JP4056088B2 - 多座イミン類およびそれらの金属錯体類 - Google Patents

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Description

本発明は、金属のイオン類、特にガドリニウム、サマリウムまたはイッテルビウムのようなランタン系金属ならびにイットリウムのような類似の化学現象を示すことが知られている金属類、さらに主族（main group）金属であるインジウムおよびガリウムのような金属のイオン類を錯体化する新規なリガンドに関する。
式：
Figure 0004056088
のイミンおよびカルボキシレートドナーを有するα−イミンカルボン酸は、単一金属中心に５−員のキレート環（すなわち、単核金属錯体）を形成する金属イオンのための二座リガンドとして機能することが知られている。金属錯体は、遷移金属であるモリブデン、鉄、ルテニウム、コバルト、ロジウム、イリジウム、銅、パラジウムおよび白金とさらに主族金属のアルミニウムおよび亜鉛で調製されてきた［M.Yamaguchi等Inorg.Chem.,35,143（1996）］。
四座Ｎ2Ｏ2ジイミンジカルボン酸類似体が調製され、これは単一金属中心をキレート化するのと対照的に、コバルトまたはイリジウムの二核金属錯体を形成する二個の遷移金属中心を橋かけすることが示されている［K.Severin等,Z.Naturfbrsch.B,50,265,（1995）］。
Figure 0004056088
M=Co,Ir
リンカー＝-CH2CH2-またはp-フェニレン
多座シッフ塩基リガンドおよびそれらのランタニド金属との錯体は公知である。例えば、Orvig等［Inorg.Chem.,27,3929（1988）］は七座Ｎ4Ｏ3リガンドを潜在的に調製し、それらのランタニド金属との金属錯体を研究した。
Figure 0004056088
リガンドがＮ4Ｏ3七座ドナーとして作用する式Ｌｎ（リガンド）のＨ3hatren、Ｈ3datrenのおよびＨ3tracのランタニド（Ｌｎ）錯体は不安定であることが判明しており、配位されたドナー原子の加水分解または溶媒置換により容易な分解を受ける。Orvig等は中性イッテルビウム錯体Yb（trac）のＸ線結晶構造を後に報告した［J.Am.Chem.Soc.,113,2528（1991）］。この七座錯体は、厳密な無水条件下でのみ明白に特性化できる。水の存在下におけるこれらの錯体の急激な加水分解により、Orvig等はこの種のランタニド錯体は非常に不安定なのでMRIコントラスト剤として有用ではないという結論に導いた。次の研究は、ソルボリシスの容易性がイミン結合の存在に帰するので、Ｃ＝Ｎイミン結合の代わりに飽和したＣＨ−ＮＨ結合をもつ類似のリガンド系を開発することに焦点を当てた。
インビトロおよびインビボの双方で加水分解的開裂を受ける放射性金属（99mTc）配位イミンの可能性は以前に注目されていた［G.F.Morgan等,J.Nucl.Med.,32,500（1991）］。研究したリガンドは四座Ｎ3ＯリガンドＭＲＰ２０だった。
Figure 0004056088
今、イミンＣ＝Ｎ結合を組み入れる新規な種類の三脚（tripodal）キレート剤が、中性のｐＨにおいて水の存在下で比較的安定なランタニド錯体およびその他の金属との錯体を形成することが見出された。
第一局面において、本発明は式：
Figure 0004056088
［式中、ＡはＮ、ＣＲ1、Ｐ、Ｐ＝Ｏ、シス、シス、シス−１，３，５−三置換−シクロヘキサンまたはＮ，Ｎ’，Ｎ”−三置換−トリアザ９〜１４員マクロ環状環であり；Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3はリンカー基であり、Ｃ1〜4アルキレン、Ｃ4〜6シクロアルキレンまたはＣ4〜6ｏ−アリーレンから独立して選択され；Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3は−ＮＨ2、−B（=O）OZ、−N=CR−B（=O）OZ、−NR−CR2−B（=O）OZ、−N［CR2−B（=O）Q］2および−O−CR2−B（=O）OZ（式中、BはCまたはPR2であり、Qは独立して−OZまたは−NR2であり、そしてZはHまたは対イオンである。）から独立して選択され；各RおよびR1基はH、C1〜5アルキル、C1〜5アルコキシアルキル、C1〜5ヒドロキシアルキル、C1〜5アミノアルキル、C5〜10アリールまたはC1〜6フルオロアルキルから独立して選択され；R2はOH、C1〜6アルキル、C1〜6アルコキシアルキル、C1〜6フルオロアルキル、C1〜10アルコキシまたはC5〜10アリールである；但し、Ｙ1、Ｙ2およびＹ3のうちの少なくとも１個は−N=CR−B（=O）OZである。］を有するリガンドを提供する。
Ａは好ましくはＮまたはCR1であり、Ｌ1、Ｌ2およびＬ3は好ましくはC1〜3アルキレン、最も好ましくはC1〜2アルキレンである。Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−三置換−トリアザ９〜１４員マクロ環状環は好ましくは９〜１２員環であり、最も好ましくは１，４，７−三置換−１，４，７−トリアザシクロノナンである。ランタニド金属類およびイットリウムの場合、Ｙ1、Ｙ2およびＹ3は好ましくは−O−CR2−B（=O）OZ、−N［CR2−B（=O）Q］2および−N=CR−B（=O）OZから選択される。最も好適なリガンドは、ＡがＮであり、Ｌ1、Ｌ2およびＬ3がすべて−CH2CH2−であり、BがCである。好ましくはZはHまたはアルカリ金属またはC1〜10テトラアルキルもしくはテトラアリールアンモニウムまたはホスホニウムイオンである。
本発明のリガンドは、ランタニド金属類もしくはイットリウムのような同様の化学現象もつ金属から適切に選択されるか、またはその他適切に選択されるインジウムおよびガリウムのような主族金属の金属錯体を調製するのに使用できる。金属イオンが常磁性または放射性であるとき、当該金属錯体は、特にヒトのインビボ診断映像のために使用できる。したがって、常磁性金属錯体はMRIコントラスト剤として有用であり、放射性金属錯体はインビボ映像または放射線療法のための放射性医薬品として有用である。当該金属錯体は、金属原子がＸ線に対して不伝導性、すなわち放射線不透過性であるという事実を使用するＸ線コントラスト剤としてインビボ診断映像のためにも有用であり得る。
ＡがＮであり、Ｌ1、Ｌ2、およびＬ3の各々がエチレンでありそしてＹ1、Ｙ2およびＹ3の各々が−N=CR−C（=O）OZであるとき、金属錯体は式（１）：
Figure 0004056088
を有し得る。
本発明の金属錯体は、同じかまたは異なることのできる１個またはそれ以上の金属イオンを含むことができる。多核錯体は利点のある特性を有し得る。例えば、一定の金属クラスターは超常磁性特性を有し、それ故、MRIコントラスト剤として特に有用である。本発明の金属錯体は１〜６個の金属原子を有し得る。MRIまたはＸ線コントラスト用途のために、錯体は、好ましくは１〜４個の金属原子を有する。放射性医薬品用途のためには、錯体は、好ましくは単一金属原子を有する。すなわち、単核である。金属錯体の金属が放射性金属であるとき、それはポジトロンエミッター（例えば、68Ga、132La、150Tb、155Dyもしくは161Er）またはγ−エミッター（例えば、111In、113mInもしくは67Ga）のいずれかであることができる。MRIに使用するための適切な金属イオンは、常磁性ランタニド金属イオンであるガドリニウム（III）、サマリウム（III）、エルビウム（III）、テルビウム（III）、イッテルビウム（III）、ジスポロシウム（III）、ホルミウム（III）、ネオジム（III）およびプラセオジム（III）がある。好適な常磁性金属イオンはガドリニウム（III）およびサマリウム（III）である。診断映像のために最も好適な放射性金属はγ−エミッター、特に111In、113mInおよび67Gaである。一定のα−エミッターまたはβ−エミッター放射性核種の金属錯体は、ガンのような種々の疾病の放射線療法のための放射性医薬品として有用であり得る。β−エミッターは、90Y、114In、115mIn、140La、149Pm、153Sm、159Gd、161Tb、165Dy、166Ho、169Er、175Ybおよび177Luから適切に選択され得る。放射線療法用途のために好適なβ−エミッターは、90Y、153Sm、159Gd、165Dy、169Er、166Ho、175Ybおよび177Luである。放射線療法のために最も好適なβ−エミッターは、90Y、153Smおよび166Hoである。Ｘ線コントラスト映像のために適切な金属には、ガドリニウム、ジスポロジウム、ホルミウムおよびプラセオジムがある。本発明のリガンドは鉱石から金属を抽出するのにも使用できる。ランタニドおよび関連金属についてのリガンドの親和力は選択的錯体形成の基礎を提供する。抽出しようとする金属（単独または複数）は中性またはアルカリ性条件下で錯体化されることができ、必要に応じ、分離・精製し、次いで、金属錯体の酸−選択性を使用して、酸性条件下でリガンドが除かれる（下記参照）。
本発明のリガンドは、式R（C=O）B（=O）OZのα−ケト酸と式A（L1Y1）（L2Y2）（L3Y3）（ここで、Y1、Y2およびY3のうちの少なくとも１個は有機溶媒中でNH2である）の適切なモノ−、ジ−もしくはトリ−一級アミンとの縮合により調製され得る。生成した水は、場合により、例えば、ベンゼン中で共沸蒸留または乾燥剤の添加によりその場で除去され得る。次いで、単離したリガンドを関心の金属イオンを用いて第２工程で反応させて所望の金属錯体を得ることができる。または、関心の金属イオンの存在下で上記の縮合反応を都合良く行うことができ、この場合、金属錯体は一工程処理でその場で直接形成する（いわゆる、金属テンプレート合成：metal template synthesis）。このようにして金属錯体を調製する場合、遊離リガンドは、問題の金属に対してより積極的な競合性リガンドを使用して当該金属から元のリガンドを置換することにより得ることができる（すなわち、トランキレーション）。この置換性リガンドは、クラウンエーテル、多座マクロ環状リガンド、例えば、ＤＯＴＡもしくはシアン化物、スルフィド（硫化水素で処理することにより）またはその他の当業者に適切な公知の置換性リガンドから適当に選択され得る。
金属イオンの電荷およびリガンドのイオン化の程度に依存して、本発明の金属錯体は荷電したまたは中性（すなわち、非イオン性）のいずれかであることができる。中性金属錯体は、錯体上の電荷の不存在が、当該錯体が過度に親水性置換基を有しないなら、細胞膜や血液脳関門のような脂質膜を通過するのに足る脂肪親和性であるということを意味するので好ましい。したがって、このような錯体は、脳または脊髄映像に特に有用である。中性の脂肪親和性の金属錯体は細胞膜を通過することもでき、それ故、診断映像のための血液細胞標識化や放射線滑膜切除のような相互空洞形成療法ならびに脳映像を含むその他のある範囲の用途に有用であり得る。置換基Ｒ、Ｒ1およびＲ2を適切に変化させることにより所望の生体内分布特性を最適化するために金属錯体の脂質親和性を調整することができる。
本発明の金属錯体は、中性条件（ｐＨ７．０±０．５）またはアルカリ条件（ｐＨ８．０〜１４）に比較してより低いｐＨ（例えば、ｐＨ４〜５．５）においてより速い加水分解を受けることが見出されている。NMRの検討によると、加水分解が対応するアルデヒドまたはケトンの発生と同時に金属に配位したＣ＝Ｎイミン結合の不可逆的開裂をもたらすことが示されている。２個以上の配位イミン結合が存在する場合、加水分解は、段階的な方式で、第１のイミン結合加水分解よりもより速い第２および第３イミン結合の加水分解が起こると思われる。金属加水分解生成物はリガンド中のイミン結合の数と金属の種類とに依存する。１または２個しかイミン結合がない場合、生成物は部分的に加水分解されたリガンドの金属錯体であることが予期される。ランタニドアミン錯体は水性溶液中で不安定であり、それ故、３個のイミン結合を持つランタニドおよび同様の金属錯体については、最終生成物は遊離（すなわち、錯体化されていない）金属イオンであると思われる。
生物系の選択される領域ではｐＨがより低いことがある。これらの領域には、ｐＨが４．５である多形核白血球（PMN）のリソソーム；炎症性滑液（リソソーム酵素に富んでいる）；慢性低酸素領域（標準の組織よりもｐＨが０．６〜０．８単位低いことがあり、時々ｐＨ５．８程度の低さ）または腫瘍のようなその他の脈管形成部位、炎症もしくは血栓部位等がある。これは、金属錯体が生物系においてより低いｐＨの領域に金属イオンを選択的に送達するのに有用であり得ることを意味する。したがって、金属錯体は、より低いｐＨの部位に関心の金属イオンを運搬し、そこで比較的速い加水分解が金属イオンの選択的トラップまたは放出をもたらすであろう。錯体化されていない金属イオンまたは配位イミン結合の加水分解からもたらされる親水性がより高い金属錯体は細胞膜を一層通過しにくくなり、それ故、関心の低ｐＨ領域において限局化されることになるであろう。もっと中性（典型的にはｐＨ７．０〜７．４）の哺乳類の体（またはその他の生物系）のその他の領域において、金属錯体は殆どが無傷のままであり、それ故、金属イオンは遊離したままであり、濃度勾配方向に移動し、クリアランスを受ける。この選択的な目標化はインビボでの診断映像または放射線療法のいずれかのために放射性金属の選択的放出に有用であることができる。PMNのリソソームのｐＨが比較的低い（約ｐＨ４．５）ことが知られているので、本発明の金属錯体はPMN細胞膜を通過でき、リソソーム中のより低いｐＨ環境中で比較的速い加水分解を受ける。これは、その他の血液細胞（特に、大部分の血液細胞を形成する赤血球）がリソソームを有しないので、その他の血液細胞の存在下でPMN細胞を選択的に標識する方法を提供できる。白血球はインビボの感染または炎症部位で濃縮することが知られているので、標識したPMN細胞は感染または炎症の診断映像のために使用できる。PMN細胞の標識化はインビトロでの細胞調製または全血液試料のいずれかで行うことができ、あるいは、金属錯体の静脈内投与に続いて、インビボで血流中において直接細胞の標識化を充分に選択ができる。
選択的低ｐＨ金属送達のための好適なキレート剤はα−イミノカルボキシレート誘導体である。何故なら、この種のリガンドの金属錯体が約ｐＨ５未満で加水分解速度の顕著な上昇を示すからである。カルボン酸のｐＫａは、ｐＨの範囲が４〜５において最初のプロトン付加の部位が配位されたカルボキシレート置換基であるようなものであると思われる。これは、金属−配位Ｙ基が水や遊離ピルビン酸のような競合性ドナー基により置換されるという効果のために、配位されたＹ基の金属ドナー能力を弱める。次いで、配位されていないイミンの加水分解が続く。Ｒ基の変動が加水分解速度に大きく影響を与え得ることも見いだされた（実施例８および９参照）。Ｒ＝ＭｅおよびＥｔ誘導体は、双方とも、中性のｐＨ条件で有利に遅い加水分解速度を与えるが、Ｒ＝Ｅｔについて、Ｒ＝Ｍｅのときよりも加水分解はわずかに速く進行することが見いだされた。グリコレート（Ｒ＝Ｈ）誘導体は、緩衝化されていない（中性）溶液中において３分未満で完全な加水分解を受け、ＮＭＲスペクトルをとるのに十分でないほど速く加水分解することが判明した。Ｒ＝ｉ−Ｐｒのとき、加水分解速度に著しい増加がある。これは、多分、アーム間の立体的反発のためであろう。これにより、Ｒ基を変化させることにより、本発明の金属錯体の加水分解速度についての制御が達成できることが示される。この情報を使用して、所望の用途に当該金属錯体の特性を調整できる。
加水分解（および多分加水分解速度）に対する感受性も、いかに多くのＹ1、Ｙ2およびＹ3基が−N=CR−B（=O）OZであるかに依存して調節できるものと考えられる。配位イミン結合の数が多いほど、加水分解の予想される容易性が高い。式（１）のランタニド（III）［Ln（III）］錯体が完全な加水分解を受けるとき、最終生成物は遊離水和ランタニド金属（III）イオンである。MRIコントラスト剤用途に必要なヒトの投与量では、遊離ランタニド（III）イオンはインビボで毒性作用を示す。しかし、本発明は、Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3部分のうちわずか一または二個のみがイミン結合を含有する場合のリガンドも提供する。イミンを含有しないＹ基は加水分解を受けると予期されず、故に、このような基は、イミン結合を含有しないＹ基（１個またはそれ以上）が加水分解されるとき、残留金属キレート化能力のための手段を提供する。したがって、例えば、錯体５（図式５）は、加水分解されたリガンドが八座であるので、加水分解に続いてランタニド金属（III）イオンを保持すると期待され得る。したがって、有意なヒト投与量が含まれる場合のMRIおよびその他の用途のためには、ランタニド金属錯体がわずか１個または２個のみしかイミン結合を有しないことが好ましく、最も好ましくは１個しかイミン結合を有しない。さらに、錯体５は水分子の配位のための配位部位を与えず、したがって、比較的に弱いMRI強化を与えることが期待される。しかし、低いｐＨの領域では、金属錯体５は加水分解し、リガンドにより与えられる減少数のドナー部位を有する生成物を与え、それ故、水分子の配位をもたらす。生成物錯体は、したがって、かなり多くのMRI強化特性を示すことが予期される。これらの特性は、人体内の低いｐＨ領域に対するMRI強化の選択的送達および場合により、トラップの可能性を許容する。
本発明の金属錯体がヒトの用途のために意図されるとき、当該錯体は経口、髄腔内または（好ましくは）静脈内のいずれかで投与されることができる。滑液に対する本剤の投与の特殊なケースでは、熟達した医者により、滑液中（関節内注入）に本剤を直接注入できる。ヒト用途のこのような薬剤は、場合により、予充填済み滅菌注射器中の単位投与形態で供給される。金属が放射性金属の場合、予充填済み注射器は作業者を放射線量から保護する注射器シールドを備えている。金属錯体は、キットの形態でも供給され得る。キットは、好ましくは、滅菌され、リガンドまたは典型的には凍結乾燥形態のリガンドのその場製造のための試薬のいずれかを含有する。このキットは関心の金属イオンで再構成され所望の金属錯体を与える。これらのキットまたは予充填注射器は、場合により、緩衝剤、薬学的に許容できる可溶化剤（例えば、シクロデキストリン、プルロニック、ツイーンのような界面活性剤または燐脂質）、薬学的に許容できる安定剤もしくは抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、ゲンチシン酸もしくはパラアミノ安息香酸）または塩化ナトリウムもしくはマンニトールのような凍結乾燥用の増量剤（bulking agent）のような別の成分を含有できる。
下記の実施例は本発明を例証する。実施例１および４〜６は本発明のリガンドの合成を与える。実施例２は種々の置換基（Ｒ）を持つイットリウム錯体の製造法を与える。実施例３はインジウム錯体の合成を与える。実施例７は不斉リガンドおよびその金属錯体の合成を与える。実施例８および９は異なるｐＨ値における加水分解の速度差の証拠を与え、その速度がリポソームの存在により本質的に影響を受けないことを示す。実施例１０は、金属錯体がリポソームを浸透できる（すなわち、生体膜を通過できる適切な性質を有する）ことを示す。実施例１０は、リポソーム内にトラップされた金属の量がｐＨが低くなるにつれて増加することも示す。実施例１１は、金属錯体が有用なMRI緩和特性（relaxivity properties）を有することを示す。これらの実施例は、本発明の金属錯体が水溶性であり、脂質膜を通過でき、血液や細胞質中に見いだされるような中性ｐＨよりもリソソームの内部に関連する酸性ｐＨにおいてイットリウム（III）がより速く放出することを示す。これらの結果は、リソソームの細胞のようなより低いｐＨである生物系の領域へ金属イオンの選択的送達およびトラップに対してこれらの錯体が潜在的利用性を有することを示す。
図１は、（２−アミノエチル）ビス（３−アザ−４−カルボキシ−３−ペンテニル）アミンのインジウム錯体のＸ線結晶構造を示す。
図２は、トリス（３−アザ−４−カルボキシ−３−ペンテニル）アミンのサマリウム錯体のＸ線結晶構造を示す。
図３は、Ａが１，４，７−トリアザシクロノナンである場合のリガンドのイットリウム錯体のＸ線結晶構造を示す。
実施例１：トリス（３−アザ−４−カルボキシ−３−ペンテニル）アミンの合成
ピルビン酸ナトリウムを室温においてメタノール中で一部溶解した。トリス（２−アミノエチル）アミン（tren、０．３３当量）を加え、得られた混合物を２時間還流し、淡黄色の溶液を得た。この溶液を冷却し、過剰のエーテルを加えると、白色沈殿としてトリス（３−アザ−４−カルボキシ−３−ペンテニル）アミンを得た。
1H NMR（d4-MeOH）:δ3.48（t,2H）,2.82および2.76（双方ともt,2H）,2.08および2.04（双方ともs,3H）ppm（シスおよびトランス異性体の混合物）
実施例２：トリス（３−アザ−４−カルボキシ−３−ペンテニル）アミンのランタニド（Ln）錯体および類似体の合成
方法Ａ
ピルビン酸ナトリウム（３３０ｍｇ、３ミリモル）を室温においてメタノール（４０ｃｍ3）中で一部溶解した。得られた溶液を撹拌し、１ミリモルの適切な金属（III）塩化物を加え、次いで、トリス（２−アミノエチル）アミン（tren、１４６ｍｇ、１ミリモル）をゆっくりと（１分間）加えた。trenを加えている間、時々Ln（OH）3の沈殿が形成するが、これは常に素速く再溶解した。次いで、得られた無色の澄明溶液を２時間加熱して還流した。次いで、この溶液を冷却し、過剰のEt2O（２５０ｃｍ3）を加え、白色沈殿を得た。これを重力下で濾過した。得られた沈殿を、濾過して痕跡のメタノールを除きながら、さらにEt2O（１００ｃｍ3）で洗浄した。得られた白色固体を減圧下で乾燥した。マイクロピペット中に形成したSephadex LH-20カラムにより前記生成物のメタノール濃縮溶液を溶離し、重力下で溶液を通過させることによりNaCl不純物の除去を行った。錯体−NaCl混合物の収率は以下の通りであった。
Figure 0004056088
Ｙ（III）錯体：1H NMR（D2O、緩衝化していない）δ=3.19（t,2H）,3.80（t,2H）,2.05（s,3H）；エレクトロスプレーマススペクトル（H2O）m/z 1769=［｛Y（L1）｝4+H］+，1327=［｛Y（L1）｝3+H］+，885=［｛Y（L1）｝2+H］+，443=［Y（L1）+H］+；IR（KBrディスク）1625vs,1368s（br）,1202s
R=H,Et,i-PrおよびPhに相当するリガンドの対応Ｙ（III）錯体類似体（図式１参照）を適切なａ−ケトンカルボキシレートナトリウム塩を使用して同じ方法を使用して合成した。D2O中の特定したリガンドのＹ（III）錯体についての1H NMRデータを以下に示す。
R=Et、トリス（３−アザ−４−カルボキシ−３−ヘキセニル）アミン：（pH=7.0緩衝化した）、δ=3.61（t,2H）,2.96（t,2H）,2.30（q,2H）,0,76（t,3H）ppm
R=i-Pr、トリス（３−アザ−４−カルボキシ−５−メチル−３−ヘキセニル）アミン：（pH=7.0緩衝化した）、δ=3.64（t,2H）,2.97（t,2H）,2.84（septet,1H）,O.99（d,6H）ppm
R=Ph、トリス（３−アザ−４−カルボキシ−４−フェニル−３−ブテニル）アミン：（緩衝下していない）、δ=7.46（m,3H）,7.27（m,2H）,3.78（br s,2H）,2.99（br s,3H）ppm
方法Ｂ
実施例１から単離したリガンドを実施例２の金属とメタノール中で反応させ、上記方法Ａで記載したのと同じ金属錯体を殆ど定量的収率で得た。Ｓｍ（III）錯体のＸ線結晶構造を図２に示す。
実施例３：（２−アミノエチル）ビス（３−アザ−４−カルボキシ−３−ペンテニル）アミンのインジウム錯体の製造
InCl3、trenおよびピルビン酸ナトリウムを使用して実施例２の方法にしたがった。
Et2Oを添加しないでインジウム（III）金属錯体を結晶化させ、収率は７２％だった。In（III）錯体のＸ線結晶構造は、三本のtrenアームの内の二本のみがシッフ塩基縮合を受けたことを示す（図１参照）。
1H NMR（D2O，緩衝化していない）：δ=3.79（m,2H）,3.24（m,2H）,2.88（m,1H）,2.81（m,1H）,2.28（s,3H）；IR（KBrディスク）1637vs,1361s,1200s
実施例４：トリス（２−アミノプロピル）アミン［C3-tren］の合成
これはこの三脚アミンの新規な合成である（図式２参照）。
（ｉ）トリス（２−シアノエチル）アミンの合成
撹拌下、３０℃の２８％アンモニア水溶液（６１ｇ，１モル）に、滴下するとその時第２相が僅かしか存在しないかまたは全く存在しないような速度で、アクリロニトリル（１１０ｇ，２モル）を滴加した。２時間３０℃で撹拌を継続し、次いで、水（３５０ｃｍ3）およびさらにアクリロニトリル（１１０ｇ，２モル）を加えた。得られた混合物を５２時間７５℃で撹拌した。次いで、水および過剰のアクリロニトリルを減圧下で除去した。残留液体を放置して結晶化させた。熱エタノールから再結晶をし、無色透明の針状結晶を得た。収率：７３％
13C NMR（D2O）δ=121.14（-CN）,48.80（CH2-CN）,16.71（N-CH2-）ppm
（ii）トリス（２−アミノプロピル）アミンの合成
トリス（２−シアノエチル）アミン（２．８０ｇ，１５．９ミリモル）をBH3.THF中に溶解させ、窒素雰囲気下４８時間還流した。この溶液にメタノール（約２０ｃｍ3）を激しく撹拌しながら、もはやガスが発生しなくなるまで滴加した。得られた溶液を真空下で蒸発させて乾燥し、得られた白色沈殿を６Ｍ塩酸（２５０ｃｍ3）中で溶液が澄明になるまで還流した。減圧下で塩酸を除去し、得られた固体を最低量の水に溶解させた。この溶液を２分割した。各部を塩基性イオン交換カラム（DOWEXイオン交換樹脂、２０〜５０メッシュ）に付し、アミンを水中（約２５０ｃｍ3）に溶離した。減圧下、水を除去し澄明な油状物としてトリス（３−アミノプロピル）アミン（１．７８ｇ，５９％）を得た。
1H NMR：（CDCl3）δ=2.71（6H,t,N（CH2CH2CH 2NH2）3,2.44（6H,t,N（CH 2CH2CH2NH2）3,1.57（6H,q,N（CH2CH 2CH2NH2）3,1.36（6H,br,N（CH2CH2CH2NH 2）3
実施例５：リン含有リガンドの合成
ＢがＰのとき、アシルホスホネート塩よりリガンドを調製できる（図式１参照）。要求されるアシルホスホネートはKaraman等の方法［R.Karaman,A.Goldblum,E.Breuer,H.Leader,J.Chem.Soc.Perkin Trans.1,1989,765-774］により調製できる。例えば、トリメチルホスファイトと適切に選択した酸クロリドRCOClとの５℃における反応により、高収率でジメチルアシルホスホネートを得る。ジメチルアシルホスホネートとヨウ化ナトリウムとの乾燥アセトン中（または乾燥MeCN中LiBr）の反応により、高収率でメチルアシルホスホネート一塩を得る。次いで、３当量のメチルアシルホスホネート一塩と１当量のトリス（２−アミノエチル）アミンおよび１当量の選択した金属とをメタノール中２時間還流下で反応させることにより金属トリ−イミノ−トリ−ホスホネート錯体を形成する。次いで、エーテルを添加して得られた生成物を沈殿化し、Sephadex LH-20カラム中で溶離させることにより精製することができる。
実施例６：［9］aneＮ3に基づくマクロ環状イミノカルボキシレート錯体の合成
（ｉ）１，４，７−トリス（シアノメチル）−１，４，７−トリチザシクロノナンの合成
［9］aneＮ3.3HBr（３．０ｇ、８．０７ミリモル）、クロロアセトニトリル（１．９ｇ、２５．２ミリモル）、およびトリエチルアミン（１０ｇ、０．０９９モル）を１５０ｃｍ3のエタノール中で窒素雰囲気下２４時間還流した。冷却後、ロータリーエバポレーターにより溶媒を除去し、赤色油状物を得、これをCHCl3（１００ｃｍ3）に溶解させ、水洗（３×１００ｃｍ3）した。有機相を集め、MgSO4で乾燥させ、濾過し、ロータリーエバポレーターにより乾燥させた。得られた黄色油状物を真空下乾燥させ、淡黄色の固体を得た（１．０５２ｇ、４．２７ミリモル）。収率：５３％
1H NMR:（CDCl3）δ=2.855（12H,s,-NCH2-）,3.594（6H,s,NCH2CN）ppm
13C NMR:（CDCl3）δ=54.12（NCH2）,46.49（NCH2CN）,116.14（CN）ppm
（ii）１，４，７−トリス（アミノエチル）−１，４，７−トリアザシクロノナンの合成
１，４，７−トリス（シアノメチル）−１，４，７−トリアザシクロノナン（０．３２０ｇ、１．２３ミリモル）およびTHF（４０ｃｍ3）中のBH3.THF 1M溶液を窒素雰囲気下４８時間還流した。冷却後、水（５ｃｍ3）を加えることにより過剰のボランを破壊し、次いで、得られた容器を真空下乾燥した。得られた白色固体を５０ｃｍ3のHCl 7M中に溶解させ、還流下４０時間加熱した。冷却後、得られた溶液を真空下で乾燥させ、白色固体を得た。この固体を最低量の水に溶解させ、1M水酸化ナトリウム溶液で活性化させたDOw6x 1×8-200カラム（１０ｇ）中に得られた溶液を通した。減圧下で溶媒を除去し、無色の油状物を得た（０．２７０ｇ、１．０４５ミリモル）。収率：８５％
1H NMR：（CDCl3）δ=2.76（12H,s,NCH 2 ）,2.75,2.59（12H,dt,CH 2CH 2N）,1.63（6H,ブロード,NH 2）ppm。13C NMR:（CDCl3）δ=56.90（NCH2）,62.21（NCH2CH2NH2）,40-26（NCH2 CH2NH2）ppm
（iii）Ln（III）錯体［Ln（L）］（Ln=Y,Sm,La,Yb）の合成
Ｙ（III）錯体の合成は典型的である。すなわち、
１，４，７−トリス（アミノエチル）−１，４，７−トリアザシクロノナン（３９．８ｍｇ、０．１５４ミリモル）、ピルビン酸ナトリウム（５０．９ｍｇ、０．４６２ミリモル）および硝酸イットリウム（５６．２ｍｇ、０．１５４ミリモル）を２時間メタノール中（３０ｃｍ3）で加熱して還流した。冷却後、溶媒量を減少させ、ジエチルエーテルを加えると、淡黄色固体を得た。この固体を濾過して除き、真空下で乾燥させた。LH-20 Sephadexカラム中に得られた固体の濃縮メタノール性溶液を通過させることによりイットリウム錯体から硝酸ナトリウムを除去した。ジエチルエーテルを加えて、白色固体を得た（６１．２ｍｇ、０．１１ミリモル）。収率：７１．４％。室温で錯体のメタノール溶液中にジエチルエーテル蒸気を拡散させることによりＸ線分析に適した単結晶を得た。
マススペクトル（エレクトロスプレー）m/z=577（M+［C21H33N6O6Y+Na+］）
13C NMR：（CD3OD）δ=53.72（NCH2）,60.31（NCH2CH2N）,60.17（NCH2 CH2N）,172.68（N=C）,17.15（CH3）,173.76（CO2）ppm
Ln=Y,Sm,La,Ybの錯体についてこの手順を成功裡に完了し、そのすべてが単結晶Ｘ線回折を特徴とした。これらの構造はすべての錯体が異性体構造であり、Ln中心に９配位が観察された（図３）。その他のランタニド金属イオンは、同様な方式でこれらのマクロ環状イミノカルボキシレートリガンドに結合することが期待できる。
実施例７：不斉錯体の合成および応用
図式５はこのような不斉三脚リガンドがどうしたら合成できるか例証する。
（ｉ）１の合成
乾燥THF（５０ｃｍ3）中にBOC-ON（４．９２ｇ、２０ミリモル）を溶解した。この溶液を３０分にわたって急速撹拌下のトリス（２−アミノエチル）アミン（２．９２ｇ、２０ミリモル）の０℃乾燥THF（３００ｃｍ3）溶液に滴加した。得られた反応混合物を２７３Ｋで４時間撹拌した。減圧下、溶媒を除去すると、濃厚な黄色油状物が残った。この油状物を沸騰エーテル中に再溶解させ、１０時間冷却し、第２の黄色油状物が分離し、これを廃棄した。減圧下、上澄み溶液から溶媒を除去し、第３の黄色油状物（impure 1）を得た。収率：６７％
1H NMR：（CDCl3）δ=7.75および7.40（m,BOC-ONから誘導された芳香族不純物），5.20（1H,Br,NHBOC）,4.55（2H,br,NH2）,3.19（2H,m,CH 2NHBOC）,2.81（4H,t,CH 2CH2）,2.59（6H,m,NCH2CH2）,1.44（9H,d,BOC基上のCH3）ppm
二重保護誘導体N（CH2CH2NH2）（CH2CH2NHBOC）2を同じ方法を使用して合成できたが、しかし、２当量のBOC-ONを使用した。
（ii）４の合成
CHCl3（５０ｃｍ3）中の２−ブロモエチルアセテート（７．０１ｇ、４２ミリモル）の溶液にトリス（２−アミノエチル）アミン（１．０２ｇ、７．０ミリモル）を加えた。得られた混合物を室温で２時間撹拌し、白色沈殿を与えた。この反応混合物を濾過した。1H NMR分析により、白色沈殿が水素添加trenの臭化物塩であることが明らかになった。減圧下、濾液から溶媒を除去し、褐色油状物を得た。真空下、６０℃で蒸留することにより未反応２−ブロモエチルアセテートを除去すると、残留濃厚油状物４が残った。収率：４１％
1H NMR：（CDCl3）δ=4.14（4H,q,-OCH 2CH3）,3.78（2H,t,NCH2CH 2）,3.58（4H,s,-CH2COO-）,3.27（2H,t,NCH 2CH2）,1.24（6H,t,-OCH2CH 3）
（iii）２および３の合成
上述した通りの４の合成方法を２の合成に使用するのにも適切に適合させることができる。H2O中のMeOH/6M HCl混合液中３６時間撹拌することによりリガンド２を脱保護化できる。次いで、減圧下、溶媒を除去する。次いで、得られる化合物をMeOHに溶解させ、１当量のLnCl3.6（H2O）および１当量の２−ケトカルボン酸のNa+塩を加える。次いで、この溶液にMeOH中のNaOHをちょうどアルカリ性になるまで加え、得られた溶液を２時間還流する。過剰のエーテルの添加により錯体３が沈殿し得る。
実施例８：加水分解速度の検討
実施例２のＹ（III）、R=Me錯体の試料２０ｍｇをイミダゾール緩衝剤（ｐＨ＝７．０）を含有するD2O中に溶解させ、室温に放置した。この溶液の1H NMRスペクトルを２日にわたって一定時間間隔（ｔ時間）で測定した（図式６参照）。この時間の間、2.91ppm（A）および3.51ppm（B）に三重項ピークの強度が減少し、2.63ppm（C）および2.92ppm（D）に新たなピークが出現し、これは錯体の加水分解が起こり水素添加trenを得たことと一致する。これらのピークの相対積分を取ると、時間の関数として解離をモニターできる。この実験を酢酸／酢酸カリウム緩衝剤（ｐＨ＝４．７）で繰り返した。
Figure 0004056088
このデーターにより、試料の総加水分解が数時間で終了するとき、リガンドの分解およびそれに続くイットリウムイオンの放出はｐＨの値が低いとき最も早く起こることが示されている。中性のｐＨで錯体はもっと長く保持され、２１時間後まだ分解が完全でない。リポソームの存在下でこれらと殆ど同じ速度で錯体の加水分解が観察された。
R=Meの別の例としてR=Etまたはi-Prで実験を繰り返し、次の結果を得た。
Figure 0004056088
実施例９：トリス（3-アザ-4-カルボキシ-4-フェニル-3-ブテニル）アミン（R=Phの場合の式（1）、）のY（III）錯体の加水分解
d4-MeOH（０．１ｃｍ3）中にY（III）（R=Ph）錯体／NaCl（７ｍｇ）を溶解させた。等モル量のY（III）（R=Me）錯体／NaClもd4-MeOH（０．１ｃｍ3）中に溶解させた。次いで、両試料をNMR管に入れ、イミダゾールｐＨ=７．０緩衝剤を含有するD2O（０．４８ｃｍ3）を同時に各試料に加えた。錯体の加水分解をモニターするために２日間にわたって一定の時間間隔で双方の試料のNMRスペクトルを取った。２日間中２試料の温度を２９３Ｋに維持した。下記の表に結果を要約する。
Figure 0004056088
R=Me誘導体に比較してR=Ph誘導体の方が速く加水分解されることが分かる。これは、R=Phのとき三脚アーム間の追加の立体混雑によるものである。
少量のd4-MeOHはD2O中の［R=Ph］.3NaClの溶解を助け、加水分解速度を有意には変化させない。残念なことに、R=Me、Etおよびi-Pr誘導体について既に得られたデータと直接比較できる大量の［R=Ph］.3NaClを溶解させることがまだできない。しかし、R=Me誘導体と比較することにより、R=Ph誘導体の加水分解速度はR=Et誘導体とi-Pr誘導体との間にあることが明かである。したがって、相対加水分解速度は、
H>>i-Pr>Ph>Et>Meである。
実施例１０：脂質膜透過性の検討
（ａ）リポソームの製造
Fry等の方法［D.W.Fry,C.White,D.J.Goldman,Anal.Biochem.,90,809（1978）］によりリポソームの１ｃｍ3試料を調製した。
例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリンC16:0（１３ｍｇ）、コレステロール（１ｍｇ）およびステアリルアミン（１ｍｇ）をガラス容器中に入れた。２個のガラスビーズを入れ、この容器を（ゴム製隔膜および金属製オーバーシール上をクリンプ止めして）封をした。上記の混合物を激しく撹拌し、澄明な無色の溶液を得た。この溶液を窒素ガス流下６０℃で蒸発させて乾燥し、容器の側部に白色固体（脂質）を得、これを、使用するまで封をした容器中に−２０℃で保存することができた。
（ｂ）ICPによるリポソーム透過性の検討
５０ｍｇのY（III）、R=Me錯体／NaCl混合物を、イミダゾール緩衝剤（ｐＨ＝７．０４）を含有する１ｃｍ3の脱ガス水中に溶解した。これを固体脂質（上述したとおりにして調製した）の入った容器に加えた。この混合物を、容器の側部にもはや脂質が付着しなくなるまで激しく撹拌し、形成した脂質が一定の寸法（顕微鏡で観察して）の球形のリポソームを形成し、次いで、錯体のいくらかを包み込む間の５分間超音波処理をした。次いで容器を正確に３時間室温に放置し、錯体の一部を加水分解させた。４本の１ｃｍ3注射器の胴部をガラスウールで栓をし、０、９％塩水中でSephadex G50を充填した。これらの注射器胴部を試験管中に吊し、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、その後、Sephadexの頂部は０．９ｃｍ3目盛まで下降し、注射器胴部の側部から離れた。次いで、これらのカラムを各々０．３ｃｍ3の脱ガスしたイミダゾール緩衝剤で洗浄し、再度、２分間２０００ｒｐｍで遠心分離をし、次いで、０．２５ｃｍ3のリポソームを各カラムに加え、２分間２０００ｒｐｍで遠心分離をした。これは、上澄みにある錯体を除去する作用があった一方、リポソーム内のリポソーム錯体はカラムを通過した。次いで、リポソームを１１０分間室温に放置し、内部錯体を拡散放出させた。この時間経過後、リポソームを別のSephadexカラム中を前記と同様通過させ、上澄みの錯体を除去した。次いで、リポソームに０．０５ｃｍ3のTriron X-100を加え、溶液が澄明になり、リポソームが分解されるまで試料を数時間放置した。この溶液を、１０％HNO3中１００ｃｍ3にし、ICPによりイットリウムについて分析した。酢酸塩ｐＨ＝４．９３およびｐＨ＝３．９１緩衝剤を用いてこの実験を繰り返し、ｐＨ＝３．９１緩衝剤中に錯体を一夜放置し総加水分解させたコントロールについても行った。
pH リポソーム中に検出されたイットリウム（ppm）
7.04（イミダゾール） 0.95
4.93（酢酸塩） 1.67
3.91（酢酸塩） 1.91
3.91（酢酸塩、コントロール） 4.93
中性ｐＨの場合、３時間加水分解後大部分イットリウムが錯体の形態であることが予期することができる一方、酸性ｐＨ値では、その時間経過後錯体は大部分加水分解されイットリウムが遊離する。コントロールの場合、錯体のすべてが加水分解され、１００％遊離三価のイットリウムカチオンを残す。これらの結果は、中性の錯体化されたイットリウムはリポソームから外に容易に拡散するが、遊離の荷電したイットリウムが内部にトラップされることを示す。
イミダゾールｐＨ＝７．０４緩衝剤中の２５０ｍｇの錯体を１０分間のみ加水分解のために放置した５ｃｍ3のリポソームを作成する、この実験のバリエーション実験を行った。上澄みの錯体を前述と同様にして除去し、そしてこの錯体をリポソームから拡散させた。一定の時間間隔で、この１ｃｍ3部分を採取し、上澄みのイットリウムを除去し、前述したようにしてICPによりリポソームをイットリウムについて分析した。
時間（時間） pH=7.04 リポソーム中に検出されたイットリウム（ppm）
0.3 1.03
0.8 1.14
1.8（ｐＨの実験から） 0.95
2.3 0.98
19.0 1.12
検出されたイットリウムはすべての場合に実験誤差範囲内で非常に類似しており、前のｐＨ実験中で検出されたのと一致した。これは、リポソームから外の錯体の拡散が非常に迅速で２０分以内に当量に達することを示す。
（ｃ）NMRによる脂質透過性の検討
イミダゾール緩衝剤（ｐＨ＝６．８０）を含有するD2O中に１００ｍｇのR=Meイットリウム錯体／NaCl混合物を溶解した。これを、上記実施例１０（ｂ）に記載した通りにしてリポソームの内部に配合した。錯体は１０分の条件下の最初の加水分解時間を与え、次いで、錯体をリポソームの外に拡散させながらさらに９０分の加水分解をした。充分に明瞭なNMRスペクトルを得るために、リポソーム部分よりもむしろ上澄み部分において観察する必要がある。前記したように、リポソームをSephadex G50中を通過させたが、次いで廃棄した。次いで、このSephadex中に上澄み錯体をトラップした。各注射器中のSephadexを０．２ｃｍ3ジューテロ化緩衝剤溶液を一度通過させて洗浄し、次いで、２分間２０００ｒｐｍで遠心分離し、次いで、そのフラクションも廃棄した。次いで、さらに０．３ｃｍ3のジューテロ化バッファーを（２分スピン、２０００ｒｐｍ）により洗浄し、このフラクション（澄明、無色の液体）を採取し、1H NMRにより分析した。
このNMR分析は、イミダゾール、水、エタノール（リポソーム製造由来）および錯体のみのピーク［d=3.65（t,2H）,3.02（t,2H）,1.97（s,3H）］を示した。これは、錯体が無傷の脂質膜を通過できることをさらに立証する。
実施例１１：トリス（3-アザ-4-カルボキシ-3-ペンテニル）アミン（R=Hの場合の式（1））（以下、［Gd（L）］）のGd（III）錯体の緩和
［Gd（L）］.3NaClの試料を秤量し、［Gd（L）］が加水分解しない溶媒であるd4-MeOHの０．１０ｃｍ３中に溶解した。同様にして各々異なる量の［Gd（L）］.3NaClを含有する５試料をさらに作成した。NMR管に最初の試料を移し、０．４８ｃｍ3のD2Oと混合した。4.707ppmにおけるHODピークの横緩和時間（T1）をBruker300MHz NMR分光器を用い３７℃の180-J-90パルスシーケンスを使用して測定した。残りの５試料についてこれを繰り返した。すべての場合で、D2Oを加えることとT1測定を終了することとの間の遅延は３０分未満であり、これは錯体の加水分解が最短である時間間隔である。精製［Gd（L）］（［Gd（L）］.3NaClをSephadex LH-20カラムにより溶離することにより精製）使用して同様にして最終試料を作成した。結果を以下に要約する。
Figure 0004056088
濃度に対する1/T1をプロットすると概ね直線となる。このグラフの勾配を取ることにより［Gd（L）］の緩和を計算する。したがって、３７℃で３００ＭＨｚの［Gd（L）］の緩和は（4.3±0.6）s-1mM-1である。
我々は以前一定範囲のアダクト［Ln（L）］/NaClを調製した。これらをSephadexカラムに通過させると、Na+のない種［Ln（L）］の結晶化をもたらし、その単結晶Ｘ線構造は［Ln=Y（IIII），Yb（III）について］H2Oの存在しない多核集合体の形成を示す。もしこれらの集合体がH2O溶液中で存在する場合、H2O分子によって占められる１または２配位部位を持つモノマーよりもより低い緩和を示すことが期待され得る。しかし、1/T1グラフにより、精製［Gd（L）］に相当する点は［Gd（L）］.3NaClの線に非常に接近してあることが示される。これは、H2O中でこれらの錯体、特に［Gd（Ln）］および［Gd（Ln）］.3NaClのすべては溶解し、同数の配位したH2O分子をもつ同種のものを与えることを示唆する。２個のH2O分子は、H2Oから再結晶した［Ln（L）］の単結晶Ｘ線構造が［Ln（L）（OH2）2］（Ln=Gd,Sm）のタイプの９配位構造を示すのでこれらの錯体に結合することを我々は確認した。これらの構造は、我々の刊行物J.Chem.Soc.,Dalton Trans.,1997,3655に要約されている。
Figure 0004056088
300MHzにおける［Gd（L）］の緩和は、10または20MHzで通常測定されるその他のMRI試薬の緩和値と正確に比較できない。しかし、緩和は通常磁場強度の増加に伴って減少するので1、［Gd（L）］の緩和はDTPA-およびDOTA-系MRI試薬よりも大きい。これは、［Gd（DTPA）］2-や［Gd（DOTA）］-に比較して［Gd（L）］に結合された配位H2O分子の数が多いことに帰することができる。
1 S.Aime,A.S.Batsanov,M.Botta,J.A.K.Howard,D.Parker,K.
Senanayake,G.Williams,Inorg.Chem.,1994,33,4693-4706
Figure 0004056088
Figure 0004056088
Figure 0004056088
Figure 0004056088

Claims (10)

  1. 式
    Figure 0004056088
    ［式中、ＡはＮであり、L 1 ,L 2 ,L 3 はすべて-CH 2 CH 2 -であり、Y 1 ，Y 2 ，Y 3 は、-N=CR-B（=O）OZ,-NR-CR 2 -B（=O）OZ,および-O-CR 2 -B（=O）OZ（ここで、ＢはＣであり、そしてＺはＨもしくは対イオンである。）から独立して選択され、各Ｒ基はＨ、C1〜5アルキル、C1〜5アルコキシアルキル、C1〜5ヒドロキシアルキル、C1〜5アミノアルキル、C5〜10アリールまたはC1〜6フルオロアルキルから独立して選択され、R2はOH，C1〜6アルキル、C1〜6アルコキシアルキル、C1〜6フルオロアルキル、C1〜10アルコキシまたはC5〜10アリールであり、但し、Y1,Y2およびY3のうちの少なくとも一つは-N=CR-B（=O）OZである。］を有するリガンド。
  2. Y1,Y2およびY3はすべで-N=CR-B（=O）OZである請求項１に記載のリガンド。
  3. 請求項１又は２に記載のリガンドの金属錯体。
  4. 金属錯体が中性である請求項３に記載の金属錯体。
  5. 式
    Figure 0004056088
    （式中、Ｍは金属である。）を有する請求項２に記載の金属錯体。
  6. 金属がランタニド金属、インジウムもしくはガリウムである請求項３〜５のいずれかに記載の金属錯体。
  7. 金属が放射性である請求項３〜６のいずれかに記載の金属錯体。
  8. 金属が90Y、153Sm、111Inまたは169Ybである請求項７に記載の金属錯体。
  9. 金属が常磁性である請求項３〜６のいずかに記載の金属錯体。
  10. 金属がカドリニウムである請求項９に記載の金属錯体。
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