JP4057091B2 - 細菌株、及び該細菌株を含む薬学的組成物、並びに胆汁酸に関しての変化した代謝に関連するか、引き起こされる疾患を治療するための、上記組成物の使用 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、細菌株、及び一以上の該細菌株を含む薬学的組成物、並びに胆汁酸に関しての変化した代謝に関連するか、引き起こされる疾患を治療するための、上記組成物の使用に関する。
【０００２】
肝性の胆汁は、血漿に似た電解質組成物を有する等張性の色素液である。胆汁の主要な組成物には、水（８２％）、胆汁酸（１２％）、レシチン及びその他のリン脂質（４％）、及び非エステル化されたコレステロ−ル（０.７％）が含まれる。その他の成分には共役ビリルビン（bilirubin）、タンパク質、電解質、粘液、及び肝臓での薬剤の変換最終産物、ホルモンなどが含まれる。基底条件における、肝臓での胆汁の生産は、約５００-１０００ml／日である。
【０００３】
一次胆汁酸である、コ−ル酸（CA）、及びケノデオキシコ−ル酸（CDCA）は、肝臓においてコレステロ−ルより合成され、グリシン、またはタウリンと共役し、胆汁に分泌される。二次胆汁酸（デオキシコ−ル酸（DCA）、及びリトコ−ル酸を含む）は、一次胆汁酸の細菌性代謝物として、大腸内で形成される。三次胆汁酸と呼ばれるその他の胆汁酸（例：ウルソデオキシコ−ル酸（UDCA））は、ステロ−ル環上の−OH基が、腸管内菌叢により酵素的にエピマ−化された後に、腸内で形成される。
【０００４】
正常な胆汁においては、グリシン共役物とタウリン共役物との比率は、約２：１であり、一方胆汁鬱帯（cholestasis）患者では、胆汁酸の硫酸共役物、及びグルクロニド共役物の濃度が上昇しているのがしばしば見られる。
【０００５】
腸管内菌叢は胆汁酸を異なる代謝産物へ変換する。これら生体変換物には、胆汁酸とタウリン、またはグリシンとの間の結合の加水分解による、非共役または遊離胆汁酸、並びにタウリン、及びグリシンの形成がある。よって、非共役胆汁酸は、C3、C7、及びC12における水酸基の酸化、並びに7α、及び７βにおけるデヒドロキシル化を受けることができるようになる。この後者の変換により、二次胆汁酸DCA、及びLAが形成される。非共役であるが変換されていない二次胆汁酸は、腸管腔より再吸収され門脈の血流に入り、次いで肝細胞により取り込まれてグリシン、またはタウリンと共役して胆汁に再分泌される（腸肝循環）。
【０００６】
通常は、胆汁酸のプ−ルは、日に５から１０回循環している。腸内でのプ−ルの吸収は、約９５％の効率であり、便での損失は日に０.３から０.６mgである。便での損失は毎日の等量合成により補われる。
【０００７】
そのため、胆汁中に存在する胆汁のプ−ルの組成は、肝臓と腸管内菌叢の酵素との間での複雑な相互作用の結果である。
【０００８】
脱共役活性は、多くの細菌、好気性菌及び嫌気性菌が有 する特徴であるが、偏性嫌気性菌、すなわちバクテロイド、真正細菌、クロストリジウム（Clostridia）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacteria）などが特に共通して有する特徴である。このような細菌の大部分は、グリシン共役物とタウリン共役物の両方に対して活性を有するが、中には、結合しているアミノ酸、及びステロイド核に結合した水酸基の数に応じて、ある程度の特異性を有するものもある。細菌性加水分解酵素の作用の後に得られた遊離型胆汁酸は、水酸化ステロイドヒドロゲナ−ゼにより、C3、C7、及びC12に存在する水酸基の酸化を受ける。
【０００９】
胆汁酸の代謝異常における興味は、胆汁酸及び／またはその代謝物が、胆汁消化不良、胆石症、急性及び慢性肝障害、大腸の炎症性疾患等の、肝−胆汁疾患、及び胃腸病学的疾患に関わるという仮説に由来する。
【００１０】
文献では、胆汁酸の疎水性が、界面活性と相関すると頻繁に書かれているが、二次胆汁酸は一次胆汁酸よりも更に疎水性であって、実際に、デオキシコ−ル酸（DCA）はコ−ル酸（CA）よりも界面活性がある。故に、DCAの胆汁中における濃度が上昇すると、
(a)飽和指標の増加にともなった、コレステロ−ルの分泌の上昇、
(b)肝臓細胞における細胞障害性効果、
が起きる可能性がある。
【００１１】
このため、胆汁酸のパタ−ンの定性的修飾が、特に上記した病理の決定的因子である。
【００１２】
故に、７α−ヒドロキシラ−ゼ活性を、脱共役とともに低減することにより、胆汁酸の代謝障害に関わる疾患を治療、及び／または予防するために使用することが可能な、効果的な細菌株または組成物の必要性が残る。
【００１３】
上記のようにして定性的に胆汁酸のパタ−ンを修飾することが可能な細菌株はいまだ見つかっていない。
【００１４】
すなわち、本発明の目的は、胆汁酸の代謝障害によるか、またはそれに関わる疾患を治療、及び／または予防するのに有益な、新規の細菌株、特にグラム陽性菌を提供することにある。
【００１５】
本発明の別の目的は、胆汁酸の代謝障害によるか、またはそれに関わる疾患を治療、及び／または予防するのに有益な、一つ以上の上記の細菌株を有する、薬学的組成物を提供することにある。
【００１６】
以下の詳細な記載より明らかなように、上記の、及びその他の目的は、７α-デヒドロキシラーゼ活性が低減されたか全くなく、さらに胆汁酸脱共役能が低減されているか全くない細菌株を発見した本発明者により達成された。このことは、先行技術とは対照的である。すなわち、本発明は上記した株を提供して、胆汁酸の代謝障害に関わるか、引き起こされる疾患を予防するように、胆汁酸の代謝を修飾する。
【００１７】
よって、第一の態様において本発明は、５０％未満、好ましくは２５％未満の７α-デヒドロキシラーゼ活性を有し、また５０％未満、好ましくは２５％未満の胆汁酸脱共役活性を有する新規の細菌株を提供する。
【００１８】
本発明における上記の株の必須的な特徴は、請求項１に定義されていて、その特異的株は、従属した請求項２から１１に定義されている。
【００１９】
本発明は更に、胆汁酸の代謝障害に関わるか、引き起こされる疾患を治療、及び／または予防するのに有益な、薬学的組成物であって、該組成物が、本発明の少なくとも一つの細菌株を具備しているものを提供する。
【００２０】
本発明の組成物の必須的特徴は、請求項１２に定義されていて、該組成物の特異的態様は、従属した請求項１３から２５に定義されている。
【００２１】
さらに本発明は、上記薬学的組成物を調製するための、本発明の少なくとも一つの細菌株の使用を提供する。該使用の必須的特徴は、請求項２６に定義されていて、特異的態様は、従属する請求項２７から３６に定義されている。
【００２２】
本発明の背景においては、胆汁酸の代謝障害に関連するか、引き起こされる疾患には、以下のような肝臓病、及び消化器の疾患が含まれる：ブラインドル−プ（blind loop）症候群、胆石、肝硬変、慢性肝障害、急性肝障害、嚢胞性線維症、肝臓内胆汁鬱帯、腸内炎症性疾患、結腸疾患（colonpathies）、吸収不良。本発明の薬学的組成物はまた、妊娠中または産後の女性、及び体重減少プログラム、またはダイエットを受けている患者における胆汁の胆石の発症を予防するのに使用することも可能である。
【００２３】
上記細菌株の７α-デヒドロキシラーゼ活性は、５０％未満、好ましくは２５％未満でなくてはならない。この７α-デヒドロキシラーゼ活性値は、以下の例１に記載の方法で測定されるものである。詳しくは、問題となっている１０7株細胞を、２mg／mlのグリココ−ル酸（GCA）、または２mg／mlのタウロコ−ル酸（TCA）を付加した特別の培地、１５ml中で、３７℃で４８時間インキュベーションし、次いで７α-デヒドロキシラーゼ産物の量を測定する。７α-デヒドロキシラーゼ活性の割合の値を以下の式に基づいて計算する。
【００２４】
【式１】
上記の式に基づき、投与する細菌株は更に、共役した胆汁酸の脱共役活性が５０％未満、好ましくは２５％未満であるべきである。胆汁酸の脱共役能は、７α-デヒドロキシラーゼ活性を測定するためのインキュベーション法を使用し、次いで生成した脱共役活性を測定することにより決定できる。脱共役活性は、以下の式に基づいて計算される。
【００２５】
【式２】
本願発明の細菌株は、経腸的に投与することが可能である。好ましくは本発明の細菌株は、経口的に投与される。
【００２６】
単一の細菌株を投与することも可能であるが、本発明のようにして二つ以上の細菌株を投与することも可能である。
【００２７】
投与する細菌の正確な投薬量は、患者の状態と大きさ、及び治療の対象となる疾患により、また投与する株の正体により変化するが、g当たり１０3から１０13の細菌細胞、好ましくは１０8から１０12を投与すると良い結果が得られた。本発明の良い効果を得るには、患者の腸内に、上記株の十分な量がポピュレ−トするのに十分な量及び濃度で、該株を投与することが好ましい。よって該株は、g当たり１０3から１０13、好ましくはg当たり１０8から１０12の株細胞を含む組成物で投与されることが好ましく、また患者が一日当たり１００mgから１００g、好ましくは一日当たり１gから２０gの該株を受けるような措置で、１から３６５日間、治療の場合には好ましくは３から６０日間、または予防の場合には周期的サイクルで投与することが好ましい。該株は、経腸的投与に適する如何なる形態、例えばカプセル、錠剤、または経口投与用の液体若しくは経腸的投与用の液体でも投与することが可能である。
【００２８】
典型的には本発明の細菌株の投与は、胆汁酸の代謝障害の診断の後で処方することができる。しかしながら、胆汁の胆石の予防の場合には、該株は、患者が危険なポピュレ−ション、例えば妊娠中または体重減少プログラム若しくはダイエットの最中であるものとされる場合に投与される。更に、本発明の細菌株は胆嚢を除去した後に投与してもよい。
【００２９】
好ましい態様においては、治療する疾患が肝硬変の場合、ラクツロ−スを一緒に投与する。適格には、ラクツロ−スは一日当たり１００mgから１００g、好ましくは一日当たり１gから２０gで投与する。
【００３０】
別の態様においては、胆汁酸に基づく調製物、例えばウルソデオキシコ−ル酸や、タウロウルソデオキシコ−ル酸を一緒に投与することが提供される。適格には、ウルソデオキシコ−ル酸またはタウロデオキシコ−ル酸は、一日当たり１０から３０００mg、好ましくは一日当たり５０から８００mgで投与される。
【００３１】
好ましくは、本発明の薬学的組成物にはg当たり１０3から１０13細胞、好ましくはg当たり１０8から１０12細胞の濃度で該細菌株が入っている。薬学的に許容される担体は、経腸的投与に適し、該細菌株に適合した如何なるものであってもよく、これにはデキストロ−ス、並びにその他の付加的物質（例：デンプン、ゲラチン、ビタミン、抗酸化剤、染料、または味覚改善物質）と一緒の炭酸カルシウムが含まれる。
【００３２】
オプションの成分として本発明の組成物は、使用する細菌と適合し、また存在する活性成分の活性を強化することが可能な薬剤を含むことも可能である。本願では以下のものについて言及する：抗コリン作用薬、抗ヒスタミン、アドレナリン作用性、抗潰瘍性、抗酸性、抗下痢（antidiarroic）、及び抗炎症性の薬剤、鎮静性、解熱性、利胆性、抗リュ−マチ性の薬剤、鎮痛剤、利尿性、防腐性の薬剤、抗脂血薬、肝保護的薬剤、及び消化器官の運動性に活性を有する薬剤（例えばトリメブチン）。
【００３３】
肝硬変を治療する際には、上記薬学的組成物は更にラクツロ−スを具備することが好ましい。適格には、該組成物は一日当たり、１００mgから１００g、好ましくは１から２０gのラクツロ−スを含む。胆汁性の肝硬変や、慢性の肝炎を治療する際には、該薬学的組成物は、胆汁酸に基づく調製物、例えばウルソデオキシコ−ル酸やタウロウルソデオキシコ−ル酸を具備することが好ましい。適格には、該組成物は上記胆汁酸調製物を一日当たり１０から３０００g、好ましくは一日当たり５０から８００mgのウルソデオキシコ−ル酸やタウロウルソデオキシコ−ル酸を含む。
【００３４】
本発明のその他の特徴は、本発明を例示するために記載した、以下の規範的な態様で明かとなるであろう。
【００３５】
例
例１
以下に示した種の株を試験した：
ストレプトコッカス・サ−モフィラス；
ストレプトコッカス・ファエキウム；
ラクトバシラス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）；
ブルガリア菌；
ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）；
ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）。それぞれの株（１０7CFU）を特異的な栄養性ブロス（１５ml）で培養した（CFUはコロニ−形成単位を意味する）。
【００３６】
異なる種に対して使用した培養液のリスト
ビフィドバクテリウム・インファンティス：MRS+０.５％グルコ−ス（滅菌後、２０％の無菌溶液を希釈して加えた）；
ストレプトコッカス・サ−モフィラス：M１７；
その他の株：MRS。
【００３７】
MRSブロスの組成（g／リットル）：
ユニバ−サル・ペプトン 10.0g
肉抽出物 5.0g
酵母抽出物 5.0g
D(+)−グルコ−ス 20.0g
リン酸水素カリウム 2.0g
Tween80 1.0g
二塩基酸のシュウ酸アンモニウム 2.0g
酢酸ナトリウム 5.0g
硫酸マグネシウム 0.1g
硫酸マンガン（manganous sulfate）0.05g
調製：蒸留水で、50g／lに溶かし、１２１℃で１５分間滅菌、25℃でpH 6.5±0.1。
【００３８】
M17ブロス（メルク社）の組成（g／リットル）：
大豆粉ペプトン 5.0g
肉ペプトン 2.5g
カゼインペプトン 2.5g
酵母抽出物 5.0g
肉抽出物 5.0g
D(+)−ラクト−ス 5.0g
アスコルビン酸 0.5g
βグリセロリン酸ナトリウム 0.25g
調製：蒸留水で、42.5g／ｌに溶かし、１２１℃で１５分間滅菌、２５℃でpH ７.2±0.1。
【００３９】
ビフィドバクテリウム・インファンティスは、嫌気性細菌であることが知られているので、嫌気的条件下で培養した。３７℃で２４時間インキュベーション後、３０mg相当の胆汁酸をそれぞれのチュ−ブへ加え、最終濃度を２mg／mlにした。以下の胆汁酸を使用した：グリココ−ル酸（GCA）、タウロコ−ル酸（TCA）（それぞれシグマケミカル社より入手）。それぞれの胆汁酸を一連の細菌培養物へ別個で加えた。
【００４０】
４８時間インキュベーション後、３mlのイソプロパノ−ルを２分間で加えた。次いで、４００rpmで１５分間遠心して、上清を回収した（５ml）。分析するまでこの上清を−３０℃で保存した。共役して存在していた胆汁酸塩の割合は、HPLC(高速液体クロマトグラフィ−)で決定した。HPLCの条件は以下のとおりであった：ギルソン社製装置；ダイオ−ドアレイモッド１０００（検出器）；スフェリソ−ブ５μmODS 2 C18（逆相カラム）；水／アセトニトリル／水で調製したメタノ−ル／リン酸緩衝液（20mM、pH2.5）（容積比は150：60：20：20）の移動相；0.85ml／分の流速；205nmの波長；100μlの試料；窒素下での乾燥。ついで内部標準として７α-OH-12α-OH-ジヒドロキシ−５８コ−ル酸（cholanic acid）(カルボケム社、U.S.A.)を2mg／mlで含む１００μlの移動相で抽出した。
【００４１】
細菌培養物とインキュベーションした胆汁酸の回収率は、内部標準に対する、検出された胆汁酸（GCA、またはTCA）の領域の割合により計算した。４８時間のインキュベーション後に細菌培養物中に見られる共役済み胆汁酸の量が５０％未満であるときには、シクロヘキサン／イソプロパノ−ル／酢酸（容積比30：10：1）の移動相を使用して、シリカ６０ゲル板上で薄膜クロマトグラフィ−（TLC）をかけて、CA及びDCAの割合を決定した。それぞれの板上に、試料のアルコ−ル抽出物20μl、CA及びDCAの溶液20μl、CAを20μl、DCAを20μlをスポットした。室温で展開した後に、この板を硫酸で処理して色のついたスポットが現れるまで、１４５℃で加熱した。
【００４２】
脱共役実験の結果（表１）は、GCAで試験した16の株のうち５株が、培養液に添加した胆汁酸を完全に脱共役したことを示しているが、このことは以前に文献で報告されている通りであり、また研究者の間には良く知られていたことである。驚くことに、１０株はGCAを脱共役したが、完全にではなくて9から90％の範囲であった（表１）。好気性細菌と嫌気性細菌との間には差異は見られなかった。二つの株、ストレプトコッカス・サ−モフィラスYS 52、及びビフィドバクテリウム・インファンティスBi 6 は、GCAに対する脱共役活性が全くない。株 ＹＳ52は、これに加えて胆汁酸−タウリン結合を攻撃しない。
【００４３】
１６株のうちただ一つ、ビフィドバクテリウム・インファンティスBi 6のみがTCAを完全に脱共役した。
【００４４】
デヒドロキシル化実験の結果（表II）は、１６の株中でただ一つ（Bi 4）が完全にGCAをデヒロキシル化したことを示している。６つの株（YS 52; SF2; SF4; LA3; LA10; Bi6）は、全くデヒドロキシル化しなかった。その他の株はGCAをデヒドロキシル化したが、完全にではなく、9から90％の範囲であった。TCAに関しては、７つの株（YS52; SF3; LA3; LA10; LB1; LB7; LB77）が全くデヒドロキシル化しなかった。ただ一つBi 6のみがTCAを完全にデヒドロキシル化し、その他の株はTCAを異なった割合でデヒドロキシル化した。
【００４５】
【表１】
【表２】
以上の株は、パスツ−ル研究所CNCM(Colecution Nationale de Cultures de Microorganismes)に、以下の受入れ番号の下に寄託された：
ストレプトコッカス・サ−モフィラスYS46: I-1668
ストレプトコッカス・サ−モフィラスYS48: I-1669
ストレプトコッカス・サ−モフィラスYS52: I-1670
ストレプトコッカス・ファエキウムSF3: I-1671
ブルガリア菌LB1: I-1664
ブルガリア菌LB3: I-1665
ブルガリア菌LB7: I-1666
ブルガリア菌LB77: I-1667
以下の株は、以下のIDで、Centro Ricerche Sitia-Yamo S.p.A. -Strada per Merlino, 3-ZELO BUON PERSICO (MILAN)-ITALYで保管されていて、またそこより入手可能である：
ストレプトコッカス・ファエキウムSF２:SF2
ストレプトコッカス・ファエキウムSF4: SF4
ラクトバシラス・アシドフィラスLA3:LA3
ラクトバシラス・アシドフィラスLA10:LA10
ビフィドバクテリウム・インファンティスBi2:Bi2
ビフィドバクテリウム・インファンティスBi3:Bi3
ビフィドバクテリウム・インファンティスBi4:Bi4
ビフィドバクテリウム・インファンティスBi6:Bi6
以上の結果は、我々が試験した多くの株は胆汁酸を脱共役する能力が低いこと、また全く脱共役しない株があることも論証している。この観察は、乳酸菌が胆汁性の塩を脱共役することが知られていなかったという点において驚くべきことである。更に、上記株の酵素は、側鎖に結合した特異的胆汁酸に対して選択的であることが明らかである。本研究において、最もはっきりとした例は、ビフィドバクテリウム・インファンティスBi 6の場合が多い。この株は、グリシンに共役した胆汁酸を脱共役することができないが、タウリンに共役した胆汁酸は完全に脱共役することが可能である。他の幾つかの株（LB7, LB77, SF3）はTCAを脱共役することができないが、GCAはある程度脱共役することが可能である。
【００４６】
まとめると、脱共役及びデヒドロキシル化の能力が弱いか、またはまったくない株が発見された。
【００４７】
例２
グラム当たり１Ｘ１０11のストレプトコッカス・サ−モフィラスYS52の細胞を含む乳酸桿菌調製物を毎日、２８日間にわたって全量６gで処置した３人の健常なボランティアに関して、処置後の胆汁酸の内容量を調べた。処置を始める前、及び１２時間の断食後に、検体をインキュベーションし、セルレチド(ceruletide)で刺激した後に胆嚢の胆汁を回収し、−８０℃で凍結した。胆嚢の収縮は、超音波検査で調べ、十二指腸の第二部分における管の位置は、Rx（蛍光透視法）で調べた。
【００４８】
処置の４週間後、検体を二回目のインキュベーションにかけて、胆汁を回収した。試料の胆汁を次いで、上記した様にして幾つかの胆汁酸の内容量について調べた。結果は、表３に示してある。
【００４９】
【表３】
本実験は、例１で示された内容の確認であり、本発明の対象である細菌を投与したときには、一つの一次胆汁酸の脱共役能が低いことを示すものである。得られた結果は、一次胆汁酸が腸肝循環においてより長く維持されることを示している。
【００５０】
胆汁酸の特徴は表IIIの備考に記載されている。よってこれらの結果によれば、選択した細菌株の投与は界面活性の性質を低減することができ、またそれゆえに胆汁酸の細胞溶解活性を低減させることができる。
【００５１】
例３
慢性の肝炎患者１４人を、ストレプトコッカス・サ−モフィラスYS 46、及びYS48(２株)、ブルガリア菌LB1、LB７、及びLB77（３株）を含む細菌性調製物で処置した。それぞれの株は他のものと混合する前に、１５０Ｘ１０9の濃度にして、それぞれの株の重量比が同じになるような混合物を調製した。一日当たり６gの該混合物を、28日間にわたって投与した。処置前及び処置後の肝臓酵素を測定し、その結果を表IVに示した。
【００５２】
【表４】
本発明は、細菌株、及び一以上の該細菌株を含む薬学的組成物、並びに胆汁酸に関しての変化した代謝に関連するか、引き起こされる疾患を治療するための、上記組成物の使用に関する。
【０００２】
肝性の胆汁は、血漿に似た電解質組成物を有する等張性の色素液である。胆汁の主要な組成物には、水（８２％）、胆汁酸（１２％）、レシチン及びその他のリン脂質（４％）、及び非エステル化されたコレステロ−ル（０.７％）が含まれる。その他の成分には共役ビリルビン（bilirubin）、タンパク質、電解質、粘液、及び肝臓での薬剤の変換最終産物、ホルモンなどが含まれる。基底条件における、肝臓での胆汁の生産は、約５００-１０００ml／日である。
【０００３】
一次胆汁酸である、コ−ル酸（CA）、及びケノデオキシコ−ル酸（CDCA）は、肝臓においてコレステロ−ルより合成され、グリシン、またはタウリンと共役し、胆汁に分泌される。二次胆汁酸（デオキシコ−ル酸（DCA）、及びリトコ−ル酸を含む）は、一次胆汁酸の細菌性代謝物として、大腸内で形成される。三次胆汁酸と呼ばれるその他の胆汁酸（例：ウルソデオキシコ−ル酸（UDCA））は、ステロ−ル環上の−OH基が、腸管内菌叢により酵素的にエピマ−化された後に、腸内で形成される。
【０００４】
正常な胆汁においては、グリシン共役物とタウリン共役物との比率は、約２：１であり、一方胆汁鬱帯（cholestasis）患者では、胆汁酸の硫酸共役物、及びグルクロニド共役物の濃度が上昇しているのがしばしば見られる。
【０００５】
腸管内菌叢は胆汁酸を異なる代謝産物へ変換する。これら生体変換物には、胆汁酸とタウリン、またはグリシンとの間の結合の加水分解による、非共役または遊離胆汁酸、並びにタウリン、及びグリシンの形成がある。よって、非共役胆汁酸は、C3、C7、及びC12における水酸基の酸化、並びに7α、及び７βにおけるデヒドロキシル化を受けることができるようになる。この後者の変換により、二次胆汁酸DCA、及びLAが形成される。非共役であるが変換されていない二次胆汁酸は、腸管腔より再吸収され門脈の血流に入り、次いで肝細胞により取り込まれてグリシン、またはタウリンと共役して胆汁に再分泌される（腸肝循環）。
【０００６】
通常は、胆汁酸のプ−ルは、日に５から１０回循環している。腸内でのプ−ルの吸収は、約９５％の効率であり、便での損失は日に０.３から０.６mgである。便での損失は毎日の等量合成により補われる。
【０００７】
そのため、胆汁中に存在する胆汁のプ−ルの組成は、肝臓と腸管内菌叢の酵素との間での複雑な相互作用の結果である。
【０００８】
脱共役活性は、多くの細菌、好気性菌及び嫌気性菌が有 する特徴であるが、偏性嫌気性菌、すなわちバクテロイド、真正細菌、クロストリジウム（Clostridia）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacteria）などが特に共通して有する特徴である。このような細菌の大部分は、グリシン共役物とタウリン共役物の両方に対して活性を有するが、中には、結合しているアミノ酸、及びステロイド核に結合した水酸基の数に応じて、ある程度の特異性を有するものもある。細菌性加水分解酵素の作用の後に得られた遊離型胆汁酸は、水酸化ステロイドヒドロゲナ−ゼにより、C3、C7、及びC12に存在する水酸基の酸化を受ける。
【０００９】
胆汁酸の代謝異常における興味は、胆汁酸及び／またはその代謝物が、胆汁消化不良、胆石症、急性及び慢性肝障害、大腸の炎症性疾患等の、肝−胆汁疾患、及び胃腸病学的疾患に関わるという仮説に由来する。
【００１０】
文献では、胆汁酸の疎水性が、界面活性と相関すると頻繁に書かれているが、二次胆汁酸は一次胆汁酸よりも更に疎水性であって、実際に、デオキシコ−ル酸（DCA）はコ−ル酸（CA）よりも界面活性がある。故に、DCAの胆汁中における濃度が上昇すると、
(a)飽和指標の増加にともなった、コレステロ−ルの分泌の上昇、
(b)肝臓細胞における細胞障害性効果、
が起きる可能性がある。
【００１１】
このため、胆汁酸のパタ−ンの定性的修飾が、特に上記した病理の決定的因子である。
【００１２】
故に、７α−ヒドロキシラ−ゼ活性を、脱共役とともに低減することにより、胆汁酸の代謝障害に関わる疾患を治療、及び／または予防するために使用することが可能な、効果的な細菌株または組成物の必要性が残る。
【００１３】
上記のようにして定性的に胆汁酸のパタ−ンを修飾することが可能な細菌株はいまだ見つかっていない。
【００１４】
すなわち、本発明の目的は、胆汁酸の代謝障害によるか、またはそれに関わる疾患を治療、及び／または予防するのに有益な、新規の細菌株、特にグラム陽性菌を提供することにある。
【００１５】
本発明の別の目的は、胆汁酸の代謝障害によるか、またはそれに関わる疾患を治療、及び／または予防するのに有益な、一つ以上の上記の細菌株を有する、薬学的組成物を提供することにある。
【００１６】
以下の詳細な記載より明らかなように、上記の、及びその他の目的は、７α-デヒドロキシラーゼ活性が低減されたか全くなく、さらに胆汁酸脱共役能が低減されているか全くない細菌株を発見した本発明者により達成された。このことは、先行技術とは対照的である。すなわち、本発明は上記した株を提供して、胆汁酸の代謝障害に関わるか、引き起こされる疾患を予防するように、胆汁酸の代謝を修飾する。
【００１７】
よって、第一の態様において本発明は、５０％未満、好ましくは２５％未満の７α-デヒドロキシラーゼ活性を有し、また５０％未満、好ましくは２５％未満の胆汁酸脱共役活性を有する新規の細菌株を提供する。
【００１８】
本発明における上記の株の必須的な特徴は、請求項１に定義されていて、その特異的株は、従属した請求項２から１１に定義されている。
【００１９】
本発明は更に、胆汁酸の代謝障害に関わるか、引き起こされる疾患を治療、及び／または予防するのに有益な、薬学的組成物であって、該組成物が、本発明の少なくとも一つの細菌株を具備しているものを提供する。
【００２０】
本発明の組成物の必須的特徴は、請求項１２に定義されていて、該組成物の特異的態様は、従属した請求項１３から２５に定義されている。
【００２１】
さらに本発明は、上記薬学的組成物を調製するための、本発明の少なくとも一つの細菌株の使用を提供する。該使用の必須的特徴は、請求項２６に定義されていて、特異的態様は、従属する請求項２７から３６に定義されている。
【００２２】
本発明の背景においては、胆汁酸の代謝障害に関連するか、引き起こされる疾患には、以下のような肝臓病、及び消化器の疾患が含まれる：ブラインドル−プ（blind loop）症候群、胆石、肝硬変、慢性肝障害、急性肝障害、嚢胞性線維症、肝臓内胆汁鬱帯、腸内炎症性疾患、結腸疾患（colonpathies）、吸収不良。本発明の薬学的組成物はまた、妊娠中または産後の女性、及び体重減少プログラム、またはダイエットを受けている患者における胆汁の胆石の発症を予防するのに使用することも可能である。
【００２３】
上記細菌株の７α-デヒドロキシラーゼ活性は、５０％未満、好ましくは２５％未満でなくてはならない。この７α-デヒドロキシラーゼ活性値は、以下の例１に記載の方法で測定されるものである。詳しくは、問題となっている１０7株細胞を、２mg／mlのグリココ−ル酸（GCA）、または２mg／mlのタウロコ−ル酸（TCA）を付加した特別の培地、１５ml中で、３７℃で４８時間インキュベーションし、次いで７α-デヒドロキシラーゼ産物の量を測定する。７α-デヒドロキシラーゼ活性の割合の値を以下の式に基づいて計算する。
【００２４】
【式１】
【００２５】
【式２】
【００２６】
単一の細菌株を投与することも可能であるが、本発明のようにして二つ以上の細菌株を投与することも可能である。
【００２７】
投与する細菌の正確な投薬量は、患者の状態と大きさ、及び治療の対象となる疾患により、また投与する株の正体により変化するが、g当たり１０3から１０13の細菌細胞、好ましくは１０8から１０12を投与すると良い結果が得られた。本発明の良い効果を得るには、患者の腸内に、上記株の十分な量がポピュレ−トするのに十分な量及び濃度で、該株を投与することが好ましい。よって該株は、g当たり１０3から１０13、好ましくはg当たり１０8から１０12の株細胞を含む組成物で投与されることが好ましく、また患者が一日当たり１００mgから１００g、好ましくは一日当たり１gから２０gの該株を受けるような措置で、１から３６５日間、治療の場合には好ましくは３から６０日間、または予防の場合には周期的サイクルで投与することが好ましい。該株は、経腸的投与に適する如何なる形態、例えばカプセル、錠剤、または経口投与用の液体若しくは経腸的投与用の液体でも投与することが可能である。
【００２８】
典型的には本発明の細菌株の投与は、胆汁酸の代謝障害の診断の後で処方することができる。しかしながら、胆汁の胆石の予防の場合には、該株は、患者が危険なポピュレ−ション、例えば妊娠中または体重減少プログラム若しくはダイエットの最中であるものとされる場合に投与される。更に、本発明の細菌株は胆嚢を除去した後に投与してもよい。
【００２９】
好ましい態様においては、治療する疾患が肝硬変の場合、ラクツロ−スを一緒に投与する。適格には、ラクツロ−スは一日当たり１００mgから１００g、好ましくは一日当たり１gから２０gで投与する。
【００３０】
別の態様においては、胆汁酸に基づく調製物、例えばウルソデオキシコ−ル酸や、タウロウルソデオキシコ−ル酸を一緒に投与することが提供される。適格には、ウルソデオキシコ−ル酸またはタウロデオキシコ−ル酸は、一日当たり１０から３０００mg、好ましくは一日当たり５０から８００mgで投与される。
【００３１】
好ましくは、本発明の薬学的組成物にはg当たり１０3から１０13細胞、好ましくはg当たり１０8から１０12細胞の濃度で該細菌株が入っている。薬学的に許容される担体は、経腸的投与に適し、該細菌株に適合した如何なるものであってもよく、これにはデキストロ−ス、並びにその他の付加的物質（例：デンプン、ゲラチン、ビタミン、抗酸化剤、染料、または味覚改善物質）と一緒の炭酸カルシウムが含まれる。
【００３２】
オプションの成分として本発明の組成物は、使用する細菌と適合し、また存在する活性成分の活性を強化することが可能な薬剤を含むことも可能である。本願では以下のものについて言及する：抗コリン作用薬、抗ヒスタミン、アドレナリン作用性、抗潰瘍性、抗酸性、抗下痢（antidiarroic）、及び抗炎症性の薬剤、鎮静性、解熱性、利胆性、抗リュ−マチ性の薬剤、鎮痛剤、利尿性、防腐性の薬剤、抗脂血薬、肝保護的薬剤、及び消化器官の運動性に活性を有する薬剤（例えばトリメブチン）。
【００３３】
肝硬変を治療する際には、上記薬学的組成物は更にラクツロ−スを具備することが好ましい。適格には、該組成物は一日当たり、１００mgから１００g、好ましくは１から２０gのラクツロ−スを含む。胆汁性の肝硬変や、慢性の肝炎を治療する際には、該薬学的組成物は、胆汁酸に基づく調製物、例えばウルソデオキシコ−ル酸やタウロウルソデオキシコ−ル酸を具備することが好ましい。適格には、該組成物は上記胆汁酸調製物を一日当たり１０から３０００g、好ましくは一日当たり５０から８００mgのウルソデオキシコ−ル酸やタウロウルソデオキシコ−ル酸を含む。
【００３４】
本発明のその他の特徴は、本発明を例示するために記載した、以下の規範的な態様で明かとなるであろう。
【００３５】
例
例１
以下に示した種の株を試験した：
ストレプトコッカス・サ−モフィラス；
ストレプトコッカス・ファエキウム；
ラクトバシラス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）；
ブルガリア菌；
ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）；
ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）。それぞれの株（１０7CFU）を特異的な栄養性ブロス（１５ml）で培養した（CFUはコロニ−形成単位を意味する）。
【００３６】
異なる種に対して使用した培養液のリスト
ビフィドバクテリウム・インファンティス：MRS+０.５％グルコ−ス（滅菌後、２０％の無菌溶液を希釈して加えた）；
ストレプトコッカス・サ−モフィラス：M１７；
その他の株：MRS。
【００３７】
MRSブロスの組成（g／リットル）：
ユニバ−サル・ペプトン 10.0g
肉抽出物 5.0g
酵母抽出物 5.0g
D(+)−グルコ−ス 20.0g
リン酸水素カリウム 2.0g
Tween80 1.0g
二塩基酸のシュウ酸アンモニウム 2.0g
酢酸ナトリウム 5.0g
硫酸マグネシウム 0.1g
硫酸マンガン（manganous sulfate）0.05g
調製：蒸留水で、50g／lに溶かし、１２１℃で１５分間滅菌、25℃でpH 6.5±0.1。
【００３８】
M17ブロス（メルク社）の組成（g／リットル）：
大豆粉ペプトン 5.0g
肉ペプトン 2.5g
カゼインペプトン 2.5g
酵母抽出物 5.0g
肉抽出物 5.0g
D(+)−ラクト−ス 5.0g
アスコルビン酸 0.5g
βグリセロリン酸ナトリウム 0.25g
調製：蒸留水で、42.5g／ｌに溶かし、１２１℃で１５分間滅菌、２５℃でpH ７.2±0.1。
【００３９】
ビフィドバクテリウム・インファンティスは、嫌気性細菌であることが知られているので、嫌気的条件下で培養した。３７℃で２４時間インキュベーション後、３０mg相当の胆汁酸をそれぞれのチュ−ブへ加え、最終濃度を２mg／mlにした。以下の胆汁酸を使用した：グリココ−ル酸（GCA）、タウロコ−ル酸（TCA）（それぞれシグマケミカル社より入手）。それぞれの胆汁酸を一連の細菌培養物へ別個で加えた。
【００４０】
４８時間インキュベーション後、３mlのイソプロパノ−ルを２分間で加えた。次いで、４００rpmで１５分間遠心して、上清を回収した（５ml）。分析するまでこの上清を−３０℃で保存した。共役して存在していた胆汁酸塩の割合は、HPLC(高速液体クロマトグラフィ−)で決定した。HPLCの条件は以下のとおりであった：ギルソン社製装置；ダイオ−ドアレイモッド１０００（検出器）；スフェリソ−ブ５μmODS 2 C18（逆相カラム）；水／アセトニトリル／水で調製したメタノ−ル／リン酸緩衝液（20mM、pH2.5）（容積比は150：60：20：20）の移動相；0.85ml／分の流速；205nmの波長；100μlの試料；窒素下での乾燥。ついで内部標準として７α-OH-12α-OH-ジヒドロキシ−５８コ−ル酸（cholanic acid）(カルボケム社、U.S.A.)を2mg／mlで含む１００μlの移動相で抽出した。
【００４１】
細菌培養物とインキュベーションした胆汁酸の回収率は、内部標準に対する、検出された胆汁酸（GCA、またはTCA）の領域の割合により計算した。４８時間のインキュベーション後に細菌培養物中に見られる共役済み胆汁酸の量が５０％未満であるときには、シクロヘキサン／イソプロパノ−ル／酢酸（容積比30：10：1）の移動相を使用して、シリカ６０ゲル板上で薄膜クロマトグラフィ−（TLC）をかけて、CA及びDCAの割合を決定した。それぞれの板上に、試料のアルコ−ル抽出物20μl、CA及びDCAの溶液20μl、CAを20μl、DCAを20μlをスポットした。室温で展開した後に、この板を硫酸で処理して色のついたスポットが現れるまで、１４５℃で加熱した。
【００４２】
脱共役実験の結果（表１）は、GCAで試験した16の株のうち５株が、培養液に添加した胆汁酸を完全に脱共役したことを示しているが、このことは以前に文献で報告されている通りであり、また研究者の間には良く知られていたことである。驚くことに、１０株はGCAを脱共役したが、完全にではなくて9から90％の範囲であった（表１）。好気性細菌と嫌気性細菌との間には差異は見られなかった。二つの株、ストレプトコッカス・サ−モフィラスYS 52、及びビフィドバクテリウム・インファンティスBi 6 は、GCAに対する脱共役活性が全くない。株 ＹＳ52は、これに加えて胆汁酸−タウリン結合を攻撃しない。
【００４３】
１６株のうちただ一つ、ビフィドバクテリウム・インファンティスBi 6のみがTCAを完全に脱共役した。
【００４４】
デヒドロキシル化実験の結果（表II）は、１６の株中でただ一つ（Bi 4）が完全にGCAをデヒロキシル化したことを示している。６つの株（YS 52; SF2; SF4; LA3; LA10; Bi6）は、全くデヒドロキシル化しなかった。その他の株はGCAをデヒドロキシル化したが、完全にではなく、9から90％の範囲であった。TCAに関しては、７つの株（YS52; SF3; LA3; LA10; LB1; LB7; LB77）が全くデヒドロキシル化しなかった。ただ一つBi 6のみがTCAを完全にデヒドロキシル化し、その他の株はTCAを異なった割合でデヒドロキシル化した。
【００４５】
【表１】
ストレプトコッカス・サ−モフィラスYS46: I-1668
ストレプトコッカス・サ−モフィラスYS48: I-1669
ストレプトコッカス・サ−モフィラスYS52: I-1670
ストレプトコッカス・ファエキウムSF3: I-1671
ブルガリア菌LB1: I-1664
ブルガリア菌LB3: I-1665
ブルガリア菌LB7: I-1666
ブルガリア菌LB77: I-1667
以下の株は、以下のIDで、Centro Ricerche Sitia-Yamo S.p.A. -Strada per Merlino, 3-ZELO BUON PERSICO (MILAN)-ITALYで保管されていて、またそこより入手可能である：
ストレプトコッカス・ファエキウムSF２:SF2
ストレプトコッカス・ファエキウムSF4: SF4
ラクトバシラス・アシドフィラスLA3:LA3
ラクトバシラス・アシドフィラスLA10:LA10
ビフィドバクテリウム・インファンティスBi2:Bi2
ビフィドバクテリウム・インファンティスBi3:Bi3
ビフィドバクテリウム・インファンティスBi4:Bi4
ビフィドバクテリウム・インファンティスBi6:Bi6
以上の結果は、我々が試験した多くの株は胆汁酸を脱共役する能力が低いこと、また全く脱共役しない株があることも論証している。この観察は、乳酸菌が胆汁性の塩を脱共役することが知られていなかったという点において驚くべきことである。更に、上記株の酵素は、側鎖に結合した特異的胆汁酸に対して選択的であることが明らかである。本研究において、最もはっきりとした例は、ビフィドバクテリウム・インファンティスBi 6の場合が多い。この株は、グリシンに共役した胆汁酸を脱共役することができないが、タウリンに共役した胆汁酸は完全に脱共役することが可能である。他の幾つかの株（LB7, LB77, SF3）はTCAを脱共役することができないが、GCAはある程度脱共役することが可能である。
【００４６】
まとめると、脱共役及びデヒドロキシル化の能力が弱いか、またはまったくない株が発見された。
【００４７】
例２
グラム当たり１Ｘ１０11のストレプトコッカス・サ−モフィラスYS52の細胞を含む乳酸桿菌調製物を毎日、２８日間にわたって全量６gで処置した３人の健常なボランティアに関して、処置後の胆汁酸の内容量を調べた。処置を始める前、及び１２時間の断食後に、検体をインキュベーションし、セルレチド(ceruletide)で刺激した後に胆嚢の胆汁を回収し、−８０℃で凍結した。胆嚢の収縮は、超音波検査で調べ、十二指腸の第二部分における管の位置は、Rx（蛍光透視法）で調べた。
【００４８】
処置の４週間後、検体を二回目のインキュベーションにかけて、胆汁を回収した。試料の胆汁を次いで、上記した様にして幾つかの胆汁酸の内容量について調べた。結果は、表３に示してある。
【００４９】
【表３】
【００５０】
胆汁酸の特徴は表IIIの備考に記載されている。よってこれらの結果によれば、選択した細菌株の投与は界面活性の性質を低減することができ、またそれゆえに胆汁酸の細胞溶解活性を低減させることができる。
【００５１】
例３
慢性の肝炎患者１４人を、ストレプトコッカス・サ−モフィラスYS 46、及びYS48(２株)、ブルガリア菌LB1、LB７、及びLB77（３株）を含む細菌性調製物で処置した。それぞれの株は他のものと混合する前に、１５０Ｘ１０9の濃度にして、それぞれの株の重量比が同じになるような混合物を調製した。一日当たり６gの該混合物を、28日間にわたって投与した。処置前及び処置後の肝臓酵素を測定し、その結果を表IVに示した。
【００５２】
【表４】
Claims (14)
- パスツール研究所CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)に、受入れ番号I-１６７０の下に寄託された、ストレプトコッカス・サーモフィラスYS 52株。
- パスツール研究所CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)に、受入れ番号I-１６６８の下に寄託された、ストレプトコッカス・サーモフィラスYS ４６株。
- パスツール研究所CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)に、受入れ番号I-１６６９の下に寄託された、ストレプトコッカス・サーモフィラスYS ４８株。
- パスツール研究所CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)に、受入れ番号I-１６７１の下に寄託された、ストレプトコッカス・ファエキウムSF ３株。
- パスツール研究所CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)に、受入れ番号I-１６６４の下に寄託された、ブルガリア菌LB1株。
- パスツール研究所CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)に、受入れ番号I-１６６５の下に寄託された、ブルガリア菌LB３株。
- パスツール研究所CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)に、受入れ番号I-１６６６の下に寄託された、ブルガリア菌LB７株。
- パスツール研究所CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)に、受入れ番号I-１６６７の下に寄託された、ブルガリア菌LB７７株。
- 胆汁酸の変化した代謝に関連するか、またはそれによって引き起こされる疾患を治療するため、及び／または予防するための薬学的組成物であって、該疾患にかかった患者における、上記の変化した代謝を正常化させるのに効果的な量の、
（１）請求項１〜８のいずれか一項に記載の少なくとも一つの細菌株、及び
（２）薬学的に許容できる担体、
を具備することを特徴とする薬学的組成物。 - １グラムの組成物当たり、１０3から１０13の細菌細胞を具備した、請求項９に記載の組成物。
- １グラムの組成物当たりの細菌細胞数が、１０8から１０12である、請求項１０に記載の組成物。
- 更にラクツロース（lactulose）を具備した、請求項９〜１１の何れか一項に記載の組成物。
- ウルソデオキシコール酸及びタウロウルソデオキシコール酸（tauroursodeoxycholic acid）から選択される、胆汁酸に基づいた調剤を更に具備した、請求項９〜１２の何れか一項に記載の組成物。
- 胆汁酸の代謝変化に関連するか、またはそれによって引き起こされる疾患を治療及び予防するための薬学的組成物の調製のための、請求項１〜８の何れか一項に記載の少なくとも一つの細菌株の使用。
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