阻害しない。この内皮下ECMの防御的役割は、細胞
を可溶性因子により刺激したときには観測されるが、貪食性刺激因子では観測さ
れなかった。
分泌される。
よびBリンパ球によるヘパラナーゼの合成と分泌を誘導する。Tリンパ球ヘパラ
ナーゼはin vivoにおいて抗原での免疫によっても誘導される。
されるが、プラズマ細胞腫および休止正常Bリンパ球によっては発現されない。
より発現されるが、培養媒体中への該酵素は放出がわずかであるか、あるいは放
出されない。同様の結果が成熟マクロファージに分化するよう誘発されたヒト骨
髄性白血病細胞により得られた。
非抗凝集性種ヘパリンの低用量により抑制される(30)。
ゼ活性はECMおよび基底膜から活性bFGFを放出する。ECMに貯留された
bFGFが放出されると、外傷の修復、炎症および腫瘍発生などの工程において
局在化した血管新生応答を誘導する可能性がある。
T細胞によるin vitro生物活性TNFαの産生における該二糖の阻害効果と関連
づけられた(31)。
にして、哺乳動物ヘパラナーゼは、ヘパリン結合増殖因子の生物利用能を調整す
ること(15)、ヘパリン結合増殖因子(例、bFGF、VEGF)およびサイ
トカイン(IL−8)への細胞性応答を調整すること(31a、29)、血漿リ
ポタンパク質との細胞相互作用を調整すること(32)、特定のウイルス性、あ
る種細菌性および原生動物性感染に対する細胞の感受性を調整すること(33、
33a、33b)、およびアミロイド・プラークの分解を調整すること(34)
などに応用し得る。このように、ヘパラナーゼは外傷修復、脈管形成、再狭窄、
アテローム性動脈硬化症、炎症、神経変性疾患およびウイルス感染などの症状に
有用であることが分かる。哺乳動物ヘパラナーゼは血漿ヘパリンを中和するため
の有力なプロタミン置換体として使用することができる。抗ヘパラナーゼ抗体は
、生検標本、血漿サンプルおよび体液における微小転移、自己免疫病変および腎
不全の免疫検出および診断に応用し得る。基礎研究における一般的な使用も期待
される。
え酵素産生を可能とする。組換えタンパク質を利用し得ることは、タンパク質の
構造機能を解明する方法を確かなものとし、新規なインヒビターの開発手段を提
供することとなる。
グ熱ウイルス(33a)の結合にとって、また細胞の引続く感染にとっての主要
な要件であることが示されている。したがって、ヘパラナーゼにより細胞表面ヘ
パラン硫酸を除去することがウイルス感染を妨げることになる。事実、(ヘパラ
ン硫酸を分解する)細菌性ヘパリチナーゼまたは(ヘパランを分解する)ヘパリ
ナーゼで細胞を処理すると、2種の関連する動物ヘルペスウイルスが細胞に結合
するのを減少させ、かつ、ウイルス感染に対して細胞が少なくとも部分的に抵抗
するようになった(33)。細胞表面ヘパラン硫酸はHIV感染にも関与してい
るという幾つかの徴候がある(33b)。
ロイツフェルト−ヤコブ病およびスクラピーのプリオンタンパク質アミロイドプ
ラーク中に同定された(34)。ヘパラナーゼはこれらのアミロイドプラークを
分解させるが、該プラークはアルツハイマー病の病因的役割を演じるとも考えら
れる。
リポタンパク質の蓄積は、アテローム性動脈硬化症と再狭窄の病因における基本
的事象である(35)。HSがSMC増殖に関与すること(すなわち、ヘパリン
結合増殖因子に対する低親和性レセプター)とは別に、HSはリポタンパク質の
結合、保持および取込みにも関与している(36)。HSPGおよびリポタンパ
ク質リパーゼは、コレステロールに富むリポタンパク質の実質的細胞内および腸
内蓄積を可能とする新しい異化経路に関わっていることが証明された(32)。
後者の経路はアポBおよびアポEに富むリポタンパク質(すなわち、LDL、V
LDL、キロミクロン)の蓄積を促進することにより高度にアテローム発生的で
あると予測されるが、細胞ステロール含有によるフィードバック阻害からは独立
している。したがって、ヘパラナーゼによりSMC HSを除去すると、SMC 増殖と脂質蓄積の両方が阻害されると期待され、したがって、再狭窄およびアテ
ローム性動脈硬化症の進行を停止させる可能性がある。
オチド、それを保持するベクター、ヘパラナーゼを発現する形質導入細胞、およ
びヘパラナーゼ活性を有する組換えタンパク質に対する必要性が広く認識され、
それらを所有することが非常に有利となろう。
クレオチド(以下では、hpa、hpa cDNAまたはhpa遺伝子という) 、それを保持するベクター、ヘパラナーゼを発現する形質導入細胞、およびヘパ
ラナーゼ活性を有する組換えタンパク質が提供される。
入宿主細胞による組換えヘパラナーゼの発現を報告する。
ミクロ配列決定に付した。解明したYGPDVGQPR(配列番号8)配列は、
対応する逆翻訳DNA配列に対する相同性についてのESTデータベースをスク
リーニングするのに用いた。2つの密接に関連するEST配列を同定し、その後
同一であることを見出した。両クローンは1020bpの挿入断片を含んでおり
、該挿入断片は973bpのオープン読み枠を含み、それに引き続いて27bp
の3’非翻訳領域とポリA尾部を含んでいた。翻訳開始部位は同定されなかった
。
DNA複合体からのDNAのPCR増幅により、ESTクローン配列に従い選択
したプライマーと複合体のリンカーを用い実施した。同定した3’エンコードE
STクローンと一部重なり合っている900bpのPCRフラグメントが得られ
た。接合したcDNAフラグメント(hpa)(1721bpの長さ、配列番号
9)は、61,192ダルトンの計算値分子量を有する543アミノ酸のポリペ
プチド(配列番号10)をエンコードするオープン読み枠を含んでいた。
よりヒトSK−hep1細胞系から可能であった。SK−hep1 hpa cD
NAの5’伸長配列はヒト胎盤から単離したhpa cDNAの配列と統合した (配列番号9)。統合した配列は、66,407ダルトンの計算値分子量を有す
る592アミノ酸のポリペプチド(配列番号14と15に示した)をエンコード
するオープン読み枠(配列番号13および15)を含んでいた。
能力を、バキュロウイルス発現系を用い、昆虫細胞においてhpa全オープン読
み枠を発現することにより試験した。hpa遺伝子含有ウイルスで感染させた細
胞の抽出物と調整培地が、可溶性ECM誘導HSPGおよび未処理ECMに対す
る高レベルのヘパラン硫酸分解活性を示した。この分解活性は、ヘパラナーゼの
もう一つの基質であるヘパリンにより阻害された。hpa遺伝子不含の同様の構
築物を感染させた細胞はかかる活性を示さず、非感染細胞の活性をも示さなかっ
た。伸長した5’クローンから発現したヘパラナーゼのヘパリンに対する能力は
哺乳動物発現系において証明された。
Rにより検討した。ヘパラナーゼ活性を有することがすでに知られている組織お
よび細胞においてのみ発現されることが判明した。
ヒト染色体4にヒト・ヘパラナーゼ遺伝子を位置づけた。新たに単離したヘパラ
ナーゼ配列を用い、染色体スプレッドのヒト・ヘパラナーゼ遺伝子を包含する染
色体領域を同定することができる。
ゼ触媒活性を有するポリペプチドエンコードポリヌクレオチド配列を包含するポ
リヌクレオチドフラグメントが提供される。
フラグメントとは、全ヒトヘパラナーゼ酵素をエンコードする配列番号9のヌク
レオチド63〜1691または配列番号13のヌクレオチド139〜1869で
ある。
オチド配列を包含するポリヌクレオチドフラグメントが提供される。
有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号9または1
3と少なくとも60%の相同性、好ましくは少なくとも70%の相同性、より好
ましくは少なくとも80%の相同性、最も好ましくは少なくとも90%の相同性
を有する。
クレオチドフラグメントは配列番号9または13の一部(フラグメント)を包含
する。例えば、かかるフラグメントはヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドを
エンコードする配列番号9のヌクレオチド63〜721および/または配列番号
9のセグメントを包含し得た。
フラグメントによりエンコードされるポリペプチドは配列番号10または14に
記載のアミノ酸配列またはその機能的部分を包含する。
配列はヘパラナーゼ活性保有ポリペプチドをエンコードし、該ポリペプチドは配
列番号10または14と少なくとも60%の相同性、好ましくは少なくとも70
%の相同性、より好ましくは少なくとも80%の相同性、最も好ましくは少なく
とも90%の相同性を有する。
フラグメントはヘパラナーゼ活性保有ポリペプチドをエンコードし、該ポリペプ
チドは、したがって、配列番号10または14に記載のアミノ酸配列の対立遺伝
子、種および/または誘発変異体であってもよい。かかる変異体はいずれも相同
体とも見なし得ると理解される。
媒活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド鎖の少なくとも一部
に相補的なポリヌクレオチド配列を含む一本鎖ポリヌクレオチドフラグメントが
提供される。
性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列包含のベクターが提
供される。
クミドまたは人工染色体をも含む適切な形状のいずれであってもよいが、これら
に限定されるものではない。ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコー
ドするポリヌクレオチド配列は上記のポリヌクレオチドフラグメントのいずれを
も包含する。
性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列包含の外来性ポリヌ
クレオチドフラグメントを包含する宿主細胞が提供される。
もよい。該宿主細胞は原核細胞、真核細胞、細胞系、または多細胞性生物の一部
としての細胞(例、形質転換生物の細胞)などのいずれの形状であってもよい。
性保有ポリペプチドを含む組換えタンパク質が提供される。
性保有組換えタンパク質を活性成分として含んでなる製剤組成物が提供される。
性保有組換えタンパク質を活性成分として含む医療用装置からなる医療用機器が
提供される。
性の過剰発現細胞を含んでなるヘパラナーゼ過剰発現系が提供される。
ヒト・ヘパラナーゼ遺伝子を包含する染色体領域を同定する方法であって、(a
)該染色体スプレッドを、ヘパラナーゼをエンコードする標識ポリヌクレオチド
プローブとハイブリッド形成させる工程、(b)染色体スプレッドを洗浄し、過
剰のハイブリッド非形成プローブを除去する工程、および(c)当該ハイブリッ
ド形成した標識ポリヌクレオチドプローブと会合したシグナルを検索し、検出さ
れたシグナルがヒトヘパラナーゼ遺伝子を包含する染色体領域の指標であるとす
る工程からなる方法が提供される。
ことができる。ヘパラナーゼ酵素をエンコードするhpa遺伝子の同定が異種発
現系においての組換え酵素産生を可能とする。
チド(以下では置換え可能なものとして、hpa、hpa cDNAまたはhp a遺伝子という)、それを保持するベクター、ヘパラナーゼを発現する形質導入
細胞、およびヘパラナーゼ活性を有する組換えタンパク質に関する。
って、以下の説明で述べた、あるいは図面で説明した成分の構築および配列の細
部に限定されるものではないことを理解すべきである。本発明は様々な方法で具
体化され、または実用化され、または実施され得る。また、本明細書で採用した
表現法および用語法は説明を目的とするものであり、制限することを意図したも
のではないことを理解すべきである。
法を開発し、また、基礎研究、とりわけ医薬・生物学の領域における基礎研究の
ための新しい手段を提供することができる。
薬を開発することができる。ヘパラナーゼ酵素をエンコードするhpa遺伝子の
同定が異種発現系においての組換え酵素産生を可能とする。
殖因子(例、bFGF、VEGF)およびサイトカイン(IL−8)への細胞性
応答、血漿リポタンパク質との細胞相互作用、ウイルス性、原生動物性およびあ
る種細菌性感染に対する細胞の感受性、および神経変性プラークの分解などを調
整することができる。このように、組換えヘパラナーゼは外傷修復、脈管形成、
再狭窄、アテローム性動脈硬化症、炎症、神経変性疾患(例えば、ゲルストマン
−シュトロイスラー症候群、クロイツフェルト−ヤコブ病、スクラピーおよびア
ルツハイマー病など)および特定のウイルス感染およびある種細菌性および原生
動物性感染などの有力な治療手段である。組換えヘパラナーゼは血漿ヘパリンを
中和するための有力なプロタミン置換体として使用することができる。
すること、減速すること、または逆行させること、あるいは疾患または症状の臨
床症候を実質的に改善すること、あるいは疾患または症状の臨床症候発現を実質
的に防止することを意味する。したがって、「モジュレーター」とは疾患または
症状を調整し得る作因物質を意味する。ウイルス性、原生動物性および細菌性感
染の調整とは、ウイルス、細菌または原生動物の活性および/またはウイルス、
細菌または原生動物の生活環期を実質的に中断、防止または低下させる効果、あ
るいはヒトまたは他の動物などの被験体においてウイルス、細菌または原生動物
による感染を低下または防止する効果を意味する。
対する傷害を意味し、急性症状、例えば、熱傷、化学傷、放射線熱傷、日焼けな
どの紫外線照射に過度に露出したことによる熱傷など、身体組織の損傷、例えば
、分娩および出産の結果による会陰損傷などの医療処置に際し被る損傷、例えば
、会陰切開、切傷などの外傷誘発損傷、例えば、自動車事故および他の機械事故
において被る損傷、および弾丸、ナイフ、その他の武器類、および術後損傷など
、ならびに慢性的症状、例えば、褥瘡、床擦れ、糖尿病および循環不全に関連す
る症状、およびすべてのタイプのざ瘡(にきび)などを意味するが、これらに限
定されるものではない。
および体液における微小転移、自己免疫病変および腎不全の免疫検出および診断
に有用である。かかる抗体はヘパラナーゼ活性に対する中和剤としても作用する
。
入細胞による組換えヘパラナーゼの発現を本明細書に報告する。これはクローン
化される最初の哺乳動物ヘパラナーゼ遺伝子である。
ミクロ配列決定に付した。
列に対する相同性についてのESTデータベースをスクリーニングするのに用い
た。2つの密接に関連するEST配列を同定し、その後同一であることを見出し
た。
のオープン読み枠を含み、それに引き続いて27bpの3’非翻訳領域とポリA
尾部を含んでいた。翻訳開始部位は同定されなかった。
複合体からのDNAのPCR増幅により、ESTクローン配列に従い選択したプ
ライマーと複合体のリンカーを用い実施した。
PCRフラグメントが得られた。接合したcDNAフラグメント(hpa)(1
721bpの長さ、配列番号9)は、図1および配列番号11に示すように、6
1,192ダルトンの計算値分子量を有する543アミノ酸のポリペプチド(配
列番号10)をエンコードするオープン読み枠を含んでいた。
ドの差異が観察された。この差異は1個のアミノ酸置換(TyrからPhe)に
至る(図1)。さらに、公開されたEST配列は未同定ヌクレオチドを含んでい
たが、ESTクローン両方のDNA配列決定により2個のヌクレオチドに分解し
た(それぞれ、配列番号9の1630位および1631位のGおよびC)。
能力を、バキュロウイルス発現系を用い、昆虫細胞中全オープン読み枠を発現す
ることにより試験した。
CM誘導HSPGおよび未処理ECMに対する高レベルのヘパラン硫酸分解活性
を示したが、この分解活性は、ヘパリンにより阻害された。一方、hpa遺伝子
不含の同様の構築物を感染させた細胞はかかる活性を示さず、非感染細胞の活性
をも示さなかった。
Rにより検討した。ヘパラナーゼ活性を有することがすでに知られている組織お
よび細胞においてのみ発現されることが判明した。
よりヒトSK−hep1細胞系から可能であった。SK−hep1 hpa cD
NAの5’伸長配列はヒト胎盤から単離したhpa cDNAの配列と統合した (配列番号9)。統合した配列は、66,407ダルトンの計算値分子量を有す
る592アミノ酸のポリペプチド(配列番号14と15に示した)をエンコード
するオープン読み枠(配列番号13および15)を含んでいた。このオープン読
み枠は哺乳動物細胞発現系において触媒的に活性なヘパラナーゼの発現を指向し
ていることが示された。発現されたヘパラナーゼは抗ヘパラナーゼ抗体によりウ
エスターンブロット分析において検出し得た。
ヒト染色体4にヒト・ヘパラナーゼ遺伝子を位置づけた。したがって、新たに単
離したヘパラナーゼ配列を用い、染色体スプレッドのヒト・ヘパラナーゼ遺伝子
を包含する染色体領域を同定することができる。
ードポリヌクレオチド配列を包含するポリヌクレオチドフラグメント(DNAま
たはRNA、一本鎖または二本鎖)が提供される。
は両方ともに、ヘパランまたはヘパラン硫酸プロテオグリカン基質に特異的な哺
乳動物エンドグリコシダーゼ水解活性をいい、ヘパリンまたはヘパラン硫酸をβ
−脱離により分解する細菌酵素(ヘパラナーゼI、IIおよびIII)の活性に対立 するものである(37)。
パラナーゼ酵素をエンコードする配列番号9のヌクレオチド63〜1691また
は配列番号13のヌクレオチド139〜1869である。
コードするオープン読み枠(ORF)の最初の開示である以上、ヒト・ヘパラナ
ーゼに限定されるものではない。hpa cDNA、その一部またはその配列に 従って設計した合成オリゴヌクレオチドを用いることは、当業者が他の哺乳動物
種の相同配列を含むゲノムおよび/またはcDNAクローンの同定を可能とする
。
下対合する塩基であって、例えば、サムブルーク、フリッシュ、マニアティス(
Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T.)(1989)分子クローニング 。実験室マニュアル。コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス
、ニューヨーク)ポリヌクレオチド配列を包含するポリヌクレオチドフラグメン
トをさらに目的とする。
13と少なくとも60%の相同性、好ましくは少なくとも70%の相同性、より
好ましくは少なくとも80%の相同性、最も好ましくは少なくとも90%の相同
性を有するポリヌクレオチド配列は、本発明範囲内のものである。
の部分を包含してもよい。例えば、新規配列である配列番号9のヌクレオチド6
3〜721を包含する。しかし、ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエン
コードする配列番号9または13のセグメントも包含する。
文および下記請求項で用いる場合、それはポリペプチドの合成を指向する能力を
いい、その活性を必要とする場合には、翻訳後修飾、例えば、これらに限定され
るものではないが、タンパク質分解(例、シグナルペプチドの除去およびプロ−
またはプレ−タンパク質配列の除去)、メチオニン修飾、糖化、アルキル化(例
、メチル化)、アセチル化などの後に、例えば、ECMおよび細胞表面会合HS
の分解において触媒的に活性となるポリペプチドの合成指向能力をいう。
ドされるポリペプチドは、配列番号10または14に示したアミノ酸配列または
その機能的部分、すなわちヘパラナーゼ触媒活性を有する部分を含む。
ドフラグメントは本発明の範囲内のものである。したがって、該ポリペプチドは
配列番号10または14に記載のアミノ酸配列またはその機能的部分の対立遺伝
子、種および/または誘発変異体であってもよい。
は14と少なくとも60%の相同性、好ましくは少なくとも70%の相同性、よ
り好ましくは少なくとも80%の相同性、最も好ましくは少なくとも90%の相
同性を有するポリヌクレオチド配列は、本発明範囲内のものである。
ポリヌクレオチド鎖の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチド配列を含む一
本鎖ポリヌクレオチドフラグメントの提供をも目的とする。本明細書にて使用す
る「相補的」という用語は塩基が対合する能力をいう。
あるいはヌクレオチド類似体(例、チオ化ヌクレオチド)を含んでいてもよく、
それは合成オリゴヌクレオチドであっても、形質導入宿主細胞により作製された
ものであってもよく、特異的な塩基対合を供与する限り所望の鎖長のものであっ
てもよく(例えば、8または10、好ましくはより長いヌクレオチド)、また、
塩基対合を妨害しない限りミスマッチを含んでいてもよい。
ヌクレオチド配列を包含するベクターの提供を目的とする。
ジまたは真核細胞に感染するウイルである。また、プラスミド、ファージミド、
コスミド、バクミド、または人工染色体であってもよい。ヘパラナーゼ触媒活性
保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列は、上記ポリヌクレオ
チドフラグメントのいずれを含んでいてもよい。
性ポリヌクレオチドフラグメントを包含する宿主細胞の提供を目的とする。
よい。該宿主細胞はどのタイプのものであってもよい。例えば、それは原核細胞
、真核細胞、細胞系、または生物の一部としての細胞である。外来性ポリヌクレ
オチドフラグメントは該細胞中に永続的に、または一過性に存在するものであっ
てよい。換言すると、安定的または一過性のトランスフェクション、形質転換ま
たは形質導入により得られる形質導入細胞はすべて本発明範囲内のものである。
本明細書に用いる「外来性」という用語は、ポリヌクレオチドフラグメントが外
部から細胞に導入されるという事実をいう。そこで該フラグメントは複数コピー
の一つに存在してもよく、また、1以上の染色体のいずれの部位に集積していて
もよく、また、染色体外物質として存在してもよい。
ゼ過度発現系の提供を目的とする。該細胞はヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプ
チドをエンコードするポリヌクレオチド配列とヘパラナーゼ過度発現指向の適切
なプロモーターおよびエンハンサー配列を含む適切なベクターを一過性にまたは
安定的に移入したまたは形質転換した宿主細胞である。しかし、過度発現細胞は
、発現細胞の内因性ヘパラナーゼ遺伝子下流のプロモーターおよび/またはエン
ハンサー配列挿入断片からの(例えば、相同性組換えによる)産物でもあり、該
内因性遺伝子からの過度発現を指向する。本明細書本文および請求項にて使用す
る「過度発現」という用語は、発現のレベルが、他の点で同一の条件下にある所
定の細胞を典型的に特徴づける基礎発現レベルよりも高いものをいう。
質の提供を目的とする。
製することおよび/または添加物と混合することが可能である。該組換えタンパ
ク質は上記細胞のいずれかを用い生産することができる。該組換えタンパク質は
いかなる形状であってもよい。それは結晶形、脱水粉末形または溶液でもよい。
該組換えタンパク質は純粋なヘパラナーゼを得るのに有用であり、さらに抗ヘパ
ラナーゼ抗体、すなわちポリまたはモノクローナル抗体の誘出に、また、抗ヘパ
ラナーゼインヒビターまたは薬物スクリーニング検定またはシステムにおけるス
クリーニング活性成分として有用である。
含む製剤組成物の提供を目的とする。
剤、噴霧剤および粉剤を包含するが、これらに限定されるものではない。常套の
製剤担体、水剤、粉末または油性基剤、増粘剤などが必要な場合、また望ましい
場合もある。被覆コンドーム、ステント、活性パッド、および他の医療装置もま
た有用である。事実、本発明の範囲はヘパラナーゼ触媒活性保有組換えタンパク
質を活性成分として含む医療装置などの医療機器を包含する。
、薬包、カプセルまたは錠剤などを包含する。増粘剤、希釈剤、矯味剤、分散剤
、乳化剤または結合剤などが望ましい場合がある。
無菌水溶液を包含するが、これらに限定されるものではない。
数回、数日ないし数ヶ月、または治療効果が現われるまでの、あるいは病状の衰
退が達成されるまでの連続した治療方針をもって実施する。当業者は最適の用量
、投与方法および反復度数を容易に決定することができる。
んでいる染色体領域の同定方法が提供される。該方法は以下の方法工程を満たし
て実施される。最初の工程においては、染色体スプレッド(静止期または中期い
ずれかのスプレッド)を、ヘパラナーゼをエンコードする標識ポリヌクレオチド
プローブとハイブリッド形成させる。該標識は、好ましくは、蛍光標識である。
本方法の第二工程において、染色体スプレッドは洗浄して、過剰のハイブリッド
非形成プローブを除去する。最後に、ハイブリッド形成した標識ポリヌクレオチ
ドプローブと会合したシグナルを検索し、ヒト・ヘパラナーゼ遺伝子を含んでい
る染色体領域の標であるシグナルを検出する。当業者は適切な標識反応に際し本
明細書に開示の配列をどのように用いるか、また、in situハイブリッド形成に より、ヒト・ヘパラナーゼ遺伝子を含んでいる染色体領域を検出するために標識
プローブをどのように用いるかを知悉しているはずである。
るものであり、限定しようとするものではない。
して選定した。精製は実質的にフックス(Fuks)の米国特許第5,362,64
1号(本明細書に全文引用したものとして、参照により組込む)記載どおりとし
た。手短に説明すると、5×1011個の細胞を500リットル懸濁液中増殖し
、以下の工程に付して約240,000倍まで精製した。(i) カチオン交換クロ
マトグラフィー(CM−セファデックス)をpH6.0、0.3〜1.4M N aCl勾配で実施した。(ii)カチオン交換クロマトグラフィー(CM−セファ
デックス)をpH7.4、0.1%CHAPSの存在下に0.3〜1.1M N aCl勾配で実施した。(iii)ヘパリン−セファロース・クロマトグラフィーを pH7.4、0.1%CHAPSの存在下に0.35〜1.1M NaCl勾配 で実施した。(iv)ConA−セファロース・クロマトグラフィーをpH6.0、
0.1%CHAPSおよび1M NaCl含有緩衝液にて実施し、0.25Mα −メチルマンノシドにより溶出した。(v)HPLCカチオン交換クロマトグラ
フィー(Mono−S)をpH7.4、0.1%CHAPSの存在下に0.25
〜1M NaCl勾配で実施した。
アクリルアミドゲル電気泳動および/またはトリプシン消化および逆相HPLC
に付した。精製タンパク質のトリプシンペプチドを逆相HPLC(C8カラム)
により分離し、均一のピークをアミノ酸配列分析に付した。
末端アミノ酸配列決定に付した(アプライド・バイオシステムズ)。
球から確立した(19、38)。保存培養株を10%ウシ新生仔血清、5%FC
Sを補ったDMEM(1gグルコース/リットル)中で維持した。活性細胞増殖
期に一日おきにbFGF(1ng/ml)を添加した(13、14)。
ートに塗付し、硫酸不含フィッシャー培地および5%デキストランT−40中、
12日間培養した。植え付け後1日目および5日目にNa35SO4(25μC
i/ml)を加え、培養物は培地を換えることなく標識とともに培養した。内皮
下ECMは0.5%トリトンX−100および20mM NH4OH含有PBS により細胞層を溶解することで露出し(5分間、室温)、次いでPBSにより4
回洗浄した。ECMは未変化のままで細胞性残屑を含まず、組織培養皿全体に強
固に付着した(19、22)。
Mをトリプシンで消化し(25μg/ml、6時間、37℃)、消化物を逆浸透
により濃縮し、濃縮物をセファロース6Bゲル濾過カラムに負荷した。得られる
高分子量物質(Kav<0.2、ピークI)を収集した。80%を超える標識物
質がヘパラン硫酸プロテオグリカンから構成されていると判明した(11、39
)。
ECMの上部で20mMリン酸バッファー(pH6.2)の存在下に培養した(
18時間、37℃)。細胞溶解物および調整培地はまた、硫酸標識ピークI物質
(10〜20μl)とともに培養した。培地を収集し、遠沈(18,000×g
、4℃、3分間)して、硫酸標識物質をセファロースCL−6Bカラム(0.9
×30cm)上のゲル濾過により分析した。フラクション(0.2ml)を5m
l/時間の流速でPBSにより溶出し、バイオ−フルオア・液体シンチレーショ
ンにより放射活性をカウントした。排除した容量(Vo)はブルーデキストラン
でマークされ、全量がフェノールレッドによる容量(Vt)を含んでいた。後者
は遊離の硫酸エステルとともに移動することが示された(7、11、23)。H
S側鎖の分解フラグメントはセファロース6Bより、0.5<Kav<0.8(
ピークII)で溶出した(7、11、23)。トリプシンによりECMから遊離さ
れた殆ど未変化のHSPGが(PBSのみでの培養ではより低い程度で)Voの
次に溶出された(Kav<0.2、ピークI)。カラム上に負荷した標識物の回
収率は異なる実験において85%ないし95%であった(11)。各実験とも少
なくとも3回実施したが、溶出位置の変動(Kav値)は±15%を超えなかっ
た。
会(2130メモリアルパークウエイSW、ハンストビル、アラバマ35801
)より入手した。該cDNAは当初プラスミドベクターpT3T7D−Pacの
EcoRIおよびNotIクローニング部位でクローン化された。これらのクロ
ーンは多少異なっていると報告されているが、DNA配列決定が示すところによ
るとこれらクローンは互いに一致する。マラソンRACE(cDNA末端の迅速
増幅)ヒト胎盤(ポリ−A)cDNA複合体は、テルアビブ大学のヨッシ・シロ
ー(Yossi Shiloh)教授からの恵与であった。この複合体はベクター不含であり
、逆転写cDNAフラグメントを含んでいて、該フラグメントの両側に二本鎖接
着体、部分的には一本鎖接着体が結合している。採用した特異複合体の構築は文
献39aに記載されている。
サンプルであった。増幅に使用したプライマーは以下のとおりである:
CTCACTATAGGGC−3’(配列番号1);3’−プライマー:HPL
229:5’−GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC−3’(配
列番号2)。
GCTCGAGCGGC−3’(配列番号3);巣化3’−プライマー:HPL
171:5’−GCATCTTAGCCGTCTTTCTTCG−3’(配列番
号4)。HPL229およびHPL171はESTクローンの配列に従い選択し
た。それらはそれぞれ配列番号9のヌクレオチド933〜956および876〜
897を包含する。
2℃−2.5分を30サイクルとした。増幅はエキスパンド・ハイ・フィデリテ
ィ(ベーリンガーマンハイム)により実施した。得られた約900bpのhp3
PCR産物をBfrIおよびPvuIIにより消化した。クローン257548(
phpa1)をEcoRIで消化し、エンド・フィリングし、さらにBfrIで
消化した。その後、hp3 PCR産物のPvuII−BfrIフラグメントを クローンphpa1の平滑断端−BfrI末端にクローン化し、pT3T7−p
acベクターにクローン化した全cDNAを保有するに至らしめ、phpa2と
命名した。
ル373A)を使用し、ベクター特異および遺伝子特異プライマーにより実施し
た。各ヌクレオチドを少なくとも2つの独立したプライマーから読み取った。
イスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ(GCG)の開発したDNA
配列分析ソフトウエアパッケージを用い実施した。
製造業者の指示書に従い調製した。1.25μgを採り、MuMLV逆転写酵素
(ギブコBRL)およびオリゴ(dT)15プライマー(配列番号5)(プロメ
ガ)を用いて逆転写反応を実施した。得られた第一鎖cDNAの増幅はTaqポ
リメラーゼ(プロメガ)により実施した。以下のプライマーを使用した: HPU−355:5’−TTCGATCCCAAGAAGGAATCAAC−3
’(配列番号6、配列番号9または11のヌクレオチド372〜394)。 HPL−229:5’−GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC−
3’(配列番号7、配列番号9または11のヌクレオチド933〜956)。 PCRプログラムは94℃−4分、次いで94℃−40秒、62℃−1分、72
℃−1分を30サイクルとした。
(ギブコBRL)中、単層培養として維持した。
コBRL)を用い構築した。伝達ベクターpFastBacをSalIとNot
Iにより消化し、XhoIとNotIで消化したphpa2の1.7kbフラグ
メントと接合した。得られるプラスミドをpFasthpa2と命名した。pF
asthpa4と命名した同一のプラスミドを複製として調製し、両方はそれぞ
れにさらなる実験に使用した。組換えバクミドを製造業者の指示書に従い、pF
asthpa2、pFasthpa4により、またpFastBacにより生成
させた。後者は陰性対照として用いた。組換えバクミドDNAをSf21昆虫細
胞中に移入した。トランスフェクションの5日後に、組換えウイルスを採取し、
T−25フラスコ中、ハイ・ファイブ昆虫細胞3×106個に感染させるために
用いた。感染の2〜3日後に細胞を採取した。細胞4×106個を遠心分離し、
20mMリン酸・クエン酸バッファーと50mM NaCl含有の反応バッファ ーに再懸濁した。細胞に3サイクルの凍結・融解を施し、溶解物を−80℃に保
存した。調整培地は4℃に保存した。
ラフィーと引続くスーパーデックス75カラム・ゲル濾過により実施した。pF
hpa4ウイルス感染Sf21細胞の培地(150ml)をヘパリン−セファロ
ース・クロマトグラフィーに付した。フラクション1mlの溶出は、10mM酢
酸ナトリウムバッファー(pH5.0)中0.1%CHAPSおよび1mM D TTの存在下に0.35〜2M NaCl勾配により実施した。各フラクション のサンプル25μlにつきヘパラナーゼ活性を試験した。ヘパラナーゼ活性は0
.65〜1.1M NaCl(フラクション18〜26、図10a)の範囲に溶 出された。各フラクション5μlを15%SDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動に付し、次いで硝酸銀染色した。ヘパリン−セファロースから溶出された活
性フラクション(図10a)をプールし、YM3カットオフ膜上濃縮した(×6
)。濃縮物0.5mlを、0.8M NaCl、1mM DTTおよび0.1%C
HAPS含有10mM酢酸ナトリウムバッファー(pH5.0)で平衡化したス
ーパーデックス75FPLCカラム30mlに負荷した。フラクション(0.5
6ml)を0.75ml/分の流速で収集した。各フラクションの一部につきヘ
パラナーゼ活性を試験し、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、次
いで硝酸銀染色した(11b)。
ョンをトリプシン消化およびミクロ配列決定に付した。EST(Expressed Sequ
ence Tag; 発現配列標識)データベースをスクリーニングし、得られたペプチド
に相当する逆翻訳DNA配列についての相同性を探査した。2つのEST配列(
受託番号N41349およびN45367)はYGPDVGQPR(配列番号8
)のペプチドをエンコードするDNA配列を含んでいた。これら2つの配列は8
ないし9週の胎盤cDNAライブラリー(ソアーズ)から調製したクローン25
7548および260138(I.M.A.G.E.協会)から誘導した。同一
であることの判明した両クローンは1020bpの挿入断片を含んでおり、この
断片は973bpのオープン読み枠(ORF)とそれに続く27bpの3’非翻
訳領域とポリA尾部を含んでいた。これらクローンの5’末端には翻訳開始部位
(AUG)が確認されなかった。
NAのPCR増幅により実施した。同定された3’エンコードESTクローンと
一部重なり合う900bpのフラグメント(hp3と命名)が得られた。
61,192ダルトンの計算値分子量を有する543アミノ酸のポリペプチド(
配列番号10)をエンコードするオープン読み枠を含んでいた(図1および配列
番号11参照)。クローン257548および260138に含まれる部分cD
NA挿入断片の3’末端は配列番号9および図1のヌクレオチドG721に開始
点があった。
配列不一致があり、それによってアミノ酸が増幅cDNAにおいてESTのTy
r246からPhe246に置換されていた。PCR増幅cDNAフラグメント
のヌクレオチド配列は2つの個々の増幅産物から確認した。新しい遺伝子をhp
aと命名した。
分cDNA挿入断片の3’末端は、hpaのヌクレオチド721(配列番号9)
に開始点があった。安定な二次構造、例えば721位前後のヌクレオチドストレ
ッチを含む基部およびループを形成するhpa cDNAの能力をコンピュータ ーモデル化により検討した。安定な基部およびループ構造はヌクレオチド698
〜724(配列番号9)が関与して形成されるらしいことが判明した。さらに、
70%までの高GC含量はhpa遺伝子の5’末端領域を特徴づけるが、3’領
域の高々約40%と対照的である。これらの知見はESTクローンの未成熟終止
とそれ故の5’末端欠如を説明する。
能力を試験するために、全オープン読み枠を、バキュロウイルス発現系により昆
虫細胞で発現させた。hpa遺伝子含有ウイルスを感染させた細胞の抽出物は高
レベルのヘパラン硫酸分解活性を示したが、hpa遺伝子不含の同様構築物を感
染させた細胞はかかる活性を示さず、非感染細胞とも違った。これらの結果はさ
らに以下の実施例でも証明される。
キュロウイルスにより、または挿入断片不含プラスミド含有対照ウイルスにより
感染させた(72時間、28℃)。細胞を収集し、ヘパラナーゼ反応バッファー
中3サイクルの凍結・融解により溶解した。細胞溶解液を次いで硫酸標識ECM
誘導HSPG(ピークI)とともに培養し(18時間、37℃)、引き続き反応
混合物のゲル濾過分析(セファロース6B)を実施した。
物質のみを含んでいた(ピークI、フラクション5〜20、Kav<0.35)
。同様の溶出パターンは、HSPG基質を対照ウイルス感染細胞の分解液と培養
した場合に得られた。これに対し、hpa含有ウイルス感染細胞の溶解液でHS
PG基質を培養すると、高Mr基質が完全に低Mr標識分解フラグメントに変換
された(ピークII、フラクション22〜35、0.5<Kav<0.75)。
それらが (i) アルカリ性水素化ホウ素またはパパインで処理することによりE CMから放出された完全ヘパラン硫酸側鎖(Kav約0.33)よりも5ないし
6倍小さいこと、また、(ii)パパインまたはコンドロイチナーゼABCによるさ
らなる消化に抵抗し、硝酸による脱アミノ化を受けやすいことにより示された(
6、11)。
ウイルス(pFhpa)により感染した細胞にはヘパラナーゼ活性が検出された
が、対照ウイルス(pF)によるものでは検出されなかった。この結果は2つの
個々に生成させた組換えウイルスによって得られた。対照の未感染ハイ・ファイ
ブ細胞の溶解液ではHSPG基質を分解し得なかった。
1細胞により調整した培地で培養した。
解フラグメントを表す低MrピークIIへ変換したことの反映であり、これがpF
hpa2またはpFhpa4ウイルス感染細胞の培養培地中に見出されたが、対
照のpF1またはpF2ウイルスによるものでは認めなかった。対照の非感染ハ
イ・ファイブまたはSf21細胞の培養培地にはヘパラナーゼ活性が検出されな
かった。
かに見積もった分子量の組換えヘパラナーゼ酵素を得た。図4に示したように、
酵素活性すべてが上部画部に保持されており、流下(<50kDa)物には活性
がなかった。この結果は予期した分子量のhpa遺伝子産物と矛盾がない。
ンヒビター(40)であるヘパリンの阻害効果を試験した。
変換されるのは、ヘパリンの存在下、完全に阻止された。
遺伝子含有バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞により活性型で発現されるこ
とが示される。
力を検討した。この目的のためにハイ・ファイブまたはSf21細胞を、代謝的
に硫酸標識したECM上に播種し、次いで、pFhpa4または対照pF2ウイ
ルスを感染させた(48時間、28℃)。次いで、培地のpHを6.2〜6.4
に調整し、細胞をさらに標識したECMとともに28℃で48時間または37℃
で24時間培養した。培養培地中に放出された硫酸標識物をセファロース6B上
のゲル濾過により分析した。
胞とともに培養すると、殆ど全部(>90%)がVoとともにあるいはその次に
溶出される高Mrフラグメント(ピークI)からなる標識物を定常的に放出する
に至った。ECMそれ自体に存在するおよび/または細胞により発現されるタン
パク質分解活性が、高Mr物質の放出によるものであることはすでに示されてい
た(6)。殆ど未処理のHSPGは引続くヘパラナーゼによる分解の可溶性基質
であり、そのことはまたヘパラナーゼ酵素をヘパリンにより阻害したときに蓄積
する比較的大量のピークI物質によっても示されている(6、7、12、図9)
。他方、標識したECMをpFhpa4ウイルスで感染した細胞と培養すると、
60〜70%のECM会合放射活性を低Mr硫酸標識フラグメントの形で放出す
るに至るが(ピークII、0.5<Kav<0.75)、これは感染細胞とECM
との培養を28℃で行ったか37℃で行ったかには関係ない。対照の未処理非感
染Sf21またはハイ・ファイブ細胞はECM HS側鎖を分解しなかった。
21細胞をpFhpa4または対照pF1ウイルスで感染させ(96時間、28
℃)、培地を硫酸標識ECMとともに培養した。低Mr HS分解フラグメント はpFhpa4で感染した細胞により調整した培地と培養したときにのみECM
から放出された。図9に示すように、これらフラグメントの産生はヘパリン存在
下に阻止された。対照の非感染細胞培養培地にはヘパラナーゼ活性が検出されな
かった。これらの結果が示すのは、pFhpa4ウイルス感染細胞により発現さ
れるヘパラナーゼ酵素が、天然産未処理ECMの他の巨大分子成分(すなわち、
フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン)に複合体形成したときにHSを分解
し得るということであり、その様式は高度転移腫瘍細胞または免疫系の活性化細
胞について報告されているものと同じである(6,7)。
Fhpa4感染Sf21細胞の培地から部分精製し(図10a)、次いでプール
した活性フラクションをFPLCスーパーデックス75カラム上ゲル濾過した(
図11a)。〜63kDaのタンパク質を観測し、その量を銀染色SDS−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により検出し、関連するカラムフラクションのヘパ
ラナーゼ活性と相関させた(それぞれ、図10bおよび11b)。このタンパク
質は対照pF1ウイルス感染細胞の培養培地には検出されず、ヘパリン−セファ
ロース上同様の分別に付した(未開示)。
るhpa遺伝子の発現を評価した。この目的のために、全RNAを逆転写し、増
幅した。予測した585bp鎖長のcDNAが、ヒト腎臓、胎盤(8および11
週)および母斑組織に、ならびに単離したばかりの短時間(1.5〜48時間)
培養ヒト胎盤細胞栄養層細胞(図12a)に明瞭に証明されたが、これらはすべ
て高いヘパラナーゼ活性を示すことが知られている(41)。hpa転写物は正
常ヒト好中球によっても発現された(図12b)。これに対し、胎児性ヒト筋肉
組織、胸腺、心臓および副腎には検出し得るhpa mRNAの発現がなかった(
図12b)。hpa遺伝子は、これらがすべてではないが数種のヒト膀胱癌細胞 系(図12c)、SK肝臓癌(SK−hep−1)、卵巣癌(OV1063)、
乳癌(435,231)、メラノーマおよび巨核球(DAMI、CHRF)ヒト
細胞系により発現された(図12d〜e)。
れたヘパラナーゼ活性レベルと非常に良好な相関関係にあることが決定された(
未開示)。
3種のマウスESTを同定し(受託番号Aa177901(マウス脾臓から)、
Aa067997(マウス皮膚から)、Aa47943(マウス胚から))、6
29bpの部分的オープン読み枠(5’末端欠失)および195bpの3’非翻
訳領域(配列番号12)を含む824bpのcDNAフラグメントに組込んだ。
図13に示すように、コード領域はhpa cDNA配列の3’末端に80%類 似している。これらEST類は恐らくマウスヘパラナーゼをエンコードするマウ
スhpa同族体のcDNAフラグメントである。
、例えば、プロコラーゲンアルファ1前駆体、チロシン−タンパク質キナーゼ−
RYK、フィブリン−1、インシュリン様成長因子結合タンパク質およびその他
数種との間のアミノ末端相同性を明らかにした。アミノ末端基は高度に疎水性で
あり、潜在的なトランスメンブランドメインを含む。既知シグナルペプチド配列
に対する相同性は、それがタンパク質局在化のためのシグナルペプチドとして機
能し得ることを示唆する。
、hpa cDNAの5’末端をヒトSK−hep1細胞系から単離した。全R NAはTRI−試薬(モレキュラー・リサーチセンター・インク)を用い、製造
業者の指示書に従いSK−hep1細胞から調製した。ポリA+RNAをmRN
A分離機キット(クロンテック)を用い単離した。
ATACGACTCACTATAGGGC−3’(配列番号1)および配列番号
9のヌクレオチド119〜99に相当するhpa特異アンチセンスプライマーh
pl−629:5’−CCCCAGGAGCAGCAGCATCAG−3’(配
列番号17)を用い実施した。得られたPCR産物を第2回の増幅に付し、その
際アダプター特異巣化プライマーAP2:5’−ACTCACTATAGGGC
TCGAGCGGC−3’(配列番号3)および配列番号9のヌクレオチド83
〜63に相当するhpa特異アンチセンス巣化プライマーhpl−666:5’
−AGGCTTCGAGCGCAGCAGCAT−3’(配列番号18)を用い
た。PCRプログラムは以下のとおりとした:94℃−1分間のホットスタート
、次いで90℃−30秒、68℃−4分を30サイクルとした。得られる300
bpのDNAフラグメントをアガロースゲルから抽出し、ベクターpGEM−T
イージー(Easy)(プロメガ)にクローン化した。得られる組換えプラスミドを
pHPSK1と命名した。
び15の最初の178ヌクレオチドである上流178ヌクレオチドを含むことが
判明した。
一致した。胎盤cDNAの9位(配列番号9)の「T」誘導体をSK−hep1
cDNAの対応する187位(配列番号13)において「C」誘導体に置換えた
。
より確認されるように、胎盤cDNAクローンの5’末端での突然変異によると
思われるが、これはSK−hep1cDNA同様、配列番号9位のCを含んでい
た。
a cDNAの配列(配列番号9)に組入れた。組み上げた配列は、配列番号1 4および15に示すように、66,407ダルトンの計算値分子量を有する59
2アミノ酸のポリペプチドをエンコードするオープン読み枠を含んでいた。この
読み枠は93bpの5’非翻訳領域(UTR)に隣接していた。
製造業者の推奨に従い単離した。該キットは5種のヒトゲノムDNAサンプルを
含み、それぞれのサンプルは異なる制限エンドヌクレアーゼ(EcoRV、Sc
aI、DraI、PvuIIおよびSspI)で消化して平滑末端を創出してある 。
サンプルは、アダプター特異プライマーおよび遺伝子特異プライマーを用い、P
CR増幅に付した。増幅はエキスパンド・ハイ・フィデリティ(ベーリンガーマ
ンハイム)により実施した。
GGGC−3’(配列番号19)および配列番号9のヌクレオチド83〜63に
相当するhpa特異アンチセンスプライマーhpl−666:5’−AGGCT
TCGAGCGCAGCAGCAT−3’(配列番号18)を用い実施した。P
CRプログラムは以下のとおりとした:94℃−3分間のホットスタート、次い
で94℃−40秒、67℃−4分を36サイクルとした。
目の増幅の鋳型として用い、該増幅には巣化アダプター特異プライマーap2:
5’−ACTATAGGGCACGCGTGGT−3’(配列番号20)および
配列番号9のヌクレオチド62〜42に相当するhpa特異アンチセンスプライ
マーhpl−690:5’−CTTGGGCTCACCTGGCTGCTC−3
’(配列番号21)を用いた。得られる増幅産物はアガロースゲル電気泳動によ
り分析した。5種の異なるPCR産物を5回の増幅反応により得た。SspI消
化DNAから得た約750bpのDNAフラグメントをゲル抽出した。精製した
フラグメントをプラスミドベクターpGEM−Tイージー(プロメガ)に結合し
た。得られる組換えプラスミドをpGHP6905と命名し、hpa挿入断片の
ヌクレオチド配列を決定した。
クレオチドは配列番号13のヌクレオチド93に相当する。配列番号16のDN
A配列はhpa cDNAの5’領域およびhpa遺伝子のプロモーター領域を 含むと予測されるゲノム上流領域の501ヌクレオチドを含んでいる。
1 hpa cDNAの5’末端に相当する110bpを胎盤cDNAと結合させ
ることにより構築した。より詳しくは、胎盤hpaDNAのマラソンRACE−
PCR増幅産物をSacIで消化し、約1kbのフラグメントをSacI−消化
pGHP6905プラスミドに結合した。得られるプラスミドをEarIおよび
AatIIで消化した。EarI粘着性末端は平滑であり、約280bpのEar
I/平滑−AatIIフラグメントを単離した。このフラグメントをEcoRIで
消化したpFasthpa(クレノウフラグメントにより平滑末端とし、さらに
AatIIで消化した)と結合した。得られるプラスミドは1827bpの挿入断
片を含み、該断片は1776bpのオープン読み枠、31bpの3’UTRおよ
び21bpの5’UTRを含んでいた。このプラスミドをpFastLhpaと
命名した。
ーゼポリペプチドの発現を稼動させた。hpa cDNAをBssHIIおよびN otIによりpFasthpaから切り出した。得られる1850bpのBss
HII−NotIフラグメントをMluIおよびNotIで消化した哺乳動物発現
ベクターpSI(プロメガ)に結合した。得られる組換えプラスミドpSIhp
aMet2をヒト293胎児性腎臓細胞系に移入した。
検討し、酵素活性をゲルシフトアッセイにより試験した。これらの手法は両方と
も1998年5月1日出願の米国特許出願09/071,739にすべて記載さ
れている(本出願を本明細書に全文記載したものとして参照により組込む)。ト
ランスフェクションの3日後に細胞を取得した。取得した細胞を150mM N aCl、50mMトリスpH7.5、1%トリトンX−100、1mM PMS Fおよびプロテアーゼインヒビターカクテル(ベーリンガーマンハイム)を含む
溶解バッファーに再懸濁した。タンパク質抽出サンプル40μgをSDS−PA
GEによる分離に用いた。タンパク質をPVDFハイボンド−P膜(アマシャム
)に移した。該膜を米国特許出願09/071,739記載のとおりにアフィニ
ティ精製ポリクローナル抗ヘパラナーゼ抗体と培養した。約50kDaの主バン
ドを移入膜に観察し、同様に約65kDaのマイナーバンドを観察した。同様の
パターンを米国特許出願09/071,739に示されたとおりにpShpaを
移入した細胞の抽出物に観察した。これら2つのバンドは恐らく移入細胞により
産生された組換えヘパラナーゼタンパク質の2つの形状を表している。65kD
aのタンパク質は恐らくヘパラナーゼ前駆体を表しており、50kDaのタンパ
ク質がここでは処理工程を経たあるいは成熟した形状であることを示唆している
。
シフトアッセイにより試験した。移入細胞抽出物および偽移入細胞抽出物を、2
0mMリン酸・クエン酸バッファー(pH5.4)、1mM CaCl2、1m M DTTおよび50mM NaClの存在下にヘパリン(各反応において6μg
)と37℃で一夜培養した。反応混合物を次いで10%ポリアクリルアミドゲル
上で分離した。組換えヘパラナーゼの触媒活性は、移入細胞抽出物で培養したヘ
パリン分子が、対照に比較して、より速く移動することにより明瞭に証明された
。急速な移動は高分子量ヘパリン分子の消失と低分子量分解産物の生成を示す。
リッドのパネルを用いて実施した。
番号9のヌクレオチド564〜586に相当するhpaプライマー:hpu56
5:5’−AGCTCTGTAGATGTGCTATACAC−3’(配列番号
22)および配列番号9のヌクレオチド897〜876に相当するアンチセンス
プライマーhpl171:5’−GCATCTTAGCCGTCTTTCTTC
G−3’(配列番号23)を使用した。
次いで94℃−45秒、66℃−1分、68℃−5分を7サイクルとし、次いで
94℃−45秒、62℃−1分、68℃−5分を30サイクルとし、72℃での
最終拡張10分とした。
た。得られる増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分析した。図14に示し
たように、約2.8Kbの単一バンドが染色体4から、同様に対照のヒトゲノム
DNAから得られた。2.8kbの増幅産物はゲノムhpaクローンの増幅に基
づくと期待される(データ未開示)。ハムスターおよびマウスの対照DNAサン
プルにも、他のヒト染色体の体細胞ハイブリッドにも増幅産物は得られなかった
。
び変法が当業者に明らかであることがはっきりしている。したがって、添付の特
許請求の範囲の精神と広範な範囲に含まれるかかる代替法、変更、および変法を
も包含することを意図するものである。
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2、679〜684。
からT)の1個のヌクレオチドの差異および得られるアミノ酸置換(Tyrから
Phe)について、それぞれ上と下に置換した単位示す。システイン残基とポリ
アデニル化共通配列に下線を付す。星印は停止コドンTGAを示す。
ファイブ細胞の溶解物(●)または対照pF2ウイルス(□)は硫酸標識ECM
誘導可溶性HSPG(ピークI)と培養した(18時間、37℃)。培養した培
地を次いでセファロース6B上ゲル濾過に付した。低分子量HS分解フラグメン
ト(ピークII)はpFhpa2感染細胞との培養に際してのみ産生されたが、p
F2感染細胞の溶解によるHSPG基質の分解(◇)はなかった。
G基質の分解を示す。pFhpa2(3a)またはpFhpa4(3b)ウイル
ス感染したハイ・ファイブ細胞の溶解物(●)または対照pF2ウイルス(□)
は硫酸標識ECM誘導可溶性HSPG(ピークI、◇)と培養した(18時間、
37℃)。培養した培地を次いでセファロース6B上ゲル濾過に付した。低分子
量HS分解フラグメント(ピークII)はhpa遺伝子含有ウイルスとの培養に際
してのみ産生された。対照ウイルス感染細胞の培地によるHSPG基質の分解は
なかった。
。pFhpa2感染ハイ・ファイブ細胞の培地を50kDaカットオフ膜に負荷
した。ヘパラナーゼ活性(ピークI基質(◇)のピークII HS分解フラグメン トへの変換)は高分子量部(>50kDa)(●)に見出されたが、低分子量部
(<50kDa)(○)には認めなかった。
パラナーゼ活性に対するヘパリンの影響を示す。pFhpa2(5a)およびp
Fhpa4(5b)感染ハイ・ファイブ細胞の培地を、ヘパリン10μg/ml
の不存在下(●)または存在下(△)に、硫酸標識ECM誘導可溶性HSPG(
ピークI、◇)と培養した(18時間、37℃)。低分子量HS分解フラグメン
トの産生はヘパラナーゼ活性の強力なインヒビターであるヘパリンの存在下に完
全に消滅していた(6、7)。
分解を示す。ハイ・ファイブ細胞(6a)およびSf21細胞(6b)を硫酸標
識ECM上に塗付し、pFhpa4(●)または対照pF1(□)ウイルスとと
もに培養した(48時間、28℃)。対照非感染Sf21細胞(R)を同様に標
識したECM上に塗付した。培養した培地のpHを6.0〜6.2に調整し、3
7℃で24時間培養した。培養培地中に放出された硫酸標識物質をセファロース
6B上ゲル濾過により分析した。HS分解産物はhpa含有ウイルス感染細胞に
よってのみ産生された。
細胞(7a)およびSf21細胞(7b)を硫酸標識ECM上に塗付し、pFh
pa4(●)または対照pF1(□)ウイルスで感染させた(48時間、28℃
)。対照非感染Sf21細胞(R)を同様に標識したECM上に塗付した。培養
した培地のpHを6.0〜6.2に調整し、28℃で48時間培養した。培養培
地中に放出された硫酸標識分解フラグメントをセファロース6B上ゲル濾過によ
り分析した。HS分解フラグメントはhpa含有ウイルス感染細胞によってのみ
産生された。
pFhpa4(●)または対照pF1(□)ウイルスで感染したハイ・ファイブ
細胞(8a)およびSf21細胞(8b)の培養培地を未処理硫酸標識ECMと
ともに培養した(48時間、37℃、pH6.0)。ECMも対照非感染Sf2
1細胞(R)の培地とともに培養した。反応混合物中に放出された硫酸標識物を
ゲル濾過分析に付した。ヘパラナーゼ活性はpFhpa4感染細胞の培養培地に
のみ検出された。
の影響を示す。硫酸標識ECMをpFhpa4感染ハイ・ファイブ細胞(9a)
およびSf21細胞(9b)とともに、ヘパリン10μg/mlの不存在下(●
)または存在下(V)に培養した(24時間、37℃、pH6.0)。培地中に
放出された硫酸標識物をセファロース6B上のゲル濾過に付した。ヘパラナーゼ
活性(ピークII HS分解フラグメントの産生)はヘパリンの存在下に完全に阻 害された。
ウイルス感染Sf21細胞の培養培地をヘパリン−セファロース・クロマトグラ
フィーに付した。フラクションの溶出を0.35〜2M NaCl勾配により実 施した(◇)。溶出フラクションのヘパラナーゼ活性を図10aに示す(●)。
フラクション15〜28を15%SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付
し、次いで硝酸銀染色した。フラクション19〜24の主要タンパク質バンド(
MW〜63,000)およびヘパラナーゼ活性間には相関が示される。
ヘパリン−セファロースから溶出した活性フラクション(図10a)をプールし
、濃縮してスーパーデックス75FPLCカラムに負荷した。フラクションを収
集し、各フラクションの一部につきヘパラナーゼ活性を試験し(C、図11a)
、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、次いで硝酸銀染色し
た(図11b)。フラクション4〜7の主要タンパク質バンド(MW〜63,0
00)の出現とヘパラナーゼ活性間には相関が見られる。
〜e)からの全RNAを用いるRT−PCRによるhpa遺伝子の発現を示す。
hpa特異プライマー(I)、GAPDHハウスキーピング遺伝子用プライマー
(II)、および逆転写酵素なしの対照反応は、RNAサンプル(III)中にゲノ ムDNAあるいは他の汚染物が存在しないことを示している。M:DNA分子量
マーカーVI(ベーリンガー・マンハイム)。図12aについて:レーン1:好
中球細胞(成人);レーン2:筋肉;レーン3:胸腺;レーン4:心臓;レーン
5:副腎。図12bについて:レーン1:腎臓;レーン2:胎盤(8週);レー
ン3:胎盤(11週);レーン4〜7:母斑(完全水胞型母斑);レーン8:栄
養膜細胞層細胞(新鮮単離);レーン9:栄養膜細胞層細胞(in vitro1.5時
間);レーン10:栄養膜細胞層細胞(in vitro6時間);レーン11:栄養膜
細胞層細胞(in vitro18時間);レーン12:栄養膜細胞層細胞(in vitro4
8時間)。図12cについて:レーン1:JAR膀胱細胞系;レーン2:NCI
TT睾丸腫瘍細胞系;レーン3:SW−480ヒト肝癌細胞系;レーン4:HT
R(SV40により形質転換した栄養膜細胞層);レーン5:HPTLP−I肝
細胞癌細胞系;レーン6:EJ−28膀胱癌細胞系。図12dについて:レーン
1:SK−hep1ヒト肝癌細胞系;レーン2:DAMIヒト骨髄巨核球細胞系
;レーン3:DAMI細胞系+PMA;レーン4:CHRF細胞系+PMA;レ
ーン5:CHRF細胞系。図12eについて:レーン1:ABAEウシ大動脈内
皮細胞;レーン2:1063ヒト卵巣細胞系;レーン3:ヒト乳癌MDA435
細胞系;レーン4:ヒト乳癌MDA231細胞系。
号12)の比較を表し、後者がヒトhpaの3’末端(配列番号9のヌクレオチ
ド1066から開始)に対し80%の相同性を示す。整列化した終止コドンに下
線を付す。
イブリッドから誘導されるDNAおよびゲノムDNAのPCR産物をhpa特異
プライマーでの増幅後、0.7%アガロースゲル上分離した。レーン1:Bst
EIIで消化したラムダDNA;レーン2:DNA不在対照;レーン3〜29:P
CR増幅産物。レーン3〜5:それぞれ、ヒト、マウスおよびハムスターゲノム
DNA。レーン6〜29:それぞれ、染色体1〜22およびXとYを表すヒト単
一染色体体細胞ハイブリッド。レーン30:BstEIIで消化したラムダDNA
。約2.8Kbの増幅産物がレーン5および9にのみ観察されるが、これらはそ
れぞれヒトゲノムDNAおよびヒト染色体4を担持する細胞ハイブリッドから誘
導されるDNAを表す。これらの結果はhpa遺伝子がヒト染色体4に局在して
いることを示している。
Claims (58)
- 【請求項1】 ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするポ
リヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドフラグメントであって、該ポ
リペプチドが、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ(GCG)
の開発したDNA配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーター
を用い定量したときに、配列番号10または14の配列と少なくとも70%の相
同性を共有することを特徴とするポリヌクレオチドフラグメント。 - 【請求項2】 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9のヌクレオチド63〜
1691または配列番号13のヌクレオチド139〜1869を含む請求項1記
載のポリヌクレオチドフラグメント。 - 【請求項3】 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9のヌクレオチド63〜
721を含む請求項1記載のポリヌクレオチドフラグメント。 - 【請求項4】 該ポリヌクレオチドが配列番号9または13に記載したとお
りのものである請求項1記載のポリヌクレオチドフラグメント。 - 【請求項5】 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9または13のセグメン
トを含み、該セグメントが該ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコー
ドする請求項1記載のポリヌクレオチドフラグメント。 - 【請求項6】 該ポリペプチドが配列番号10または14に記載したアミノ
酸配列を含むものである請求項1記載のポリヌクレオチドフラグメント。 - 【請求項7】 該ポリペプチドが配列番号10または14のセグメントを含
み、該セグメントが該ヘパラナーゼ触媒活性を有するものである請求項1記載の
ポリヌクレオチドフラグメント。 - 【請求項8】 該ポリヌクレオチド配列が二本鎖DNA、一本鎖DNAおよ
びRNAからなる群より選択されるものである請求項1記載のポリヌクレオチド
フラグメント。 - 【請求項9】 ポリヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドフラグ
メントであって、該ポリヌクレオチド配列が、ウイスコンシン大学、遺伝子コン
ピューターグループ(GCG)の開発したDNA配列分析ソフトウエアパッケー
ジのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号9または13の
配列と少なくとも70%の相同性を有し、かつ、ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリ
ペプチドをエンコードするものであることを特徴とするポリヌクレオチドフラグ
メント。 - 【請求項10】 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9または13に記載し
たとおりのものである請求項9記載のポリヌクレオチドフラグメント。 - 【請求項11】 ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードする
ポリヌクレオチド配列を含んでなるベクターであって、該ポリペプチドが、ウイ
スコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ(GCG)の開発したDNA配
列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したとき
に、配列番号10または14の配列と少なくとも70%の相同性を共有すること
を特徴とするベクター。 - 【請求項12】 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9のヌクレオチド63
〜1691または配列番号13のヌクレオチド139〜1869を含む請求項1
1記載のベクター。 - 【請求項13】 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9のヌクレオチド63
〜721を含む請求項11記載のベクター。 - 【請求項14】 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9または13に記載し
たとおりのものである請求項11記載のベクター。 - 【請求項15】 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9または13のセグメ
ントを含み、該セグメントが該ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコ
ードする請求項11記載のベクター。 - 【請求項16】 該ポリペプチドが配列番号10または14に記載したアミ
ノ酸配列を含むものである請求項11記載のベクター。 - 【請求項17】 該ポリペプチドが配列番号10または14のセグメントを
含み、該セグメントが該ヘパラナーゼ触媒活性を有するものである請求項11記
載のベクター。 - 【請求項18】 該ポリヌクレオチド配列が二本鎖DNA、一本鎖DNAお
よびRNAからなる群より選択されるものである請求項11記載のベクター。 - 【請求項19】 該ベクターがバクロウイルスベクターである請求項11記
載のベクター。 - 【請求項20】 ポリヌクレオチド配列を含んでなるベクターであって、該
ポリヌクレオチド配列が、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ
(GCG)の開発したDNA配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパ
ラメーターを用い定量したときに、配列番号9または13の配列と少なくとも7
0%の相同性を有し、かつ、ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコー
ドするものであることを特徴とするベクター。 - 【請求項21】 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9または13に記載し
たとおりのものである請求項20記載のベクター。 - 【請求項22】 ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードする
ポリヌクレオチド配列含有の外来性ポリヌクレオチドフラグメントを含んでなる
宿主細胞であって、該ポリペプチドが、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピュー
ターグループ(GCG)の開発したDNA配列分析ソフトウエアパッケージのデ
フォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号10または14の配列
と少なくとも70%の相同性を共有することを特徴とする宿主細胞。 - 【請求項23】 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9のヌクレオチド63
〜1691または配列番号13のヌクレオチド139〜1869を含む請求項2
2記載の宿主細胞。 - 【請求項24】 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9のヌクレオチド63
〜721を含む請求項22記載の宿主細胞。 - 【請求項25】 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9または13に記載し
たとおりのものである請求項22記載の宿主細胞。 - 【請求項26】 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9または13のセグメ
ントを含み、該セグメントが該ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコ
ードする請求項22記載の宿主細胞。 - 【請求項27】 該ポリペプチドが配列番号10または14に記載したアミ
ノ酸配列を含むものである請求項22記載の宿主細胞。 - 【請求項28】 該ポリペプチドが配列番号10または14のセグメントを
含み、該セグメントが該ヘパラナーゼ触媒活性を有するものである請求項22記
載の宿主細胞。 - 【請求項29】 該ポリヌクレオチド配列が二本鎖DNA、一本鎖DNAお
よびRNAからなる群より選択されるものである請求項22記載の宿主細胞。 - 【請求項30】 該細胞が昆虫細胞である請求項22記載の宿主細胞。
- 【請求項31】 ポリヌクレオチド配列を含んでなる宿主細胞であって、該
ポリヌクレオチド配列が、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ
(GCG)の開発したDNA配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパ
ラメーターを用い定量したときに、配列番号9または13の配列と少なくとも7
0%の相同性を有し、かつ、ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコー
ドするものであることを特徴とする宿主細胞。 - 【請求項32】 該ポリヌクレオチド配列が配列番号9または13に記載し
たとおりのものである請求項31記載の宿主細胞。 - 【請求項33】 ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドを含んでなる組換
えタンパク質であって、該ポリペプチドが、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピ
ューターグループ(GCG)の開発したDNA配列分析ソフトウエアパッケージ
のデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号10または14の
配列と少なくとも70%の相同性を共有することを特徴とする組換えタンパク質
。 - 【請求項34】 該ポリペプチドが配列番号10または14のセグメントを
含む請求項33記載の組換えタンパク質。 - 【請求項35】 該ポリペプチドが配列番号10または14に記載したとお
りのものである請求項33記載の組換えタンパク質。 - 【請求項36】 配列番号10または14に記載したアミノ酸配列。
- 【請求項37】 配列番号10または14に相同のアミノ酸配列。
- 【請求項38】 ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドを含む組換えタン
パク質を活性成分として含んでなる製剤組成物であって、該ポリペプチドが、ウ
イスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ(GCG)の開発したDNA
配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したと
きに、配列番号10または14の配列と少なくとも70%の相同性を共有するこ
とを特徴とする製剤組成物。 - 【請求項39】 該ポリペプチドが配列番号10または14のセグメントを
含む請求項38記載の製剤組成物。 - 【請求項40】 該ポリペプチドが配列番号10または14に記載したとお
りのものである請求項38記載の製剤組成物。 - 【請求項41】 ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドを含む組換えタン
パク質を活性成分として含み、ヘパリン結合増殖因子、ヘパリン結合増殖因子お
よびサイトカインへの細胞性応答、血漿リポタンパク質との細胞相互作用、ウイ
ルス、原生動物および細菌感染に対する細胞の感受性、または神経変性プラーク
の分解のモジュレーターであって、該ポリペプチドが、ウイスコンシン大学、遺
伝子コンピューターグループ(GCG)の開発したDNA配列分析ソフトウエア
パッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号10ま
たは14の配列と少なくとも70%の相同性を共有することを特徴とするモジュ
レーター。 - 【請求項42】 該ポリペプチドが配列番号10または14のセグメントを
含む請求項41記載のモジュレーター。 - 【請求項43】 該ポリペプチドが配列番号10または14に記載したとお
りのものである請求項41記載のモジュレーター。 - 【請求項44】 ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドを含む組換えタン
パク質を活性成分として含有する医療装置を含んでなる医療機器であって、該ポ
リペプチドが、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ(GCG)
の開発したDNA配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーター
を用い定量したときに、配列番号10または14の配列と少なくとも70%の相
同性を共有することを特徴とする医療機器。 - 【請求項45】 該ポリペプチドが配列番号10または14のセグメントを
含む請求項44記載の医療機器。 - 【請求項46】 該ポリペプチドが配列番号10または14に記載したとお
りのものである請求項44記載の医療機器。 - 【請求項47】 組換えヘパラナーゼを発現する宿主細胞であって、該組換
えヘパラナーゼが、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ(GC
G)の開発したDNA配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメー
ターを用い定量したときに、配列番号10または14の配列と少なくとも70%
の相同性を共有することを特徴とする宿主細胞。 - 【請求項48】 該ポリペプチドが配列番号10または14のセグメントを
含む請求項47記載の宿主細胞。 - 【請求項49】 該ポリペプチドが配列番号10または14に記載したとお
りのものである請求項47記載の宿主細胞。 - 【請求項50】 該細胞が昆虫細胞である請求項47記載の宿主細胞。
- 【請求項51】 請求項22〜32および47〜50のいずれかに記載の宿
主細胞の抽出物または培地を含んでなる細胞抽出物もしくは調整細胞培地または
部分精製細胞抽出物もしくは調整細胞培地。 - 【請求項52】 請求項51記載の細胞抽出物もしくは調整細胞培地または
部分精製細胞抽出物もしくは調整細胞培地を含んでなるヘパラナーゼインヒビタ
ー・スクリーニングシステム。 - 【請求項53】 請求項33〜35のいずれかに記載の組換えタンパク質を
含んでなるヘパラナーゼインヒビター・スクリーニングシステム。 - 【請求項54】 ヘパラナーゼ触媒活性を過度に発現する細胞を含んでなる
ヘパラナーゼ過度発現系であって、該ヘパラナーゼ触媒活性が、ウイスコンシン
大学、遺伝子コンピューターグループ(GCG)の開発したDNA配列分析ソフ
トウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番
号10または14の配列と少なくとも70%の相同性を共有するヘパラナーゼに
よて達成されることを特徴とするヘパラナーゼ過度発現系。 - 【請求項55】 該ポリペプチドが配列番号10または14のセグメントを
含む請求項54記載の発現系。 - 【請求項56】 該ポリペプチドが配列番号10または14に記載したとお
りのものである請求項54記載の発現系。 - 【請求項57】 染色体スプレッドのヘパラナーゼ遺伝子を包含する染色体
領域を同定する方法であって、 (a)該染色体スプレッドを、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグ
ループ(GCG)の開発したDNA配列分析ソフトウエアパッケージのデフォー
ルトパラメーターを用い定量したときに、配列番号9または13の配列またはそ
の一部と少なくとも70%の相同性を有する標識ポリヌクレオチドプローブとハ
イブリッド形成させる工程、 (b)染色体スプレッドを洗浄し、過剰のハイブリッド非形成プローブを除去
する工程、および (c)当該ハイブリッド形成した標識ポリヌクレオチドプローブと会合したシ
グナルを検索し、検出されたシグナルがヘパラナーゼ遺伝子を包含する染色体領
域の指標であるとする工程、 からなることを特徴とする方法。 - 【請求項58】 配列番号9のヌクレオチド226ないし721により規定
されるポリヌクレオチド鎖の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチド配列を
含んでなる一本鎖ポリヌクレオチドフラグメント。
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