ES2200145T3

ES2200145T3 - Cepas de bacterias con metabolismo alterado de acidos biliares y su uso.

Info

Publication number: ES2200145T3
Application number: ES97830040T
Authority: ES
Inventors: Claudio De Simone; Renata Maria Anna Cavaliere Vesely
Original assignee: VESELY ALESSANDRO; VESELY MARINA EVA; VESELY SARA
Current assignee: VESELY ALESSANDRO; VESELY MARINA EVA; VESELY SARA
Priority date: 1996-03-11
Filing date: 1997-02-05
Publication date: 2004-03-01
Anticipated expiration: 2017-02-05
Also published as: KR100472061B1; US7959911B2; US20040259227A1; ITMI960468A0; MX9701816A; US20030082791A1; DK0795604T3; CA2198518C; EP0795604A2; JPH1086A; EP0795604A3; PT795604E; USRE41276E1; CN1110547C; CA2198518A1; CN1165857A; ITMI960468A1; US6225104B1; EP0795604B1; US20010012629A1

Abstract

CEPAS DE BACTERIAS QUE SE CARACTERIZAN PORQUE PRESENTAN: (A) UNA ACTIVIDAD DE LA 7(ALFA)-DESHIDROXILASA INFERIOR AL 50 % Y (V) UNA ACTIVIDAD DE DESCONJUGACION DE LOS ACIDOS BILIARES INFERIOR AL 50 %, Y DESCENDIENTES, MUTANTES Y DERIVADOS DE LAS MISMAS QUE MANTIENEN LAS ACTIVIDADES (A) Y (B); Y UNA COMPOSICION FARMACEUTICA QUE CONTIENE UNA O MAS DE TALES CEPAS Y EL USO DE LA MISMA PARA LA PREVENCION Y TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES ASOCIADAS A O PROVOCADAS POR UN METABOLISMO ALTERADO DE LOS ACIDOS BILIARES.

Description

Cepas de bacterias con metabolismo alterado de ácidos biliares y su uso.

Esta invención se refiere a cepas de bacterias y composiciones farmacéuticas que contienen una o más de esas cepas y el uso de las mismas para prevenir y/o tratar enfermedades asociadas con o causadas por un metabolismo alterado de los ácidos biliares.

La bilis hepática es un fluido isotónico pigmentado con una composición de electrolitos que se parece al plasma sanguíneo. Los principales componentes de la bilis incluyen agua (82 por ciento), ácidos biliares (12 por ciento), lecitina y otros fosfolípidos (4 por ciento), y colesterol no esterificado (0,7%). Otros constituyentes incluyen bilirrubina conjugada, proteínas, electrolitos, mucus y los productos finales de la transformación hepática de fármacos, hormonas, etc. La producción en el hígado de bilis, en condiciones basales, es aproximadamente 500-1000 ml/día.

Los ácidos biliares primarios, el ácido cólico (CA) y el ácido quenodesoxicólico (CDCA), se sintetizan a partir del colesterol en el hígado, se conjugan con glicina o taurina, y se excretan en la bilis. Los ácidos biliares secundarios, incluyendo el ácido desoxicólico (DCA) y el ácido litocólico (LA), se forman en el colon como metabolitos bacterianos de los ácidos biliares primarios. Otros ácidos biliares, llamados ácidos biliares terciarios (por ejemplo, ácido ursodesoxicólico - UDCA), se forman en el intestino después de la epimerización enzimática de grupos -OH sobre anillos de esterol por la flora intestinal.

En la bilis normal, la proporción de conjugados de glicina a taurina es aproximadamente 2:1, mientras en pacientes con colestasis, se encuentran a menudo concentraciones aumentadas de conjugados de sulfato y glucurónidos de ácidos biliares.

La microflora intestinal transforma los ácidos biliares en diferentes metabolitos. Estas biotransformaciones incluyen la hidrólisis del enlace entre el ácido biliar y la taurina o glicina, conformación de ácidos biliares libres o no conjugados y taurina o glicina. Los ácidos biliares no conjugados están por consiguiente disponibles para la oxidación de los grupos hidroxílicos en las posiciones C3, C7 y C12 y para la deshidroxilación en las posiciones 7Ó y 7\beta. Esta última transformación lleva a la formación de los ácidos biliares secundarios DCA y LA. Los ácidos biliares primarios, desconjugados pero no transformados, y los ácidos biliares secundarios se reabsorben desde el lumen del intestino y entran en la corriente sanguínea, después son tomados por los hepatocitos, conjugados con glicina o taurina y resecretados en la bilis (circulación enterohepática).

Normalmente, el conjunto de ácidos biliares circula aproximadamente de 5 a 10 veces diarias. La absorción intestinal del conjunto es aproximadamente del 95%, así que la pérdida fecal de ácidos biliares está en el intervalo de 0,3 a 0,6 g/día. La pérdida fecal está compensada por una síntesis diaria igual.

Por esta razón, la composición del conjunto de ácidos biliares presentes en la bilis es el resultado de interacciones complejas que ocurren entre las enzimas hepáticas y las de la microflora.

La actividad de desconjugación es una característica compartida por muchas bacterias, aerobias y anaerobias, pero es particularmente común entre las bacterias anaeróbicas obligadas, es decir, Bacteroides, Eubacteria, Clostridia, Bifidobacteria, etc. La mayoría de las bacterias es activa contra conjugados de taurina y de glicina; sin embargo, algunas de ellas tienen un cierto grado de especificidad, dependiendo del aminoácido unido, y del número de hidróxidos unidos al núcleo esteroide. Los ácidos libres biliares obtenidos después de la acción de las hidrolasas bacterianas pueden sufrir la oxidación de los grupos hidróxido presentes en las posiciones C3, C7 y C12 por la hidroxiesteroidodeshidrogenasa.

El interés en los trastornos metabólicos de los ácidos biliares viene de la hipótesis de que los ácidos biliares y/o sus metabolitos están implicados en la patogénesis de algunas enfermedades hepatobiliares y gastroenterológicas: dispepsia biliar, colelitiasis, hepatopatías agudas y crónicas, enfermedades inflamatorias del colon, etc.

Muy a menudo en la bibliografía la hidrofobicidad del ácido biliar se correlaciona con la detergencia; los ácidos biliares secundarios son más hidrófobos que los ácidos biliares primarios, siendo el ácido desoxicólico (DCA) realmente más detergente que el ácido cólico (CA). Por consiguiente, una concentración aumentada de DCA en la bilis puede implicar:

: a) un aumento de la secreción de colesterol, con índice de saturación aumentado;

: b) un efecto citotóxico sobre las células del hígado.

Por esta razón, una modificación cualitativa del modelo de ácidos biliares puede ser un factor decisivo, especialmente al tratar las patologías mencionadas antes.

El documento EP 671 468 se refiere a bacterias de ácido láctico del género Lactobacillus que pertenecen al Lactobacillus acidophilus capaces de disminuir el colesterol en la sangre y el hígado sin exhibir las propiedades que conviene conocer de las bacterias del ácido láctico del género Lactobacillus, es decir, sin exhibir desconjugación de ácidos biliares conjugados, que se cree elevan el riesgo de cáncer de intestino grueso e inhiben la absorción de nutrientes lípidos, como los ácidos esenciales o las vitaminas solubles en grasas.

En T. Takahashi y M. Morotoni "Ausencia de actividad 7\alpha-heshidroxilasa cólica en las cepas de Lactobacillus y Bifidobacterium" Journal of Dairy Science, vol. 77, nº. 11, 1994, páginas 3275-3286, se presenta un estudio con el fin de comprobar si o no las bacterias de ácido láctico tales como las cepas de lactobacillus, bifidobaterias, lactococos y estreptococos muestran una actividad 7\alpha-deshidroxilasa sobre los ácidos biliares. Además, dicho artículo científico revela que la especie Streptococcus salivarius spp. Thermophilus carece de actividad \alpha-deshidroxilasa de ácido cólico.

Así, subsiste una necesidad de cepas bacterianas efectivas o composiciones que, reduciendo la actividad de \alpha-deshidroxilasa y al mismo tiempo la desconjugación, pueda usarse para tratar y/o prevenir enfermedades asociadas con trastornos metabólicos de los ácidos biliares.

No se han encontrado bacterias que sean capaces de modificar cualitativamente el modelo de ácidos biliares de ese modo.

Conforme a esto, es objeto de esta invención proporcionar cepas nuevas de bacterias, en particular bacterias gram-positivas, que son útiles para tratar o prevenir enfermedades asociadas con o causadas por un trastorno metabólico de los ácidos biliares.

Es otro objeto de esta invención proporcionar composiciones farmacéuticas que contienen una o más cepas de esas bacterias y son útiles para tratar y/o prevenir enfermedades asociadas con o causadas por un trastorno metabólico de los ácidos biliares.

El precedente y otros objetos, que se harán más evidentes durante la siguiente descripción detallada, han sido conseguidos por los inventores, que han encontrado cepas de bacterias que tienen una actividad de 7\alpha-deshidroxilasa reducida o cero y una capacidad reducida o cero para desconjugar los ácidos biliares. Esto contrasta con la técnica anterior conocida. Conforme a esto, esta invención proporciona el uso de esas cepas para modificar el metabolismo de los ácidos biliares de manera útil para prevenir o tratar enfermedades causadas por o asociadas con trastornos metabólicos de los ácidos biliares.

Así, en una primera realización, esta invención proporciona nuevas cepas de bacterias que tienen una actividad 7\alpha-deshidroxilasa de menos del 50%, y una actividad de desconjugación de ácidos biliares conjugados de menos del 50%, preferiblemente menos del 25%.

Las características esenciales de las cepas conforme a esta invención se definen en las reivindicaciones 1, 2 y 3; cepas específicas que tienen esas características se definen también en las reivindicaciones dependientes 4 a 8.

Esta invención también proporciona una composición farmacéutica para tratar y/o prevenir enfermedades asociadas con o causadas por un metabolismo alterado de ácidos biliares, comprendiendo esa composición al menos una cepa de bacterias conforme a esta invención. Las características esenciales de la composición conforme a la invención se definen en la reivindicación 9; realizaciones específicas de esa composición se definen en las reivindicaciones dependientes 10 a 17.

Además, esta invención proporciona el uso de al menos una cepa de bacterias conforme a esta invención para preparar dichas composiciones farmacéuticas. Las características esenciales de dicho uso se definen en la reivindicación 18; realizaciones específicas se definen en las reivindicaciones dependientes 19 a 23.

En el contexto de esta invención, las enfermedades asociadas con o causadas por un trastorno metabólico de los ácidos biliares incluyen enfermedades del hígado y enfermedades del aparato digestivo, como el síndrome del asa ciega, cálculos biliares, cirrosis, hepatopatías crónicas, hepatopatías agudas, fibrosis quística, colestasis intrahepática, enfermedades inflamatorias intestinales, colonpatías, malabsorción. Estas composiciones farmacéuticas pueden también usarse para prevenir la aparición de cálculos biliares en mujeres durante el embarazo o períodos subsiguientes y en sujetos que sufren programas o dietas de pérdida de peso.

La actividad 7\alpha-deshidroxilasa de la cepa de bacterias deberá ser menos del 50%, preferiblemente menos del 25%. Los valores de actividad 7\alpha-deshidroxilasa son los medidos por el método descrito en el Ejemplo 1 a continuación. Específicamente, las 10^{7} células de la cepa en cuestión se incuban a 37ºC durante 48 horas, en 15 ml del medio de cultivo específico con la adición de 2 mg/ml de ácido glicocólico (GCA) o 2 mg/ml de ácido taurocólico (TCA), y después se mide la cantidad de producto 7\alpha-deshidroxilado. El valor porcentaje para la actividad 7\alpha-deshidroxilasa se calcula por la fórmula siguiente:

	masa de GCA o TCA 7\alpha-deshidroxilado después de 48 horas de incubación
Actividad de \hskip5mm =	---------------------------------------------------------------------------------------------	x 100
7\alpha-deshidroxilasa	masa de GCA o TCA al comienzo de la incubación

\newpage

Basándose en lo anterior, la cepa de bacterias a administrar debería además tener una actividad de desconjugación de ácido biliar conjugado de menos del 50%, preferiblemente menos del 25%. La capacidad para desconjugar ácido biliar se determina utilizando el mismo procedimiento de incubación descrito para medir la actividad 7\alpha-deshidroxilasa seguido de la medición de la cantidad de producto desconjugado formado. La actividad de desconjugación se calcula utilizando la fórmula siguiente:

	masa de GCA o TCA después de 48 horas de incubación
Actividad de \hskip5mm =	------------------------------------------------------------------------------	x 100
desconjugación	masa de GCA o TCA en el comienzo de la incubación

Las cepas de bacterias de esta invención pueden administrarse entéricamente. Preferiblemente, las cepas de bacterias de esta invención se administran oralmente.

Aunque puede administrase una cepa única de bacterias, también es posible administrar una mezcla de dos o más bacterias conforme a la presente invención.

Aunque la dosis exacta de bacterias a administrar variará con la condición y tamaño del paciente, la enfermedad exacta a tratar, y la identidad de las cepas que se administran, se han conseguido buenos resultados administrando 10^{8} a 10^{13} células de las bacterias/g, preferiblemente 10^{8} a 10^{13} células de la cepa de bacterias/g. Para conseguir los buenos efectos de esta invención, se prefiere que la cepa se administre en una cantidad y concentración suficientes para dar lugar a que los intestinos del paciente se pueblen con una cantidad suya suficiente. Así, se prefiere que la cepa se administre en una composición que contenga 10^{8} a 10^{13} células de la cepa/g, preferiblemente 10^{8} a 10^{12} células de la cepa/g y que la composición se administre en un régimen tal que el paciente reciba 100 mg a 100 g de la cepa/día, preferiblemente 1 g a 20 g de la cepa/día, durante un período de 1 a 365 días, preferiblemente 3 a 60 días en caso de terapia, o según ciclos periódicos en caso de profilaxis. La cepa de bacterias puede administrarse en cualquier forma conveniente para administración enteral, como cápsulas, comprimidos, o líquidos para administración oral o líquidos para administración enteral.

Típicamente, la administración de la cepa de bacterias según esta invención puede prescribirse después del diagnóstico de trastornos metabólicos de los ácidos biliares. Sin embargo, en el caso de la profilaxis de cálculos biliares, la cepa puede administrarse cuando se determina que el sujeto pertenece a una población de riesgo, como una embarazada o una persona que comienza un programa o dieta de pérdida de peso. Además, esta cepa de bacterias puede administrarse después de que a un paciente se le ha extirpado su vesícula biliar.

En una realización preferida, la coadministración de lactulosa se proporciona cuando la enfermedad a tratar es cirrosis. Convenientemente, la lactulosa se administra en una cantidad de 100 mg a 100g/día, preferiblemente 1 g a
20 g/día.

En otra realización preferida, se proporciona la coadministración de preparaciones basadas en ácidos biliares, como el ácido ursodesoxicólico o tauroursodesoxicólico. Convenientemente, el ácido ursodesoxicólico o tauroursodesoxicólico se administra en una cantidad de 10 a 3.000 mg/día, preferiblemente 50 a 800 mg/día.

Preferiblemente, estas composiciones farmacéuticas contienen la(s) cepa(s) de bacterias en una concentración de 10^{8} a 10^{13} células/g, preferiblemente 10^{8} a 10^{12} células/g. El vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser cualquiera conveniente para administración enteral y compatible con la cepa de bacterias, como dextrosa, carbonato cálcico junto con diferentes sustancias adicionales como almidón, gelatina, vitaminas, antioxidantes, colorantes o sustancias mejoradoras del sabor.

Como componente opcional, las composiciones de la invención pueden contener posiblemente un fármaco compatible con las bacterias empleadas y capaz de potenciar la actividad de los ingredientes activos presentes. Pueden mencionarse aquí los fármacos anticolinérgicos, antihistamínicos, adrenérgicos, antiulcerosos, antiácidos, antidiarreicos y fármacos antiinflamatorios, sedantes, antipiréticos, coleréticos, antirreumáticos, fármacos analgésicos, diuréticos, antisépticos, antilipémicos, fármacos hepatoprotectores y fármacos activos sobre la motilidad gastrointestinal (por ejemplo, trimebutine).

Cuando se trata la cirrosis, se prefiere que la composición farmacéutica comprenda además lactulosa. Convenientemente, la composición contendrá 100 mg a 100 g/día, preferiblemente 1 g a 20 g/día de lactulosa. Cuando se trata la cirrosis biliar y la hepatitis crónica, se prefiere que la composición farmacéutica comprenda preparaciones basadas en ácidos biliares, como el ácido ursodesoxicólico o tauroursodesoxicólico. Convenientemente, la composición contendrá 10 a 3.000 mg/día de esas preparaciones de ácidos biliares, preferiblemente 50 a 800 mg/día de ácido ursodesoxicólico o tauroursodesoxicólico.

Otras características de la invención se harán evidentes en el curso de las siguientes descripciones de realizaciones de ejemplos que se dan para ilustrar la invención y no se pretende que sean limitadoras.

\newpage

Ejemplos Ejemplo 1

Se han ensayado cepas de las siguientes especies: Streptococcus thermophilus, Streptococcus faecium, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis. Cada cepa (10^{7} CFU) se cultivó por duplicado en caldos nutrientes específicos (15 ml); "CFU" significa "unidades formadoras de colonias".

Lista de los medios de cultivo empleados que dependen de las diferentes especies Bifidobacterium infantis: MRS + glucosa al 0,5% (añadida después de esterilización diluyendo una solución estéril al 20%).

Streptococcus thermophilus:	M17
Todas las cepas remanentes	MRS

Composición del caldo MRS

g/litro	peptona universal	10,0 g
	extracto de carne	5,0 g
	extracto de levadura	5,0 g
	(D+)-glucosa	20,0 g
	fosfato de hidrógeno potasio	2,0 g
	Tween 80	1,0 g
	citrato de amonio dibásico	2,0 g
	acetato sódico	5,0 g
	sulfato magnésico	0,1 g
	sulfato manganoso	0,05 g

Preparación: disolver 50 g/l en agua destilada, esterilizada a 121ºC durante 15 minutos - Ph 6,5 + - 0,1 a 25ºC.

Composición de caldo M17 (Merck)

g/litro	peptona de harina de soja	5,0 g
	peptona de carne	2,5 g
	peptona de caseína	2,5 g
	extracto de levadura	2,5 g
	extracto de carne	5,0 g
	D(+)-lactosa	5,0 g
	ácido ascórbico	0,5 g
	\beta-glicerofosfato de sodio	19,0 g
	fosfato de magnesio	0,25 g

Preparación: disolver 42,5 g/l en agua destilada, esterilizada a 121ºC durante 15 minutos - pH 7,2 + - 0,1 a 25ºC.

Bifidobacterium infantis se cultivó bajo condiciones anaeróbicas ya que se sabe que es una bacteria anaeróbica. Después de 24 horas de incubación a 37ºC a cada tubo se añadió una cantidad de sales biliares equivalente a 30 mg con el fin de obtener una concentración final de 2 mg/ml. Los ácidos biliares empleados son ácido glicocólico (GCA) y ácido taurocólico (TCA), obtenidos de Sigma Chemicals. Cada ácido biliar se añadió separadamente a cada serie de cultivos bacterianos.

Después de 48 horas de incubación, se añadió isopropanol, 3 ml, durante 2 minutos. Después se centrífugo a 400 rpm durante 15 minutos y se recogió el sobrenadante (5 ml). El sobrenadante se mantuvo refrigerado a -30ºC hasta que se analizó. El porcentaje de sales biliares conjugadas presentes se determinó por HLPC (cromatografía líquida de alto rendimiento) utilizando un aparato Wilson equipado con un dispositivo de díodo detector modelo 1000 y una columna de fase invertida Spherisorb 5 \mum ODS 2 C18, una fase móvil compuesta por metanol/fosfato tamponado (20 mMol), pH 2,5 en agua/acetonitrilo/agua (150:60:20:20 en volumen) una velocidad de flujo de 0,85 ml/min, a una longitud de onda de 205 nm; 100 \mul de la muestra a ensayar, se secó bajo nitrógeno, se extrajo con 100 \mul de la fase móvil que contenía como estándar interno ácido 7\alpha-OH-12\alpha-OH-dihidroxi-58-colánico (Calbiochem U.S.A.) a una concentración de 2 mg/ml.

El porcentaje de recuperación de los ácidos biliares incubados con los cultivos bacterianos se calculó por la relación del área de los ácidos biliares a detectar (GCA o TCA) al área del estándar interno. Cuando la cantidad del ácido biliar conjugado encontrado en los cultivos bacterianos después de 48 horas de incubación era menos del 50%, se realizó la cromatografía en capa fina (TLC) sobre placas de gel de sílice para detectar la presencia de CA y DCA, utilizando una fase móvil de ciclohexano/isopropanol/ácidoacético (30:10:1 en volumen). Sobre cada placa se marcaron 20 \mul del extracto alcohólico de la muestra, 20 \mul de una solución de CA y DCA, y 20 \mul de CA, 20 \mul de DCA. Las placas, después del desarrollo a temperatura ambiente, se trataron con ácido sulfúrico y se calentaron a 145ºC hasta la aparición de las manchas coloreadas.

Los resultados de los experimentos de desconjugación (Tabla 1) muestran que 5 de las 16 cepas ensayadas con GCA eran capaces de desconjugar completamente los ácidos biliares añadidos al cultivo, como se informó previamente en la bibliografía y lo conocen ampliamente todos los investigadores. Sorprendentemente, 10 cepas eran capaces de desconjugar GCA pero no completamente, oscilando desde 9 a 90% (Tabla 1). No había diferencia entre bacterias aeróbicas y anaeróbicas. La cepa Bifidobacterium infantis Bi 6 no tiene ninguna actividad desconjugante para GCA.

Solamente una de las 15 cepas ensayadas era capaz de desconjugar totalmente el TCA: el Bifidobacterium infantis Bi 6.

Los resultados de los experimentos de deshidroxilación (Tabla II) muestran que sólo una (Bi 4) de las 15 cepas es capaz de deshidroxilar completamente GCA. Cinco cepas no se deshidroxilaron en absoluto: SF 2; SF 4; LA 3; LA 10; Bi 6. Las otras cepas eran capaces de deshidroxilar GCA pero no completamente, oscilando desde 9 a 90%. En lo que se refiere a TCA, seis cepas no lo deshidroxilaron en absoluto: SF 3; LA 3; LA 10; LB 1; LB 7; LB 77. Una cepa Bi 6 deshidroxiló TCA completamente; las otras cepas deshidroxilaron TCA conforme a varios porcentajes.

TABLA I Porcentaje de desconjugación de GCA y TCA por cultivos bacterianos después de 48 horas de incubación

Bacteria	Entrada Nº.	%GCA	%TCA

Streptococcus thermophilus YS 46	I-1668	9	9
Streptococcus thermophilus YS 48	I-1669	17	11
Streptococcus faecium SF 2		100	3
Streptococcus faecium SF 3	I-1671	27	0
Streptococcus faecium SF 4		100	12
Lactobacillus acidophilus LA 3		100	80
Lactobacillus acidophilus LA 10		100	95
Lactobacillus bulgaricus LB 1	I-1664	9	0
Lactobacillus bulgaricus LB 3	I-1665	20	12
Lactobacillus bulgaricus LB 7	I-1666	14	0
Lactobacillus bulgaricus LB 77	I-1667	20	0
Bifidobacterium infantis Bi 2		80	15
Bifidobacterium infantis Bi 3		90	10
Bifidobacterium infantis Bi 4		100	26
Bifidobacterium infantis Bi 6		0	100

TABLA II Porcentaje de deshidroxilación de GCA y TCA por cultivos bacterianos después de 48 horas de incubación

Bacteria	Entrada Nº.	%GCA	%TCA

Streptococcus thermophilus YS 46	I-1668	9	9
Streptococcus thermophilus YS 48	I-1669	17	11
Streptococcus faecium SF 2		0	3
Streptococcus faecium SF 3	I-1671	27	0
Streptococcus faecium SF 4		0	12
Lactobacillus acidophilus LA 3		0	0
Lactobacillus acidophilus LA 10		0	0
Lactobacillus bulgaricus LB 1	I-1664	9	0
Lactobacillus bulgaricus LB 3	I-1665	20	12
Lactobacillus bulgaricus LB 7	I-1666	14	0
Lactobacillus bulgaricus LB 77	I-1667	20	0

TABLA II (continuación)

Bacteria	Entrada Nº.	%GCA	%TCA

Bifidobacterium infantis Bi 2		80	15
Bifidobacterium infantis Bi 3		90	10
Bifidobacterium infantis Bi 4		100	26
Bifidobacterium infantis Bi 6		0	100

Estas cepas se han depositado en la CNCM-Collection Nationale de Cultures de Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo los siguientes números de entrada:

Streptococcus thermophilus YS 46:	I-1668
Streptococcus thermophilus YS 48:	I-1669
Streptococcus faecium SF 3:	I-1671
Lactobacillus bulgaricus LB 1:	I-1664
Lactobacillus bulgaricus LB 3:	I-1665
Lactobacillus bulgaricus LB 7:	I-1666
Lactobacillus bulgaricus LB 77:	I-1667

Las siguientes cepas se ha guardado y están disponibles en el Centro Ricerche Sitia-Yomo S.p.A.-Strada per Merlino, 3 - ZELO BUON PERSICO (Milán) - Italia, distinguidas por los identificadores indicados a continuación:

Streptococcus faecium SF 2:	SF 2
Streptococcus faecium SF 4:	SF 4
Lactobacillus acidophilus LA 3:	LA 3
Lactobacillus acidophilus LA 10:	LA 10
Bifidobacterium infantis Bi 2:	Bi 2
Bifidobacterium infantis Bi 3:	Bi 3
Bifidobacterium infantis Bi 4:	Bi 4
Bifidobacterium infantis Bi 6:	Bi 6

Estos resultados demuestran que la mayoría de las cepas ensayadas por nosotros tienen una baja capacidad para desconjugar los ácidos biliares y que hay cepas que no desconjugan en absoluto. Esta observación es sorprendente porque no se sabía que las bacterias de ácido láctico desconjugaban las sales biliares. Además, es evidente que las enzimas de las cepas son selectivas para el ácido biliar específico unido a la cadena lateral. En este estudio, el ejemplo más claro lo ofrece Bifidobacterium infantis Bi 6. Esta cepa no es capaz de desconjugar el ácido biliar conjugado con glicina pero es capaz de desconjugar totalmente el ácido biliar conjugado con taurina. Algunas otras cepas (LB 1, LB 7, LB 77, SF 3) son incapaces de desconjugar el TCA pero son capaces de desconjugar el GCA en cierta extensión.

Para concluir, se han descubierto cepas que tienen una capacidad débil o cero para desconjugar y deshidroxilar.

Ejemplo 2

Catorce pacientes con hepatitis crónica se trataron con una preparación bacteriana que contenía Streptococcus thermophilus YS 46 y YS 48 (dos cepas), Lactobacillus bulgaricus, LB1, LB7 y LB 77 (tres cepas). Cada cepa se ha llevado a una concentración de 150x10^{9} células por gramo antes de mezclarse con las otras, para preparar una mezcla que contenía las mismas partes en peso de cada cepa. Seis gramos por día de dicha mezcla se administraron durante 28 días. Las enzimas hepáticas se midieron antes y después del tratamiento, y los resultados se muestran en la Tabla III.

TABLA III Influencia del tratamiento con la mezcla bacteriana sobre las enzimas hepáticas aspartato transaminasa (AST; SGOT) y alanina transaminasa (ALT; SGPT)

Paciente	AST(SGOT)	ALT(SGPT)
	antes	después	antes	después
Nº 1	92	59	102	46
Nº 2	89	67	96	42
Nº 3	174	86	97	39
Nº 4	121	91	102	66
Nº 5	116	81	111	55
Nº 6	156	87	94	76
Nº 7	163	66	69	37
Nº 8	78	64	122	57
Nº 9	109	39	87	86
Nº 10	166	70	102	48
Nº 11	56	24	118	62
Nº 12	131	83	96	79
Nº 13	137	86	94	74
Nº 14	84	87	144	114
Media	119	71	102	63
Desviación estándar	36	19	17	21
Ensayo t de Student de
significancia para datos apareados	p<0,001	P<0,001

Claims

1. Una cepa de bacterias gram-positivas, caracterizada porque dicha cepa pertenece a una especie seleccionada del grupo que comprende Streptococcus faecium y Lactobacillus bulgaricus y porque dicha cepa muestra:

(a) una actividad de 7\alpha-deshidroxilasa de menos del 50% para el ácido glicocólico y el taurocólico calculada por la siguiente fórmula:

y

(b) una actividad de desconjugación de ácido biliar de menos del 50% para el ácido glicocólico y el ácido taurocólico calculada por la siguiente fórmula:

masa de GCA o TCA después de 48 horas de incubación A 37ºC Actividad de \hskip5mm = ------------------------------------------------------------------------------ x 100 desconjugación masa de GCA o TCA al comienzo de la incubación

en la que cada incubación se lleva a cabo sobre 10^{7} células de cepa con la adición de dicha masa de ácido biliar conjugado al comienzo de la incubación en un medio de cultivo, consistiendo dicho medio de cultivo en MRS con una formulación como se especifica en el ejemplo 1 de la descripción para las especies Streptococcus faecium y Lactobacillus bulgaricus.

2. Una cepa de bacterias gram-positivas, caracterizada porque dicha cepa es Streptococcus thermophilus YS 46, depositada en la CNCM –Collection Nacionale de Cultures de Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo el número de entrada I-1668 y porque dicha cepa muestra:

(a) una actividad de 7\alpha-deshidroxilasa de menos del 50% para el ácido glicocólico y el ácido taurocólico calculada por la siguiente fórmula:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ masa de GCA o TCA 7 \alpha -deshidroxilado
después de 48 horas de incubación A 37ºC\+\cr  Actividad de 
 \hskip5mm  = \+
---------------------------------------------------------------------------------------------------
\+  x 100\cr  7 \alpha   -  deshidroxilasa \+ masa de
GCA o TCA al comienzo de la
incubación\+\cr}

y

(b) una actividad de desconjugación del ácido biliar del menos de 50% para el ácido glicocólico y el taurocólico calculada por la siguiente fórmula:

en la que cada incubación se lleva a cabo sobre 10^{7} células de cepa con la adición de dicha masa de ácido biliar conjugado al comienzo de la incubación en un medio de cultivo, comprendiendo dicho medio de cultivo M17 con una formulación como se especifica en el ejemplo 1 de la descripción para la especie Streptococcus thermophilus.

3. Una cepa de bacterias gram-positivas, caracterizada porque dicha cepa es Streptococcus thermophilus YS 48, depositada en la CNCM -Collection Nationale de Cultures de Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo el número de entrada I-1669 y en que dicha cepa muestra:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ masa de GCA o TCA 7 \alpha -deshidroxilado
después de 48 horas de incubación A 37ºC\+\cr  Actividad de
 \hskip5mm  = \+
-----------------------------------------------------------------------------------------------------
\+  x 100\cr  7 \alpha   -  deshidroxilasa \+ masa de
GCA o TCA al comienzo de la
incubación\+\cr}

y

en la que cada incubación se lleva a cabo sobre 10^{7} células de cepa con la adición de dicha masa de ácido biliar conjugado al comienzo de la incubación en un medio de cultivo que comprende M17 con una formulación como se especifica en el ejemplo 1 de la descripción para la especie Streptococcus thermophilus.

4. La cepa de la reivindicación 1, en la que la cepa de bacterias es Streptococcus faecium SF 3 depositado en la CNCM –Collection Nationale de Cultures de Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo el número de entrada I-1671.

5. La cepa de la reivindicación 1, en que la cepa de bacterias es Lactobacillus bulgaricus LB 1 depositada en la CNCM -Collection Nationale de Cultures de Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo el número de entrada I-1664.

6. La cepa de la reivindicación 1, en que la cepa de bacterias es Lactobacillus bulgaricus LB 3 depositada en la CNCM -Collection Nationale de Cultures de Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo el número de entrada I-1665.

7. La cepa de la reivindicación 1, en que la cepa de bacterias es Lactobacillus bulgaricus LB 7 depositada en la CNCM -Collection Nationale de Cultures de Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo el número de entrada I-1666.

8. La cepa de la reivindicación 1, en que la cepa de bacterias es Lactobacillus bulgaricus LB 77 depositada en la CNCM -Collection Nationale de Cultures de Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo el número de entrada I-1667.

9. Una composición farmacéutica para prevenir y/o tratar enfermedades asociadas con o causadas por un metabolismo alterado de los ácidos biliares, caracterizada porque comprende una cantidad efectiva capaz de producir un efecto normalizador sobre ese metabolismo alterado en un paciente que lo sufre, de

: (1) al menos una cepa de bacterias gram-positivas, según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3; y

: (2) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. La composición de la reivindicación 9, en que la cepa de bacterias es Streptococcus faecium SF 3 depositado en la CNCM- Collection Nationale de Cultures de Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo el número de entrada
I-1671.

11. La composición de la reivindicación 9, en que la cepa de bacterias es Lactobacillus bulgaricus LB1 depositada en la CNCM -Collection Nationale de Cultures de Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo el número de entrada
I-1664.

12. La composición de la reivindicación 9, en que la cepa de bacterias es Lactobacillus bulgaricus LB 3 depositada en la CNCM -Collection Nationale de Cultures de Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo el número de entrada
I-1665.

13. La composición de la reivindicación 9, en que la cepa de bacterias es Lactobacillus bulgaricus LB 7 depositada en la CNCM -Collection Nationale de Cultures de Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo el número de entrada
I-1666.

14. La composición de la reivindicación 9, en que la cepa de bacterias es Lactobacillus bulgaricus LB 77 depositada en la CNCM -Collection Nationale de Cultures de Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo el número de entrada
I-1667.

15. La composición de la reivindicación 9, comprendiendo 10^{8} a 10^{13} células de la cepa de bacterias por gramo de composición.

16. La composición de la reivindicación 9, comprendiendo además lactulosa.

17. La composición de la reivindicación 9, comprendiendo además preparaciones basadas en ácidos biliares seleccionados del ácido ursodesoxicólico y el ácido tauroursodesoxicólico.

\newpage

18. Uso de al menos una cepa de bacterias gram-positivas, según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, para preparar una composición farmacéutica para prevenir y tratar enfermedades causadas por asociadas con un metabolismo alterado de los ácidos biliares.

19. El uso de la reivindicación 18, en que la cepa de bacterias es Streptococcus faecium SF 3 depositado en la CNCM -Collection Nationale de Cultures de Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo el número de entrada I-1671.

20. El uso de la reivindicación 18, en que la cepa de bacterias es Lactobacillus bulgaricus LB 1 depositada en la CNCM -Collection Nationale de Cultures de Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo el número de entrada I-1664.

21. El uso de la reivindicación 18, en que la cepa de bacterias es Lactobacillus bulgaricus LB 3 depositada en la CNCM -Collection Nationale de Cultures de Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo el número de entrada I-1665.

22. El uso de la reivindicación 18, en que la cepa de bacterias es Lactobacillus bulgaricus LB 7 depositada en la CNCM -Collection Nationale de Cultures de Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo el número de entrada I-1666.

23. El uso de la reivindicación 18, en que la cepa de bacterias es Lactobacillus bulgaricus LB 77 depositada en la CNCM -Collection Nationale de Cultures de Microorganismes- Instituto Pasteur, bajo el número de entrada I-1667.