JP4007669B2 - 肝機能診断剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、肝機能診断剤、詳しくは少なくとも１以上の特定位の炭素が13Ｃで標識された極性アミノ酸、複素環アミノ酸、及び分枝アミノ酸からなる群から選ばれるアミノ酸を含む肝機能診断剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肝機能障害のスクリーニングには、血中のトランスアミナーゼ（GPTおよびGOT）、アルカリフォスファターゼ（ALP）、乳酸脱水素酵素（LDH）などの酵素を定量する血液生化学検査が一般的に行われている。これらの酵素は肝障害時に肝臓組織から血中に漏出する。中でも GPT、GOT は肝臓に主に存在する酵素で、正常時では血中濃度が低いのに対し、肝機能障害時には顕著に高くなることから肝障害を鋭敏に検出する優れた指標となっている。しかしながら、肝機能が著しく低下している慢性肝炎や肝硬変時には肝臓組織内の酵素量が低下しているために酵素の漏出量も低下し、障害程度が高いにも関わらず高い値を示さない場合がある（今日の診療 CD-ROM Vol.6 、医学書院刊）。また、漏出した酵素が血中から消失するには時間がかかるため、検査の時点では肝機能障害から回復していても高い値を示す場合もある。したがって、これらの酵素の定量は、肝機能障害の程度を評価する検査法として不充分である。
【０００３】
特に、肝臓外科手術時には、肝臓の障害程度および肝機能の評価が非常に重要である（消化器診療プラクティス１ 肝障害の診断的アプローチ、大久保昭行編、文光堂刊）。肝臓の障害程度および肝機能の評価には血清ビリルビンの測定、ICG 負荷試験が主に行われている。しかしながら、これらの検査法にもそれぞれ問題点がある（消化器診療プラクティス１ 肝障害の診断的アプローチ、大久保昭行編、文光堂刊）。例えば、血清ビリルビンの上昇は必ずしも肝機能の低下を意味するものではなく、また、術後等の短時間に肝機能がドラスティックに変化する過程を追うことは困難である。ICG 負荷試験は、ICG が肝細胞に取り込まれる際にビリルビンと競合するため、ビリルビンが高値を示している場合には信頼性のある結果を得ることができない。こうした状況から、検査を行う時点での肝臓の障害程度および肝機能を、被験者の状態に関わらず安全かつ簡便に評価できる手段が望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、肝機能を、被験者の状態に関わらず安全かつ簡便に評価することのできる、肝機能診断剤を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、少なくとも１以上の特定位の炭素が13Ｃで標識された極性アミノ酸、複素環アミノ酸、及び分枝アミノ酸からなる群から選ばれるアミノ酸を投与し、呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の増加率を測定することにより肝機能を正確に診断することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、少なくとも１以上の特定位の炭素が13Ｃで標識された極性アミノ酸、複素環アミノ酸、及び分枝アミノ酸からなる群から選ばれるアミノ酸を含む肝機能診断剤である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の肝機能診断剤の極性アミノ酸、複素環アミノ酸、又は分枝アミノ酸は、少なくとも１以上の特定位の炭素が13Ｃで標識された極性アミノ酸、複素環アミノ酸、又は分枝アミノ酸である。
【０００８】
本発明において使用する極性アミノ酸とは、好適にはアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、システイン、シスチン、グリシン、リジン、セリン、スレオニン、チロシン、オルニチン等が挙げられるが、これに限定されるわけではない。さらに複素環アミノ酸とは、好適にはトリプトファン、プロリン、ヒスチジン等が挙げられ、分枝アミノ酸とは、ロイシン、イソロイシン、バリン等が挙げられるが、これに限定されるわけではない。
【０００９】
また、上記の極性アミノ酸、複素環アミノ酸、及び分枝アミノ酸は少なくとも１以上の特定位の炭素が標識されたものであればよい。標識される炭素位は限定されない。
13Ｃは安定同位体であるので放射性同位体と異なり放射線被曝の危険も一切ないので、本剤の安全性に問題はない。
【００１０】
本発明の肝機能診断剤を用いる検査は、これを被験者に単回投与あるいは持続投与し、投与後の呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の増加を測定する呼気テストにより行う。具体的には、投与後の呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度を測定し、投与後一定時間（例えば5分、10分、15分）経過後における呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）、あるいは投与後一定時間までの呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）の経時変化（立ち上がりの傾き、傾きの変化、ピークの時間等）のデータから肝機能の評価を行う。さらに、かかる呼気テストによる評価は、単独でも有用であるが、ビリルビン値等と組み合わせて総合的に判断することがより好ましい。
ここで、呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の測定は、ガスクロマトグラフ−質量分析法（GC-MS）、赤外分光法、質量分析法、光電音響分光法、ＮＭＲ（核磁気共鳴）法で行うことができる。
【００１１】
本発明の肝機能診断剤は、上記の少なくとも１以上の特定位の炭素が13Ｃで標識された極性アミノ酸、複素環アミノ酸、及び分枝アミノ酸からなる群から選ばれるアミノ酸（以下、標識アミノ酸という）を単独で、あるいは賦形剤または担体と混合し、投与経路に応じて経口剤（錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、液剤等）、注射剤などに製剤化される。賦形剤または担体としては、当分野で常套的に使用され、薬剤学的に許容されるものであればよく、その種類及び組成は、投与経路や投与方法によって適宜変更される。例えば、液状担体としては水が用いられる。固体担体としては、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウムなどの有機酸塩などが使用される。注射剤の場合、一般に滅菌水、生理食塩水、各種緩衝液が望ましい。また、凍結乾燥製剤とし経口剤として用いたり、それを投与時に注射用の適当な溶剤、例えば滅菌水、生理食塩水、電解質溶液等の静脈投与用液体に溶解して投与することもできる。
【００１２】
製剤中における標識アミノ酸の含量は、製剤の種類により異なるが、通常1〜100 重量％、好ましくは50〜100 重量％である。例えば注射剤の場合には、通常1〜40重量％となるように添加すればよい。カプセル剤、錠剤、顆粒剤、粉剤の場合は、約10〜100 重量％、好ましくは50〜100 重量％であり、残部は担体である。
【００１３】
本発明の肝機能診断剤の投与量は、投与による呼気中の13ＣＯ2 の増加を確認できる量が必要であり、患者の年齢、体重、検査目的により異なるが、例えば1回当たりの投与量は成人の場合、1〜1000mg/kg 体重程度である。
本発明の肝機能診断剤は、肝硬変、慢性肝炎、急性肝炎、肝ガン等の肝疾患、肝障害の診断、外科手術前後の肝機能の評価に利用できる。
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに何ら限定されるものではない。
【００１４】
【実施例】
本発明に使用する標識アミノ酸の13Ｃ標識位置における13Ｃ純度は99 %以上である。その他特に明記しない限り特級試薬を用いた。
〔実施例１〕 呼気テストの方法
(1) 急性肝炎ラットの作成
被験動物として、雄性Sprague-Dawley (SD) ラットを、日本チャールズリバー社より購入した。購入したラットは、23±2 ℃、湿度 55 ±10% の条件で使用時まで飼育した。7〜10週齢の当該ラットにネンブタール腹腔内投与（50 mg/kg）で麻酔後、ガラクトサミン塩酸塩（200 mg/ml 生理食塩水溶液）を 0.6〜1.2 g/kg腹腔内投与した [Koff, S. et al., Proc. Soc. Exptl. Med 137, 696 (1971) ; Keppler, D. et al., Exp. Mol. Pathology, 9, 279 (1968) ;（疾患別）モデル動物の作製と新薬開発のための試験・実験法、内貴正治 監修、126 (1993)] 。2 日後に尾静脈採血を行い血清を分離し、富士ドライケム FDC5500 [（株）富士写真フィルム] によりグルタミックピルビックトランスアミナーゼ活性(GPT)値および総ビリルビン値を測定した。
【００１５】
(2) 13Ｃ−呼気テスト
(1)で作成した急性肝炎ラットと健常ラットについて、以下の呼気テストを実施した。
(2)-1 静脈内投与
一晩絶食したラットをネンブタール腹腔内投与（50 mg/kg）で麻酔し、手術台に固定した。頭部に呼気吸引用のキャップを被せ、標識アミノ酸を大腿静脈より所定量投与した。ストロークポンプ [バリアブル・ストロークポンプ VS-500、（株）柴田科学工業] を用いて呼気を約 100 ml/min の速度で吸引し、そのまま13ＣＯ2 アナライザー EX-130S [（株）日本分光] のフローセルに導入した。呼気吸引用のキャップとストロークポンプの間にはパーマピュアドライヤー（ MD-050-12P、Perma Pure INC. ）を設置して呼気中の水蒸気を除去した。
【００１６】
13ＣＯ2 アナライザーから出力されるデータはＡＤ変換した後パーソナルコンピュータ（Apple Power Macintosh 8500）に取込み、データ処理ソフトウェア Lab VIEW (National Instruments)を用いて 5秒間隔で 100msec毎 10 点のデータを積算平均し、13Ｃatom%、Δ13Ｃ(‰)、炭酸ガス濃度(%)に変換することで連続測定 13Ｃ−呼気テストを行った。変換したデータはリアルタイムで画面表示した後、ハードディスク中に保存した。呼気テスト中、直腸温をモニターし、小動物用体温コントローラー TR-100 (Fine Science Tools INC.）により、37± 0.5℃に維持した。また、吸引呼気中の炭酸ガス濃度は 3± 0.5 %に維持した。実験終了後、ラットは過剰量のネンブタールを投与し屠殺した。
尚、Δ13Ｃ(‰)は各時点の呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度(13Ｃ tmin)とＣＯ2 標準ガスの13Ｃ濃度( 13Ｃ std)から下式により算出した。
【００１７】
【数１】
Δ13Ｃ(‰)＝｛(13Ｃ tmin-13Ｃ 0min)/13Ｃ std｝×1000
【００１８】
(2)-2 経口投与
一晩絶食したラットを無麻酔のままマイクロ照射装置用ラットホルダー内に固定した。ストロークポンプ [バリアブル・ストロークポンプ VS-500、（株）柴田科学工業] を用いて呼気を約 100〜300 ml/minの速度で吸引し、そのまま13ＣＯ2 アナライザー EX-130S [（株）日本分光] のフローセルに導入した。ラットホルダーとストロークポンプの間にはパーマピュアドライヤー（ MD-050-12P、Perma Pure INC. ）を設置して呼気中の水蒸気を除去した。炭酸ガス濃度が安定した状態でいったんラットホルダーからラットを出し、標識シスチンを、経口投与用ゾンデを用いて胃内に所定量投与した。
【００１９】
13ＣＯ2 アナライザーから出力されるデータはＡＤ変換した後パーソナルコンピュータ（Apple Power Macintosh 8500）に取込み、データ処理ソフトウェア Lab VIEW (National Instruments)を用いて 5秒間隔で 100msec毎 10 点のデータを積算平均し、13Ｃatom%、Δ13Ｃ(‰)、炭酸ガス濃度(%)に変換することで連続測定 13Ｃ−呼気テストを行った。変換したデータはリアルタイムで画面表示した後、ハードディスク中に保存した。呼気テスト中、直腸温をモニターし、小動物用体温コントローラー TR-100 (Fine Science Tools INC.）により、37± 0.5℃に維持した。また、吸引呼気中の炭酸ガス濃度は 3± 0.5 %に維持した。実験終了後、ラットは過剰量のネンブタールを投与し屠殺した。
尚、Δ13Ｃ(‰)は上記式により算出した。
【００２０】
〔実施例２〕 1-13Ｃ-アルギニン呼気テスト
健常ラット（8週齢，総ビリルビン値≦0.5mg/dl，n=4）および急性肝炎ラット（8週齢，総ビリルビン値＞3mg/dl，n=4）に、生理食塩水に溶解した1-13Ｃ-アルギニン（ICON社より購入）を大腿静脈より50mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
健常ラットでは、1-13Ｃ-アルギニン投与後約10分までΔ13Ｃ(‰)値は増加したが、その後20分までほぼ一定値を示した。一方、急性肝炎ラットでは、投与後20分までΔ13Ｃ(‰)値は増加を続けた（図２）。
【００２１】
投与後10分のΔ13Ｃ(‰)値は急性肝炎ラットで 62.55±4.93‰、健常ラットで 145.69±6.11‰であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.0001 (ANOVA with Fischer LSD)）に低かった。
また、投与後4分から9分におけるΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きは、急性肝炎ラットで 22.16±2.64‰／5分、健常ラットで 56.67±4.22‰／5分であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.0001 (ANOVA with Fischer LSD)）に小さかった。
したがって、1-13Ｃ-アルギニン投与後一定時間後のΔ13Ｃ(‰)値、あるいは、投与後のΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きから肝機能障害を検出することが可能である。
【００２２】
〔実施例３〕 1-13Ｃ-ヒスチジン呼気テスト
健常ラット（8週齢，総ビリルビン値≦0.5mg/dl，n=4）および急性肝炎ラット（8週齢，総ビリルビン値＞4mg/dl，n=4）に、生理食塩水に溶解した1-13Ｃ-ヒスチジン（ICON社より購入）を大腿静脈より30mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
健常ラットでは、1-13Ｃ-ヒスチジン投与後約17分までΔ13Ｃ(‰)値は増加したが、その後20分までほぼ一定値を示した。一方、急性肝炎ラットでは、投与後20分までΔ13Ｃ(‰)値は増加を続けた（図３）。
【００２３】
投与後15分のΔ13Ｃ(‰)値は急性肝炎ラットで 14.20±4.57‰、健常ラットで 90.01±18.15 ‰であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.001 (ANOVA with Fischer LSD)）に低かった。
また、投与後5分から10分におけるΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きは、急性肝炎ラットで 4.68±1.47‰／5分、健常ラットで 43.76±10.84 ‰／5分であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.001 (ANOVA with Fischer LSD)）に小さかった。
したがって、1-13Ｃ-ヒスチジン投与後一定時間後のΔ13Ｃ(‰)値、あるいは、投与後のΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きから肝機能障害を検出することが可能である。
【００２４】
〔実施例４〕 1,2-13Ｃ-オルニチン呼気テスト
健常ラット（8週齢，総ビリルビン値＜0.5mg/dl，n=4）および急性肝炎ラット（8週齢，総ビリルビン値≧2.2mg/dl，n=4）に、生理食塩水に溶解した1,2-13Ｃ-オルニチン塩酸塩（ICON社より購入）を大腿静脈より20mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
【００２５】
健常ラットでは、1,2-13Ｃ-オルニチン塩酸塩投与後20分までΔ13Ｃ(‰)値は増加を続けた。一方、急性肝炎ラットでは、投与後約3分までΔ13Ｃ(‰)値は急激に増加したが、その後20分まで徐々に増加した（図４）。
投与後15分のΔ13Ｃ(‰)値は急性肝炎ラットで 102.00±3.42‰、健常ラットで 137.37±10.79 ‰であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.01 (ANOVA with Fischer LSD)）に低かった。
【００２６】
また、投与後4分から9分におけるΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きは、急性肝炎ラットで 13.27±4.77‰／5分、健常ラットで 39.92±3.91‰／5分であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.001 (ANOVA with Fischer LSD)）に小さかった。
したがって、1,2-13Ｃ-オルニチン塩酸塩投与後一定時間後のΔ13Ｃ(‰)値、あるいは、投与後のΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きから肝機能障害を検出することが可能である。
【００２７】
〔実施例５〕 1-13Ｃ-バリン呼気テスト
健常ラット（8週齢，総ビリルビン値≦0.6mg/dl，n=4）および急性肝炎ラット（8週齢，総ビリルビン値＞3.5mg/dl，n=4）に、生理食塩水に溶解した1-13Ｃ-バリン（mass Trace社より購入）を大腿静脈より20mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
【００２８】
健常ラット、急性肝炎ラット共に、1-13Ｃバリン投与後20分までΔ13Ｃ(‰)値は増加を続けた（図５）。
投与後8分のΔ13Ｃ(‰)値は急性肝炎ラットで 34.65±6.08‰、健常ラットで 54.4±4.05‰であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.01 (ANOVA with Fischer LSD)）に低かった。
【００２９】
また、投与後15分から20分におけるΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きは、急性肝炎ラットで 4.3±1.38‰／5分、健常ラットで -1.22±1.85‰／5分であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.01 (ANOVA with Fischer LSD)）に大きかった。
したがって、1-13Ｃ-バリン投与後一定時間後のΔ13Ｃ(‰)値、あるいは、投与後のΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きから肝機能障害を検出することが可能である。
【００３０】
〔実施例６〕 1-13Ｃ-リジン呼気テスト
健常ラット（7週齢，総ビリルビン値≦0.7mg/dl，n=4）および急性肝炎ラット（7週齢，総ビリルビン値＞3.5mg/dl，n=4）に、生理食塩水に溶解した1-13Ｃ-リジン塩酸塩（mass Trace社より購入）を大腿静脈より50mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
【００３１】
健常ラットでは、1-13Ｃ-リジン塩酸塩投与後約10分までΔ13Ｃ(‰)値は急激に増加し、約15分までほぼ一定値を示したが、その後20分まで徐々に減少した。一方、急性肝炎ラットでは、投与後20分までΔ13Ｃ(‰)値は増加を続けた（図６）。
投与後10分のΔ13Ｃ(‰)値は急性肝炎ラットで 51.53±34.60 ‰、健常ラットで 138.29±9.76‰であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.01 (ANOVA with Fischer LSD)）に低かった。
【００３２】
また、投与後3分から8分におけるΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きは、急性肝炎ラットで 31.83±21.00 ‰／5分、健常ラットで 86.41±6.93‰／5分であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.01 (ANOVA with Fischer LSD)）に小さかった。
したがって、1-13Ｃ-リジン塩酸塩投与後一定時間後のΔ13Ｃ(‰)値、あるいは、投与後のΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きから肝機能障害を検出することが可能である。
【００３３】
〔実施例７〕 1-13Ｃ-セリン呼気テスト
健常ラット（8週齢，総ビリルビン値≦0.6mg/dl，n=4）および急性肝炎ラット（8週齢，総ビリルビン値＞3mg/dl，n=3）に、生理食塩水に溶解した1-13Ｃ-セリン（ICON社より購入）を大腿静脈より50mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
【００３４】
健常ラットでは、1-13Ｃ-セリン投与後約8分までΔ13Ｃ(‰)値は急激に増加し、約15分までほぼ一定値を示したが、その後20分まで徐々に減少した。一方、急性肝炎ラットでは、投与後20分までΔ13Ｃ(‰)値は増加を続けた（図７）。
投与後2分のΔ13Ｃ(‰)値は急性肝炎ラットで 9.92±1.59‰、健常ラットで 28.42±5.43‰であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.01 (ANOVA with Fischer LSD)）に低かった。
【００３５】
また、投与後10分から20分におけるΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きは、急性肝炎ラットで 20.68±4.86‰／10分、健常ラットで -8.81±4.16‰／10分であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.001 (ANOVA with Fischer LSD)）に大きかった。
したがって、1-13Ｃ-セリン投与後一定時間後のΔ13Ｃ(‰)値、あるいは、投与後のΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きから肝機能障害を検出することが可能である。
【００３６】
〔実施例８〕 1-13Ｃ-スレオニン呼気テスト
健常ラット（7週齢，総ビリルビン値≦0.6mg/dl，n=4）および急性肝炎ラット（7週齢，総ビリルビン値＞3mg/dl，n=4）に、生理食塩水に溶解した1-13Ｃ-スレオニン（mass Trace社より購入）を大腿静脈より50mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
【００３７】
健常ラットでは、1-13Ｃ-スレオニン投与後約8分までΔ13Ｃ(‰)値は急激に増加したが、その後20分までほぼ一定値を示した。一方、急性肝炎ラットでは、投与後20分までΔ13Ｃ(‰)値は増加を続けた（図８）。
投与後8分のΔ13Ｃ(‰)値は急性肝炎ラットで 20.56±9.62‰、健常ラットで 92.92±36.36 ‰であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、有意（ p＜ 0.05 (ANOVA with Fischer LSD)）に低かった。
【００３８】
また、投与後10分から20分におけるΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きは、急性肝炎ラットで 14.65±4.11‰／10分、健常ラットで 0.01±5.79‰／10分であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、有意（ p＜ 0.05 (ANOVA with Fischer LSD)）に大きかった。
したがって、1-13Ｃ-スレオニン投与後一定時間後のΔ13Ｃ(‰)値、あるいは、投与後のΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きから肝機能障害を検出することが可能である。
【００３９】
〔実施例９〕 1-13Ｃ-システイン呼気テスト
健常ラット（8週齢，総ビリルビン値≦0.5mg/dl，n=4）および急性肝炎ラット（8週齢，総ビリルビン値≧2.1mg/dl，n=2）に、生理食塩水に溶解した1-13Ｃ-システイン（ICON社より購入）を大腿静脈より20mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
【００４０】
健常ラットでは、1-13Ｃ-システイン投与後約4分までΔ13Ｃ(‰)値は急激に増加したが、その後20分まで徐々に減少した。一方、急性肝炎ラットでは、投与後約7分までΔ13Ｃ(‰)値は増加したが、その後20分まで徐々に減少した（図９）。
投与後2分のΔ13Ｃ(‰)値は急性肝炎ラットで 30.11‰、健常ラットで 71.93±13.52 ‰であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、有意（ p＜ 0.05 (ANOVA with Fischer LSD)）に低かった。
したがって、1-13Ｃ-システイン投与後一定時間後のΔ13Ｃ(‰)値から肝機能障害を検出することが可能である。
【００４１】
〔実施例１０〕 1-13Ｃ-グルタミン酸呼気テスト
健常ラット（8週齢，総ビリルビン値≦0.6mg/dl，n=2）および急性肝炎ラット（8週齢，総ビリルビン値＞4mg/dl，n=4）に、生理食塩水に溶解した1-13Ｃ-グルタミン酸（mass Trace社より購入）を大腿静脈より10mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
健常ラット、急性肝炎ラット共に、1-13Ｃ-グルタミン酸投与後約4分までΔ13Ｃ(‰)値は急激に増加したが、その後20分まで徐々に減少した（図１０）。
【００４２】
投与後3分のΔ13Ｃ(‰)値は急性肝炎ラットで 175.98±20.94 ‰、健常ラットで 236.10 ‰であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、有意（ p＜ 0.05 (ANOVA with Fischer LSD)）に低かった。
したがって、1-13Ｃ-グルタミン酸投与後一定時間後のΔ13Ｃ(‰)値から肝機能障害を検出することが可能である。
【００４３】
〔実施例１１〕 1-13Ｃ-プロリン呼気テスト
健常ラット（8週齢，総ビリルビン値＜0.5mg/dl，n=4）および急性肝炎ラット（8週齢，総ビリルビン値≧1.5mg/dl，n=4）に、生理食塩水に溶解した1-13Ｃ-プロリン（mass Trace社より購入）を大腿静脈より20mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
【００４４】
健常ラットでは、1-13Ｃ-プロリン投与後約9分までΔ13Ｃ(‰)値は増加したが、その後20分まで徐々に減少した。一方、急性肝炎ラットでは、投与後20分までΔ13Ｃ(‰)値は増加を続けた（図１１）。
投与後15分から20分におけるΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きは、急性肝炎ラットで -0.25±2.93‰／5分、健常ラットで -8.91±1.18‰／5分であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.01 (ANOVA with Fischer LSD)）に大きかった。
したがって、1-13Ｃ-プロリン投与後のΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きから肝機能障害を検出することが可能である。
【００４５】
〔実施例１２〕 1-13Ｃ-ロイシン呼気テスト
健常ラット（8週齢，総ビリルビン値≦0.5mg/dl，n=3）および急性肝炎ラット（8週齢，総ビリルビン値≧1.2mg/dl，n=3）に、生理食塩水に溶解した1-13Ｃ-ロイシン（mass Trace社より購入）を大腿静脈より20mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
健常ラットでは、1-13Ｃ-ロイシン投与後約12分までΔ13Ｃ(‰)値は増加したが、その後20分までほぼ一定値を示した。一方、急性肝炎ラットでは、投与後20分までΔ13Ｃ(‰)値は増加を続けた（図１２）。
【００４６】
投与後10分から20分におけるΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きは、急性肝炎ラットで 38.00±4.91‰／10分、健常ラットで 3.60±7.87‰／10分であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.01 (ANOVA with Fischer LSD)）に大きかった。
したがって、1-13Ｃ-ロイシン投与後のΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きから肝機能障害を検出することが可能である。
【００４７】
〔実施例１３〕 1-13Ｃ-トリプトファン呼気テスト
健常ラット（9週齢，総ビリルビン値≦0.5mg/dl，n=4）および急性肝炎ラット（9週齢，総ビリルビン値≧4mg/dl，n=4）に、生理食塩水に溶解した1-13Ｃ-トリプトファン（mass Trace社より購入）を大腿静脈より10mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
【００４８】
1-13Ｃ-トリプトファン投与後5分のΔ13Ｃ(‰)値は急性肝炎ラットで 1.49±0.51‰、健常ラットで 4.78±2.04‰であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、有意（ p＜ 0.05 (ANOVA with Fischer LSD)）に低かった。
したがって、1-13Ｃ-トリプトファン投与後一定時間後のΔ13Ｃ(‰)値から肝機能障害を検出することが可能である。
【００４９】
〔実施例１４〕 1-13Ｃ-イソロイシン呼気テスト
健常ラット（8週齢，総ビリルビン値≦0.5mg/dl，n=4）および急性肝炎ラット（8週齢，総ビリルビン値＞4mg/dl，n=4）に、生理食塩水に溶解した1-13Ｃ-イソロイシン（mass Trace社より購入）を大腿静脈より20mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
【００５０】
投与後10分から20分におけるΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きは、急性肝炎ラットで 27.99±2.70‰／10分、健常ラットで 11.28±3.44‰／10分であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.001 (ANOVA with Fischer LSD)）に大きかった。
したがって、1-13Ｃ-イソロイシン投与後のΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きから肝機能障害を検出することが可能である。
【００５１】
〔実施例１５〕 1,1-13Ｃ-シスチン呼気テスト
健常ラット（9週齢，総ビリルビン値≦0.6mg/dl，n=4）および急性肝炎ラット（9週齢，総ビリルビン値＞4.5mg/dl，n=4）に、0.5%カルボキシメチルセルロースナトリウム水溶液を加え懸濁した1,1-13Ｃ-シスチン（mass Trace社より購入）を45mg/kg経口投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
【００５２】
健常ラット、急性肝炎ラット共に、1,1-13Ｃ-シスチン投与後30分までΔ13Ｃ(‰)値は増加を続けた（図１３）。
投与後30分のΔ13Ｃ(‰)値は急性肝炎ラットで 58.36±13.51 ‰、健常ラットで 146.48±19.34 ‰であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.001 (ANOVA with Fischer LSD)）に低かった。
【００５３】
また、投与後5分から10分におけるΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きは、急性肝炎ラットで 10.93±3.83‰／5分、健常ラットで 38.11±9.58‰／5分であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.01 (ANOVA with Fischer LSD)）に小さかった。
したがって、1,1-13Ｃ-シスチン投与後一定時間後のΔ13Ｃ(‰)値、あるいは、投与後のΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きから肝機能障害を検出することが可能である。
【００５４】
〔実施例１６〕 1-13Ｃ-アスパラギン酸呼気テスト
健常ラット（8週齢，総ビリルビン値≦0.4mg/dl，n=4）および急性肝炎ラット（8週齢，総ビリルビン値≧2.8mg/dl，n=4）に、生理食塩水に溶解した1-13Ｃ-アスパラギン酸（mass Trace社より購入）を大腿静脈より10mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
【００５５】
投与後2分のΔ13Ｃ(‰)値は急性肝炎ラットで 139.25±2.53‰、健常ラットで 158.35±8.54‰であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.01 (ANOVA with Fischer LSD)）に低かった。
したがって、1-13Ｃ-アスパラギン酸投与後一定時間後のΔ13Ｃ(‰)値から肝機能障害を検出することが可能である。
【００５６】
〔製剤例１〕 （注射剤）
１-13Ｃ-アルギニン10重量部に対し、生理食塩水を加え全量を100重量部として、これを溶解後ミリポアフィルターを用いて除菌濾過した。この濾液をバイアル瓶にとり、密封して注射剤を得た。
〔製剤例２〕 （内服液剤）
１-13Ｃ-ヒスチジン10重量部に対し、精製水を加え全量を100重量部として、これを溶解後ミリポアフィルターを用いて除菌濾過した。この濾液をバイアル瓶にとり、密封して内服液剤を得た。
【００５７】
【発明の効果】
本発明によれば、被験者の身体的負担が小さく、正確な検査結果を即時に知ることができ、かつ副作用がなく安全に使用できる肝機能診断剤が提供される。本発明の肝機能診断剤は、検査を行った時点での肝機能の評価に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ラットの呼気回収法の模式図を示す。
【図２】１-13Ｃ-アルギニン投与後の呼気中13ＣＯ2 の増加を示す。
【図３】１-13Ｃ-ヒスチジン投与後の呼気中13ＣＯ2 の増加を示す。
【図４】１,２-13Ｃ-オルニチン投与後の呼気中13ＣＯ2 の増加を示す。
【図５】１-13Ｃ-バリン投与後の呼気中13ＣＯ2 の増加を示す。
【図６】１-13Ｃ-リジン投与後の呼気中13ＣＯ2 の増加を示す。
【図７】１-13Ｃ-セリン投与後の呼気中13ＣＯ2 の増加を示す。
【図８】１-13Ｃ-スレオニン投与後の呼気中13ＣＯ2 の増加を示す。
【図９】１-13Ｃ-システイン投与後の呼気中13ＣＯ2 の増加を示す。
【図１０】１-13Ｃ-グルタミン酸投与後の呼気中13ＣＯ2 の増加を示す。
【図１１】１-13Ｃ-プロリン投与後の呼気中13ＣＯ2 の増加を示す。
【図１２】１-13Ｃ-ロイシン投与後の呼気中13ＣＯ2 の増加を示す。
【図１３】１,１-13Ｃ-シスチン投与後の呼気中13ＣＯ2 の増加を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、肝機能診断剤、詳しくは少なくとも１以上の特定位の炭素が13Ｃで標識された極性アミノ酸、複素環アミノ酸、及び分枝アミノ酸からなる群から選ばれるアミノ酸を含む肝機能診断剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肝機能障害のスクリーニングには、血中のトランスアミナーゼ（GPTおよびGOT）、アルカリフォスファターゼ（ALP）、乳酸脱水素酵素（LDH）などの酵素を定量する血液生化学検査が一般的に行われている。これらの酵素は肝障害時に肝臓組織から血中に漏出する。中でも GPT、GOT は肝臓に主に存在する酵素で、正常時では血中濃度が低いのに対し、肝機能障害時には顕著に高くなることから肝障害を鋭敏に検出する優れた指標となっている。しかしながら、肝機能が著しく低下している慢性肝炎や肝硬変時には肝臓組織内の酵素量が低下しているために酵素の漏出量も低下し、障害程度が高いにも関わらず高い値を示さない場合がある（今日の診療 CD-ROM Vol.6 、医学書院刊）。また、漏出した酵素が血中から消失するには時間がかかるため、検査の時点では肝機能障害から回復していても高い値を示す場合もある。したがって、これらの酵素の定量は、肝機能障害の程度を評価する検査法として不充分である。
【０００３】
特に、肝臓外科手術時には、肝臓の障害程度および肝機能の評価が非常に重要である（消化器診療プラクティス１ 肝障害の診断的アプローチ、大久保昭行編、文光堂刊）。肝臓の障害程度および肝機能の評価には血清ビリルビンの測定、ICG 負荷試験が主に行われている。しかしながら、これらの検査法にもそれぞれ問題点がある（消化器診療プラクティス１ 肝障害の診断的アプローチ、大久保昭行編、文光堂刊）。例えば、血清ビリルビンの上昇は必ずしも肝機能の低下を意味するものではなく、また、術後等の短時間に肝機能がドラスティックに変化する過程を追うことは困難である。ICG 負荷試験は、ICG が肝細胞に取り込まれる際にビリルビンと競合するため、ビリルビンが高値を示している場合には信頼性のある結果を得ることができない。こうした状況から、検査を行う時点での肝臓の障害程度および肝機能を、被験者の状態に関わらず安全かつ簡便に評価できる手段が望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、肝機能を、被験者の状態に関わらず安全かつ簡便に評価することのできる、肝機能診断剤を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、少なくとも１以上の特定位の炭素が13Ｃで標識された極性アミノ酸、複素環アミノ酸、及び分枝アミノ酸からなる群から選ばれるアミノ酸を投与し、呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の増加率を測定することにより肝機能を正確に診断することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、少なくとも１以上の特定位の炭素が13Ｃで標識された極性アミノ酸、複素環アミノ酸、及び分枝アミノ酸からなる群から選ばれるアミノ酸を含む肝機能診断剤である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の肝機能診断剤の極性アミノ酸、複素環アミノ酸、又は分枝アミノ酸は、少なくとも１以上の特定位の炭素が13Ｃで標識された極性アミノ酸、複素環アミノ酸、又は分枝アミノ酸である。
【０００８】
本発明において使用する極性アミノ酸とは、好適にはアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、システイン、シスチン、グリシン、リジン、セリン、スレオニン、チロシン、オルニチン等が挙げられるが、これに限定されるわけではない。さらに複素環アミノ酸とは、好適にはトリプトファン、プロリン、ヒスチジン等が挙げられ、分枝アミノ酸とは、ロイシン、イソロイシン、バリン等が挙げられるが、これに限定されるわけではない。
【０００９】
また、上記の極性アミノ酸、複素環アミノ酸、及び分枝アミノ酸は少なくとも１以上の特定位の炭素が標識されたものであればよい。標識される炭素位は限定されない。
13Ｃは安定同位体であるので放射性同位体と異なり放射線被曝の危険も一切ないので、本剤の安全性に問題はない。
【００１０】
本発明の肝機能診断剤を用いる検査は、これを被験者に単回投与あるいは持続投与し、投与後の呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の増加を測定する呼気テストにより行う。具体的には、投与後の呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度を測定し、投与後一定時間（例えば5分、10分、15分）経過後における呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）、あるいは投与後一定時間までの呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）の経時変化（立ち上がりの傾き、傾きの変化、ピークの時間等）のデータから肝機能の評価を行う。さらに、かかる呼気テストによる評価は、単独でも有用であるが、ビリルビン値等と組み合わせて総合的に判断することがより好ましい。
ここで、呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の測定は、ガスクロマトグラフ−質量分析法（GC-MS）、赤外分光法、質量分析法、光電音響分光法、ＮＭＲ（核磁気共鳴）法で行うことができる。
【００１１】
本発明の肝機能診断剤は、上記の少なくとも１以上の特定位の炭素が13Ｃで標識された極性アミノ酸、複素環アミノ酸、及び分枝アミノ酸からなる群から選ばれるアミノ酸（以下、標識アミノ酸という）を単独で、あるいは賦形剤または担体と混合し、投与経路に応じて経口剤（錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、液剤等）、注射剤などに製剤化される。賦形剤または担体としては、当分野で常套的に使用され、薬剤学的に許容されるものであればよく、その種類及び組成は、投与経路や投与方法によって適宜変更される。例えば、液状担体としては水が用いられる。固体担体としては、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウムなどの有機酸塩などが使用される。注射剤の場合、一般に滅菌水、生理食塩水、各種緩衝液が望ましい。また、凍結乾燥製剤とし経口剤として用いたり、それを投与時に注射用の適当な溶剤、例えば滅菌水、生理食塩水、電解質溶液等の静脈投与用液体に溶解して投与することもできる。
【００１２】
製剤中における標識アミノ酸の含量は、製剤の種類により異なるが、通常1〜100 重量％、好ましくは50〜100 重量％である。例えば注射剤の場合には、通常1〜40重量％となるように添加すればよい。カプセル剤、錠剤、顆粒剤、粉剤の場合は、約10〜100 重量％、好ましくは50〜100 重量％であり、残部は担体である。
【００１３】
本発明の肝機能診断剤の投与量は、投与による呼気中の13ＣＯ2 の増加を確認できる量が必要であり、患者の年齢、体重、検査目的により異なるが、例えば1回当たりの投与量は成人の場合、1〜1000mg/kg 体重程度である。
本発明の肝機能診断剤は、肝硬変、慢性肝炎、急性肝炎、肝ガン等の肝疾患、肝障害の診断、外科手術前後の肝機能の評価に利用できる。
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに何ら限定されるものではない。
【００１４】
【実施例】
本発明に使用する標識アミノ酸の13Ｃ標識位置における13Ｃ純度は99 %以上である。その他特に明記しない限り特級試薬を用いた。
〔実施例１〕 呼気テストの方法
(1) 急性肝炎ラットの作成
被験動物として、雄性Sprague-Dawley (SD) ラットを、日本チャールズリバー社より購入した。購入したラットは、23±2 ℃、湿度 55 ±10% の条件で使用時まで飼育した。7〜10週齢の当該ラットにネンブタール腹腔内投与（50 mg/kg）で麻酔後、ガラクトサミン塩酸塩（200 mg/ml 生理食塩水溶液）を 0.6〜1.2 g/kg腹腔内投与した [Koff, S. et al., Proc. Soc. Exptl. Med 137, 696 (1971) ; Keppler, D. et al., Exp. Mol. Pathology, 9, 279 (1968) ;（疾患別）モデル動物の作製と新薬開発のための試験・実験法、内貴正治 監修、126 (1993)] 。2 日後に尾静脈採血を行い血清を分離し、富士ドライケム FDC5500 [（株）富士写真フィルム] によりグルタミックピルビックトランスアミナーゼ活性(GPT)値および総ビリルビン値を測定した。
【００１５】
(2) 13Ｃ−呼気テスト
(1)で作成した急性肝炎ラットと健常ラットについて、以下の呼気テストを実施した。
(2)-1 静脈内投与
一晩絶食したラットをネンブタール腹腔内投与（50 mg/kg）で麻酔し、手術台に固定した。頭部に呼気吸引用のキャップを被せ、標識アミノ酸を大腿静脈より所定量投与した。ストロークポンプ [バリアブル・ストロークポンプ VS-500、（株）柴田科学工業] を用いて呼気を約 100 ml/min の速度で吸引し、そのまま13ＣＯ2 アナライザー EX-130S [（株）日本分光] のフローセルに導入した。呼気吸引用のキャップとストロークポンプの間にはパーマピュアドライヤー（ MD-050-12P、Perma Pure INC. ）を設置して呼気中の水蒸気を除去した。
【００１６】
13ＣＯ2 アナライザーから出力されるデータはＡＤ変換した後パーソナルコンピュータ（Apple Power Macintosh 8500）に取込み、データ処理ソフトウェア Lab VIEW (National Instruments)を用いて 5秒間隔で 100msec毎 10 点のデータを積算平均し、13Ｃatom%、Δ13Ｃ(‰)、炭酸ガス濃度(%)に変換することで連続測定 13Ｃ−呼気テストを行った。変換したデータはリアルタイムで画面表示した後、ハードディスク中に保存した。呼気テスト中、直腸温をモニターし、小動物用体温コントローラー TR-100 (Fine Science Tools INC.）により、37± 0.5℃に維持した。また、吸引呼気中の炭酸ガス濃度は 3± 0.5 %に維持した。実験終了後、ラットは過剰量のネンブタールを投与し屠殺した。
尚、Δ13Ｃ(‰)は各時点の呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度(13Ｃ tmin)とＣＯ2 標準ガスの13Ｃ濃度( 13Ｃ std)から下式により算出した。
【００１７】
【数１】
Δ13Ｃ(‰)＝｛(13Ｃ tmin-13Ｃ 0min)/13Ｃ std｝×1000
【００１８】
(2)-2 経口投与
一晩絶食したラットを無麻酔のままマイクロ照射装置用ラットホルダー内に固定した。ストロークポンプ [バリアブル・ストロークポンプ VS-500、（株）柴田科学工業] を用いて呼気を約 100〜300 ml/minの速度で吸引し、そのまま13ＣＯ2 アナライザー EX-130S [（株）日本分光] のフローセルに導入した。ラットホルダーとストロークポンプの間にはパーマピュアドライヤー（ MD-050-12P、Perma Pure INC. ）を設置して呼気中の水蒸気を除去した。炭酸ガス濃度が安定した状態でいったんラットホルダーからラットを出し、標識シスチンを、経口投与用ゾンデを用いて胃内に所定量投与した。
【００１９】
13ＣＯ2 アナライザーから出力されるデータはＡＤ変換した後パーソナルコンピュータ（Apple Power Macintosh 8500）に取込み、データ処理ソフトウェア Lab VIEW (National Instruments)を用いて 5秒間隔で 100msec毎 10 点のデータを積算平均し、13Ｃatom%、Δ13Ｃ(‰)、炭酸ガス濃度(%)に変換することで連続測定 13Ｃ−呼気テストを行った。変換したデータはリアルタイムで画面表示した後、ハードディスク中に保存した。呼気テスト中、直腸温をモニターし、小動物用体温コントローラー TR-100 (Fine Science Tools INC.）により、37± 0.5℃に維持した。また、吸引呼気中の炭酸ガス濃度は 3± 0.5 %に維持した。実験終了後、ラットは過剰量のネンブタールを投与し屠殺した。
尚、Δ13Ｃ(‰)は上記式により算出した。
【００２０】
〔実施例２〕 1-13Ｃ-アルギニン呼気テスト
健常ラット（8週齢，総ビリルビン値≦0.5mg/dl，n=4）および急性肝炎ラット（8週齢，総ビリルビン値＞3mg/dl，n=4）に、生理食塩水に溶解した1-13Ｃ-アルギニン（ICON社より購入）を大腿静脈より50mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
健常ラットでは、1-13Ｃ-アルギニン投与後約10分までΔ13Ｃ(‰)値は増加したが、その後20分までほぼ一定値を示した。一方、急性肝炎ラットでは、投与後20分までΔ13Ｃ(‰)値は増加を続けた（図２）。
【００２１】
投与後10分のΔ13Ｃ(‰)値は急性肝炎ラットで 62.55±4.93‰、健常ラットで 145.69±6.11‰であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.0001 (ANOVA with Fischer LSD)）に低かった。
また、投与後4分から9分におけるΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きは、急性肝炎ラットで 22.16±2.64‰／5分、健常ラットで 56.67±4.22‰／5分であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.0001 (ANOVA with Fischer LSD)）に小さかった。
したがって、1-13Ｃ-アルギニン投与後一定時間後のΔ13Ｃ(‰)値、あるいは、投与後のΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きから肝機能障害を検出することが可能である。
【００２２】
〔実施例３〕 1-13Ｃ-ヒスチジン呼気テスト
健常ラット（8週齢，総ビリルビン値≦0.5mg/dl，n=4）および急性肝炎ラット（8週齢，総ビリルビン値＞4mg/dl，n=4）に、生理食塩水に溶解した1-13Ｃ-ヒスチジン（ICON社より購入）を大腿静脈より30mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
健常ラットでは、1-13Ｃ-ヒスチジン投与後約17分までΔ13Ｃ(‰)値は増加したが、その後20分までほぼ一定値を示した。一方、急性肝炎ラットでは、投与後20分までΔ13Ｃ(‰)値は増加を続けた（図３）。
【００２３】
投与後15分のΔ13Ｃ(‰)値は急性肝炎ラットで 14.20±4.57‰、健常ラットで 90.01±18.15 ‰であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.001 (ANOVA with Fischer LSD)）に低かった。
また、投与後5分から10分におけるΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きは、急性肝炎ラットで 4.68±1.47‰／5分、健常ラットで 43.76±10.84 ‰／5分であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.001 (ANOVA with Fischer LSD)）に小さかった。
したがって、1-13Ｃ-ヒスチジン投与後一定時間後のΔ13Ｃ(‰)値、あるいは、投与後のΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きから肝機能障害を検出することが可能である。
【００２４】
〔実施例４〕 1,2-13Ｃ-オルニチン呼気テスト
健常ラット（8週齢，総ビリルビン値＜0.5mg/dl，n=4）および急性肝炎ラット（8週齢，総ビリルビン値≧2.2mg/dl，n=4）に、生理食塩水に溶解した1,2-13Ｃ-オルニチン塩酸塩（ICON社より購入）を大腿静脈より20mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
【００２５】
健常ラットでは、1,2-13Ｃ-オルニチン塩酸塩投与後20分までΔ13Ｃ(‰)値は増加を続けた。一方、急性肝炎ラットでは、投与後約3分までΔ13Ｃ(‰)値は急激に増加したが、その後20分まで徐々に増加した（図４）。
投与後15分のΔ13Ｃ(‰)値は急性肝炎ラットで 102.00±3.42‰、健常ラットで 137.37±10.79 ‰であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.01 (ANOVA with Fischer LSD)）に低かった。
【００２６】
また、投与後4分から9分におけるΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きは、急性肝炎ラットで 13.27±4.77‰／5分、健常ラットで 39.92±3.91‰／5分であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.001 (ANOVA with Fischer LSD)）に小さかった。
したがって、1,2-13Ｃ-オルニチン塩酸塩投与後一定時間後のΔ13Ｃ(‰)値、あるいは、投与後のΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きから肝機能障害を検出することが可能である。
【００２７】
〔実施例５〕 1-13Ｃ-バリン呼気テスト
健常ラット（8週齢，総ビリルビン値≦0.6mg/dl，n=4）および急性肝炎ラット（8週齢，総ビリルビン値＞3.5mg/dl，n=4）に、生理食塩水に溶解した1-13Ｃ-バリン（mass Trace社より購入）を大腿静脈より20mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
【００２８】
健常ラット、急性肝炎ラット共に、1-13Ｃバリン投与後20分までΔ13Ｃ(‰)値は増加を続けた（図５）。
投与後8分のΔ13Ｃ(‰)値は急性肝炎ラットで 34.65±6.08‰、健常ラットで 54.4±4.05‰であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.01 (ANOVA with Fischer LSD)）に低かった。
【００２９】
また、投与後15分から20分におけるΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きは、急性肝炎ラットで 4.3±1.38‰／5分、健常ラットで -1.22±1.85‰／5分であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.01 (ANOVA with Fischer LSD)）に大きかった。
したがって、1-13Ｃ-バリン投与後一定時間後のΔ13Ｃ(‰)値、あるいは、投与後のΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きから肝機能障害を検出することが可能である。
【００３０】
〔実施例６〕 1-13Ｃ-リジン呼気テスト
健常ラット（7週齢，総ビリルビン値≦0.7mg/dl，n=4）および急性肝炎ラット（7週齢，総ビリルビン値＞3.5mg/dl，n=4）に、生理食塩水に溶解した1-13Ｃ-リジン塩酸塩（mass Trace社より購入）を大腿静脈より50mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
【００３１】
健常ラットでは、1-13Ｃ-リジン塩酸塩投与後約10分までΔ13Ｃ(‰)値は急激に増加し、約15分までほぼ一定値を示したが、その後20分まで徐々に減少した。一方、急性肝炎ラットでは、投与後20分までΔ13Ｃ(‰)値は増加を続けた（図６）。
投与後10分のΔ13Ｃ(‰)値は急性肝炎ラットで 51.53±34.60 ‰、健常ラットで 138.29±9.76‰であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.01 (ANOVA with Fischer LSD)）に低かった。
【００３２】
また、投与後3分から8分におけるΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きは、急性肝炎ラットで 31.83±21.00 ‰／5分、健常ラットで 86.41±6.93‰／5分であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.01 (ANOVA with Fischer LSD)）に小さかった。
したがって、1-13Ｃ-リジン塩酸塩投与後一定時間後のΔ13Ｃ(‰)値、あるいは、投与後のΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きから肝機能障害を検出することが可能である。
【００３３】
〔実施例７〕 1-13Ｃ-セリン呼気テスト
健常ラット（8週齢，総ビリルビン値≦0.6mg/dl，n=4）および急性肝炎ラット（8週齢，総ビリルビン値＞3mg/dl，n=3）に、生理食塩水に溶解した1-13Ｃ-セリン（ICON社より購入）を大腿静脈より50mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
【００３４】
健常ラットでは、1-13Ｃ-セリン投与後約8分までΔ13Ｃ(‰)値は急激に増加し、約15分までほぼ一定値を示したが、その後20分まで徐々に減少した。一方、急性肝炎ラットでは、投与後20分までΔ13Ｃ(‰)値は増加を続けた（図７）。
投与後2分のΔ13Ｃ(‰)値は急性肝炎ラットで 9.92±1.59‰、健常ラットで 28.42±5.43‰であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.01 (ANOVA with Fischer LSD)）に低かった。
【００３５】
また、投与後10分から20分におけるΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きは、急性肝炎ラットで 20.68±4.86‰／10分、健常ラットで -8.81±4.16‰／10分であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.001 (ANOVA with Fischer LSD)）に大きかった。
したがって、1-13Ｃ-セリン投与後一定時間後のΔ13Ｃ(‰)値、あるいは、投与後のΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きから肝機能障害を検出することが可能である。
【００３６】
〔実施例８〕 1-13Ｃ-スレオニン呼気テスト
健常ラット（7週齢，総ビリルビン値≦0.6mg/dl，n=4）および急性肝炎ラット（7週齢，総ビリルビン値＞3mg/dl，n=4）に、生理食塩水に溶解した1-13Ｃ-スレオニン（mass Trace社より購入）を大腿静脈より50mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
【００３７】
健常ラットでは、1-13Ｃ-スレオニン投与後約8分までΔ13Ｃ(‰)値は急激に増加したが、その後20分までほぼ一定値を示した。一方、急性肝炎ラットでは、投与後20分までΔ13Ｃ(‰)値は増加を続けた（図８）。
投与後8分のΔ13Ｃ(‰)値は急性肝炎ラットで 20.56±9.62‰、健常ラットで 92.92±36.36 ‰であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、有意（ p＜ 0.05 (ANOVA with Fischer LSD)）に低かった。
【００３８】
また、投与後10分から20分におけるΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きは、急性肝炎ラットで 14.65±4.11‰／10分、健常ラットで 0.01±5.79‰／10分であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、有意（ p＜ 0.05 (ANOVA with Fischer LSD)）に大きかった。
したがって、1-13Ｃ-スレオニン投与後一定時間後のΔ13Ｃ(‰)値、あるいは、投与後のΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きから肝機能障害を検出することが可能である。
【００３９】
〔実施例９〕 1-13Ｃ-システイン呼気テスト
健常ラット（8週齢，総ビリルビン値≦0.5mg/dl，n=4）および急性肝炎ラット（8週齢，総ビリルビン値≧2.1mg/dl，n=2）に、生理食塩水に溶解した1-13Ｃ-システイン（ICON社より購入）を大腿静脈より20mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
【００４０】
健常ラットでは、1-13Ｃ-システイン投与後約4分までΔ13Ｃ(‰)値は急激に増加したが、その後20分まで徐々に減少した。一方、急性肝炎ラットでは、投与後約7分までΔ13Ｃ(‰)値は増加したが、その後20分まで徐々に減少した（図９）。
投与後2分のΔ13Ｃ(‰)値は急性肝炎ラットで 30.11‰、健常ラットで 71.93±13.52 ‰であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、有意（ p＜ 0.05 (ANOVA with Fischer LSD)）に低かった。
したがって、1-13Ｃ-システイン投与後一定時間後のΔ13Ｃ(‰)値から肝機能障害を検出することが可能である。
【００４１】
〔実施例１０〕 1-13Ｃ-グルタミン酸呼気テスト
健常ラット（8週齢，総ビリルビン値≦0.6mg/dl，n=2）および急性肝炎ラット（8週齢，総ビリルビン値＞4mg/dl，n=4）に、生理食塩水に溶解した1-13Ｃ-グルタミン酸（mass Trace社より購入）を大腿静脈より10mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
健常ラット、急性肝炎ラット共に、1-13Ｃ-グルタミン酸投与後約4分までΔ13Ｃ(‰)値は急激に増加したが、その後20分まで徐々に減少した（図１０）。
【００４２】
投与後3分のΔ13Ｃ(‰)値は急性肝炎ラットで 175.98±20.94 ‰、健常ラットで 236.10 ‰であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、有意（ p＜ 0.05 (ANOVA with Fischer LSD)）に低かった。
したがって、1-13Ｃ-グルタミン酸投与後一定時間後のΔ13Ｃ(‰)値から肝機能障害を検出することが可能である。
【００４３】
〔実施例１１〕 1-13Ｃ-プロリン呼気テスト
健常ラット（8週齢，総ビリルビン値＜0.5mg/dl，n=4）および急性肝炎ラット（8週齢，総ビリルビン値≧1.5mg/dl，n=4）に、生理食塩水に溶解した1-13Ｃ-プロリン（mass Trace社より購入）を大腿静脈より20mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
【００４４】
健常ラットでは、1-13Ｃ-プロリン投与後約9分までΔ13Ｃ(‰)値は増加したが、その後20分まで徐々に減少した。一方、急性肝炎ラットでは、投与後20分までΔ13Ｃ(‰)値は増加を続けた（図１１）。
投与後15分から20分におけるΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きは、急性肝炎ラットで -0.25±2.93‰／5分、健常ラットで -8.91±1.18‰／5分であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.01 (ANOVA with Fischer LSD)）に大きかった。
したがって、1-13Ｃ-プロリン投与後のΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きから肝機能障害を検出することが可能である。
【００４５】
〔実施例１２〕 1-13Ｃ-ロイシン呼気テスト
健常ラット（8週齢，総ビリルビン値≦0.5mg/dl，n=3）および急性肝炎ラット（8週齢，総ビリルビン値≧1.2mg/dl，n=3）に、生理食塩水に溶解した1-13Ｃ-ロイシン（mass Trace社より購入）を大腿静脈より20mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
健常ラットでは、1-13Ｃ-ロイシン投与後約12分までΔ13Ｃ(‰)値は増加したが、その後20分までほぼ一定値を示した。一方、急性肝炎ラットでは、投与後20分までΔ13Ｃ(‰)値は増加を続けた（図１２）。
【００４６】
投与後10分から20分におけるΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きは、急性肝炎ラットで 38.00±4.91‰／10分、健常ラットで 3.60±7.87‰／10分であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.01 (ANOVA with Fischer LSD)）に大きかった。
したがって、1-13Ｃ-ロイシン投与後のΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きから肝機能障害を検出することが可能である。
【００４７】
〔実施例１３〕 1-13Ｃ-トリプトファン呼気テスト
健常ラット（9週齢，総ビリルビン値≦0.5mg/dl，n=4）および急性肝炎ラット（9週齢，総ビリルビン値≧4mg/dl，n=4）に、生理食塩水に溶解した1-13Ｃ-トリプトファン（mass Trace社より購入）を大腿静脈より10mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
【００４８】
1-13Ｃ-トリプトファン投与後5分のΔ13Ｃ(‰)値は急性肝炎ラットで 1.49±0.51‰、健常ラットで 4.78±2.04‰であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、有意（ p＜ 0.05 (ANOVA with Fischer LSD)）に低かった。
したがって、1-13Ｃ-トリプトファン投与後一定時間後のΔ13Ｃ(‰)値から肝機能障害を検出することが可能である。
【００４９】
〔実施例１４〕 1-13Ｃ-イソロイシン呼気テスト
健常ラット（8週齢，総ビリルビン値≦0.5mg/dl，n=4）および急性肝炎ラット（8週齢，総ビリルビン値＞4mg/dl，n=4）に、生理食塩水に溶解した1-13Ｃ-イソロイシン（mass Trace社より購入）を大腿静脈より20mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
【００５０】
投与後10分から20分におけるΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きは、急性肝炎ラットで 27.99±2.70‰／10分、健常ラットで 11.28±3.44‰／10分であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.001 (ANOVA with Fischer LSD)）に大きかった。
したがって、1-13Ｃ-イソロイシン投与後のΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きから肝機能障害を検出することが可能である。
【００５１】
〔実施例１５〕 1,1-13Ｃ-シスチン呼気テスト
健常ラット（9週齢，総ビリルビン値≦0.6mg/dl，n=4）および急性肝炎ラット（9週齢，総ビリルビン値＞4.5mg/dl，n=4）に、0.5%カルボキシメチルセルロースナトリウム水溶液を加え懸濁した1,1-13Ｃ-シスチン（mass Trace社より購入）を45mg/kg経口投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
【００５２】
健常ラット、急性肝炎ラット共に、1,1-13Ｃ-シスチン投与後30分までΔ13Ｃ(‰)値は増加を続けた（図１３）。
投与後30分のΔ13Ｃ(‰)値は急性肝炎ラットで 58.36±13.51 ‰、健常ラットで 146.48±19.34 ‰であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.001 (ANOVA with Fischer LSD)）に低かった。
【００５３】
また、投与後5分から10分におけるΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きは、急性肝炎ラットで 10.93±3.83‰／5分、健常ラットで 38.11±9.58‰／5分であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.01 (ANOVA with Fischer LSD)）に小さかった。
したがって、1,1-13Ｃ-シスチン投与後一定時間後のΔ13Ｃ(‰)値、あるいは、投与後のΔ13Ｃ(‰)値の増加の傾きから肝機能障害を検出することが可能である。
【００５４】
〔実施例１６〕 1-13Ｃ-アスパラギン酸呼気テスト
健常ラット（8週齢，総ビリルビン値≦0.4mg/dl，n=4）および急性肝炎ラット（8週齢，総ビリルビン値≧2.8mg/dl，n=4）に、生理食塩水に溶解した1-13Ｃ-アスパラギン酸（mass Trace社より購入）を大腿静脈より10mg/kg投与し、実施例１に記載の方法に従って、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）を測定した。
【００５５】
投与後2分のΔ13Ｃ(‰)値は急性肝炎ラットで 139.25±2.53‰、健常ラットで 158.35±8.54‰であり、急性肝炎ラットは健常ラットに比べて、非常に有意（ p＜ 0.01 (ANOVA with Fischer LSD)）に低かった。
したがって、1-13Ｃ-アスパラギン酸投与後一定時間後のΔ13Ｃ(‰)値から肝機能障害を検出することが可能である。
【００５６】
〔製剤例１〕 （注射剤）
１-13Ｃ-アルギニン10重量部に対し、生理食塩水を加え全量を100重量部として、これを溶解後ミリポアフィルターを用いて除菌濾過した。この濾液をバイアル瓶にとり、密封して注射剤を得た。
〔製剤例２〕 （内服液剤）
１-13Ｃ-ヒスチジン10重量部に対し、精製水を加え全量を100重量部として、これを溶解後ミリポアフィルターを用いて除菌濾過した。この濾液をバイアル瓶にとり、密封して内服液剤を得た。
【００５７】
【発明の効果】
本発明によれば、被験者の身体的負担が小さく、正確な検査結果を即時に知ることができ、かつ副作用がなく安全に使用できる肝機能診断剤が提供される。本発明の肝機能診断剤は、検査を行った時点での肝機能の評価に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ラットの呼気回収法の模式図を示す。
【図２】１-13Ｃ-アルギニン投与後の呼気中13ＣＯ2 の増加を示す。
【図３】１-13Ｃ-ヒスチジン投与後の呼気中13ＣＯ2 の増加を示す。
【図４】１,２-13Ｃ-オルニチン投与後の呼気中13ＣＯ2 の増加を示す。
【図５】１-13Ｃ-バリン投与後の呼気中13ＣＯ2 の増加を示す。
【図６】１-13Ｃ-リジン投与後の呼気中13ＣＯ2 の増加を示す。
【図７】１-13Ｃ-セリン投与後の呼気中13ＣＯ2 の増加を示す。
【図８】１-13Ｃ-スレオニン投与後の呼気中13ＣＯ2 の増加を示す。
【図９】１-13Ｃ-システイン投与後の呼気中13ＣＯ2 の増加を示す。
【図１０】１-13Ｃ-グルタミン酸投与後の呼気中13ＣＯ2 の増加を示す。
【図１１】１-13Ｃ-プロリン投与後の呼気中13ＣＯ2 の増加を示す。
【図１２】１-13Ｃ-ロイシン投与後の呼気中13ＣＯ2 の増加を示す。
【図１３】１,１-13Ｃ-シスチン投与後の呼気中13ＣＯ2 の増加を示す。
Claims (1)
- １位の炭素が １３ Ｃで標識されたアルギニン、ヒスチジン、バリン、リジン、セリン、スレオニン、システイン、グルタミン酸、プロリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン酸、１，２− １３ Ｃ−オルニチン、及び１，１− １３ Ｃ−シスチンからなる群から選ばれるアミノ酸を含む肝機能診断剤。
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