JP3947551B2 - タム−ホースフォール・グリコプロテインとウロモジュリンの識別法 - Google Patents
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Description
本発明はヒト尿由来のタム−ホースフォール・グリコプロテイン(Tamm−HorsfallGlycoprotein)(以後THGと略称する)およびウロモジュリン(Uromodulin)の精製物について免疫グロブリンを用いる両蛋白の識別法に関するものである。
THGは当初、ウリナリ・ムコプロテイン(urinarymucoprotein)として発見され(Morner KAH,1895 Skand.Arch.Physiol.6:332)、ウィルスによる赤血球凝集反応を尿中で阻害する因子であると報告された(TammI and HorsfallFL.1950Proc.Soc.Exp.Biol.Med.74:108)。具体的な精製法としては、尿を集め、4℃で一晩保存した後上清を一部廃棄し、その残部に0.58MになるようにNaClを加え攪拌する。その後遠心分離し沈澱を集め、水で溶かし再び遠心しその上清を集めて凍結乾燥したものがTHGであるとされている。以後多くの研究者によってTHGは部分的改良を施された様々な方法で精製されているが、基本的には上記の方法に沿って精製されている(MoonenP et al,1988 FEBS Lett.226:314、Toma G et al,1994 Biochem.Biophys.Res.Commun.200:275)。
一方、妊婦尿からTHGと同じアミノ酸配列を持つ糖タンパク質ウロモジュリン(Uromodulin)が精製された(MuchmoreAV andDecker JM,1985 Science 229:479)。ウロモジュリンは妊婦尿をレクチンカラム(Con A−Sepharose colomn)にかけた後、α−メチルマンノースによって溶出した液を水に対し透析し凍結乾燥する。これをリン酸緩衝食塩水に再溶解しゲル濾過、等電点電気泳動によって再度分離し、限外濾過膜にて濃縮して精製される。当初、ウロモジュリンの糖鎖部位には多くの機能がありIL−1,IL−2,腸瘍壊死因子(TNF)などのサイトカインの特異的なリガンドとされてきた(HessionC et al,1987 Science 237:1497、SherblomAP et al,1989 J.Immunol.143:939、BrownKM et al,1986 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:9119、Winkelstein A et al,1990 Immunopharmacology 20:201)。しかし最近では単に尿から塩析法によって精製されたものをTHG、妊婦尿を原料として塩析法によって精製されたものをウロモジュリンと呼んでいる。
THGには分子量の約30%の糖が含まれており、GluNa2 Man(5−7)(GluNa:N−アセチルグルコサミン、Man:マンノース)で示されるマンノースを豊富に含む糖鎖構造を有している。そしてMan5,Man6の糖鎖残基がIL−1やIL−2、腫瘍壊死因子(TNF)を含むサイトカインと特異的に結合していることが判明している。これらのことはTHGが免疫調節機構に関与している可能性を示唆しているが、アミノ酸配列が同一であるウロモジュリンのほうが免疫抑制作用が10倍以上高いとされている。また、最近羊由来のTHGが羊IgGと結合し、ヒト由来THGも同様にヒトIgGと結合することが報告されている(RhodesDCJ et al,1993 Kidney Int.44:1014)。したがって、THGはサイトカインを介した免疫調節機構以外にも、細尿管内での新しい免疫制御または免疫防衛に重要な役割をしているものと考えられる。しかし、現在THGとウロモジュリンの識別を正確に把握し、定量する方法は確立されていない。
Morner KAH,1895 Skand.Arch.Physiol.6:332 TammI and HorsfallFL.1950Proc.Soc.Exp.Biol.Med.74:108 MoonenP et al,1988 FEBS Lett.226:314、Toma G et al,1994 Biochem.Biophys.Res.Commun.200:275 MuchmoreAV andDecker JM,1985 Science 229:479 HessionC et al,1987 Science 237:1497、SherblomAP et al,1989 J.Immunol.143:939、BrownKM et al,1986 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:9119、Winkelstein A et al,1990 Immunopharmacology 20:201 RhodesDCJ et al,1993 Kidney Int.44:1014
Morner KAH,1895 Skand.Arch.Physiol.6:332 TammI and HorsfallFL.1950Proc.Soc.Exp.Biol.Med.74:108 MoonenP et al,1988 FEBS Lett.226:314、Toma G et al,1994 Biochem.Biophys.Res.Commun.200:275 MuchmoreAV andDecker JM,1985 Science 229:479 HessionC et al,1987 Science 237:1497、SherblomAP et al,1989 J.Immunol.143:939、BrownKM et al,1986 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:9119、Winkelstein A et al,1990 Immunopharmacology 20:201 RhodesDCJ et al,1993 Kidney Int.44:1014
THG及びウロモジュリンの精製を行うに当たり多くの研究者は上記の塩析法を用いている。しかしこの方法では目的タンパク質は勿論のこと、それ以外にも多くの不純物を巻き込んで沈澱させる恐れがあり、後の精製過程において不純物を除く過程を多く取り入れなければならない。この問題点を克服するためにはもっと穏やかな方法でタンパク沈澱を得る必要がある。また、THG及びウロモジュリンは金属イオン(Na+ 、Ca2+など)がその溶液中に存在すると容易にゲル化するため、凍結乾燥したTHGを生理的食塩水で溶解するのは容易ではない。このため、THGの精製過程において、凍結乾燥の過程を取り入れずに初めから生理的条件下において精製することが望ましい。更に、THGとウロモジュリンが正確に測定でき、その定量法が確立されれば、その生理的および臨床的意義がより有効に解明されるものと考えられる。
本発明者らは一般尿、妊婦尿に関わらず尿を一度凍結し解凍したときに多くの沈澱物が生じており、その沈澱に多量のTHGが含まれていることを見いだし、塩析法を用いずに凍結融解の1過程において、多量のTHGを沈澱させることに成功した。また、塩析法とは違って急激に沈澱を生じさせる方法ではないため不純物を巻き込みにくいという利点も持っていた。次に、多くの精製過程を簡素化した結果、高速液体クロマトグラフィー(以下、HPLCと略称する)を用いてゲル濾過を行えば、効率よく不純物(主に色素)を取り除くことができ、また、集めたフラクションは凍結乾燥することなく、たとえば孔径約0.2μmのフィルターを通すことにより、4℃で保存できることを知った。ウロモジュリンは妊婦尿から上記の凍結融解沈澱法以外にも安息香酸沈澱法で精製できる方法を確立した。更に、精製THGはヒト免疫グロブリンのクラス(IgG、IgA、IgM)とIgGのサブクラスの全て(IgG1,IgG2,IgG3,IgG4)、およびIgGのF(ab’)2 断片と結合する。しかしウロモジュリンはヒト免疫グロブリンのクラス(IgG、IgA)およびIgGのサブクラス(IgG1,IgG2,IgG4)と結合するがIgM、IgGのサブクラスであるIgG3およびIgGのF(ab’)2 断片とは結合しにくいことを見いだした。
本発明によれば、THGおよびウロモジュリンの精製物の特性を利用して両者を識別することができる。
本発明はこれらの新知見を基礎としてさらに発展させたもので、人尿を凍結したのち融解して生成する沈澱分画や人尿に安息香酸ナトリウムもしくはアンモニウムを溶解したのち溶液を安息香酸の析出する酸性にして生成する沈澱分画のような特定の性質を有するTHGもしくはウロモジュリンの精製物、およびそれらを含有する試料にヒトIgGのF(ab’)2 断片等のウロモジュリンが結合しにくい免疫グロブリンを作用させ、その作用量を測定することを特徴とするTHGとウロモジュリンを識別する方法に関する。
人尿の凍結、融解は通常の方法で行うことができ、融解液中に生成している沈澱分画を採取する。安息香酸ナトリウムもしくはアンモニウムは尿に約2%(W/V)加えれば充分である。その溶液に、たとえば塩酸を加えてpH3〜4の酸性にすれば安息香酸は析出し、所望の糖タンパクを吸着して沈澱する。この沈澱分画にエタノールを添加、攪拌することにより沈澱中の安息香酸は溶解し除去した沈澱分画が得られる。
上記で得られる沈澱分画を、たとえばリン酸緩衝食塩水に溶解してゲル濾過すれば色素などを含む不純物を除去してさらに精製することができる。
かくして得られる精製物が精製THGの場合にはヒトの免疫グロブリンのクラスであるIgGのF(ab’)2 断片、IgA(モノマー)とIgMおよびIgGのサブクラスであるIgG1、IgG2、IgG3とIgG4のすべてと結合する特性を有し、精製ウロモジュリンの場合は、ヒトの免疫グロブリンのクラスであるIgGとIgA(モノマー)およびIgGのサブクラスであるIgG1、IgG2とIgG4と結合するが、ヒトの免疫グロブリンのクラスであるIgGのF(ab’)2 断片、IgM、およびIgGのサブクラスであるIgG3とは結合しにくい特性を有する。
それで精製物を公知の手段によってそれぞれ固定化しておき、これにヒト免疫グロブリンのクラスIgMまたはIgGのサブクラスIgG3を作用させ、その作用量を酵素標識−プロテインGで測定するか、または直接酵素標識したIgGのF(ab’)2 断片を作用させ、その作用量を測定することによりTHGとウロモジュリンを識別することができる。
エンドトキシンショックや敗血症等炎症に関係するサイトカインIL−1やTNFによって引き起こされていると考えられており、ヒト尿由来のTHGまたはウロモジュリンはサイトカインIL−1に阻害作用があるからこれらの病気にたいする治療薬として有効であり、また、THGまたはウロモジュリンは免疫グロブリンと反応するから感染抵抗性増強作用も保持すると考えられる。更に、免疫グロブリンを用いたTHGとウロモジュリン識別法が確立されたので、これら蛋白の生理的および臨床的意義を開明するために有用である。
以下に、参考例及び実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の参考例及び実施例に限定されるものではない。
参考例1
健常人尿を集め−20℃にて凍結させた後4℃にて再解凍させることにより沈澱を得た。これを3,000×g、30min遠心分離し上清を捨て、沈澱をリン酸緩衝食塩水(PBS)に溶解させ同緩衝液で透析をした。この後遠心分離を行いその上清をアミコンにて濃縮し、HPLCを用い、移動相をPBSの条件でゲル濾過(TSK−3000SW:東ソー社)を行った(図1)。ボイド・ボリューム(voidvolume)に溶出されるフラクションをSDS−PAGEにかけTHGの分子量と純度を確認した(図2)。妊婦尿(妊娠2ケ月半〜6ケ月)を用いた場合でも上記の方法でウロモジュリンを精製出来た。
健常人尿を集め−20℃にて凍結させた後4℃にて再解凍させることにより沈澱を得た。これを3,000×g、30min遠心分離し上清を捨て、沈澱をリン酸緩衝食塩水(PBS)に溶解させ同緩衝液で透析をした。この後遠心分離を行いその上清をアミコンにて濃縮し、HPLCを用い、移動相をPBSの条件でゲル濾過(TSK−3000SW:東ソー社)を行った(図1)。ボイド・ボリューム(voidvolume)に溶出されるフラクションをSDS−PAGEにかけTHGの分子量と純度を確認した(図2)。妊婦尿(妊娠2ケ月半〜6ケ月)を用いた場合でも上記の方法でウロモジュリンを精製出来た。
参考例2
妊婦尿(妊娠2ケ月半〜6ケ月)に尿量の2%の安息香酸ナトリウムを添加し30分攪拌し溶解させた。その後16%塩酸にて溶液のpHを3.9に合わせ60分攪拌しタンパク質の沈澱を安息香酸の微粒子沈澱に効率よく吸着させた。これを濾過し、沈澱を集め沈澱の20倍量の安息香酸飽和冷水(0.3%(w/v))で洗浄した。これを圧搾濾過し沈澱を得た。沈澱の3倍量の冷エタノールを添加し22%アンモニア水でpHを5.5に合わせた後30分攪拌した。これを4℃で3時間放置し上清の2/3を廃棄した。残りの沈澱液をセライトプレコート〔GEMLITE SuperM(商標)白山工業(株)製〕中に添加し濾過した。沈澱物を回収し、−30℃にて保存した。このwetcakeを溶解し、PBSに対し透析をし、15,000rpm、10分間遠心分離した後、HPLCを用いて移動相をPBSの条件でゲル濾過(TSK3000−SW:東ソー)を行った(図3)。ボイド・ボリューム(voidvolume)に溶出されるフラクションをSDS−PAGEにかけ分子量と純度を確認した(図4)。ウロモジュリンが主に含まれるフラクションを集め、0.22μmのフィルターに通して4℃で保存した。健常人尿を用いた場合でも上記の方法でTHGを精製出来た。
妊婦尿(妊娠2ケ月半〜6ケ月)に尿量の2%の安息香酸ナトリウムを添加し30分攪拌し溶解させた。その後16%塩酸にて溶液のpHを3.9に合わせ60分攪拌しタンパク質の沈澱を安息香酸の微粒子沈澱に効率よく吸着させた。これを濾過し、沈澱を集め沈澱の20倍量の安息香酸飽和冷水(0.3%(w/v))で洗浄した。これを圧搾濾過し沈澱を得た。沈澱の3倍量の冷エタノールを添加し22%アンモニア水でpHを5.5に合わせた後30分攪拌した。これを4℃で3時間放置し上清の2/3を廃棄した。残りの沈澱液をセライトプレコート〔GEMLITE SuperM(商標)白山工業(株)製〕中に添加し濾過した。沈澱物を回収し、−30℃にて保存した。このwetcakeを溶解し、PBSに対し透析をし、15,000rpm、10分間遠心分離した後、HPLCを用いて移動相をPBSの条件でゲル濾過(TSK3000−SW:東ソー)を行った(図3)。ボイド・ボリューム(voidvolume)に溶出されるフラクションをSDS−PAGEにかけ分子量と純度を確認した(図4)。ウロモジュリンが主に含まれるフラクションを集め、0.22μmのフィルターに通して4℃で保存した。健常人尿を用いた場合でも上記の方法でTHGを精製出来た。
参考例1および2で得られた精製THGまたはウロモジュリンを50mM炭酸ナトリウム緩衝液(以下、SCB:シグマ社)(pH9.6)で希釈し、96穴プレート(ヌンク社)の各穴に50μlずつ分注して4℃で一晩静置した。プレートをSCBで洗った後、1%BSA−SCB溶液300μlを各穴に加え4℃で一晩静置した。これを20mM Tris bufferedsaline+0.05% Tween20(以下、TTBS)(pH7.4)で洗い、1%BSA−TTBSで3mg/mlから2倍の段階希釈をしたヒトIgG(カッペル社)を50μlずつ加え4℃で一晩静置し反応させた。これをTTBSで洗った後、ペルオキシダーゼ標識EIA gradeProtein G(バイオラッド社)を1%BSA−TTBSで3000倍に希釈したものを各穴に50μlずつ加え37℃で2時間反応させた。これをTTBSで洗った後SCBですすぎ、TMBパーオキシダーゼEIAサブメトレート・キット(TMB Peroxidase EIA SubstrateKit;バイオラッド社)にて発色させ、プレートリーダーによって450nmの吸光度を計測した。図5a)に示したように、THGとウロモジュリンはヒト免疫グロブリンIgGに対して用量依存的に反応するという結果を得た。
参考例1および2で得られた精製THGまたはウロモジュリンをMSCBで希釈し、96穴プレートの各穴に50μlずつ分注して4℃で一晩静置した。プレートをSCBで洗った後、1%BSA−SCB溶液300μlを各穴に加え4℃で一晩静した。これをTTBSで洗い、1%BSA−TTBSで3mg/mlから2倍の段階希釈をしたペルオキシダーゼ標識ヒトIgGのF(ab’)2 断片(ロックランド社)を50μlずつ加え4℃で一晩静置し反応させた。これをTTBSで洗った後SCBですすぎ、TMBperoxidase EIA SubstrateKitにて反応させ、プレートリーダーによつて450nmの吸光度を計測した。図5b)に示したように、THGはヒト1gG F(ab’)2 断片に対して用量依存的に反応するがウロモジュリンは反応しにくいという結果を得た。
人尿または妊婦尿を試料として50mMSCBで希釈し、96穴プレートの各穴に50μlずつ分注して4℃で一晩静置した。プレートをSCBで洗った後、1%BSA−SCB溶液300μlを各穴に加え4℃で一晩静置した。これを20mM TTBSで洗い、1%BSA−TTBSで3mg/mlから2倍の段階希釈をしたヒトIgGを50μlずつ加え4℃で一晩静置し反応させた。これをTTBSで洗った後、ペルオキシダーゼ標識EIA gradeProtein Gを1%BSA−TTBSで3000倍に希釈したものを各穴に50μlずつ加え37℃で2時間反応させた。これをTTBSで洗った後SCBですすぎ、TMB peroxidaseEIA Substrate Kitにて発色させ、プレートリーダーによって450nmの吸光度を測定したところ実施例1と同様の結果を得た。
人尿または妊婦尿を試料として50mMSCBで希釈し、96穴プレートの各穴に50μlずつ分注して4℃で一晩静置した。プレートをSCBで洗った後、1%BSA−SCB溶液300μlを各穴に加え4℃で一晩静置した。これを20mM TTBSで洗い、1%BSA−TTBSで3mg/mlから2倍の段階希釈をしたペルオキシダーゼ標識ヒト1gGF(ab’)2 断片50μlずつ加え4℃で一晩静置し反応させた。これをTTBSで洗った後SCBですすぎ、TMB peroxidaseEIA Substrate Kitにて発色させ、プレートリーダーによって450nmの吸光度を計測してところ実施例2と同様の結果を得た。
Claims (2)
- タム−ホースフォール・グリコプロテインであるかウロモジュリンであるか識別されていない試料にヒトの免疫グロブリンのクラスIgMまたはIgGのサブクラスIgG3を作用させ、その作用量を酵素標識−プロテインGで測定するか、または直接酵素標識したIgGのF(ab’)2 断片を作用させ、その作用量を測定をすることを特徴とするタム−ホースフォール・グリコプロテインとウロモジュリンを識別する方法。
- 試料が人尿を低温放置又は凍結したのち融解して生成する沈澱分画もしくは人尿に安息香酸ナトリウムもしくはアンモニウムを溶解したのち溶液を安息香酸の析出する酸性にして生成する沈澱分画の精製物である請求項1記載の方法。
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