JP4180020B2 - デオキシウリジン誘導体および光応答性ヌクレオチド - Google Patents
デオキシウリジン誘導体および光応答性ヌクレオチド Download PDFInfo
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Description
この出願の発明は、デオキシウリジン誘導体に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、アンチセンスＤＮＡ、アンチジーンＤＮＡ、光遺伝子診断治療、ＤＮＡ−タンパク質相互作用の解析等への応用に有用で、核酸と生体関連分子の連結構造の形成や特異的な解裂を光により制御できるデオキシウリジン誘導体を利用した新しい可逆的光連結性ヌクレオチド、ならびにこれらを用いた光結合と光切断の方法に関するものである。
ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、タンパク質等の生体分子自身およびこれらの相互における結合・切断を特異的に制御すること、すなわち生体分子の結合・切断を特異的に制御することは、遺伝子機能の解析、各種の生理活性物質や生体分子の作用機構の解明など分子遺伝学分野において重要である。さらに、新規な生理活性物質の探索や創製、具体的にはアンチセンスＤＮＡ、アンチジーンＤＮＡ、遺伝子診断治療、すなわち遺伝子発現の制御にかかる分子医薬分野おいても極めて重要である。
現在までのところ、生体分子の特異的な結合・切断は、例えばＤＮＡ切断酵素等の各種酵素による方法が開発されているが、酵素法は反応条件に制約が多く、生体内での適用など広範囲の簡便な適用が難しい。これに対し、特開２００１−１６９５９４では、核酸の５′末端において可逆的な結合・切断を示す核酸、および前駆体であるフォスフォロアミダイトが開示されている。しかしながら、広範囲な適用を行うにあたり、前記の発明においては生体分子の結合・切断が前記核酸の５′末端にのみ限定されており、結合・切断の方向に一定の制約があった。
この出願の発明は、以上の通りの背景から、核酸の５′末端のみならず、３′末端においても、生体高分子との選択的に高い連結収率を与え、連結部の特異的な光解裂をも可能として、光連結と光解裂とを可逆的に制御することのできる新しい技術的手段を提供することを課題としている。
この出願の発明の発明者らは光応答性ヌクレオチドに関する研究を鋭意すすめ、上記の課題を解決するために下記の手段を発明した。すなわち、この出願の発明は第一に一般式（１）
加えて、この出願の発明は第３に、前記デオキシウリジン誘導体のうち少なくとも一方を含むことを特徴とする核酸合成用フォスフォロアミダイト試薬を提供する。そして、この出願の発明は第４には前記デオキシウリジン誘導体をヌクレオチド鎖中あるいは鎖末端に含むことを特徴とする光応答性ヌクレオチドを提供する。この出願の発明はさらには、第５に、前記の光応答性ヌクレオチドと生体関連高分子との系に光照射して両者の結合を形成することを特徴とする光連結方法を、第７に前記光応答性ヌクレオチドと生体関連高分子との連結構造を光照射により切断することを特徴とする光解裂方法をそれぞれ提供する。
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、核酸の５′末端のみならず、３′末端においても、生体高分子との選択的に高い連結収率を与え、連結部の特異的な光解裂をも可能として、光連結と光解裂とを可逆的に制御することのできる新しい技術的手段を提供する。この出願の発明は、各種の生理活性物質や生体分子の作用機構の解明、新規な生理活性物質の探索や創製、遺伝子の機能解析や発現制御おいての研究開発や実施利用への応用によるそれらの発展に寄与するものと期待される。
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
この発明の前記式（１）のデオキシウリジン誘導体は、ピリミジン環の５位にシアノビニル基を持つ特徴のある構造を有している。この構造におけるシアノビニル基の存在が、相手となる生体関連高分子、たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、タンパク質等との連結と解裂を光制御できるようにしている。また、この出願の発明の提供する光応答性ヌクレオチドは、シアノビニルデオキシウリジンを含む機能性核酸と呼ぶこともできる。この出願の発明の提供するデオキシウリジン誘導体は、ピリミジン環やヌクレオシド部分に許容される他の置換基を有していてもよく、またアミノ基（ＮＨ2）、ヒドロキシ基（ＯＨ）は、許容される保護基により保護されていてもよく、またデオキシウリジンは１，２，４−トリアゾールを用いる方法などの公知の方法によってシトシンに変換してもよい。
この出願の発明の５−シアノビニル−１′−α−２′−デオキシウリジン誘導体（式（１））の一態様であって、そのＸ、Ｙともに水素原子である５−シアノビニル−１′−α−２′−デオキシウリジン（式（６））は、化７に示す経路によって、１′−クロロ−３′，５′−Ｏ−ｐ−ジトリオイルデオキシリボース（クロロシュガー）より、式（４）および式（５）で表わされる反応中間体を経由することによって合成することができる。
この出願の発明の提供する光応答性ヌクレオチドは、２塩基以上１００塩基未満のオリゴヌクレオチドあるいは１００塩基以上のポリヌクレオチドからなるＤＮＡあるいはＲＮＡであり、これをもとに誘導されるＰＮＡ、あるいは公知の技術により改変された各種核酸であってもよい。この光応答性ヌクレオチドは、式（８）で表されるフォスフォロアミダイトを含むアミダイト試薬を用いフォスフォロアミダイト法によって合成することが可能であり、この合成核酸をもとに公知の方法あるいはこの出願の発明の提供する方法によって切断、あるいはさらに他のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等の生体分子と結合、またはこれらの結合・切断方法を組み合わせて作成されたＤＮＡ、ＲＮＡあるいはＰＮＡであってもよい。この出願の発明の提供する光応答性ヌクレオチドは、各種の分析や診断を目的として公知の方法により放射性同位体、蛍光物質の結合などによって化学修飾されたヌクレオチドであってもよい。
この出願の発明の提供する光による結合は、相手となる生体分子、つまりＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、あるいはタンパク質の共存下に光照射することで可能とされる。一方、光解裂については、より短波長の光を照射することで連結部での特異的な解裂として実施される。具体的には、たとえば３３０ｎｍよりも長波長の光励起により光連結を生じさせ、３２０ｎｍより単波長の光励起により解裂を生じさせることができる。これら光の照射の方法としては各種の手段から選択され、たとえばトランスイルミネータを用いることができる。
以下に実施例を用いてこの出願の発明をさらに詳細に説明するが、下記実施例はこの出願の発明のひとつの態様にすぎず、この出願の発明の実施の態様が下記実施例に制限されるものではない。
この出願の発明の提供する光による結合は、相手となる生体分子、つまりＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、あるいはタンパク質の共存下に光照射することで可能とされる。一方、光解裂については、より短波長の光を照射することで連結部での特異的な解裂として実施される。具体的には、たとえば３３０ｎｍよりも長波長の光励起により光連結を生じさせ、３２０ｎｍより単波長の光励起により解裂を生じさせることができる。これら光の照射の方法としては各種の手段から選択され、たとえばトランスイルミネータを用いることができる。
以下に実施例を用いてこの出願の発明をさらに詳細に説明するが、下記実施例はこの出願の発明のひとつの態様にすぎず、この出願の発明の実施の態様が下記実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕＜５−ヨード−３′，５′−Ｏ−ｐ−ジトルオイル−２′−デオキシウリジン反応中間体の合成＞
ヨードウラシル (4.76 g, 20mmol) をトルエン 250 ml に加え窒素置換した。これに硫酸アンモニウム (264 mg, 2 mmol) 、アセトアミド (118 mg, 2mmol) 、ヘキサメチルジシラザン (250 ml, 1185 mmol) を加えた後、3時間環流下で130℃ 加熱した。反応終了後トルエンと過剰のヘキサメチルジシラザンをエバポレーターで蒸発させ、さらに真空ポンプで3時間攪拌しながら減圧下で除いた。減圧後、窒素置換してからアセトニトリル 400 ml に溶かしクロロシュガー (9.06g, 22 mmol) とヨウ化銅 (4.19 g, 22 mmol) を加えて室温で14時間攪拌した。この溶液をアセトニトリルで濾過した後、エバポレーターで溶媒を除いてさらにクロロホルムで濾過をした。クロロホルムをエバポレーターで除いた後クロロホルム: メタノール= 98:2でシリカゲルカラムにかけて生成物５−ヨード−３′，５′−Ｏ−ｐ−ジトルオイル−２′−デオキシウリジン反応中間体（収量9.54 g, 16.2 mmol, 収率 88％；式（４）） を得た。前記生成物の物性値を下記に示す。
Rf値(クロロホルム: メタノール= 98:2) 0.10.
HRMS (ES) calc. for C25H23IN2O7 ([M + Na]+) 613.0442, found 613.0440
〔実施例２〕＜５−ヨード−２′−デオキシウリジン反応中間体の合成＞
実施例１で得た５−ヨード−３′，５′−Ｏ−ｐ−ジトルオイル−２′−デオキシウリジン反応中間体(10.4 g, 17.7 mmol；式（４）) にメタノール (100 ml )と28% アンモニア水 (300 ml) を加え室温で12時間攪拌した。エバポレーターで溶媒を除きクロロホルム: メタノール= 9:1の溶液で3回洗浄操作を行い生成物５−ヨード−２′−デオキシウリジン反応中間体（収量 5.52 g , 15.6 mmol 収率 90%；式（５））を得た。前記生成物の物性値を下記に示す。
Rf値 (クロロホルム: メタノール= 9:1) 0.11.
HRMS (ES) calc. for C9H11IN2O5 ([M + Na]+) 376.9605, found 376.9626
〔実施例３〕＜５−シアノビニル−１′−α−２′−デオキシウリジンの合成＞
トリフェニルフォスフィン (342 mg, 8.70 mmol) とパラジウムアセテート (II) (97 mg, 0.44 mmol)、トリエチルアミン (1.1 ml, 10.4 mmol) をジオキサン (60 ml) に溶かし込みオイルバスで75℃, 3分撹拌すると暗褐色に色が変化した。これに実施例２で得た５−ヨード−２′−デオキシウリジン反応中間体(3.08 g, 8.70 mmol；式（５）) とアクリロニトリル (0.923 ml, 17.4 mmol)を加えて75℃, 3時間撹拌した。反応終了後にろ過をしてパラジウムの粉を取り除き、エバポレーターで溶媒を蒸発させ酢酸エチル (20 ml、3回)と水 (30 ml)で分液し有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させた。エバポレーターで溶媒を蒸発させた後、クロロホルム: メタノール= 95:5でシリカゲルカラムにかけ生成物 (0.77 g , 2.35 mmol , 収率 27％)を得た。この生成物は下記に示す物性値より、５−シアノビニル−１′−α−２′−デオキシウリジン（式（６））と同定された。なお、２′−デオキシウリジン（CAS [951-78-0]）は２−デオキシ−Ｄ−リボースの１位のＣとウラシルの１位のＮがβ-グリコシド結合した分子であるが、前記生成物は式（６）に示すとおり、２−デオキシ−Ｄ−リボースの１位のＣと５−シアノビニルウラシル（（Ｅ）−５−シアノビニル−２，４−ジヒドロキシピリミジン）の１位のＮがα-グリコシド結合した分子である。
Rf値 (クロロホルム: メタノール= 9:1) 0.35.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 11.6 (br.s, 1H, NH); 8.41 (s, 1H, H-C(6)); 7.36 (d, 1H, J= 15.9, CH=CH); 6.84 (d, 1H, J= 16.2, CH=CH); 6.12 (d, 1H, J= 6.3, H-C(1′)); 5.25 (d, 1H, J= 4.5, H-C(3′-OH));5.16 (t, 1H, J= 5.4, H-C(5′-OH)) 4.42 (m, 1H, H-C(3′)); 3.79 (m, 1H, H-C(4′)); 3.66-3.57 (m, 2H, , H-C(5′)); 2.17 (m, 2H, Ha-C(2′)).
HRMS (MALDI) calc. for C12H13N3O5 ([M + Na]+) 302.0753, found 302.0615
(max(() = 276 nm ( 0.89 ( 104 M-1( cm-1)
(max(() = 300 nm ( 1.08 ( 104 M-1( cm-1)
(max(() = 366 nm ( 80 M-1( cm-1)
〔実施例４〕＜５−シアノビニル−１′−α−２′−デオキシ−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル―ウリジンの合成＞
実施例３で得た５−シアノビニル−１′−α−２′−デオキシウリジン(872 mg , 3.12 mmol；式（６）) をピリジン (3 ml、2回)で共沸した後、ピリジン(4 ml)に溶かし込んだ。そこへピリジン(4 ml)に溶かし込んだ 4,4−ジメトキシトリチルクロライド (2.19 g , 6.45 mmol)をシリンジで滴下し、さらにピリジン(2 ml)に溶かし込んだＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン (157 mg , 1.29 mmol)を氷浴下で加えて室温12時間撹拌した。反応終了後に脱酢酸した酢酸エチル (50 ml、3回)と水 (60 ml)で分液し有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させた。エバポレーターで溶媒を蒸発させた後、クロロホルム: エタノール= 97:3でシリカゲルカラムにかけ生成物 (933 mg , 1.60 mmol , 収率 54%)を得た。この生成物は下記に示す物性値より、５−シアノビニル−１′−α−２′−デオキシ−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル―ウリジン（式（７））と同定された。
Rf 値 (クロロホルム: エタノール= 97:3) 0.25.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 8.18 (br.s, 1H, NH); 7.97 (s, 1H, H-C(6)); 7.39- 7.21 (m, 10H, arom. H, arom. OCH3, CH=CH); 6.93 (d, 1H, J= 15.6, CH=CH); 6.83 (d, 4H, J= 9.3, arom. H); 6.27 (dd, 1H, J= 7.2, 1.5 H-C(1′)); 4.44 (m, 2H, H-C(3′), H-C(4′); 3.78 (s, 6H,arom. H); 3.47 (bs, 1H, OH); 3.27 (dd, 1H, J= 10.0, 4.5, Ha-C(5′)); 3.17 (dd, 1H, J= 10.0, 3.6, Hb-C(5′)); 2.85- 2.75 (m, 1H, Ha-C(2′)); 2.16- 2.11 (m, 1H,, Hb-C(2′)).
HRMS (MALDI) calc. for C33H31N3O7 ([M + Na]+) 604.2060, found 604.2192
〔実施例５〕＜５−シアノビニル−１′−α−２′−デオキシ−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−ウリジン−３´−Ｏ−（シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）フォスフォロアミダイトの合成＞
実施例４で得た５−シアノビニル−１′−α−２′−デオキシ−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル―ウリジン(190 mg , 0.34 mmol；式（７）) をアセトニトリル (1 ml)で共沸した後アセトニトリル(1.5 ml)、2- シアノエチル Ｎ、Ｎ、Ｎ′、Ｎ′−テトライソプロピルフォスフォロアミダイト (0.10 ml, 0.34 mmol)と0.5 M テトラゾール (0.95 ml)を加えて2時間撹拌した。反応終了後にアセトニトリルをエバポレーターで蒸発させ、脱酢酸した酢酸エチル (10 ml、3回)と飽和炭酸水素ナトリウム (15 ml)で分液し硫酸マグネシウムを用いて脱水した。そして硫酸マグネシウムをろ過で取り除き、溶媒をエバポレーターと真空ポンプで蒸発させた。この生成物は下記に示す物性値より、５−シアノビニル−１′−α−２′−デオキシ−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−ウリジン−３´−Ｏ−（シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）フォスフォロアミダイト（式（８））と同定された。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 8.01 (br.s, 1H, NH); 7.98 (s, 1H, H-C(6)); 7.32- 7.20 (m, 10H, arom. H, arom OCH3, CH=CH); 6.93 (d, 1H, J= 15.6, CH=CH); 6.83 (d, 4H, J= 9.3, arom. H); 6.35 (dd, 1H, J= 6.0, 2.7, H-C(1′)); 4.28- 4.07 (m, 2H, H-C(3′), H-C(4′); 3.78 (s, 6H,arom. H); 3.59- 3.40 (m, 7H OCH 2CH2CN, CH(CH3)2 , H-C(5′)); 2.74(t , 1H, J= 6.0, CH2CN); 2.60 (t , 1H, J= 6.0, CH2CN); 2.26- 2.24 (m, 1H, Ha-C(2′)); 2.16- 2.11 (m, 1H,, Hb-C(2′)). 1.17- 1.12(m, 9H, CH(CH3) ); 1.03( d, 3H, J= 6.9, CH(CH3)
HRMS (MALDI) calc. for C42H48N5O8P ([M + Na]+) 804.3139, found 804.3851
〔参考例１〕＜５−シアノビニル−１′−β−２′−デオキシウリジンの合成＞
トリフェニルフォスフィン (342 mg, 8.70 mmol) とパラジウムアセテート (II) (97 mg, 0.44 mmol)、トリエチルアミン (1.1 ml, 10.4 mmol) をジオキサン (60 ml)に溶かし込みオイルバスで75℃, 3分撹拌すると暗褐色に色が変化した。そこへ5- ヨード- 1'-α - 2'- デオキシウリジン (3.08 g, 8.70 mmol) とアクリロニトリル (0.923 ml, 17.4 mmol)を加えて75℃, 3時間撹拌した。反応終了後にろ過をしてパラジウムの粉を取り除き、エバポレーターで溶媒を蒸発させ酢酸エチル (20 ml、3回)と水 (30 ml)で分液し有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させた。エバポレーターで溶媒を蒸発させた後、クロロホルム: メタノール= 95:5でシリカゲルカラムにかけ生成物 (0.77 g , 2.35 mmol , 収率 27%)を得た。この生成物は下記に示す物性値より、５−シアノビニル−１′−β−２′−デオキシウリジンと同定された。
Rf値 (クロロホルム: メタノール= 9:1) 0.30.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 11.70 (br.s, 1H, NH); 8.33 (s, 1H, H-C(6)); 7.36 (d, 1H, J= 15.9, CH=CH); 6.84 (d, 1H, J= 16.2, CH=CH); 6.12 (d, 1H, J= 6.3, H-C(1')); 5.25 (d, 1H, J= 4.5, H-C(3'-OH));5.16 (t, 1H, J= 5.4, H-C(5'-OH)) 4.42 (m, 1H, H-C(3')); 3.79 (m, 1H, H-C(4')); 3.66-3.57 (m, 2H, , H-C(5')); 2.17 (m, 2H, Ha-C(2')).
HRMS (MALDI) calc. for C12H13N3O5 ([M + Na]+) 302.0753, found 302.0615
(max(() = 276 nm ( 0.89 ( 104 M-1( cm-1)
(max(() = 300 nm ( 1.08 ( 104 M-1( cm-1)
(max(() = 366 nm ( 80 M-1( cm-1)
〔参考例２〕＜５−シアノビニル−１′−β−２′−デオキシ−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル―ウリジンの合成＞
参考例１で得た５−シアノビニル−１′−β−２′−デオキシウリジン(872 mg , 3.12 mmol) をピリジン (3 ml、2回)で共沸した後、ピリジン(4 ml)に溶かし込んだ。そこへピリジン(4 ml)に溶かし込んだ 4,4−ジメトキシトリチルクロライド (2.19 g , 6.45 mmol)をシリンジで滴下し、さらにピリジン(2 ml)に溶かし込んだN,N-ジメチルアミノピリジン (157 mg , 1.29 mmol)を氷浴下で加えて室温12時間撹拌した。反応終了後に脱酢酸した酢酸エチル (50 ml、3回)と水 (60 ml)で分液し有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させた。エバポレーターで溶媒を蒸発させた後、クロロホルム: エタノール= 97:3でシリカゲルカラムにかけ生成物 (933 mg , 1.60 mmol , 収率 54%)を得た。この生成物は下記に示す物性値より、５−シアノビニル−１′−β−２′−デオキシ−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−ウリジン）と同定された。
Rf 値 (クロロホルム: エタノール= 97:3) 0.20. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 11.95 (br.s, 1H, NH); 8.22 (s, 1H, H-C(6)); 7.59- 7.45 (m, 5H, arom. H); 7.08 (dd,4H, J- 9.0, 2.1, arom. H); 6.85 (d, 1H, J= 16.2, CH=CH); 6.70 (d, 1H, J= 16.2, CH=CH); 6.37 (t , 1H, J= 6.9, H-C(1')); 4.50 (t, 1H, J= 4.5, H-C(3'), 4.15- 4.11 (m, 1H, H-C(4'); 3.95 (s, 6H, OCH3); 3.49- 3.45 (m, 1H, OH- C(3')); 3.41- 3.37 (m, 2H, H-C(5')); 2.47 (m, 2H,, H-C(2')).
HRMS (MALDI) calc. for C33H31N3O7 ([M + Na]+) 604.2060, found 604.2105
〔参考例３〕＜５−シアノビニル−１′−β−２′−デオキシ−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−ウリジン−３´−Ｏ−（シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）フォスフォロアミダイトの合成＞
参考例２で得た５−シアノビニル−１′−β−２′−デオキシ−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−ウリジン(190 mg , 0.34 mmol) をアセトニトリル (1 ml)で共沸した後アセトニトリル(1.5 ml)、2- シアノエチル N, N, N', N'- テトライソプロピルフォスフォロアミダイト (0.10 ml, 0.34 mmol)と0.5 M テトラゾール (0.95 ml)を加えて2時間撹拌した。
反応終了後にアセトニトリルをエバポレーターで蒸発させ、脱酢酸した酢酸エチル (10 ml、3回)と飽和炭酸水素ナトリウム (15 ml)で分液し硫酸マグネシウムを用いて脱水した。そして硫酸マグネシウムを濾過で取り除き、溶媒をエバポレーターと真空ポンプで蒸発させた。この生成物は下記に示す物性値より、５−シアノビニル−１′−β−２′−デオキシ−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−ウリジン−３´−Ｏ−（シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）フォスフォロアミダイト）と同定された。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 8.01 (br.s, 1H, NH); 7.98 (s, 1H, H-C(6)); 7.32- 7.26 (m, 5H, arom. H, arom,); 7.21 (dd, 4H, J= 7.8, 2.1, arom. H) 6.83 (dd, 4H, J= 9.3, 2.6, arom.H); 6.47 (d, 1H, J= 16.2, CH=CH arom. H); 6.34 (dd, 1H, J= 12.6, 6.0 , H-C(1')); 5.53 (d, 1H, J= 16.2, CH=CH,) 4.23- 4.04 (m, 2H, H-C(3'), H-C(4'); 3.78 (s, 6H, OCH3); 3.58- 3.38 (m, 6H, CE, CH(CH3)2 , H-C(5')); 2.74- 2.32(m , 4H,CE, H-C(2')); 1.19- 1.02(m, 12H, CH(CH 3)2 ).
HRMS (MALDI) calc. for C42H48N5O8P ([M + Na]+) 804.3139, found 804.3440
〔実施例６〕＜光応答性ヌクレオチドの合成＞
Applide Biosystems 3400 DNA Synthesizerを用いてシアノエチルフォスフォロアミダイト法によりデオキシオリゴヌクレオチド（以下ＯＤＮと称する）を合成した。なお、ＯＤＮ１合成およびＯＤＮ６合成においては前記実施例５で作成した式（８）のアミダイトを、またＯＤＮ６合成においてはさらにおよび参考例３で作成したアミダイトをそれぞれアミダイド試薬として用いた。合成完了後55℃のアンモニア水中で8時間かけてＯＤＮの固相担体からの切り出し、保護基の脱離操作を行い、下記に示すＯＤＮ１、ＯＤＮ２、ＯＤＮ３、ＯＤＮ４、ＯＤＮ５およびＯＤＮ６を得た。これらＯＤＮは、日本分光PU-980、UV-970、HG-980-31による逆相高速液体クロマトグラフィーを通じて精製した。それぞれのＯＤＮはApplide Biosystems Voyager-DE-PRO-SFによる質量分析とP1ヌクレアーゼ、アルカリンフォスファターゼを用いて酵素分解を行いＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕの各ヌクレオシドの組成比から表１のとおり塩基配列と分子量が同定された。
なお、表１および以下に示すヌクレオチド配列において「αCNVU」は前記実施例５で取得したα体のアミダイト由来の塩基で、（Ｅ）−５−シアノビニルウラシルが１位のＮでデオキシリボースの１位のＣにα−グリコシド結合した塩基を、「βCNVU」は前記参考例３で取得したβ体のアミダイト由来の塩基で、（Ｅ）−５−シアノビニルウラシルが１位のＮでデオキシリボースの１位のＣにβ−グリコシド結合した塩基を、「αCNVUp」は３′末端にリン酸基が付加されていることをそれぞれ示す。
ヨードウラシル (4.76 g, 20mmol) をトルエン 250 ml に加え窒素置換した。これに硫酸アンモニウム (264 mg, 2 mmol) 、アセトアミド (118 mg, 2mmol) 、ヘキサメチルジシラザン (250 ml, 1185 mmol) を加えた後、3時間環流下で130℃ 加熱した。反応終了後トルエンと過剰のヘキサメチルジシラザンをエバポレーターで蒸発させ、さらに真空ポンプで3時間攪拌しながら減圧下で除いた。減圧後、窒素置換してからアセトニトリル 400 ml に溶かしクロロシュガー (9.06g, 22 mmol) とヨウ化銅 (4.19 g, 22 mmol) を加えて室温で14時間攪拌した。この溶液をアセトニトリルで濾過した後、エバポレーターで溶媒を除いてさらにクロロホルムで濾過をした。クロロホルムをエバポレーターで除いた後クロロホルム: メタノール= 98:2でシリカゲルカラムにかけて生成物５−ヨード−３′，５′−Ｏ−ｐ−ジトルオイル−２′−デオキシウリジン反応中間体（収量9.54 g, 16.2 mmol, 収率 88％；式（４）） を得た。前記生成物の物性値を下記に示す。
Rf値(クロロホルム: メタノール= 98:2) 0.10.
HRMS (ES) calc. for C25H23IN2O7 ([M + Na]+) 613.0442, found 613.0440
〔実施例２〕＜５−ヨード−２′−デオキシウリジン反応中間体の合成＞
実施例１で得た５−ヨード−３′，５′−Ｏ−ｐ−ジトルオイル−２′−デオキシウリジン反応中間体(10.4 g, 17.7 mmol；式（４）) にメタノール (100 ml )と28% アンモニア水 (300 ml) を加え室温で12時間攪拌した。エバポレーターで溶媒を除きクロロホルム: メタノール= 9:1の溶液で3回洗浄操作を行い生成物５−ヨード−２′−デオキシウリジン反応中間体（収量 5.52 g , 15.6 mmol 収率 90%；式（５））を得た。前記生成物の物性値を下記に示す。
Rf値 (クロロホルム: メタノール= 9:1) 0.11.
HRMS (ES) calc. for C9H11IN2O5 ([M + Na]+) 376.9605, found 376.9626
〔実施例３〕＜５−シアノビニル−１′−α−２′−デオキシウリジンの合成＞
トリフェニルフォスフィン (342 mg, 8.70 mmol) とパラジウムアセテート (II) (97 mg, 0.44 mmol)、トリエチルアミン (1.1 ml, 10.4 mmol) をジオキサン (60 ml) に溶かし込みオイルバスで75℃, 3分撹拌すると暗褐色に色が変化した。これに実施例２で得た５−ヨード−２′−デオキシウリジン反応中間体(3.08 g, 8.70 mmol；式（５）) とアクリロニトリル (0.923 ml, 17.4 mmol)を加えて75℃, 3時間撹拌した。反応終了後にろ過をしてパラジウムの粉を取り除き、エバポレーターで溶媒を蒸発させ酢酸エチル (20 ml、3回)と水 (30 ml)で分液し有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させた。エバポレーターで溶媒を蒸発させた後、クロロホルム: メタノール= 95:5でシリカゲルカラムにかけ生成物 (0.77 g , 2.35 mmol , 収率 27％)を得た。この生成物は下記に示す物性値より、５−シアノビニル−１′−α−２′−デオキシウリジン（式（６））と同定された。なお、２′−デオキシウリジン（CAS [951-78-0]）は２−デオキシ−Ｄ−リボースの１位のＣとウラシルの１位のＮがβ-グリコシド結合した分子であるが、前記生成物は式（６）に示すとおり、２−デオキシ−Ｄ−リボースの１位のＣと５−シアノビニルウラシル（（Ｅ）−５−シアノビニル−２，４−ジヒドロキシピリミジン）の１位のＮがα-グリコシド結合した分子である。
Rf値 (クロロホルム: メタノール= 9:1) 0.35.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 11.6 (br.s, 1H, NH); 8.41 (s, 1H, H-C(6)); 7.36 (d, 1H, J= 15.9, CH=CH); 6.84 (d, 1H, J= 16.2, CH=CH); 6.12 (d, 1H, J= 6.3, H-C(1′)); 5.25 (d, 1H, J= 4.5, H-C(3′-OH));5.16 (t, 1H, J= 5.4, H-C(5′-OH)) 4.42 (m, 1H, H-C(3′)); 3.79 (m, 1H, H-C(4′)); 3.66-3.57 (m, 2H, , H-C(5′)); 2.17 (m, 2H, Ha-C(2′)).
HRMS (MALDI) calc. for C12H13N3O5 ([M + Na]+) 302.0753, found 302.0615
(max(() = 276 nm ( 0.89 ( 104 M-1( cm-1)
(max(() = 300 nm ( 1.08 ( 104 M-1( cm-1)
(max(() = 366 nm ( 80 M-1( cm-1)
〔実施例４〕＜５−シアノビニル−１′−α−２′−デオキシ−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル―ウリジンの合成＞
実施例３で得た５−シアノビニル−１′−α−２′−デオキシウリジン(872 mg , 3.12 mmol；式（６）) をピリジン (3 ml、2回)で共沸した後、ピリジン(4 ml)に溶かし込んだ。そこへピリジン(4 ml)に溶かし込んだ 4,4−ジメトキシトリチルクロライド (2.19 g , 6.45 mmol)をシリンジで滴下し、さらにピリジン(2 ml)に溶かし込んだＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン (157 mg , 1.29 mmol)を氷浴下で加えて室温12時間撹拌した。反応終了後に脱酢酸した酢酸エチル (50 ml、3回)と水 (60 ml)で分液し有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させた。エバポレーターで溶媒を蒸発させた後、クロロホルム: エタノール= 97:3でシリカゲルカラムにかけ生成物 (933 mg , 1.60 mmol , 収率 54%)を得た。この生成物は下記に示す物性値より、５−シアノビニル−１′−α−２′−デオキシ−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル―ウリジン（式（７））と同定された。
Rf 値 (クロロホルム: エタノール= 97:3) 0.25.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 8.18 (br.s, 1H, NH); 7.97 (s, 1H, H-C(6)); 7.39- 7.21 (m, 10H, arom. H, arom. OCH3, CH=CH); 6.93 (d, 1H, J= 15.6, CH=CH); 6.83 (d, 4H, J= 9.3, arom. H); 6.27 (dd, 1H, J= 7.2, 1.5 H-C(1′)); 4.44 (m, 2H, H-C(3′), H-C(4′); 3.78 (s, 6H,arom. H); 3.47 (bs, 1H, OH); 3.27 (dd, 1H, J= 10.0, 4.5, Ha-C(5′)); 3.17 (dd, 1H, J= 10.0, 3.6, Hb-C(5′)); 2.85- 2.75 (m, 1H, Ha-C(2′)); 2.16- 2.11 (m, 1H,, Hb-C(2′)).
HRMS (MALDI) calc. for C33H31N3O7 ([M + Na]+) 604.2060, found 604.2192
〔実施例５〕＜５−シアノビニル−１′−α−２′−デオキシ−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−ウリジン−３´−Ｏ−（シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）フォスフォロアミダイトの合成＞
実施例４で得た５−シアノビニル−１′−α−２′−デオキシ−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル―ウリジン(190 mg , 0.34 mmol；式（７）) をアセトニトリル (1 ml)で共沸した後アセトニトリル(1.5 ml)、2- シアノエチル Ｎ、Ｎ、Ｎ′、Ｎ′−テトライソプロピルフォスフォロアミダイト (0.10 ml, 0.34 mmol)と0.5 M テトラゾール (0.95 ml)を加えて2時間撹拌した。反応終了後にアセトニトリルをエバポレーターで蒸発させ、脱酢酸した酢酸エチル (10 ml、3回)と飽和炭酸水素ナトリウム (15 ml)で分液し硫酸マグネシウムを用いて脱水した。そして硫酸マグネシウムをろ過で取り除き、溶媒をエバポレーターと真空ポンプで蒸発させた。この生成物は下記に示す物性値より、５−シアノビニル−１′−α−２′−デオキシ−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−ウリジン−３´−Ｏ−（シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）フォスフォロアミダイト（式（８））と同定された。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 8.01 (br.s, 1H, NH); 7.98 (s, 1H, H-C(6)); 7.32- 7.20 (m, 10H, arom. H, arom OCH3, CH=CH); 6.93 (d, 1H, J= 15.6, CH=CH); 6.83 (d, 4H, J= 9.3, arom. H); 6.35 (dd, 1H, J= 6.0, 2.7, H-C(1′)); 4.28- 4.07 (m, 2H, H-C(3′), H-C(4′); 3.78 (s, 6H,arom. H); 3.59- 3.40 (m, 7H OCH 2CH2CN, CH(CH3)2 , H-C(5′)); 2.74(t , 1H, J= 6.0, CH2CN); 2.60 (t , 1H, J= 6.0, CH2CN); 2.26- 2.24 (m, 1H, Ha-C(2′)); 2.16- 2.11 (m, 1H,, Hb-C(2′)). 1.17- 1.12(m, 9H, CH(CH3) ); 1.03( d, 3H, J= 6.9, CH(CH3)
HRMS (MALDI) calc. for C42H48N5O8P ([M + Na]+) 804.3139, found 804.3851
〔参考例１〕＜５−シアノビニル−１′−β−２′−デオキシウリジンの合成＞
トリフェニルフォスフィン (342 mg, 8.70 mmol) とパラジウムアセテート (II) (97 mg, 0.44 mmol)、トリエチルアミン (1.1 ml, 10.4 mmol) をジオキサン (60 ml)に溶かし込みオイルバスで75℃, 3分撹拌すると暗褐色に色が変化した。そこへ5- ヨード- 1'-α - 2'- デオキシウリジン (3.08 g, 8.70 mmol) とアクリロニトリル (0.923 ml, 17.4 mmol)を加えて75℃, 3時間撹拌した。反応終了後にろ過をしてパラジウムの粉を取り除き、エバポレーターで溶媒を蒸発させ酢酸エチル (20 ml、3回)と水 (30 ml)で分液し有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させた。エバポレーターで溶媒を蒸発させた後、クロロホルム: メタノール= 95:5でシリカゲルカラムにかけ生成物 (0.77 g , 2.35 mmol , 収率 27%)を得た。この生成物は下記に示す物性値より、５−シアノビニル−１′−β−２′−デオキシウリジンと同定された。
Rf値 (クロロホルム: メタノール= 9:1) 0.30.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 11.70 (br.s, 1H, NH); 8.33 (s, 1H, H-C(6)); 7.36 (d, 1H, J= 15.9, CH=CH); 6.84 (d, 1H, J= 16.2, CH=CH); 6.12 (d, 1H, J= 6.3, H-C(1')); 5.25 (d, 1H, J= 4.5, H-C(3'-OH));5.16 (t, 1H, J= 5.4, H-C(5'-OH)) 4.42 (m, 1H, H-C(3')); 3.79 (m, 1H, H-C(4')); 3.66-3.57 (m, 2H, , H-C(5')); 2.17 (m, 2H, Ha-C(2')).
HRMS (MALDI) calc. for C12H13N3O5 ([M + Na]+) 302.0753, found 302.0615
(max(() = 276 nm ( 0.89 ( 104 M-1( cm-1)
(max(() = 300 nm ( 1.08 ( 104 M-1( cm-1)
(max(() = 366 nm ( 80 M-1( cm-1)
〔参考例２〕＜５−シアノビニル−１′−β−２′−デオキシ−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル―ウリジンの合成＞
参考例１で得た５−シアノビニル−１′−β−２′−デオキシウリジン(872 mg , 3.12 mmol) をピリジン (3 ml、2回)で共沸した後、ピリジン(4 ml)に溶かし込んだ。そこへピリジン(4 ml)に溶かし込んだ 4,4−ジメトキシトリチルクロライド (2.19 g , 6.45 mmol)をシリンジで滴下し、さらにピリジン(2 ml)に溶かし込んだN,N-ジメチルアミノピリジン (157 mg , 1.29 mmol)を氷浴下で加えて室温12時間撹拌した。反応終了後に脱酢酸した酢酸エチル (50 ml、3回)と水 (60 ml)で分液し有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させた。エバポレーターで溶媒を蒸発させた後、クロロホルム: エタノール= 97:3でシリカゲルカラムにかけ生成物 (933 mg , 1.60 mmol , 収率 54%)を得た。この生成物は下記に示す物性値より、５−シアノビニル−１′−β−２′−デオキシ−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−ウリジン）と同定された。
Rf 値 (クロロホルム: エタノール= 97:3) 0.20. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 11.95 (br.s, 1H, NH); 8.22 (s, 1H, H-C(6)); 7.59- 7.45 (m, 5H, arom. H); 7.08 (dd,4H, J- 9.0, 2.1, arom. H); 6.85 (d, 1H, J= 16.2, CH=CH); 6.70 (d, 1H, J= 16.2, CH=CH); 6.37 (t , 1H, J= 6.9, H-C(1')); 4.50 (t, 1H, J= 4.5, H-C(3'), 4.15- 4.11 (m, 1H, H-C(4'); 3.95 (s, 6H, OCH3); 3.49- 3.45 (m, 1H, OH- C(3')); 3.41- 3.37 (m, 2H, H-C(5')); 2.47 (m, 2H,, H-C(2')).
HRMS (MALDI) calc. for C33H31N3O7 ([M + Na]+) 604.2060, found 604.2105
〔参考例３〕＜５−シアノビニル−１′−β−２′−デオキシ−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−ウリジン−３´−Ｏ−（シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）フォスフォロアミダイトの合成＞
参考例２で得た５−シアノビニル−１′−β−２′−デオキシ−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−ウリジン(190 mg , 0.34 mmol) をアセトニトリル (1 ml)で共沸した後アセトニトリル(1.5 ml)、2- シアノエチル N, N, N', N'- テトライソプロピルフォスフォロアミダイト (0.10 ml, 0.34 mmol)と0.5 M テトラゾール (0.95 ml)を加えて2時間撹拌した。
反応終了後にアセトニトリルをエバポレーターで蒸発させ、脱酢酸した酢酸エチル (10 ml、3回)と飽和炭酸水素ナトリウム (15 ml)で分液し硫酸マグネシウムを用いて脱水した。そして硫酸マグネシウムを濾過で取り除き、溶媒をエバポレーターと真空ポンプで蒸発させた。この生成物は下記に示す物性値より、５−シアノビニル−１′−β−２′−デオキシ−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−ウリジン−３´−Ｏ−（シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）フォスフォロアミダイト）と同定された。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 8.01 (br.s, 1H, NH); 7.98 (s, 1H, H-C(6)); 7.32- 7.26 (m, 5H, arom. H, arom,); 7.21 (dd, 4H, J= 7.8, 2.1, arom. H) 6.83 (dd, 4H, J= 9.3, 2.6, arom.H); 6.47 (d, 1H, J= 16.2, CH=CH arom. H); 6.34 (dd, 1H, J= 12.6, 6.0 , H-C(1')); 5.53 (d, 1H, J= 16.2, CH=CH,) 4.23- 4.04 (m, 2H, H-C(3'), H-C(4'); 3.78 (s, 6H, OCH3); 3.58- 3.38 (m, 6H, CE, CH(CH3)2 , H-C(5')); 2.74- 2.32(m , 4H,CE, H-C(2')); 1.19- 1.02(m, 12H, CH(CH 3)2 ).
HRMS (MALDI) calc. for C42H48N5O8P ([M + Na]+) 804.3139, found 804.3440
〔実施例６〕＜光応答性ヌクレオチドの合成＞
Applide Biosystems 3400 DNA Synthesizerを用いてシアノエチルフォスフォロアミダイト法によりデオキシオリゴヌクレオチド（以下ＯＤＮと称する）を合成した。なお、ＯＤＮ１合成およびＯＤＮ６合成においては前記実施例５で作成した式（８）のアミダイトを、またＯＤＮ６合成においてはさらにおよび参考例３で作成したアミダイトをそれぞれアミダイド試薬として用いた。合成完了後55℃のアンモニア水中で8時間かけてＯＤＮの固相担体からの切り出し、保護基の脱離操作を行い、下記に示すＯＤＮ１、ＯＤＮ２、ＯＤＮ３、ＯＤＮ４、ＯＤＮ５およびＯＤＮ６を得た。これらＯＤＮは、日本分光PU-980、UV-970、HG-980-31による逆相高速液体クロマトグラフィーを通じて精製した。それぞれのＯＤＮはApplide Biosystems Voyager-DE-PRO-SFによる質量分析とP1ヌクレアーゼ、アルカリンフォスファターゼを用いて酵素分解を行いＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕの各ヌクレオシドの組成比から表１のとおり塩基配列と分子量が同定された。
なお、表１および以下に示すヌクレオチド配列において「αCNVU」は前記実施例５で取得したα体のアミダイト由来の塩基で、（Ｅ）−５−シアノビニルウラシルが１位のＮでデオキシリボースの１位のＣにα−グリコシド結合した塩基を、「βCNVU」は前記参考例３で取得したβ体のアミダイト由来の塩基で、（Ｅ）−５−シアノビニルウラシルが１位のＮでデオキシリボースの１位のＣにβ−グリコシド結合した塩基を、「αCNVUp」は３′末端にリン酸基が付加されていることをそれぞれ示す。
実施例６で作成したＯＤＮ１(10(M)とＯＤＮ２(10(M) の混合溶液に対し、相補的な鋳型ＯＤＮ３(13(M)の共在下において、366 nmの光照射を行った。反応条件は0℃でカコジル酸ナトリウム 25 mM、塩化ナトリウム 50 mM、トランスイルミネータを用いた。この光照射により連結体ＯＤＮＣ１を得た。光照射前、光照射後0分、5分、30分でそれぞれ逆相HPLC分析を行った結果を図１に示した。溶離液は30分間にギ酸アンモニウム：アセトニトリル＝ 94:6から85:15へと移動相の組成を変化させたものを用いた。実施例６と同様の方法で連結体ＯＤＮＣ１の塩基配列および分子量を測定した結果、連結体ＯＤＮＣ１はＯＤＮ１の３′末端のαCNVUとＯＤＮ２の５′末端が結合した5′−d(TGTGCαCNVUTGCGTG)− 3′と同定された（表１）。
〔実施例８〕＜光応答性ヌクレオチドによるＤＮＡの切断＞
実施例７で得られた連結体ＯＤＮＣ１にさらに312 nmの光照射を５分間行った。光照射前、光照射後5分でそれぞれ逆相HPLC分析を行った。得られた各ピークに対し実施例６と同様に分子量と塩基配列を同定した。その結果を図１に示す。ＯＤＮＣ１は光照射後、αCNVUの３′側で解裂し、ＯＤＮ１およびＯＤＮ２に分離切断されたことが明らかとなった。これよりこの出願の発明の提供する光応答性ヌクレオチドにおいては図２の模式図で示すようなαCNVUの３′側で可逆的に結合・切断を行うことが可能であることが確認された。
〔実施例９〕＜光応答性ヌクレオチドによるＤＮＡの両末端における双方向連結＞
実施例８で作成したＯＤＮ２(10(M)、ＯＤＮ４(10(M)、およびＯＤＮ５(10(M)の混合溶液に対し、相補的な鋳型鎖ＯＤＮ６(10(M)共在下において、366 nmの光照射を行った。反応条件は0℃でカコジル酸ナトリウム 50 mM、塩化ナトリウム 100 mM、トランスイルミネータで60分光照射を行った。この光照射により連結体ＯＤＮＣ２を得た。光照射前、光照射後30分でそれぞれ逆相HPLC分析を行った結果を図３に示した。溶離液は30分間にギ酸アンモニウム：アセトニトリル＝ 94: 6から85: 15へと移動相の組成を変化させたものを用いた。実施例９と同様の方法で連結体ＯＤＮＣ２の塩基配列および分子量を測定した結果、連結体ＯＤＮＣ２は５′側よりＯＤＮ４、ＯＤＮ５、ＯＤＮ２が結合しており、ＯＤＮ５の３′末端のαCNVUとＯＤＮ２の５′末端が結合し、ＯＤＮ５の５′末端のβCNVUとＯＤＮ４の３′末端が結合した5′−d(GACAGCβCNVUGTGCαCNVUTGCGTG)−3′と同定された（表１）。また、この光連結の作用機構は図４に示す機構と考察される。
この出願の発明の提供するこれよりこの出願の発明の提供するβCNVUおよびαCNVUをそれぞれ５′および３′末端に持つ光応答性ヌクレオチドにおいては両末端で同時に光連結を行うことが可能であることが確認された。
Claims (6)
- 一般式（１）
- Ｙが前記式（２）のフォスフォロアミダイト基である請求項１記載のデオキシウリジン誘導体。
- 請求項２記載のデオキシウリジン誘導体を含むことを特徴とする核酸合成用フォスフォロアミダイト試薬。
- 請求項１記載のデオキシウリジン誘導体をヌクレオチド鎖中あるいは鎖末端に含むことを特徴とする光応答性ヌクレオチド。
- 請求項４記載の光応答性ヌクレオチドと生体関連高分子との系に光照射して両者の結合を形成することを特徴とする光連結方法。
- 請求項４記載の光応答性ヌクレオチドと生体関連高分子との連結構造を光照射により切断することを特徴とする光解裂方法。
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