JP4081143B2 - 多孔性架橋多糖ゲルの製造方法並びにゲル濾過媒質としておよびクロマトグラフィーにおけるその用途 - Google Patents

多孔性架橋多糖ゲルの製造方法並びにゲル濾過媒質としておよびクロマトグラフィーにおけるその用途 Download PDF

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Description

この発明は、品質が改善された架橋多糖ゲルの製造方法およびその方法により得られるゲルおよびその用途に関するものである。より正確には、この発明は、新規架橋方法であって、エマルジョンおよびゲル形成前に2官能性架橋剤を多糖溶液中に導入する方法に関するものである。
クロマトグラフィー方法は、分子、例えばタンパク質、核酸、多糖類などの分離および精製に常用される。無機材料並びに合成ポリマーおよび多糖類など広範な種類の分離媒質が使用可能である。
多糖類のゲルマトリックスは、品質が良いため長年の間分離媒質として使用されており、上記マトリックスは現在では生化学研究室における標準備品である。多糖類は広い範囲の条件下で生体分子に対し不活性である。多糖類は天然物質であり、多くの適用分野に関して当局(例えばアメリカ合衆国では食品医薬品局(FDA))により認可されている。クロマトグラフィー分離方法を用いる場合、分離生成物中に分離媒質の痕跡が残存し得る。多糖類が分離媒質として使用される場合、この物質は毒性がないので無害である。
一般に、クロマトグラフィー分離は、粒子ビーズ形態の分離マトリックスによりパッキングされたカラムで行われる。急速な流速で反応速度が速い分離媒質は、生産性を高めるもので、粒子サイズの低減化により達成され得る。しかしながら、ビーズが小さいと、パッキングベッドにおける粒子間の対流的フローチャンネルが狭まるため背圧が高くなる。高分子を分離させ得るためには、粒子は大きな孔をもつべきであるが、孔が大きいと、粒子構造は弱くなり得る。多糖類は軟物質であるため、粒子は特に高い流速では容易に崩壊し得る。すなわち、より安定した多糖粒子の製造方法が要望されている。ポリマーを架橋することにより、多糖粒子の安定性が高められることはよく知られている。架橋プロセスでは、ポリマー鎖をそれぞれの遊離ヒドロキシル基のところで互いに化学結合させることにより多糖ゲルマトリックスが安定化される。架橋は、ヒドロキシルおよびクロスリンカーの官能基間で行われる。これは粒子剛性に影響を及ぼすが、孔のサイズにはそれほどまたは全く影響しない。異なる架橋方法を開示している特許および文献も幾つかある。公知架橋剤は、エピクロロヒドリン、ビス−エポキシド類、ジビニルスルホンである。
EP203049では、使用される架橋剤が単官能性であるが、後で活性化され得る追加の遮蔽官能基も含んでいると、多糖類の剛性はかなり改善されると報告されていた。架橋は2段階で為された。まず多糖を単官能基により誘導体化した。そして次の段階で、遮蔽基を活性化し、多糖類のヒドロキシル基と反応させた。こうして架橋の長さが制御され、所望の剛性が得られた。
当業界の現行方法に共通した特徴は、架橋がゲル粒子形成後の多糖ポリマーで行われることである。すなわち、架橋は、既製構造で為される。例えばアガロースの粒子は、加熱して水にアガロースを溶かすことにより製造される。次いで、温水溶液を乳化すると、有機溶媒、例えばトルエン中に球形粒子が形成される。冷却後粒子が沈澱する。次いで粒子を架橋する。アガロース溶液の濃度を変えることにより、様々な孔サイズが得られる。アガロース溶液の濃度が低いと、大きな孔が得られる。
この発明の目的は、改善された架橋多糖ゲル製造方法を得ることであった。
この発明のさらに別の目的は、高い流速/背圧に耐える吸収力が改善されているが、分離特質は保持している剛性多糖ゲル粒子を製造することであった。
この発明の目的は、請求の範囲に記載された製法および多糖ゲルにより達成される。この発明によると、多孔性架橋多糖ゲルの製造方法であって、次の段階:
a)多糖類の溶液または分散液を製造し、
b)段階a)で得られた溶液または分散液に1活性部位および1不活性部位を有する2官能性架橋剤を加え、
c)多糖類のヒドロキシル基を架橋剤の活性部位と反応させ、
d)多糖ゲルを形成させ、
e)架橋剤の不活性部位を活性化し、
f)段階e)の活性化部位を多糖ゲルのヒドロキシル基と反応させることにより、ゲルの架橋が行われる
ことを特徴とする方法が得られる。
この発明のさらに別の態様によると、多孔性架橋多糖ゲルは、次の段階:
a)多糖類の溶液または分散液を製造し、
b)段階a)で得られた溶液または分散液に1活性部位および1不活性部位を有する2官能性架橋剤を加え、
c)多糖類のヒドロキシル基を架橋剤の活性部位と反応させ、
d)多糖ゲルを形成させ、
e)架橋剤の不活性部位を活性化し、
f)段階e)の活性化部位を多糖ゲルのヒドロキシル基と反応させることにより、ゲルの架橋が行われる
ことにより得られる。
この発明によると、驚くべきことに、既知ゲルと比べて、300%を越える割合で大きな圧力/フロー吸収力をもつゲルが得られることが見いだされた。粒子直径も小さい(約10μm)高度剛性ゲル粒子を製造することが可能であった。
この発明の新規方法によると、ゲル形成前に架橋剤を多糖溶液または分散液に導入する。架橋剤は、1活性部位および1不活性部位をもつ2官能性剤である。多糖溶液または分散液に加えられると、薬剤の活性部位と多糖類のヒドロキシル基との反応が行われる。それにより架橋剤がポリマー鎖に化学結合した後、ゲル形成プロセスが開始される。こうして内部架橋剤は多糖類に導入される。
このプロセスの第1段階では、多糖類の溶液または分散液が形成される。多糖類と一緒に常用される溶媒または分散剤として、例えばアセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ピリジン、s−およびt−アルコール類、例えばイソプロパノールなどが使用され得る。しかしながら、この発明の好ましい態様によると、多糖類の水溶液が使用される。
架橋剤導入後、ゲルが多糖から形成される。溶媒として水を使用しなかった場合、溶媒または分散剤を捨て、多糖を水に溶かす。水溶液を有機溶媒、例えばトルエンまたはヘプタン中で乳化することにより、ゲルが形成される。次いで、架橋剤の不活性部位を活性化し、多糖類のヒドロキシル基と反応させることにより、ゲルが架橋される。
架橋ゲルは、当業界の現段階までに知られている慣用的方法によりさらに架橋され得る。このさらなる架橋は、どの程度の剛性の粒子が要求されるかにより1度または数回行われ得る。この慣用的架橋はまた、段階e)およびf)における架橋剤の不活性部位の活性化および反応の前またはそれと同時に段階d)のゲルで行われ得る。この発明のさらに別の態様では、段階b)およびc)を段階d)またはe)の後に1度または数回反復することにより、段階e)およびf)または段階f)を行う前にさらに架橋剤を加えることができる。
この発明に従い使用される2官能性架橋剤は、1活性部位および1不活性部位を含む。活性部位とは、多糖類のヒドロキシル基と反応し得る基を全て包含する。上記基の例は、ハライド、エポキシド、メチロール基である。不活性部位とは、反応性部位に関する反応条件下では反応しないが後に活性化されて多糖類のヒドロキシル基と反応し得る基である。二重結合を含む基、例えばアリル、ビニル、アクリル基が適当である。活性および不活性部位を結合する基は不可欠というわけではないが、当然結合活性を欠き、長すぎないものであるべきである。好ましい架橋剤は、アリルグリシジルエーテルおよびアリルハライド、好ましくはアリルブロミドであるが、例えばN−メチロールアクリルアミド、ビニルベンジルクロリド、シナモイルクロリドを使用することも可能である。ヒドロキシル基および活性部位および活性化不活性部位間の反応、並びにこの部位の活性化は、それ自体公知の化学反応である。
2官能性架橋剤との反応は、次の反応式をもつアガロース(AG)に関して説明され得る。
アリルグリシジルエーテルの活性部位との反応:
Figure 0004081143
不活性部位の活性化および反応:
Figure 0004081143
慣用的方法によるさらなる架橋は、公知架橋剤のいずれかにより達成され得る。適当な化合物は、エピハロヒドリン、ビス−エポキシド、ジビニルスルホン、アリルグリシジルエーテルおよびジブロモプロパン−1−オールの群から選ばれる1種または数種の物質である。すなわち、慣用的架橋は、内部第一架橋段階の場合と同じクロスリンカーまたは別のクロスリンカーまたはクロスリンカーの混合物により行われ得る。
この発明による方法は、あらゆるタイプの多糖類、例えばアガロース、アガロース誘導体、澱粉誘導体、デキストランまたはその誘導体、アルギナート、カラゲーニンにおいて使用され得る。しかしながら、アガロースが好ましい物質である。
この発明によるゲルマトリックスは、好ましくは粒子として製造される。ゲルの製造はよく知られた方法により行われる。アガロースは例えば、アガロースに関するゲル点より高温に溶液を加熱することにより水に溶解する。架橋剤を温水アガロース溶液に加え、薬剤の活性部位をアガロースのヒドロキシル基と反応させる。
次いで、アガロース溶液を有機溶媒、例えばトルエン中で乳化する。冷却によりゲル粒子が沈澱する。その後、架橋剤の不活性部位を活性化し、アガロース粒子のヒドロキシル基と反応させることにより、ゲルが架橋される。
粒子のサイズは、アガロース溶液を乳化するときの撹拌速度により決まる。要求される最終粒子サイズは、ふるいにより達成される。孔サイズは、例えば多糖濃度を変えることにより調節される。この発明による方法を用いることにより、慣用的直径および孔サイズをもつ多糖粒子を製造することができる。アガロース粒子を製造する場合、濃度は好適には0.5−20重量%、好ましくは1−12重量%である。粒子直径は、1mm−1μm、好ましくは500μm−1μm、最も好ましくは200μm−1μmである。
この発明によると、高度剛性多糖粒子を製造することが可能である。多糖濃度も上述した孔サイズに対してだけでなく剛性にとっても重要であるにせよ、剛性に影響する主要パラメーターは、加えられるクロスリンカーの量である。剛性粒子を得るため、クロスリンカー濃度は、ゲル1gに対し好ましくは30−80マイクロモル、最も好ましくは45−60マイクロモルの範囲内とすべきである。30マイクロモル/gより濃度が低いと、ゲルの圧力/フロー吸収力が比較的低いものとなる傾向がある。80マイクロモル/gより濃度が高いと、収縮し過ぎて許容し得ないゲルになり得る。
この発明による多孔性架橋多糖ゲルは、分子をそれらのサイズの差異によって分離するゲル濾過媒質として使用され得る。それらはまた修飾後、様々なタイプのアフィニティー・クロマトグラフィーにおいても使用され得る。ゲルは、自体公知の方法で多くの異なる基により置換され得る。それらの基の中では、次のものが挙げられる:
1.正に荷電した基(第1級、第2級、第3級または第4級アミノ基)
2.負に荷電した基(例、カルボキシ、ホスホン酸、スルホン酸など)
3.両性基
4.特異的親和力をもつ基(例、IgG−結合タンパク質(プロテインA、G、Lなど)およびIgG、レクチンおよび炭水化物、抗原/ハプテンおよび抗体、(ストレプト)アビジンおよびビオチン間における場合)、
5.相補的核酸/オリゴヌクレオチド、
6.パイ電子系をもつ基
7.キレート基
8.疎水性基。
これらの基を伴うと、マトリックスは、アフィニティー・クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、共有結合クロマトグラフィーなどで使用され得る。
以下、実施例によりこの発明について説明するが、それらはこの発明の限定を意図するものではない。部およびパーセントは、特に明記していなければ重量部および重量パーセントを意味する。
実施例1
アガロース溶液の製造
アガロース溶液は、バッチ反応器中95℃で2時間7gのアガロースを撹拌しながら100mlの蒸留水に加えることにより製造される。
2時間の反応後、溶液を70℃に冷却し、1mlの45%NaOHおよび1.67mlのアリルグリシジルエーテル(AGE)をアガローススラリーに加える。この反応を、70℃で撹拌下2時間続行させる。次いで溶液を0.15mlの60%酢酸およびHClにより中和する(pH7−8)。
エマルジョン媒質
エマルジョン媒質は、エマルジョン反応器中60℃で撹拌下5.3gのエチルセルロース(N−50乳化剤)を117mlのトルエンに加えることにより製造される(トルエン中におけるN−50の溶解は約2時間かかる)。
エマルジョン反応器へのアガロース溶液の移入
アガロース溶液をエマルジョン媒質へ移す。撹拌を130rpmに調節する。それによりアガロースゲル粒子が形成され、それらのサイズは撹拌装置の回転速度を変え、さらにN−50を加えることにより制御され得る。
所望の最大粒子サイズは150μmである。ゲル粒子が大きすぎる場合、回転速度は220rpmまで増大され得、追加のN−50が加えられ得る。最大粒子サイズは、約10分ごとにサンプルを採取し、サイズ目盛りが組み込まれた顕微鏡で分析することにより制御される。
150μmに達すると、溶液を冷却する。
冷却工程
溶液を約30分で60℃〜<25℃に冷却する。
ゲル洗浄工程
ゲル粒子を撹拌下で1リットルの99.5%エタノールにより洗浄し、傾斜する。次いで、ゲルを、吸引漏斗(nutsch)で4×1リットルの99.5%エタノールおよび4×1リットルの蒸留水により洗浄する。
アリルグリシジルエーテルの不活性部位の活性化およびアガロースの架橋=架橋番号1
臭素化
10gのNaAc(酢酸ナトリウム)を、100mlのゲルおよび200mlの蒸留水から成る溶液を含む反応器中に撹拌しながら加える。5分後、暗黄色となるまで臭素−水(Br2/HO)を溶液に加え、1分間にわたって維持する。反応が約15分間続いた後、蟻酸ナトリウムを加えるとゲルは白くなる。ゲルを3×1リットルの蒸留水により洗浄する。
架橋
5gのNaSOを、100mlの臭素化ゲルおよび100mlの蒸留水から成る溶液を含む反応器に撹拌しながら加える。15分後、10mlの45%NaOHおよび0.3gのNaBHを溶液に加える。反応は3時間続き、次いで溶液温度を40℃に高め、反応を16時間続行させる。ゲルをpH=7になるまで蒸留水で洗浄する。
慣用的方法によるさらなる架橋=架橋番号2
45.3gのNaSOを、100mlのAGE架橋ゲルおよび33.3mlの蒸留水から成る溶液(75%ゲルスラリー)を含む反応器に撹拌しながら加える。反応温度を50℃に高め、2時間後、1.33mlの45%NaOHおよび0.4gのNaBHを加え、並びに9.33mlの45%NaOHおよび10mlのエピクロロヒドリン(ECH)を6−8時間の間に加える。反応は一夜にわたって(約16時間)続く。ゲルを蒸留水で洗浄し、60%酢酸を加えてpH=5−6にする。
次いで、ゲルをふるいにかけて、所望の粒子サイズ間隔(40−100μm)にする。
実施例2
この実施例では、この発明による架橋後慣用的方法により2回架橋された粒子が製造される。すなわち、実施例1により製造された粒子を、架橋番号2方法で架橋した。
118gのNaSOを、260mlのECH架橋ゲルおよび87mlの蒸留水から成る溶液に撹拌しながら加える。温度をゆっくりと50℃に高め、2時間後3.5mlの45%NaOHおよび0.35gのNaBHを加え、24mlの45%NaOHおよび26mlのECHをゆっくりと(6−8時間)溶液中へ注入する。反応を16時間保ち、次いでゲルをpH=5−6になるまで蒸留水(および0.6ml酢酸)により洗浄する。ゲルをふるいにかけ、試験する。
実施例3
比較実施例として、エマルジョン工程後にアリル化されたアガロースゲルマトリックスを製造する。乳化前のアリル化について実施例1に記載された合成方法に類似した合成方法を使用する。これらの生成物は、新たに開発された技術により製造されたものと同じアリル濃度を有する。これらのゲルを製造するのに使用される別の合成方法は、次の段階により構成される。
エマルジョン
28gのアガロースを400mlの蒸留水に加え、2時間95℃に加熱する。その後、溶液を70℃に冷却し、470mlトルエンおよび35gのN−50(乳化剤)を含む60℃温溶液に移す。約45分の撹拌後、150μmの平均粒子サイズが得られる。溶液を約30分間22℃に冷却し、無水エタノール(4×2リットル)および蒸留水(4×2リットル)により洗浄する。
アリル化:
33.5gのNaSOおよび1.8gのNaBHを、355mlのアガロースゲルおよび106.5mlの蒸留水を含む溶液に加える。この溶液を30℃の温度で5分間撹拌し、次いで25mlのAGEおよび71mlの45%NaOHを溶液にゆっくりと(6−8時間)注入する。撹拌を同温度で16時間続行する。アリル化ゲル蒸留水(3×2リットル)で洗浄する。
臭素化:
36gの酢酸ナトリウムを、360mlのアリル化ゲルおよび720mlの蒸留水の溶液に加える。5分撹拌後、146mlのBr2/HOを溶液に加え、反応を15分間行わせる。次いで、0.5gの蟻酸ナトリウムを加えると、ゲルは白くなる。ゲルを3×2ゲル体積の蒸留水により洗浄する。
架橋番号1:
18gのNaSOを、360mlの臭素化ゲルおよび360mlの蒸留水から成る溶液に加える。混合物を撹拌し続け、15分後、72mlの45%NaOHを1.08gのNaBHと一緒に溶液中に注入する(30分間)。3時間後、温度を40℃に高め、反応を16時間持続する。次いでゲルをpHが約7になるまで蒸留水で洗浄する。
架橋番号2:
156.4gのNaSOを、345mlの架橋ゲルおよび115mlの蒸留水を含む溶液に加える。溶液を撹拌し続け、ゆっくりと50℃に加熱する。2時間後、4.6mlの45%NaOHおよび0.46gのNaBHを混合物に加え、その間32.2mlの45%NaOHおよび34.5mlのECHを6−8時間で溶液に注入する。反応は16時間続き、次いでゲルをpHが約5−6になるまで蒸留水(および0.6mlの酢酸)で洗浄する。ゲルをふるいにかけ、試験する。
実施例4
架橋番号1後のアリル化アガロースゲルマトリックスの追加的アリル化
アガロース溶液のアリル化工程中、2官能性AGE分子は、活性部位から不活性部位を遊離させたアガロースポリマー鎖に結合する。遊離部位をまず臭素化し、架橋番号1中それをNaOHでエポキシド化することにより、AGE分子は第2アガロースポリマー鎖に結合され得る。ここでの別の合成方法は、下記段階で実験的に説明されているとおり、第1架橋開始前にアリル化工程を複数回反復することによりさらにAGEをポリマー鎖に結合させることを目的とする。
臭素化:
35gの酢酸ナトリウムを、実施例1に従い製造された350mlのアリル化ゲルおよび700mlの蒸留水から成る溶液に加える。混合物を撹拌し続け、5分後160mlのBr2/HOを加える。反応を15分間続行させ、次いで0.5gの蟻酸ナトリウムを加える。ゲルの色が白く変わると、ゲルを蒸留水(3×1リットル)で洗浄する。
アリル化:
17.5gのNaSO、0.5gのNaBHおよび35mlの45%NaOHを、350mlの臭素化ゲルおよび175mlのHOから成る溶液に加える。混合物を40℃で撹拌し続け、1時間後20mlのAGEを加える。反応を16時間続行させた後、pHが約7になるまでゲルを蒸留水で洗浄する。
臭素化:
38.5gの酢酸ナトリウムを、385mlの2度アリル化されたゲルおよび770mlの蒸留水を含む撹拌溶液に加える。5分後、85mlのBr2/HOを加え、反応を15分間維持し、次いで0.5gの蟻酸ナトリウムを加えると、白いゲルが得られる。次いでゲルを蒸留水(3×1リットル)で洗浄する。
架橋番号1:
19.25gのNaSOを、上述の臭素化ゲル385mlおよび蒸留水385mlから成る撹拌混合物に加える。15分後、38.5mlの45%NaOHを、1.16gのNaBHと一緒に溶液に注入する(注入期間=30分)。反応を45分間続行させた後、温度を40℃に高める。溶液を16時間撹拌し続ける。次いでpHが約7になるまでゲルを蒸留水で洗浄する。
架橋番号2:
174.4gのNaSOを、385mlの架橋ゲルおよび128mlの蒸留水から成る撹拌溶液に加える。混合物をゆっくりと50℃に加熱し、2時間後5.13mlの45%NaOHおよび0.51gのNaBHを溶液に加えながら、36mlの45%NaOHおよび38.5mlのECHを反応器中にゆっくりと(6−8時間)注入する。反応は16時間続き、次いでpH=5−6になるまでゲルを蒸留水(および0.6ml酢酸)で洗浄する。
ゲルをふるいにかけ、試験する。
実施例5
第1架橋前の第2架橋
この合成では、ECH架橋は、架橋番号1前に行われる。実験手順は次の段階で説明されている。
架橋番号2:
実施例1記載の方法に従いアリル化ゲルが製造される。158.8gのNaSOを、このアリル化ゲル350mlおよび蒸留水117mlを含む溶液に加える。混合物を撹拌し、ゆっくりと50℃に加熱し、2時間後4.67mlの45%NaOHおよび0.67gのNaBHを溶液に加え、かつ32.7mlの45%NaOHおよび35mlのECHをゆっくりと(6−8時間)反応器中に注入する。この反応は16時間続けられ、次いでpHが約5−6になるまでゲルを蒸留水により洗浄する。
臭素化:
20.5gの酢酸ナトリウムを、205mlのECH−架橋ゲルおよび410mlの蒸留水から製造された溶液に加える。混合物を撹拌し、5分後、70mlのBr/HOを加え、15分の反応時間後、0.5gの蟻酸ナトリウムを加えると、ゲルは白色になる。次いでゲルを蒸留水(3×1リットル)で洗浄する。
架橋番号1:
10.25gのNaSOを、205mlの臭素化ゲルおよび205mlの蒸留水を含む溶液に加える。混合物を15分間撹拌し、次いで20.5mlの45%NaOHおよび0.61gのNaBHを加える。3時間の反応時間後、温度を40℃に高め、溶液をさらに16時間撹拌し続ける。次いで、pHが約5−6になるまでゲルを蒸留水で洗浄する。
ゲルをふるいにかけ、試験する。
実施例で製造されたゲルを、アリル濃度、圧力/フロー吸収力、Kav値(Kavは相対孔サイズについて容認された定義)およびそれに応じて粒子サイズ分布に関して分析した。
アリル濃度分析
標準方法に従い、0.1モルAgNOを含むメットラーDL40GPメモ・タイトレーターにおいてアリル濃度を分析した。
圧力/フロー吸収力分析
器械:XK−16/40カラム
HR10/30カラム
FPLCディレクター(商標)システムコントロールユニット(最大圧力/フロー出力:26−30バールまたは200−210ml/分):
1台のファルマシア・バイオテク・コントローラーLCC−501プラスおよびビルトイン接続器を備えた2台のファルマシア・バイオテク・ポンプP−6000およびPC−ユニット。
方法:ゲルマトリックスの圧力/フロー耐性試験は、ゲル平均ビーズサイズおよびカラムパッキングプロセスに左右される。製造されたゲルビーズは2種の平均サイズ間隔a)8−12μmおよびb)40−100μmを有する。
パッキング:
a)平均サイズ8−12μmのゲルビーズに対するカラムパッキング方法は、Kav試験(次項参照)の場合と同様にして一連の圧力/時間変動を伴いHR10/30カラムで行われる。
b)平均サイズ40−100μmのゲルビーズに対するカラムパッキング方法は、ベッドの高さが31±1cmのXK16/40カラムで行われた遊離沈降方法である。
圧力/フロー試験:
a)HR−10/30カラムでの試験は、5分ごとに流速0.1ml/分を増し、5分ごとに背圧変化を読み取ることにより行われる。
b)XK−16/40カラムでの試験は、5分ごとに流速1または5ml/分を増し、5分ごとに背圧変化を読み取ることにより行われる。
Kav値測定分析
器械:ファルマシアUVM−検出装置
ファルマシア・バイオテク・FPLCディレクター(商標)システムコントロール2チャンネル記録装置(プロッティングユニット)
方法:ゲルマトリックスのKav値の決定により、ゲルビーズの孔サイズが推定される。この決定は、最終産物(架橋ゲル)において下される。これは、ゲルマトリックスを含むカラムに注入された幾つかのタンパク質の遅延時間をグラフ解釈することにより行われる。
パッキング:
最終産物を、17バールの圧力下HR10/30カラムに充填する。使用するパッキング溶媒は、下記組成の溶液である。
1000ml当たり60gのHAc+1gのトゥイーン(商標)20
カラムを充填するため、30gのゲルを30gパッキング溶媒に分散させる。
ゲルマトリックスを、まず50分間6バール、次いで10分間17バールの圧力下で充填する。
タンパク質注入およびKav測定:
Kav値を4タンパク質について測定する。
・チログロブリン(MW=669000g/モル)
・フェリチン(MW=440000g/モル)
・BSA(MW=67000g/モル)
・リボヌクレアーゼ(MW=13700g/モル)
これらのタンパク質を、一度に1または2種ずつ(部分的重複が起こるのを防ぐため)カラムに注入する。
この処理中に使用される溶離液媒質は、pH=7.2で下記組成を有する緩衝溶液である。
・50ミリモルのジヒドロリン酸ナトリウム(NaHPO×2HO)
・150ミリモルの塩化ナトリウム(NaCl)
・0.02%アジ化ナトリウム(NaN
Kav値を測定するためには、空隙が占める容積(アガロースビーズ周囲の容積)を知ることが必要であり、これはブルーデキストランをカラムに注入することにより行われる。
得られたプロットを解釈し、所望のKav値を計算するPCによりデータを分析する。
粒子サイズ分布分析:
平均粒子サイズ分布(d50v)を、コールターマルチサイザーにより行った。
実施例1−5からの結果を、標準アガロースゲル(セファロース(商標)6FF)と比較し、下表に示す。
Figure 0004081143
Figure 0004081143
実施例6
この実施例では、この発明による方法を用いて、アガロース含有率8.1w/v%の高度剛性アガロースゲルビーズを製造した。実施例2による方法を反復したが、アガロース溶液製造時、100mlの水に対し8.1gのアガロースを使用した。ゲルをふるいにかけると、2種の異なる粒子サイズを有する2フラクションが得られた(実施例6aおよび6b)。さらに別の粒子サイズ、実施例6cも同様にして製造された。上述の方法と同様にしてゲルビーズを試験した。製造された粒子を、アガロース含有率8.1w/v%(ファルマシアからのスパロース(商標))の慣用的粒子と比較した。試験結果を表2aおよび2bに一緒に示す。
Figure 0004081143
Figure 0004081143
以下の実施例では、アガロース含有率が異なるゲルが製造された。
実施例7
実施例1による方法を反復したが、アガロース含有率は異なっていた。結果を下表3aおよび3bに示す。アガロース7%の実施例7aは実施例1の場合と同一である。
実施例8
この実施例では、異なるアガロース含有率を用い、実施例5による方法を使用した。結果を下表に示す。
Figure 0004081143
Figure 0004081143
結論:
この発明による新規架橋方法を用いると、ゲルのKav値は類似しているが、慣用的ゲル粒子または既知方法(実施例3)により製造された粒子の場合よりも3倍を越える割合で高いフローに耐え得るゲルが得られることは、表から明らかである。
この発明のゲルの優れた性質は図1−3においても説明され得る。図面の説明は次の通りである。
図1は、実施例1−5および同等化合物の背圧に対するフローのプロットである。
図2は、実施例6a、6b、6cおよび同等化合物の背圧に対するフローのプロットである。
図3aは、実施例7a、7b、8a、8b、8c、8dおよび同等化合物に関する最大フローに対するKav値のプロットである。
図3bは、図3aの場合と同じ実施例に関する背圧に対するフローのプロットである。
当業界で現在使用されている粒子の場合フローが適度の値を越えて増加すると背圧が急速に上昇することが図面から明らかであり、フローが増加し過ぎると、粒子が崩壊することを示している。しかしながら、この発明によるゲルに関する圧力/フロープロットはかなり低い勾配を示しており、流速が増しても背圧がゆっくりと上昇するだけであることを示している。
図3aでは、実施例7a、bおよび8a、b、c、dによるゲルマトリックスに関するKavが、最大フローに対してプロットされている。アガロースw/vパーセンテージとは無関係に、実施例7または実施例8に従い製造されたマトリックスの場合最大許容流速が300%の割合で増していることは図から容易にわかる。しかしながら、アガロースw/vパーセンテージは、Kav値で表されるゲルビーズ孔サイズに対して重要な影響力を有しており、ゲルビーズ中のアガロースの量が減少すると上記値は増加する。

Claims (21)

  1. 次の段階:
    a)多糖類の溶液または分散液を製造し、
    b)多糖類のヒドロキシル基と反応し得る1活性部位および活性部位に関する反応条件下では反応しないが後に活性化されて多糖類のヒドロキシル基と反応し得る1不活性部位を有する2官能性架橋剤を段階a)からの溶液または分散液に加え、
    c)多糖類のヒドロキシル基を架橋剤の活性部位と反応させ、
    d)多糖ゲルを形成させ、
    e)架橋剤の不活性部位を活性化し、
    f)段階e)からの活性化部位を多糖ゲルのヒドロキシル基と反応させることにより、ゲルの架橋が行われる
    ことを特徴とする、多孔性架橋多糖ゲルの製造方法。
  2. 得られた架橋多糖ゲルが、1回または数回慣用的方法によりさらに架橋されることを特徴とする、請求項1記載の方法。
  3. 段階d)からのゲルが段階e)およびf)が行われる前に慣用的方法により架橋されることを特徴とする、請求項1または2記載の方法。
  4. 段階d)からのゲルが段階e)およびf)を行うと同時に慣用的方法により架橋されることを特徴とする、請求項1または2記載の方法。
  5. 段階b)およびc)が、段階d)またはe)の後、1回または数回反復されることを特徴とする、請求項1または2記載の方法。
  6. 段階a)で製造される多糖類の溶液が水溶液であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
  7. 有機溶媒中、粒子に対して段階c)からの水溶液を乳化することによりゲルが形成されることを特徴とする、請求項6記載の方法。
  8. 2官能性架橋剤がアリルグリシジルエーテルまたはアリルブロミドであることを特徴とする、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
  9. 慣用的方法によるさらなる架橋が、エピハロヒドリン、ビス−エポキシド類、ジビニルスルホン、アリルグリシジルエーテルおよびジブロモプロパン−1−オールのいずれかからの1種または数種の化合物により達成されることを特徴とする、請求項2−5のいずれかに記載の方法。
  10. 多糖がアガロースであることを特徴とする、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
  11. 次の段階:
    a)多糖類の溶液または分散液を製造し、
    b)多糖類のヒドロキシル基と反応し得る1活性部位および活性部位に関する反応条件下では反応しないが後に活性化されて多糖類のヒドロキシル基と反応し得る1不活性部位を有する2官能性架橋剤を段階a)からの溶液または分散液に加え、
    c)多糖類のヒドロキシル基を架橋剤の活性部位と反応させ、
    d)多糖ゲルを形成させ、
    e)架橋剤の不活性部位を活性化し、
    f)段階e)からの活性化部位を多糖ゲルのヒドロキシル基と反応させることにより、ゲルの架橋が行われること
    により得られる多孔性架橋多糖ゲル。
  12. 得られた架橋多糖ゲルが、1回または数回慣用的方法によりさらに架橋されることを特徴とする、請求項11記載の多糖ゲル。
  13. 段階d)からのゲルが段階e)およびf)が行われる前に慣用的方法により架橋されることを特徴とする、請求項11または12記載の多糖ゲル。
  14. 段階d)からのゲルが段階e)およびf)を行うと同時に慣用的方法により架橋されることを特徴とする、請求項11または12記載の多糖ゲル。
  15. 段階b)およびc)が、段階d)またはe)の後、1回または数回反復されることを特徴とする、請求項11または12記載の多糖ゲル。
  16. 段階a)で製造される多糖類の溶液が水溶液であることを特徴とする、請求項1〜15のいずれかに記載の多糖ゲル。
  17. 有機溶媒中、粒子に対して段階c)からの水溶液を乳化することによりゲルが形成されることを特徴とする、請求項16記載の多糖ゲル。
  18. 2官能性架橋剤がアリルグリシジルエーテルまたはアリルハライドであることを特徴とする、請求項1〜17のいずれかに記載の多糖ゲル。
  19. 得られた架橋多糖ゲルが、エピハロヒドリン、ビス−エポキシド類、ジビニルスルホン、アリルグリシジルエーテルおよびジブロモプロパン−1−オールのいずれかからの1種または数種の化合物によりさらに架橋されることを特徴とする、請求項12記載の多糖ゲル。
  20. 多糖がアガロースであることを特徴とする、請求項1〜19のいずれかに記載の多糖ゲル。
  21. ゲル濾過媒質として、アフィニティー・クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、キレートクロマトグラフィー、共有結合クロマトグラフィーにおける、請求項1〜20のいずれかに記載の多孔性架橋多糖ゲルの使用
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