ES2200145T3 - Cepas de bacterias con metabolismo alterado de acidos biliares y su uso. - Google Patents
Cepas de bacterias con metabolismo alterado de acidos biliares y su uso.Info
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Abstract
CEPAS DE BACTERIAS QUE SE CARACTERIZAN PORQUE PRESENTAN: (A) UNA ACTIVIDAD DE LA 7(ALFA)-DESHIDROXILASA INFERIOR AL 50 % Y (V) UNA ACTIVIDAD DE DESCONJUGACION DE LOS ACIDOS BILIARES INFERIOR AL 50 %, Y DESCENDIENTES, MUTANTES Y DERIVADOS DE LAS MISMAS QUE MANTIENEN LAS ACTIVIDADES (A) Y (B); Y UNA COMPOSICION FARMACEUTICA QUE CONTIENE UNA O MAS DE TALES CEPAS Y EL USO DE LA MISMA PARA LA PREVENCION Y TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES ASOCIADAS A O PROVOCADAS POR UN METABOLISMO ALTERADO DE LOS ACIDOS BILIARES.
Description
Cepas de bacterias con metabolismo alterado de
ácidos biliares y su uso.
Esta invención se refiere a cepas de bacterias y
composiciones farmacéuticas que contienen una o más de esas cepas y
el uso de las mismas para prevenir y/o tratar enfermedades asociadas
con o causadas por un metabolismo alterado de los ácidos
biliares.
La bilis hepática es un fluido isotónico
pigmentado con una composición de electrolitos que se parece al
plasma sanguíneo. Los principales componentes de la bilis incluyen
agua (82 por ciento), ácidos biliares (12 por ciento), lecitina y
otros fosfolípidos (4 por ciento), y colesterol no esterificado
(0,7%). Otros constituyentes incluyen bilirrubina conjugada,
proteínas, electrolitos, mucus y los productos finales de la
transformación hepática de fármacos, hormonas, etc. La producción en
el hígado de bilis, en condiciones basales, es aproximadamente
500-1000 ml/día.
Los ácidos biliares primarios, el ácido cólico
(CA) y el ácido quenodesoxicólico (CDCA), se sintetizan a partir
del colesterol en el hígado, se conjugan con glicina o taurina, y se
excretan en la bilis. Los ácidos biliares secundarios, incluyendo el
ácido desoxicólico (DCA) y el ácido litocólico (LA), se forman en el
colon como metabolitos bacterianos de los ácidos biliares primarios.
Otros ácidos biliares, llamados ácidos biliares terciarios (por
ejemplo, ácido ursodesoxicólico - UDCA), se forman en el intestino
después de la epimerización enzimática de grupos -OH sobre anillos
de esterol por la flora intestinal.
En la bilis normal, la proporción de conjugados
de glicina a taurina es aproximadamente 2:1, mientras en pacientes
con colestasis, se encuentran a menudo concentraciones aumentadas de
conjugados de sulfato y glucurónidos de ácidos biliares.
La microflora intestinal transforma los ácidos
biliares en diferentes metabolitos. Estas biotransformaciones
incluyen la hidrólisis del enlace entre el ácido biliar y la taurina
o glicina, conformación de ácidos biliares libres o no conjugados y
taurina o glicina. Los ácidos biliares no conjugados están por
consiguiente disponibles para la oxidación de los grupos
hidroxílicos en las posiciones C3, C7 y C12 y para la
deshidroxilación en las posiciones 7Ó y 7\beta. Esta última
transformación lleva a la formación de los ácidos biliares
secundarios DCA y LA. Los ácidos biliares primarios, desconjugados
pero no transformados, y los ácidos biliares secundarios se
reabsorben desde el lumen del intestino y entran en la corriente
sanguínea, después son tomados por los hepatocitos, conjugados con
glicina o taurina y resecretados en la bilis (circulación
enterohepática).
Normalmente, el conjunto de ácidos biliares
circula aproximadamente de 5 a 10 veces diarias. La absorción
intestinal del conjunto es aproximadamente del 95%, así que la
pérdida fecal de ácidos biliares está en el intervalo de 0,3 a 0,6
g/día. La pérdida fecal está compensada por una síntesis diaria
igual.
Por esta razón, la composición del conjunto de
ácidos biliares presentes en la bilis es el resultado de
interacciones complejas que ocurren entre las enzimas hepáticas y
las de la microflora.
La actividad de desconjugación es una
característica compartida por muchas bacterias, aerobias y
anaerobias, pero es particularmente común entre las bacterias
anaeróbicas obligadas, es decir, Bacteroides, Eubacteria,
Clostridia, Bifidobacteria, etc. La mayoría de las bacterias es
activa contra conjugados de taurina y de glicina; sin embargo,
algunas de ellas tienen un cierto grado de especificidad,
dependiendo del aminoácido unido, y del número de hidróxidos unidos
al núcleo esteroide. Los ácidos libres biliares obtenidos después de
la acción de las hidrolasas bacterianas pueden sufrir la oxidación
de los grupos hidróxido presentes en las posiciones C3, C7 y C12 por
la hidroxiesteroidodeshidrogenasa.
El interés en los trastornos metabólicos de los
ácidos biliares viene de la hipótesis de que los ácidos biliares y/o
sus metabolitos están implicados en la patogénesis de algunas
enfermedades hepatobiliares y gastroenterológicas: dispepsia biliar,
colelitiasis, hepatopatías agudas y crónicas, enfermedades
inflamatorias del colon, etc.
Muy a menudo en la bibliografía la hidrofobicidad
del ácido biliar se correlaciona con la detergencia; los ácidos
biliares secundarios son más hidrófobos que los ácidos biliares
primarios, siendo el ácido desoxicólico (DCA) realmente más
detergente que el ácido cólico (CA). Por consiguiente, una
concentración aumentada de DCA en la bilis puede implicar:
- a) un aumento de la secreción de colesterol, con índice de saturación aumentado;
- b) un efecto citotóxico sobre las células del hígado.
Por esta razón, una modificación cualitativa del
modelo de ácidos biliares puede ser un factor decisivo,
especialmente al tratar las patologías mencionadas antes.
El documento EP 671 468 se refiere a bacterias de
ácido láctico del género Lactobacillus que pertenecen al
Lactobacillus acidophilus capaces de disminuir el colesterol
en la sangre y el hígado sin exhibir las propiedades que conviene
conocer de las bacterias del ácido láctico del género
Lactobacillus, es decir, sin exhibir desconjugación de ácidos
biliares conjugados, que se cree elevan el riesgo de cáncer de
intestino grueso e inhiben la absorción de nutrientes lípidos, como
los ácidos esenciales o las vitaminas solubles en grasas.
En T. Takahashi y M. Morotoni "Ausencia de
actividad 7\alpha-heshidroxilasa cólica en las
cepas de Lactobacillus y Bifidobacterium" Journal
of Dairy Science, vol. 77, nº. 11, 1994, páginas
3275-3286, se presenta un estudio con el fin de
comprobar si o no las bacterias de ácido láctico tales como las
cepas de lactobacillus, bifidobaterias, lactococos y estreptococos
muestran una actividad 7\alpha-deshidroxilasa
sobre los ácidos biliares. Además, dicho artículo científico revela
que la especie Streptococcus salivarius spp. Thermophilus
carece de actividad \alpha-deshidroxilasa de
ácido cólico.
Así, subsiste una necesidad de cepas bacterianas
efectivas o composiciones que, reduciendo la actividad de
\alpha-deshidroxilasa y al mismo tiempo la
desconjugación, pueda usarse para tratar y/o prevenir enfermedades
asociadas con trastornos metabólicos de los ácidos biliares.
No se han encontrado bacterias que sean capaces
de modificar cualitativamente el modelo de ácidos biliares de ese
modo.
Conforme a esto, es objeto de esta invención
proporcionar cepas nuevas de bacterias, en particular bacterias
gram-positivas, que son útiles para tratar o
prevenir enfermedades asociadas con o causadas por un trastorno
metabólico de los ácidos biliares.
Es otro objeto de esta invención proporcionar
composiciones farmacéuticas que contienen una o más cepas de esas
bacterias y son útiles para tratar y/o prevenir enfermedades
asociadas con o causadas por un trastorno metabólico de los ácidos
biliares.
El precedente y otros objetos, que se harán más
evidentes durante la siguiente descripción detallada, han sido
conseguidos por los inventores, que han encontrado cepas de
bacterias que tienen una actividad de
7\alpha-deshidroxilasa reducida o cero y una
capacidad reducida o cero para desconjugar los ácidos biliares. Esto
contrasta con la técnica anterior conocida. Conforme a esto, esta
invención proporciona el uso de esas cepas para modificar el
metabolismo de los ácidos biliares de manera útil para prevenir o
tratar enfermedades causadas por o asociadas con trastornos
metabólicos de los ácidos biliares.
Así, en una primera realización, esta invención
proporciona nuevas cepas de bacterias que tienen una actividad
7\alpha-deshidroxilasa de menos del 50%, y una
actividad de desconjugación de ácidos biliares conjugados de menos
del 50%, preferiblemente menos del 25%.
Las características esenciales de las cepas
conforme a esta invención se definen en las reivindicaciones 1, 2 y
3; cepas específicas que tienen esas características se definen
también en las reivindicaciones dependientes 4 a 8.
Esta invención también proporciona una
composición farmacéutica para tratar y/o prevenir enfermedades
asociadas con o causadas por un metabolismo alterado de ácidos
biliares, comprendiendo esa composición al menos una cepa de
bacterias conforme a esta invención. Las características esenciales
de la composición conforme a la invención se definen en la
reivindicación 9; realizaciones específicas de esa composición se
definen en las reivindicaciones dependientes 10 a 17.
Además, esta invención proporciona el uso de al
menos una cepa de bacterias conforme a esta invención para preparar
dichas composiciones farmacéuticas. Las características esenciales
de dicho uso se definen en la reivindicación 18; realizaciones
específicas se definen en las reivindicaciones dependientes 19 a
23.
En el contexto de esta invención, las
enfermedades asociadas con o causadas por un trastorno metabólico
de los ácidos biliares incluyen enfermedades del hígado y
enfermedades del aparato digestivo, como el síndrome del asa ciega,
cálculos biliares, cirrosis, hepatopatías crónicas, hepatopatías
agudas, fibrosis quística, colestasis intrahepática, enfermedades
inflamatorias intestinales, colonpatías, malabsorción. Estas
composiciones farmacéuticas pueden también usarse para prevenir la
aparición de cálculos biliares en mujeres durante el embarazo o
períodos subsiguientes y en sujetos que sufren programas o dietas de
pérdida de peso.
La actividad
7\alpha-deshidroxilasa de la cepa de bacterias
deberá ser menos del 50%, preferiblemente menos del 25%. Los valores
de actividad 7\alpha-deshidroxilasa son los
medidos por el método descrito en el Ejemplo 1 a continuación.
Específicamente, las 10^{7} células de la cepa en cuestión se
incuban a 37ºC durante 48 horas, en 15 ml del medio de cultivo
específico con la adición de 2 mg/ml de ácido glicocólico (GCA) o 2
mg/ml de ácido taurocólico (TCA), y después se mide la cantidad de
producto 7\alpha-deshidroxilado. El valor
porcentaje para la actividad
7\alpha-deshidroxilasa se calcula por la fórmula
siguiente:
| masa de GCA o TCA 7\alpha-deshidroxilado después de 48 horas de incubación | ||
| Actividad de \hskip5mm = | --------------------------------------------------------------------------------------------- | x 100 |
| 7\alpha-deshidroxilasa | masa de GCA o TCA al comienzo de la incubación |
\newpage
Basándose en lo anterior, la cepa de bacterias a
administrar debería además tener una actividad de desconjugación de
ácido biliar conjugado de menos del 50%, preferiblemente menos del
25%. La capacidad para desconjugar ácido biliar se determina
utilizando el mismo procedimiento de incubación descrito para medir
la actividad 7\alpha-deshidroxilasa seguido de
la medición de la cantidad de producto desconjugado formado. La
actividad de desconjugación se calcula utilizando la fórmula
siguiente:
| masa de GCA o TCA después de 48 horas de incubación | ||
| Actividad de \hskip5mm = | ------------------------------------------------------------------------------ | x 100 |
| desconjugación | masa de GCA o TCA en el comienzo de la incubación |
Las cepas de bacterias de esta invención pueden
administrarse entéricamente. Preferiblemente, las cepas de bacterias
de esta invención se administran oralmente.
Aunque puede administrase una cepa única de
bacterias, también es posible administrar una mezcla de dos o más
bacterias conforme a la presente invención.
Aunque la dosis exacta de bacterias a administrar
variará con la condición y tamaño del paciente, la enfermedad exacta
a tratar, y la identidad de las cepas que se administran, se han
conseguido buenos resultados administrando 10^{8} a 10^{13}
células de las bacterias/g, preferiblemente 10^{8} a 10^{13}
células de la cepa de bacterias/g. Para conseguir los buenos efectos
de esta invención, se prefiere que la cepa se administre en una
cantidad y concentración suficientes para dar lugar a que los
intestinos del paciente se pueblen con una cantidad suya
suficiente. Así, se prefiere que la cepa se administre en una
composición que contenga 10^{8} a 10^{13} células de la cepa/g,
preferiblemente 10^{8} a 10^{12} células de la cepa/g y que la
composición se administre en un régimen tal que el paciente reciba
100 mg a 100 g de la cepa/día, preferiblemente 1 g a 20 g de la
cepa/día, durante un período de 1 a 365 días, preferiblemente 3 a 60
días en caso de terapia, o según ciclos periódicos en caso de
profilaxis. La cepa de bacterias puede administrarse en cualquier
forma conveniente para administración enteral, como cápsulas,
comprimidos, o líquidos para administración oral o líquidos para
administración enteral.
Típicamente, la administración de la cepa de
bacterias según esta invención puede prescribirse después del
diagnóstico de trastornos metabólicos de los ácidos biliares. Sin
embargo, en el caso de la profilaxis de cálculos biliares, la cepa
puede administrarse cuando se determina que el sujeto pertenece a
una población de riesgo, como una embarazada o una persona que
comienza un programa o dieta de pérdida de peso. Además, esta cepa
de bacterias puede administrarse después de que a un paciente se le
ha extirpado su vesícula biliar.
En una realización preferida, la coadministración
de lactulosa se proporciona cuando la enfermedad a tratar es
cirrosis. Convenientemente, la lactulosa se administra en una
cantidad de 100 mg a 100g/día, preferiblemente 1 g a
20 g/día.
20 g/día.
En otra realización preferida, se proporciona la
coadministración de preparaciones basadas en ácidos biliares, como
el ácido ursodesoxicólico o tauroursodesoxicólico. Convenientemente,
el ácido ursodesoxicólico o tauroursodesoxicólico se administra en
una cantidad de 10 a 3.000 mg/día, preferiblemente 50 a 800
mg/día.
Preferiblemente, estas composiciones
farmacéuticas contienen la(s) cepa(s) de bacterias en
una concentración de 10^{8} a 10^{13} células/g, preferiblemente
10^{8} a 10^{12} células/g. El vehículo farmacéuticamente
aceptable puede ser cualquiera conveniente para administración
enteral y compatible con la cepa de bacterias, como dextrosa,
carbonato cálcico junto con diferentes sustancias adicionales como
almidón, gelatina, vitaminas, antioxidantes, colorantes o sustancias
mejoradoras del sabor.
Como componente opcional, las composiciones de la
invención pueden contener posiblemente un fármaco compatible con las
bacterias empleadas y capaz de potenciar la actividad de los
ingredientes activos presentes. Pueden mencionarse aquí los
fármacos anticolinérgicos, antihistamínicos, adrenérgicos,
antiulcerosos, antiácidos, antidiarreicos y fármacos
antiinflamatorios, sedantes, antipiréticos, coleréticos,
antirreumáticos, fármacos analgésicos, diuréticos, antisépticos,
antilipémicos, fármacos hepatoprotectores y fármacos activos sobre
la motilidad gastrointestinal (por ejemplo, trimebutine).
Cuando se trata la cirrosis, se prefiere que la
composición farmacéutica comprenda además lactulosa.
Convenientemente, la composición contendrá 100 mg a 100 g/día,
preferiblemente 1 g a 20 g/día de lactulosa. Cuando se trata la
cirrosis biliar y la hepatitis crónica, se prefiere que la
composición farmacéutica comprenda preparaciones basadas en ácidos
biliares, como el ácido ursodesoxicólico o tauroursodesoxicólico.
Convenientemente, la composición contendrá 10 a 3.000 mg/día de esas
preparaciones de ácidos biliares, preferiblemente 50 a 800 mg/día de
ácido ursodesoxicólico o tauroursodesoxicólico.
Otras características de la invención se harán
evidentes en el curso de las siguientes descripciones de
realizaciones de ejemplos que se dan para ilustrar la invención y no
se pretende que sean limitadoras.
\newpage
Se han ensayado cepas de las siguientes especies:
Streptococcus thermophilus, Streptococcus faecium,
Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus,
Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis.
Cada cepa (10^{7} CFU) se cultivó por duplicado en caldos
nutrientes específicos (15 ml); "CFU" significa "unidades
formadoras de colonias".
Lista de los medios de
cultivo empleados que dependen de las diferentes especies
Bifidobacterium infantis: MRS + glucosa al 0,5% (añadida
después de esterilización diluyendo una solución estéril al
20%).
| Streptococcus thermophilus: | M17 |
| Todas las cepas remanentes | MRS |
| g/litro | peptona universal | 10,0 g |
| extracto de carne | 5,0 g | |
| extracto de levadura | 5,0 g | |
| (D+)-glucosa | 20,0 g | |
| fosfato de hidrógeno potasio | 2,0 g | |
| Tween 80 | 1,0 g | |
| citrato de amonio dibásico | 2,0 g | |
| acetato sódico | 5,0 g | |
| sulfato magnésico | 0,1 g | |
| sulfato manganoso | 0,05 g |
Preparación: disolver 50 g/l en agua destilada,
esterilizada a 121ºC durante 15 minutos - Ph 6,5 + - 0,1 a 25ºC.
| g/litro | peptona de harina de soja | 5,0 g |
| peptona de carne | 2,5 g | |
| peptona de caseína | 2,5 g | |
| extracto de levadura | 2,5 g | |
| extracto de carne | 5,0 g | |
| D(+)-lactosa | 5,0 g | |
| ácido ascórbico | 0,5 g | |
| \beta-glicerofosfato de sodio | 19,0 g | |
| fosfato de magnesio | 0,25 g |
Preparación: disolver 42,5 g/l en agua destilada,
esterilizada a 121ºC durante 15 minutos - pH 7,2 + - 0,1 a 25ºC.
Bifidobacterium infantis se cultivó bajo
condiciones anaeróbicas ya que se sabe que es una bacteria
anaeróbica. Después de 24 horas de incubación a 37ºC a cada tubo se
añadió una cantidad de sales biliares equivalente a 30 mg con el fin
de obtener una concentración final de 2 mg/ml. Los ácidos biliares
empleados son ácido glicocólico (GCA) y ácido taurocólico (TCA),
obtenidos de Sigma Chemicals. Cada ácido biliar se añadió
separadamente a cada serie de cultivos bacterianos.
Después de 48 horas de incubación, se añadió
isopropanol, 3 ml, durante 2 minutos. Después se centrífugo a 400
rpm durante 15 minutos y se recogió el sobrenadante (5 ml). El
sobrenadante se mantuvo refrigerado a -30ºC hasta que se analizó.
El porcentaje de sales biliares conjugadas presentes se determinó
por HLPC (cromatografía líquida de alto rendimiento) utilizando un
aparato Wilson equipado con un dispositivo de díodo detector modelo
1000 y una columna de fase invertida Spherisorb 5 \mum ODS 2
C18, una fase móvil compuesta por metanol/fosfato tamponado (20
mMol), pH 2,5 en agua/acetonitrilo/agua (150:60:20:20 en volumen)
una velocidad de flujo de 0,85 ml/min, a una longitud de onda de 205
nm; 100 \mul de la muestra a ensayar, se secó bajo nitrógeno, se
extrajo con 100 \mul de la fase móvil que contenía como estándar
interno ácido
7\alpha-OH-12\alpha-OH-dihidroxi-58-colánico
(Calbiochem U.S.A.) a una concentración de 2 mg/ml.
El porcentaje de recuperación de los ácidos
biliares incubados con los cultivos bacterianos se calculó por la
relación del área de los ácidos biliares a detectar (GCA o TCA) al
área del estándar interno. Cuando la cantidad del ácido biliar
conjugado encontrado en los cultivos bacterianos después de 48 horas
de incubación era menos del 50%, se realizó la cromatografía en capa
fina (TLC) sobre placas de gel de sílice para detectar la presencia
de CA y DCA, utilizando una fase móvil de
ciclohexano/isopropanol/ácidoacético (30:10:1 en volumen). Sobre
cada placa se marcaron 20 \mul del extracto alcohólico de la
muestra, 20 \mul de una solución de CA y DCA, y 20 \mul de CA,
20 \mul de DCA. Las placas, después del desarrollo a temperatura
ambiente, se trataron con ácido sulfúrico y se calentaron a 145ºC
hasta la aparición de las manchas coloreadas.
Los resultados de los experimentos de
desconjugación (Tabla 1) muestran que 5 de las 16 cepas ensayadas
con GCA eran capaces de desconjugar completamente los ácidos
biliares añadidos al cultivo, como se informó previamente en la
bibliografía y lo conocen ampliamente todos los investigadores.
Sorprendentemente, 10 cepas eran capaces de desconjugar GCA pero no
completamente, oscilando desde 9 a 90% (Tabla 1). No había
diferencia entre bacterias aeróbicas y anaeróbicas. La cepa
Bifidobacterium infantis Bi 6 no tiene ninguna actividad
desconjugante para GCA.
Solamente una de las 15 cepas ensayadas era capaz
de desconjugar totalmente el TCA: el Bifidobacterium infantis Bi
6.
Los resultados de los experimentos de
deshidroxilación (Tabla II) muestran que sólo una (Bi 4) de las 15
cepas es capaz de deshidroxilar completamente GCA. Cinco cepas no se
deshidroxilaron en absoluto: SF 2; SF 4; LA 3; LA 10; Bi 6. Las
otras cepas eran capaces de deshidroxilar GCA pero no completamente,
oscilando desde 9 a 90%. En lo que se refiere a TCA, seis cepas no
lo deshidroxilaron en absoluto: SF 3; LA 3; LA 10; LB 1; LB 7; LB
77. Una cepa Bi 6 deshidroxiló TCA completamente; las otras cepas
deshidroxilaron TCA conforme a varios porcentajes.
| Bacteria | Entrada Nº. | %GCA | %TCA |
| Streptococcus thermophilus YS 46 | I-1668 | 9 | 9 |
| Streptococcus thermophilus YS 48 | I-1669 | 17 | 11 |
| Streptococcus faecium SF 2 | 100 | 3 | |
| Streptococcus faecium SF 3 | I-1671 | 27 | 0 |
| Streptococcus faecium SF 4 | 100 | 12 | |
| Lactobacillus acidophilus LA 3 | 100 | 80 | |
| Lactobacillus acidophilus LA 10 | 100 | 95 | |
| Lactobacillus bulgaricus LB 1 | I-1664 | 9 | 0 |
| Lactobacillus bulgaricus LB 3 | I-1665 | 20 | 12 |
| Lactobacillus bulgaricus LB 7 | I-1666 | 14 | 0 |
| Lactobacillus bulgaricus LB 77 | I-1667 | 20 | 0 |
| Bifidobacterium infantis Bi 2 | 80 | 15 | |
| Bifidobacterium infantis Bi 3 | 90 | 10 | |
| Bifidobacterium infantis Bi 4 | 100 | 26 | |
| Bifidobacterium infantis Bi 6 | 0 | 100 |
| Bacteria | Entrada Nº. | %GCA | %TCA |
| Streptococcus thermophilus YS 46 | I-1668 | 9 | 9 |
| Streptococcus thermophilus YS 48 | I-1669 | 17 | 11 |
| Streptococcus faecium SF 2 | 0 | 3 | |
| Streptococcus faecium SF 3 | I-1671 | 27 | 0 |
| Streptococcus faecium SF 4 | 0 | 12 | |
| Lactobacillus acidophilus LA 3 | 0 | 0 | |
| Lactobacillus acidophilus LA 10 | 0 | 0 | |
| Lactobacillus bulgaricus LB 1 | I-1664 | 9 | 0 |
| Lactobacillus bulgaricus LB 3 | I-1665 | 20 | 12 |
| Lactobacillus bulgaricus LB 7 | I-1666 | 14 | 0 |
| Lactobacillus bulgaricus LB 77 | I-1667 | 20 | 0 |
| Bacteria | Entrada Nº. | %GCA | %TCA |
| Bifidobacterium infantis Bi 2 | 80 | 15 | |
| Bifidobacterium infantis Bi 3 | 90 | 10 | |
| Bifidobacterium infantis Bi 4 | 100 | 26 | |
| Bifidobacterium infantis Bi 6 | 0 | 100 |
Estas cepas se han depositado en la
CNCM-Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo los siguientes números
de entrada:
| Streptococcus thermophilus YS 46: | I-1668 |
| Streptococcus thermophilus YS 48: | I-1669 |
| Streptococcus faecium SF 3: | I-1671 |
| Lactobacillus bulgaricus LB 1: | I-1664 |
| Lactobacillus bulgaricus LB 3: | I-1665 |
| Lactobacillus bulgaricus LB 7: | I-1666 |
| Lactobacillus bulgaricus LB 77: | I-1667 |
Las siguientes cepas se ha guardado y están
disponibles en el Centro Ricerche Sitia-Yomo
S.p.A.-Strada per Merlino, 3 - ZELO BUON PERSICO (Milán) - Italia,
distinguidas por los identificadores indicados a continuación:
| Streptococcus faecium SF 2: | SF 2 |
| Streptococcus faecium SF 4: | SF 4 |
| Lactobacillus acidophilus LA 3: | LA 3 |
| Lactobacillus acidophilus LA 10: | LA 10 |
| Bifidobacterium infantis Bi 2: | Bi 2 |
| Bifidobacterium infantis Bi 3: | Bi 3 |
| Bifidobacterium infantis Bi 4: | Bi 4 |
| Bifidobacterium infantis Bi 6: | Bi 6 |
Estos resultados demuestran que la mayoría de las
cepas ensayadas por nosotros tienen una baja capacidad para
desconjugar los ácidos biliares y que hay cepas que no desconjugan
en absoluto. Esta observación es sorprendente porque no se sabía que
las bacterias de ácido láctico desconjugaban las sales biliares.
Además, es evidente que las enzimas de las cepas son selectivas para
el ácido biliar específico unido a la cadena lateral. En este
estudio, el ejemplo más claro lo ofrece Bifidobacterium infantis
Bi 6. Esta cepa no es capaz de desconjugar el ácido biliar
conjugado con glicina pero es capaz de desconjugar totalmente el
ácido biliar conjugado con taurina. Algunas otras cepas (LB 1, LB 7,
LB 77, SF 3) son incapaces de desconjugar el TCA pero son capaces de
desconjugar el GCA en cierta extensión.
Para concluir, se han descubierto cepas que
tienen una capacidad débil o cero para desconjugar y
deshidroxilar.
Catorce pacientes con hepatitis crónica se
trataron con una preparación bacteriana que contenía
Streptococcus thermophilus YS 46 y YS 48 (dos cepas),
Lactobacillus bulgaricus, LB1, LB7 y LB 77
(tres cepas). Cada cepa se ha llevado a una concentración de
150x10^{9} células por gramo antes de mezclarse con las otras,
para preparar una mezcla que contenía las mismas partes en peso de
cada cepa. Seis gramos por día de dicha mezcla se administraron
durante 28 días. Las enzimas hepáticas se midieron antes y después
del tratamiento, y los resultados se muestran en la Tabla III.
| Paciente | AST(SGOT) | ALT(SGPT) | ||
| antes | después | antes | después | |
| Nº 1 | 92 | 59 | 102 | 46 |
| Nº 2 | 89 | 67 | 96 | 42 |
| Nº 3 | 174 | 86 | 97 | 39 |
| Nº 4 | 121 | 91 | 102 | 66 |
| Nº 5 | 116 | 81 | 111 | 55 |
| Nº 6 | 156 | 87 | 94 | 76 |
| Nº 7 | 163 | 66 | 69 | 37 |
| Nº 8 | 78 | 64 | 122 | 57 |
| Nº 9 | 109 | 39 | 87 | 86 |
| Nº 10 | 166 | 70 | 102 | 48 |
| Nº 11 | 56 | 24 | 118 | 62 |
| Nº 12 | 131 | 83 | 96 | 79 |
| Nº 13 | 137 | 86 | 94 | 74 |
| Nº 14 | 84 | 87 | 144 | 114 |
| Media | 119 | 71 | 102 | 63 |
| Desviación estándar | 36 | 19 | 17 | 21 |
| Ensayo t de Student de | ||||
| significancia para datos apareados | p<0,001 | P<0,001 |
Claims (23)
1. Una cepa de bacterias
gram-positivas, caracterizada porque dicha
cepa pertenece a una especie seleccionada del grupo que comprende
Streptococcus faecium y Lactobacillus bulgaricus y
porque dicha cepa muestra:
(a) una actividad de
7\alpha-deshidroxilasa de menos del 50% para el
ácido glicocólico y el taurocólico calculada por la siguiente
fórmula:
y
(b) una actividad de desconjugación de ácido
biliar de menos del 50% para el ácido glicocólico y el ácido
taurocólico calculada por la siguiente fórmula:
en la que cada incubación se lleva a cabo sobre
10^{7} células de cepa con la adición de dicha masa de ácido
biliar conjugado al comienzo de la incubación en un medio de
cultivo, consistiendo dicho medio de cultivo en MRS con una
formulación como se especifica en el ejemplo 1 de la descripción
para las especies Streptococcus faecium y Lactobacillus
bulgaricus.
2. Una cepa de bacterias
gram-positivas, caracterizada porque dicha
cepa es Streptococcus thermophilus YS 46, depositada en la
CNCM –Collection Nacionale de Cultures de Microorganismes-
Instituto Pasteur, bajo el número de entrada I-1668
y porque dicha cepa muestra:
(a) una actividad de
7\alpha-deshidroxilasa de menos del 50% para el
ácido glicocólico y el ácido taurocólico calculada por la siguiente
fórmula:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\+ masa de GCA o TCA 7 \alpha -deshidroxilado
después de 48 horas de incubación A 37ºC\+\cr Actividad de
\hskip5mm = \+
---------------------------------------------------------------------------------------------------
\+ x 100\cr 7 \alpha - deshidroxilasa \+ masa de
GCA o TCA al comienzo de la
incubación\+\cr}
y
(b) una actividad de desconjugación del ácido
biliar del menos de 50% para el ácido glicocólico y el taurocólico
calculada por la siguiente fórmula:
en la que cada incubación se lleva a cabo sobre
10^{7} células de cepa con la adición de dicha masa de ácido
biliar conjugado al comienzo de la incubación en un medio de
cultivo, comprendiendo dicho medio de cultivo M17 con una
formulación como se especifica en el ejemplo 1 de la descripción
para la especie Streptococcus
thermophilus.
3. Una cepa de bacterias
gram-positivas, caracterizada porque dicha
cepa es Streptococcus thermophilus YS 48, depositada en la
CNCM -Collection Nationale de Cultures de Microorganismes-
Instituto Pasteur, bajo el número de entrada I-1669
y en que dicha cepa muestra:
(a) una actividad de
7\alpha-deshidroxilasa de menos del 50% para el
ácido glicocólico y el ácido taurocólico calculada por la siguiente
fórmula:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\+ masa de GCA o TCA 7 \alpha -deshidroxilado
después de 48 horas de incubación A 37ºC\+\cr Actividad de
\hskip5mm = \+
-----------------------------------------------------------------------------------------------------
\+ x 100\cr 7 \alpha - deshidroxilasa \+ masa de
GCA o TCA al comienzo de la
incubación\+\cr}
y
(b) una actividad de desconjugación de ácido
biliar de menos del 50% para el ácido glicocólico y el ácido
taurocólico calculada por la siguiente fórmula:
en la que cada incubación se lleva a cabo sobre
10^{7} células de cepa con la adición de dicha masa de ácido
biliar conjugado al comienzo de la incubación en un medio de cultivo
que comprende M17 con una formulación como se especifica en el
ejemplo 1 de la descripción para la especie Streptococcus
thermophilus.
4. La cepa de la reivindicación 1, en la que la
cepa de bacterias es Streptococcus faecium SF 3 depositado en
la CNCM –Collection Nationale de Cultures de Microorganismes-
Instituto Pasteur, bajo el número de entrada
I-1671.
5. La cepa de la reivindicación 1, en que la cepa
de bacterias es Lactobacillus bulgaricus LB 1 depositada en
la CNCM -Collection Nationale de Cultures de Microorganismes-
Instituto Pasteur, bajo el número de entrada
I-1664.
6. La cepa de la reivindicación 1, en que la cepa
de bacterias es Lactobacillus bulgaricus LB 3 depositada en
la CNCM -Collection Nationale de Cultures de Microorganismes-
Instituto Pasteur, bajo el número de entrada
I-1665.
7. La cepa de la reivindicación 1, en que la cepa
de bacterias es Lactobacillus bulgaricus LB 7 depositada en
la CNCM -Collection Nationale de Cultures de Microorganismes-
Instituto Pasteur, bajo el número de entrada
I-1666.
8. La cepa de la reivindicación 1, en que la
cepa de bacterias es Lactobacillus bulgaricus LB 77
depositada en la CNCM -Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo el número de entrada
I-1667.
9. Una composición farmacéutica para prevenir y/o
tratar enfermedades asociadas con o causadas por un metabolismo
alterado de los ácidos biliares, caracterizada porque
comprende una cantidad efectiva capaz de producir un efecto
normalizador sobre ese metabolismo alterado en un paciente que lo
sufre, de
- (1) al menos una cepa de bacterias gram-positivas, según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3; y
- (2) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
10. La composición de la reivindicación 9, en que
la cepa de bacterias es Streptococcus faecium SF 3
depositado en la CNCM- Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo el número de
entrada
I-1671.
I-1671.
11. La composición de la reivindicación 9, en que
la cepa de bacterias es Lactobacillus bulgaricus LB1
depositada en la CNCM -Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo el número de
entrada
I-1664.
I-1664.
12. La composición de la reivindicación 9, en que
la cepa de bacterias es Lactobacillus bulgaricus LB 3
depositada en la CNCM -Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo el número de
entrada
I-1665.
I-1665.
13. La composición de la reivindicación 9, en que
la cepa de bacterias es Lactobacillus bulgaricus LB 7
depositada en la CNCM -Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo el número de
entrada
I-1666.
I-1666.
14. La composición de la reivindicación 9, en que
la cepa de bacterias es Lactobacillus bulgaricus LB 77
depositada en la CNCM -Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo el número de
entrada
I-1667.
I-1667.
15. La composición de la reivindicación 9,
comprendiendo 10^{8} a 10^{13} células de la cepa de bacterias
por gramo de composición.
16. La composición de la reivindicación 9,
comprendiendo además lactulosa.
17. La composición de la reivindicación 9,
comprendiendo además preparaciones basadas en ácidos biliares
seleccionados del ácido ursodesoxicólico y el ácido
tauroursodesoxicólico.
\newpage
18. Uso de al menos una cepa de bacterias
gram-positivas, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2 ó 3, para preparar una composición
farmacéutica para prevenir y tratar enfermedades causadas por
asociadas con un metabolismo alterado de los ácidos biliares.
19. El uso de la reivindicación 18, en que la
cepa de bacterias es Streptococcus faecium SF 3 depositado en
la CNCM -Collection Nationale de Cultures de Microorganismes-
Instituto Pasteur, bajo el número de entrada
I-1671.
20. El uso de la reivindicación 18, en que la
cepa de bacterias es Lactobacillus bulgaricus LB 1 depositada
en la CNCM -Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo el número de entrada
I-1664.
21. El uso de la reivindicación 18, en que la
cepa de bacterias es Lactobacillus bulgaricus LB 3 depositada
en la CNCM -Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo el número de entrada
I-1665.
22. El uso de la reivindicación 18, en que la
cepa de bacterias es Lactobacillus bulgaricus LB 7 depositada
en la CNCM -Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo el número de entrada
I-1666.
23. El uso de la reivindicación 18, en que la
cepa de bacterias es Lactobacillus bulgaricus LB 77
depositada en la CNCM -Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo el número de entrada
I-1667.
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